Lokalisation und Aktivierung von ADAM-Proteasen im Kontext ... · TAE Tris/Acetat/EDTA TBS...

Lokalisation und Aktivierung von

ADAM-Proteasen im Kontext der

Fas-Ligand-Proteolyse in T-Zellen

DISSERTATION

zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät

der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel

vorgelegt von Henriette Ebsen

Kiel

2014

Erster Gutachter: Prof. Dr. Ottmar Janßen Zweiter Gutachter: Prof. Dr. Dr. Thomas C. G. Bosch Tag der mündlichen Prüfung: 14.08.2014 Zum Druck genehmigt: 14.08.2014

gez. Prof. Dr. Wolfgang J. Duschl, Dekan

Inhaltsverzeichnis

I

I. Inhaltsverzeichnis

I. Inhaltsverzeichnis I

II. Abkürzungsverzeichnis V

1. Einleitung 1

1.1 Fas-Ligand .........................................................................................................1

1.1.1 Struktur des Fas-Liganden .................................................................................1

1.1.2 Funktionen des Fas-Liganden ............................................................................3

1.1.3 Expression des Fas-Liganden ............................................................................5

1.1.4 Regulationsmechanismen zur Kontrolle der Expression des Fas-Liganden ........6

1.1.4.1 Transkriptionale Regulation des Fas-Liganden ...................................................6

1.1.4.2 Posttranslationale Modifikationen des Fas-Liganden ..........................................6

1.2 A Disintegrin And Metalloproteases (ADAMs) .................................................. 10

1.2.1 Struktur von ADAM10 ....................................................................................... 11

1.2.2 Funktionen von ADAM10 .................................................................................. 13

1.2.3 Expression von ADAM10 .................................................................................. 13

1.2.4 Regulationsmechanismen zur Kontrolle der ADAM10-Aktivität ......................... 14

1.2.4.1 Transkriptionale Regulation von ADAM10 ........................................................ 14

1.2.4.2 Posttranslationale Modifikationen von ADAM10 ............................................... 15

1.2.5 Implikationen von ADAM-Proteasen bei bestimmten Krankheitsbildern ............ 20

2. Fragestellung 22

3. Material 24

3.1 Material für die Zellbiologie ............................................................................... 24

3.1.1 Zellkultur........................................................................................................... 24

3.1.2 Bakterien und Phagen ...................................................................................... 24

3.1.3 Medien und Puffer ............................................................................................ 25

3.1.3.1 Zellkulturmedien/Zusätze für die Zellkultur ....................................................... 25

3.1.3.2 Kalzium-Phosphat-Transfektion ........................................................................ 25

3.1.3.3 Konfokale Mikroskopie ..................................................................................... 26

3.1.3.4 Durchflusszytometrie ........................................................................................ 26

3.1.3.5 Antikörper ......................................................................................................... 27

3.1.4 Weitere Reagenzien und Inhibitoren ................................................................. 28

3.1.5 Verwendete Kits für die Zellbiologie .................................................................. 28

Inhaltsverzeichnis

II

3.2 Material für molekularbiologische Experimente................................................. 28

3.2.1 Vektoren und Konstrukte .................................................................................. 28

3.2.2 Primer .............................................................................................................. 29

3.2.3 siRNAs ............................................................................................................. 29

3.2.4 Enzyme für die Molekularbiologie ..................................................................... 29

3.2.5 Agarose-Gelelektrophorese .............................................................................. 30

3.2.6 Puffer und weitere Reagenzien ........................................................................ 30

3.2.7 Material für das Screening interagierender SH3-Domänen ............................... 30

3.2.8 Kits für die Molekularbiologie ............................................................................ 31

3.3 Material für biochemische Analysen ................................................................. 32

3.3.1 Puffer und Reagenzien ..................................................................................... 32

3.3.1.1 Aufreinigung von GST-Fusionsproteinen .......................................................... 32

3.3.1.2 Lysieren von Zellen .......................................................................................... 32

3.3.1.3 Proteinbestimmung .......................................................................................... 32

3.3.1.4 Pull-Down/Immunpräzipitation .......................................................................... 32

3.3.1.5 SDS-PAGE: Protean II-System (Bio-Rad) ........................................................ 33

3.3.1.6 SDS-PAGE: NuPAGE-System (Invitrogen) ....................................................... 33

3.3.1.7 Coomassie-Färbung von Proteinen in SDS-Polyacrylamidgelen ...................... 34

3.3.1.8 Western Blot ..................................................................................................... 34

3.3.2 GST-Fusionsproteine ....................................................................................... 35

3.3.3 Antikörper ......................................................................................................... 36

3.3.4 Kits für die Biochemie ....................................................................................... 37

3.4 Weitere Materialien .......................................................................................... 37

3.5 Geräte .............................................................................................................. 38

4. Methoden ........................................................................................................ 40

4.1 Zellbiologische Methoden ................................................................................. 40

4.1.1 Zellkultur........................................................................................................... 40

4.1.2 Bestimmung der Zellzahl und Zellvitalität.......................................................... 40

4.1.3 Kryokonservierung von Zellen .......................................................................... 40

4.1.4 Transfektion von Zellen .................................................................................... 41

4.1.4.1 Kalzium-Phosphat-Transfektion ........................................................................ 41

4.1.4.2 Nukleofektion ................................................................................................... 41

4.1.5 Immunfluoreszenzanalysen .............................................................................. 41

4.1.5.1 Konfokale Mikroskopie ..................................................................................... 41

4.1.5.2 Durchflusszytometrie ........................................................................................ 42

4.1.5.2.1 Detektion von Zelloberflächenmolekülen .......................................................... 42

4.1.5.2.2 Zelltodanalyse mittels Propidiumiodidfärbung ................................................... 43

4.1.6 Stimulation von Zellen ...................................................................................... 43

Inhaltsverzeichnis

III

4.2 Molekularbiologische Methoden ....................................................................... 44

4.2.1 RNA-Isolierung ................................................................................................. 44

4.2.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR).................................................................... 44

4.2.2.1 RT-PCR............................................................................................................ 44

4.2.2.2 Konventionelle PCR ......................................................................................... 45

4.2.3 Agarose-Gelelektrophorese .............................................................................. 46

4.2.4 Restriktionsverdau ............................................................................................ 46

4.2.5 Ligation ............................................................................................................ 46

4.2.6 Transformation hitzeschockkompetenter Bakterien .......................................... 47

4.2.7 Aufreinigung von Plasmid-DNA aus Bakterien .................................................. 47

4.2.8 Sequenzierung und Sequenzierungsanalyse .................................................... 48

4.2.9 Glycerolstocks .................................................................................................. 48

4.2.10 Identifizierung interagierender SH3-Domänen mittels Phagenbibliothek ........... 48

4.3 Biochemische Methoden .................................................................................. 50

4.3.1 Expression und Aufreinigung rekombinanter GST-Fusionsproteine .................. 50

4.3.2 Herstellung von Zelllysaten und Bestimmung des Proteingehalts ..................... 51

4.3.3 Detektion von löslichem FasL in Zellkulturüberständen (ELISA) ....................... 51

4.3.4 Pull-Down mit rekombinanten GST-Fusionsproteinen ...................................... 51

4.3.5 Immunpräzipitation ........................................................................................... 52

4.3.6 Isolation sekretorischer Granula ....................................................................... 52

4.3.7 Isolation Detergenz-resistenter Membranen (DRMs) ........................................ 52

4.3.8 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) ......................................... 53

4.3.9 Coomassie-Färbung von Proteinen in SDS-Polyacrylamidgelen ...................... 54

4.3.10 Western Blot ..................................................................................................... 54

5. Ergebnisse 55

5.1 ADAM10 reguliert die Expression des Fas-Liganden ........................................ 55

5.1.1 Oberflächenexpression und Aktivität von ADAM10 ........................................... 55

5.1.2 ADAM10 ist die Haupt-Sheddase des FasL bei TPA/Ionomycin-induzierter Proteolyse ........................................................................................................ 62

5.1.3 Die Stimulation des T-Zellrezeptors induziert die Proteolyse des FasL ............. 66

5.2 Lokalisation von ADAM10, ADAM17 und FasL in T-Zellen ............................... 75

5.2.1 Lokalisation in sekretorischen Lysosomen ........................................................ 75

5.2.2 Aktivierungsinduzierte Änderungen der Lokalisation ........................................ 78

5.2.3 Einfluss der Cholesteroldepletion und Inhibierung posttranslationaler Modifikationen auf die CD3/CD28-vermittelte Proteolyse des FasL .................. 83

5.3 Interaktionspartner der intrazellulären Domäne von ADAM10 .......................... 94

5.3.1 Identifizierte präzipitierte SH3-Domänen einer Phagenbibliothek ..................... 94

5.3.2 Verifizierung potentieller Interaktionen .............................................................. 98

Inhaltsverzeichnis

IV

6. Diskussion 108

6.1 ADAM10 reguliert die Expression des Fas-Liganden ...................................... 108

6.1.1 Oberflächenexpression und Aktivität von ADAM10 ......................................... 108

6.1.2 ADAM10 ist die Haupt-Sheddase des FasL bei TPA/Ionomycin-induzierter Proteolyse ...................................................................................................... 114

6.1.3 Intramembrane Proteolyse des FasL durch SPPL2a ...................................... 115

6.1.4 Die Stimulation des T-Zellrezeptors induziert die Proteolyse des FasL ........... 115

6.2 Lokalisation von ADAM10, ADAM17 und FasL in T-Zellen ............................. 117

6.2.1 Lokalisation in sekretorischen Lysosomen ...................................................... 117

6.2.2 Aktivierungsinduzierte Änderungen der Lokalisation ...................................... 119

6.3 Interaktionspartner der intrazellulären Domäne von ADAM10 ........................ 122

6.4 Proteolyse als posttranslationale Modifikation kontrolliert die Expression des FasL ........................................................................................................ 129

7. Zusammenfassung 131

8. Summary 133

9. Literaturverzeichnis 135

10. Anhang 152

10.1 Publikationsliste .............................................................................................. 152

10.2 Tabelle A1 ...................................................................................................... 154

10.3 Abbildungen A1-3 ........................................................................................... 155

10.4 Danksagung ................................................................................................... 157

10.5 Wissenschaftlicher Werdegang ...................................................................... 158

10.6 Eidesstattliche Erklärung ................................................................................ 159

Inhaltsverzeichnis

V

II. Abkürzungsverzeichnis

2BP 2-Brompalmitat 2HMA 2-Hydroxymyristylsäure Abb. Abbildung ADAM A Disintegrin And Metalloprotease AEBSF 4-(2-Aminoethyl)benzensulfonylfluorid AICD activation-induced cell death AK Antikörper ALPS autoimmunes lymphoproliferatives Syndrom APS Ammoniumperoxodisulfat AS Aminosäure ATP Adenosintriphosphat BAR Bin/Amphiphysin/Rvs BSA bovine serum albumin, Rinderalbumin CAU Christian-Albrechts-Universität zu Kiel CD cluster of differentiation cdc42 cell division cycle protein 42 cDNA complementary DNA CKI Casein-Kinase-I CO2 Kohlenstoffdioxid CTF C-terminales Fragment CTLA-4 cytotoxic T-lymphocyte associated protein-4 DAPI 4′,6-Diamidin-2-Phenylindol DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium DMSO Dimethylsulfoxid DNA deoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphate E. coli Escherichia coli EBV Epstein-Barr Virus ECL enhanced chemoluminescence light EDTA Ethylendiamintetraacetat EGF epidermal growth factor EGFR epidermal growth factor receptor EGTA Ethylenglycol-bis(aminoethylether)-N,N,N′,N′-

tetraessigsäure e.H. eigene Herstellung ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay ER Endoplasmatisches Retikulum FACS Fluorescence activated cell sorting FasL Fas-Ligand FCH Fes/CIP4 homology FCS Fetal calf serum, fötales Kälberserum FWP FACS-Waschpuffer g gravity (Erdbeschleunigung: 9,81 m/s2) GADS Grb2-related adaptor downstream of Shc GAPDH Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase GEF guanine-nucleotide exchange factor gld generalized lymphoproliferative disease Grb2 growth factor binding protein 2 GST Glutathion-S-Transferase h Stunde HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-

ethansulfonsäure

Inhaltsverzeichnis

VI

HRP Horseradish peroxidase (Meerrettich-Peroxidase) ICD intracellular domain Ig Immunglobulin IL Interleukin IP Immunpräzipitation IPTG Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid k.A. keine Angabe kDa Kilodalton LAMP Lysosomen-assoziiertes Membranprotein LAT linker for activation of T cells Lck lymphocyte-specific protein tyrosine kinase lpr lymphoproliferation LSM Laser-Scanning-Mikroskop MHC major histocompatibility complex min Minute MICA/B MHC-class-I-related chain A/B MMP Matrix-Metalloprotease mRNA messenger ribonucleic acid MβCD Methyl-β-Cyclodextrin NEB New England Biolabs NK-Zellen Natürliche Killerzellen NP-40 Nonidet P-40 NTF N-terminales Fragment PACSIN Protein kinase C and casein kinase substrate in

neurons protein PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese PBMC Peripheral blood mononuclear cell PBS Phosphate-buffered saline PCH pombe cdc15 homology PCR polymerase chain reaction PD Pull-Down PE Phycoerythrin PFA Paraformaldehyd PHA Phytohämagglutinin PHA-Blasten Phytohämagglutinin-aktivierte T-Zell-Blasten PI Propidiumiodid PIPES Piperazin-N,N'-bis(2-Ethansulfonsäure) PKC Proteinkinase C PP1 1-(1,1-Dimethylethyl)-3-(4-Methylphenyl)-1H-

Pyrazol[3,4-d]Pyrimidin-4-Amin PRD Prolin-reiche Domäne pTyr Phosphotyrosin rIL-2 rekombinantes IL-2 RNA ribonucleic acid rpm rounds per minutes RPMI Roswell Park Memorial Institute RT-PCR Reverse Transkriptase-PCR SAP Shrimp alkaline phosphatase SDS sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese sek Sekunde sFasL soluble Fas ligand (löslicher Fas-Ligand) SH2/3 Src homology 2/3 siRNA small interfering RNA SLP-76 SH2-domain-containing leukocyte protein of 76 kDa

