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Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae dentariae (Dr. med. dent.)
Vorgelegt dem Rat der Medizinischen Fakultät der
Friedrich-Schiller-Universität Jena
von Shokoufeh Gawellek
geboren am 30. März 1971 in Shahroud
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2.1. Aufbau des Varicella-Zoster-Virus sowie Unterschiede zwischen
Wild- und Impftyp-Viren 3
2.2. Erkrankungen durch das Varicella-Zoster-Virus sowie Diagnostik
und Therapie 8
2.3. Varizellenimpfung 14
2.4. Aufgabenstellung 18
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3.1. Untersuchungsmaterialien 19
3.1.1. Materialien von Patienten 19
3.1.2. Varicella-Zoster-Virus-Prototypstämme 23
3.2. Zellkulturen 24
3.3. Virusanzüchtung 25
3.4. Virustypisierung 25
3.5. DNA-Präparation 26
3.6. Virus-DNA-Nachweis mittels Polymerasekettenreaktion 29
3.7. Restriktionsenzymanalyse 32
3.7.1. DNA-Quantifizierung mittels Spektrophotometrie 32
3.7.2. Enzymverdau der Amplifikate mit Restriktionsendonukleasen 33
3.8. Darstellung der viralen DNA mittels Agarosegelelektrophorese 34
3.9. Statistische Analyse der Untersuchungsergebnisse 36
3.10. Rezepturen 36
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4
4.1. Varicella-Zoster-Virus-Gene 38 und 54 39 4.2. Varicella-Zoster-Virus-Gen 38 43
4.3. Varicella-Zoster-Virus-Gen 62 46
4.4. Zusammenfassung und Vergleich der Ergebnisse zur Genotypisierung
des Varicella-Zoster-Virus 50
4.5. Ergebnisse der Genotypisierung in Bezug zur klinischen Diagnose und 52
dem Alter der Patienten
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Literatur
Danksagung
Lebenslauf
Ehrenwörtliche Erklärung
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9HU]HLFKQLV�YHUZHQGHWHU�$EN�U]XQJHQ�
AE - Elutionspuffer
AIDS - Acquired immunodeficiency syndrome
AL - Lysispuffer AW 1 - Waschpuffer I
AW 2 - Waschpuffer II
%JOI - Restriktionsendonuklease %JOI bp - Basenpaare
cpE - cytopathischer Effekt
&3*� � �� &RQWUROOHG�SRUH�JODVVHV�DNA - Desoxyribonukleinsäure
dNTP - Desoxynucleotidtriphosphat
E - Early
FITC - Fluoreszeinisothiozyanat
gp - Glykoprotein
HELF - Humane embryonale Lungenfibroblasten
HSV - Herpes-simplex-Virus
IE - Immediate early
IRL - Internal repeats long
IRS - Internal repeats short
i.v. - intravenös
L - Late
LCAA - Long chain allcylamin
MGS - Molekulargewichtsstandard
Oka-Virus - VZV, von dem die Varizellenimpfstoffe abgeleitet sind, bezeichnet mit dem Namen des Kindes, von dem das Virus isoliert wurde
ORF - Open reading frame
PBS - Phosphate buffered saline
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3VWI - Restriktionsendonuklease 3VWI PZN - Postzosterische Neuralgie RFLP - Restriction fragment length polymorphism RNA - Ribonukleinsäure
6
6PD,� � �� 5HVWULNWLRQVHQGRQXNOHDVH�6PD,�7%(� � �� 7ULV�%RUDW�('7$�3XIIHU�TE - Tris-HCl-EDTA-Puffer
TRL - Terminal repeats long
TRS - Terminal repeats short
UL - Unique long
US - Unique short
UV - Ultraviolett
VZV - Varicella-Zoster-Virus
ZNS - Zentralnervensystem
7
��� =XVDPPHQIDVVXQJ�Varizellen gehören in Deutschland zu den häufigsten impfpräventablen
Infektionskrankheiten. Mit der Einführung der allgemeinen Varizellenimpfung unter
Verwendung eines attenuierten Lebendimpfstoffes ist es aus epidemiologischen
Gründen zukünftig erforderlich, eine Surveillance zirkulierender Varicella-Zoster-Virus
(VZV)-Stämme durchzuführen. Die Unterscheidung von Wild- und Impftyp-Viren
erweist sich auch als notwendig, um die Ursache auftretender Impfkomplikationen in
Form von Varizellen oder Zoster beurteilen zu können. Bisherige Erfahrungen
belegen, dass eine zweifelsfreie Unterscheidung von Wild- und Impftyp-Viren nur
mittels Charakterisierung genetischer Marker möglich ist.
Aufgabe der vorliegenden Promotionsarbeit war es, VZV-Isolate sowie VZV-DNA-
positive Untersuchungsmaterialien von Patienten mit Varizellen oder Zoster mittels
molekularbiologischer Verfahren zu typisieren. Dabei wurde vorrangig eine
Unterscheidung zwischen Wild- und Impftyp-Viren angestrebt. Ausgehend von
diesen Experimenten sollten methodische Fragen sowie die Verteilung bestimmter
Genotypen des VZV abgeklärt werden.
Methodisch wurden mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) und nachfolgender
Restriktionsenzymanalyse DNA-Fragmente der offenen Leserahmen (ORF) 38, 54
und 62 des VZV-Genoms charakterisiert. Für die Untersuchungen standen 53 VZV-
Isolate sowie zur Prüfung der direkten molekularen Typisierung 73 VZV-DNA-positive
Proben von Patienten mit VZV-Infektionen zur Verfügung.
Im Ergebnis der Untersuchungen wurden alle 53 VZV-Isolate genetisch typisiert.
Mittels direkter Genotypisierung der viralen DNA in den Patientenproben wurden 63
der 73 Materialien (86,3%) charakterisiert, wenn Primer der ORF 38 und 54
eingesetzt wurden. Im Vergleich dazu erbrachte die PCR zur Amplifikation des Gens
62 in 59 Fällen (80,8%) positive Ergebnisse, die sich mittels nachfolgender
Verdauung durch Endonukleasen weiter spezifizieren ließen. Diese Ergebnisse
belegen, dass die Verwendung von Virusisolaten für die Genotypisierung des VZV
als Methode der Wahl anzusehen ist.
Als dominanter Genotyp wurde der Wildtyp 3VWI+ %JOI¯ bei 93,1% aller Patienten mit
einem Durchschnittsalter von 47 Jahren nachgewiesen. 90,7% dieser Patienten
hatten einen Zoster, und 9,3% waren an Varizellen erkrankt. Diese Befunde
entsprechen den bereits publizierten Ergebnissen in den USA und Großbritannien.
8
Bei 6% aller Patienten mit einem Durchschnittsalter von 14 Jahren ließ sich der
Wildtyp 3VWI+ %JOI+ nachweisen. Fünf dieser Patienten entwickelten Varizellen und
zwei erkrankten an einem Zoster. Im Vergleich zu diesen Ergebnissen wurde in den
USA und in Großbritannien bei ca. 20% aller Wildtyp-Stämme eine %JOI-Schnittstelle
im ORF 54 gefunden. Da diese Stämme in Großbritannien vor allem bei Immigranten
aus tropischen Ländern nachweisbar waren, könnten diese Resultate aus einem
wesentlich geringeren Anteil an Einwanderern aus diesen Gebieten in Deutschland
resultieren. Allerdings kann der gehäufte Nachweis von %JOI+-Stämmen bei Varizellen
auf eine Zunahme dieses Genotyp in den kommenden Jahren hindeuten.
Nur bei einem Patienten wurde der Oka-Impftyp 3VWI¯ %JOI+ gefunden. Dies reflektiert
die bislang relativ seltene Durchführung der Varizellenimpfung in Deutschland. Der
Oka-Stamm wurde bei einem Kind nachgewiesen, das 16 Monate nach
Varizellenimpfung an einem Zoster erkrankte. Zoster-Erkrankungen nach Impfung
sind in der Literatur bislang selten dokumentiert worden. Das Zoster-Risiko bei
Impflingen soll erhöht sein, wenn nach Impfung ein Befall der Haut als
impfbegleitender Rash oder in Form milder Varizellen auftritt.
Die eingesetzten Methoden erlauben eine zuverlässige Genotypisierung des VZV.
Eine gemeinsame Charakterisierung der ORF 38/54 gestattet die Unterscheidung
von europäischen und nordamerikanischen Wildtyp-Isolaten von Oka-ähnlichen Wild-
oder Impftyp-Stämmen sowie eine Analyse des %JOI-Polymorphismus. Nur mittels
Charakterisierung des ORF 62 ist eine universelle Unterscheidung von VZV-Wild-
und Impftyp-Stämmen auch unter Einschluss japanischer Oka-ähnlicher Wildtyp-
Isolate möglich.
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XQG�,PSIW\S�9LUHQ�Das VZV zählt neben dem Herpes-simplex-Virus (HSV) Typ 1 und 2, dem Epstein-
Barr-Virus, dem Zytomegalievirus und den Humanen Herpesviren 6, 7 und 8 zur
Familie der Herpesviridae. Es ist ein ubiquitär vorkommendes Virus, welches als
Primärinfektion die Varizellen und als endogenes Rezidiv den Zoster hervorruft.
Innerhalb der Familie der Herpesviridae wird das VZV zusammen mit dem HSV in die
Unterfamilie Herpesvirinae eingeordnet.
Das VZV ist der kleinste Vertreter der humanpathogenen Herpesviren. Die Größe
des Genoms beträgt ca. 125.000 Basenpaare (bp). Es besteht aus einer
doppelsträngigen DNA, die eine lange (UL) und eine kurze (US) Untereinheit bildet
und von internalen (IRS, IRL) und terminalen (TRS, TRL) repetitiven Regionen flankiert
wird. Das VZV-Genom kodiert für mindestens 30 Polypeptide. Umgeben wird die
DNA von einem isometrisch aufgebauten Kapsid aus 162 Kapsomeren sowie dem
glykoproteinhaltigen Tegument. Nach außen wird das Virus durch eine dreischichtige
glykoprotein- und lipidhaltige Hülle umschlossen (Abb. 1). Der Durchmesser des VZV
beträgt etwa 200 nm.
Abb. 1: Aufbau des VZV (modifiziert nach einer Darstellung von Rahaus et
al. 1999)
A: Schematische Darstellung des Virusaufbaus B: Aufschnitt-Darstellung der Glykoprotein-Spikes C: Elektronenmikroskopische Aufnahme des VZV
10
Bis heute wurden mindestens 71 ORF des VZV-Genoms identifiziert und über 70
RNA-Transkripte in infizierten Zellen nachgewiesen. Die VZV-DNA besitzt zahlreiche
Sequenzhomologien mit der DNA des HSV, was bei der Primerauswahl für die PCR
und bei der Durchführung von Hybridisierungsexperimenten berücksichtigt werden
muss. Wie bei den übrigen Vertretern der Herpesviren werden in virusinfizierten
Zellen „immediate early“ (IE)-, „early“ (E)- und „late“ (L)-Gene transkribiert. In VZV-
infizierten Zellen können mehr als 30 viruskodierte Polypeptide mit einer Molmasse
von 16,5 bis 200 Kilodalton nachgewiesen werden. Zu ihnen gehören sechs
Glykoproteine (gpI - gpVI). GpI, II und III tragen neutralisierende Epitope, gpI und II
sind außerdem für die zellvermittelte Immunantwort von Bedeutung. Typisch für das
VZV ist, dass es sich nahezu ausschließlich in Zellen repliziert, die vom Menschen
oder Affen stammen.
Vom VZV ist nur ein Serotyp bekannt. Zwischen verschiedenen VZV-Isolaten
konnten nur geringe antigene Unterschiede festgestellt werden. 1974 gelang es der
japanischen Arbeitsgruppe um Takahashi, einen VZV-Lebendimpfstoff zu entwickeln
(Takahashi et al. 1974). Ausgangsvirus war ein japanischer VZV-Wildtyp-Stamm, der
von einem 3-jährigen Windpockenpatienten mit dem Familiennamen Oka isoliert
wurde. Von diesem VZV-Stamm Oka leiten sich sämtliche VZV-Lebendimpfstoffe ab,
die derzeit weltweit verfügbar sind. Impf- und Wildtyp-Stämme vom VZV
unterscheiden sich in ihren biologischen Charakteristika und in den klinischen
Manifestationen der Infektion. Die biologischen Eigenschaften, die für den
Impfstamm beschrieben wurden, reflektieren z.T. die Methode, die gebraucht wurde,
um den Wildtyp-Stamm in ein Impfvirus zu überführen. So wurde eine Attenuierung
vorwiegend durch serienmäßige Kultivierung in humanen embryonalen
Lungenfibroblasten (HELF) bei 34°C sowie durch Passagierung in embryonalen
Fibroblasten vom Meerschweinchen erreicht (Takahashi et al. 1985). Als Ergebnis
bildet der Impftyp-Stamm Oka bei 39°C kleinere Plaques in HELF und vermehrt sich
besser bei 34°C. Im Gegensatz zu Wildtyp-Stämmen lässt sich der Oka-Stamm in
embryonalen Meerschweinchenfibroblasten anzüchten (Takahashi et al. 1974). Bei
einer Infektion mit Wildtyp-Stämmen resultieren Varizellen, die häufig auf
empfängliche Kontaktpersonen übertragen werden können. Die Primärinfektion mit
dem Wildtyp-VZV führt regelmäßig zur Latenz in sensorischen Ganglien, wobei nach
endogener Virusreaktivierung der Zoster entsteht. Eine Infektion mit dem Impftyp-
Virus resultiert primär in der Bildung einer schützenden Immunantwort. Gelegentlich
11
führt sie zu den sog. Impfvarizellen, die nur selten auf empfängliche Kontaktpersonen
übertragen werden. Im Vergleich zum Wildtyp-Virus kommt es beim Impftyp-Virus
wesentlich seltener zur Latenz und zum Zoster (LaRussa und Gershon 2001).� Bezüglich des Genomaufbaus konnten in den letzten beiden Jahrzehnten mit
molekularbiologischen Methoden Fortschritte bei der Typisierung bzw.
Unterscheidung von Virus-Isolaten erzielt werden. Durch Analyse der viralen DNA
mittels Restriktionsendonukleasen wurde der endgültige Beweis dafür erbracht, dass
Windpocken und Gürtelrose durch den gleichen Erreger verursacht werden (Straus
et al. 1984). 1986 konnte die VZV-DNA als erstes Herpesvirusgenom durch Davison
und Scott (1986) komplett sequenziert werden, so dass Sequenzvergleiche für
weitere Studien möglich wurden. Dabei zeigte sich, dass zahlreiche genomische
Differenzen sowohl zwischen Wildtypen des VZV als auch zwischen Wildtyp-Viren
und dem Impftyp-Virus bestehen (LaRussa et al. 1992; Muir et al. 2002). Eine
ausgeprägte genetische Divergenz zwischen Wild- und Impftyp-Viren ist vor allem für
ORF 62 belegt (Gomi et al. 2001, Gomi et al. 2002). Dies führte zur Annahme, dass
das IE-Gen 62 mit hoher Wahrscheinlichkeit für die Veränderungen des VZV-Impftyp-
Virus bezüglich Replikation und Attenuierung verantwortlich ist. Obwohl sich
deutliche biologische Unterschiede zwischen VZV-Oka- und Wildtyp-Stämmen
nachweisen lassen, gelingt eine zweifelsfreie Unterscheidung nur mittels Analyse des
VZV-Genoms. In den vergangenen Jahren wurden zahlreiche molekulare Methoden
zur Genotypisierung des VZV eingesetzt. Die Mehrzahl dieser Verfahren wurde in
Japan und den USA entwickelt. Wesentliche Methoden basieren auf der Amplifikation
mittels PCR und nachfolgender Restriktionsenzymanalyse von DNA-Fragmenten der
ORF 38, 54, 62 sowie der R5 repeat region (Abb. 2) (Adams et al. 1989, LaRussa et
al. 1992, Hawrami et al. 1996, LaRussa et al. 1998, Loparev et al. 2000, Sauerbrei et
al. 2003a). Die Ergebnisse bisheriger Untersuchungen reflektieren geographische
Differenzen bezüglich der Verteilung unterschiedlicher VZV-Genotypen.
In den USA und in Großbritannien lassen sich alle Wildtyp-Stämme durch eine
Schnittstelle mit dem Restriktionsenzym 3VWI im Gen 38 von VZV-Oka unterscheiden
(Abb. 3), der diese Schnittstelle nicht aufweist (Hawrami und Breuer 1997, Gershon
et al. 1999). Bezieht man auch ORF 54 in die Untersuchungen ein (Abb. 3), so
können diese Wildtyp-Stämme aufgrund eines unterschiedlichen
Restriktionsenzymmusters nach Spaltung mit %JOI in %JOI+- und %JOI¯ -Stämme
unterteilt werden. Etwa 20% aller Wildtyp-Stämme in den USA und in Großbritannien
12
besitzen eine %JOI-Schnittstelle im ORF 54 (Hawrami und Breuer 1997, Gershon et
al. 1999), die jedoch ebenfalls in Oka-Stämmen nachweisbar ist.
