WesternWestern--Analyse Analyse ProteinProtein--Elektrophorese Elektrophorese

ELISA ELISA ProteinProtein--ChipChip

DNADNA--RNARNA--ProteinProtein

Die Struktur der DNADie Struktur der DNA

Ebene der Proteinstruktur Ebene der Proteinstruktur

DieDieGruppenGruppen

derderAminoAmino--ssääurenuren

Darstellung RDarstellung Rääumliche umliche Proteinstrukturen (RProteinstrukturen (Rööntgenntgen--

Krystallographie)Krystallographie)

• Lyse der Zellen/Gewebe(Detergens, Mechanisch; Hemmung der Proteasen)(Detergens, Mechanisch; Hemmung der Proteasen)•• Aufreinigung Aufreinigung (Zentrifugierung, Chromatographie)(Zentrifugierung, Chromatographie)•• Probevorbereitung Probevorbereitung ••(H(Häängt von Zwecken ab; Elektrophorese: nativngt von Zwecken ab; Elektrophorese: nativ--denaturierend; denaturierend; EnzymaktivitEnzymaktivitäät; Proteomik: 2t; Proteomik: 2--DD--Elektrophorese) Elektrophorese)

Proteinisolierung und AufreinigungProteinisolierung und Aufreinigung

AntigenAntigen--AntikAntiköörperrper

Antigen: Fremdes Material, welches Wirbeltiere erkennen und dagegen die B-Zellen des Immunsystems hochspezifische Antikörper bilden. „Stärke” der Antigene: Proteine> Polysaccharide > Lipide > Nukleinsaure.

Antikörper: Proteine, die aus schwere- und leichte Ketten bestehen. Antikörper bilden spezifische Bindung mit dem Antigen. Nach der Immunisierung kann man sie aus dem gamma-Globulin-Fraktion des Blutserum isolieren.

Antikörper-Klassen

Kinetik der AntikKinetik der Antiköörperbildungrperbildung

Erzeugung monoklonaler Antikörper

Die auf AntigenDie auf Antigen--AntikAntiköörperrper--Bindung Bindung gegrgegrüündeten Verfahrenndeten Verfahren

Direktes VerfahrenPrimärer Antikörper trägt ein konjugiertes Protein, welches Detektierung ermöglicht

Indirektes VerfahrenDer sekundäre Antikörper erkennt die schwere Kette des primären Antikörpers und trägt konjugierten Teil (Enzym, fluoreszierende Verbindung) für Detektierung

Affinität-Verfahren („sandwich”)Kovalent-Bindung des primaren Antikörpers an Träger Chromatographie der Antigen-Lösung – BindungElution des Antigens/Detektierung mit markierten Antikörper

Detektierung AntigenDetektierung Antigen--AntikAntiköörper rper BindungBindung

Chromogener Substrat,Farbreaktion

Fluorochrom Markierung,Fluoreszenz-Entstehung

Die WesternDie Western--Analyse Analyse

Während Western-analyse detektieren wira. Die Grösse des Proteins (kD)b. Die Konzentration des Proteins

PolyPoly--AkrylamidAkrylamid--GelelektrophoreseGelelektrophorese

Vorbereitung der Probe: Denaturierung und Reduzierung mit SDS und -Merkapto-Ethanol, 3-5 Min, 90 oCPolyakrylamid-Gelelektrophorese (Sammler-Gel, Trennung-Gel)Elektrischer Transfer der Proteine auf Nitrozellulose (bindetProteine mit hocher Affinität)A Kontrolle des Transfers (Färbung, Ponceau-red)

Polymerisierung von AkrylamidPolymerisierung von Akrylamid

Achtung: Toxisch!!!!

Denaturierung von Proteine mit SDSDenaturierung von Proteine mit SDS

SDS kezelés előtt

SDS kezelés után

Töltéssel rendelkezőrészek

Hidrofób részek

Betain-Struktur,Zwitterion

Einheitlich negativ-geladenes Protein

Vertikale GelelektrophoreseVertikale Gelelektrophorese

FFäärbung getrennter Proteinerbung getrennter Proteine

Farbstoff fFarbstoff füür Fr Fäärbungrbung

WesternWestern--AnalyseAnalyse

MembranMembran--Blockierung Blockierung

GesGesäättigung unspezifischer Proteinttigung unspezifischer Protein--Bindungsstellen mit Kasein oder BSABindungsstellen mit Kasein oder BSA

Inkubierung mit dem primInkubierung mit dem primäären Antikren Antiköörper rper Erkennung spezifischer Bindungsstellen Erkennung spezifischer Bindungsstellen 3x Waschen3x Waschen

Inkubierung mit dem sekundInkubierung mit dem sekundäären Antikren Antiköörperrperz.B. horsez.B. horse--raddish (Meerretich)raddish (Meerretich)--PeroxidasePeroxidase--Konjugat (HRP)Konjugat (HRP)3x Waschen 3x Waschen

