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Protein- Interaktionsanalysen mittels Yeast-Two-Hybrid Assay Grundpraktikum Genetik

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Analyse von Protein-Protein Interaktionen In vitro Methoden: (Co-)Immunprzipitation (zwei interagierenden Proteinen im Lysat) Affinittschromatographie (potentieller Interaktionspartner ist immobilisiert) Cross-linking (chemische Verknpfung von Partnern) Protein-probing (markiertes Protein beweist eine Bindung) Phage-display (Suche nach Partner in einer Bibliothek) Protein-Chip In vivo Methoden: Fluorescence energy transfer (FRET) Hefe-Zwei-Hybrid Hefe-Tribrid-System Split-YFP

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Saccharomyces cerevisiae 1996 Genomsequenz 1. sequenzierter eukaryotischer Organismus ~ 12 Mb, 16 Chromosomen ~ 6000 Gene biotechnologische Nutzung Modellorganismus Genetik, Biochemie, Molekularbiologie Zellbiologie schnelles Wachstum, leicht zu kultivieren leichte Isolierbarkeit, Charakterisierung von Mutanten nicht pathogen stabiler haploider Zyklus transformierbar

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Yeast-Two-Hybrid: GAL4 Transkriptionsfaktor keine Galaktose im Medium: Galaktose im Medium: GAL80 bindet an AD von GAL4 GAL80/GAL4 Komplex bindet an UAS bindet an den Promtor Transkription der GAL-Gene unterdrckt GAL4 bindet an Promotor Transkription der GAL-Gene aktiviert

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Yeast-Two-Hybrid: Prinzip X = Bait = Protein fr Identifikation von Bindungs- partner X = Prey = Target fr Bait z.b. Bibliothek !!!! Verwendete Hefe-Stmme haben ein mutiertes (defektes) Gal4 !!!!

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Yeast-Two-Hybrid: Prinzip -Galactosidase ins Hefe-Genom integriert

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Auxotrophie und Prototrophie auxotroph: bezeichnet Organismen, die bestimmte essentielle Substanzen nicht selbststndig synthetisieren knnen prototroph: bezeichnet Organismen, die alle bentigten organischen Wachstumsfaktoren (Aminosuren, Nukleotide,) selbst synthetisieren knnen

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Yeast-Two-Hybrid: Hefestmme a-Zelle a-factor, -Rezeptor -Zelle -factor, a-Rezeptor Klassische(genetische) Nomenklatur: ARG 2Wildtyp Gen arg2Mutiertes Gen arg2-9Spezifische Mutation in Gen arg2-Deletionsmutante ARG2::LEU2Disruptionsmutante Arg2pProtein Arg+Arg prototroph Arg-Arg auxotroph

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Yeast-Two-Hybrid: Plasmide

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Yeast-Two-Hybrid: Transformation Transformation: Hitzeschock bei 42C LiAC: erhht Permeabilitt und DNA-Bindekapazitt der Zellwand carrier DNA: bindet an die Zellwand (einzelstrngige DNA bindet effektiver als doppelstrngige DNA) PEG: vermittelt Anlagerung des Plasmids und der carrier-DNA an Hefezellen

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Yeast-Two-Hybrid: Transformation Wichtig: Unter der Cleanbench arbeiten Alle Lsungen und Platten nur unter der Bench ffnen Berechnung der Plasmidmenge (1 g fr Trafo) Bsp.: 129 ng/l = Miniprep 1000 ng 129 ng/l !! SD-Trp fr Stamm AH109 und pGBKT7-constructs !! SD-Leu fr Stamm Y187 und GADT7-constructs = 7,75 l

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Mating und Selecting 1 2 3 4 5 6 7 8 910 11 12 13 14 15 16

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Testen auf Protein-Protein Interaktion

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Mangelmedium SD-Leu-Trp-His: low stringency medium Galaktosidase-Assay -Galaktosidase (MEL1): wird ins Medium sekretiert MEL1 UAS schwacher Promotor -Galaktosidase (lacZ): wird nicht sekretiert GAL1 UAS starker Promotor

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Testen auf Protein-Protein Interaktion HIS3 Gen wurde in AH109 und Y187 durch eine spezifische Mutation ausgeschaltet aber: schwache Hintergrundexpression von HIS3 falsch Positive 3AT: 3 Amino-1,2,4 triazol kompetiver Inhibitor des HIS3 Genproduktes (Imidazolglycerol-Phosphat Dehydratase) !!! Selektives Medium ohne Histidin ntig !!!