Abb. 2: ORF des VZV-Genoms, Quelle: Cohen 1999
Abb. 3: Amplifikation und Restriktionsenzymanalyse von DNA-Fragmenten der
ORF 38 und 54, Quelle: LaRussa et al. 1992, RFLP – Restriction
fragment length polymorphism
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In Japan zirkulierende Wildtyp-Stämme besitzen zu 20 bis 30% keine 3VWI-Schnittstelle im Gen 38 und sind damit von Oka-Stämmen bezüglich dieses Markers
nicht zu unterscheiden (Takada et al. 1995). Aus diesem Grunde erlaubt die
Beurteilung des 3VWI-Polymorphismus im Gen 38 nur außerhalb Japans oder
japanischer Kommunen eine zuverlässige Unterscheidung von Wildtyp-Stämmen.
Mittels Charakterisierung des ORF 62 ist es möglich, VZV-Oka von allen in und
außerhalb Japans zirkulierenden Wildtyp-Stämmen zu unterscheiden. Ein Verfahren
dazu wurde von Loparev et al. (2000) entwickelt. Es beruht auf der Amplifikation
eines DNA-Fragments des ORF 62 mit einer Größe von 268 bp. Durch eine sich
anschließende Restriktionsenzymanalyse mittels 6PDI-Verdauung gelingt eine
universelle Differenzierung des Oka-Impfstammes von allen Oka-ähnlichen oder
nicht-ähnlichen Wildtyp-Stämmen (Abb. 4).
Abb. 4: Amplifikation und Restriktionsenzymanalyse von DNA-Fragmenten des
ORF 62
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- (SLGHPLRORJLH�XQG�.OLQLN�Der Mensch ist das einzige Reservoir für das als hochkontagiös geltende VZV.
Infektionsquelle für eine VZV-Primärinfektion sind Patienten mit Windpocken oder mit
Zoster. Mit ca. 750.000 Erkrankungen pro Jahr gehören die Windpocken in
Deutschland zu den häufigsten durch Impfung vermeidbaren Infektionskrankheiten
(Verschreibungsindex für Pharmazeutika 2000). In der Regel treten Windpocken
zwischen dem 5. und 9. Lebensjahr auf (Asano et al.1999). Die Durchseuchung mit
dem VZV erreicht in Deutschland bei Vorschulkindern 60 bis 65% und bei 10- bis 12-
Jährigen bereits 94%. Nach dem 4. Dezenium sind nur noch Einzelpersonen ohne
VZV-Antikörper und demzufolge für eine Primärinfektion empfänglich (Wutzler et al.
2001). Exogene Reinfektionen mit dem VZV sind extrem selten (Hawrami et al.
1997). Eine in England und Wales beobachtete Verschiebung der Varizellen in
höhere Lebensjahrzehnte (Fairley und Miller 1996) konnte für Deutschland nicht
bestätigt werden (Wutzler et al. 2001).
Abb. 5: Klinisches Bild der Windpocken, Quelle: Emond, 1976
Windpocken (Abb. 5) sind hochgradig kontagiös, wobei allerdings außerhalb des
Körpers das Virus rasch seine Infektiosität verliert. In den gemäßigten Klimazonen ist
eine jahreszeitliche Häufung in den Winter- und Frühjahrsmonaten zu beobachten.
Die Virusübertragung erfolgt aerogen durch virushaltige Tröpfchen, die beim Atmen
15
oder Husten ausgeschieden werden. Ferner ist die Übertragung durch virushaltigen
Bläscheninhalt bei Kontakt möglich. Im Vergleich zu Varizellen besteht beim Zoster
eine wesentlich geringere Kontagiosität, da das Virus nicht über Sekrete des
Respirationstraktes ausgeschieden wird. Zum Ausbruch von Varizellen kommt es
nach einer Inkubationszeit von ca. 14 (10-23) Tagen. Nach Primärkontakt dringt das
VZV über die Schleimhäute des Nasopharynx bzw. die Konjunktiven und
Tränenwege in den Körper ein. Im Anschluss daran tritt in der frühen Phase der
Inkubationszeit eine erste Virämie auf. Bei der Untersuchung von Monozyten im
peripheren Blut von Kindern, die an Varizellen erkrankten, wurde mittels PCR schon
zu dieser Zeit VZV-DNA nachgewiesen (Ozaki et al. 1994). Nach der Virusreplikation
in den regionären Lymphknoten kommt es zur zweiten Virämie mit anschließender
Organmanifestation an Haut und Schleimhäuten, dem Auftreten des typischen
bunten Varizellenexanthem (Abb. 5). Dabei stehen Effloreszenzen verschiedener
Entwicklungsstadien nebeneinander (Spiess 1986), deren differenzialdiagnostische
Abgrenzung von den echten Pocken bis 1978 von Bedeutung war und gegenwärtig
mit der Möglichkeit bioterroristischer Anschläge mit Pockenviren wieder an Aktualität
gewonnen hat. In der Regel zeigen Kinder mit Windpocken einen komplikationslosen
Verlauf. Zu den häufigsten Komplikationen zählen bakterielle Superinfektionen.
Komplikationen wie Pneumonien, die auch bei Schwangeren einen schweren Verlauf
zeigen können, Hepatopathien und seltener Enzephalitiden oder Myokarditiden
(Bächli et al. 1996) treten vorzugsweise bei Jugendlichen und Erwachsenen sowie
bei immuninkompetenten Kindern auf (Balfour et al. 1988). Kommt es zu Varizellen
während der Schwangerschaft, kann die Erkrankung auch schwere Folgen für das
Kind haben. Bei mütterlichen Windpocken im ersten und zweiten Trimenon besteht
die Möglichkeit kongenitaler Missbildungen, die als fetales Varizellensyndrom
beschrieben werden (Sauerbrei und Wutzler 2003). Varizellen um den Geburtstermin
sind ebenfalls gefürchtet, da beim Neugeborenen dann neonatale Windpocken
möglich sind (Sauerbrei und Wutzler 2001).
Eine Prophylaxe von Varizellen ist mit spezifischem Immunglobulin möglich.
Voraussetzung dafür ist die rechtzeitige Gabe des Präparates innerhalb der ersten
72, maximal 96 Stunden nach Expositionsbeginn. Kommt es dennoch zum Auftreten
von Windpocken, so verlaufen diese mild. Risikogruppen, die für eine passive
Immunprophylaxe in Frage kommen, sind empfängliche, abwehrgeschwächte
Personen, schwangere Frauen ohne Varizellenanamnese, Neugeborene, deren
16
Mütter um den Geburtstermin an Varizellen erkranken, und exponierte Frühgeborene
(Deutsche Gesellschaft für Pädiatrische Infektologie 2003).
Auf eine VZV-Primärinfektion reagiert der Organismus mit einer humoralen und
zellulären Immunantwort. Die humorale Immunreaktion besteht in der Bildung von
virusspezifischen Antikörpern der IgM-, IgA- und IgG-Klasse. Antikörper der IgG-
Klasse persistieren bei immunkompetenten Personen lebenslang und schützen vor
einer klinisch manifesten exogenen Zweitinfektion. In einzelnen Fällen, insbesondere
bei Kindern mit gestörter zellulärer Abwehr, kann es trotz vorausgegangener
Erstinfektion zu einer erneuten Varizellenerkrankung kommen (Heidl et al. 1986,
Terada et al. 1998, Urban, 1982).
Nach der Primärinfektion persistiert das VZV latent in zentralen und spinalen
sensorischen Ganglien und verursacht nach endogener Reaktivierung den Zoster
(Bastian et al. 1974, Gilden et al. 1983, Mahalingeam et al. 1990), der bei bis zu 23%
aller seropositiven Individuen auftritt (Krause und Klinman 2000). Prinzipiell besteht
bei jeder Person, die eine VZV-Primärinfektion durchgemacht hat, die Möglichkeit,
dass das latente Virus reaktiviert wird und einen Zoster verursacht (Hope-Simpson
1965). Ein erhöhtes Risiko findet man bei älteren Menschen, Patienten mit
Immunsuppression, malignen Lymphomen bzw. Leukämien, unter
immunsuppressiver Therapie, nach Transplantationen sowie bei Traumata,
Alkoholabusus, Stress oder AIDS (Baba et al. 1986, Bilgrami et al. 1999, Friedman-
Kein et al. 1986, Wutzler 2002). Auch Kinder, die eine intrauterine
Windpockeninfektion durchgemacht haben, können gehäuft an einem Zoster
erkranken (Brunell und Kotchmar 1981, Dworsky et al. 1980, Sauerbrei und Wutzler
2003). Die Zoster-Inzidenz liegt in Abhängigkeit vom Alter bei Kindern und
Jugendlichen zwischen 42 und 160 pro 100.000 Personen-Jahre, bei 40-jährigen
Erwachsenen zwischen 200 und 300 pro 100.000 Personen-Jahre und nach dem 80.
Lebensjahr bei >1.000 pro 100.000 Personen-Jahre (Guess et al. 1985, Gross 1997,
Petursson et al. 1998). In einer großen epidemiologischen Studie in North Carolina,
USA, wurde festgestellt, dass Menschen mit schwarzer Hautfarbe ein signifikant
geringeres Risiko als „Weiße″ haben, einen Zoster zu entwickeln (Schmader et al.
1995). Dagegen spielten Geschlecht, Bildungsgrad und die Lokalisation des Zosters
keine entscheidende Rolle für das Risiko, an einem Zoster zu erkranken.
17
Im Rahmen der Zoster-Pathogenese kommt es auf neuronalem Weg zum
zentrifugalen Transport des VZV vom Nervenganglion bis ins Innervationsgebiet des
dazugehörigen Nerven. Es folgt das Prodromalstadium� mit unspezifischen
Allgemeinbeschwerden, lokalisierten Parästhesien und brennenden Schmerzen im
befallenen Dermatom. Im Verlauf von einigen Tagen entsteht das typische klinische
Bild, das durch ein unilaterales Bläschenexanthem im sensiblen Versorgungsgebiet
eines Hautnerven (Abb. 6) und z.T. heftigen Neuralgien gekennzeichnet ist. Nahezu
60% aller Infektionen betreffen die Haut des Thoraxbereichs, während die Lumbal-,
Sakral-, Kopf- und Halsregionen seltener befallen sind. Im weiteren Verlauf der
Erkrankung trocknen die Bläschen ein, und es kommt zur Bildung von Krusten, die
nach zwei bis drei Wochen abfallen. Als Komplikationen werden häufig bakterielle
Sekundärinfektionen und seltener Nekrosen, Blutungen und neurologische
Symptome beobachtet (Bredlich et al. 1998). Beim Befall eines Hirnnerven drohen
starke Beschwerden und komplizierte Krankheitsverläufe, da die Gefahr der
Mitbeteiligung von Auge und Innenohr besteht. Mit bis zu 70% der Fälle stellt die
Postzosterische Neuralgie (PZN) die häufigste aller Zoster-Komplikationen dar
(Whitley et al. 1999). Es besteht eine Abhängigkeit vom Alter und Geschlecht der
Patienten, von der Anzahl und Art der Effloreszenzen und vom befallenen Dermatom
(Wutzler und Meister 1997). Eine Disseminierung des Zoster unter Einbeziehung
viszeraler Organe wird bei immuninkompetenten Patienten in 8 bis 15% der Fälle
beschrieben (Balfour et al. 1988, Heidl et al. 1989).
18
Abb. 6: Klinisches Bild eines Zoster im Gesichtsbereich (sensibler Ast des N.
Trigeminus), Quelle: Tusalud, www.tusalud.com.mx
- 'LDJQRVWLN�Varizellen und Zoster werden in den meisten Fällen klinisch diagnostiziert. Unter dem
Aspekt der Differenzialdiagnostik werden virologische Untersuchungen vor allem zur
Abklärung von atypischen Krankheitsbildern bei Patienten mit Immundefizienz, zur
Abgrenzung anderer bläschenbildender Dermatosen sowie zum Nachweis von
Infektionen des Zentralnervensystems (ZNS) oder einer Pneumonie erforderlich
(Sauerbrei und Wutzler 2004). Weitere Indikationen für eine Labordiagnostik
bestehen bei negativer oder zweifelhafter Varizellenanamnese nach VZV-Kontakt
während der Schwangerschaft, zur Abklärung einer intrauterinen Infektion sowie bei
Verdacht auf ein fetales Varizellensyndrom oder bei fraglichen neonatalen Varizellen.
Mit der Einführung der allgemeinen Varizellenimpfung ist es notwendig,
Impfvarizellen von natürlich erworbenen Windpocken zu unterscheiden. Darüber
hinaus müssen empfängliche Personen erkannt werden, um eine Immunprophylaxe
einzuleiten oder eine Impfung vorzunehmen. Eine frühzeitige und sichere
Labordiagnose von Windpocken und Zoster lässt sich nur über den Erregernachweis
19
mittels PCR erreichen (Sauerbrei et al. 1999). Steht keine PCR zur Verfügung, kann
der Nachweis des VZV in Hauteffloreszenzen auch mittels Immunfluoreszenz
erfolgen (Coffin und Hodinka 1995). Eine Virusanzüchtung sollte nur dann versucht
werden, wenn Spezialuntersuchungen wie die molekulare Typisierung des VZV zur
Unterscheidung von Wild- und Impftyp-Viren oder die Resistenzbestimmung
gefordert sind. Serologische Untersuchungen haben in erster Linie Berechtigung zur
Bestimmung des Immunstatus. Dafür sind Immunfluoreszenzteste und
Enzymimmunassays geeignet (Sauerbrei et al. 2004).
- $QWLYLUDOH�7KHUDSLH�Für eine kausale antivirale Therapie von VZV-Infektionen stehen verschiedene
Substanzen zur Verfügung (Tab. 1). Die ersten Virostatika zur Behandlung von
Herpesvirus-Infektionen wurden bereits vor über 40 Jahren entwickelt. Der
entscheidende Durchbruch in der antiviralen Therapie von VZV-Infektionen gelang
vor ca. 20 Jahren mit der Einführung von Aciclovir (Zovirax), dessen
Bioverfügbarkeit nach oraler Applikation jedoch nur 15 bis 30% beträgt (Snoeck et
al., 1999). Erst seit wenigen Jahren stehen mit Valaciclovir (Valtrex), dem L-
Valinester von Aciclovir, und Famciclovir (Famvir), dem oralen Prodrug von
Penciclovir, wesentlich besser enteral resorbierbare Medikamente zur Verfügung, die
sich zur oralen Therapie eignen. Für die antivirale Behandlung von VZV-Infektionen
sind heute Aciclovir (i.v., p.o.), Brivudin (p.o.), Famciclovir (p.o.) und Valaciclovir
(p.o.) zugelassen (Wutzler 2002). Im Falle des Zosters kann bei einem
Therapiebeginn innerhalb von 72 Stunden nach Auftreten der Hauterscheinungen
neben der schnelleren Abheilung der Zoster-Effloreszenzen eine Reduzierung des
Zoster-assoziierten Schmerzes erreicht werden (Gross et al. 2003). Behandelt
werden sollten Immunsupprimierte mit Zoster oder Varizellen, Patienten mit Zoster
ab dem 50. Lebensjahr, Zoster im Kopf-Halsbereich, schwerem Zoster an Stamm
und Extremitäten sowie bei schwerer Dermatitis atopica und ausgedehnten Ekzemen
(Wutzler und Sauerbrei 2004). Eine antivirale Therapie mit Aciclovir ist auch bei
Schwangeren mit Varizellen-Pneumonie, Säuglingen mit neonatalen Varizellen und
bei VZV-Enzephalitis indiziert. Resistenzen gegenüber Aciclovir und verwandten
Substanzen werden selten beobachtet. Sie beruhen meistens auf Mutationen des
20
Thymidinkinase-Gens und seltener des DNA-Polymerase-Gens. Als alternatives
Therapeutikum wird für diese Fälle Foscarnet (Foscavir) vorgehalten.
Tab. 1: Potentielle Angriffspunkte von Virostatika zur antiviralen Therapie von
VZV-Infektionen, nach Weber et al. 2002
:LUNVXEVWDQ]� :LUNXQJVPHFKDQLVPXV�$FLFORYLU� • Aktivierung zu Aciclovir-Monophosphat über virale
Tymidinkinase
• kompetitive Hemmung der DNA-Polymerase
• Kettentermination
9DODFLFORYLU� • Konversion zu Aciclovir in Dünndarm und Leber
)DPFLFORYLU� • Konversion zu Penciclovir in Dünndarm und Leber
%ULYXGLQ� • Aktivierung zu Mono- und Diphosphat durch VZV-
Tymidinkinase
• Abbruch der DNA-Kette durch Einbau von Brivudin-
Triphosphat
)RVFDUQHW� • Pyrophosphatantagonist
• keine vorherige Aktivierung
• nichtkompetitive Inhibition der DNA-Polymerase
����� 9DUL]HOOHQLPSIXQJ�Mit der Isolierung und Attenuierung des VZV-Oka-Stammes vor ca. 30 Jahren in
Japan (Takahashi et al. 1974) wurden die Grundlagen für die spätere Einführung der
Varizellenimpfung in zahlreichen Ländern geschaffen. Das Oka-Impfvirus ist der
einzige von der WHO empfohlene VZV-Stamm für eine Anwendung am Menschen.
