S. 1

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RRespirationespiration AActivityctivity MoMonitoringnitoring SSystemystem

Bioprozessoptimierung

S. 2

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Online – Bestimmung der Atmungsaktivitäten

(OTR, CTR, RQ)in Schüttelkolben

Bioprozessoptimierung

RRespirationespiration AActivityctivity MoMonitoringnitoring SSystemystem

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Das Tablar

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Anwendungsgebiete

Online-Verfolgung der Stoffwechselaktivitätvon pro- und eukaryotischen Kulturen in Schüttelreaktoren

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Einfache Ermittlung von Kenngrößen:

Sauerstofftransferrate (OTR)Kohlendioxidtransferrate (CTR)Respirationsquotient (RQ)maximale Wachstumsrate (µmax)volumetrischer Sauerstoffübergangskoeffizient (kLa)…,

die ein sicheres Scale–Up ermöglichen.

Anwendungsgebiete

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Unlimitiertes Wachstum auf Minimalmedium Sauerstofflimitierung

Produktinhibierung( z.B. pH, Temp.) Diauxie

Fermentationszeit

Sau

erst

offtr

ansf

erra

te

Fermentationszeit

Sau

erst

offtr

ansf

erra

te

Fermentationszeit

Sau

erst

offtr

ansf

erra

te

Fermentationszeit

Sau

erst

offtr

ansf

erra

te

maximale Sauerstoff-

transferkapazität

gesamterSauerstoffverbrauch[mol/l]

=

Substratlimitierung(außer C-Quelle)

Fermentationszeit

Sau

erst

offtr

ansf

erra

te

Schnelle Erkennung von charakteristischenbiologischen Phänomenen. OTR Verläufe:

Anwendungsgebiete

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Schnelle Erkennung von charakteristischenbiologischen Phänomenen.CTR-Verläufe:

Anwendungsgebiete

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Ermittlung geeigneter Bedingungen für daskonventionelle Massenscreening(Versuchsdauer, Medien, Betriebsbedingungen …)

Optimieren von Substratkonzentrationen undReduzierung der Entwicklungszeiten für Medien

Bilanzieren von Fermentationen (Toxizitäts- undProliferationsassays)

Wachstumskontrolle unter sterilen Bedingungen

Gezielte Probennahme nach der Sauerstofftransferrate

Qualitätskontrolle

Anwendungsgebiete

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Online-Abgasanalytik

gerührterBioreaktor

OTRCTRRQ

online

geschüttelterBioreaktor

Stand der Technik

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Motivation

„Die Nachteile des Schüttelkolbens als Experimentiersystem, sind die, dass der

Experimentator nur sehr begrenzte Möglichkeiten der Überwachung und

Regelung hat.“Payne et al., 1990

„Die Schwäche von small-scale Flüssigfermentationen:

diskontinuierliche Überwachung“Hilton, 1999

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Was wird gemessen?

Kohlenstoffquelle(Glutamin, Glucose, ...)

Stickstoffquelle(Ammonium, Harnstoff, Hefeextrakt, Pepton, ...)

Phosphorquelle(Phosphat, Phytin)

Schwefelquelle(Sulfat, Cystein, ...)

Spurenelemente, Vitamine

Kohlendioxid

Sauerstoff

Produkt(Alkohol, Proteine, Aminosäuren, ...)

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Unbekannter Fermentationsverlauf

?Zeit

Kulturverlauf

Versuchsende

A

B

Normaler Schüttelkolben:

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BekannterFermentationsverlauf

B

A

Zeit

Kulturverlauf

Versuchsende

A

B

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bestimmt online die Atmungsaktivitäten (OTR, CTR, RQ)

von aeroben Mikroorganismenin Schüttelkolben unter sterilen

Bedingungen

Lösung

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Klare Vorteile

Mehr Informationen über die mikrobiologischenProzesse im Schüttelkolben

Schnelle Charakterisierung und gezielte Optimierung von Medien

Ersetzt teure Versuche im Fermenter

Paralleltechnik (Zeit, Vergleichbarkeit, …)

