Transcript of Protein- Interaktionsanalysen mittels Yeast-Two-Hybrid Assay Grundpraktikum Genetik.
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- Protein- Interaktionsanalysen mittels Yeast-Two-Hybrid Assay
Grundpraktikum Genetik
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- Analyse von Protein-Protein Interaktionen In vitro Methoden:
(Co-)Immunprzipitation (zwei interagierenden Proteinen im Lysat)
Affinittschromatographie (potentieller Interaktionspartner ist
immobilisiert) Cross-linking (chemische Verknpfung von Partnern)
Protein-probing (markiertes Protein beweist eine Bindung)
Phage-display (Suche nach Partner in einer Bibliothek) Protein-Chip
In vivo Methoden: Fluorescence energy transfer (FRET)
Hefe-Zwei-Hybrid Hefe-Tribrid-System Split-YFP
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- Saccharomyces cerevisiae 1996 Genomsequenz 1. sequenzierter
eukaryotischer Organismus ~ 12 Mb, 16 Chromosomen ~ 6000 Gene
biotechnologische Nutzung Modellorganismus Genetik, Biochemie,
Molekularbiologie Zellbiologie schnelles Wachstum, leicht zu
kultivieren leichte Isolierbarkeit, Charakterisierung von Mutanten
nicht pathogen stabiler haploider Zyklus transformierbar
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- Yeast-Two-Hybrid: GAL4 Transkriptionsfaktor keine Galaktose im
Medium: Galaktose im Medium: GAL80 bindet an AD von GAL4 GAL80/GAL4
Komplex bindet an UAS bindet an den Promtor Transkription der
GAL-Gene unterdrckt GAL4 bindet an Promotor Transkription der
GAL-Gene aktiviert
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- Yeast-Two-Hybrid: Prinzip X = Bait = Protein fr Identifikation
von Bindungs- partner X = Prey = Target fr Bait z.b. Bibliothek
!!!! Verwendete Hefe-Stmme haben ein mutiertes (defektes) Gal4
!!!!
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- Yeast-Two-Hybrid: Prinzip -Galactosidase ins Hefe-Genom
integriert
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- Auxotrophie und Prototrophie auxotroph: bezeichnet Organismen,
die bestimmte essentielle Substanzen nicht selbststndig
synthetisieren knnen prototroph: bezeichnet Organismen, die alle
bentigten organischen Wachstumsfaktoren (Aminosuren, Nukleotide,)
selbst synthetisieren knnen
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- Yeast-Two-Hybrid: Hefestmme a-Zelle a-factor, -Rezeptor -Zelle
-factor, a-Rezeptor Klassische(genetische) Nomenklatur: ARG
2Wildtyp Gen arg2Mutiertes Gen arg2-9Spezifische Mutation in Gen
arg2-Deletionsmutante ARG2::LEU2Disruptionsmutante Arg2pProtein
Arg+Arg prototroph Arg-Arg auxotroph
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- Folie 10
- Yeast-Two-Hybrid: Plasmide
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- Yeast-Two-Hybrid: Transformation Transformation: Hitzeschock
bei 42C LiAC: erhht Permeabilitt und DNA-Bindekapazitt der Zellwand
carrier DNA: bindet an die Zellwand (einzelstrngige DNA bindet
effektiver als doppelstrngige DNA) PEG: vermittelt Anlagerung des
Plasmids und der carrier-DNA an Hefezellen
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- Yeast-Two-Hybrid: Transformation Wichtig: Unter der Cleanbench
arbeiten Alle Lsungen und Platten nur unter der Bench ffnen
Berechnung der Plasmidmenge (1 g fr Trafo) Bsp.: 129 ng/l =
Miniprep 1000 ng 129 ng/l !! SD-Trp fr Stamm AH109 und
pGBKT7-constructs !! SD-Leu fr Stamm Y187 und GADT7-constructs =
7,75 l
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- Mating und Selecting 1 2 3 4 5 6 7 8 910 11 12 13 14 15 16
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- Testen auf Protein-Protein Interaktion
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- Mangelmedium SD-Leu-Trp-His: low stringency medium
Galaktosidase-Assay -Galaktosidase (MEL1): wird ins Medium
sekretiert MEL1 UAS schwacher Promotor -Galaktosidase (lacZ): wird
nicht sekretiert GAL1 UAS starker Promotor
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- Testen auf Protein-Protein Interaktion HIS3 Gen wurde in AH109
und Y187 durch eine spezifische Mutation ausgeschaltet aber:
schwache Hintergrundexpression von HIS3 falsch Positive 3AT: 3
Amino-1,2,4 triazol kompetiver Inhibitor des HIS3 Genproduktes
(Imidazolglycerol-Phosphat Dehydratase) !!! Selektives Medium ohne
Histidin ntig !!!