Varizellenimpfstoffe werden heute von verschiedenen Firmen hergestellt. Sie
unterscheiden sich in der Anzahl der Viruspassagen in humanen diploiden
Zellkulturen, im Gehalt an vermehrungsfähigem Virus und im Zusatz von
21
Stabilisatoren. Wesentliche Fortschritte brachte die Zubereitung lyophilisierter
Impfstoffe, die erstmals 1995 auf den Markt kamen (Gershon et al. 1999, Gershon
2001).
Bereits 1984 erfolgte in Deutschland und einigen anderen Ländern die Zulassung
eines Oka-Impfstoffes für Hochrisikopatienten und deren Kontaktpersonen. 1995
wurde die allgemeine Varizellenimpfung in den USA zur Prävention von VZV-
Infektionen bei allen Personen ab dem vollendeten 12. Lebensmonat eingeführt. Ein
Jahr später startete ein Programm zur Impfung aller Kinder im Alter von 12 bis 18
Monaten, von älteren empfänglichen Kindern, Jugendlichen und Erwachsenen, von
Kontaktpersonen immunsupprimierter Patienten und Mitarbeitern im
Gesundheitsdienst (Gershon 2001, Watson 2001). Gegenwärtig werden
Lebendimpfstoffe auf der Basis des VZV-Stammes Oka in zahlreichen weiteren
Ländern wie Kanada, Australien, Japan und Südkorea mit Erfolg für Impfungen im
Kindesalter eingesetzt. Mehrere europäische Länder empfehlen die Varizellen-
Schutzimpfung für Personen mit einem hohen Risiko für schwerverlaufende
Varizellen und/oder für seronegative Mitarbeiter im Gesundheitsdienst. In
Deutschland wurden darüber hinaus seit 2001 die nationalen Impfempfehlungen
durch die Ständige Impfkommission am Robert Koch-Institut (STIKO) auf Kinder und
Jugendliche zwischen 12 und 15 Jahren ohne Varizellenanamnese erweitert (STIKO
2001). Im Juli 2003 hat der Freistaat Sachsen als erstes Bundesland eine generelle
Varizellenimpfung im Kindesalter eingeführt. 2004 hat die STIKO die allgemeine
Varizellenimpfung bei Kindern ab dem 2. Lebensjahr für Gesamtdeutschland
empfohlen (STIKO 2004). Mit der Impfung wird das Ziel verfolgt, die hohe Morbidität
der Varizellen und die Rate der vielfältigen Varizellen-assoziierten Komplikationen zu
reduzieren sowie darüber hinaus die Hospitalisierungsrate zu senken. Es wird auch
erwartet, dass bei sinkenden Erkrankungsraten infolge der Herdimmunität Säuglinge,
Schwangere und Personen aus klinisch relevanten Risikogruppen wie Patienten mit
Leukämie bzw. unter immunsuppressiver Therapie von der Impfung profitieren.
Varizellenimpfstoffe induzieren sowohl eine humorale als auch zelluläre
Immunantwort. Die Immunogenität der Impfstoffe ist abhängig vom Alter und von der
Immunkompetenz der Impflinge sowie vom Virusgehalt der verabreichten Vakzine.
Zahlreiche Studien, die vor allem in den USA und Japan durchgeführt worden sind,
belegen, dass der Impfstoff eine gute Immunogenität besitzt (Asano et al. 1994,
Kuter et al. 1995, Asano 1996, Varis and Vesikari 1996, Burges et al. 1999). Die
22
Serokonversionsrate beträgt bei gesunden Kindern sechs bis acht Wochen nach
einer Impfung mehr als 95%. Bei Jugendlichen und Erwachsenen sowie bei
immundefizienten Kindern sind zwei Impfstoffdosen im Abstand von mindestens vier
bis sechs Wochen erforderlich, um Serokonversionsraten von über 90% zu erreichen
(Gershon et al. 1999, Takahashi 2001). Die Varizellenimpfung wird allgemein gut
toleriert. Durch mehrere nichtkontrollierte Studien konnte gezeigt werden, dass die
VZV-Vakzine nur relativ geringe lokale und systemische Nebenwirkungen auslöst.
Dazu gehören Schmerzen an der Einstichstelle bei 25 bis 30% und Fieber bei 10%
der geimpften Kinder, Jugendlichen und Erwachsenen (Weber et al. 1996). Ein
lokalisiertes Exanthem trat in 1 bis 3% der Impflinge auf, und varizellenartige
Hauterscheinungen mit relativ wenigen Effloreszenzen, als Impfvarizellen bezeichnet,
wurden zu ca. 5% nach der ersten Dosis und zu ca. 1% nach der zweiten Dosis im
Abstand von zwei bis vier Wochen nach der Impfung beobachtet (American Academy
of Pediatrics 2000).
Der Oka-Impfstamm kann, ähnlich dem Wildtyp-Virus, zu einer latenten Infektion in
sensorischen Ganglien führen und nach endogener Reaktivierung auch einen Zoster
verursachen (Gershon 2001). Bisherige Untersuchungen haben jedoch gezeigt, dass
der Oka-Stamm wesentlich seltener als das Wildtyp-VZV reaktiviert wird (Gershon
2001). Über das Auftreten eines Zosters nach Varizellenimpfung wurde bei gesunden
Kindern mit einer Inzidenz von 13 bis 18 pro 100.000 Personen-Jahre berichtet
(Gershon et al. 1999, Watson 2001). Damit liegt die Zoster-Inzidenz bei geimpften
Kindern etwa fünffach niedriger als bei Kindern, die natürliche Varizellen
durchgemacht haben. Der Oka-Impfstamm wurde bislang nur in sehr wenigen Fällen
als Ursache für einen Zoster identifiziert (Liang et al. 1998, Sharrar et al. 2000, Uebe
et al. 2002). Ein relatives Risiko, an einem Zoster nach Varizellenimpfung zu
erkranken, scheint bei solchen Impflingen zu bestehen, die entweder ein
Impfexanthem oder sog. Durchbruchsvarizellen entwickelt haben (Hardy et al. 1991).
Auf dieser Grundlage wurde die Hypothese entwickelt, dass Hauteffloreszenzen die
Voraussetzung für das Eindringen des VZV in die Hautnerven und für eine
aszendierende Infektion der Dorsalganglien darstellen.
Wie Fallkontrollstudien belegen, schützt die Varizellenimpfung zu über 95% vor
schwer verlaufenden Windpocken und verhindert zu 70 bis 90% Windpocken
jeglichen Schweregrades (Watson 2001). Japanische Langzeitbeobachtungen haben
ergeben, dass die durch die Impfung induzierte Antikörperantwort für mindestens 20
23
Jahre persistieren soll (Takahashi 2001). Die Folge nachlassender Immunität bzw.
unzureichender Immunreaktion sind Impfdurchbrüche bei immungesunden Personen.
Sie werden jährlich bei ca. 1% der Geimpften beobachtet (Watson 2001). Vorläufige
Daten weisen darauf hin, dass bei älteren Menschen eine Boosterung der VZV-
spezifischen Abwehr durch die Verabreichung von Varizellenimpfstoff einen Zoster
verhindern oder zumindest die klinische Symptomatik abschwächen kann (Färber
2004).
Eine Übertragung von Impfviren auf Kontaktpersonen ist prinzipiell nur möglich, wenn
diese noch keine Varizellen durchgemacht haben und demzufolge seronegativ sind.
Dies trifft in Deutschland auf ca. 3% aller Frauen im gebärfähigem Alter zu (Wutzler
et al. 2001). Da im Unterschied zur natürlichen Infektion mit Wildtyp-Viren das
Impfvirus bei immungesunden Menschen nicht über den Oropharynx ausgeschieden
wird, kann eine Übertragung des Oka-Impfvirus auf empfängliche Kontaktpersonen
nur stattfinden, wenn der Impfling ein Exanthem mit Vesikeln in Form von
Impfvarizellen entwickelt. Bei Exposition im häuslichen Milieu ist die
Wahrscheinlichkeit der Übertragung des Impfvirus auf empfängliche Personen vier
bis fünf mal niedriger, als dies bei dem Wildtyp-Virus der Fall ist (Tsolia et al. 1990).
Wenn es doch zu einer Übertragung kommt, verläuft die Infektion meist subklinisch.
Bisher sind nur wenige gut dokumentierte Fälle von varizelliformen Exanthemen als
Folge der Übertragung des Impfvirus auf Kontaktpersonen bekannt geworden
(Salzman et al. 1997). Bisherige Erfahrungen belegen auch, dass eine Infektion
schwangerer Frauen mit dem Impfvirus nicht zu kongenitalen Fehlbildungen führt
(Shields et al. 2001).
Die Durchführung der Varizellenimpfung bei einer großen Anzahl von Personen hat
auch Konsequenzen für die Surveillance und Diagnostik von VZV-Infektionen. Es ist
zu erwarten, dass einerseits die Anzahl der Personen, die Varizellen durchgemacht
haben und Träger des Wildtyp-Virus sind, abnimmt und andererseits die geimpfte
Population, die z.T. Träger des Impfvirus ist, zunimmt. Damit rücken Fragen nach der
Unterscheidung von Impf- und Wildtyp-Viren in den Vordergrund. Dies trifft auch für
die Beurteilung von Windpocken- oder Zoster-Erkrankungen zu, die nach Impfung
auftreten können. Bisherige Erfahrungen haben gezeigt, dass eine zweifelsfreie
Unterscheidung zwischen Impf- und Wildtyp-VZV nur mittels Genotypisierung
möglich ist (La Russa et al. 2000, Argaw et al. 2000, Gomi et al. 2001).
24
����� $XIJDEHQVWHOOXQJ�Die Aufgabe der vorliegenden Promotionschrift war es, VZV-Isolate von Patienten mit
Varizellen oder Zoster, die in den vergangenen zehn Jahren am Institut für Virologie
und Antivirale Therape isoliert und archiviert worden waren, mit
molekularbiologischen Verfahren zu typisieren. Darüber hinaus standen zur Prüfung
mittels direkter molekularer Typisierung auch VZV-DNA-positive
Untersuchungsmaterialien von Patienten mit Varizellen oder Zoster zur Verfügung.
Im Rahmen der geplanten Untersuchungen sollten spezielle VZV-Genomabschnitte
in den ORF 38, 54 und 62 charakterisiert werden, die in der einschlägigen Literatur
bislang am häufigsten zur Genotypisierung des VZV mit dem vorrangigen Ziel der
Unterscheidung von Wild- und Impftyp-Viren verwendet wurden. Die Auswahl dieser
Genomabschnitte erfolgte auch deshalb, um die eigenen Ergebnisse mit den aus der
Literatur bekannten Typisierungsmustern europäischer, amerikanischer und
japanischer VZV-Stämme vergleichen zu können. Methodisch sollten in die
Untersuchungen die PCR zur Amplifikation viraler DNA und die Charakterisierung der
Amplifikate mittels Restriktionsenzymanalyse einbezogen werden.
Ausgehend von diesen geplanten Experimenten sollten folgende
Hauptfragestellungen bearbeitet werden:
• Welche Methode gestattet eine zuverlässige routinemäßige Genotypisierung des
VZV einschließlich Unterscheidung von Wild- und Impftyp-Viren?
• Ist für die Genotypisierung des VZV die Anzüchtung eines Virusisolates
erforderlich oder gelingt auch eine direkte Viruscharakterisierung im
Untersuchungsmaterial?
• Welche Genotypen des VZV werden bei Personen mit VZV-Infektionen in
Thüringen beobachtet? Bestehen dabei Unterschiede zu anderen europäischen
und außereuropäischen Ländern?
• Welche Verbreitung besitzt der Impfstamm Oka in der Population?
25
��� 0DWHULDO�XQG�0HWKRGHQ������ 8QWHUVXFKXQJVPDWHULDOLHQ�3.1.1. Materialien von Patienten
- 9DULFHOOD�=RVWHU�9LUXV�6WlPPH�In die vorliegende Arbeit wurden VZV-Stämme von 53 Patienten einbezogen. Diese
Virusstämme waren in den Jahren 1997 bis 2001 am Institut für Virologie und
Antivirale Therapie isoliert worden. Die klinische Diagnose lautete bei 40 Patienten
Zoster sowie bei 11 Patienten Varizellen. Bei zwei Patienten war die Diagnose
unbekannt. Durch Einsicht in die Krankenunterlagen konnte bei 14 Patienten eine
Immuninsuffizienz eruiert werden, wobei zehn Patienten an einem Zoster und vier an
Varizellen erkrankt waren (Tab. 2).
Tab. 2: Klinische Diagnosen der Patienten, von denen VZV-Stämme
angezüchtet worden waren
.OLQLVFKH�'LDJQRVH� $Q]DKO�GHU�LVROLHUWHQ�9=9�6WlPPH�
Varizellen (ohne Immunsuppression) 7
Varizellen (mit Immunsuppression) 4
Zoster (ohne Immunsuppression) 30
Zoster (mit Immunsuppression) 10
Unbekannt 2
Σ 53
- 3DWLHQWHQSUREHQ�
In die Untersuchungen wurden ebenfalls VZV-DNA-positive Proben von 73 Patienten
mit Zoster oder Varizellen einbezogen. Diese Proben waren zwischen 1999 und
2001 aus den Einsendungen an das Konsiliarlabor für HSV und VZV am Institut für
26
Virologie und Antivirale Therapie gesammelt worden. Die präparierte DNA lagerte bei
-80°C.
Die klinische Diagnose war bei insgesamt 52 Patienten mit Zoster und bei 8
Patienten mit Varizellen angegeben. Bei 19 Patienten lagen in der Anamnese
Hinweise auf eine Immunschwäche vor. Davon zeigten alle Patienten eine Zoster-
Erkrankung (Tab. 3).
Der Nachweis von VZV-DNA war mittels PCR unter Anwendung der Primer der VZV-
Gene 4, 28 und 29 geführt worden (Sauerbrei et al., 1999).
Tab. 3: Klinische Diagnosen der Patienten, von denen VZV-DNA-positive
Proben zur Untersuchung kamen
.OLQLVFKH�'LDJQRVH� $Q]DKO�YRQ�3DWLHQWHQSUREHQ� Varizellen (ohne Immunsuppression) 8
Zoster (ohne Immunsuppression) 35
Zoster (mit Immunsuppression) 19
Unbekannt 11
Σ 73
- $UW�GHV�8QWHUVXFKXQJVPDWHULDOV�Beim Ausgangsmaterial aller Proben handelte es sich um den Inhalt von
Hautbläschen (Bläschenabstriche, Bläschenpunktate), Krusten, Hautabstriche,
Biopsiematerialien der Haut, Liquores und Rachenabstriche (Tab. 4).
27
Tab. 4: Art der Untersuchungsmaterialien der in Tab. 2 und 3 aufgelisteten
VZV-Stämme und Patientenproben
����������8QWHUVXFKXQJVPDWHULDO� $Q]DKO� Bläscheninhalt 51
Bläschenabstrich 14
Hautkrusten 2
Liquor 3
Rachenabstrich 2
Biopsiematerial der Haut 1
Unbekannt 53
Σ 126
- +HUNXQIW�GHU�8QWHUVXFKXQJVPDWHULDOLHQ�Bezüglich der behandelnden medizinischen Einrichtungen ergab sich die in Tabelle 5
dargestellte Verteilung. Insgesamt wurden 41 Proben von der Hautklinik, zehn
Proben von der Kinderklinik, zwei Proben vom Institut für Mikrobiologie und eine
Probe von der Klinik für Innere Medizin des Universitätsklinikums Jena eingesandt.
Aus dem Helios-Klinikum Erfurt wurden 27 Proben durch die Hautklinik, 22 Proben
von der Medizinische Klinik, fünf Proben durch die Kinderklinik, eine Probe durch die
HNO-Klinik und eine weitere durch die Klinik für Strahlentherapie geschickt. Weitere
zwei Proben stammten aus Arztpraxen in Erfurt, eine Probe vom Katholischen
Krankenhaus Erfurt und eine weitere vom Klinikum der Universität Halle. Bei 12
Proben war die einsendende medizinische Einrichtung nicht mehr zu bestimmen.
28
Tab. 5: Herkunft der Patienten, von denen Materialien zur Untersuchung kam
(LQULFKWXQJ� $Q]DKO�GHU�3UREHQ�Hautklinik, Universitätsklinikum Jena 41
Hautklinik, Helios-Klinikum Erfurt 27
Medizinische Klinik, Helios-Klinikum Erfurt 22
Kinderklinik, Universität Jena 10
Kinderklinik, Helios-Klinikum Erfurt 5
Institut für Mikrobiologie, Universitätsklinikum
Jena
2
Arztpraxen, Erfurt 2
Klinik für Innere Medizin, Universitätsklinikum
Jena
1
HNO-Klinik, Helios-Klinikum Erfurt 1
Katholisches Krankenhaus Erfurt 1
Klinik für Strahlentherapie, Helios-Klinikum
Erfurt
1
Klinikum, Universität Halle 1
Unbekannt 12
Σ 126
- $OWHUVYHUWHLOXQJ�GHU�3DWLHQWHQ��Die Altersverteilung der Patienten, von denen Materialien zur Untersuchung kamen,
ist aus Tabelle 6 ersichtlich. Nahezu alle Patienten mit Varizellen stammten aus der
Altersgruppe bis 20 Jahre, während die häufigsten Fälle mit Zoster bei den 50- bis
80-Jährigen zu finden waren.
