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Optimierte Immundiagnostik durch krankheitsbezogene Immunprofile
Kompetenzzentrum für komplementär medizinische Diagnostik Labor Dr. Bayer
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2 Optimierte Immundiagnostik durch krankheitsbezogene Immunprofile
Vor zirka dreißig Jahren wurde durch zwei bahnbrechende Entwicklungen eine umfassende Typisierung von Immunzellen durchführbar. Durch Verwendung monoklonaler Antikörper gegen Oberflächenmarker von Zellen sowie durch den Einsatz der Durchflusszytometrie wurde eine Analyse mikroskopisch nicht zu unterscheidender Lymphozytensubpopulationen möglich. Die ursprünglichen Hauptindikationen für die Erhebung solcher Immunprofile waren die Diagnose und Verlaufskontrolle chronisch lymphatischer Leukämien, die Aufdeckung von Immundefektsyndromen, die Ermittlung des Grades der Immunschwäche im Zuge einer HIVInfektion sowie die Eruierung der Immunrekonstitution nach myeloablativer Therapie nach Knochenmark oder Stammzelltransplantation.
Seit langem weiß man, dass Veränderungen des Immunsystems auch bei weniger schweren Grunderkrankungen auftreten, was sich in Veränderungen einzelner Lymphozytensubpopulationen niederschlägt. Für eine ganze Reihe von Grunderkrankungen konnte die klinische Relevanz der Erhebung eines Immunstatus belegt werden. Diese reichen von einer Abklärung der Ursachen einer erhöhten Infektanfälligkeit über Tumorerkrankungen bis hin zu Allergien und Autoimmunerkrankungen. Ein wichtiges Feld sind auch iatrogen ausgelöste Immundefizite.
Die Indikationen für die Erhebung eines Immunstatus können daher wie folgt zusammengefasst werden:
• rezidivierende Infekte, auch als Folge einer immunsuppressiven Behandlung• Abklärung unklarer Lymphozytosen und unklarer Lymphozytopenien/Leukopenien• Virusinfektionen einschließlich Monitoring bei HIVInfektion• Tumoren einschließlich der Therapiekontrolle, auch bei aggressiven Therapieformen wie Chemo und
Strahlentherapie• allergische Erkrankungen • chronisch entzündliche Erkrankungen einschließlich Autoimmunerkrankungen• Planung und Optimierung einer individuellen Immuntherapie• Therapiekontrolle im Rahmen einer Immuntherapie• Überwachung des Immunstatus nach Transplantationen.
Die einzelnen Zellpopulationen
Lymphozyten lassen sich grob schematisiert in die drei Hauptgruppen der TZellen, der BZellen und der NKZellen einteilen (siehe Abbildung 1).
T-Lymphozyten
Die TLymphozyten durchlaufen einen Reifeprozess in der Thymusdrüse und sind charakterisiert durch den Oberflächen marker CD3. Sie stellen normalerweise den Hauptteil der Lymphozyten dar. TLymphozyten sind ein zentraler Träger der zellulären Immunabwehr gegen Viren und Pilze sowie auch gegen Tumorzellen. Die TLymphozyten können in eine Vielzahl von Subpopulationen aufgeteilt werden. Besonders wichtig sind:
1. THelferzellen: Diese tragen den Oberflächenmarker CD4 und haben im zellulären Immunsystem eine hochregulierende Wirkung. Sie sind in der Lage, antigene Strukturen zu erkennen, die von so genannten antigenpräsentierenden Zellen (z. B. Makrophagen) exprimiert werden und geben dann Zytokine (Interleukine, Interferon) ab, womit sie EffektorZellen wie z. B. NKZellen stimulieren. Sie stimulieren auch die BLymphozyten zur Transformation zu Plasmazellen und damit zur Produktion von Antikörpern.
2. Suppressor/zytotoxische TZellen: Diese tragen den Oberflächenmarker CD8. CD8positive Zellen haben unterschied liche Funktionen. Sie greifen in die Regulation des Immunsystems ein und haben hier suppressorische
Abbildung 1
3Optimierte Immundiagnostik durch krankheitsbezogene Immunprofile
Funktio nen, d. h. sie haben eine abregulierende Wirkung auf das Immunsystem. Dies kann besonders zur Verhinderung und Eingrenzung von Autoaggressionserkrankungen wichtig sein. Andere Untergruppen der CD8positiven Zellen verfügen jedoch auch über zytotoxische Eigenschaften und spielen damit eine wesentliche Rolle bei der Eliminierung von virusinfizierten und Tumorzellen. Durch geeignete Marker können die CD8positiven Zellen weiter aufgeteilt werden in solche mit suppressorischer und andere mit zytotoxischer Funktion.
