Optimierte Immundiagnostik durch krankheitsbezogene Immunprofile

Kompetenzzentrum für komplementär medizinische Diagnostik Labor Dr. Bayer

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2 Optimierte Immundiagnostik durch krankheitsbezogene Immunprofile

Vor zirka dreißig Jahren wurde durch zwei bahnbrechende Entwicklungen eine umfassende Typisierung von Immun­zellen durchführbar. Durch Verwendung monoklonaler Antikörper gegen Oberflächenmarker von Zellen sowie durch den Einsatz der Durchflusszytometrie wurde eine Analyse mikroskopisch nicht zu unterscheidender Lymphozyten­subpopulationen möglich. Die ursprünglichen Hauptindikationen für die Erhebung solcher Immunprofile waren die Diagnose und Verlaufskontrolle chronisch lymphatischer Leukämien, die Aufdeckung von Immundefektsyndromen, die Ermittlung des Grades der Immunschwäche im Zuge einer HIV­Infektion sowie die Eruierung der Immunrekonstitution nach myeloablativer Therapie nach Knochenmark­ oder Stammzelltransplantation.

Seit langem weiß man, dass Veränderungen des Immunsystems auch bei weniger schweren Grunderkrankungen auftreten, was sich in Veränderungen einzelner Lymphozytensubpopulationen niederschlägt. Für eine ganze Reihe von Grund­erkrankungen konnte die klinische Relevanz der Erhebung eines Immunstatus belegt werden. Diese reichen von einer Ab­klärung der Ursachen einer erhöhten Infektanfälligkeit über Tumorerkrankungen bis hin zu Allergien und Autoimmun­erkrankungen. Ein wichtiges Feld sind auch iatrogen ausgelöste Immundefizite.

Die Indikationen für die Erhebung eines Immunstatus können daher wie folgt zusammengefasst werden:

• rezidivierende Infekte, auch als Folge einer immunsuppressiven Behandlung• Abklärung unklarer Lymphozytosen und unklarer Lymphozytopenien/Leukopenien• Virusinfektionen einschließlich Monitoring bei HIV­Infektion• Tumoren einschließlich der Therapiekontrolle, auch bei aggressiven Therapieformen wie Chemo­ und

Strahlentherapie• allergische Erkrankungen • chronisch entzündliche Erkrankungen einschließlich Autoimmunerkrankungen• Planung und Optimierung einer individuellen Immuntherapie• Therapiekontrolle im Rahmen einer Immuntherapie• Überwachung des Immunstatus nach Transplantationen.

Die einzelnen Zellpopulationen

Lymphozyten lassen sich grob schematisiert in die drei Hauptgruppen der T­Zellen, der B­Zellen und der NK­Zellen einteilen (siehe Abbildung 1).

T-Lymphozyten

Die T­Lymphozyten durchlaufen einen Reifeprozess in der Thymusdrüse und sind charakterisiert durch den Oberflächen marker CD3. Sie stellen normalerweise den Hauptteil der Lymphozyten dar. T­Lymphozyten sind ein zentraler Träger der zellulären Immunabwehr gegen Viren und Pilze sowie auch gegen Tumorzellen. Die T­Lympho­zyten können in eine Vielzahl von Subpopulationen aufgeteilt werden. Besonders wichtig sind:

1. T­Helferzellen: Diese tragen den Oberflächenmarker CD4 und haben im zellulären Immunsystem eine hoch­regulierende Wirkung. Sie sind in der Lage, antigene Strukturen zu erkennen, die von so genannten antigenpräsen­tierenden Zellen (z. B. Makrophagen) exprimiert werden und geben dann Zytokine (Interleukine, Interferon) ab, womit sie Effektor­Zellen wie z. B. NK­Zellen stimulieren. Sie stimulieren auch die B­Lymphozyten zur Trans­formation zu Plasmazellen und damit zur Produktion von Antikörpern.

2. Suppressor­/zytotoxische T­Zellen: Diese tragen den Oberflächenmarker CD8. CD8­positive Zellen haben unterschied liche Funktionen. Sie greifen in die Regulation des Immunsystems ein und haben hier suppressorische

Abbildung 1

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Funktio nen, d. h. sie haben eine abregulierende Wirkung auf das Immunsystem. Dies kann besonders zur Verhinde­rung und Eingrenzung von Autoaggressionserkrankungen wichtig sein. Andere Untergruppen der CD8­positiven Zellen verfügen jedoch auch über zytotoxische Eigenschaften und spielen damit eine wesentliche Rolle bei der Eli­minierung von virusinfizierten und Tumorzellen. Durch geeignete Marker können die CD8­positiven Zellen weiter aufgeteilt werden in solche mit suppressorischer und andere mit zytotoxischer Funktion.