29
Tab. 6: Altersverteilung der Patienten (n = 126)
$OWHU�GHU�3DWLHQWHQ� +HUSHV�]RVWHU� 9DUL]HOOHQ�0-9 4 9
10-19 12 6
20-29 9 0
30-39 7 1
40-49 5 0
50-59 19 0
60-69 23 0
70-79 14 0
80-89 8 0
90-99 1 0
Unbekannt 8 0
Σ 110 16
3.1.2. Varicella-Zoster-Virus-Prototypstämme
Folgende VZV-Prototypstämme aus der Sammlung des Konsiliarlabors für HSV und
VZV am Institut für Virologie und Antivirale Therapie wurden als Kontrollen
verwendet:
• VZV Wildtyp-Stamm YS-R, TK-, Herkunft: Rega Institute for Medical Research,
Katholicke Universiteit Leuven, Belgien
• VZV Impftyp-Stamm Oka: American Type Culture Collection (ATCC) VR-795
• VZV Impftyp-Stamm Oka 07-1, Herkunft: Rega Institute for Medical Research,
Katholicke Universiteit Leuven, Belgien
• VZV Impftyp-Stamm Oka, 1991 isoliert aus dem Impfstoff Varilrix
(SmithklineBeecham, München)
30
• VZV Impftyp-Stamm Oka I, 1995 isoliert aus dem Impfstoff Varilrix
(GlaxoSmithKline, Großbritannien)
• VZV Impftyp-Stamm Oka II, 1999 isoliert aus dem Impfstoff Varilrix, Ch. B.:VA
212 A 44B-1 (GlaxoSmithKline, Großbritannien)
����� =HOONXOWXUHQ�Alle VZV-Stämme wurden entweder in Kulturen frisch aufbereiteter primärer
Zellsuspensionen menschlicher Strumazellen oder in HELF-Kulturen angezüchtet
und vermehrt. Insbesondere die Strumazellkulturen wurden zur Isolierung und
Passagierung des VZV genutzt.
Alle Primärkulturen humaner Strumazellen wurden nach einer Methode von
Schweizer (Schweizer 1968) präpariert, als Monolayerzellkulturen kultiviert und
kryokonserviert. Die Herstellung frischer Zellsuspensionen erfolgte durch kurzes
Überfluten von drei bis vier Tage alten primären Monolayerzellkulturen mit Chelaplex-
Trypsin-Lösung (Rp. 4). Nach Einstellung der Zelldichte auf ca. 5 x 105 Zellen/ml
wurden die Strumazellen in einem Medium kultiviert, das sich aus folgenden
Komponenten zusammensetzte:
- 50% Lactalbuminydrolysat in HANKS-Lösung (Rp. 1),
- 40% Zellzuchtmedium 199 nach PARKER (Biochrom KG, Berlin) und
- 10% L-15-Medium nach LEIBOVITZ (Biochrom KG, Berlin).
Der pH-Wert wurde mittels 5%iger Natriumbicarbonatlösung auf 7,2 eingestellt.
Zusätzlich enthielt das Medium
- 10% fetales Kälberserum (Biochrom KG, Berlin)
- 100.000 IU/l Penicillin und
- 0,1 g/l Streptomycinsulfat.
Für die Kultivierung von HELF der 5.-15. Passage als Monolayerzellkulturen wurde
ein Medium aus
- 50% Lactalbuminhydrolysat in HANKS-Lösung (Rp. 1) und
- 50% L15 Medium nach Leibovitz (Biochrom KG, Berlin) verwendet.
31
Das Medium wurde durch folgende Zusätze ergänzt:
- 10% fetales Kälberserum,
- 100.000 IU/l Penicillin,
- 0,1 g/l Streptomycinsulfat und
- 200 mM L-Glutamin.
Zur Passagierung wurden sieben Tage alte Lungenfibroblasten mittels Trypsin-
Lösung (Rp. 3) vom Gefäßboden abgelöst und suspendiert. Anschließend wurden
die Zellen in frisches Medium aufgenommen und in neue Zellkulturflaschen eingesät,
wobei der Gehalt an Kälberserum auf 5% reduziert wurde.
����� 9LUXVDQ]�FKWXQJ�Zur Virusanzüchtung und Passagierung erfolgte die Beimpfung einer 5 ml-
Zellsuspension mit einer Zelldichte von ca. 4 x 105 Zellen/ml in T 25-
Zellkulturflaschen (Sarstedt, Nümbrecht) mit ca. 300 µl der Abstrichmaterialien bzw.
mit ca. 1 ml Suspension VZV-infizierter Zellen. Während der Inkubation über 10 bis
14 Tage bei 35°C wurden die Kulturen täglich mikroskopisch unter dem
Umkehrmikroskop Telaval (Carl Zeiss, Jena) hinsichtlich des Auftretens
cytopathischer Effekte (cpE) befundet. Nach Erreichen eines cpE von 75% wurde der
Zellrasen mechanisch abgeschabt, zentrifugiert und in neues Zellkulturmedium
aufgenommen.
Das Abfüllen der infizierten Zellsuspension in Ampullen zwecks Lagerung in der
Stammsammlung bei –80°C wurde nach der Virustypisierung durchgeführt.
����� 9LUXVW\SLVLHUXQJ�Zur Virustypisierung wurde ein Teil der infizierten und pelletierten Zellen in
phosphatgepufferter Kochsalzlösung (Rp. 5) gewaschen und in einer Dichte von
ca.105 Zellen/ml auf Objektträger getropft. Nach Trocknung der Präparate und
Fixierung in Azeton für 1 h bei –20°C erfolgte die Überschichtung mit dem
monoklonalen Antikörper Anti-VZV Glycoprotein l, Mab, lgG 2b (Paesel/Lorei,
Frankfurt) in einer Verdünnung von 1:300. Zum Ausschluss von HSV-Isolaten wurden
in separater Weise die Präparate mit monoklonalen HSV-1- und 2-Antikörpern von
32
der Maus (DAKO, Hamburg) überschichtet. Es folgte eine Inkubation für 2 h in einer
feuchten Kammer bei 37°C. Danach wurden die Präparate zur Entfernung
nichtgebundener Antikörper in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (Rp. 5) gespült,
mit Fluoreszeinisothiozyanat (FITC)-markiertem Anti-Maus-Globulin (DAKO,
Hamburg) in einer Verdünnung von 1:2 überschichtet und wiederum für 1 h in einer
feuchten Kammer inkubiert. Nach dem Spülen in Phosphatpufferlösung (Rp. 5)
schloss sich die Bewertung der Präparate unter dem Fluoreszenzmikroskop Olympus
BH2-RF CA (Olympus, Japan) an. Typischerweise zeigte sich bei positivem Befund
eine charakteristische brillantgrüne Fluoreszenz der intranukleären Einschlüsse
sowie des Zytoplasma in VZV-infizierten Zellen.������� '1$�3UlSDUDWLRQ�Zur Präparation der VZV-DNA wurde der QIAampDNA Blood Kit (Qiagen, Hilden)
verwendet. In Anlehnung an das vom Hersteller empfohlene Präparationsprotokoll
wurden die zu untersuchenden Virusstämme, Isolate und Abstrichmaterialien in
identischer Weise behandelt. Im Einzelnen wurden folgende Arbeitsschritte
durchgeführt (Abb. 7):
• Zum Lyseansatz wurden 20 µl Qiagen-Protease, 200 µl virushaltiges Material und
200 µl Lysispuffer AL aufeinanderfolgend in ein Safelock-Eppendorf-Röhrchen
pipettiert, ca. 15 sek mit dem Vortexer gemischt und dicht verschlossen. Nach
kurzer Zentrifugation für 12 sek erfolgte eine Wärmebehandlung für 10 min bei
56°C in einem Thermomixer (Eppendorf Hamburg). Hierbei wurden die Zellwände
aufgelöst und die DNA freigesetzt.
• Durch Zusatz von 200 µl 96 bis 100%igem Äthanol und gutes Durchmischen
wurde die Lyse gestoppt und die DNA präzipiert.
• Es folgt die Aufzentrifugation der entstandenen Mischung auf eine QIAamp-
Minisäule bei 6.000 x g für 1 min. Durch diesen Arbeitsschritt wird die DNA von
der Lösung getrennt und in eine der Reinigung zugängliche Form überführt. Die
DNA bleibt in der Minisäule fixiert, und die abzentrifugierte Flüssigkeit wird
verworfen.
• Zwecks Reinigung der DNA wurde die Minisäule nacheinander mit 500 µl des
mitgelieferten Waschpuffers I AW 1 und Waschpuffers II AW 2 bestückt und
33
jeweils 1 min bei 6.000 x g zentrifugiert. Hierbei wurde das Auffanggefäß
gewechselt. Zur Restpufferentfernung erfolgte eine hochtourige Zentrifugation bei
16.000 x g über 1 min.
• Abschließend wurde mit 50 µl Elutionspuffer AE die gereinigte DNA von der
Minisäule gelöst. Zu diesem Zweck wurde die mit dem Elutionspuffer versehene
Minisäule in ein Eppendorf-Mikrozentrifugenröhrchen platziert, für 1 min bei
Raumtemperatur belassen und anschließend für 1 min bei 6.000 x g zentrifugiert.
Um eine restlose Wiedergewinnung des Eluats zu erreichen, wurde abschließend
nochmals 1 min bei einer vollen Drehzahl von 16.000 x g zentrifugiert.
Die auf diese Weise gewonnenen DNA-Proben wurden bis zur weiteren Verarbeitung
entweder für wenige Tage im Kühlschrank bei 4°C oder für mehrere Wochen bei
-20°C in den Auffanggefäßen aufbewahrt.
34
Abb. 7: Schema zur Präparation der Virus-DNA für die PCR mittels QIAamp
Blood Kit (Qiagen), PBS – Phosphate buffered saline
/\VHDQVDW]�
�����O�YLUXVKDOWLJHV�0DWHULDO N ������������O�4LDJHQ�3URWHDVH�������������O�/\VLVSXIIHU�$/�
���VHN�9RUWH[����PLQ�,QNXEDWLRQ�EHL���� O &�LP�7KHUPREORFN��7KHUPRPL[HU��
�bWKDQROIlOOXQJ�
0LQL�6lXOHQ�5HLQLJXQJ
hEHUI�KUXQJ�GHV����/\VH�bWKDQRO��*HPLVFKHV�DXI��4,$DPS�0LQLVlXOH�� ��$XI]HQWULIXJDWLRQ����PLQ�EHL�������[�J�
���:DVFKHQ�GHU�6lXOH�PLW������O�:DVFKSXIIHU�$:���=HQWULIXJDWLRQ���PLQ�EHL�������[�J��QHXHV�$XIIDQJJHIl���
���:DVFKHQ�GHU�6lXOH�PLW������O�:DVFKSXIIHU�$:����QHXHV�$XIIDQJJHIl���
=HQWULIXJDWLRQ���PLQ�EHL�������[�J�
5HVWSXIIHU�(QWIHUQXQJ��=HQWULIXJDWLRQ���PLQ�EHL�YROOHP�6SHHG������������[�J�
=XJDEH�YRQ�����O�bWKDQRO���������
��³�9RUWH[�
'1$�(OXWLRQ�����O�(OXWLRQVSXIIHU�$(�
�ELV�����O��DXI�4,$DPS�0LQLVlXOH��QHXHV�$XIIDQJJHIl����VWHULO��PLW�'HFNHO��
$E]HQWULIXJDWLRQ���PLQ�EHL������[�J�XQG���PLQ�EHL�
YROOHP�6SHHG������������[�J��
$XIEHZDKUXQJ�GHU�(OXDWH�EHL����� O &�
N *HZHEHNXOWXU�EHUVWDQG���$EVWULFKPDWHULDO�LQ�3%6�
35
����� 9LUXV�'1$�1DFKZHLV�PLWWHOV�3RO\PHUDVHNHWWHQUHDNWLRQ�Folgende PCR-Techniken wurden in Rahmen der vorliegenden Untersuchungen
durchgeführt:
1. Multiplex-PCR unter Verwendung von Primer-Paaren aus den ORF 38 und 54
(Larussa et al. 1992),
2. PCR mit einem Oligonukleotid-Primer-Paar aus dem ORF 38 (Mori et al. 1998),
3. PCR mit einem Oligonukleotid-Primer-Paar aus dem ORF 62 (Loparev et al.
2000).
Die Nukleotidsequenz der verwendeten Primer, ihre Lokalisation im VZV-Genom
sowie die Größe des Amplifikationsproduktes sind in der Tab. 7 zusammengefasst.
Die Synthese der Primer erfolgte im Institut für Virologie und Antivirale Therapie. Zur
Herstellung der DNA-Primer diente der ExpediteTM DNA/RNA Synthesizer, Modell
8909 (Applied Biosystems, Framingham, USA; Software-Version 2.4). Für das nach
der Festphasen-Phosphoramidit-Methode arbeitende System wurden Cyanoethyl-
Phosphoramidit, CDI-Aktivator (Di-cyanomidazol), Cappingreagens, Oxidationsmittel,
Detritylierungsmittel und Acetonitril (Proligo Biochemie GmbH, Hamburg) verwendet.
Als Festphasenträger dienten bei der Herstellung der Primer spezielle Säulen des
Typs CPG-500 Å LCAA (Proligo Biochemie GmbH) mit den entsprechenden
Startnukleosiden. Zur Abspaltung vom Träger und zur Entschützung wurde die Säule
1,5 h mit 28%igem wässrigem Ammoniak und anschließend 20–24h bei 55°C
behandelt. Die Aufreinigung der Oligonukleotide erfolgte mittels Shimadzu HPLC LC
10AT Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Mono Q MR 5/5
Anionaustauschsäule (Pharmacia, Uppsala, Schweden) mit einem linearen
Salzgradienten bis 1 M NaCl und 10 mM NaOH. Zur Entsalzung diente Sephadex G
25 (Pharmacia).
36
Tab. 7: Primer-Design zur Amplifikation von VZV-DNA mittels PCR
3ULPHU�VSH]LILWlW� 1XNOHRWLGVHTXHQ]�
� P �������!�P �1XNOHRWLGH�GHV�9=9�*HQRPV�
$PSOLIL�NDWLRQV�SURGXNW��ES��
/LWHUDWXU�
Gen 38
Primer 1: TTGAACAATCACGAACCGTT Primer 2: CGGGTGAACCGTATTCTGAG
69250 bis
69269
69599 bis 69580
350
LaRussa
et al. 1992
Gen 54
Primer 1: TCCCTTCATGCCCGTTACAT Primer 2: GGAACCCCTGCACCATTAAA
95109 bis
95128
95330 bis 95311
222
LaRussa
et al. 1992
Gen 38
Primer 1: AAGTTTCAGCCAACGTGCCAATAAA Primer 2: AGACGCGCTTAACGGAAGTAACG
69060 bis
69084
69706 bis 69684
648
Mori et al.
1998
Gen 62
Primer 1: TTCCCACCGCGGCACAAACA Primer 2: GGTTGCTGGTGTTGGACGCG
106036 bis
106055
106303 bis 106284
268
Loparev
et al. 2000
Die PCR-Protokolle zur Amplifikation der entsprechenden Genabschnitte wurden
unter Verwendung von Komponenten des HotStarTaq Master Mix Kits (Qiagen) in
Anlehnung an die Originalliteratur gestaltet. Hierbei waren grundsätzlich im
Mastermix folgende Komponenten enthalten.
- PCR-Puffer (50 mM KCl, 15 mM Tris-Hydrochlorid pH 8, 1,5 mM MgCl2)
- Desoxynukleotidtriphosphat (200 µM Endkonzentration jedes dNTP’s)
- Q-Solution (2 µl)
- HotStarTaq DNA-Polymerase (2,5 Einheiten)
- Primer (jeweils 100 pmol)
37
- Steriles Aqua dest. (ad 90 µl)
Als Template waren 10 µl mit ca. 500 ng DNA vorgesehen.
Die einzelnen Mastermixe unterschieden sich lediglich anhand der differenten
Konfigurationen der zugesetzten Primer (siehe Tab. 7).
Mittels Vortexer wurde das Amplifikationsgemisch nach Zugabe von 10 µl DNA für
10 sek gemischt. Die Realisierung der Temperaturprofile zu den einzelnen
Amplifikationsschritten, bestehend aus Denaturierung, Hybridisierung und
Polymerisierung, erfolgte in einem T4-Thermozykler (Whatman/Biometra, Göttingen).
Dem eigentlichen Startzyklus musste eine Temperaturphase von 95°C für 15 min
vorgeschaltet sein, um die HotStarTaq-Polymerase zu aktivieren. Am Ende aller
durchlaufenen Zyklen schloss sich eine Final-Extension für 5 min bei 72 °C an, bevor
die Proben im Thermozykler auf 4°C abgekühlt wurden. Abfolge und Dauer der
einzelnen PCR-Schritte sind in Tab. 8 dargestellt.
Tab. 8: Zeitlicher Verlauf der einzelnen PCR-Methoden
3&5�0HWKRGH� =\NOXVDQ]DKO� 9RUJDQJ� 7HPSHUDWXU� 'DXHU��
Gen 38/54
(LaRussa et al.