Inhaltsverzeichnis

VII

SNX Sorting Nexin SPPL Signal Peptide Peptidase-like TAE Tris/Acetat/EDTA TBS Tris-buffered saline TEMED N, N, N’, N’-Tetramethylendiamin TGF transforming growth factor TGN trans-Golgi-Netzwerk THD TNF-Homologie-Domäne TNF tumor necrosis factor TNFR TNF-Rezeptor TNFRSF6 TNFR superfamily member 6 TNFSF6 TNF ligand superfamily member 6 TPA Tetradecanoylphorbolacetat Tris Tris (Hydroxymethyl)-Aminomethan TZR T-Zellrezeptor UK S-H Universitätsklinikum Schleswig-Holstein UV Ultraviolett V Volt v/v Volumen pro Volumen w/v Gewicht pro Volumen WB Western Blot

Einleitung

1

1. Einleitung

1.1 Fas-Ligand

Der Fas-Ligand (FasL, CD95L, Apo-1L, CD178, TNFSF6) nimmt durch seine

Eigenschaft, in Fas-exprimierenden Zellen Apoptose zu induzieren, eine wichtige

regulatorische Rolle innerhalb des Immunsystems ein. Er ist unter anderem an der

zytotoxischen Effektorfunktion von T- und NK-Zellen zur Elimierung infizierter Zellen,

der Beendigung einer Immunantwort nach Aktivierung des adaptiven Immunsystems

(activation-induced cell death, AICD) sowie der Ausbildung immunpreviligierter

Gewebe beteiligt. Verschiedene Tumorzellen exprimieren den FasL auf ihrer

Oberfläche und können dadurch aktivierte Tumor-infiltrierende Fas-positive

Lymphozyten eliminieren. Die Oberflächenexpression des FasL muss strikt reguliert

werden, da sein Rezeptor Fas (CD95, Apo-1, TNFRSF6) auf verschiedensten

Zelltypen exprimiert wird. Dies erfolgt auf verschiedenen Ebenen: neben einer

transkriptionalen Basiskontrolle erfolgt die Regulation auch auf posttranslationaler

Ebene, z.B. durch Speicherung des FasL in sekretorischen Lysosomen, durch eine

aktivierungsabhängige Mobilisierung zur Zelloberfläche und durch proteolytische

Prozessierung zur Reduktion der Oberflächenexpression.

1.1.1 Struktur des Fas-Liganden

Der FasL ist ein Typ-II-Transmembranprotein der TNF-Superfamilie und ist aus

verschiedenen funktionellen Domänen aufgebaut (Abbildung 1.1). Humaner FasL

besteht aus 281 Aminosäuren, muriner FasL aus 279 Aminosäuren (Suda et al.,

1993; Takahashi et al., 1994). Das FasL-Gen liegt hoch konserviert vor: humaner

und muriner FasL weisen eine Sequenzhomologie von 76,9% auf (Takahashi et al.,

1994). Der N-terminale intrazelluläre Teil enthält zwei Casein-Kinase-I-Substrat-

Motive (CKI-Motive), denen eine wichtige Funktion im Rahmen einer reversen

Signaltransduktion zugewiesen wurde (Watts et al., 1999; Sun et al., 2007), sowie

eine Prolin-reiche Domäne (PRD, AS 37-70) zur Interaktion mit Proteinen mit SH3-

(Src homology 3-) oder WW-Domänen (Wenzel et al., 2001, Ghadimi et al., 2002;

Janssen et al., 2003; Lettau et al., 2008). Der zytosolische Teil des FasL beinhaltet

außerdem drei mögliche Tyrosinphosphorylierungsstellen (AS Y7, Y9, Y13) (Zuccato

et al., 2007). Nach der Transmembranregion (AS 81-102) folgt eine Domäne zur

Selbstaggregation (AS 137-183). Der FasL bildet wie auch andere Mitglieder der

Einleitung

2

TNF-Superfamilie funktionell aktive Trimere (Tanaka et al., 1995; Tang et al., 1995).

Die TNF-Homologie-Domäne (THD, AS 184-275) vermittelt mit der C-terminalen

Rezeptorbindungsregion die Bindung des Liganden an seinen Rezeptor Fas. In Nähe

der Transmembranregion befinden sich potentielle Spaltstellen für Metalloproteasen

(hFasL S126/127L, K129/130Q (Schneider et al., 1998); mFasL K127/128Q (Tanaka

et al., 1998)). Hier wird der FasL proteolytisch gespalten und ein N-terminales

Fragment (NTF) generiert, welches in der Membran verankert bleibt, sowie ein

lösliches Zytokin (soluble FasL, sFasL) (Schulte et al., 2007), welches als Antagonist

des membrangebundenen Liganden angesehen wird (Schneider et al., 1998). Das N-

terminale Fragment kann innerhalb der Transmembranregion von der I-CLiP

(intramembrane cleaving protease) SPPL2a gespalten werden (hFasL L81/82C;

mFasL L79/80W) und die intrazelluläre Domäne (intracellular domain, ICD) wird in

das Zellinnere freigesetzt (Schulte et al., 2007; Kirkin et al., 2007).

Abb. 1.1: Schematischer Aufbau des Fas-Liganden. N-terminal befinden sich zwei Casein-Kinase-I-Substrat-Motive. Die Prolin-reiche Domäne dient der Protein-Protein-Interaktion mit SH3-/WW-Domänen. Nach der Transmembrandomäne folgt Selbstaggregationsdomäne für die Multimerisierung. Für die Bindung des FasL an seinen Rezeptor Fas wird die TNF-Homologie-Domäne benötigt. Am C-terminalen Ende liegt die Rezeptorbindungsstelle. Bei Proteolyse des FasL durch Metalloproteasen entsteht ein lösliches extrazelluläres Fragment (soluble FasL, sFasL) und ein membranständiges N-terminales Fragment (NTF). Bei weiterer Prozessierung durch innerhalb der Membran schneidende Proteasen wird die intrazelluläre Domäne (intracellular domain, ICD) ins Zytosol entlassen. Abkürzungen: I-CLiPs: intramembrane cleaving protease; TNF: tumor necrosis factor.

Einleitung

3

1.1.2 Funktionen des Fas-Liganden

Der FasL erfüllt durch die Induktion von Apoptose über die Ligation seines Rezeptors

Fas verschiedene Aufgaben innerhalb des Immunsystems (Abbildung 1.2). Als

zytotoxisches Effektormolekül auf T- und NK-Zellen kann er in Fas-exprimierenden

infizierten Zielzellen Apoptose einleiten. Dies stellt eine Ergänzung der klassischen

Zytotoxizität über Granzym B und Perforin dar (Rouvier et al., 1993; Trambas und

Griffiths, 2003). Weiterhin spielt der FasL eine wichtige Rolle beim

aktivierungsinduzierten Zelltod (activation-induced cell death, AICD). Während naive

T-Zellen resistent gegenüber Fas-vermittelter Apoptose sind (Green et al., 1992),

exprimieren aktivierte T-Zellen steigende Level an Fas und FasL und werden sensitiv

für Fas/FasL-induzierte Apoptose (Refaeli et al., 1998; Janssen et al., 2000a; Green

et al., 2003). AICD resultiert in der Eliminierung aktivierter T-Zellen durch erneute

Stimulation des T-Zellrezeptors (TZR) und dient der Beendigung einer Immunantwort

und Erhaltung der peripheren Toleranz durch Beseitigung autoreaktiver T-Zellen (Shi

et al., 1990; Dhein et al., 1995; Green et al., 2003; Singer und Abbas, 1994; Zhang et

al., 2004). Eine weitere Rolle als zytotoxisches Effektormolekül wird dem FasL auch

bei der negativen Selektion während der Reifung von Lymphozyten im Thymus

zugesprochen (Kishimoto et al., 1998). Ist die Fas/FasL-induzierte Apoptose durch

Mutationen beeinträchtigt, kann es durch eine gestörte T-Zellhomöostase zur

Entstehung von Autoimmunitäten mit Lymphadenopathien, Splenomegalien oder

Lupus erythematodes kommen (Rieux-Laucat et al., 2003; Fisher et al., 1995; Wu et

al., 1996; Magerus-Chatinet et al., 2013). Eine natürlich vorkommende Maus-Mutante

(gld, generalized lymphoproliferative disease) weist ähnliche pathologische

Veränderungen auf wie Patienten mit einem autoimmunen lymphoproliferativen

Syndrom (ALPS).

Eine weitere Funktion des FasL ist der Schutz immunpreviligierter Regionen, in

denen immunologische Immunantworten stark reduziert sind. Es gibt verschiedene

Mechanismen zum Aufbau derartiger Barrieren: die Expression von MHC-Molekülen

ist reduziert, es bildet sich ein inhibitorisches Zytokinmilieu (z.B. IL-10, TGF)

und/oder entsprechende Gewebe (z.B. Cornea, Testis, Gehirn) exprimieren den FasL

zur Beseitigung infiltrierender Fas-tragender Lymphozyten (Griffith et al., 1995;

Bellgrau et al., 1995; Niederkorn, 2006). Eine „negative“ Rolle wird dem FasL bei der

Umgehung des Immunsystems von Tumorzellen zugeschrieben. Bei der

sogenannten „Tumor Counterattack“ exprimieren Tumorzellen FasL auf ihrer

Einleitung

4

Oberfläche bzw. sekretieren den FasL mit speziellen Vesikeln und beseitigen oder

hemmen einwandernde Lymphozyten, um ihrer Eliminierung zu entgehen (O’Connell

et al., 1996; Andreola et al., 2002). Die Bedeutung des FasL auf Tumorzellen wird

jedoch durchaus kontrovers diskutiert, da die Expression des FasL auch mit pro-

inflammatorischen, anti-apoptotischen Effekten assoziiert wurde (Igney und

Krammer, 2005).

Abb. 1.2: Funktionen und Regulationsmechanismen des Fas-Liganden. Die Bindung des FasL an seinen Rezeptor führt zur Induktion von Apoptose und trägt damit zur Eliminierung von virusinfizierten Zellen und Tumorzellen sowie dem aktivierungsinduzierten Zelltod (activation-induced cell death, AICD) zur Erhaltung der Immunhomöostase bei. Außerdem spielt er bei der T-Zellaktivierung als kostimulatorisches Molekül eine Rolle. Expression und Aktivität des FasL werden durch transkriptionale (aktivierungsinduzierte Genexpression) und posttranslationale Mechanismen (Speicherung in sekretorischen Lysosomen, aktivierungsinduzierter Transport auf die Zelloberfläche, Proteolyse) kontrolliert. Die als verantwortliche Protease identifizierte Metalloprotease ADAM10 generiert einen löslichen Teil (soluble FasL, sFasL) und ein membranständiges N-terminales Fragment (NTF). Im zweiten Schritt wird das FasL-NTF durch SPPL2a proteolytisch gespalten und die intrazelluläre Domäne (intracellular domain, ICD) ins Zytosol freigesetzt. Es wird vermutet, dass die ICD in den Zellkern transloziert und die Genexpression beeinflusst oder im Zytosol degradiert wird. Abkürzungen: ER, endoplasmatisches Retikulum; PN: perinukleäre Region; mFasL: membrane FasL, membranständiger FasL.

Einleitung

5

Der FasL besitzt nicht nur zytotoxisches Potential, sondern wurde auch als

kostimulatorisches Molekül beschrieben. Die sogenannte reverse Signaltransduktion

ist für verschiedene Mitglieder der TNF-Familie beschrieben worden (z.B. TNF-

(Horiuchi et al., 2010)) und auch für den FasL konnte gezeigt werden, dass

Stimulation mittels FasL-spezifischen Antikörpern oder Fas-exprimierenden Zellen

die T-Zellaktivierung und -proliferation beeinflusst und dass dabei sowohl die CKI-

Bindungsmotive als auch die Prolin-reiche Region eine Rolle spielen (Desbarats et

al., 1998; Suzuki und Fink, 2000; Suzuki et al., 2000; Sun et al., 2006, Paulsen et al.,

2009).

1.1.3 Expression des Fas-Liganden

Die Expression des FasL muss streng reguliert sein, da sein Rezeptor Fas konstitutiv

oder nach Induktion auf vielen unterschiedlichen Zellen exprimiert wird (Nagata und

Golstein, 1995). Der FasL ist vorwiegend auf hämatopoetischen Zellen

nachgewiesen, besonders hoch exprimiert ist er in zytotoxischen T-Lymphozyten und

Natürlichen Killer-(NK-)Zellen. Bereits naive NK-Zellen exprimieren FasL, jedoch wird

durch Stimulation der Zellen eine verstärkte Expression erreicht (Eischen et al., 1996;

Medvedev et al., 1997; Bossi und Griffiths, 1999). CD4-positive TH1-Zellen weisen

nach Stimulation des T-Zellrezeptors einen ansteigenden FasL-Gehalt auf, der bei

CD8-positiven Zellen noch verstärkt auftritt (Janssen et al., 2000b; Suda et al, 1995).

Weiterhin konnte die Expression des FasL auch für Monozyten nachgewiesen

werden (Kiener et al., 1997). Zellen in immunprivilegierten Geweben weisen zur

Wahrung ihrer Integrität den FasL auf ihrer Oberfläche auf (Griffith et al., 2005;

Green und Ferguson, 2001) und auch Tumorzellen exprimieren FasL, um einer

Elimierung durch Lymphozyten zu entkommen (Hahne et al., 1996; O’Connell et al.,

1996; Andreola et al., 2002). Für zytotoxische T- und NK-Zellen, die hohe Level an

endogenem FasL aufweisen, wurde eine Speicherung in speziellen sekretorischen

Lysosomen nachgewiesen (Bossi und Griffiths, 1999; Blott et al., 2001; Schmidt et

al., 2009). Für die Regulation der Oberflächenexpression des FasL wurde der

intrazellulären Domäne mit der Prolin-reichen Region eine wichtige Rolle zugesagt,

an die regulatorisch-wirkende Proteine mit SH3-Domänen binden (Baum et al., 2005;

Lettau et al., 2006; Qian et al., 2006).