Schafft optimale Screeningbedingungen

Erkennung des optimalen Inokulierungszeitpunktes

Quasi-Non-Stop-Betrieb durch sehr kurze Rüstzeiten

Reduzierung der Versuchsdauer auf die tatsächlicherforderliche ZeitUnterscheidung betriebsbedingter und biologischer Effekte

Einfache Handhabung

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Messkolben

S. 1

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Beispielfermentationen

Tierische Zellkultur Hybridoma (50 mL Kulturvolumen)

Ermittlung der optimalen Inokulierungs– und Fed-Batch– Startzeit

Fermentationszeit [h]

OTR

/CTR

[m

ol/(

L·h)

]

Zelld

icht

e [N

/mL]

0 50 100 150 200

OTRCTRZelldichte

Glutamin- undGlucoseverbrauch Glucoseverbrauch

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E

Medienoptimierung am Beispiel: Osmolalitätsoptimum

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0,22 0,24 0,26 0,28 0,3 0,32 0,34 0,36 0,38

Wac

hstu

msr

ate

µ [h

-1]

Osmolalität [osmol/kg]

Das Osmolalitätsoptimumliegt bei 0,318 osmol/kg

Beispielfermentationen

Tierische Zellkultur Hybridoma (50 mL Kulturvolumen)

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Tierische Zellkultur Hybridoma

Vergleich von RAMOS mit einem Rührkesselfermenter mit Abgasanalytik

Fermentationszeit [h]Fermentationszeit [h]

OTR

[m

ol/(

L·h)

]

0 20 40 60 80

Rührkesselfermenter (2 Liter Kulturvolumen)RAMOS (0,05 Liter Kulturvolumen)

Dipl.-Ing. M. Canzoneri

Beispielfermentationen

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Bakterium Corynebacterium glutamicum

Einfluss verschiedener Flüssigkeitsvolumina

Fermentationszeit [h]

Kolben 1 : 10 mLKolben 2 : 15 mLKolben 3 : 20 mLKolben 4 : 30 mLKolben 5 : 40 mLKolben 6 : 50 mL

Sauerstofflimitierung

OTR

[m

ol/(

L·h)

]

Beispielfermentationen

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Einfluss verschiedenerSubstratkonzentrationen

Bakterium Pseudomonas fluorescensO

TR [

mol

/(L·

h)]

1x konzentriert2x konzentriert4x konzentriert

Fermentationszeit [h]

Beispielfermentationen

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Medium- und Prozessoptimierung

OTR

[m

ol/(

L·h)

]

Fermentationszeit [h]

Medium mit 100% Komp. 1,30 mL FlüssigkeitMedium mit 200% Komp. 1,30 mL FlüssigkeitMedium mit 200% Komp. 1,20 mL Flüssigkeit

Hefe Hansenula polymorpha

Beispielfermentationen

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Tierische Zellkultur Hybridoma

Zellwachstum innerhalb eines RAMOS-Versuchs

Beispielfermentationen

Dipl.-Ing. M. Canzoneri

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Tierische Zellkultur Hybridoma

Zellwachstum innerhalb eines RAMOS-Versuchs

Fermentationszeit [h]Fermentationszeit [h]

Zelld

icht

e [N

/ml]

0 40 80 120 160

8-fach Parallelmessung

Beispielfermentationen

Dipl.-Ing. M. Canzoneri

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Handhabungsvorteile

Geringer Platzbedarf –RAMOS passt auf einen normalen Labortisch

Einfaches und schnell erlernbares Handling

Komplett automatisierte Anwendersoftware

Quasi-Non-Stop-Betrieb durch sehr kurze Rüstzeiten

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Bedienoberfläche

S. 2

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Kolbenübersicht

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Sauerstofftransferrate (OTR)