B-Lymphozyten

B­Lymphozyten können unter Stimulierung durch Zytokine zu Plasmazellen differenzieren, die Träger der Antikörper­bildung sind. B­Lymphozyten sind damit unerlässlich für die Aufrechterhaltung der humoralen Immunabwehr. Die Reifung der B­Lymphozyten findet im Knochenmark statt. Sie sind charakterisiert durch den Oberflächenmarker CD19.

NK-Zellen

Die natürlichen Killer­(NK­)Zellen sind charakterisiert durch die Markerkombination CD3­/CD16+/CD56+. Sie sind zu einer durch Zellkontakt vermittelten unspezifischen Lyse von Zielzellen wie virustransformierte und Tumorzellen befähigt. Ihre Funktion ist antigenunabhängig.

Immunprofil Panel 1: Basisprofil

Dieses Profil hat sich seit vielen Jahren bewährt und stellt ein Basisinstrument im Rahmen der Immundiagnostik dar. Bezüglich der Suppressor/zytotoxischen T­Lymphozyten haben wir das Basisprofil an die heute überwiegend durchge­führte Phänotypisierung mit der Marker­Kombination CD3+/CD8+ (statt nur CD8+) angepasst. Damit wird verhindert, dass auch CD8­positive NK­Zellen zu diesem Subset hinzugerechnet werden. Durch diese Änderung ergeben sich auch Veränderungen bei den Normalbereichen.

Folgende Zellpopulationen werden beim Basisprofil untersucht:

Seit der Einführung dieses Basisprofils wurde eine Vielzahl zusätzlicher Oberflächenmarker auf Immunzellen nachgewiesen und ihre Relevanz für die immunologische Diagnostik evaluiert. Es hat sich als sinnvoll erwiesen, aus der Vielfalt der sich hier ergebenden immundiagnostischen Ansatzpunkte spezielle und krankheitsbezogene Immunprofile zu entwickeln, wobei wir in Ergänzung zum Basisprofil zwei weitere Immunprofile zusammengestellt haben.

Zellpopulation Marker

Leukozyten

Lymphozyten

Monozyten

Granulozyten

T-Lymphozyten CD3+

T-Helferzellen CD3+/CD4+

Suppressor-/zytotoxische T-Zellen CD3+/CD8+

aktivierte T-Zellen CD3+/HLA-DR+

non-MHC zytotoxische T-Zellen CD3+/CD16+/CD56+

CD4+/CD8+-Ratio

B-Lymphozyten CD19+

NK-Zellen CD3-/CD16+/CD56+

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Immunprofil Panel 2: Infektanfälligkeit/chronische Entzündungen/Autoimmunerkrankungen (Entzündungsprofil)

In Erweiterung des Basisprofils erfolgt eine Subdifferenzierung

• der CD4­positiven T­Helferzellen in naive und Memory­Zellen• der CD19­positiven B­Zellen in polyreaktive und Memory­B­Zellen.

Zusätzlich werden die kurzzeitaktivierten T­Helferzellen sowie die regulatorischen T­Zellen bestimmt.

Die klinische Relevanz dieser zusätzlichen Marker ist nachfolgend dargestellt.

Aktivierungszustand des T-Zellsystems

Die Bestimmung dieser Aktivierungsparameter dient zur Beschreibung des funktionellen Zustandes des T­Zellsystems, was durch die alleinige Feststellung von Zellzahlen nicht möglich ist. Unter einer Aktivierung bilden die T­Lymphozyten Oberflächenmarker wie CD69 oder HLA­DR aus. CD69 ist dabei ein sehr früh exprimierter Aktivierungsmarker, der bereits wenige Stunden nach einer Aktivierung der T­Zelle nachweisbar wird und somit ein frühes Stadium der T­Zellaktivierung anzeigt. Die Expression des Markers HLA­DR setzt hingegen eine längere Zeit der Aktivierung voraus, so dass solche Zellen auch als langzeitaktivierte T­Zellen bezeichnet werden. Eine Verminderung der aktivierten T-Lymphozy ten, vor allem bei niedriger Gesamt-T-Zellzahl weist auf eine Hyporesponsivität hin, wie dies häufig bei infektanfälligen Patien ten nachzuweisen ist. Patienten mit angeborenen oder erworbenen Defekten im spezifischen Immunsystem weisen hingegen oft Zeichen einer T-zellulären Überstimulation auf, wie dies z. B. bei HIV-infizierten Patienten nachzuweisen ist. Hier ist die Aktivierung der T-Lymphozyten unproduktiv und führt über eine aktivierungsinduzierte Apoptose zum Absterben der T-Zellen.