1992)
30
Denaturierung
Hybridisierung
Polymerisierung
94 °C
52 °C
72 °C
1 min
1 min
2 min
Gen 38
(Mori et al. 1998)
35
Denaturierung
Hybridisierung
Polymerisierung
95 °C
56 °C
72 °C
20 sek
20 sek
30 sek
Gen 62
(Loparev et al.
2000)
30
Denaturierung
Hybridisierung
Polymerisierung
94 °C
72 °C
72 °C
1 min
1 min
3 min
38
Bis zur weiteren Aufarbeitung für die Restriktionsanalyse wurden die Amplifikate
entweder für 24 h bei Kühlschranktemperatur oder darüber hinaus bei –20°C
aufbewahrt.
Zur Vermeidung von Kontaminationen der PCR-Versuchsansätze mit Fremd-DNA
wurden die Arbeiten nach den derzeitig als zweckmäßig und allgemeingültig
anerkannten Arbeitsregeln für die PCR durchgeführt. Dazu gehören:
- Tragen von Gummihandschuhen,
- Verwendung von Einwegmaterialien (Mikrozentrifugationsröhrchen,
Pipettenspitzen),
- Räumliche Trennung der einzelnen Arbeitsschritte: Herstellung des
Amplifikationsgemisches, Vorbereitung der Untersuchungsmaterialien für die
PCR sowie Durchführung der PCR-Ansätze an speziellen, dekontaminierten
Arbeitsplätzen.
����� 5HVWULNWLRQVHQ]\PDQDO\VH�3.7.1 DNA-Quantifizierung mittels Spektrophotometrie
Die Quantifizierung der amplifizierten DNA wurde mit Hilfe des UV-
Spektralphotometers Ultrospec Plus, (Pharmacia) bei einer Wellenlänge von 260 nm
vorgenommen.
Unter Zugrundelegung der Tatsache, dass bei einer Schichtdicke von 1 cm eine
Lösung von 50 µg/ml doppelsträngiger DNA bei 260 nm eine optische Dichte von 1
aufweist (Maniatis et al., 1982), wurden die DNA-Gehalte in µg/µl berechnet. Als
Verdünnungs- und Leerwertpuffer diente zweckmäßigerweise der Elutionspuffer AE
des Qiagen DNA-Präparationskits, mit dem am Ende der Präparation die DNA eluiert
worden war (Qiagen). Bei einer Vorverdünnung der Messproben von 1:5 ergab sich
ein Faktor von 0,2 zur Umrechnung der Extinktionswerte in µg/µl. Die Verwendung
von Mikrovolumen-Messküvetten mit einem maximalen Messvolumen von 100 µl
gestattete es, dass mit einem Aliquot von 20 µl der zu kalibrierenden DNA-Lösung
auf sparsame Weise gemessen werden konnte.
39
3.7.2. Enzymverdau der Amplifikate mit Restriktionsendonukleasen
Zur Bestimmung von DNA-Sequenzunterschieden in den durch PCR amplifizierten
Genomabschnitten wurden Restriktionsfragmentanalysen mit den
Restriktionsenzymen %JOI��3VWI sowie 6PDI durchgeführt (Tab. 9):
Tab. 9: Restriktionsendonukleasen zum Enzymverdau der PCR-Amplifikate
5HVWULNWLRQV�HQGRQXNOHDVH�
(UNHQQXQJVVHTXHQ]�GHU�(QGRQXNOHDVH�
+HUVWHOOHU��
�%JOI
GCC(N)4↓NGGC
Roche Diagnostics,
Mannheim
�3VWI
CTGCA↓G
Roche Diagnostics,
Mannheim
�6PDI�
CCC↓GGG
Jena Bioscience, Jena
Unter Verwendung des vom Hersteller mitgelieferten 10-fach konzentrierten
Reaktionspuffers wurde der Reaktionsansatz für den Endonuklease-Verdau durch
Mischung folgender Komponenten als 50 µl-Ansatz in einem Eppendorf-
Reaktionsgefäß vorgenommen:
- 10-fach konzentrierter Enzympuffer 5,0 µl,
- quantifizierte Amplifikat-DNA 2 µg,
- Endonuklease 10 U,
- H2O ad 50 µl.
Das Volumen der zugegebenen DNA wurde aus den Daten der durch
Spektrophotometrie bestimmten DNA-Konzentration im jeweiligen PCR-Amplifikat
berechnet (siehe 3.7.1). In der Regel wurden pro Ansatz 2 bis 6 µg DNA verwendet.
40
Nach zweistündiger Inkubation des Verdauungsansatzes im Thermoschüttler bei 650
rpm und 37°C war im allgemeinen die Spaltung in die Restriktionsfragmente
vollständig und konnte durch die anschließende Elektrophorese in einem 2%igen
Agarosegel (siehe 3.8.) sichtbar gemacht werden. Bei Anwendung der Methode nach
Loparev et al. (2000) wurde die Inkubation auf 3 bis 4 h verlängert. Die DNA-
Spaltung wurde durch Zugabe von 100%igem Äthanol gestoppt und die DNA
präzipitiert. Dazu wurde der Verdauungsansatz mit 2,5 µl einer 4-molaren LiCl-
Lösung sowie 125 µl kaltem 100%igem Äthanol versetzt und für 15 min bei –80°C
aufbewahrt. Zur Gewinnung des DNA-Pellets wurde nach Zentrifugation bei 14.000 x
g das Sediment mittels SpeedVAC-Vakuumtrockner DNA 110 (Savant, USA)
vollständig von Äthanolresten befreit und in 30 µl TE-Puffer pH 8,0 (Rp. 9)
aufgenommen.
�����'DUVWHOOXQJ�GHU�YLUDOHQ�'1$�PLWWHOV�$JDURVHJHOHOHNWURSKRUHVH�Das verwendete Verfahren der Agarosegelelektrophorese zur Darstellung der
Amplifikate entsprach dem Standardprotokoll nach Maniatis et al. (1982). Es wurde
unter Verwendung einer Minielektrophoresekammer (Serva, Heidelberg)
durchgeführt.
Zunächst wurde der benötigte TBE-Puffer als Stocklösung in einer Konzentration von
5x TBE (Rp. 7) zubereitet. Die Verdünnung erfolgte kurz vor seiner Verwendung.
Entsprechend der zu erwartenden Größe der Amplifikate und Restriktionsfragmente
(Angaben in base pairs, bp) wurde eine 2%ige Agarose für DNA-Zwecke (Serva),
aufgenommen in 1x TBE, verwendet. Diese wurde, in 35 ml-Portionen abgefüllt, als
Vorrat im Kühlschrank bei 4°C aufbewahrt. Die Zubereitung des Elektrophoresegels
erfolgte durch Verflüssigung der Agarose in einem Mikrowellengerät. Nach
Abkühlung auf ca. 50°C wurden zum späteren Sichtbarmachen der DNA unter UV-
Licht 2 µl Ethidiumbromid in einer Endkonzentration von 0,5 µg/ml hinzugegeben
und das Gelbett mit Hilfe des zur Elektrophoresekammer gehörenden Gel-Gieß-Kits
blasenfrei zubereitet. Die Schichtdicke des Gels betrug 5 mm, die Gelfläche 65 x 10
mm. Zum Formieren der Probenreservoirs wurde ein Teflonkamm mit einer
Zahngrösse von 2 x 4 mm in das noch flüssige Gel eingehängt. Dieser sorgte für acht
bzw. zwölf Vertiefungen mit einem Fassungsvolumen bis zu 20 µl im Agarosegel. Vor
dem Beladen des Gels mit den DNA-Proben wurde das erstarrte Gel im Gelträger
41
aus der Gießvorrichtung herausgenommen und in die Elektrophoresekammer
umgesetzt. Es folgte die Zugabe von 1x TBE–Puffer bis ca. 3 mm über die
Geloberfläche.
Die zu analysierenden DNA-Proben wurden mit 6 x Ladepuffer (Rp. 8) im Verhältnis
von 1:6 versetzt und vorsichtig in die Gelvertiefungen pipettiert. Zur
Größenbestimmung der darzustellenden DNA-Fragmente dienten
Molekulargewichtsstandards in einer Konzentration von 250 µg/ml (Roche
Diagnostics), die bei jeder Elektrophorese mitgeführt wurden (Tab. 10).
Tab. 10: Eingesetzte Molekulargewichtsstandards
0HWKRGH� 0ROHNXODUJHZLFKWV�VWDQGDUG�
(QWKDOWHQH�'1$�)UDJPHQWH��ES��
ORF 38 und 54 (LaRussa
et al. 1992)
ORF 62 (Loparev et al.
2000)
V
(Roche Diagnostics)
64, 80, 89, 104, 124, 184,
192, 213, 234, 267, 434,
458, 504, 540, 587
ORF 38 (Mori et al. 1998) IX
(Roche Diagnostics)
72, 118, 194, 234, 271,
281, 310, 603, 872, 1078,
1353
Jeweils 5 µl des Molekulargewichtsstandards wurden mit 1 µl 6x Ladepuffer gemischt
und ebenfalls in die Gelvertiefungen pipettiert. Nach Schließen des Deckels der
Elektrophoresekammer wurde eine Spannung von 80 V Gleichstrom über 1 h
angelegt, wobei die Wanderung der DNA-Fragmente entsprechend ihrem
Molekulargewicht erfolgte. Anschließend wurden die DNA-Banden im Gel durch UV-
Licht mit einer Intensität von 9,4 mW pro cm² unter Verwendung eines
Transilluminators (HSI Hoefer Scientific Instruments, Atlanta, USA) sichtbar gemacht.
Diese Ergebnisse wurden mit einer Polaroid MP4-Kamera (Polaroid MP4+ Instant
42
Camera System, USA) fotografisch dokumentiert. In Auswertung der Befunde
erfolgte die Größenbestimmung der DNA-Amplifikate und -Fragmente im Vergleich
zu den DNA-Fragmenten des mitgelaufenen Molekulargewichtsstandards.
����� 6WDWLVWLVFKH�$QDO\VH�GHU�8QWHUVXFKXQJVHUJHEQLVVH�Die Ergebnisse der Methoden zur Genotypisierung des VZV wurden statistisch
mittels χ2-Test bei unabhängigen Variablen miteinander verglichen. Darüber hinaus
wurde die Sensitivität der eingesetzten Verfahren ermittelt. Diese wurde als Anteil der
Untersuchungsmaterialien definiert, der korrekt als positiv durch die jeweilige
Methode erkannt werden konnte.
������� 5H]HSWXUHQ�Rp. 1: Laktalbuminhydrolysat in HANKS-Lösung
Glucose 4,00
Laktalbuminhydrolysat 5,00
Hefeextrakt 0,10
L-Glutamin 0,20
NaHCO3 0,35
Salzlösung nach HANKS (Rp. 2) ad 2000,0 ml
Rp. 2: Salzlösung nach HANKS
NaCl 8,00
KCl 0,40
MgSO4 x 7 H2O 0,20
CaCl2 0,07
KH2PO4 0,06
Na2HPO4 x 12 H2O 0,06
NaHCO3 0,35
Glucose 1,00
Aqua dest. ad 1000,00 ml
43
Rp. 3: Trypsin in Phosphatpufferlösung
NaCl 8,00
KCl 0,20
Na2HPO4 x 12 H2O 2,90
Phenolrot 0,20
Trypsin (1:250) 1,00
Aqua dest. ad 1000,00 ml
Rp. 4: Chelaplex-Trypsin-Lösung
1 Teil 0,25%iges Trypsin in Phosphatpufferlösung
4 Teile 0,02%iges Chelaplex in Phosphatpufferlösung
Chelaplex in Phosphatpufferlösung (PBS)
NaCl 8,00
KCl 0,20
Na2HPO4 x 12H2O 2,90
KH2PO4 0,20
Chelaplex 0,20
Aqua dest. ad 1000,00 ml
Rp. 5: Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)
NaCl 8,00
KCl 0,20
Na2HPO4 x 12H2O 2,90
KH2PO4 0,20
Aqua bidest. ad 1000,00 ml
Rp. 6: PCR-Puffer, 10-fach (pH 8,3)
KCl 500 mM
MgCl2 15 mM
Tris HCl 100 mM
44
Rp. 7: TBE-Puffer (5x)
Tris 54,0 g/l
Borsäure 27,5 g/l
EDTA 0,5M (pH 8,0) 20,0 ml
Rp. 8: Ladepuffer (6x)
Bromphenolblau 0,25%
Saccarose (in H2O) 40,0%
Andere Möglichkeit für Herstellung des Ladepuffers:
Bromphenolblau 10 mg
Xylencyanol 10 mg
Glycerin 5 ml
10mM EDTA 38,02 mg
Aqua dest. ad 10,00 ml
Rp. 9: Tris-HCl EDTA (TE)-Lösung (pH 8,0)
1,0 M Tris-HCl 10,0 ml
0,5 M EDTA 0,2 ml
Aqua bidest. ad 1000,00 ml
45
��� (UJHEQLVVH������� 9DULFHOOD�=RVWHU�9LUXV�*HQH����XQG����Unter Anwendung von Primern für die Gene 38 und 54 (LaRussa et al. 1992)
enthielten die Amplifikate nach der Multiplex-PCR im positiven Falle
erwartungsgemäß zwei verschieden große DNA-Fragmente, die nach Auftrennung in
der Agarosegelelektrophorese eine Größe von 350 bp (ORF 54) und 222 bp (ORF
38) aufwiesen (Abb. 8).
QSRUTWVUXZY\[U]\^_Qa`_Q2QUQaR
Abb. 8: Beispiel einer Agarosegelelektrophorese im Anschluss an die PCR
nach LaRussa et al. (1992) (Gene 38/54) mit Darstellung der
Amplifikate von zehn Untersuchungsmaterialien (Position 1 bis 10).
Position 11: VZV-Labor-Wildtyp-Stamm; Position 12: VZV-Impftyp-
Stamm. Nach der Elektrophorese sind stets zwei Banden mit einem
Molekulargewicht von 350 bp (ORF 54) und 222 bp (ORF 38) sichtbar.
Trennbedingungen: 2%ige Agarose; Laufzeit 1 h; 80 V
350 bp
222 bp
46
Bei den Ergebnissen zeigte sich, dass alle 53 angezüchteten VZV-Stämme in der
Multiplex-PCR auch als „VZV-positiv“ beurteilt werden konnten, d.h. es kamen in der
Agarosegelelektrophorese stets DNA-Fragmente mit einer Größe von 350 bp und
222 bp zur Darstellung. Im Vergleich dazu zeigte bei den 73 Patientenproben die
PCR in 60 Fällen (84,5%) ein positives, bei drei Proben (4,2%) ein schwach positives
und in zehn Fällen ein negatives Ergebnis (11,3%) (Tab. 11).
Tab. 11: Untersuchungsergebnisse von 53 VZV-Stämmen und 73
Patientenproben nach Durchführung der Multiplex-PCR zur
Amplifikation von DNA-Fragementen der ORF 38/54 nach LaRussa et
al. (1992)
�3&5�SRVLWLY�
��
3&5�VFKZDFK�SRVLWLY�
�
�3&5�QHJDWLY�
�8QWHUVXFKXQJV�PDWHULDOLHQ��Q���
Anzahl
%
Anzahl
%
Anzahl
%
VZV-Stämme (53)
����
�����
���
���
���
���
Patientenproben (73)
����
������
���
�����
����
������
Σ = 126
�����
������
���
�����
����
�����
Beim anschließenden Restriktionsenzymverdau mit den Enzymen 3VWI� und� %JOI�ergaben sich die in Abb. 9 dargestellten Banden-Muster. Die Einordnung der
dazugehörigen Patienten-Abstrichproben und VZV-Stämme in Impf- und Wildtyp-
Stämme wurde nach der von LaRussa et al. (1992) beschriebenen Nomenklatur
vorgenommen. Bei VZV-Wildtyp-Stämmen wird prinzipiell das DNA-Fragment des
ORF 54 mit 350 bp durch 3VWI� in zwei Fragmente mit einer Größe von 250 bp und
100 bp zerschnitten. Im Gegensatz dazu besitzen VZV-Impftyp-Stämme keine
47
Schnittstelle für 3VWI im ORF 54. Bei VZV-Impftyp-Stämmen lässt sich das
amplifizierte DNA-Fragment des ORF 38 durch %JOI in zwei Fragmente zerteilen, die
eine Größe von 85 bp und 137 bp besitzen. VZV-Wildtyp-Stämme können diese
Schnittstelle aufweisen. Demzufolge lassen sich %JOI-positive und %JOI-negative
Wildtyp-Stämme unterscheiden.