B-Lymphozyten
BLymphozyten können unter Stimulierung durch Zytokine zu Plasmazellen differenzieren, die Träger der Antikörperbildung sind. BLymphozyten sind damit unerlässlich für die Aufrechterhaltung der humoralen Immunabwehr. Die Reifung der BLymphozyten findet im Knochenmark statt. Sie sind charakterisiert durch den Oberflächenmarker CD19.
NK-Zellen
Die natürlichen Killer(NK)Zellen sind charakterisiert durch die Markerkombination CD3/CD16+/CD56+. Sie sind zu einer durch Zellkontakt vermittelten unspezifischen Lyse von Zielzellen wie virustransformierte und Tumorzellen befähigt. Ihre Funktion ist antigenunabhängig.
Immunprofil Panel 1: Basisprofil
Dieses Profil hat sich seit vielen Jahren bewährt und stellt ein Basisinstrument im Rahmen der Immundiagnostik dar. Bezüglich der Suppressor/zytotoxischen TLymphozyten haben wir das Basisprofil an die heute überwiegend durchgeführte Phänotypisierung mit der MarkerKombination CD3+/CD8+ (statt nur CD8+) angepasst. Damit wird verhindert, dass auch CD8positive NKZellen zu diesem Subset hinzugerechnet werden. Durch diese Änderung ergeben sich auch Veränderungen bei den Normalbereichen.
Folgende Zellpopulationen werden beim Basisprofil untersucht:
Seit der Einführung dieses Basisprofils wurde eine Vielzahl zusätzlicher Oberflächenmarker auf Immunzellen nachgewiesen und ihre Relevanz für die immunologische Diagnostik evaluiert. Es hat sich als sinnvoll erwiesen, aus der Vielfalt der sich hier ergebenden immundiagnostischen Ansatzpunkte spezielle und krankheitsbezogene Immunprofile zu entwickeln, wobei wir in Ergänzung zum Basisprofil zwei weitere Immunprofile zusammengestellt haben.
Zellpopulation Marker
Leukozyten
Lymphozyten
Monozyten
Granulozyten
T-Lymphozyten CD3+
T-Helferzellen CD3+/CD4+
Suppressor-/zytotoxische T-Zellen CD3+/CD8+
aktivierte T-Zellen CD3+/HLA-DR+
non-MHC zytotoxische T-Zellen CD3+/CD16+/CD56+
CD4+/CD8+-Ratio
B-Lymphozyten CD19+
NK-Zellen CD3-/CD16+/CD56+
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Immunprofil Panel 2: Infektanfälligkeit/chronische Entzündungen/Autoimmunerkrankungen (Entzündungsprofil)
In Erweiterung des Basisprofils erfolgt eine Subdifferenzierung
• der CD4positiven THelferzellen in naive und MemoryZellen• der CD19positiven BZellen in polyreaktive und MemoryBZellen.
Zusätzlich werden die kurzzeitaktivierten THelferzellen sowie die regulatorischen TZellen bestimmt.
Die klinische Relevanz dieser zusätzlichen Marker ist nachfolgend dargestellt.
Aktivierungszustand des T-Zellsystems
Die Bestimmung dieser Aktivierungsparameter dient zur Beschreibung des funktionellen Zustandes des TZellsystems, was durch die alleinige Feststellung von Zellzahlen nicht möglich ist. Unter einer Aktivierung bilden die TLymphozyten Oberflächenmarker wie CD69 oder HLADR aus. CD69 ist dabei ein sehr früh exprimierter Aktivierungsmarker, der bereits wenige Stunden nach einer Aktivierung der TZelle nachweisbar wird und somit ein frühes Stadium der TZellaktivierung anzeigt. Die Expression des Markers HLADR setzt hingegen eine längere Zeit der Aktivierung voraus, so dass solche Zellen auch als langzeitaktivierte TZellen bezeichnet werden. Eine Verminderung der aktivierten T-Lymphozy ten, vor allem bei niedriger Gesamt-T-Zellzahl weist auf eine Hyporesponsivität hin, wie dies häufig bei infektanfälligen Patien ten nachzuweisen ist. Patienten mit angeborenen oder erworbenen Defekten im spezifischen Immunsystem weisen hingegen oft Zeichen einer T-zellulären Überstimulation auf, wie dies z. B. bei HIV-infizierten Patienten nachzuweisen ist. Hier ist die Aktivierung der T-Lymphozyten unproduktiv und führt über eine aktivierungsinduzierte Apoptose zum Absterben der T-Zellen.