Die Fas/FasL-vermittelte Apoptose stellt einen zentralen Mechanismus zur

Aufrechterhaltung der Homöostase innerhalb des Immunsystems dar. Kommt es zu

Einleitung

6

Defekten dieses Systems, z.B. durch Mutationen des Rezeptors oder des Liganden,

sind schwere pathologische Krankheitsbilder die Folge. Das im Kindesalter

auftretende ALPS beruht je nach Subtyp auf einer Mutation des Fas-Rezeptors, des

FasL oder der Caspase-10 (Oliveira et al., 2010). Natürlich auftretende Mausstämme

mit Mutationen des Fas-Gens (lpr, lymphoproliferative disease) oder FasL-Gens (gld,

generalized lymphoproliferative disease) weisen schwere Immundefekte auf. Bei

diesen Stämmen erfolgt nach einer Immunantwort kein AICD und es kommt in der

Folge zur Akkumulation von reaktiven Lymphozyten, Lymphadenopathie und

Splenomegalie (Takahashi et al., 1994; Nagata und Suda, 1995; Nagata, 1994).

1.1.4 Regulationsmechanismen zur Kontrolle der Expression des Fas-Liganden

Eine Expression des FasL ist wie erwähnt von großer Bedeutung für ein

funktionierendes Immunsystem und wird deshalb auf verschiedenen Ebenen

kontrolliert (Abbildung 1.2).

1.1.4.1 Transkriptionale Regulation des Fas-Liganden

Die Transkription des FasL wird durch mehrere Transkriptionsfaktoren reguliert, z.B.

NFAT, Irf-1 oder NF-B (Latinis et al., 1997; Chow et al., 2000; Kasibhatla et al.,

1999; Kavurma und Khachigian, 2003). Die Aktivierung des T-Zellrezeptors bewirkt

eine Induktion der Transkription (Dhein et al., 1995). Bei der Aktivierung des

TZR/CD3-Komplexes spielen Src-Kinasen eine wichtige Rolle und ohne ihre

Beteiligung wird die Expression des FasL inhibiert (Dhein et al., 1995; Oberg et al.,

1997).

1.1.4.2 Posttranslationale Modifikationen des Fas-Liganden

Nach Transkription und Translation erfolgt der Transport des FasL auf die

Zelloberfläche oder seine Speicherung in sekretorischen Lysosomen. Beim Transport

des FasL zur Zelloberfläche sowie seiner Lokalisation in bestimmten

Membranregionen spielen Protein-Protein-Interaktionen des FasL mit SH3-Domänen

eine wichtige Rolle. Weiterhin wird die Dichte des membranständigen FasL über eine

proteolytische Prozessierung durch Metalloproteasen reguliert. Die weitere

Proteolyse des N-terminalen Fragmentes durch I-CLiPs führt zur Generierung eines

intrazellulären Fragmentes, welches in den Zellkern translozieren und die

Transkription von Zielgenen induzieren oder einfach degradiert werden könnte.

Einleitung

7

Speicherung in sekretorischen Lysosomen

Zur Kontrolle des zytotoxischen Potentials des FasL erfolgt die Freisetzung auf der

Zelloberfläche unter regulierten Bedingungen. Ein Mechanismus der sicheren

Speicherung des FasL mit der Möglichkeit, schnell, effektiv und vor allem lokal

begrenzt die Oberflächendichte des FasL zur Induktion von Apoptose einer Zielzelle

zu erhöhen, stellt die Assoziation des FasL in sekretorischen Lysosomen dar. Dies

wurde für T- und NK-Zellen nachgewiesen (Bossi und Griffiths, 1999; Blott et al.,

2001; Schmidt et al., 2009). Sekretorische Lysosomen sind bifunktionale Organellen

und weisen die klassischen Eigenschaften von Verdauungsorganellen mit den

charakteristischen Hydrolasen und typischen Membranproteinen wie den Lysosom-

assoziierten Membranproteinen (LAMPs) auf. Sie dienen aber gleichzeitig auch als

Reservoir für auszuschleusende Proteine wie Granzym B und Perforin oder

Membranproteine wie FasL und CTLA-4, die kontrolliert in die immunologische

Synapse entlassen bzw. auf der Zellmembran präsentiert werden und beispielsweise

bei der Lyse infizierter Zellen zusammenwirken (Iida et al., 2000; Blott et al., 2001;

Blott und Griffiths, 2002; Stinchcombe und Griffiths, 2007). Bei Aktivierung, z.B. über

den T-Zellrezeptor, werden die sekretorischen Granula in einem aktinabhängigen

Prozess zur immunologischen Synapse transportiert und fusionieren mit der

Plasmamembran (Lettau et al., 2006). Voraussetzung für die Sortierung des FasL in

sekretorische Lysosomen ist das Vorhandensein der Prolin-reichen Domäne. Fehlt

diese, wird der FasL verstärkt auf der Zelloberfläche präsentiert. In diesem

Zusammenhang wurde eine Interaktion der Prolin-reichen Domäne des FasL mit

regulatorischen Proteinen mit SH3-Domänen vermutet, die den Transport des FasL

in sekretorische Lysosomen steuert (Blott et al., 2001). Es konnte gezeigt werden,

dass der FasL u.a. mit dem Adapterprotein Nck interagiert (Wenzel et al., 2001).

Später stellte sich heraus, dass Nck im Falle einer Aktivierung essentiell für den

Transport des FasL zur immunologischen Synapse ist (Lettau et al., 2006). In

anderen Studien wurde gezeigt, dass Proteine der PCH-(Pombe Cdc15 homology-)

Familie zur Retention des FasL in lysosomalen Kompartimenten und damit zu

verringerter Zytotoxizität beitragen (Baum et al., 2005; Qian et al., 2006). Zuccato

und Kollegen berichteten außerdem, dass der Transport des FasL von

Phosphorylierungen am N-terminalen Ende (Y7/Y9/Y13) durch Src-Kinasen abhängt,

die ihrerseits an die PRD rekrutiert werden (Zuccato et al., 2007).

Einleitung

8

Spezifische Interaktionen mit Proteinen mit SH3-Domänen

Protein-Protein-Interaktionen stellen einen wichtigen Mechanismus zum gerichteten

Ablauf zellulärer Prozesse dar. Spezifische, kontrollierte Interaktionen regulieren die

Verteilung, den Transport und die Signalweiterleitung. Bei vielen Interaktionen

spielen hoch-konservierte Bindungsdomänen eine Rolle, die definierte Motive in

anderen Proteinen erkennen und selektiv an diese binden. Ein wichtiges

Interaktionsmodul stellen SH3-(Src homology 3-)Domänen dar. Sie bestehen aus

etwa 60 Aminosäuren und interagieren mit Proteinen, die bestimmte Prolin-haltige

Sequenzen aufweisen. Oft ist in diesen sogenannten Prolin-reichen Domänen (PRD)

ein PXXP-Motiv enthalten, doch auch davon abweichende Sequenzen sind als

Interaktionsmodule bekannt (Kay et al., 2000; Li, 2005; Mayer, 2006). Die

Interaktionen sind in der Regel konstitutiv und aktivierungsunabhängig. SH3-

Domänen spielen eine wichtige Rolle bei der Bildung von Proteinkomplexen. Im

Gegensatz zu den anderen Mitgliedern der TNF-Superfamilie besitzt der FasL einen

großen intrazellulären Bereich von 80 Aminosäuren (TNF 35 AS; TRAIL 17 AS).

Darin enthalten ist eine Prolin-reiche Domäne (AS 37-80), für die bereits zahlreiche

Protein-Protein-Interaktionen nachgewiesen wurden (Voss et al., 2009).

Beschriebene Interaktionspartner sind verschiedene Tyrosinkinasen der Src-Familie,

Adapterproteine, Mitglieder der PCH-(Pombe Cdc15 homology-)Familie und SNX-

(Sorting Nexin-)Proteine (Hane et al., 1995; Wenzel et al., 2001, Ghadimi et al.,

2002; Baum et al., 2005; Qian et al., 2006; Voss et al., 2009; Lettau et al., 2014;

Voss et al., 2008). Für verschiedene Interaktionen konnte gezeigt werden, dass sie

die Speicherung des FasL in sekretorischen Lysosomen, der Transport aus

sekretorischen Lysosomen zur immunologischen Synapse (siehe oben) und die

Expression des FasL auf der Zelloberfläche in Lipidmikrodomänen (Cahuzac et al.,

2006) regulieren. Ist die PRD deletiert, wird der FasL verstärkt auf der Oberfläche der

Zelle exprimiert (Blott et al., 2001). Dies suggeriert die Bedeutung der Interaktion der

FasL-PRD mit Proteinen mit SH3-Domänen, die den Transport des FasL in

sekretorische Lysosomen begünstigen.

Lokalisation in lipidhaltigen Signalplattformen

Eine weitere Möglichkeit die zytotoxische Effektorfunktion des FasL zu kontrollieren,

besteht in der gezielten Lokalisation in bestimmte Bereiche der Zellmembran. Durch

die Anreicherung von Cholesterol, Sphingolipiden und Phospholipiden kommt es zu

Einleitung

9

Signalplattformen innerhalb der Zellmembran. Die Trennung sogenannter Lipid Rafts

(Simons und Ikonen, 1997) von den lipidärmeren Bereichen der Zellmembran

ermöglicht die Separierung von Proteinen und dessen kontrollierte Rekrutierung

beispielsweise im Rahmen einer Aktivierung (Simons und Toomre, 2000). Auch für

den FasL konnte eine zumindest partielle Assoziation mit Lipidmikrodomänen sowohl

in Transfektanten als auch in primären T-Zellen nachgewiesen werden (Cahuzac et

al., 2006; Nachbur et al., 2006). Dabei wird die Rekrutierung des FasL zu

Lipidmikrodomänen ebenfalls von seiner Prolin-reichen Domäne vermittelt (Cahuzac

et al., 2006; Nachbur et al., 2006). Es wurde außerdem gezeigt, dass die Lokalisation

des FasL in Lipidmikrodomänen durch die Bindung an Fas verstärkt wird und eine

Reduktion des Cholesterolgehalts zu verminderter Zytotoxizität führt (Cahuzac et al.,

2006, Nachbur et al., 2006). Auch für die Regulation der ADAM10-vermittelten

Proteolyse des FasL wurde die Bedeutung von Lipidmikrodomänen analysiert.

Während der unprozessierte FasL sowohl in leichten als auch schweren Fraktionen

von Dichtegradienten detektiert wurde, wurde das N-terminale Fragment (NTF) nur in

leichten Fraktionen nachgewiesen. Reifes ADAM10 wurde in geringen

Konzentrationen in den leichten Fraktionen nachgewiesen, hauptsächlich befand sich

die Protease aber in den schweren Fraktionen, sowohl die Proform als auch die

mature, aktive Form. Behandlung der Zellen mit Cholesteroloxidase und

Metalloproteaseinhibitoren führte zur Reduktion der NTFs (Guardiola-Serrano et al.,

2010). Die proteolytische Prozessierung des FasL in Lipidmikrodomänen wurde auf

die Palmitoylierung eines Cysteins (Aminosäure 82) zurückgeführt, während die

Interaktion von unreifem sowie reifem ADAM10 mit dem FasL unabhängig vom

Palmitoylierungszustand auftrat (Guardiola-Serrano et al., 2010).

Proteolytische Prozessierung durch ADAM-Proteasen

Die Oberflächenexpression des FasL wird weiterhin mittels Proteolyse durch

Metalloproteasen reguliert (Abbildung 1.2). Als hauptverantwortliche Protease wurde

ADAM10 identifiziert (Schulte et al., 2007; Kirkin et al., 2007). Die Proteolyse von

FasL durch ADAM10 führt zur Reduzierung des membranständigen FasL (membrane

FasL, mFasL) und einer erhöhten Freisetzung des löslichen FasL (soluble FasL,

sFasL). Hierdurch nimmt ADAM10 Einfluss auf die T-Zellfunktionalität und reduziert

die Auslösung des AICD sowie die zytotoxische Wirkung von T-Zellen (Schulte et al.,

2007). sFasL kann durch die Selbstaggregationsdomäne nach wie vor trimerisieren

Einleitung

10

und sowohl pro- als auch anti-apoptotische Eigenschaften konnten gezeigt werden.

Jedoch wurde dem membranständigen FasL ein tausendfach höheres zytotoxisches

Potential als dem löslichen Fragment zugesagt (Schneider et al., 1998; O’Reilly et al.,

2009). Nach erfolgter Proteolyse durch ADAM10 wird im Anschluss das N-terminale

Fragment (NTF) durch SPPL2a aus der SPPL(Signal Peptide Peptidase-like)-Familie

der Aspartyl-Proteasen gespalten (Kirkin et al., 2007). Die ICD des FasL wird in das

Zellinnere entlassen, wo sie möglicherweise Einfluss auf die Transkription nimmt. Sie

könnte aber auch direkt im Zytosol degradiert werden.

1.2 A Disintegrin And Metalloproteases (ADAMs)

Proteolyse stellt eine wichtige posttranslationale Modifikation zur Regulation von

biologischen Prozessen dar. Beim sogenannten Shedding werden

Transmembranproteine irreversibel innerhalb der extrazellulären Domäne gespalten,

wodurch biologische Prozesse entweder initiiert (z.B. bei der Freilassung von

löslichen Faktoren wie TNF-) oder beendet (wie bei der Proteolyse von

Adhäsionsmolekülen, z.B. L-Selektin) werden. Die freigesetzte extrazelluläre

Domäne kann anschließend autokrin oder parakrin wirken. Das Shedding ist

außerdem häufig Voraussetzung für die folgende regulierte intramembrane

Proteolyse (RIPping), bei dem das N- bzw. C-terminale Fragment (NTF, CTF)

proteolytisch weiter prozessiert wird und eine intrazelluläre Domäne ins Zytosol

freigesetzt wird (Weihofen und Martoglio, 2003; Brown et al., 2000). Diese kann wie

im Fall des an Entwicklungsprozessen beteiligten Transmembranproteins Notch bei

der Transkription von Zielgenen aktiv werden (Schroeter et al., 1998; De Strooper et

al., 1999).

