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Enzymatische Katalyse

1. Katalysmechanismen

2. Lysozym

3. Serin Proteasen

4. Drug Design

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Enzyme erhöhen Reaktionsgeschwindigkeit um mehrere Grössenordungen.Sie arbeiten unter milden Bedingungen und sind hochspezifisch.Die katalytischen Mechanismen sind identisch mit chemischen Katalysatoren.

Dskussion: Grundlagen der enzymatischen KatalysePrinzip der chemischen ReaktionsmechanismenDiskussion einiger Beispiele: Lysozym, Serin Proteasen, HIV-1

Protease.

1. KatalysemechanismenKatalyse erhöht die Geschwindigkeit mit der eine Reaktion dem Gleichgewicht zustrebt.2 Eigenschaften die Enzyme zu wirksamen Katalysatoren macht:

1) spezifische Substratbindung2) optimale Anordnung

Klassifikation von Katalysemechanismen: 1) Säure-Base Katalyse2) Kovalente Katalyse3) Metallionen Katalyse4) Elektrostatische Katalyse5) Nachbargruppen und Orientierungseffekte6) Bevorzugte Bindung des Übergangszustandskomplexes

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U. Albrecht BC1A. Säure-Base Katalyse

Keto-Enol tautomerisierung

Unkatalysiert (langsam)

säurekatalysiert

basekatalysiert

Wenn beide katalysen gleichzeitig -> Säure-Base katalysierte Reaktion

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U. Albrecht BC1Mutarotation wird von Säuren und Basen katalysiert

Mutarotationsgeschwindigkeit nimmt mit den Konzentrationen von allgemeinenSäuren und Basen zu.

In Benzol (polar) -> tautomerisiert nichtIn Phenol (schwache Säure) -> tautomerisiertPyridin (schwache Base) -> tautomerisiert Hat basische und saure Gruppen

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U. Albrecht BC1RNaseA Reaktion ist ein Beispiel für die allgemeine

Säure-Base Katalyse

Ribonuclease A (RNase A) = Verdauungsenzym das RNA hydrolysiert undin ihre Nucleotid-Bausteine zerlegt.

The pH dependence of V′max/K′M in the RNase A–catalyzed hydrolysis of cytidine-2′,3′ -cyclic phosphate.

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Histidine 12 -> zuerstSäure dann Base

Histidine 119 -> zuerstBase dann Säure

The bovine pancreatic RNase A–catalyzed hydrolysis of RNA is a two-step process with the intermediate formation of a 2′,3′ -cyclic nucleotide.

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The decarboxylation of acetoacetate.

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U. Albrecht BC1B. Kovalente Katalyse

Nicht katalysiert

Es wird vorübergehend eine kovalente Bindung zwischen Katalysator und Substrat gebildet

Katalysiert durch primäre Amine

Nucleophile und elektro-phile Schritte.AS-Ketten und Coenzyme könnenals kovalente KatalysatorenFungieren(His, Cys, Asp, Ser, Thiaminpyro-Phosphat, Pyridoxalphosphat)

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U. Albrecht BC1C. Metallionen-Katalyse

2 Klassen von Metallionen Enzymen: -) Metalloenzyme: enthalten festgebundene Metall-ionen, meist Übergansmetallionen, Fe, Cu, Zn,Mn und Co ionen.

-) Metallionen-aktivierte Enzyme: binden schwacheMetallionen aus Lösung, Alkali- und Erdalkali-metalle, Na, K, Mg oder Ca ionen.

Auf 3 Arten am katalytischen Prozess beteiligt:

1. Bindung an Substrat um dies für die Reaktion in eine geeignete Konformation zu bringen.

2. Reversible Änderung ihres Oxidationszustandes vermitteln Redoxreaktionen.

3. Elektrostatischer Ausgleich negativer Ladungen und damit Stabilisierung und Abschirmung

Im Folgenden vor allem 3. Aspekt.

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Metall-Ionen fördern die Katalyse durch Ladungsstabilisierung

Metall-Ionen sind wirksamere Katalysatorenals Protonen, da sie bei neutralen pH-WertenIn hohen Konzentrationen vorliegen und Ladungen >+1 haben können.

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U. Albrecht BC1Metall-Ionen unterstützen die nucleophile Katalyse durchErhöhen des Ionisierungsgrades des Wassers

Metall-Ionen wirken in wassriger Lösung sauer, da koordinierende Wassermoleküle leicht Protonen abgeben.