Subtypisierung der Helferzellen
Mittels des Einsatzes des Antikörpers gegen CD45RA können so genannte Naive Helferzellen (CD4+/CD45RA+) von Memory Helferzellen (CD4+/CD45RA) unterschieden werden. Memory Zellen sind antigenerfahrene Zellen und dadurch in der Lage, bei einem erneuten Kontakt mit dem Antigen eine prompte und starke Gegenreaktion aufzubauen.
Zellpopulation Marker
Leukozyten
Lymphozyten
Monozyten
Granulozyten
T-Lymphozyten CD3+
langzeitaktivierte T-Zellen CD3+/HLA-DR+
T-Helferzellen CD3+/CD4+
– kurzzeitaktivierte Helferzellen CD4+/CD69+
– naive Helferzellen CD4+/CD45 RA+
– Memory Helferzellen CD4+/CD45 RA–
Regulatorische T-Zellen (Treg) CD4+/CD25+/CD127 LO
T-Suppressor-/zytotoxische T-Zellen CD8+
non-MHC zytotoxische T-Zellen CD3+/CD16+/CD56+
CD4+/CD8+-Ratio
B-Lymphozyten CD19+
polyreaktive B-Zellen CD19+/CD5+
Memory-B-Zellen CD19+/CD27+
NK-Zellen CD3-/CD16+/CD56+
5Optimierte Immundiagnostik durch krankheitsbezogene Immunprofile
Naive Zellen bilden hingegen die „immunologische Reserve“. Sie wird benötigt, um bei einem immunologi schen Challenge eine Erstantwort aufbauen zu können. Beide Zelltypen sollten in ausgewogener Relation vorliegen.
Ein Anstieg des Verhältnisses von Memory zu Naiven Zellen ist ein sensitives Zeichen für eine persistierende Immunaktivierung, vor allem dann, wenn die Erhöhung auf einer Expansion von Memory Zellen basiert. Solche erhöhten Verhältnisse von Memory zu Naiven Zellen trifft man bei folgenden Grunderkrankungen an:
• Virusinfektionen (HIV, CMV, VZV und HSV)• Tumorerkrankungen• Autoimmunerkrankungen • im Übertrainingszustand eines Sportlers• bei CFS• im hohen Alter.
Ein rasches Ansteigen des Memory:Naiven-Verhältnisses kann bei Patienten mit MS auf einen bevorstehenden Schub hinweisen.
Eine Verminderung des Verhältnisses von Memory zu Naiven Zellen kann z. B. beim Allergiker, aber auch bei Patienten mit metabolischen Störungen wie Diabetes mellitus angetroffen werden.
Subtypisierung der B-Lymphozyten
Im Rahmen der Subtypisierung von BLymphozyten werden folgende beiden Subpopulationen bestimmt:
a) CD5positive BLymphozyten. Hierbei handelt es sich um polyreaktive BZellen (so genannte B1Zellen), die niedrigaffine, polyreaktive Antikörper der IgMKlasse bilden. Erhöhte Anteile dieser Zellpopulation finden sich z.B. bei Patienten mit Autoimmunerkrankungen. Auch chronischlymphatische Leukämien sind häufig durch diesen BZelltyp charakterisiert.
b) CD27positive BLymphozyten. Dabei handelt es sich um so genannte Memory BZellen, also BLymphozyten, die als Gedächtniszellen vorliegen und bei einem erneuten Kontakt mit einem bereits bekannten Erreger eine effiziente und schnelle Immunantwort auslösen können. Defizite der Memory B-Zellen können z.B. bei chronisch-entzündlichen Erkrankungen sowie bei CVID nachgewiesen werden.
Regulatorische T-Lymphozyten bei Autoimmunerkrankungen
Die regulatorischen TZellen (Treg) sind durch die Markerkombination CD4+/CD25+/CD127low gekennzeichnet. Es handelt sich also um eine Untergruppe der THelferzellen, wobei der Anteil dieser Zellpopulation an den THelferzellen normalerweise bei 5–10 % liegt. Regulatorische TZellen spielen eine wichtige Rolle bei der Limitierung immunpathologischer Reaktionen im Zusammenhang mit Allergien, Autoimmunerkrankungen und Transplantationen. Sie wirken suppressorisch auf die TZelleffektorAntworten und sind damit ein wesentlicher Bestandteil der Gegenregulation nach erfolgter Immunaktivierung. Bei einem erfolgreichen Behandlungsverlauf von Autoimmunerkrankungen steigen die regula-torischen T-Zellen häufig an.