1 2 3
�
Abb. 9: Beispiel des Restriktionsenzymverdaus mit 3VWI� und� %JOI von PCR-
Amplifikaten der ORF 38 und 54�� Nr. 1: Wildtyp-Stamm 3VWI b%JOI b ��Nr. 2: Wildtyp-Stamm 3VWI b %JOI c ���Nr. 3: Oka-Impftyp-Stamm 3VWI c ��%JOI b �
⇐ Start 9HUGDXXQJ�PLW�3VW,�� ⇐ Start 9HUGDXXQJ�PLW�%JO,�
3VW�, d��%JO, e�2ND�,PSIW\S��6WDPP�������3VW�, e��%JO, d�:LOGW\S�6WDPP������3VW�, e�%JO, e�:LOGW\S�6WDPP
�
����ES� ����ES�����ES� ����ES�
�����ES� ����ES�
137 p
85 p
����ES�
����ES�����ES�
����ES�����ES�
����ES�
����ES�����ES�
����ES�����ES�
48
Die Auswertung aller 116 Untersuchungsmaterialien, bei denen ein positives
Ergebnis erzielt werden konnte, ergab die in Tabelle 12 aufgelisteten Resultate. Als
dominanter Genotyp wurde der Typ 3VWI b �%JOI c nachgewiesen (Abb. 10). Dieser VZV-
Genotyp lag in 108 (93,1%) von 116 Materialien vor. Dabei handelte es sich um 47
VZV-Stämme und um 61 Patientenproben. Der Genotyp 3VWI b �%JOI b (Abb. 10) bildete
mit sieben (6,0%) von 116 Untersuchungsmaterialien, fünf VZV-Stämmen und zwei
Patientenproben, die zweithäufigste Gruppe. Unter allen untersuchten Materialien
wurde nur in einem Fall (0,9%) ein Oka-Virus mit dem Genotyp 3VWI c �%JOI b gefunden
(Abb. 10). Es stammte aus der Gruppe der VZV-Stämme.
fhgjilkjmonjprqtsufavwf�fxfagufaiwfykzfymzfanwf{pwf{qwfas��������������
Abb. 10: Beispiel einer Agarosegelelektrophorese nach Verdauung der PCR-
Amplifikate des ORF 54 mit 3VWI� (obere Bildhälfte) und� %JOI� (untere
Bildhälfte). Position 1-14: Genotyp 3VWI b %JOI c , Position 15-18: Genotyp
3VWI b %JOI b , Spur 19: Oka-Impftyp 3VWI c %JOl b
i2m�v�|%}g2m�v�|%}g�g2g�|%}
f{v2v�|%}
i2m�v�|%}
g�g2g�|%} f{i2p�|%}
q~m�|%}
9HUGDX�PLW�3VW,
9HUGDX�PLW�%JO,
49
Tab. 12: Ergebnisse der Restriktionsenzymanalyse von PCR-Amplifikaten der
VZV-Gene 38/54 bei 53 VZV-Stämmen und 63 Abstrichproben von
Patienten mit VZV-Infektionen
�9=9�*HQRW\S�3VW, � �%JO, � �
�9=9�*HQRW\S�3VW, � �%JO, � �
�9=9�*HQRW\S�3VW, � �%JO, �
�8QWHUVXFKXQJV�PDWHULDOLHQ��Q��
Anzahl
%
Anzahl
%
Anzahl
%
VZV-Stämme (53)
����
������
���
�����
���
�����
Patientenproben (63)
����
������
���
�����
���
���
Σ = 116
�����
�������
���
�����
���
�����
����� 9DULFHOOD�=RVWHU�9LUXV�*HQ�����Unter Anwendung von Primern zur Amplifikation von Gensequenzen aus dem ORF
38 nach der Methode von Mori et al. (1998) wurde ein Amplifikat produziert, das nach
der elektrophoretischen Auftrennung im Agarosegel unabhängig vom VZV-Genotyp
eine Größe von 647 bp aufwies (Abb. 11).
50
�����������������������������������������������������������������������
1353
Abb. 11: Amplifikate nach der PCR mit Primern aus dem VZV-Gen 38.
Positionen 1-4: unverdaute PCR-Amplifikate mit einer Größe von 647
bp. Position 5: Molekulargewichtsstandard (MGS) IX (Roche).
Positionen 6-9: mit 3VWI�verdaute PCR-Amplifikate. 6-7: Entstehung von
DNA-Fragmenten mit einer Größe von 357 bp und 290 bp. 8-9: keine
Verdauung durch 3VWI Die Auswertung der Untersuchungen zeigte, dass bei allen 53 einbezogenen VZV-
Stämmen ein DNA-Fragment von 647 bp amplifiziert werden konnte. Dies war bei
den 73 Patientenproben in 71 Materialien (97,3%) der Fall (Tab. 13). Davon war die
PCR in 60 Proben (82,2%) deutlich positiv und in 11 (15,1%) schwach positiv. In zwei
Proben war nach der PCR kein Amplifikat nachweisbar (2,7%). Diese wurden als
negativ bewertet.
����ES�
����ES�
����ES�
0*6�,;��ES�
fai2m�ifav�p2qq2p�gn2v�i
i/f{vg2q�f�� g2p�fg2i~kfas~k
p2g
51
Tab. 13: Untersuchungsergebnisse von 53 VZV-Stämmen und 73
Patientenproben nach Durchführung der PCR zur Amplifikation eines
DNA-Fragements des ORF 38 entsprechend Mori et al. (1998)
3&5�SRVLWLY��
3&5�VFKZDFK�SRVLWLY�
�
�3&5�QHJDWLY�
�8QWHUVXFKXQJV�PDWHULDOLHQ��Q��
Anzahl
%
Anzahl
%
Anzahl
%
VZV-Stämme (53)
����
�����
���
���
���
���
Patientenproben (73)
����
������
����
������
���
�����
Σ = 126
�����
������
����
�����
���
�����
� Als Ergebnis der Restriktionsenzymverdauung mittels 3VWI� wurde zwischen 3VWI-positiven und 3VWI-negativen VZV-Genotypen unterschieden (Abb. 11). Nach
erfolgreicher Verdauung mittels 3VWI konnten in der Agarosegelelektrophorese zwei
DNA-Fragmente mit einer Größe von 357 und 290 bp dargestellt werden. Die
Stämme, deren Amplifikate sich durch 3VWI nicht spalten ließen, wurden dem Oka-
Genotyp zugerechnet. Aus Tab. 14 ist ersichtlich, dass sich nur einer von 53 VZV-
Stämmen (1,9%) als Oka-Typ erwies, was den Ergebnissen unter 4.1. entsprach. Bei
den übrigen in die Untersuchungen einbezogenen 52 VZV-Stämmen (98,1%) sowie
bei allen 60 Patientenproben (100%) wurde der VZV-Genotyp 3VWI b nachgewiesen.
�������
52
�Tab. 14:� Ergebnisse der Restriktionsenzymanalyse von PCR-Amplifikaten des
ORF 38 bei 53 VZV-Stämmen und 62 Abstrichproben von Patienten
mit VZV-Infektionen
�
*HQRW\S�3VW, � �
*HQRW\S�3VW, � ��2ND�7\S��
8QWHUVXFKXQJV�PDWHULDOLHQ��Q��
Anzahl
%
Anzahl
%
�VZV-Stämme (53)
����
������
���
�����
�Patientenproben (62)
����
�����
���
���
Σ = 115
�����
������
���
�����
����� 9DULFHOOD�=RVWHU�9LUXV�*HQ�����Unter Anwendung der PCR zur Amplifikation eines DNA-Fragmentes aus dem VZV-
Gen 62 in Anlehnung an die Methode von Loparev et al. (2000) wurden nach
Untersuchung aller 53 VZV-Stämme positive Ergebnisse nachgewiesen. Dabei
erfolgte stets mittels Agarosegelelektrophorese die Darstellung eines Amplifikats, das
die Größe von 268 bp aufwies (Tab. 15). Bei zwei der 53 Virusstämme (4%)
erbrachte die PCR jedoch nur ein schwach positives Ergebnis. Im Vergleich dazu
waren von den 73 Patientenproben 59 (80,8%) positiv. Davon zeigten sieben
Patientenproben (9,6%) schwach positive Resultate. 14 Proben (19,2%) waren in der
PCR negativ und konnten deshalb durch Restriktionsenzymanalyse nicht weiter
untersucht werden.
�
53
Tab. 15: Untersuchungsergebnisse von 53 VZV-Stämmen und 73
Patientenproben nach Durchführung der PCR zur Amplifikation eines
DNA-Fragements des ORF 62 entsprechend Loparev et al. (2000)
�3&5�SRVLWLY�
��
3&5�VFKZDFK�SRVLWLY�
�
�3&5�QHJDWLY�
�8QWHUVXFKXQJV�PDWHULDOLHQ��Q���
Anzahl
%
Anzahl
%
Anzahl
%
VZV-Stämme (53)
����
����
���
���
���
���
Patientenproben (73)
����
������
���
�����
����
������
Σ = 126
�����
������
���
�����
����
������
Bei der sich anschließenden Restriktionsenzymanalyse mit 6PDI zeigte nach
Agarosegelelektrophorese der häufigste Genotyp drei charakteristische DNA-
Banden, die einem Molekulargewicht von 153 bp, 79 bp und 36 bp entsprachen
(Abb. 12). Dies war mit dem Bandenmuster des VZV-Wildtyps vergleichbar,
unabhängig davon, ob es sich dabei um Wildtyp-Stämme aus Europa oder
Nordamerika oder um Oka-ähnliche Wildtyp-Stämme aus Japan handelte. Der VZV-
Wildtyp war bei 52 der 53 (98,1%) untersuchten VZV-Stämmen zu finden (Tab. 16).
Bei einem VZV-Stamm handelte es sich um den Oka-Impftyp-Stamm, bei dem nach
Enzymverdau die vier DNA-Banden 112 bp, 79 bp, 41 bp und 36 bp dargestellt
werden konnten. Dabei waren die DNA-Fragmente mit einer Größe von 41 bp und 36
bp meist nicht getrennt nachweisbar (s. auch Abb. 12), was jedoch auf die
Ergebnisauswertung keinen Einfluss hatte. In allen 59 Patientenproben, die in der
PCR positiv waren, konnte der VZV-Wildtyp nachgewiesen werden (Tab. 16).
54
Tab. 16: Ergebnisse der Restriktionsenzymanalyse von PCR-Amplifikaten des
ORF 62 bei 53 VZV-Stämmen und 59 Abstrichproben von Patienten
mit VZV-Infektionen
��
9=9�:LOGW\S
�2ND�,PSIW\S�
8QWHUVXFKXQJV�PDWHULDOLHQ��Q��
Anzahl
%
Anzahl
%
VZV-Stämme (53)
����
������
���
�����
Patientenproben (59)
����
�����
���
���
Σ = 112
�����
������
���
�����
���������������������������������
55
������������������������������������������������������������������
� �������
Abb. 12: Beispiel einer Agarosegelelektrophorese nach PCR-Amplifikation von
DNA-Sequenzen des ORF 62. Positionen 1-3: Amplifikate mit 268 bp,
Position 4: Molekulargewichtsstandard (MGS) V (Roche). Positionen 5-
10: Restriktionsenzymanalyse mit 6PDI. 5-6, 9-10: Oka-Impftyp. 7-8:
VZV-Wildtyp.
����ES�
����ES�����ES�
���ES�������ES�
���ES�
0*6�9��ES���������������������������������������������������������
56
������ =XVDPPHQIDVVXQJ� XQG� 9HUJOHLFK� GHU� (UJHEQLVVH� ]XU� *HQRW\SLVLHUXQJ���� GHV�9DULFHOOD�=RVWHU�9LUXV�Alle VZV-Stämme konnten mittels PCR zur Amplifikation von DNA-Fragmenten der
ORF 38, 54 und 62 sowie anhand der sich anschließenden
Restriktionsenzymanalyse genotypisiert werden. Die direkte Genotypisierung von
viraler DNA in den Abstrichmaterialien der Patientenstämme war anhand von
Sequenzen der Gene 38/54 in 63 von 73 DNA-Proben (86,3%) erfolgreich (Tab. 17).
Unter Anwendung anderer Primer des Gens 38 wurden bei 62 von 73
Patientenproben (84,9%) positive Ergebnisse erzielt. Die PCR zur Amplifikation von
Fragmenten des ORF 62 einschließlich Restriktionsenzymanalyse war in 59 der 73
Proben positiv (80,8%). Prinzipiell war nach erfolgreicher Amplifikation, unabhängig
davon, ob es sich um ein deutlich positives oder schwach positives Ergebnis
handelte, stets eine erfolgreiche Analyse der DNA-Fragmente durch
Restriktionsenzyme möglich.
Der Ergebnisvergleich aller Untersuchungsmaterialien, d.h. der VZV-Stämme und
Patientenproben, zeigte, dass es unter Verwendung des ORF 62 wesentlich mehr
schwach positive sowie negative Ergebnisse gab, als dies bei den ORF 38 und 54
der Fall war. Die Anzahl der schwach positiven Resultate in der PCR betrug unter
Einbeziehung aller Materialien beim ORF 62 7,1%, beim ORF 38 1,6% und bei der
Multiplex-PCR zur Amplifikation von Sequenzen der ORF 38/54 2,4% (Tab. 17). Die
meisten negativen Ergebnisse waren beim ORF 62 mit 11,1% der Patientenproben
zu verzeichnen, während beim ORF 38 zu 8,7% und beim ORF 38/54 zu 7,9%
negative Ergebnisse zu finden waren. Sowohl die Unterschiede bezüglich schwach
positiver Resultate als auch die Differenzen hinsichtlich positiver und negativer
Ergebnisse aller drei Methoden waren statistisch nicht signifikant und damit relativ
gering.
Für die Multiplex-PCR zum Nachweis von DNA-Sequenzen der ORF 38/54 wurde mit
92,1% die höchste Sensitivität ermittelt, gefolgt von der Methode zur Amplifikation
des ORF 38 mit 91,3%. Das Verfahren zur Darstellung von DNA-Sequenzen des
ORF 62 wies mit 88,8% die niedrigste Sensitivität auf (Tab. 17).
57
Tab. 17: Vergleich der Ergebnisse zur Genotypisierung von 53 VZV-Stämmen
und 73 Abstrichmaterialien von Patienten mit VZV-Infektionen nach
PCR und Restriktionsenzymanalyse der ORF 38, 54 und 62
�25)����XQG����
��
�25)����
�25)����
�8QWHUVXFKXQJV�PDWHULDOLHQ��Q�� �
Anzahl
%
Anzahl
%
Anzahl
%
�9=9�6WlPPH�������Positiv Schwach positiv Negativ �
53
0
0
100
0
0
53 0 0
100 0 0
51 2 0
96,2
3,8 0
�3DWLHQWHQSUREHQ�������Positiv Schwach positiv Negativ�
60
3
10
82,2
4,1
13,7
60 2
11
82,2
2,7
15,1
52 7
14
71,2
9,6
19,2
�6��������Positiv Schwach positiv Negativ �
���
113
3
10�
���
������
�����
����
���
113 2
11�
���
������
�����
����
���
103 9
14�
���
������
�����
������6HQVLWLYLWlW������
������
������
������
����
58
����� (UJHEQLVVH�GHU�*HQRW\SLVLHUXQJ�LQ�%H]XJ�]XU�NOLQLVFKHQ��'LDJQRVH�XQG���� GHP�$OWHU�GHU�3DWLHQWHQ�Die dominierende Erkrankung in dieser Studie war der Zoster bei 101 von 116
einbezogenen Patienten, was einem Anteil vom 87,1% entspricht (Tab. 18). Das
Durchschnittsalter dieser Patienten lag bei 47 Jahren. Von den VZV-Stämmen
wurden 44 und von den Patientenproben 57 der klinischen Diagnose Zoster
zugeordnet. 98 dieser Erkrankungen wurden durch Wildtyp-VZV mit dem Genotyp
3VWI b %JOI c � (97%), zwei durch Wildtyp-VZV 3VWI b %JOI b (2,0%) und ein Fall durch den
Oka-Impftyp 3VWI c �%JOI b �(1,0%) verursacht.
Die klinische Diagnose bei den restlichen 15 Patienten (22,9%) lautete Windpocken,
wobei neun VZV-Stämme und sechs Proben von Patienten mit Windpocken
stammten. Das durchschnittliche Alter dieser Patienten betrug neun Jahre.
Dominanter Genotyp war bei den Patienten mit Varizellen in zehn Fällen ebenfalls
der Wildtyp 3VWI b �%JOI c (66,7%). Bei insgesamt fünf Patienten kam der��Wildtyp 3VWI b%JOI b (33,3%) vor. Der Oka-Impftyp 3VWI c %JOI b wurde bei keinem Patienten mit
Windpocken beobachtet.
Berücksichtigt man alle einbezogenen Patienten, so wurde der VZV-Wildtyp 3VWI b%JOI c �bei 93,1% mit einem Durchschnittsalter von 47 Jahren nachgewiesen. Bei 6%
der Patienten mit einem durchschnittlichen Alter von 14 Jahren war der Wildtyp %JOI b �3VWI b vorhanden und ein Patient war im Alter von zwei Jahren an einem Zoster durch
den Oka-Impftyp 3VWI c �%JOI b � erkrankt.
Die Genotypen der als Kontrollen mitgeführten VZV-Prototypstämme sind in der
Tabelle 19 zusammengefasst.