(NH3)5Co3+(H2O) (NH3)5Co3+(OH-) + H+Potentes Nucleophil

Gutes beispiel für dieses Phänomen ist die Carboanhydrase: CO2 + H2O HCO3- + H+

Zn2+

3 His Seitenketten

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X-Ray structures of human carbonicanhydrase. (b) The active site showing the proton shuttle.

‚in‘ conformation

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X-Ray structures of human carbonicanhydrase. (a) Its active site in complex with bicarbonate ion.

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His 64 in ‚out‘ conformation

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U. Albrecht BC1Metall-Ionen fördern Reaktionen durch Ladungsabschirmung

Ladungsabschrimung bei Kinasen

Nucleophile Gruppen des EnzymsGreift dieses P and und nicht andere

D. Elektrostatische KatalyseDie Bindung eines Substrates and das aktive Zentrum findet in Abwesenheit vonWasser statt.

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U. Albrecht BC1E. Katalyse durch Nachbargruppen und Orientierungseffekte

Hohe Effizienz von Enzymen erreicht durch richtige räumliche Anordnung der Reaktanden. -> Nähe und Orientierung wichtig.

Intermolekulare Reaktion Intramolekulare Reaktion

Gleiche Reaktion aber Umsetzungsrate Viel schneller.

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The geometry of an SN2 reaction.

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U. Albrecht BC1

Orientierung der Reaktanden und fixieren deren relativer Bewegungsfreiheitkann zu Ratensteigerung beitragen

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Relative Rates of Anhydride Formation for Esters Possessing Different Degrees of Motional Freedom in the Reaction Above.

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Reaction coordinate diagrams for a hypothetical enzymatically catalyzed reaction (single substrate - blue; corresponding uncatalyzed reaction -red).

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The alternating NAG–NAM polysaccharide component of bacterial cell walls.

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2. Lysozym

Lysozym zerstört bakterielle Zellwände

Spaltung der glykosidischen ß(1-4) BindungNAM= N-AcetylmuraminsäureNAG= N-Acetylglucosamin

Lysozym in Sekreten und Zellen -> Bacteriocid in Kombination mit anderen Substanzen->Beseitigung von Zellwänden.

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Primary structure of HEW lysozyme(Hühnereiweiss).

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14.6 kD

In Substrat-bindungstasche

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(a) The polypeptide chain is shown with a bound (NAG)6 substrate (green).

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X-Ray structure of HEW lysozyme.

Substrat

Spalte übers ganzeEnzym

Disulfidbrücken

Nichtredu-zierendesEnde

Spaltstelle

KatalytischeReste

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X-Ray structure of HEW lysozyme. (b) A ribbon diagram of lysozyme highlighting the protein’s secondary structure.

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X-Ray structure of HEW lysozyme. (c) A computer-generated model showing the protein’s molecular envelope (purple) and Cα backbone (blue).

Identifiziert durch Mutagenese

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Rates of HEW Lysozyme-Catalyzed Hydrolysis of Selected Oligosaccharide Substrate Analogs.

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schneller

(Wechselzahl)

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Chair and half-chair conformations.

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H-Brückenbildungdurch axialen Seitenrest

D-Ring sterisch im Konflikt mit Glu 57 und Trp 108->Verdrehung -> Seitenguppe aus Äquatorialer in AxialePosition-> H-Brücke

NAG3bindet hieraber keineSpaltung

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Phillips-Mechanismus

1

2

1 Brückensauerstoffatom wird protoniert.

2 D-Ring Oxonium Ion wird duch dieNähe der Carboxygruppe des Asp52und durch die enzyminduzierteVerzerrung des D-Ringes stabilisiert.

3 Ist E-Ring abdissoziert verbindet sichOH- eines Wassers mit dem OxoniumIon, während das H+ das Glu35reprotoniert.

3

Asp neg. geladen (unprotoniert)da zwischenpH 6 und 8 enzym aktiv.

In polaremBereich

In unpolarem Bereich -> protoniert

Säure-BaseKatalysator

H-C-O-R‘‘ + H+ H-C-O-R‘‘

OR‘

R

OR‘

HR

R‘‘OH

O

C

R‘

RH

+

+

O

C

R‘

RH

+

Oxonium Ion

Acetal

H-C-OH

OR‘

R

H2O

H+Halbacetal

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The D-ring oxonium ion (carbocation) intermediate in the Phillips mechanism is stabilized by resonance.

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Figure 15-16 The δ-lactone analog of (NAG)4.

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Lactone inhibitor von Lysozym -> in gleicher Konformation wie Oxonium Ion -> blockiert enzym an D-Ring Bindungstelle

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The HEW lysozyme covalent intermediate.