Die „A Disintegrin And Metalloproteases“ (ADAMs) stellen die größte Familie der

Sheddasen dar und spielen u.a. eine Rolle bei der Regulation von

Entwicklungsprozessen, Entzündungsreaktionen und der Entstehung bzw.

Ausbreitung von Tumoren. Zusammen mit den Matrix-Metalloproteasen (MMPs),

Snake Venom-Proteasen (SNVPs) und ADAM containing thrombospondin motifs

(ADAMTs) bilden sie die Adamalysin-Subfamilie (Stöcker et al., 1995). ADAM-

Proteine sind phylogenetisch hoch konserviert. Im Menschen umfasst die Familie der

ADAMs 21 verwandte Proteine, von denen jedoch nur 13 an der Proteolyse von

Wachstumsfaktoren, Rezeptoren, Zytokinen und Adhäsionsmolekülen beteiligt sind

(Edwards et al., 2008). Obwohl die Liste von Proteinen, die durch ADAM-Mitglieder

Einleitung

11

gespalten werden, unaufhörlich wächst, sind die näheren Umstände der Regulation

von ADAM-Proteasen nur wenig verstanden. Strukturell weisen die einzelnen

Mitglieder eine gewisse Homologie auf. ADAMs sind Typ-I-Transmembranproteine

mit einer durchschnittlichen Länge von 750 Aminosäuren. Durch den Aufbau in

multiple Domänen sind sie an verschiedenen biologischen Prozessen beteiligt, wie

die Migration von Zellen, Wundheilung und der Verschmelzung von Spermium und

Eizelle. Die generelle Struktur gliedert sich in eine N-terminale Signalsequenz, eine

Prodomäne, die Metalloprotease-Domäne, gefolgt von der Disintegrin-Domäne und

einer membranproximalen Domäne mit einer Cystein-reichen Region und einem

EGF-Motiv. Anschließend folgt eine Transmembrandomäne und C-terminal gelegen

der intrazelluläre Teil, der sich zwischen den einzelnen Mitgliedern der Familie in

Länge und Sequenz unterscheidet, was zu verschiedenen Eigenschaften bezüglich

Reifung, Lokalisation, Aktivität, Regulation und Signalgebung führt (Black und White,

1998; Seals und Courtneidge, 2003). Die ADAM-Familie bevorzugt keine spezifische

Spaltsequenz und es wird vermutet, dass auch die nicht-katalytischen extrazellulären

Domänen zur Substraterkennung beitragen (Reddy et al., 2000; Smith et al., 2002;

White, 2003). Die besondere Stellung der Proteasen ADAM10 und ADAM17 in

Entwicklungsprozessen wurde durch Depletion der verantwortlichen Gene in Mäusen

deutlich, bei denen multiple schwere Defekte auftraten und die Mäuse nicht

lebensfähig waren (Peschon et al., 1998; Hartmann et al., 2002). ADAM10 und

ADAM17 wurden als verantwortliche Proteasen für eine Reihe von Substraten

identifiziert. Teilweise wird ein Substrat von beiden geschnitten, viele Substrate

werden jedoch auch ausschließlich durch eine der beiden Proteasen prozessiert

(Edwards et al., 2008; Saftig und Reiss, 2011). Für den FasL wurde durch

Verwendung von verschiedenen Inhibitoren ADAM10 als Haupt-Sheddase

identifiziert (Schulte et al., 2007; Kirkin et al., 2007).

1.2.1 Struktur von ADAM10

Die Metalloprotease ADAM10 (CD156c, KUZ, MADM) ist ein proteolytisch aktives

Mitglied der ADAM-Familie. ADAM10 ist ein Typ-I-Transmembranprotein und

entspricht im Aufbau der grundlegenden Struktur der ADAMs (Abbildung 1.3).

Humanes ADAM10 besteht aus 748 Aminosäuren, murines ADAM10 aus 749

Aminosäuren. N-terminal gelegen befindet sich eine Signalsequenz (AS 1-19), die für

den Transport in das endoplasmatische Retikulum benötigt wird. Die Prodomäne

Einleitung

12

(AS 20-213) ist bei der Reifung von ADAM10 von Bedeutung. Sie wirkt inhibierend

auf die proteolytische Aktivität von ADAM10 und hält das Protein in einem latenten

Zustand (Van Wart und Birkedal-Hansen, 1990; Becker et al., 1995; Moss et al.,

2007). Außerdem dient die Prodomäne als Chaperon zur korrekten Faltung der

Protease, insbesondere der Metalloprotease-Domäne (Milla et al., 1999; Anders et

al., 2001). Sie wird durch Proprotein-Konvertasen (PCs) proteolytisch abgespalten

(Pei und Weiss, 1995; Lum et al., 1998; Anders et al., 2001). Die katalytische

Prozessierung der Substrate wird durch die hoch konservierte Metalloprotease-

Domäne (AS 220-456) mit der Kernsequenz HExGHxxGxxHD vermittelt (Schlöndorff

und Blobel, 1999). Die nachfolgende Disintegrin-Domäne (AS 457-551), die bei der

Interaktion mit Integrinen von Bedeutung ist (Reddy et al., 2000; White, 2003), sowie

die membranproximale Domäne (AS 552-672) mit einer Cystein-reichen Region

tragen zur Substraterkennung und zur Zelladhäsion durch Bindung an Glykoproteine

wie Syndecan oder Fibronektin bei (Iba et al., 1999; Janes et al., 2005; Reiss und

Saftig, 2009). Der extrazelluläre Teil von ADAM10 weist verschiedene potentielle N-

Glykosylierungsstellen auf (AS 267, 278, 439, 551; Howard et al., 1996). Im

Anschluss an die Transmembrandomäne (AS 673-693) folgt der intrazelluläre Teil mit

Prolin-reichen Regionen (AS 708-717, AS 722-728) zur möglichen Bindung von SH3-

Domänen. Der intrazelluläre Teil von ADAM10 unterscheidet sich in Mensch und

Maus lediglich im Austausch eines Glutamins zu Prolin (AS 733Q > AS 734 P), was

auf die hoch konservierte regulatorische Funktion der Domäne hindeutet

(Abbildung 1.3). ProADAM10 weist ein berechnetes Molekulargewicht von 84,14 kDa

auf, nach Entfernung der Prodomäne entsteht die reife, aktive Form von ADAM10

(59,4 kDa). Für ADAM10 konnte gezeigt werden, dass die Protease selbst

proteolytisch prozessiert werden kann. ADAM9 und ADAM15 spalten ADAM10

extrazellulär und generieren ein lösliches Fragment (soluble ADAM10, sADAM10)

sowie ein C-terminales Fragment (CTF), welches durch die -Secretase zu einer

intrazellulären Domäne prozessiert und ins Zytosol entlassen wird (Tousseyn et al.,

2009).

Einleitung

13

Abb. 1.3: Schematischer Aufbau von ADAM10. N-terminal befindet sich ein Signalpeptid, anschließend die katalytische Metalloprotease-Domäne. Die Disintegrin-Domäne fungiert bei der Bindung von Integrinen und zusammen mit der Cystein-reichen Region in der membranproximalen Domäne bei der Substraterkennung. Nach der Transmembrandomäne folgt die intrazelluläre Domäne mit zwei Prolin-reichen Regionen zur Interaktion mit SH3-Domänen. Abkürzung: AS, Aminosäure. Modifiziert nach Ebsen et al., 2014.

1.2.2 Funktionen von ADAM10

Durch die Vielzahl an Substraten erfüllt ADAM10 als Sheddase multiple Funktionen

innerhalb eines Organismus, besonders innerhalb des Nervensystems, bei

Entzündungsreaktionen und der Entstehung und Ausbreitung von Tumoren. Die

wichtige Stellung von ADAM10 wurde auch durch genetisch veränderte Mäuse

deutlich, bei denen ADAM10 deletiert war. Durch schwerwiegende Defekte des

zentralen Nerven- und Kardiovaskularsystems waren sie embryonal letal und der

Phänotyp dieses Knockouts ähnelte Mäusen, bei denen Notch mutiert war (Hartmann

et al., 2002). Da ADAM10 selbst prozessiert wird, ist es möglich, dass das ins Zytosol

freigesetzte intrazelluläre Fragment bei der Transkription aktiv wird.

1.2.3 Expression von ADAM10

ADAM-Proteasen wurden in Vertebraten, Insekten und Nematoden nachgewiesen.

Während die Expression bestimmter ADAMs nur auf wenige Gewebe, besonders die

Hoden, beschränkt ist, werden andere (ADAM8, 9, 10, 11, 12, 15, 17, 19, 22, 23, 28

und 33) in einer Vielzahl von Geweben exprimiert. Das Gen für ADAM10 ist im

Einleitung

14

Menschen auf Chromosom 15 (15q21.3-q23; Yamazaki et al., 1997) und in der Maus

auf Chromosom 9 lokalisiert (Yamazaki et al., 1997). ADAM10 wird konstitutiv auf

fast allen Zellen und Geweben exprimiert (Chantry und Glynn, 1990; Wolfsberg et al.,

1996; Yavari et al., 1998; Kärkkäinen et al., 2000). Für einige ADAM-Proteasen (u.a.

ADAM10) wurde nachgewiesen, dass durch alternatives Spleißen verschiedene

Isoformen entstehen, wodurch es neben den membrangebundenen Formen zu

sekretierten Proteasen kommt (Yavari et al., 1998; Hotoda et al., 2002). ADAM10

wird als inaktives Zymogen produziert. Nach Abspalten der Signalsequenz reift

ADAM10 auf dem sekretorischen Weg. Hierbei spielt die Prodomäne eine große

Rolle, da sie inhibierend und als intramolekulares Chaperon bei der korrekten

Faltung wirkt (Van Wart und Birkedal-Hansen, 1990; Becker et al., 1995; Milla et al.,

1999; Anders et al., 2001; Moss et al., 2007). Sie wird proteolytisch durch Furin bzw.

der Proprotein-Konvertase 7 (PC7) entfernt (Anders et al., 2001; Seals und

Courtneidge, 2003). Inhibierend auf die Reifung von ADAM10 zur aktiven Form wirkt

auch die Bindung von Calmodulin, das an eine IQ-Konsensusbindestelle innerhalb

der intrazellulären Domäne von ADAM10 bindet (Horiuchi et al., 2007). Unter

Verwendung pharmakologischer Inhibitoren des frühen sekretorischen Reifungswegs

(Monensin und Brefeldin A) konnte nachgewiesen werden, dass die Reifung und

Aktivierung von ADAM10 im trans-Golgi-Netzwerk stattfindet (Lum et al., 1998;

Roghani et al., 1999; Howard et al., 2000; Anders et al., 2001; Kang et al., 2002). Im

späteren Verlauf der Reifung im trans-Golgi-Netzwerk erfolgt die Glykosylierung von

ADAM10 und nachfolgend der regulierte Transport zum Wirkungsort.

1.2.4 Regulationsmechanismen zur Kontrolle der ADAM10-Aktivität

Neben einer generellen Kontrolle der Transkription wurde für verwandte ADAMs

(ADAM9, 12 und 15) gezeigt, dass auf posttranslationaler Ebene eine Regulation

erzielt wird. In diesem Zusammenhang sind u.a. Proteine mit SH3-Domänen, die an

die kurzen intrazellulären Prolin-reichen Regionen der ADAMs binden, von

Bedeutung und auch durch differentielle Lokalisation der ADAMs von ihren

Substraten wird eine Regulation der Aktivität gewährleistet.

1.2.4.1 Transkriptionale Regulation von ADAM10

Die proteolytische Aktivität von ADAM10 wird bereits auf transkriptionaler Ebene

kontrolliert. So wurde gezeigt, dass Retinolsäure, ein Vitamin-A-Metabolit, die

Einleitung

15

Transkription von ADAM10 durch Bindung an spezifische Elemente (retinoic acid

responsive elements, RAREs) innerhalb der Promotorregion verstärkt und zu

steigenden mRNA- und Proteinleveln von ADAM10 führt (Endres et al., 2005;

Holback et al., 2005). Weiterhin wurden einige Transkriptionsfaktoren identifiziert, die

die Expression von ADAM10 beeinflussen. Der Transkriptionsfaktor PAX2 kann in

renalen Karzimomzellen an die Promotorregion von ADAM10 binden und die

Proteinexpression regulieren (Doberstein et al., 2013). Als ein weiterer induzierender

Transkriptionsfaktor der ADAM10-Genexpression im Zusammenhang der Alzheimer-

Erkrankung wurde das X-Box-Protein 1 (XBP-1) identifiziert (Reinhardt et al., 2014).

In einem Alzheimer-Modell wurde die NAD-abhängige Deacetylase Sirtuin 1 (SIRT1)

als induzierender Faktor der ADAM10-Genexpression im Gehirn nachgewiesen

(Donmez et al., 2010). Weiteren Einfluss nimmt der 5‘-untranslatierte Bereich (5‘-

UTR) der ADAM10-mRNA. Es wurde gezeigt, dass insbesondere der vordere

Bereich des 5‘-UTR durch Ausbildung einer stabilen Sekundärstruktur verantwortlich

für die translationale Suppression von ADAM10 ist (Lammich et al., 2010; Lammich

et al., 2011).

1.2.4.2 Posttranslationale Modifikationen von ADAM10

Über posttranslationale Regulationsmechanismen zur Kontrolle der Aktivität und

Oberflächenexpression von ADAM10 ist bisher wenig bekannt. Nach der Translation

wird die Reifung von ADAM10 im ER und Golgi-Netzwerk streng kontrolliert. Es

konnte für ADAM12 gezeigt werden, dass Proteine mit SH3-Domänen die Aktivität

von ADAM12 beeinflussen und über Endozytoseprozesse die Oberflächendichte

regulieren. Durch die Lokalisation in bestimmten Membranregionen erfolgt eine

Trennung von Substraten und deren Sheddasen. Unter bestimmten Stimuli erfolgt

dann eine Vereinigung mit nachfolgendem Anstieg der Proteolyse. Als ein weiterer

Regulationsmechanismus wird ADAM10 selbst proteolytisch prozessiert, wodurch

eine Regulation der Expression auf der Zelloberfläche und hierdurch der Aktivität

erfolgt.