59
Tab. 18: Genotypisierung der viralen DNA von 53 VZV-Stämmen und 63
Proben von Patienten mit VZV-Infektion in Abhängigkeit von der
klinischen Diagnose und dem Alter
�:LOG�7\S�3VW, � �%JO, �
�:LOG�7\S�3VW, � %JO, � �
�,PSI�7\S�3VW,� � �%JO, � �
�8QWHUVXFKXQJV�PDWHULDOLHQ��Q���
�'XUFKVFKQLWWV��
DOWHU�GHU�3DWLHQWHQ�
� �n
%
n
%
N
%
�9=9�6WlPPH�������Varizellen (9) Zoster (44)
11
53
47 4
43
88,7
44,4
97,7
5 5 0
9,4
55,5
97,7
1 0 1
1,9
0
2,3
3DWLHQWHQSUREHQ������ Varizellen (6) Zoster (57)
7
38
61 6
55
96,8
100
96,5
2 0 2
3,2
0
3,5
0 0 0
0 0 0
�6��������Varizellen (15) 22,9% Zoster (101) 87,1%
9
47
108
10
98
������
������
����
7 5 2
�����
������
���
1 0 1
��������
���
60
Tab. 19: Genotypen der als Kontrollen mitgeführten VZV-Prototypstämme
�9=9�3URWRW\SVWDPP�
�*HQRW\S�
VZV Wildtyp-Stamm YS-R, TK-
Wildtyp 3VWI b �%JOI c
VZV Impftyp-Stamm Oka ATCC VR-795
Impftyp 3VWI c �%JOI b
VZV Impftyp-Stamm Oka 07-1
Impftyp 3VWI c �%JOI b
VZV Impftyp-Stamm Oka, Varilrix 1991
Impftyp 3VWI c �%JOI b
VZV Impftyp-Stamm Oka I, Varilrix 1995
Impftyp 3VWI c �%JOI b
VZV Impftyp-Stamm Oka II, Varilrix
1999
Impftyp 3VWI c �%JOI b
61
��� 'LVNXVVLRQ�Mit der Einführung der allgemeinen Varizellenimpfung macht sich eine
epidemiologische Surveillance zirkulierender VZV-Stämme erforderlich. Wesentliche
Gründe dafür sind, dass das Impfvirus auch in der Lage ist, einen Zoster auszulösen
(Gershon et al. 2001) und in seltenen Fällen von Geimpften auf empfängliche
Personen übertragen werden kann (Tsolia et al. 1990). Darüber hinaus muss bei
Varizellen oder Zoster nach Impfung eine Unterscheidung von Impf- und Wildtyp-VZV
erfolgen. Da eine zuverlässige Differenzierung von Wild- und Impftyp-Viren nur
mittels Genotypisierung möglich ist, war es das Ziel der vorliegenden Arbeit,
Methoden zur Charakterisierung des VZV-Genotyps zu etablieren und sie hinsichtlich
ihres Einsatzes in der virologischen Routinediagnostik zu testen. Aufgrund der
Tatsache, dass in der Literatur bislang keine Daten zur molekularen Epidemiologie
des VZV in Deutschland existieren, sollten erstmals grundlegende Erkenntnisse über
die Verteilung verschiedener Genomtypen des VZV in Thüringen gewonnen werden.
Dazu war die Einbeziehung einer repräsentativen Anzahl an VZV-Isolaten und
Untersuchungsmaterialien von Patienten mit Windpocken oder Zoster notwendig.
In den vorliegenden Untersuchungen wurden 53 VZV-Isolate und 73 Proben von
Patienten mit VZV-Infektionen hinsichtlich genetischer Marker der ORF 38, 54 und 62
unter Einbeziehung der PCR sowie der Restriktionsenzymanalyse untersucht. Alle
geprüften Virusisolate waren zuvor unter Verwendung monoklonaler Antikörper
gegen das virale Glykoprotein I zweifelsfrei als VZV-Stämme identifiziert worden
(Sauerbrei et al. 1999). In allen Patientenproben, bei denen es sich meistens um
Bläscheninhalt von Hauteffloreszenzen handelte, konnte im Vorfeld der
Untersuchungen mittels PCR unter Einbeziehung von Primern der ORF 4, 28 und 29
(Sauerbrei et al. 1999) der Nachweis von VZV-DNA geführt werden. Wie die
Ergebnisse der Experimente belegen, wurden alle 53 VZV-Isolate genetisch typisiert.
Mittels direkter Genotypisierung der viralen DNA in den Patientenproben wurden 63
der 73 Materialien (86,3%) charakterisiert, wenn Primer der ORF 38 und 54
eingesetzt wurden. Im Vergleich dazu erbrachte die PCR zur Amplifikation des Gens
62 in 59 Fällen (80,8%) positive Ergebnisse, die sich mittels nachfolgender
Verdauung durch Endonukleasen weiter spezifizieren ließen. Diese Ergebnisse
belegen eine reduzierte Sensitivität der Methoden zur Genotypisierung im Vergleich
zur hochsensitiven diagnostischen PCR. Die Ursache dafür kann in der Amplifikation
differenter DNA-Fragmente des VZV-Genoms gesehen werden. Ergebnisse aus der
62
Literatur unter Einbeziehung von DNA-Oligonukleotiden der ORF 4, 13, 28, 29, 36,
62, 63 und 68 belegen eine unterschiedliche Sensitivität von PCR-Methoden zum
Nachweis von VZV-DNA (Dlugosch et al. 1991, Kido et al. 1991, Sauerbrei et al.
1999).
Die zur Genotypisierung eingesetzten PCR-Methoden zeigten in den eigenen
Untersuchungen auch Unterschiede bezüglich ihrer Sensitivität, wobei die Multiplex-
PCR zur Amplifikation von DNA-Fragmenten der Gene 38/54 die höchste
Empfindlichkeit aufwies. Insgesamt waren die Sensitivitätsunterschiede jedoch
statistisch nicht signifikant und damit relativ gering. Um die Frage beantworten zu
können, welche Methode eine zuverlässige routinemäßige Genotypisierung des VZV
einschließlich Unterscheidung von Wild- und Impftyp-Viren gestattet, ist es
notwendig, Vor- und Nachteile der eingesetzten Verfahren zu analysieren (Tab. 20).
Zunächst bleibt festzustellen, dass alle Methoden Erfahrungen bei der Durchführung
molekularbiologischer Untersuchungen sowie einen relativ hohen apparativen
Aufwand erfordern. Diese Voraussetzungen sind meist nur an virologischen
Speziallaboratorien gegeben. Von allen eingesetzten Verfahren gestattet nur die
Analyse des ORF 62 (Loparev et al. 2000) eine universelle Unterscheidung von VZV-
Wild- und Impftyp-Stämmen auch unter Einschluss japanischer Oka-ähnlicher
Wildtyp-Isolate. Die beiden anderen Methoden zur gemeinsamen Charakterisierung
der ORF 38/54 (LaRussa et al. 1992) bzw. nur zur Analyse des ORF 38 (Mori et al.
1998) erlauben eine Unterscheidung von europäischen und nordamerikanischen
Wildtyp-Isolaten von Oka-ähnlichen Wild- oder Impftyp-Stämmen. Da Oka-ähnliche
Wildtyp-Stämme in Europa und Nordamerika mit Ausnahme japanischer Kommunen
nicht vorkommen, wurden in Großbritannien und in den USA bislang meist nur die
ORF 38/54 in entsprechenden Untersuchungen charakterisiert (Hawrami und Breuer
1997, Gershon et al. 1999). Die gemeinsame Charakterisierung der ORF 38/54 hat
den Vorteil, den %JOI-Polymorphismus des Gens 54 mit in die Untersuchungen
einzubeziehen. Die alleinige Analyse des ORF 38 entsprechend der Methode nach
Mori et al. (1998) bringt im Vergleich dazu keinen Erkenntnisgewinn, so dass auf sie
verzichtet werden kann. Für Genotypisierungsversuche in Deutschland sollte in der
Regel die Einbeziehung des Verfahrens nach LaRussa et al. (1992) ausreichen.
Beim Nachweis 3VWI-negativer Stämme ist jedoch für eine zweifelsfreie Abgrenzung
des Oka-Impfstammes die Analyse des ORF 62 in Anlehnung an die von Loparev et
al. (2000) beschriebene Methode notwendig.
63
Tab. 20: Vor- und Nachteile der eingesetzten Methoden zur Genotypisierung des
VZV
�0HWKRGH�
�9RUWHLOH�
��
1DFKWHLOH��
$QDO\VH�25)��������/D5XVVD�HW�DO��������
�
Unterscheidung der Oka-Impfstämme und Oka-ähnlichen Stämme von europäischen und nordamerikanischen Wildtyp-Stämmen Charakterisierung des %JOI-Polymorphismus des ORF 54 Höchste Sensitivität in der vorliegenden Studie
Keine universelle Genotypisierung unter Einschluss japanischer Wildtypstämme
�$QDO\VH�25)�����0RUL�HW�DO��������
�
Keine Vorteile im Vergleich zur Analyse ORF 38/54
Keine universelle Genotypisierung unter Einschluss japanischer Wildtypstämme Keine Charakterisierung des %JOI-Polymorphismus des ORF 54
�$QDO\VH�25)����
�/RSDUHY�HW�DO���������
Universelle Unterscheidung von VZV-Wild- und Impftyp-Stämmen unter Einschluss japanischer Wildtypstämme
Keine Unterscheidung der Oka-Impfstämme und Oka-ähnlichen Stämme von europäischen und nordamerikanischen Wildtyp-Stämmen Keine Charakterisierung des %JOI-Polymorphismus des ORF 54 Niedrigste Sensitivität in der vorliegenden Studie
64
Aus den vorliegenden Ergebnissen kann geschlussfolgert werden, dass die
Genotypisierung von VZV-Isolaten als Methode der Wahl anzusehen ist. Die
Verwendung von Virus-Isolaten ist auch deshalb von Vorteil, weil eine große Menge
an viraler DNA für die Untersuchungen bereitgestellt werden kann. Dies ermöglicht
auch eventuelle Sequenzierungsexperimente zum detaillierten Nachweis
genomischer Veränderungen. Allerdings sollte in zusätzlichen Untersuchungen
abgesichert werden, ob sich die zu analysierenden viralen Genomabschnitte auch
stabil verhalten, wenn das Virus über mehrere Zellkulturpassagen geführt wird. Des
weiteren ist bei der Virusanzucht in Zellkulturen zu berücksichtigen, dass die
Viruskultur wenig sensitiv und sehr zeitaufwendig ist sowie ein hohes Maß an
Erfahrung von Seiten des Untersuchers erfordert (Dlugosch et al. 1991, Coffin und
Hodinka 1995, Sauerbrei et al. 2002). Unter optimalen Abnahme-, Transport- und
Kulturbedingungen lässt sich die Sensitivität der Virusanzüchtung jedoch verbessern.
Eine große Bedeutung kommt dabei einer sorgfältigen und frühzeitigen Gewinnung
von Bläschenabstrichen zu. Trotz geringerer Erfolgschancen im Vergleich zur
Genotypisierung von Virusisolaten sollte eine direkte Genotypisierung in
Patientenproben versucht werden. Dies ist von besonderer Bedeutung, wenn das
Ergebnis schnell verfügbar sein soll oder kein geeignetes Untersuchungsmaterial wie
z.B. Bläscheninhalt für die Virusisolierung in Zellkulturen zur Verfügung steht. Wie die
eigenen Untersuchungen gezeigt haben, ist bei zweifelhaften Ergebnissen eine
Versuchswiederholung meist nicht möglich, da die präparierte DNA-Ausbeute aus
den Patientenproben relativ gering ist.
Die vorliegenden Ergebnisse belegen weiterhin, dass alle typisierten DNA-
Materialien bis auf eine Ausnahme eine 3VWI-Schnittstelle im Gen 38 aufwiesen. Dies
entspricht den bereits publizierten Ergebnissen in den USA und Großbritannien
(Hawrami und Breuer 1997, Gershon et al. 1999). Der dominante Genotyp besaß die
Wildtyp-Marker 3VWI+ %JOI¯ . Er wurde bei 93,1% aller Patienten mit einem
Durchschnittsalter von 47 Jahren nachgewiesen. 90,7% dieser Patienten hatten
einen Zoster, und 9,3% waren an Varizellen erkrankt. Bei 6% aller Patienten mit
einem Durchschnittsalter von 14 Jahren ließ sich der Wildtyp 3VWI+ %JOI+ nachweisen.
Fünf dieser Patienten entwickelten Varizellen und zwei erkrankten an einem Zoster.
Bei einem Patienten wurde der Oka-Impftyp 3VWI¯ %JOI+ gefunden. Es handelte sich
dabei um ein Kind, das 16 Monate nach Varizellenimpfung einen Zoster entwickelte
(Uebe et al. 2002).
65
Im Ergebnis der Untersuchungen ließen sich alle Wildtyp-Stämme durch eine 3VWI-Schnittstelle im Gen 38 vom Oka-Impfstamm unterscheiden, der diese Schnittstelle
nicht aufweist. Im Gegensatz dazu besitzen Wildtyp-Stämme, die in Japan
zirkulieren, zu 20 bis 30% keine 3VWI-Schnittstelle im Gen 38 und sind damit von
Oka-Impftyp-Stämmen bezüglich dieses Markers nicht zu unterscheiden. Für 3%
aller Wildtyp-Stämme wurden im Vergleich zum VZV-Stamm Oka identische
polymorphe Marker nachgewiesen (Takada et al. 1995). Aus diesem Grunde erlaubt
die Beurteilung des 3VWI-Polymorphismus im Gen 38 nur außerhalb Japans oder
japanischer Kommunen eine zuverlässige Unterscheidung von Oka-ähnlichen
Stämmen und Wildtyp-Isolaten. In den vergangenen Jahren gelang es der
japanischen Arbeitsgruppe um Gomi (Gomi et al. 2001), zahlreiche Mutationen bei
Oka-Impfstämmen im Vergleich zu Oka-ähnlichen und –nichtähnlichen Wildtyp-
Stämmen im ORF 62 nachzuweisen. Aufgrund dieser Veränderungen im IE-Gen des
VZV ist es möglich, Oka-Impfstämme von allen in und außerhalb Japans
zirkulierenden Wildtyp-Stämmen mittels Charakterisierung des ORF 62 zu
unterscheiden. Ein Verfahren, das auf der Amplifikation eines 268 bp großen DNA-
Fragmentes des ORF 62 mit nachfolgender Restriktionsenzymanalyse beruht
(Loparev et al. 2000), wurde auch im Rahmen dieser Arbeit etabliert und an allen
einbezogenen VZV-Stämmen und VZV-DNA-positiven Patientenproben getestet. Wie
die eigenen Ergebnisse und Befunde aus der Literatur belegen, gelingt durch die
Verdauung des PCR-Amplifikates mit der Endonuklease 6PDI eine universelle
Differenzierung des Oka-Impfvirus von Wildtyp-Stämmen, die sowohl in Europa und
Nordamerika als auch in Japan zirkulieren (Loparev et al. 2000).
Wird das ORF 54 ebenfalls in die Untersuchungen einbezogen, so können Wildtyp-
Stämme aufgrund eines unterschiedlichen Restriktionsenzymmusters nach Spaltung
mit %JOI in %JOI+- und %JOI -̄Stämme unterteilt werden (Hawrami und Breuer 1997,
Gershon et al. 1999). Wild-Stämme des %JOI+-Genotyps ließen sich im Rahmen der
eigenen Untersuchungen nur mit einem Anteil von 6% nachweisen. Dieser Anteil
könnte auch als repräsentativ für Thüringen bzw. für Deutschland angesehen
werden, wobei in weiterführenden Untersuchungen eine Absicherung dieser Befunde
an einer größeren Anzahl von Patientenproben mit unterschiedlicher regionaler
Verteilung angestrebt werden sollte. Im Vergleich zu diesen Ergebnissen wurden in
den USA und in Großbritannien bei ca. 20% aller Wildtyp-Stämme eine %JOI-Schnittstelle im ORF 54 gefunden (Hawrami und Breuer 1997, Gershon et al. 1999).
66
Eine stetige Zunahme der Prävalenz von %JOI+-Stämmen zeigte sich in den
vergangenen Jahren in Großbritannien. Diese genetische Variante des VZV wurde
vor allem bei Personen mit Zoster nachgewiesen, die aus tropischen Ländern Asiens,
Afrikas und der Karibik eingewandert waren (Hawrami et al. 1997). In diesen
Ländern, die auch als Niedrig-Prävalenz-Gebiete bezeichnet werden, besteht im
Unterschied zu Europa und Nordamerika eine relativ geringe VZV-Durchseuchung im
Erwachsenenalter. Bis zu 50% der jungen Erwachsenen haben noch keine VZV-
Primärinfektion durchgemacht und sind für das Virus empfänglich (Garnett et al.
1993). Diese spät einsetzende Durchseuchung wird damit erklärt, dass die
Übertragung des VZV im feuchten und heißen Klima weniger effektiv erfolgt als in
gemäßigten Klimazonen. %JOI+-Stämme wurden in Großbritannien aber auch
zunehmend bei Kindern mit Varizellen nachgewiesen, was für eine vermehrte
Zirkulation dieser genetischen Variante spricht. Insgesamt führten diese Befunde zur
Annahme, dass %JOI+-VZV-Wildtyp-Stämme aus tropischen Ländern eingeschleppt
werden und nicht das Ergebnis von Stamm-Mutationen sind.
Aus den in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnissen sowie den in der Literatur
dokumentierten Befunden kann die Schlussfolgerung abgeleitet werden, dass
Wildtyp-Stämme mit einer %JOI-Schnittstelle im Gen 54 in Deutschland bedeutend
seltener vorkommen als in den USA und Großbritannien. Dies könnte auf einen
wesentlich geringeren Anteil an Einwanderern aus Ländern mit geringer
Antikörperprävalenz im Erwachsenenalter zurückzuführen sein.