DetektierungDetektierungAlkalische Phosphatase, HRP, ECL (Chemilumineszenz) Alkalische Phosphatase, HRP, ECL (Chemilumineszenz)

ElektroElektro--TransferTransfer

ElektroElektro--TransferTransfer

Kontrolle des Protein-Transfers: Ponceau-Färbung

Ergebnis der WesternErgebnis der Western--AnalyseAnalyse

Ponceau: Färbt alle Proteine; Antikörper

markiert das

Zielprotein

ECLECL--DetektierungDetektierung

Substrat fSubstrat füür Alkalische Phosphataser Alkalische Phosphatase

Bestimmung LymeBestimmung Lyme--Erkrankung mithilfe Erkrankung mithilfe WesternAnalyseWesternAnalyse

Zecke - Borrelia burgdorferi - bakterielle Proteine aus Blutserum

Beispiel für Lyme-Erkrankung

Proben:1: Molekulargewicht-Marker 2-3: Lyme-positiv-Sera 4-7: Diskriminierungsantikörper8: Positive Kontrolle

Bestimmung DystrophinBestimmung Dystrophin--ProteinProtein

ProteinProtein--ChipChip

LigandLigand--ChipChip: Mit spezifischer Antigen: Mit spezifischer Antigen--AntikAntiköörperrper--Bindung; ExpressionsmusterBindung; Expressionsmuster--Bestimmung auf ProteinBestimmung auf Protein--Ebene Ebene

(DNA(DNA--Chip: Hybridisierung)Chip: Hybridisierung) AntikAntiköörperrper--Bindungen auf GlassBindungen auf Glass--OberflOberfläächeche Anwendung: Forschung, DiagnoseAnwendung: Forschung, Diagnose

ProteinProtein--Chip:Detektierung AntigenChip:Detektierung Antigen--AntikAntiköörper Wechselwirkungenrper Wechselwirkungen

Muster von HefeproteineMuster von Hefeproteine

ChipChip--Automatisierung Automatisierung

ELISAELISA--VerfahrenVerfahren

ELISAELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay, (Enzyme Linked Immunosorbent Assay, EnzymEnzym--gekoppeltesgekoppeltes--ImmunosorbenzImmunosorbenz--Verfahren)Verfahren)

Antigen wird auf festen TrAntigen wird auf festen Trääger (Mikrotiterger (Mikrotiter--Platte) Platte) gebunden gebunden

Reaktion mit Serum der Patienten nach Reaktion mit Serum der Patienten nach VerdVerdüünnungennnungen

Anwendung: Klinische Labordiagnose Anwendung: Klinische Labordiagnose Bestimmung von Bakterien, Viren, Hormone, usw. Bestimmung von Bakterien, Viren, Hormone, usw.

Die in ELISA angewandten Enzyme Die in ELISA angewandten Enzyme und Substrateund Substrate

Enzyme

Meerettichperoxidase (HRP)Alkalische Phosphatase (AP)

(Konjugiert mit dem AK)

Substratmoleküle

3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (HRP)3,5-Dichloro-2-hydroxybenzenesulfonic acid (HRP)

5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl phosphate, BCIP (AP)Indoxyl phosphate (AP)

AP-BCIP-Farbreaktion

ELISAELISA--ReaktionReaktion

Quantitative Ergebnisse von ELISA

Positive Kontrolle

Negatíve Kontrolle Patient A

PatientB

Patient C

Test-Kontrolle

1.689 0.153 O.055 0.412 1.999 0.123

ELISA-Platte

(Mikrotiterplatte)

Semiquantitative BildanalyseNach der Gelseparation von Proteine und Nukleinsären kann aus der Densität des Bandes (summierung der grauheitsstufen der Bildpunkte) auf dem grauen Gelbild eine quantitative Information gewonnen werden.

Densität auf einem Pixel: Grauheitswert auf einem Pixel.

32 stufiger Durchgang

8 bit (256 Farben) Durchgang

255 Wert = schwarz 0 Wert= weiss

16 bit Graumatrix

Analyse der farbigen Aufnahmen geschieht aufgrund der Aufteilung auf

RGB Farben

RotRot

GrGrüünn

BlauBlau

Densitometrische Analyse des Gelbildesa) Profila) Profil b) Flb) Fläächenanalysechenanalyse

Ablauf: Wir stellen das Querschnittprofil des Bandes her, mit der Subtraktion der Grunddensität des Gels kann aus der Flächengrösse unter der Kurve eine quantitative Schlussfolgerung gezogen werden. (Intensität/Pixel)

Wir markieren ein, von dem Band etwas grösseren Gebiet. Wir bestimmen die Densitätsumme der Pixeln mit Grundintensität, welche aus der Summe der Pixeldensitätwerte des aktuellen Bandes subtraktiert wird