Subzelluläre Lokalisation

Über die subzelluläre Lokalisation von ADAM10 und auch ADAM17 ist bisher wenig

bekannt. Nach der Translation im ER erfolgt die Reifung unter Abspaltung der

Prodomäne im trans-Golgi-Netzwerk (Lum et al., 1998; Dallas et al., 1999; Lammich

Einleitung

16

et al., 1999; Roghani et al., 1999; Hougaard et al., 2000; Howard et al., 2000;

Schlöndorff et al., 2000; Kang et al., 2002; Gutwein et al., 2003). In der

zytoplasmatischen Domäne von ADAM10 soll ein Retentionssignal den Transport

und die Reifung von ADAM10 kontrollieren (Marcello et al., 2010). Für die

membranständige Isoform von ADAM12 (ADAM12L) wurde gezeigt, dass Deletion

der intrazellulären Domäne die Speicherung im trans-Golgi-Netzwerk verhindert und

zur Akkumulation von reifem ADAM12 auf der Zelloberfläche führt. Dies wurde auf

ein Retentionssignal innerhalb der zytoplasmatischen und Transmembrandomäne

zurückgeführt (Hougaard et al., 2000). Auch für ADAM10 wurde von zwei

verschiedenen Isoformen durch alternatives Spleißen berichtet, was zu sekretiertem

und membranständigem ADAM10 führte (Yavari et al., 1998). Es gibt viele Berichte

über die Speicherung von ADAM-Proteasen in perinukleären Bereichen und

Kolokalisation mit Golgi-Markern (Lum et al., 1998; Lammich et al., 1999; Hougaard

et al., 2000; Schlöndorff et al., 2000; Kang et al., 2002; Dornier et al., 2012). Da die

proteolytische Prozessierung durch ADAM-Proteasen generell zur Freisetzung der

extrazellulären Domäne von Membranproteinen führt, geht man von der

Zelloberfläche als Ort der Proteolyse aus. Für ADAM-Proteasen und auch speziell für

ADAM10 wurde gezeigt, dass vorwiegend die maturen, aktiven Formen der ADAMs

auf der Zellmembran lokalisiert sind (Black et al., 1997; Lum et al., 1998; Lammich et

al., 1999; Roghani et al., 1999; Schlöndorff et al., 2000; Gutwein et al., 2003; Carey

et al., 2011). Mittels Trypsinierung der Zelloberflächenproteine wurde für ADAM15

gezeigt, dass die Hälfte an reifem ADAM15 intrazellulär gespeichert wird, während

reifes ADAM28 vorwiegend auf der Zelloberfläche nachgewiesen wurde (Lum et al.,

1998; Howard et al., 2000). Mittels Biotinylierung von Membranproteinen wurde

gefunden, dass auf der Zelloberfläche vorwiegend reifes ADAM10 lokalisiert ist,

welches Dynamin-abhängig endozytiert wird (Carey et al., 2011). Es gibt weiterhin

Berichte, dass ADAMs bereits intrazellular aktiv sein können (Lammich et al., 1999;

Skovronsky et al., 2000; Shirakabe et al., 2001; Gutwein et al., 2003). In B-Zellen

wurde für ADAM10 und dessen Substrat CD23 von einer gemeinsamen Freisetzung

über Exosomen berichtet (Padro et al., 2013) und auch in Prostatakarzinomzellen

wurden MICA-, ADAM10- und ADAM17-enthaltende Exosomen extrahiert (Chitadze

et al., 2013). Eine nukleäre Lokalisation von ADAM10 wurde für

Prostatakarzinomzellen (McCulloch et al., 2004) und eine lysosomale Assoziation für

Brustkrebszellen beobachtet (Gutwein et al., 2003). Letztendlich scheinen

Einleitung

17

subzelluläre Lokalisationen der ADAM-Proteasen und der Ort der proteolytischen

Prozessierung je nach Zelltyp, Protease und Substrat zu variieren.

Interaktionen mit regulatorischen Proteinen

Viele ADAM-Proteasen weisen intrazelluläre Bindungsstellen für Proteine mit SH3-

Domänen auf. Die Anzahl dieser Prolin-reichen Domänen (PRDs) variiert stark

zwischen einzelnen Mitgliedern. Während einige ADAMs keine PRDs besitzen (wie

ADAM28), haben andere ein oder zwei PRDs (z.B. ADAM10, ADAM17) oder eine

Vielzahl Prolin-reicher Bindungsstellen (ADAM12, ADAM15). Der Unterschied in der

Anzahl von PRDs weist hierbei auf eine mögliche spezifische Regulation bei

Transport, Lokalisation und/oder Aktivität der jeweiligen ADAMs durch interagierende

Proteine mit SH3-Domänen hin. ADAM10 beinhaltet in der intrazellulären Domäne

zwei Prolin-reiche Regionen zur potentiellen Interaktion mit regulatorischen Proteinen

(Abbildung 1.3). Bisher sind jedoch nur wenige regulatorische Bindungspartner von

ADAM10 bekannt. Für andere ADAMs konnte jedoch der Einfluss von Proteinen mit

SH3-Domänen auf Aktivität und Regulation gezeigt werden. In Xenopus-Embryos

wurde eine Interaktion von X-(Xenopus-)PACSIN2 und ADAM13 nachgewiesen.

Überexpression von X-PACSIN2 konnte Entwicklungsdefekte aufheben, die durch

Überexpression von ADAM13 entstanden (Cousin et al., 2000). In weiteren Analysen

konnte die Interaktion von ADAM12 mit zahlreichen SH3-Domänen verifiziert werden.

Dazu gehörten SH3-Domänen der Src-Kinasen c-Src und Yes (Kang et al., 2000;

Suzuki et al., 2000), das Adapterprotein Grb2 (Suzuki et al., 2000), das

Adapterprotein TKS5 (Five SH3 domain-containing protein = FISH) (Abram et al.,

2003), die p85-Untereinheit der Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K) (Kang et al.,

2001), PACSIN3 (Protein kinase C and casein kinase substrate in neurons protein 3)

(Mori et al., 2003), die Zytoskelettproteine -Actinin-1 und -2 (Cao et al., 2001;

Galliano et al., 2000) sowie das ADAM-bindende Protein Eve-1 (SH3D19, EBP)

(Tanaka et al., 2004). Für einige der interagierenden Proteine wurde regulatorisches

Potential bezüglich der ADAM-Aktivität nachgewiesen. So verstärkten PACSIN3 und

Eve-1 die ADAM12-vermittelte Proteolyse von HB-EGF (Mori et al., 2003, Tanaka et

al., 2004). ADAM12 wurde durch transiente Interaktion mit c-Src phosphoryliert,

wodurch es zu Änderungen der subzellulären Verteilung von perinukleären Regionen

zur Zellperipherie kam (Stautz et al., 2009). Die Interaktion von Grb2 mit ADAM12

spielt eine Rolle bei der Internalisierung von ADAM12, nimmt jedoch keinen Einfluss

Einleitung

18

auf dessen Aktivität (Stautz et al., 2012). In anderen Analysen wurden die

endozytotisch aktiven Proteine Endophilin-A1 (EEN-B1, SH3GL1) und Sorting Nexin

9 (SNX9, SH3PX1) als interagierende Proteine von ADAM9 und ADAM15 identifiziert

(Howard et al., 1999). Auch für ADAM15 wurde eine Bindung an das Adapterprotein

Grb2 und an verschiedene Mitglieder der Src-Familie (Src, Lck und Hck) gezeigt

(Poghosyan et al., 2002). Als Interaktionspartner von ADAM17 wurde außerdem

SAP97 (Synapse-associated protein 97) identifiziert, welches die proteolytische

Aktivität von ADAM17 beeinflusste (Peiretti et al., 2003). Auch für ADAM10 konnte

eine Interaktion mit SAP97 mit Einfluss auf die Lokalisation von ADAM10 gezeigt

werden (Marcello et al., 2007).

In eigenen Vorarbeiten (Diplomarbeit H. Oberdoerster, 2010) wurde ein erstes

Screening von interagierenden SH3-Domänen der zytoplasmatischen Domäne von

ADAM10 (GST-hADAM10cyt(697-748) durchgeführt. Hierbei wurde eine kommerziell

erhältliche Phagenbibliothek verwendet (All SH3 Domain Phager® von Geneart). Als

Kontrollprotein wurde GST verwendet. Insgesamt wurden 158 Klone sequenziert, die

mit GST und GST-hADAM10(697-748) präzipitierten. Von diesen 158 Klonen

interagierten 45 Klone ausschließlich mit dem intrazellulären Anteil von ADAM10 und

nicht mit der Kontrolle GST. Durch die Sequenzierung wurden 22 SH3-Domänen

identifiziert, von denen die SH3-Domänen von iASPP (inhibitor of ASPP protein;

14 Klone), Endophilin-A2 (5 Klone) und SKAP1 (Src kinase-associated

phosphoprotein 1; 3 Klone) am häufigsten präzipitiert wurden (Abbildung 1.4).

Abb. 1.4: Screening einer Phagenbibliothek zur Identifizierung interagierender SH3-Domänen mit GST-hADAM10(697-748). Von 305 humanen SH3-Domänen wurden 22 ausschließlich als potentielle Interaktoren der zytoplasmatischen Domäne von ADAM10 identifiziert.

Einleitung

19

Als weiterer Regulationsmechanismus der Expression und Aktivität von ADAM10

wurden Interaktionen mit Tetraspaninen nachgewiesen. Für verschiedene

Tetraspanine (TSPAN12, CD9, CD53, CD63, CD81, CD82, CD151) wurden

Interaktionen mit der reifen Form von ADAM10 gezeigt, die teilweise zu erhöhtem

Shedding führten (Arduise et al., 2008; Xu et al., 2009). Auch für Mitglieder der

TetraspaninC8-Subfamilie (Tspan5, Tspan10, Tspan14, Tspan15, Tspan17 und

Tspan33) wurde eine direkte Interaktion mit ADAM10 nachgewiesen (Haining et al.,

2012). Außerdem wurde gezeigt, dass einige der TspanC8-Mitglieder den Transport

von ADAM10 aus dem ER begünstigen und teilweise die Expression von ADAM10

auf der Zelloberfläche regulieren (Dornier et al., 2012).

Lokalisation in verschiedenen Membrankompartimenten

Die Separation von ADAMs und deren Substraten durch Lokalisation in bestimmte

Membrankompartimente sorgt zusätzlich für eine Regulation der Aktivität. So konnte

für zahlreiche ADAM17-Substrate gezeigt werden, dass sie in sogenannten Lipid

Rafts lokalisiert sind (Tellier et al., 2006). In dieser Veröffentlichung wurde auch für

ADAM17 eine Akkumulation in den mit Cholesterol und Sphingolipiden

angereicherten Lipidmikrodomänen nachgewiesen (Tellier et al., 2006). Auflösen der

Signalplattformen durch Cholesteroldepletion führte zu einer erhöhten Freisetzung

von löslichem TNF, TNFR1 und TNFR2 (Tellier et al., 2006). Auch CD30, ein Mitglied

der TNF-Superfamilie, wurde in Rafts detektiert, während ADAM17 in dieser

Publikation von Rafts ausgeschlossen war. Cholesteroldepletion führte auch hier zu

erhöhter Proteolyse von CD30 (von Tresckow et al., 2004). Die proteolytische

Prozessierung des Notch-Liganden Jagged1 durch ADAM17 wurde im Gegensatz als

Raft-unabhängig beschrieben (Parr-Sturgess et al., 2010). Für weitere ADAM-

Proteasen ist ebenfalls eine differentielle Lokalisation von ihren Substraten zur

Regulation der Aktivität bekannt. Für das amyloide Vorläuferprotein (amyloid

precurser protein, APP) wurde gezeigt, dass die Verminderung des

Cholesterolgehalts in verstärktem Shedding von APP durch ADAM10 und folglich

einem Anstieg des neuroprotektiven löslichen Fragmentes resultierte (Kojro et al.,

2001). In einer weiteren Publikation wurden verschiedene Lokalisationen von APP,

sowohl Raft-assoziiert als auch nicht Raft-assoziiert, nachgewiesen. Dies führte zu

Unterschieden in der proteolytischen Prozessierung durch -Sekretasen (Rafts) oder

Einleitung

20

-Sekretasen (außerhalb der Rafts) (Ehehalt et al., 2003). Auch das Glykoprotein

CD44 wurde in Lipid Rafts detektiert, während ADAM10 außerhalb der Rafts

nachgewiesen wurde. Durch Reduktion von zellulärem Cholesterol kam es zu einer

verstärkten Proteolyse von CD44 (Murai et al., 2011). Auch für andere Substrate von

ADAMs wurde ein Effekt von verändertem Cholesterolgehalt auf die Proteolyserate

gezeigt, z.B. für den Interleukin-6-Rezeptor (IL6R) (Matthews et al., 2003), L1-CAM

(Mechtersheimer et al., 2001), und die Kollagene XVII und XXIII (Zimina et al., 2005;

Veit et al., 2007). In Zusammenhang mit dem FasL und ADAM10 wurde in

vorhergehenden Untersuchungen eine Lokalisation von geringen Mengen an reifem

ADAM10 in Lipid Rafts nachgewiesen. Unreifes ADAM10 wurde lediglich außerhalb

Raft-assoziierter Fraktionen detektiert (Guardiola-Serrano et al., 2010).

1.2.5 Implikationen von ADAM-Proteasen bei bestimmten Krankheitsbildern

ADAM-Proteasen spielen eine wichtige Rolle innerhalb des Immunsystems und sind

in einer Vielzahl von Krankheitsbildern impliziert. Neben Asthma und rheumatoider

Arthritis wurde auch bei der Entstehung multipler dermatologischer Pathologien

gezeigt, dass Proteolyse eine Rolle spielt (Kawaguchi und Hearing, 2011; Duffy et

al., 2011). So wurde z.B. für E-Cadherin bzw. N-Cadherin gezeigt, dass eine

reduzierte Expression durch Proteolyse zur verminderten Adhäsion von

Keratinozyten und Ausbildung von Ekzemen, Morbus Hailey-Hailey, Morbus Darier,

Psoriasis und Pemphigus vulgaris (Blasensucht) führt (Burge und Schomberg, 1992;

Furukawa et al., 1994; Chung et al., 2005; Reiss et al., 2005; Maretzky et al., 2008).

