ZellfraktionierungOrganellenpräparation aus Saccharomyces

cerevisiae

Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

Anzucht der Zellen auf unterschiedlichen Nährmedien Ernten Aufschluss der Zellen: enzymatisch und mechanisch Isolierung + Reinigung der Fraktionen

◦ Mitochondrien◦ Mikrosomen

Proteinbestimmung nach Lowry Markerenzymmessungen

◦ NADPH-Cytochrom c-Reduktase (Mikrosomen)◦ Succinatdehydrogenase (Mitochondrien)

Quantitative Bestimmung der Cytochromen

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Durchführung

Puffer A (Dithiothreitol)◦ Di-Sulfidbrücken werden dadurch aufgebrochen (Vorbereitung für Zymolyasezugabe)

Puffer B ( Sorbit) & Puffer C ( Mannit)◦ Damit der osmotische Druck stabil bleibt

Zymolyase◦ Enzym zum Abbau von Zellmembran

Phenylmethylsulfonylfluorid◦ Inhibiert proteolytische Abbaureaktionen

Triton X-100◦ Detergenz löst Membranlipide

Phenanzinmethosulfat◦ Mediator zur Wasserstoffübertragung, verstärkt die ReaktionBernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara

Treusch

Reagentien

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Messung durcho Aktivitätsenzym, welches nur in spezifischen Organell einer Zelle eine

Reaktion hervorruft

o Immunologische Charakterisierung

o Identifizierung von Zellfraktionen durch charakteristische Proteine mittels Elektrophorese

o Elektronenmikroskopie, Bestimmte Strukturen und Dichte sind spezifisch für das jeweilige Organell.

Aktivitätsmessung

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Unterschiede der NährmedienLactat Glucose

Aerob Citratzyklus + Oxidative

Phosphorylierung Mitochondrien Bis zu 12 ATP / Lactat Niedrigere Zellausbeute zu

erwarten

Anaerob, aber auch unter aeroben Bedingungen

Glycolyse + Fermentation zur Energiegewinnung bevorzugt

Cytosol 2 ATP / Glucose Pasteur-Effekt Crabtree-Effekt Höhere Zellausbeute zu

erwarten

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Lactat -> Pyruvat liefert keine Energie, deshalb erfolgt keine Fermentation sondern eine aerobe Verstoffwechselung durch den Citratzyklus

Citratcyclus & Fermentation im Vergleich

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• Umsetzung von Lactat zu Pyruvat mit Cytochrom b2

Citratcyclus & Fermentation im Vergleich 2

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Unterschiede im Zellaufbau

Lactat Glucose

Atmungskette findet in den Mitochondrien statt- dadurch vermehrte Mitochondrien-Bildung

Höherer Anteil an ß-1,6-Glucan (verursacht langsameren Verdau) in der Zellwand◦ 50 min. bei 30°C mit Zymolyase

Fermentation findet im Endoplasmatischen Reticulum statt- dadurch vermehrte Mikrosomen-Bildung

Niedrigerer Anteil an ß-1,6-Glucan◦ 30 min. bei 30°C mit halber

Zymolyase-Menge

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Ablesen der Proteinmenge in der Messküvette aus gegebener Kalibrationskurve (c[µg/2,6mL] gegen Absorption)

Proteinbestimmung nach Lowry

Probe [µl] f E546 Blindwert E546

korr. Proteinmenge (Kalibration)

Protein [mg/mL]

Homogenat 15 10 0,212 0,088 0,124 25 16,67

Mitochondrien 15 2 0,221 0,088 0,133 26 3,47

Mikrosomen 15 5 0,231 0,088 0,143 29 9,67

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Benötigte Werte:

◦ Aktivität ([ΔE/min], entspricht

der Steigung), in dem Bereich,

in dem die Steigung maximal

ist!- umrechnen in Minuten

◦ Volumen der

Organellenfraktionen

◦ Proteinkonzentration in der

jeweiligen Fraktion

Markerenzymbestimmung

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.60

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

f(x) = 0.0174479876160991 x + 0.0550960533195735R² = 0.999601279646301

f(x) = 0.0234495337650324 x + 0.0792991322849214R² = 0.999659799676429

Aktivitätsbestimmung NCCR Homogenat

[min]

Ab

s

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Spezifische Aktivität [(ΔE/min)/mg]

Gesamtaktivität der Fraktion [ΔE/min]

Markerenzyme- Aktivitätsberechnungen

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Ausbeute

Anreicherungsfaktor

Kreuzkontamination

Markerenzyme- Reinheitsbestimmung

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Mittels Lambert-beer‘schem Gesetz Wellenlängenpaar λBasis/λMax zur Bestimmung von ΔE

Quantitative Cytochrombestimmung

λBasis/λMax [nm] ε [l/(mmol*cm)]

Cytochrom aa3 602/627 24,0

Cytochrom b 562/576 25,5

Cytochrom c/c1 550/533 19,2

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Bestimmung erfolgt über Differenzspektrum der α-Banden

ΔE…Extinktionsunterschied zw. λmax und λBasis

Cytochrom- Berechnung

ε Proteinkonzentration[mg/ml] Eλmax,α Ebasis ΔE c (Messlsg.)

[mmol/l]c (Mit.-Susp.)

[nmol/mg]

Cytochrom aa3 24 3,6590,012794

-0,00115 0,0139 5,810E-04 0,1588

Cytochrom b 25,5 3,6940,076551

0,047876 0,0287 1,125E-03 0,3044

Cytochrom c+c1 19,2 3,6590,088646

0,018298 0,0703 3,664E-03 1,0015

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Verdünnungen beachten

Einheiten

Taschenrechner

Schummelzettel

Nicht vergessen!

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Danke für die Aufmerksamkeit

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