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Kovalentes intermediatvia Asp 52

NichtkovalenterKomplex

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A Selection of Serine Proteases.

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3. Serin Proteasen

Haben Ser-Rest im aktiven Zentrum

Chymotrypsin, Trypsin und Elastase= Verdauungsenzyme, die von Acinuszellen des Pankreas sezerniert werden.

Sie katalysieren die Hydrolyse von Peptidbindungen.

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Time course of p-nitrophenylacetate hydrolysis as catalyzed by two different concentrations ofchymotrypsin.

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U. Albrecht BC1

A. Kinetik und katalytische Gruppen

Esterhydrolyse als kinetisches Modell

Chymotripsin arbeitet alsEsterase und als Protease

Unten Esterase Mech.

2 Phasen: schnelles binden Substrat und langsames dissoziieren von Acetat.

GeschätzteAnfangskonz.

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U. Albrecht BC1

Annahme: 2 stufiger Prozess -> Chymotrypsin folgt einem Ping-Pong-Bi-Bi-Mechansimus

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U. Albrecht BC1

Identifizierung der katalytischen Reste

Markierungsexperimente: Reaktion von Serin mit DIPF -> iireversible Inaktivierung

DIPF als Hemmstoff für Enzyme entdecktWeil als Phosphoverbindung stark neuro-Toxisch -> inaktiviert Acetylcholinesterase

Botenstoff an Synapsen -> muss schnellDegradiert werden sonst neurolog. Störungen.DIPF militärisch als Nervengas gebraucht.

Ser 195

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Reaction of TPCK with chymotrypsin to alkylate His 57.

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His 57

TPCK bindet kovalent

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X-Ray structure of bovine trypsin.(a) A drawing of the enzyme in complex.

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Spez. Bindungs-tasche

Peptidkette

Asp, His, Ser = katalyt.Triade

B. Stuktur von Trypsin

Chymotrypsin, Trypsin und Elastasehaben alle ähnlich Stuktur

Werden als Propeptidesynthetisiert z.B. Chymotrypsiongen

Elastase sehr klein ->Schneidet nach kleinenUngeladnene AS. VieleDavon in Elastin (elast. Protein desBindegewebes).

Trypsin: Arg-LysChtryp:

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X-Ray structure of bovine trypsin. (b) A ribbon diagram of trypsin.

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X-Ray structure of bovine trypsin. (c) A drawing showing the surface of trypsin(blue) superimposed on its polypeptide backbone (purple).

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The active site residues of chymotrypsin.

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Die katalytische Triade von Chymotrypsin

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Relative positions of the active site residues insubtilisin, chymotrypsin, serine carboxypeptidase II, and ClpP protease.

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U. Albrecht BC1

Evolutionäre Beziehungen zwischen Serinproteasen

Chymotrypsin, Trypsin, Elastase ->Sehr ähnliche Struktur. -> aus Gen-duplikation eines Vorläufers entstanden.

Protease A aus Streptomyces griseus->Prokaryont auch sehr ähnlich -> Ur-Trypsin hat sich vor der Trennung vonEukaryonten von prokaryonten ereignet.

Aber: Strukturell nicht verwandte Proteasen wie Subtilisin etc. ->Auch convergente Evolution.

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U. Albrecht BC1C. Katalytischer Mechanismus

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Trypsin–BPTI complex. (a) The X-ray structure shown as a cutaway surface drawing indicating howtrypsin (red) binds BPTI (green).

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U. Albrecht BC1Das tetrahydrale Zwischenprodukt kann als Komplex mitTrypsin Inhibitor dargestellt werden.

Trypsin–BPTI complex. (b)Trypsin Ser 195, the activeSer, is in closer-than-van der Waals contact with the carbonyl carbon of BPTI’sscissile peptide.

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Transition state stabilization in the serine proteases. (a) The Michaelis complex.

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Transition state stabilization in theserine proteases. (b) The tetrahedral intermediate.

Serinproteasen binden bevorzugt den Überganszustand

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X-Ray structures of porcine pancreaticelastase in complex with theheptapeptide BCM7 (YPFVEPI). (a) The complex at pH 5.

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Wasser attackiert das Acyl- Enzym

(b) The complex at pH 9.

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Activation of trypsinogen to form trypsin.