Immunprofil Panel 3: Tumorerkrankungen (Onkoprofil)
Zusätzliche Marker haben die Einschätzung der Immunitätslage eines Tumorpatienten einschließlich der Prognose deutlich verbessert und dienen zur Überwachung einer immunstimulierenden Therapie. Neben den bereits erwähnten regulatorischen TZellen (Treg) gehört dazu eine Beurteilung der Thymusreserve, eine Differenzierung der CD8positiven Zellen in solche mit suppressorischer/regulativer beziehungsweise zytotoxischer Funktion und die Beurteilung des Aktivierungsgrades der Killerzellen. Unter Heranziehung dieser Marker haben wir ein spezielles Onkoprofil erstellt:
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Regulatorische T-Lymphozyten: kritische Rolle bei Tumorerkrankungen
Die Bedeutung der regulatorischen TLymphozyten bei Autoimmunerkrankungen haben wir bereits besprochen. Allerdings spielen diese Zellen eine doppeldeutige Rolle, da regulatorische TZellen auch Immunreaktionen gegen Tumor antigene limitieren beziehungsweise supprimieren können. Dabei spielt auch die Anreicherung regulatorischer TZellen im Tumorgewebe eine wichtige Rolle. Eine Akkumulierung von regulatorischen TZellen im Tumorgewebe geht mit einer verminderten Überlebensrate einher. Möglicherweise fördern regulatorische TZellen das Tumorwachstum. Bei allen immunmodulierenden Maßnahmen bei Tumorpatienten stellen die regulatorischen T-Zellen einen wichtigen Verlaufsmarker dar, da deren Absinken unter der Therapie, beziehungsweise zumindest die Verhinderung eines weiteren Ansteigens als prognostisch günstig anzusehen ist. Eine weitere Erhöhung von Treg unter immunstimulierender Therapie ist als ungünstig anzusehen.
Zellpopulation Marker
Leukozyten
Lymphozyten
Monozyten
Granulozyten
T-Lymphozyten CD3+
kurzzeitaktivierte T-Zellen CD3+/CD69+
langzeitaktivierte T-Zellen CD3+/HLA-DR+
T-Helferzellen CD3+/CD4+
– naive Helferzellen CD4+/CD45RA+
– Memory Helferzellen CD4+/CD45RA-
Regulatorische T-Zellen (Treg) CD4+/CD25+/CD127 LO
Recent thymus emigrants (Thymusreserve) CD4+/CD45RA+/CD31+
T-Suppressor-/zytotoxische T-Zellen CD3+/CD8+
– MHC-zytotoxische CD8-pos. Zellen CD8+/CD28+
– suppressorische CD8-pos. Zellen CD8+/CD28-
non-MHC zytotoxische T-Zellen CD3+/CD16+/CD56+
B-Lymphozyten CD19+
NK-Zellen CD3-/CD16+/CD56+
aktivierte Killerzellen CD56+/HLA-DR+
Abbildung 2: Von der antigenen Belastung (Infektion, Tumor) bis zur kontrollierten Immun antwort. In der stark vereinfachten Übersicht wird ein Bruchstück des Erregers bzw. des Tumors von antigenpräsentierenden Zellen den T-Helferzellen gezeigt, woraufhin diese über verschiedene Cocktails von Botenstoffen (Zytokinen) unterschiedliche Effektorzellen anregen, was zum einen eine Antikörperbildung und zum anderen eine Rekrutierung von zytotoxischen Effektorzellen in Gang setzt. Von Makrophagen frei gesetzte Mediatoren sowie vom Mikromilieu ausgehende Stoffe des Gewebs- und Tumorzerfalls können Suppressorzellen anschalten und so den Immunaktivierungsprozess beenden.
7Optimierte Immundiagnostik durch krankheitsbezogene Immunprofile
Differenzierung der CD8-positiven Suppressor-/zytotoxischen T-Lymphozyten
CD8positive TLymphozyten wurden früher allgemein als „Suppressorzellen“ bezeichnet. Dies ist falsch, da diese Zellen sowohl suppressorische/regulative wie auch zytotoxische Funktionen haben können. Dies lässt sich differenzieren über den Marker CD28. CD8positive, aber CD28negative Lymphozyten haben suppressorisch/regulative Eigenschaften und einen modulierenden Einfluss auf die T und BZellfunktionen. Sie wirken überschießenden Immunreaktionen entgegen. TLymphozyten, die hingegen CD8 und CD28 positiv sind, spielen eine wichtige Rolle bei der antiviralen und der antitumoralen Abwehr. Dabei kann eine unklare Erhöhung dieser Zellpopulation bereits eine immunologische Auseinan-dersetzung mit virusinfizierten beziehungsweise aberranten Zellen widerspiegeln. Bei immunstimulierenden Therapien wird es das Ziel sein, den Anteil an zytotoxischen, also CD28-positiven Zellen zu erhöhen. Ein solcher Anstieg signalisiert ein Ansprechen des Immunsystems auf die immunmodulierende Therapie.