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Analyse von Protein-Protein Interaktionen Yeast-Two-Hybrid Analyse in S. cerevisiae Anwendungen: Interaktion zwischen Protein 1 und Protein 2 Interaktion zwischen Proteindomnen Rolle einzelner Aminosurereste fr Interaktion Identifizierung von neuen Interaktionspartnern

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Vorteile/Nachteile des Yeast-Two-Hybrid Vorteile hoch sensitiv in vivo (keine biochemische Reinigung der Proteine ntig, postranslationale Modifizierungen) billig, robust Screening Nachteile Interaktionsstelle durch AD/BD Domne verdeckt kann nur im Zellkern der Hefe stattfinden richtige Faltung, Stabilitt der Proteine in der Hefezelle abweichende posttranslationale Modifizierungen in Hefe Protein ist toxisch fr Hefe BD-Fusionprotein zeigen Interaktion (falsch Positive) zeitliche und rumliche Expression der Proteine

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MADS-BOX Domain Proteine MADSIKC DNA- binding Protein-protein interaction Transcriptional activation

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ABC Modell Arabidopsis thaliana A

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ABCDE Modell Arabidopsis thaliana

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Liriodendron tulipifera (tulip tree) Family: Magnoliaceae Flower: Monoecious 9 tepals small genom size (784 Mbp) Habitat: Eastern North America

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Amborella trichopoda most basal angiosperm Family: Amborellaceae small, evergreen unisexual flower : tiny, typically about 4-8 mm 5 8 tepals wind and insect pollination Habitat: New Caledonia A B A: female flower B: male flower

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zu untersuchende Proteine Amborella trichopoda (AMTR) AMTR-AGL2 AMTR-PI AMTR-AG E function B function (GLO) C function Liriodendron tulipifera (LITU) LITU-DEF1 LITU-AGL2 LITU-PI B function E function B function (GLO)

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Evolution des ABC-Models in Abhngigkeit von der Speziation der Bltenpflanzen. se-Sepalen, pe-Petalen, st-Stamina, ca-Carpell

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Protein- Interaktionsanalysen mittels Yeast-Two-Hybrid Assay 2. Tag

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Auswertung 1. Tag -Galactosidase Assay Kolonie-PCR

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Auswertung 1. Tag Kolonien zhlen Wachstum? Was ist auffllig, anders als die Erwartung?

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Kolonie-PCR Primer fwd Primer rv PCR PCR-Produkt Gel Zellaufschluss mit NaOH

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Mastermix 1 x5,5 x (oder 6 x) Puffer 10 x5 l27,5 l dNTPs 2mM5 l27,5 l ddH 2 O34 l187 l Taq1 l5,5 l 45 l (final 50 l) Mischung enthlt alle Komponenten um mehrere Reaktionen anzusetzen. Reduktion der Pipettierarbeit und des Fehlers! Bsp: 5 Reaktionen

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-Galactosidase Assay Indigo Farbstoff wird nicht sekretiert Zellaufschluss mit Chloroform!!

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-Galactosidase Assay Agarplatte Alufolie Chloroform Abdampfen lassen !!! + Agar mit X-Gal 3h 24 h

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Organisatorische Infos !!!!! Arbeiten mit Chloroform und EtBr !!!!! 3 Freiwillige zum Gele gieen Mittagspause nach dem X-Gal Test Praktikum Do und Fr Start pnktlich 8 Uhr Bitte das Skript runterladen und LESEN!! Fragen beantworten!!! Klausur am Freitag 15 Uhr 16 Uhr