Subtypisierung der Helferzellen

Mittels des Einsatzes des Antikörpers gegen CD45RA können so genannte Naive Helferzellen (CD4+/CD45RA+) von Memory Helferzellen (CD4+/CD45RA­) unterschieden werden. Memory Zellen sind antigenerfahrene Zellen und da­durch in der Lage, bei einem erneuten Kontakt mit dem Antigen eine prompte und starke Gegenreaktion aufzubauen.

Zellpopulation Marker

Leukozyten

Lymphozyten

Monozyten

Granulozyten

T-Lymphozyten CD3+

langzeitaktivierte T-Zellen CD3+/HLA-DR+

T-Helferzellen CD3+/CD4+

– kurzzeitaktivierte Helferzellen CD4+/CD69+

– naive Helferzellen CD4+/CD45 RA+

– Memory Helferzellen CD4+/CD45 RA–

Regulatorische T-Zellen (Treg) CD4+/CD25+/CD127 LO

T-Suppressor-/zytotoxische T-Zellen CD8+

non-MHC zytotoxische T-Zellen CD3+/CD16+/CD56+

CD4+/CD8+-Ratio

B-Lymphozyten CD19+

polyreaktive B-Zellen CD19+/CD5+

Memory-B-Zellen CD19+/CD27+

NK-Zellen CD3-/CD16+/CD56+

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Naive Zellen bilden hingegen die „immunologische Reserve“. Sie wird benötigt, um bei einem immunologi schen Challenge eine Erstantwort aufbauen zu können. Beide Zelltypen sollten in ausgewogener Relation vorliegen.

Ein Anstieg des Verhältnisses von Memory zu Naiven Zellen ist ein sensitives Zeichen für eine persistierende Im­munaktivierung, vor allem dann, wenn die Erhöhung auf einer Expansion von Memory Zellen basiert. Solche erhöhten Verhältnisse von Memory zu Naiven Zellen trifft man bei folgenden Grunderkrankungen an:

• Virusinfektionen (HIV, CMV, VZV und HSV)• Tumorerkrankungen• Autoimmunerkrankungen • im Übertrainingszustand eines Sportlers• bei CFS• im hohen Alter.

Ein rasches Ansteigen des Memory:Naiven-Verhältnisses kann bei Patienten mit MS auf einen bevorstehenden Schub hinweisen.

Eine Verminderung des Verhältnisses von Memory zu Naiven Zellen kann z. B. beim Allergiker, aber auch bei Patienten mit metabolischen Störungen wie Diabetes mellitus angetroffen werden.

Subtypisierung der B-Lymphozyten

Im Rahmen der Subtypisierung von B­Lymphozyten werden folgende beiden Subpopulationen bestimmt:

a) CD5­positive B­Lymphozyten. Hierbei handelt es sich um polyreaktive B­Zellen (so genannte B1­Zellen), die niedrig­affine, polyreaktive Antikörper der IgM­Klasse bilden. Erhöhte Anteile dieser Zellpopulation finden sich z.B. bei Patienten mit Autoimmunerkrankungen. Auch chronisch­lymphatische Leukämien sind häufig durch diesen B­Zell­typ charakterisiert.

b) CD27­positive B­Lymphozyten. Dabei handelt es sich um so genannte Memory B­Zellen, also B­Lymphozyten, die als Gedächtniszellen vorliegen und bei einem erneuten Kontakt mit einem bereits bekannten Erreger eine effiziente und schnelle Immunantwort auslösen können. Defizite der Memory B-Zellen können z.B. bei chronisch-entzündlichen Erkrankungen sowie bei CVID nachgewiesen werden.

Regulatorische T-Lymphozyten bei Autoimmunerkrankungen

Die regulatorischen T­Zellen (Treg) sind durch die Markerkombination CD4+/CD25+/CD127low gekennzeichnet. Es handelt sich also um eine Untergruppe der T­Helferzellen, wobei der Anteil dieser Zellpopulation an den T­Helfer­zellen normalerweise bei 5–10 % liegt. Regulatorische T­Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der Limitierung immun­pathologischer Reaktionen im Zusammenhang mit Allergien, Autoimmunerkrankungen und Transplantationen. Sie wirken suppressorisch auf die T­Zelleffektor­Antworten und sind damit ein wesentlicher Bestandteil der Gegenregulation nach erfolgter Immunaktivierung. Bei einem erfolgreichen Behandlungsverlauf von Autoimmunerkrankungen steigen die regula-torischen T-Zellen häufig an.