Eine Beteiligung von ADAMs wurde auch in anderen Krankheiten nachgewiesen. In

Bezug auf die Proteolyse von APP wurde für ADAM10 eine neuroprotektive Wirkung

bei der Alzheimer-Erkrankung gezeigt. APP kann durch mehrere Proteasen

gespalten werden, wodurch unterschiedliche Fragmente generiert werden. Bei dem

amyloidogenen Weg führt die Prozessierung von APP durch die β-Sekretase BACE-

1 zur Formierung des löslichen Fragmentes sAPPβ und dem membranständigen C-

terminalen Fragment (CTF C99), welches anschließend durch γ-Sekretasen weiter

prozessiert wird. Das entstehende Aβ-Peptid trägt hauptsächlich zum Krankheitsbild

der Alzheimer-Erkrankung bei. Bei dem nicht-amyloidogenen Weg verhindert

ADAM10 als α-Sekretase das Shedding von APP zu den toxischen Fragmenten und

führt stattdessen zur Generierung des löslichen neuroprotektiven Fragmentes sAPPα

Einleitung

21

und einem kürzeren membranständigen CTF (CTF C83) (Endres und Fahrenholz,

2012).

Bei verschiedenen Tumoren wurde gezeigt, dass ADAM-Proteasen konstitutiv aktiv

oder überexprimiert sind und zur Metastasierung beitragen (z.B. durch Proteolyse

von Adhäsionsmolekülen oder Wachstumsfaktoren) (McCulloch et al., 2004; Knösel

et al., 2005; Lendeckel et al., 2005; Gavert et al., 2007; Ko et al., 2007; Mochizuki

und Okada, 2007; Kohutek et al., 2009; Duffy et al., 2009; Gaida et al., 2010;

Armanious et al., 2011). Durch den großen Einfluss von ADAMs bei Zelladhäsion,

-migration, Entzündungsprozessen und Krebs sind sie im Focus möglicher

Therapieansätze. In einigen Versuchen wurde die Aktivität von ADAMs durch

synthetische Inhibitoren (Duffy et al., 2011; Rose-John, 2013), aufgereinigte oder

synthetisch hergestellte Prodomänen (Moss et al., 2007; Gonzales et al., 2004),

veränderte Varianten der natürlich auftretenden Inhibitoren von ADAMs (TIMPs,

tissue inhibitors of metalloproteases) (Huovila et al., 2005; Rapti et al., 2008;

Kveiborg et al., 2010) oder monoklonale Antikörper (Lendeckel et al., 2005) inhibiert.

Synthetische Inhibitoren wurden in klinischen Studien getestet und führten u.a. zu

reduziertem Wachstum von Tumoren (Duffy et al., 2011). Bei der Behandlung von

rheumatoider Arthritis mit ADAM17-Inhibitoren traten aber auch akute

Nebenwirkungen wie Hepatotoxizität auf, weshalb die Studien nicht weiter geführt

werden konnten (Moss et al., 2008; Duffy et al., 2011). Um den Einfluss der ADAM-

Proteasen bei bestimmten Krankheitsbildern für mögliche Therapien nutzen zu

können, ist es wichtig, die genauen molekularen Regulationsmechanismen und

Zusammenhänge zu verstehen. Durch die Vielzahl an Substraten ist eine Erhöhung

bzw. eine Reduktion der ADAM-Aktivität immer mit weiteren Immunreaktionen

innerhalb des Organismus verbunden und muss bei einer eventuellen Therapie

berücksichtigt werden.

Fragestellung

22

2. Fragestellung

Durch vorhergehende Untersuchungen innerhalb der Arbeitsgruppe konnte eine

Regulation des FasL durch proteolytische Prozessierung von Mitgliedern der A

Disintegrin and Metalloprotease- (ADAM)-Familie gezeigt werden. Hierbei wurde

durch den Einsatz synthetischer Inhibitoren ADAM10 als hauptverantwortliche

Protease identifiziert. Die Regulationsmechanismen von ADAM10, im Speziellen im

Kontext mit der Proteolyse des FasL, sind jedoch weitestgehend unbekannt und

auch die subzelluläre Lokalisation von ADAM10 in T-Zellen wurde bisher nicht

analysiert. Basierend auf den vorhergehenden Ergebnissen ergaben sich für die

vorliegende Arbeit folgende Ziele:

1) Eine Induktion der Proteolyse verschiedener Substrate von ADAM10 und

ADAM17 wird vorwiegend über den Einsatz von TPA (Aktivierung der

Proteinkinase C), sowie durch Verwendung des Kalziumionophors Ionomycin

(Kalziumeinstrom) erzielt. Auch bezüglich der induzierten Prozessierung des FasL

wird diese Kombination meist verwendet. Im Rahmen der Arbeit sollte detailliert

analysiert werden, welchen Einfluss die beiden unphysiologischen Stimuli einzeln

und in Kombination auf die Proteolyse des FasL nehmen.

2) Zur Feststellung der hauptverantwortlichen Protease bei der Proteolyse des

FasL sollten die Inhibitoren-basierenden Ergebnisse durch spezifische

Herunterregulation von ADAM10 und ADAM17 mittels transienter Transfektion mit

siRNAs und anschließender Induktion der Proteolyse verifiziert werden.

3) Die Expression des FasL ist auf wenige Zelltypen beschränkt und spielt vor

allem bei der Funktionalität von T-Zellen eine Rolle. Aus diesem Grund sollte

nachfolgend untersucht werden, welche Auswirkungen eine T-Zellrezeptor-

spezifische Stimulation über Verwendung von anti-CD3/CD28-Antikörpern auf die

proteolytische Prozessierung des FasL hat.

4) Während die subzelluläre Lokalisation des FasL bereits näher untersucht

wurde, gibt es über ADAM10 und ADAM17 in diesem Kontext nur wenig bekannte

Details. Zur näheren Untersuchung einer möglichen intrazellulären Kolokalisation von

Fragestellung

23

Substrat und Protease sollte die eventuelle Speicherung der Proteasen in

intrazellulären Vesikeln, den sogenannten sekretorischen Lysosomen, in denen auch

der FasL gespeichert wird, analysiert werden. Weiterhin sollte die

Oberflächenexpression und eine mögliche Kolokalisation des FasL und ADAM10 in

Lipidmikrodomänen auf der Zellmembran näher untersucht werden.

5) ADAM10 besitzt zwei intrazelluläre Prolin-reiche Regionen mit putativen SH3-

Bindungsmotiven. Mehrere potentiell interagierende Proteine mit SH3-Domänen

konnten bereits in Vorarbeiten identifiziert werden. Die Analyse von Protein-Protein-

Interaktionen von ADAM10 mit Proteinen mit SH3-Domänen sollte ausgeweitet

werden. Identifizierte Bindungspartner sollten verifiziert und eventuell ihr Einfluss auf

ADAM10 und die Proteolyse des FasL untersucht werden.

Material und Methoden

24

3. Material

3.1 Material für die Zellbiologie

3.1.1 Zellkultur

Für die Isolation mononukleärer Zellen des peripheren Blutes (peripheral blood

mononuclear cell, PBMC) wurden Leukozytenkonzentrate (Buffy-Coat-Präparate)

gesunder Spender verarbeitet, die vom Institut für Transfusionsmedizin, UK S-H

Campus Kiel bzw. Campus Lübeck, zur Verfügung gestellt wurden. Ein

entsprechendes Ethikvotum der Kommission der Medizinischen Fakultät der

Christian-Albrecht-Universität zu Kiel (D405/10) zur Verwendung der Blutproben

sowie die schriftlichen Einverständniserklärungen der Blutspender liegen vor. CD4-

positive T-Zellklone 12603/12632 wurden in der Arbeitsgruppe generiert und

beschrieben (Lettau et al., 2006), ebenso wie die mit hFasL stabil-transfizierte Jurkat-

Zelllinie JFL39.1 (Qian et al., 2006). Weiterhin wurde die Jurkat-Zelllinie JE6-1

(ATCC TIB 152), sowie die humane embryonale Nierenzelllinie 293T (ATCC CRL-

1573) für Experimente kultiviert. Für Restimulationen der T-Zellklone wurde die EBV-

transformierte B-Zelllinie EBV-W verwendet, die innerhalb des Instituts für

Immunologie generiert wurde.

3.1.2 Bakterien und Phagen

E. coli-Bakterien (Stamm DH5 bzw. BL-21, Invitrogen/Life Technologies, Carlsbad,

USA) wurden nach Standardprotokollen passagiert und zur Transfektion vorbereitet.

Der E. coli-Stamm TG1 wurde von Stratagene (La Jolla, CA, USA) bezogen. Für die

Identifizierung von interagierenden SH3-Domänen wurde eine kommerziell

erhältliche Phagenbibliothek verwendet (All SH3 Domain Phager®, Geneart AG,

Regensburg).


25

3.1.3 Medien und Puffer

3.1.3.1 Zellkulturmedien/Zusätze für die Zellkultur

Gibco® RPMI 1640 mit 25 mM HEPES und L-Glutamin Life Technologies, Karlsruhe

DMEM (Dulbecco’s Modified Eagles’s Medium) Biochrom AG, Berlin

Penicillin/Streptomycin (10000 U/10000 μg) Biochrom AG

FCS (fötales Kälberserum/fetal calf serum; 30 min inaktiviert bei 56 °C, sterilfiltriert (0,22 µm))

Life Technologies

L-Glutamin (200 mM) Biochrom AG

Zellkulturmedien wurden vor der Verwendung mit 1% (v/v) Antibiotika und 5-10% (v/v)

FCS versetzt. DMEM-Medium wurde zusätzlich mit 1% (v/v) L-Glutamin versetzt.

Einfriermedium wurde aus Zellkulturmedium mit 20% (v/v) FCS und 10% (v/v) DMSO

hergestellt und vor dem Einfrieren heruntergekühlt.

PBS (Phosphate-buffered saline)

Biochrom AG

Trypsin/EDTA (0,5%/0,2% (w/v)) Biochrom AG

Trypanblau-Lösung (0,1% Trypanblau in PBS) Sigma-Aldrich, München

Ficoll (1,077 g/ml) Biochrom AG

Proleukin® S (rekombinantes Interleukin-2, 10 U/ml ) Chiron, Marburg

Phytohämagglutinin (PHA, 0,5 µg/ml) Murex Biotech, Dartford, UK

3.1.3.2 Kalzium-Phosphat-Transfektion

HBS-Puffer (2x)

- 50 mM HEPES (2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-

ethansulfonsäure)

- 280 mM NaCl

- 1,5 mM Na2HPO4 x 2H2O

pH 7,17; sterilfiltriert (0,22 µm)

Merck

Carl Roth, Karlsruhe

Merck

Kalziumchlorid-Lösung

- 2,5 mM CaCl2

sterilfiltriert (0,22 µm)

Merck


26

3.1.3.3 Konfokale Mikroskopie

Poly-L-Lysin-Lösung

- 100 µg/ml Poly-L-Lysin in PBS

Sigma-Aldrich

PEM-Puffer (2x)

- 200 mM PIPES (Piperazin-N,N'-bis(2-ethansulfonsäure)

- 2 mM MgCl2

- 2 mM EGTA (bis-(Aminoethyl)glycolether- N,N,N´,N´-tetraessigsäure)); pH 6,95; sterilfiltriert (0,22 µm)

Carl Roth

Merck

Merck

Borat-Puffer (2x)

- 200 mM Natriumborat (Na2B4O7)

- 2 mM MgCl2

pH 11,0; sterilfiltriert (0,22 µm)

Merck

Merck

Fixierungspuffer

- 6% (w/v) Paraformaldehyd (PFA) in PBS, pH 7,0

Merck

Permeabilisierungspuffer

- 1% (v/v) Triton X-100 in PBS

Merck

Reduktionslösung

- 1 mg/ml NaBH4 in Wasser

Carl Roth

Blockierungspuffer

- 0,2 % (w/v) BSA

- 0,01 % (v/v) Triton X-100 in PBS

Serva, Heidelberg

Merck

Eindeckelmedium (Gold Prolong Antifade Reagent Mounting Medium mit DAPI)

Life Technologies

Der Fixierungspuffer wird vor der Fixierung der Proben mit gleichen Volumen PEM-

Puffer (2x) bzw. Borat-Puffer (2x) gemischt.