Beurteilung der Thymusreserve
Im Laufe des Lebens kommt es zu einem kontinuierlichen Rückgang der Größe der Thymusdrüse beziehungsweise zu einem Ersatz des funktionsfähigen Thymus durch Fettgewebe. Die Thymusdrüse ist die „Schule“ der TLymphozyten. Die Beurteilung der Funktion der Thymusdrüse beziehungsweise der so genannten Thymusreserve erfolgt über den Marker CD31, der von naiven THelferzellen exprimiert wird. CD31 wird dabei von solchen Zellen exprimiert, die erst kürzlich die Thymusdrüse verlassen haben und man spricht hier von „recent thymic emigrants“. Der Anteil dieser Zellen ist damit ein Maß für die verbliebene Thymusrestfunktion. Bei eingeschränkter Thymusfunktion kommt es zu einer verminderten Bildung omnipotenter naiver TLymphozyten. Die Abschätzung der Thymusfunktion ist von besonderer Bedeutung bei Chemo und Strahlentherapie, zur Abklärung unklarer persistierender Lymphozytopenien und stellt einen Therapiemarker für die Indikation einer Behandlung mit Thymuspeptiden dar.
Killerzellaktivierung
Die funktionelle Aktivität des Killerzellsystems kann nicht allein anhand ihrer Zellzahl abgeschätzt werden. Da Killerzellen nach Aktivierung eine deutlich erhöhte Koexpression des HLADRMarkers zeigen, gibt die Zahl solcher Zellen einen Einblick in ihren funktionellen Zustand. Erfasst werden über diesen Marker alle Killerzellen, die CD56 exprimieren und damit sowohl NKZellen als auch MHCunrestringierte zytotoxische TLymphozyten. Die Bestimmung dieses Markers erlaubt daher eine Einschätzung der Zytotoxizitätsfunktionen der Killerzellen, kann jedoch einen NKZellZytotoxizitätstest nicht, oder zumindest nicht gänzlich, ersetzen.
Fazit:
Die hier dargestellten Immunprofile erleichtern eine gezielte, krankheitsbezogene Immundiagnostik. Sie dienen der Erkennung von Immundysbalancen, sind unerlässlich für die weitere diagnostische Abklärung bei einer Vielzahl von Grunderkrankungen (Infektanfälligkeit, chronischentzündliche Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen, Tumor erkrankungen), geben wichtige Hinweise zur Prog nose, z.B. bei Autoimmun und Tumorerkrankungen, sind für eine individuell optimierte Immuntherapie unabdingbar und für die Beurteilung einer jeglichen immunmodulatorischen Therapie erforderlich.
In Anhängigkeit vom Ergebnis der immundiagnostischen Untersuchungen ergeben sich unterschiedliche Ansätze für die Immuntherapie, wie aus Abbildung 3 hervorgeht.
Immunbiologisches Merkmal Immunmodulatorischer Ansatz
T-Zellen Thymus, Zink
B-Zellen Bronchovaxom, Ribomunyl, Splenuvocal
Helferzellen Thymus, NAC, Thuja-Extrakt
CD-8-(TS)-Zellen Isoprinosine, Copaxone, Zink
T-Zell-Aktivierung Echinacea, Eleukokk, Artemisinin, Vitamin A
NK-Zellen Mistel, Biobran, Selen, Regacan, DHEA
Killer-Zell-Aktivierung Mistel, Biobran, Herba Abrotani
Abbildung 3
Mineralstoffe
Spurenelemente
Schwermetalle
Vitamine
Fettsäureprofil
Aminosäureprofil
Säure-Basen-Haushalt
kardiovaskuläre Risikofaktoren
Hormone/ Neurotransmitter
Immundiagnostik
Nahrungsmittel- unverträglichkeiten
Candida-/ Schimmelpilz-Serologie
Stuhldiagnostik
Kompetenzzentrum für komplementärmedizinische Diagnostik
Diagnostic Center of Complementary Medicine