Immunprofil Panel 3: Tumorerkrankungen (Onkoprofil)

Zusätzliche Marker haben die Einschätzung der Immunitätslage eines Tumorpatienten einschließlich der Prognose deut­lich verbessert und dienen zur Überwachung einer immunstimulierenden Therapie. Neben den bereits erwähnten regu­latorischen T­Zellen (Treg) gehört dazu eine Beurteilung der Thymusreserve, eine Differenzierung der CD8­positiven Zellen in solche mit suppressorischer/regulativer beziehungsweise zytotoxischer Funktion und die Beurteilung des Akti­vierungsgrades der Killerzellen. Unter Heranziehung dieser Marker haben wir ein spezielles Onkoprofil erstellt:

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Regulatorische T-Lymphozyten: kritische Rolle bei Tumorerkrankungen

Die Bedeutung der regulatorischen T­Lymphozyten bei Auto­immunerkrankungen haben wir bereits besprochen. Allerdings spielen diese Zellen eine doppeldeutige Rolle, da regulato­rische T­Zellen auch Immunreaktionen gegen Tumor antigene limitieren beziehungsweise supprimieren können. Dabei spielt auch die Anreicherung regulatorischer T­Zellen im Tumor­gewebe eine wichtige Rolle. Eine Akkumulierung von regulato­rischen T­Zellen im Tumorgewebe geht mit einer verminderten Überlebensrate einher. Möglicherweise fördern regulatorische T­Zellen das Tumorwachstum. Bei allen immunmodulierenden Maßnahmen bei Tumorpatienten stellen die regulatorischen T-Zellen einen wichtigen Verlaufsmarker dar, da deren Absinken unter der Therapie, beziehungsweise zumindest die Verhinderung eines weiteren Ansteigens als prognostisch günstig anzusehen ist. Eine weitere Erhöhung von Treg unter immunstimulierender Therapie ist als ungünstig anzusehen.

Zellpopulation Marker

Leukozyten

Lymphozyten

Monozyten

Granulozyten

T-Lymphozyten CD3+

kurzzeitaktivierte T-Zellen CD3+/CD69+

langzeitaktivierte T-Zellen CD3+/HLA-DR+

T-Helferzellen CD3+/CD4+

– naive Helferzellen CD4+/CD45RA+

– Memory Helferzellen CD4+/CD45RA-

Regulatorische T-Zellen (Treg) CD4+/CD25+/CD127 LO

Recent thymus emigrants (Thymusreserve) CD4+/CD45RA+/CD31+

T-Suppressor-/zytotoxische T-Zellen CD3+/CD8+

– MHC-zytotoxische CD8-pos. Zellen CD8+/CD28+

– suppressorische CD8-pos. Zellen CD8+/CD28-

non-MHC zytotoxische T-Zellen CD3+/CD16+/CD56+

B-Lymphozyten CD19+

NK-Zellen CD3-/CD16+/CD56+

aktivierte Killerzellen CD56+/HLA-DR+

Abbildung 2: Von der antigenen Belastung (Infektion, Tumor) bis zur kontrollierten Immun antwort. In der stark vereinfachten Übersicht wird ein Bruchstück des Erregers bzw. des Tumors von antigenpräsentierenden Zellen den T-Helferzellen gezeigt, woraufhin diese über verschiedene Cocktails von Botenstoffen (Zytokinen) unterschiedliche Effektorzellen anregen, was zum einen eine Antikörperbildung und zum anderen eine Rekrutierung von zytotoxischen Effektorzellen in Gang setzt. Von Makrophagen frei gesetzte Mediatoren sowie vom Mikromilieu ausgehende Stoffe des Gewebs- und Tumorzerfalls können Suppressorzellen anschalten und so den Immunaktivierungsprozess beenden.

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Differenzierung der CD8-positiven Suppressor-/zytotoxischen T-Lymphozyten

CD8­positive T­Lymphozyten wurden früher allgemein als „Suppressorzellen“ bezeichnet. Dies ist falsch, da diese Zellen sowohl suppressorische/regulative wie auch zytotoxische Funktionen haben können. Dies lässt sich differenzieren über den Marker CD28. CD8­positive, aber CD28­negative Lymphozyten haben suppressorisch/regulative Eigenschaften und einen modulierenden Einfluss auf die T­ und B­Zellfunktionen. Sie wirken überschießenden Immunreaktionen entgegen. T­Lymphozyten, die hingegen CD8 und CD28 positiv sind, spielen eine wichtige Rolle bei der antiviralen und der antitumoralen Abwehr. Dabei kann eine unklare Erhöhung dieser Zellpopulation bereits eine immunologische Auseinan-dersetzung mit virusinfizierten beziehungsweise aberranten Zellen widerspiegeln. Bei immunstimulierenden Therapien wird es das Ziel sein, den Anteil an zytotoxischen, also CD28-positiven Zellen zu erhöhen. Ein solcher Anstieg signalisiert ein Ansprechen des Immunsystems auf die immunmodulierende Therapie.