Überraschenderweise hatten jedoch fünf der sieben Patienten mit %JOI-positiven
Stämmen Varizellen und nur bei zwei dieser Patienten wurde ein Zoster
diagnostiziert. Das Durchschnittsalter der Patienten mit %JOI+-Stämmen war mit 14
Jahren auch bedeutend niedriger als das der Patienten mit %JOI -̄Stämmen, die im
Durchschnitt 47 Jahre alt waren. Der gehäufte Nachweis von %JOI+-Stämmen bei
Varizellen könnte darauf hindeuten, dass dieser Genotyp des VZV in Zukunft auch
vermehrt in Deutschland auftreten wird. Für eine zweifelsfreie Absicherung dieser
Befunde wäre jedoch die Untersuchung einer größeren Anzahl von Patienten mit
Varizellen notwendig. Bis heute ist nicht bekannt, ob der %JOI-Polymorphismus von
VZV-Stämmen auch mit Differenzen hinsichtlich der Pathogenese und Virulenz
verbunden ist.
Bei Oka-Impfstämmen lässt sich im Vergleich zu Wildtyp-Stämmen, die nur teilweise
%JOI+ sind, prinzipiell immer eine %JOI-Schnittstelle im ORF 54 nachweisen. Aufgrund
67
dieser Befunde stellt sich die Frage, ob Wildtyp-Stämme diese Mutation von Impftyp-
Stämmen durch genetische Rekombination erworben haben, wie dies beispielsweise
von den Influenza A-Viren bekannt ist. Da der %JOI-Polymorphismus des ORF 54 in
klinischen Isolaten jedoch bereits vor der Einführung der Varizellen-Schutzimpfung
nachgewiesen werden konnte, geht man davon aus, dass diese genetischen
Veränderungen höchstwahrscheinlich als Ergebnis einer Basenpaar-Mutation
entstanden sind (LaRussa et al. 1992). Sie haben ihre Ursache deshalb vermutlich
nicht in genetischen Rekombinationen zwischen dem Oka-Impftyp- und Wildtyp-VZV,
obwohl ein Austausch von Genen zwischen unterschiedlichen VZV-Stämmen sowohl
LQ� YLWUR (Dohner et al. 1988) als auch LQ� YLYR (Shiraki et al. 1991) belegt werden
konnte.
In der Literatur werden weitere Genmarker des VZV für eine mögliche
Unterscheidung von Impf- und Wildtyp-VZV beschrieben. Dazu gehören vor allem
Regionen des VZV-Genoms wie die R2 und R5 repeat regions, die eine
unterschiedliche Anzahl sich wiederholender DNA-Fragmente enthalten (Takada et
al. 1995). Am besten untersucht ist bislang die R5 repeat region, die zwischen den
ORF 60 und 61 des VZV-Genoms lokalisiert ist (Abb. 13). Entsprechend dem
Vorkommen von sich wiederholenden DNA-Fragmenten mit einer Größe von 24 bp
und 88 bp können die VZV-Allele R5A, R5B und R5C unterschieden werden.
Bisherige Daten sprechen dafür, dass die R5-Region von Oka-Stämmen polymorph
sein kann und deshalb nicht für eine molekulare Charakterisierung von Oka-
Impfstämmen geeignet ist (Sauerbrei et al. 2003a). Prinzipiell haben Oka-
Impfstämme, die aus Japan stammen, zwei sich wiederholende R5-Einheiten, was
als R5B-Allele bezeichnet wird (Yoshida und Tamura 1999). In Übereinstimmung
damit lassen sich 75% aller Wildtyp-Stämme in Japan der R5B-Allele zuordnen
(Takada et al. 1995). Bei Oka-Impfstämmen, die außerhalb Japans produziert
wurden, kann nur eine R5-Einheit existieren, was der R5A-Allele entspricht (Hawrami
und Breuer 1997). Da sich die R5 repeat region auch nach zahlreichen
Zellkulturpassagen stabil verhalten soll (Hondo und Yogo 1988), sind die Gründe für
die Variabilität der R5-Region von Oka-Impfstämmen bislang unbekannt.
68
Abb. 13: Struktur der R5 repeat region, nach Yoshida und Tamura (1999)
Nur ein Virusisolat wurde im Rahmen dieser Arbeit als VZV-Oka-Impfstamm
charakterisiert. Diese Ergebnisse belegen, dass das Oka-Impfvirus in Deutschland
bislang sehr selten bei Personen nachweisbar ist. Dies ist auch nicht verwunderlich,
da die Varizellenimpfung in den vergangenen Jahren nur in relativ wenigen Fällen
durchgeführt wurde. Der nachgewiesene Oka-Virusstamm war von einem 2-jährigen
Kind mit Zoster isoliert worden, der 16 Monate nach der Varizellenimpfung
aufgetreten war. Mit hoher Wahrscheinlichkeit handelt es sich um das weltweit
bislang erste Virusisolat von einem Zoster nach Impfung. Insgesamt wurde das Oka-
Impfvirus bis heute nur bei wenigen Kindern mit Zoster nachgewiesen (Liang et al.
1998, Brunell und Argaw 2000, Sharrar et al. 2000). In einer 2001 veröffentlichten
Studie zur Bewertung des Varizellenimpfstoffes durch Merck Research Laboratories
(USA) wurde über 205 Zoster-Fälle pro 16,1 Millionen Impfungen (1,3/100.000) mit
dem Impfstoff Varivax berichtet (Sharrar et al. 2000). Davon traten 143
Erkrankungen bei Kindern unter fünf Jahren auf, was einem Anteil von 77%
entspricht. In den Untersuchungsmaterialien, die für eine Genotypisierung des
Erregers zur Verfügung standen, wurde in 22 Fällen der Oka-Impfstamm und in zehn
Fällen das Wildtyp-VZV nachgewiesen (LaRussa et al. 2000). Diese Ergebnisse
zeigen, dass ein Zoster bei geimpften Kindern selten auftritt. Zur zweifelsfreien
Unterscheidung eines Zosters durch Wild- oder Impftyp-Viren ist jedoch eine
virologische Diagnostik einschließlich Genotypisierung zu fordern.
69
In dem beobachteten Fall trat die Zoster-Erkrankung bei einer 27 Monate alten
Patientin im Bereich des rechten Unterarms und Handrückens auf (Abb. 14) (Uebe et
al., 2002). Das Kind wurde im Alter von 11 Monaten mit dem Impfstoff Varilrix
(GlaxoSmithKline) gegen Varizellen geimpft. Die Impfung erfolgte nicht in
Übereinstimmung mit den zu dieser Zeit geltenden Impfempfehlungen der STIKO
(STIKO 2001) als Postexpositionsprophylaxe zwei Tage nachdem die Schwester an
Varizellen erkrankt war. Bei dem geimpften Kind bestanden keine Hinweise auf eine
angeborene oder erworbene Immundefizienz. Unter intravenöser antiviraler Therapie
mit Aciclovir in einer Dosierung von 10 mg/kg Körpergewicht dreimal täglich über 7
Tage heilte der Zoster innerhalb von zwei Wochen komplikationslos ab. Serologische
Untersuchungen ergaben die für einen Zoster „typische Antikörperkonstellation“, d.h.
den Nachweis von VZV-spezifischen IgA-Antikörpern in hohen Titern (Sauerbrei et al.
2002). Während spezifische IgM-Antikörper mittels ELISA (Virion/Serion, Würzburg)
nicht nachweisbar waren, konnte innerhalb von 14 Tagen nach Krankheitsbeginn ein
signifikanter Anstieg der spezifischen IgG-Antikörper belegt werden. Auch dies sind
oft zu findende serologische Befunde bei Zoster. Aus dem Bläscheninhalt, gewonnen
am 4. und 7. Tag der Erkrankung, gelang sowohl der VZV-DNA-Nachweis mittels
PCR als auch die Virusanzüchtung in primären humanen Strumazellen (Sauerbrei et
al. 2003b).
Abb. 14: Typisches klinisches Bild eines Zoster am rechten Arm und der Hand
(C6 – C8) 4 Tage nach Krankheitsausbruch, Quelle: Uebe et al. 2002
70
Das Virusisolat wies im Gegensatz zum in Deutschland vorkommenden Wildtyp-VZV
keine Schnittstelle für 3VWI im ORF 38 auf. Im ORF 54 war eine Schnittstelle für %JOI vorhanden. Beide Befunde zusammen sprechen für einen Oka-Stamm. Durch die
Amplifikation des ORF 62 und anschließende Verdauung mit 6PDI entsprechend der
Methode von Loparev et al. (2000) konnte zweifelsfrei belegt werden, dass es sich
bei dem Zoster-Isolat um ein Oka-Impfvirus handelte.
Über die Ursachen, warum das attenuierte Oka-Impfvirus in seltenen Fällen in der
Lage ist, einen Zoster auszulösen, ist bis heute wenig bekannt. In der Literatur wurde
postuliert, dass das Zoster-Risiko erhöht ist, wenn nach Impfung ein Befall der Haut
entweder als impfbegleitender Rash oder in Form milder Varizellen auftritt (Hardy et
al. 1991). Anlass dafür waren Beobachtungen, dass Impflinge, bei denen ein
Impfexanthem aufgetreten war, häufiger einen Zoster bekamen als diejenigen ohne
Hauterscheinungen. Durch eine Beteiligung der Haut soll das Impfvirus in der Lage
sein, die proximalen Nervenenden zu erreichen und eine Viruslatenz zu etablieren.
Im beschriebenen Fall konnte keine Beteiligung der Haut beobachtet werden (Uebe
et al. 2002). Darüber hinaus bestand kein klinisch und labordiagnostisch fassbarer
Immundefekt. Dies könnte darauf hinweisen, dass auch mögliche Faktoren von
Seiten des Impfstoffes die Entstehung eines Zosters begünstigen können.
Zusammenfassend und schlussfolgernd lässt sich sagen, dass in der vorliegenden
Arbeit wesentliche Erkenntnisse über das methodische Vorgehen bei der
Genotypisierung von VZV-Isolaten gewonnen werden konnten. Unter Einbeziehung
der beschriebenen molekularbiologischen Untersuchungen gelang es, Impftyp-
Stämme von Wildtyp-Stämmen sicher abzugrenzen. Durch die Analyse von VZV-
Isolaten und VZV-DNA-positiven Materialien von Patienten mit Varizellen oder Zoster
konnten erstmals Daten zur Verteilung verschiedener VZV-Genotypen in
Deutschland gewonnen und Unterschiede zu anderen europäischen und
außereuropäischen Ländern aufgezeigt werden. Die gewonnenen
Untersuchungsergebnisse stellen eine gute Grundlage für weiterführende gezielte
Untersuchungen an einer größeren Anzahl von Patientenproben dar.
71
��� 6FKOXVVIROJHUXQJHQ�• Mit der Einführung der Varizellenimpfung ist eine epidemiologische Surveillance
zirkulierender VZV-Stämme erforderlich. Darüber hinaus muss bei Varizellen oder
Zoster nach Impfung eine Unterscheidung von Impf- und Wildtyp-VZV erfolgen.
• Eine zuverlässige Unterscheidung von Impf- und Wildtyp-VZV ist nur mittels
Genotypisierung möglich. Dies setzt Erfahrungen bei der Durchführung
molekularbiologischer Arbeiten sowie einen relativ hohen apparativen Aufwand
voraus.
• Unter Einbeziehung der ORF 38, 54 und 62 gelingt mittels PCR und
nachfolgender Restriktionsenzymanalyse die zuverlässige Genotypisierung des
VZV. Als Methode der Wahl ist die Genotyp-Bestimmung von VZV-Isolaten
anzusehen.
• Eine direkte Genotypisierung der viralen DNA in Patientenproben sollte versucht
werden, wenn das Ergebnis schnell verfügbar sein soll und kein geeignetes
Untersuchungsmaterial für die Virusisolierung zur Verfügung steht.
• Die höchste Sensitivität weist die Multiplex-PCR zur gleichzeitigen Amplifikation
von DNA-Fragmenten der ORF 38 und 54 auf.
• Die gleichzeitige Analyse der ORF38/54 erlaubt eine Unterscheidung von
europäischen und nordamerikanischen Wildtyp-Isolaten von Oka-ähnlichen Wild-
oder Impftyp-Stämmen. Parallel dazu kann der %JOI-Polymorphismus des Gens
54 mit abgeklärt werden.
• Mittels Charakterisierung von DNA-Fragmenten des ORF 62 ist eine universelle
Differenzierung von VZV-Wild- und Impftyp-Stämmen auch unter Einschluss
japanischer Oka-ähnlicher Wildtyp-Isolate möglich.
• Alle typisierten VZV-Wildtyp-Stämme enthielten eine 3VWI-Schnittstelle im ORF
38. Dies entspricht den publizierten Ergebnissen in den USA und in
Großbritannien.
• Der dominante Genotyp besaß die Wildtyp-Marker 3VWI+ %JOI .̄ Er wurde in über
90% der Fälle bei Patienten mit Zoster und einem Durchschnittsalter von 47
Jahren nachgewiesen.
72
• Bei 6% aller Patienten mit einem Durchschnittsalter von 14 Jahren ließ sich der
Wildtyp 3VWI+ %JOI+ nachweisen, wobei die Mehrzahl dieser Patienten an
Varizellen erkrankt war.
• Wildtyp-Stämme mit einer %JOI-Schnittstelle im Gen 54 kommen in Deutschland
bedeutend seltener vor als in den USA und Großbritannien. Der gehäufte
Nachweis bei Varizellen könnte darauf hindeuten, dass dieser Genotyp in Zukunft
auch vermehrt in Deutschland auftreten wird.
• Bei einem Patienten wurde der Oka-Impftyp 3VWI ̄ %JOI+ gefunden. Diese
Ergebnisse sprechen dafür, dass das Oka-Impfvirus in Deutschland bislang sehr
selten bei Personen nachweisbar ist.
• Das Oka-Impfvirus ließ sich bei einem Kind nachweisen, das nach
Varizellenimpfung einen Zoster entwickelte.
• Ein Zoster kann bei geimpften Personen auftreten, wenn es nach Impfung zu
einem Befall der Haut als impfbegleitendes Exanthem oder zu mild verlaufenden
Windpocken kommt.
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'DQNVDJXQJ��Bedanken möchte ich mich bei Herrn Professor Dr. med. habil. P. Wutzler, Direktor
des Instituts für Virologie und Antivirale Therapie des Universitätsklinikums Jena,
dass er mir für die Durchführung des experimentellen Teils meiner Arbeit sehr gute
Arbeitsbedingungen gewährt hat.
Mein besonderen Dank gilt Herrn Privatdozent Dr. med. habil. A. Sauerbrei für das
zur Verfügung gestellte Thema, für die fachliche Beratung und Unterstützung bei der
Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Abfassung des Manuskripts.
Ich danke Herrn Dr. med. U. Eichhorn für die Unterstützung bei der Durchführung der
praktischen Tätigkeiten sowie bei der Abfassung des Manuskripts und Frau M. Alexi
für die Unterstützung bei der Durchführung der Laborversuche.
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/HEHQVODXI��
/HEHQVODXI��Shokoufeh Gawellek
Geburtsdatum: 30.03 1971 Geburtsort: Shahroud
1977-1980 Grundschule in Shahroud
1980-1985 Grund- und Mittelschule in Karadj
1985-1989 Oberschule mit Berufsabschluss als Grundschullehrerin in Karadj
1989 Abitur
1989-1993 Lehrerin der Grundschule und Psychologie-Studium in Karadj
1993 Abschluss: Diplompsychologe
1993-1996 Lehrerin und Schulpsychologin in Karadj
1996 Einreise nach Deutschland
1996-1998 Deutschkurs in Mainz
1998-2003 Studium der Zahnmedizin, Friedrich-Schiller-Universität Jena
16.12.2003 Staatsexamen, Friedrich-Schiller-Universität Jena
ab 2001 Arbeiten zur Promotion am Institut für Virologie und Antivirale
Therapie des Universitätsklinikums Jena
seit 2002 verheiratet mit Mario Gawellek
2004 Geburt der Tochter Jasmin Gawellek
Jena, im November 2004
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(KUHQZ|UWOLFKH�(UNOlUXQJ��Hiermit erkläre ich, dass mir die Promotionsordnung der Medizinischen Fakultät der
Friedrich-Schiller-Universität bekannt ist.
Ich habe die vorliegende Dissertationsschrift selbstständig und nur unter
Verwendung der angegebenen Hilfsmittel und Literatur angefertigt.
Herr Privatdozent Dr. med. habil. A. Sauerbrei und Herr Dr. med. U. Eichhorn haben
mich bei der Auswahl und Auswertung des Materials und bei der Abfassung des
Manuskripts unterstützt.
Die Hilfe eines Promotionsberaters wurde nicht in Anspruch genommen und Dritte
erhielten weder unmittelbar noch mittelbar von mir geldwerte Leistungen für Arbeiten,
die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.
Ich habe diese Dissertation noch nicht als Prüfungsarbeit für eine staatliche oder
eine andere wissenschaftliche Prüfung eingereicht.
Ebenso habe ich diese Arbeit nicht bei einer anderen Hochschule als Dissertation
eingereicht.
�
Jena, im November 2004