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Detailansicht für jedeneinzelnen Kolben (OTR, CTR, RQ)

lag-Phase

Sauerstofflimitierung

C-Quelle (Glucose)verbraucht

Ethanol verbrauchtexp-Phase

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O2-, CO2 - Transfer

Sauerstofftransfer (OT) Kohlendioxidtransfer (CT)

Bilanzierung des gesamtenSauerstofftransfers über den Fermentationsverlauf

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Wachstumsrate µ

maximale Wachstumsrate µmaximale Wachstumsrate µ

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OTR CTR

Bringen Sie Licht in Ihre ProzesseBringen Sie Licht in Ihre Prozesse

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Wirtschaftlichkeitsbetrachtung

Optimierung der Fermentationszeit

Amortisationszeit: ca. 6 Monate

OTR

[m

ol/(

L·h)

]

Fermentationszeit [h]

Medium mit 100% Komp. 1,30 ml Flüssigkeit

Medium mit 200% Komp. 1,30 ml FlüssigkeitMedium mit 200% Komp. 1,20 ml Flüssigkeit

Zusatznutzen: Vermeidung von Fehloptimierungen

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Zellkultur (Hybridoma)• Dosierung

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FTT® Fluid-Train System• Dosierung und Probenahme

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FTT® Fluid-Train System• Geregelte Dosierung

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● Bestimmung von RQ durch OUR, CER online Messungen● exakte Fütterung der Kulturen● signifikant erhöhte Produktionsrate● Verkürzung der Fermentationszeiten

RQFeed™

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● Reproduzierbare biomechanische Messung● Personalisierte Medikamenten- und Toxinforschung ● Ersatz für Tierversuche● Integrierte, vollautomatische und heißsterilisierbare Pipettiereinheit● 24 - 96 Multiwell Einheit mit integrierter Sensorik

CellDrum™ - Zellkraftmessung

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● 1 bis 8(5) Messkanäle für 1 bis 4 Fermenter● Hochauflösende Messung (-c Version)● Feuchtekorrektur (-c Version)● „Echte“ OUR, CER und RQ Messung (-c Version)● Geringe Querempfindlichkeit● Überdruck möglich● Verschleißfreie Sensorik● Kompakt● Zusatzfunktionen integrierbar● Opt. frei programmierbar● Viele Kopplungsmöglichkeiten ● Datenexport möglich

HiSense™ - Präzisionsabgasanalytik

S. 4

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Zellkultur (Hybridoma)• Ohne Dosierung

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Zellkultur (Hybridoma)• Dosierung auf OTR geregelt ab RQ < 1

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Zellkultur (Hybridoma)• Dosierprogramm

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Zellkultur (Hybridoma)• Parametrierung der Probenahme

S. 4

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Kooperationen und VeröffentlichungenKooperationen:

Veröffentlichungen:Anderlei T., Büchs J., Device for sterile online measurement of the oxygen transferrate in shaking flasks, Biochem. Eng. J. 7(2), 157-162, 2001 Stöckmann Ch., Maier U., Anderlei T., Knocke Ch., Gellissen G., Büchs J.,The Oxygen Transfer Rate as Key Parameter for the Characterisation of Hansenula polymorphaScreening Cultures, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 30, 613-622, 2003 Anderlei T., Zang W., Büchs J., Online respiration activity measurement (OTR, CTR, RQ)in shake flasks, Biochem. Eng. J. 17(3), 187-194, 2004 Lotter St., Büchs J. Utilization of power input measurements for optimisation of cultureconditions in shaking flasks, Biochem. Eng. J. 17(3), 195-204, 2004 Losen M., Lingen B., Pohl M., BüchsJ., Effect of oxygen-limitation and medium compositionon Escherichia coli in small-scale cultures, Biotechnol. Progress. (accepted)

Fachhochschule Aachen, Abteilung JülichLabor für ZellkulturtechnikProf. Dr. Manfred Biselli

Technische Hochschule Aachen,Lehrstuhl für BioverfahrenstechnikProf. Dr.-Ing. Jochen Büchs