Beurteilung der Thymusreserve

Im Laufe des Lebens kommt es zu einem kontinuierlichen Rückgang der Größe der Thymusdrüse beziehungsweise zu einem Ersatz des funktionsfähigen Thymus durch Fettgewebe. Die Thymusdrüse ist die „Schule“ der T­Lymphozyten. Die Beurteilung der Funktion der Thymusdrüse beziehungsweise der so genannten Thymusreserve erfolgt über den Marker CD31, der von naiven T­Helferzellen exprimiert wird. CD31 wird dabei von solchen Zellen exprimiert, die erst kürzlich die Thymusdrüse verlassen haben und man spricht hier von „recent thymic emigrants“. Der Anteil dieser Zellen ist damit ein Maß für die verbliebene Thymusrestfunktion. Bei eingeschränkter Thymusfunktion kommt es zu einer verminderten Bildung omnipotenter naiver T­Lymphozyten. Die Abschätzung der Thymusfunktion ist von besonderer Bedeutung bei Chemo­ und Strahlentherapie, zur Abklärung unklarer persistierender Lymphozytopenien und stellt einen Therapiemarker für die Indikation einer Behandlung mit Thymuspeptiden dar.

Killerzellaktivierung

Die funktionelle Aktivität des Killerzellsystems kann nicht allein anhand ihrer Zellzahl abgeschätzt werden. Da Killer­zellen nach Aktivierung eine deutlich erhöhte Koexpression des HLA­DR­Markers zeigen, gibt die Zahl solcher Zellen einen Einblick in ihren funktionellen Zustand. Erfasst werden über diesen Marker alle Killerzellen, die CD56 exprimie­ren und damit sowohl NK­Zellen als auch MHC­unrestringierte zytotoxische T­Lymphozyten. Die Bestimmung dieses Markers erlaubt daher eine Einschätzung der Zytotoxizitätsfunktionen der Killerzellen, kann jedoch einen NK­Zell­Zytoto­xizitätstest nicht, oder zumindest nicht gänzlich, ersetzen.

Fazit:

Die hier dargestellten Immunprofile erleichtern eine gezielte, krankheitsbezogene Immundiagnostik. Sie dienen der Erkennung von Immundysbalancen, sind unerlässlich für die weitere diagnostische Abklärung bei einer Vielzahl von Grunderkrankungen (Infektanfälligkeit, chronisch­entzündliche Erkrankungen, Autoimmunerkran­kungen, Tumor erkrankungen), geben wichtige Hinweise zur Prog nose, z.B. bei Autoimmun­ und Tumor­erkrankungen, sind für eine individuell optimierte Immuntherapie unabdingbar und für die Beurteilung einer jeglichen immunmodulatorischen Therapie erforderlich.

In Anhängigkeit vom Ergebnis der immundiagnostischen Untersuchungen ergeben sich unterschiedliche Ansätze für die Immuntherapie, wie aus Abbildung 3 hervorgeht.

Immunbiologisches Merkmal Immunmodulatorischer Ansatz

T-Zellen Thymus, Zink

B-Zellen Bronchovaxom, Ribomunyl, Splenuvocal

Helferzellen Thymus, NAC, Thuja-Extrakt

CD-8-(TS)-Zellen Isoprinosine, Copaxone, Zink

T-Zell-Aktivierung Echinacea, Eleukokk, Artemisinin, Vitamin A

NK-Zellen Mistel, Biobran, Selen, Regacan, DHEA

Killer-Zell-Aktivierung Mistel, Biobran, Herba Abrotani

Abbildung 3

Mineralstoffe

Spurenelemente

Schwermetalle

Vitamine

Fettsäureprofil

Aminosäureprofil

Säure-Basen-Haushalt

kardiovaskuläre Risikofaktoren

Hormone/ Neurotransmitter

Immundiagnostik

Nahrungsmittel- unverträglichkeiten

Candida-/ Schimmelpilz-Serologie

Stuhldiagnostik

Kompetenzzentrum für komplementärmedizinische Diagnostik

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