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E. Zymogene

Inaktive Vorläufer = ZymogeneDies ist nötig da sonst Enzyme schon aktiv an Syntheseort -> Pankreatitis

Serinproteasen werden autokatalytisch aktiviert

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Activation of chymotrypsinogen by proteolytic cleavage.Pa

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4. Drug designU. Albrecht BC1

Pharmakologisch wirksame Substanzen am Anfang des 20. Jahrhunderts:

-) Digitalis -> Herz Stimulans

-) Quinine -> Malaria Behandlung (von Chinchona Baum)

-) Quecksilber -> Syphilis (Behandlung of schlimmer als Krankheit)

Die meisten heutigen wirksamen Substanzen in den letzten 3 oder 4Jahrzehnten entdeckt (antidepressants, antipsychotics, entzüdnungshemmer,Immunsuppressoren, anaesthetica)

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A. Techniken zur Identifizierung von neuen Pharmaka

Die meisten Pharmaka wirken über Bindung an einen Rezeptor.

Der Rezeptor kann ein Membrantransporter oder ein Singnaltransduktions-gekoppelter Rezeptor sein.

Wenn die Bindung die Funktion des Rezeptors beeinträchtigt wird dieSubstanz als ein Agonist bezeichnet.

Wenn die Bindung blockiert wird nicht aber die Funktion des Rezeptors ->Antagonist.

Synthethische und natürliche Substanzen werden im Grossmasstab ‚gescreent‘, zuerst in vitro über Bakterien oder Zellkulturen -> wirksameSubstanzen werden dann in Tieren getestet.

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Wirksame Substanz wird als Lead Compound bezeichent.KD < 1µM -> Substant muss hohe Affinität haben -> kleine Dosen,Wenig unspezifische Bindungen -> weniger Nebeneffekte.

Messgrössen für die Beschreibung einer wirksamen Substanz:

IC50 = inhibitor concentration bei welcher das Enzym 50% der Maximal-aktivität hat.

ED50 = effektive dosis bei welcher die Substanz einen therapeutischen Effekt in 50% der Testsamples hat.

TD50 = mittlere toxische dosis welche einen toxischen Effekt in Tierenhat.

LD50 = mittlere lethale dosis welche 50% des Testsamples tötet.

Therapeutischer Index = TD50/ ED50 -> sollte möglichst gross sein.

Pharmakodynamics= Biochemical and pharmacological effects and mechanism of a drug.

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Catepsin K ist ein Drug Target für Osteoporose

Osteoporose

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Synthetisieren organischeMatrix -> Mineralisierung

Solubilisieren mineralsierteMatrix über proteolytischeEnzyme -> Cathepsin

Mutation in Cathepsin -> brüchige Knochen ->Cathepsin ist drug target für Behandlung vonOsteporose.

Cathepsin isoliert von Osteo-Clastoma Zellen.

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SARs and QSARs are useful tools for drug discovery

SARs = structure activity relationships -> which group isimportant for the drugs function ? -> improvement of a lead compound.5 -10 related compounds are typically synthesizedto generate a useful drug.

QSARs = quantitative structure activtiy relationships.mathematical relationship between biologicalactivity and physicochemical properties.

Structure based drug design

Von Proteinstruktur ausgehendes rationales design des Wirkstoffes-> in den Wenigsten Fällen da Proteinstruktur nicht bekannt ist.

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The combinatorial synthesis of arylidene diamides.

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Kombinatorsiche Chemie und Hochdurchsatz Screening

Trial and error an einem in vitro reporter system um lead compoundszu bekommen.

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B. Einführung in die Pharmakologie

In vitro Entwicklung einer Substanz erster Schritt. Danach die Frage, wie wirdDie Substanz zum Wirkungsort gebracht (delivery) und was sind die Nebeneffekte?

Pharmakokinetik ist ein vielfältiges Phänomen

Orale Einnahme eines Medikaments am einfachsten -> Verschiedene Barrieren

1) Substanz muss chemisch stabil sein um den sauren pH 1 im Magen zu überleben2) muss vom Gastrointestinaltrakt absorbiert werden um ins Blut zu gelangen3) geringe affinität zu anderen Substanzen (Lipide, Albumin)4) muss derivatisierung in Leber überleben, da der intestinale Blutstrom direkt in die

Leber führt welche die Funktion hat Xenobiotika (fremde Substanzen) zu neutralisieren5) keine schnelle Ausscheidung durch die Nieren6) muss von Kapillaren zu Zielgewebe gelangen können7) wenn fürs Hirn -> Blut-Hirn Schranke muss überwunden werden8) wenn für einen intracellulären Rezeptor -> passieren der Plasmamembran

Wie eine Substanz mit diesen Anforderungen zurechtkommt wird alsPhamakokinetik bezeichnet -> Biologische Verfügbarkeit einer Substanz hängt vonVerabreichter Dosis und der Pharmakokinetik ab.Um 1 und 2 zu umgehen -> Injektionen möglich aber nicht praktisch.