3.1.3.4 Durchflusszytometrie

FACS-Waschpuffer

- 1% (w/v) BSA in PBS, sterilfiltriert (0,22 µm)

Serva, Biochrom AG

Fixierungspuffer

- 1% (w/v) PFA in PBS

sterilfiltriert (0,22 µm)

Merck

Propidiumiodidlösung

- 4 µg/ml in PBS

Serva


27

3.1.3.5 Antikörper

Tabelle 3.1: Primärantikörper für Analysen humaner Zellen

Primärantikörper Klon Konzentration Applikation Hersteller

DZ KM

α-CD3 OKT3 1 mg/ml / / Cilag, Sulzbach

α-CD28 CD28.2 1 mg/ml / / BD Pharmingen, Heidelberg

α-ADAM10 AD214Y 0,2 mg/ml 1/20 / Santa Cruz, CA, USA

α -ADAM10-PE SHM14 50 µg/ml 1/10 1/10 Biolegend, London, UK

α-ADAM17 A300E 0,5 mg/ml 1/30 / AG Grötzinger, Biochemie, CAU

α-ADAM17-PE 111633 25 µg/ml pur / R&D Systems, Wiesbaden

α-FasL-PE Alf-2.1A 1 mg/ml 1:50 / Ancell, Bayport, MN, USA

Abkürzungen: DZ, Durchflusszytometrische Analyse; KM, Konfokale Mikroskopie; k.A., keine Angabe des Herstellers

Tabelle 3.2: verwendete Isotypkontrollen und Sekundärantikörper

Antikörper Klon Konzentration Applikation Hersteller

DZ KM

Isotypkontrollen

Maus-IgG1-PE X-40 50 µg/ml 1/2,5 1/10 1/10 BD Pharmingen

Maus-IgG1-PE k.A. k.A. 1/5 / Immunotools, Friesoythe

Maus-IgG1 MOPC-21 0,5 mg/ml 1/30 / Abcam, Cambridge, UK

Maus-IgG2a MOPC-173 0,5 mg/ml 1/100 / Abcam

Maus-IgG2b k.A. k.A. 1/100 / Immunotools

Sekundärantikörper

Ziege--Maus-PE k.A. k.A. 1/60 / Immunotools

Kaninchen--Maus (RaM)

k.A. 1,8 mg/ml / / Dianova, Hamburg

Abkürzungen: DZ, Durchflusszytometrische Analyse; KM, Konfokale Mikroskopie; k.A., keine Angabe des Herstellers


28

3.1.4 Weitere Reagenzien und Inhibitoren (Angabe der Einsatzkonzentration)

Tetradecanoylphorbolacetat (TPA, 10 ng/ml) Sigma-Aldrich

Ionomycin (500 ng/ml) Life Technologies

Methyl-β -Cyclodextrin (MβCD, 5-10 mM) Sigma-Aldrich

PP1 (Src-Kinase-Inhibitor, 10 µM) Sigma-Aldrich

2-Brompalmitat (2BP, 100 µM) Sigma-Aldrich

2-Hydroxymyristylsäure (2HMA, 100 µM) Santa Cruz

3.1.5 Verwendete Kits für die Zellbiologie

Human T Cell Nucleofector Kit Lonza Group AG, Basel

3.2 Material für molekularbiologische Experimente

3.2.1 Vektoren und Konstrukte

Tabelle 3.3: verwendete Vektoren und Konstrukte

Insert Vektor Bezugsquelle

- pGEX-2T GE Healthcare, UK

- pGEX-4T3 GE Healthcare, UK

- pcDNA3.1/myc-HisA Life Technologies

- pEGFP-C1 Life Technologies

hPACSIN1 pcDNA3.1/myc-HisA e.H.



hSNX9 peak12linker S.F. Lichtenthaler, München

hSNX18 peak12linker S.F. Lichtenthaler

hSNX33 peak12linker S.F. Lichtenthaler

hEndophilin-A2/EEN pCMV4/TO Origene Technologies, Rockville, MD, USA

Abkürzung: e.H., eigene Herstellung (Labor AG Janssen)


29

3.2.2 Primer

Tabelle 3.4: verwendete Primer

Name Sequenz

GAPDH 5‘ GACCCCTTCATTGACCTC

GAPDH 3‘ CCAAAGTTGTCATGGATG

pGEX-2T 5‘ CTGGCAAGCCACGTTTGG

pGEX-2T 3‘ GGGAGCTGCATGTGTCAG

EEN-SH3 5‘ TGGGATCCCTGGACCAGCCGAGCTGC

EEN-SH3 3‘ TGGGATTCGGGCACAAGCACCTCCAC

J-55 CCTATTGCCTACGGCAGCC

H-301 CGTTTTCGCCGGAAACTGAGGGAC

Alle verwendeten Primer wurden über MWG Eurofins Genomics, Ebersberg, bezogen.

3.2.3 siRNAs

Tabelle 3.5: verwendete siRNAs für transiente Transfektionen

siRNA ID Bezugsquelle

ADAM10_1 HSS100167 Invitrogen/Life Technologies






SPPL2a_1 HSS131389 Invitrogen/Life Technologies



Scramble-Negativkontrolle_low 12935-200 Ambion/Life Technologies

Scramble-Negativkontrolle_med 12935-300 Ambion/Life Technologies

GAPDH-Positivkontrolle 12935-140 Ambion/Life Technologies

3.2.4 Enzyme für die Molekularbiologie

EcoRI

BamHI

NEB, Ipswich, USA

NEB

DreamTaq-DNA-Polymerase Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA

Pfu-DNA-Polymerase Thermo Fisher Scientific

T4-DNA-Ligase NEB


30

3.2.5 Agarose-Gelelektrophorese

Tris-Acetat-EDTA-Puffer (TAE, 50x)

- 242 g/l Tris (Tris-hydroxymethyl-Aminomethan)

- 55 g Borsäure

- 40 ml 0,5 M EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure)

auf 1 L mit ddH20

Merck

Carl Roth

Merck

Braun, Melsungen

Agarosegele

- UltraPure® Agarose

- 1x TAE-Puffer

- 0,5 mg/ml Ethidiumbromid

Life Technologies

s.o.

Merck

Probenpuffer für Agarosegele (10x) Life Technologies

Molekulargewichtsstandards

- 100 bp DNA Ladder

- 1 kb DNA Ladder

Life Technologies

Life Technologies

3.2.6 Puffer und weitere Reagenzien

LB-Medium

- 10 g/l Pepton

- 5 g/l Hefeextrakt

- 10 g/l NaCl

autoklavieren

- 50 µg/ml Ampicillin/Kanamycin

Carl Roth

Carl Roth

Carl Roth

Merck/Serva

LB-Agarplatten

- 15 g/l Agar-Agar in 1 l LB-Medium

autoklaviert, je 15-25 ml in sterile Platten gegossen

Serva

Circle-Grow-Medium

- 40 g/l Circle-Grow-Pulver, autoklaviert

Bio101 Inc., Carlsbad,

CA, USA

dNTPs Thermo Fisher Scientific

3.2.7 Material für das Screening interagierender SH3-Domänen

All SH3 Domain Phager® Geneart AG, Regensburg

Dynabeads® M-270 Epoxy Invitrogen


31

Natriumphosphatpuffer

- 2,62 g/l NaH2PO4 x H2O

- 14,42 g/l Na2HPO4 x 2H2O

auf pH 7,4 einstellen

Merck

Merck

Ammoniumsulfatlösung

- 39,6 g Ammoniumsulfat in 100 ml Natriumphosphatpuffer

Merck

Waschpuffer

- 0,5% Tween-20 in PBS

Merck

Blockierungspuffer

- 5% BSA (w/v) in Waschpuffer

Serva

Elutionspuffer

- 200 mM Glycin

auf pH 2,2 einstellen

Carl Roth

1 M Tris-Puffer, pH 9,0 Merck

SOBAG-Platten

- 20 g/l Pepton

- 5 g/l Hefeextrakt

- 0,5 g/l NaCl

- 15 g/l Agar-Agar

autoklavieren

- 2,5 mM MgCl2 (Stock: 1 M)

- 100 mM D-Glucose (Stock: 1 M)

- 100 µg/ml Ampicillin

je 25 ml in Platten gegossen

Carl Roth

Carl Roth

Merck

Serva

Merck

Merck

Merck

3.2.8 Kits für die Molekularbiologie

BigDye® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit Life Technologies

DyeEx® 2.0 Spin Kit Qiagen, Hilden

RNeasy® Mini Kit Qiagen

QIAquick® Gel Extraction Kit Qiagen

QIAquick® PCR Purification Kit Qiagen

QIAprep® Spin Miniprep Kit Qiagen

QIAGEN® Plasmid Maxi Kit Qiagen

First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo Fisher Scientific

Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) Thermo Fisher Scientific


32

3.3 Material für biochemische Analysen

3.3.1 Puffer und Reagenzien

3.3.1.1 Aufreinigung von GST-Fusionsproteinen

Glutathion SepharoseTM 4B-Beads GE Healthcare, Freiburg

Isopropyl-1-thio-Galactopyranosid (IPTG, 0,1 M) Merck

Lysepuffer

- 1% (v/v) Triton X-100 in PBS

Merck

Elutionspuffer

- 10 mM Glutathion reduziert

- 50 mM Tris-Puffer pH 8,0

Sigma-Aldrich

Merck

3.3.1.2 Lysieren von Zellen

Lysepuffer

- 1% (v/v) Nonidet® P40 (NP-40)

- 20 mM Tris-Puffer, pH 7,4

- 0,15 M NaCl

(- 5 mM EDTA)

Sigma-Aldrich

Merck

Carl Roth

Merck

Inhibitoren

- 2 µg/ml Aprotinin

- 2 µg/ml Leupeptin

- 1 mM AEBSF

- 2 µg/ml Pepstatin A

- 1 mM Natriumorthovanadat

- 10 mM Natriumfluorid

- 1 mM Natriumpyrophosphat

Sigma-Aldrich

Sigma-Aldrich

Sigma-Aldrich

Biochrom AG

Merck

Sigma-Aldrich

Sigma-Aldrich

3.3.1.3 Proteinbestimmung

Coomassie-Protein-Assay-Reagenz Thermo Fisher Scientific

3.3.1.4 Pull-Down/Immunpräzipitation

Protein-G-SepharoseTM 4B-Beads GE Healthcare

Glutathion-SepharoseTM 4B-Beads GE Healthcare


33

3.3.1.5 SDS-PAGE: Protean II-System (Bio-Rad)

Laufgel (30 ml pro Gel, 10%)

- 10 ml 30% Acrylamid/0,8% Bisacrylamid

- 11,2 ml 1 M Tris-Puffer, pH 8,8

- 300 µl SDS (10% in ddH20)

- 8,7 ml ddH20

- 100 µl 20% Ammoniumperoxodisulfat (APS)

- 20 µl N, N, N’, N’-Tetramethylendiamin (TEMED)

Carl Roth

Merck

Merck

Braun

Merck

GE Healthcare

Sammelgel (10 ml pro Gel)

- 1,67 ml 30% Acrylamid/0,8% Bisacrylamid

- 1,25 ml 1 M Tris-Puffer, pH 6,8

- 100 µl SDS (10% in ddH20)

- 7,03 ml ddH20

- 50 µl 20% APS

- 10 µl TEMED

Carl Roth

Merck

Merck

Braun

Merck

GE Healthcare

Elektrophoresepuffer (10 x)

- 250 mM Tris

- 1,92 M Glycin

- 0,1% SDS

Vor Gebrauch wurden 500 ml mit 4,5 l ddH20 gemischt.

Merck

Merck

Serva

Probenpuffer

- 6% (w/v) SDS

- 30% (v/v) Glycerin

- 200 mM Tris, pH 6,8

- 0,005% Bromphenolblau

- 2-5% -Mercaptoethanol

Serva

Carl Roth

Merck

Merck

Merck

Protein-Molekulargewichtsstandards

- Low Range-Standard

- Precision Plus Protein All Blue-Standard

Bio-Rad, München

Bio-Rad

3.3.1.6 SDS-PAGE: NuPAGE®-System (Invitrogen)

NuPAGE® MES 20x SDS-Laufpuffer (1:20 mit ddH20) Life Technologies

NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Proteingele Life Technologies


34

3.3.1.7 Coomassie-Färbung von Proteinen in SDS-Polyacrylamidgelen

Coomassie-Färbelösung

- 410 ml Methanol

- 70 ml Essigsäure (100%ig)

- 0,125 g Coomassie Brilliant Blue G250

- 510 ml ddH20

Carl Roth

Carl Roth

Bio-Rad

Braun

Coomassie-Entfärbelösung

- 410 ml Methanol

- 70 ml Essigsäure (100%ig)

- 510 ml ddH20

Carl Roth

Carl Roth

Braun

3.3.1.8 Western Blot

Transferpuffer

- 25 mM Tris

- 192 mM Glycin

- 20% Methanol

- 0,015% (v/v) SDS

Merck

Merck

Carl Roth

Merck

Protein-Färbelösung

- Ponceau-S

- 5% Essigsäure (100%ig)

Carl Roth

Carl Roth

Waschpuffer (TBS)

- 10 mM Tris

- 0,15 M NaCl

pH 7,5-8,0

Merck

Carl Roth

Waschpuffer (TBS-T)

- 10 mM Tris

- 0,15 M NaCl

- 0,05% Tween-20

Merck

Carl Roth

Merck

Blockierungslösung

- 100 mM Tris pH 7,5

- 2,2% (w/v) NaCl

- 5% (w/v) BSA

- 0,01% (w/v) Natriumazid

Merck

Carl Roth

Serva

Braun


35

Strippinglösung

- 62,5 mM Tris pH 6,8

- 2% (v/v) -Mercaptoethanol

- 6,9% (w/v) SDS

Merck

Merck

Serva

ECL-Detektionsreagenz GE Healthcare

3.3.2 GST-Fusionsproteine

Tabelle 3.6: verwendete GST-Fusionsproteine

Fusionsprotein Konzentration Applikation Bezugsquelle

GST-ADAM10cyt(697-748) 1 mg/ml 10-25 µg e.H.

GST-ADAM17cyt(694-824) 1 mg/ml 10-25 µg e.H.

GST 1 mg/ml 10-25 µg e.H.

GST-Abl-SH2 1 mg/ml 10-25 µg e.H.

GST-Abl-SH3 1 mg/ml 10-25 µg e.H.

GST-Fyn-SH2 0,45 mg/ml 10-25 µg e.H.

GST-Fyn-SH3 1 mg/ml 10-25 µg e.H.

GST-Fyn-SH2-SH3 1 mg/ml 10-25 µg e.H.

GST-Hck-SH 1 mg/ml 10-25 µg e.H.

GST-Hck-SH3 1 mg/ml 10-25 µg e.H.

GST-Src-SH2 0,44 mg/ml 10-25 µg e.H.

GST-Src-SH3 1,7 mg/ml 10-25 µg e.H.

GST-Yes-SH3 0,8 mg/ml 10-25 µg e.H.

GST-Lck-SH2 1 mg/ml 10-25 µg e.H.

GST-Lck-SH3 1 mg/ml 10-25 µg e.H.

GST-Lck-SH2-SH3 1 mg/ml 10-25 µg e.H.

GST-Grb2-SH2 1 mg/ml 10-25 µg e.H.

GST-Grb2-SH3C 1 mg/ml 10-25 µg e.H.

GST-Grb2-SH3N 1 mg/ml 10-25 µg e.H.

GST-Grap-SH3C 1 mg/ml 10-25 µg e.H.

GST-Grap-SH3N 1 mg/ml 10-25 µg e.H.

GST-Grap2-SH3C 0,9 mg/ml 10-25 µg e.H.