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- Analyse von Protein-Protein Interaktionen Yeast-Two-Hybrid
Analyse in S. cerevisiae Anwendungen: Interaktion zwischen Protein
1 und Protein 2 Interaktion zwischen Proteindomnen Rolle einzelner
Aminosurereste fr Interaktion Identifizierung von neuen
Interaktionspartnern
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- Vorteile/Nachteile des Yeast-Two-Hybrid Vorteile hoch sensitiv
in vivo (keine biochemische Reinigung der Proteine ntig,
postranslationale Modifizierungen) billig, robust Screening
Nachteile Interaktionsstelle durch AD/BD Domne verdeckt kann nur im
Zellkern der Hefe stattfinden richtige Faltung, Stabilitt der
Proteine in der Hefezelle abweichende posttranslationale
Modifizierungen in Hefe Protein ist toxisch fr Hefe
BD-Fusionprotein zeigen Interaktion (falsch Positive) zeitliche und
rumliche Expression der Proteine
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- MADS-BOX Domain Proteine MADSIKC DNA- binding Protein-protein
interaction Transcriptional activation
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- ABC Modell Arabidopsis thaliana A
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- ABCDE Modell Arabidopsis thaliana
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- Liriodendron tulipifera (tulip tree) Family: Magnoliaceae
Flower: Monoecious 9 tepals small genom size (784 Mbp) Habitat:
Eastern North America
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- Amborella trichopoda most basal angiosperm Family:
Amborellaceae small, evergreen unisexual flower : tiny, typically
about 4-8 mm 5 8 tepals wind and insect pollination Habitat: New
Caledonia A B A: female flower B: male flower
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- zu untersuchende Proteine Amborella trichopoda (AMTR) AMTR-AGL2
AMTR-PI AMTR-AG E function B function (GLO) C function Liriodendron
tulipifera (LITU) LITU-DEF1 LITU-AGL2 LITU-PI B function E function
B function (GLO)
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- Evolution des ABC-Models in Abhngigkeit von der Speziation der
Bltenpflanzen. se-Sepalen, pe-Petalen, st-Stamina, ca-Carpell
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- Protein- Interaktionsanalysen mittels Yeast-Two-Hybrid Assay 2.
Tag
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- Auswertung 1. Tag -Galactosidase Assay Kolonie-PCR
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- Auswertung 1. Tag Kolonien zhlen Wachstum? Was ist auffllig,
anders als die Erwartung?
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- Kolonie-PCR Primer fwd Primer rv PCR PCR-Produkt Gel
Zellaufschluss mit NaOH
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- Mastermix 1 x5,5 x (oder 6 x) Puffer 10 x5 l27,5 l dNTPs 2mM5
l27,5 l ddH 2 O34 l187 l Taq1 l5,5 l 45 l (final 50 l) Mischung
enthlt alle Komponenten um mehrere Reaktionen anzusetzen. Reduktion
der Pipettierarbeit und des Fehlers! Bsp: 5 Reaktionen
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- -Galactosidase Assay Indigo Farbstoff wird nicht sekretiert
Zellaufschluss mit Chloroform!!
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- -Galactosidase Assay Agarplatte Alufolie Chloroform Abdampfen
lassen !!! + Agar mit X-Gal 3h 24 h
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- Organisatorische Infos !!!!! Arbeiten mit Chloroform und EtBr
!!!!! 3 Freiwillige zum Gele gieen Mittagspause nach dem X-Gal Test
Praktikum Do und Fr Start pnktlich 8 Uhr Bitte das Skript
runterladen und LESEN!! Fragen beantworten!!! Klausur am Freitag 15
Uhr 16 Uhr