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Pharmakokinetik und Pharmakodynamik müssen optimiert werden

Lipinskis 5 er Regel: Eine Substanz wird schlecht absorbiert oder permeiert schlecht wenn:

1) seine Masse grösser als 500 D ist.2) mehr als 5 Wasserstoffbindungsdonoren da sind (Smme aller

OH und NH Gruppen)3) mehr als 10 Wasserstoffbrücken akzeptoren (Summe der N und O

Atome)4) wenn die Substanz zu hydrophob ist

-> nicht zu hydrophil und nicht zu hydrophob.

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Toxizität und Nebenreaktionen eliminieren die meisten Kandidaten

Nach allen in vitro und Tierexperimenten wird die Sicherheit und Effizienzam Menschen in Klinischen Versuchen durchgeführt.

Phase I: Sicherheit, Dosierung, Verabreichung wird in 20-100 Freiwilligengesunden Probanden getestet.

Phase II: Effizienz wird in 100-500 freiwilligen Patienten getestet.Nebeneffekte werden verfolgt und die Dosierung optimiert.Single blind test: die Patienten wissen nicht ob sie Medikament oder

Placebo erhalten.

Phase III: Langzeit Studie über Nebeneffekte an 1000-5000 Patienten.Statistischer Vergleich zu Kontrollsubstanzen.Doppelblind Studie: Patient und Arzt wissen nicht wer Medikament

und wer Placebo erhält.

5 von 5000 Kandidaten kommen in Phase I. Von diesen nur 1 als Medikament40% passieren Phase I, davon 50% Phase II.Präklinik -> 3 Jahre -> Klinik -> 7-10 Jahre -> teuer ca. 300 Mio Dollar für 1MedRückzug mancher Drogen wie

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X-Ray structure of cytochrome P450CAMfrom Pseudomonas putida showing its active site region.

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U. Albrecht BC1The Cytochromes P450 Metabolisiert die meisten Medikamente

Gewisse Leute reagieren auf eine Substanz anders als die meisten. Polymorphismen In Cytochromen -> d.h. andere metabolisierun. Machen Substanzen mehr löslich zurAusscheidung. RH +O2 +2H+ + 2e- -> ROH + H2O

Wenn 2 Substanzen zusammen Gegeben werden kann die eine dieDetoxifizierungseffizienz von P450 Auf die andere Droge verändern ->Pharmakokinetisches Profil verändert Sich. -> eine Harmlise substanz kann inKombination mit einer anderen toxischwerden.

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The metabolic reactions of acetaminophen that convert it to its conjugate with glutathione.

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Acetaminophen = Fiebersenker

Therapeutische dosis 1.2g/Tagfür Erwachsenen

Hohe Dosen >10g -> toxisch

-> Saturierung von Gluthation-> kann nicht schnell genugNachgebildet werden.

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Figure 15-33 The assembly, budding, and maturation of HIV-1.

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Figure 15-34a HIV-1 polyproteins. (a) The organization of the HIV-1 gag and gag–pol polyproteins.

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Figure 15-34b HIV-1 polyproteins. (b) The sequences flanking the HIV-1 protease cleavage sites (red bonds) indicated in Part a.

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Figure 15-35 Renin participation in blood pressure regulation.

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Figure 15-36a X-Ray structure of pepsin. (a) Ribbon diagram.

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Figure 15-36b X-Ray structure of pepsin. (b) Enlarged view of the active site Asp residues and their bound water molecule indicating the lengths (in Å) of possible hydrogen bonds (gray).

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Figure 15-37 Catalytic mechanism of aspartic proteases.

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Figure 15-38a X-Ray structure of HIV-1 protease. (a)Uncomplexed.

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Figure 15-38b X-Ray structure of HIV-1 protease. (b) In complex with its inhibitor.

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Figure 15-39 Arrangement of hydrogen bonds between HIV-1 protease and a modeled substrate.

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Figure 15-40 Comparison of a normal peptide bond to several groups (red) that are similar to the tetrahedral intermediate of aspartic proteases.

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Figure 15-41 Some HIV-1 protease inhibitors that are in clinical use.

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Figure 15-42 Mechanism of carboxypeptidase A.

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Table 15-3 Binding Free Energies of HEW Lysozyme Subsites.

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