GST-Grap2-SH3N 1 mg/ml 10-25 µg e.H.

GST-PACSIN1-SH3 1 mg/ml 10-25 µg e.H.



GST-EEN-SH3 1 mg/ml 10-25 µg e.H.

Abkürzung: e.H., eigene Herstellung (Labor AG Janssen)


36

3.3.3 Antikörper

Tabelle 3.7: Antikörper für biochemische Analysen

Antikörper Klon/Nr. Konzentration Applikation Bezugsquelle

WB IP

Primärantikörper

Α-ADAM10 11G2 1 mg/ml 1:2000 1-2 µg/ml Hölzel Diagnostika, Köln

α-ADAM10 Tier 1 1 mg/ml 1:500 / Prof. Saftig, CAU Kiel

α-ADAM17 A318 0,5 mg/ml 1:500 / Prof. Grötzinger, CAU Kiel

α-ADAM17 H300 0,2 mg/ml 1:500 / Santa Cruz

α-BiP/Grp78 40 0,25 mg/ml 1:250 / BD Biosciences

α-COXIV 10G8D12C12

1 mg/ml 1:1000 / Abcam/ MitoSciences

α-Endophilin-A2 2F5 1 mg/ml 1:2000 1 µg/ml Abcam

α-FasL N20 0,2 mg/ml 1:500 / Santa Cruz

α-FasL FcII 1 mg/ml 1:1000 2 µg e.H.

α-GAPDH 6C5 2 mg/ml 1:2000 / Abcam

α-Granulysin AF3138 0,2 mg/ml 1:1000 / R&D Systems

α-Granzym B 2C5/F5 0,5 mg/ml 1:2500 / BD Biosciences

α-Grb2 C-23 0,2 mg/ml 1:500 / Santa Cruz

α-HA 3F10 0,1 mg/ml 1:500 1-2 µg/ml Roche, Grenzach-Whylen

α-Katalase ab1877 10 mg/ml 1:1000 / Abcam

α-LAMP-1 25 0,25 mg/ml 1:500 / BD Biosciences

α-LAT 9166 k.A. 1:1000 / Cell Signaling, Danvers, USA

α-Lck 4/129 1 mg/ml 1:1000 1-2 µg/ml e.H.

α-Lck 4/215 1 mg/ml 1:1000 1-2 µg/ml e.H.

α-myc 46-0603 1,2 mg/ml 1:5000 / Life Technologies

α-pTyr 4G10 1 mg/ml 1:5000 e.H.

Sekundärantikörper

α-Maus-IgG-HRP NA9310 k.A. 1:7500 / GE Healthcare

α-Kaninchen-IgG-HRP

NA9340 k.A. 1:5000 / GE Healthcare

α-Ratte-IgG-HRP NA935 k.A. 1:5000 / GE Healthcare

Abkürzungen: WB, Western Blot; IP, Immunpräzipitation; HRP, Meerrettich-Peroxidase; CAU, Christian-Albrechts-Universität zu Kiel; e.H., eigene Herstellung (Labor AG Janssen)


37

3.3.4 Kits für die Biochemie

Lysosome Isolation Kit Sigma-Aldrich

Human Fas Ligand DuoSet R&D Systems

3.4 Weitere Materialien

Amicon® Ultra Konzentrator 10000 MWCO

Amicon® Ultra Konzentrator 30000 MWCO

Bakterienimpfösen/-nadeln

Branson Sonifier 450

Deckgläser (18 mm)

Einfrierröhrchen CryoTubeTM

FACS-Röhrchen

Filterpapier

Filterpapier Whatman 3MM

HyperfilmTM ECL-Chemilumineszenz-Film

Kolibrispitzen

Microlance® Kanülen

Nitrozellulosemembran Optitran® 0,2 µm

Nitrozellulosemembran Optitran® 0,45 µm

NuPAGETM 4-12% Bis-Tris (10 Well, 1,5 mm)

NuPAGETM 4-12% Bis-Tris (15 Well, 1,5 mm)

Objektträger

Parafilm®

Pasteurpipetten ungestopft

PCR-Reaktionsgefäße

Pipettenspitzen

Reaktionsgefäße (0,5 ml; 1,5 ml; 2 ml)

Serologische Pipetten

Skalpell

Spektrometerküvetten

Spitzbodenplatte (96 Vertiefungen)

Spritzenvorsatzfilter 0,2 µm

Spritzenvorsatzfilter 0,45 µm

Sterilvakuumfilter 0,2 µm

Ultra-ClearTM-Zentrifugenröhrchen, 11-60 mm

Ultra-ClearTM-Zentrifugenröhrchen, 16-102 mm

Zellkulturflaschen (50, 250, 650 ml)

Zellkulturplatten (6, 12, 24, 96 Vertiefungen)

Zentrifugenröhrchen (15 und 50 ml)

Millipore, Darmstadt

Millipore

Greiner, Frickenhausen

Hielscher Ultrasonics, Teltow

Carl Roth

Nunc, DK

Greiner

Whatman, UK

Whatman

GE Healthcare

Kisker Biotech GmbH, Steinfurt

Becton Dickinson

GE Healthcare

GE Healthcare

Life Technologies

Life Technologies

Carl Roth

Pechiney Plastic Packaging, USA

Hecht, Sondheim

Sarstedt

Sarstedt

Sarstedt

Greiner

Feather, Osaka, Japan

Sarstedt

Nerbe plus, Winsen/Luhe

Whatman/GE Healthcare

Whatman/GE Healthcare

Millipore, Eschborn

Beckman Coulter, Krefeld

Beckman Coulter

Greiner

Nunc

Sarstedt, Nürnberg


38

3.5 Geräte

Absaugvorrichtung Filter Mate Harvester

Pipettierhilfe Accu-Jet pro

Pipettierhilfe pipetus® akku

Dokumentationsanlage Gel Imager

Agarose-Gel-Kammer Mini-Sub® Cell GT

Agarose-Gel-Kammer Wide Mini-Sub® Cell GT

CO2- Begasungsbrutschrank

DNA/RNA-Photometer Nanodrop ND-1000

Dounce-Homogenisatoren (7 und 14 ml)

Durchflußzytometer FACS Calibur

Ein- und Zwölfkanalpipetten

Elektrophoresekammer Protean® II

Entwicklungskassetten HypercassetteTM

Filmentwicklermaschine CP1000

Feinwaage A120S

Fluoreszenzmikroskop Axiovert 100

Gelelektrophorese-Kammer X Cell SureLockTM

Geltrockner

Genetic Analyser 3130

Heizblock HB-2

Heizblock Thermostat (DB2A und DB3A)

Kühl-/Gefrierkombination

Kühlzentrifuge Biofuge 15R

Magnetrührer RET basic

Laser-Scanning-Mikroskop LSM 510 Meta

Lichtmikroskop Axioskop

Lichtmikroskop Axiovert 10

Mikroplatten- Photometer 'InfiniteTM M200'

Mikrowelle

Netzgerät Power Pack 200/300

Netzgerät Power Supply 250-2

Neubauer-Zählkammer

Nukleofektionsgerät NucleofectorTM II

PCR-Maschine T Gradient

pH-Meter wtw pH 315i

Reagenzglasschüttler Vortex-Genie 2

Rollen-Mischgerät 'Assistent' RM-5

Rotator 'Rotamix'

Perkin Elmer, Dreieich

Brand, Wertheim

Hirschmann, Eberstadt

Intas, Göttingen

Bio-Rad

Bio-Rad

Forma Scientific, USA

Nanodrop Technologies, USA

Braun

BD Biosciences

Eppendorf, Hamburg

Bio-Rad

Amersham

Agfa Deutschland, Köln

Sartorius

Zeiss, Jena

Invitrogen/Life Technologies

Bio-Rad

Applied Biosystems

Wealtec, USA

Techne, Wertheim

Liebherr, Ochsenhausen

Heraeus

IKA Labortechnik, Staufen

Zeiss

Zeiss

Zeiss

Tecan, Crailsheim

Bosch, Stuttgart

Bio-Rad

Sigma Techware, München

Fischer, Frankfurt a.M.

Amaxa, Köln

Biometra, Göttingen

Hanna Instruments, Kehl a.R.

Scientific Industries, USA

Hecht, Sondheim

Heto-Holten, Wettenberg


39

Schüttelinkubator

Schütteltisch

Schüttelwasserbad

Spektrometer SmartSpecTM3000

Sterilbank 'Lamin air®'

Tischzentrifugen 5415C, 5417C, 5417R

Ultrazentrifuge XL-80

Western Blot Transfer-Tank Trans-Blot®

Western Blot Transfer-Tank Mini Trans-Blot®

Wipptisch „Rocky“

Zentrifuge AvantiTM J-25l

Zentrifuge Biofuge 15R

Zentrifuge Megafuge 1.0

Zentrifuge Varifuge 3.0R

Zentrifuge Labofuge GL

GFL, Burgwedel

IKA Labortechnik

GFL

Bio-Rad

Heraeus

Eppendorf

Beckman Coulter

Bio-Rad

Bio-Rad

Fröbel Labortechnik, Lindau

Beckman Coulter, Krefeld

Heraeus

Heraeus

Heraeus

Heraeus


40

4. Methoden

4.1 Zellbiologische Methoden

4.1.1 Zellkultur

Alle genannten Zelllinien wurden bei 37 °C in einer wasserdampfgesättigten

Atmosphäre mit 5% (v/v) CO2 kultiviert. PBMCs wurden mittels Ficoll-Hypaque-

Dichtegradientenzentrifugation isoliert und durch Zugabe des Lektins

Phytohämagglutinin (PHA, 0,5 µg/ml) polyklonal aktiviert. Drei bis vier Tage später

wurden tote Zellen durch erneute Dichtegradientenzentrifugation entfernt und die

generierten PHA-Blasten in Kulturmedium mit rIL-2 (10 U/ml) zur weiteren Expansion

kultiviert. CD4-positive T-Zellklone (12603/12632) wurden durch regelmäßige

Aktivierung mit radioaktiv-bestrahlten PBMCs und EBV-W-Zellen, sowie Zugabe von

rIL-2 (10 U/ml) und PHA (0,5 µg/ml) vermehrt. Suspensionszellen (PHA-Blasten,

CD4+-T-Zellklone 12603/12632, JE6-1, JFL39.1, EBV-W) wurden in RPMI-1640-

Zellkulturmedium mit 25 mM HEPES, 1% (v/v) Penicillin/Streptomycin (10×103 U und

10×103 µg/ml) und 5-10% (v/v) hitzeinaktiviertem FCS kultiviert. Die adhärente

Zelllinie HEK 293T wurde in DMEM-Zellkulturmedium mit 10% (v/v) FCS, 1% (v/v)

Penicillin/Streptomycin und 1% (v/v) L-Glutamin kultiviert. Zur Passage wurden die

Zellen mit Trypsin/EDTA-Lösung (0,5%/0,2% (w/v)) für 10 Minuten bei 37 °C

abgelöst, anschließend mit Medium gewaschen, geteilt und weiter kultiviert.

4.1.2 Bestimmung der Zellzahl und Zellvitalität

Die Bestimmung der Zellzahl erfolgte nach Verdünnung der Zellsuspension mit

Trypanblau-Lösung mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer. Tote Zellen werden

hierbei selektiv angefärbt, wodurch gleichzeitig eine Beurteilung der Zellvitalität

ermöglicht wird.

4.1.3 Kryokonservierung von Zellen

Für eine längerfristige Lagerung von Zellen wurden diese in flüssigem Stickstoff

konserviert. Hierbei erfolgte der Versatz von Kulturmedium mit DMSO zur

Vermeidung von Kristallbildung innerhalb der Zellen. Adhärente Zellen wurden mit

einer Dichte von 5x106 Zellen, Suspensionszellen mit einer Dichte von 20-30x106

Zellen pro ml kaltem Einfriermedium (4 °C) resuspendiert und in Kryoröhrchen

überführt. Die Zellen wurden nun vorerst bei -80 °C gelagert, bevor sie in flüssigen


41

Stickstoff (-196 °C) gelagert wurden. Zum Auftauen der Zellen wurden diese

tropfenweise zu vorgelegtem Zellkulturmedium gegeben, zweimal mit Kulturmedium

gewaschen (1400 rpm, 5 min) und die Zellen nach Bestimmung der Zellzahl und

Zellvitalität in Kulturmedium bei 37 °C kultiviert.

4.1.4 Transfektion von Zellen

4.1.4.1 Kalzium-Phosphat-Transfektion

Adhärente HEK 293T-Zellen können mittels Kalzium-Phosphat-Transfektion transient

transfiziert werden. Hierfür wurden 4x106 Zellen in 40 ml DMEM-Medium ausgesät.

Einen Tag später wurden 10-20 µg DNA mit sterilem Wasser auf ein Volumen von

1,8 ml eingestellt und mit 200 µl Kalziumchloridlösung (2,5 M) versetzt. Die Lösung

wurde anschließend unter leichtem Schütteln (800 rpm) zu 2 ml HBS-Lösung (2x)

gegeben. Nach 15 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur erfolgte tropfenweise die

Zugabe des Gemischs zu den Zellen. Nach 18 Stunden bei 37 °C wurde die

Transfektionseffizienz überprüft, die Zellen lysiert und mittels Western Blot analysiert.

4.1.4.2 Nukleofektion

Für die Transfektion von siRNA wurden je Ansatz 5x106 PHA-Blasten (Tag 9-11)

verwendet. Die Zellen wurden in 100 µl Nukleofektionslösung (Human T Cell

Nucleofector® Kit) resuspendiert, zusammen mit 30 nM siRNA in eine

Nukleofektionsküvette überführt und mit dem Programm X-001 im NucleofectorTM II

elektroporiert. Nach Zugabe von 500 µl warmem Zellkulturmedium wurden die Zellen

gut resuspendiert und zu 1,4 ml vorgewärmtem Zellkulturmedium mit 10 U/ml rIL-2 in

12-Loch-Platten gegeben. Nach 72 Stunden bei 37 °C wurden die Zellen gezählt und

analysiert.

4.1.5 Immunfluoreszenzanalysen

4.1.5.1 Konfokale Mikroskopie

Vorbereitung der Deckgläser

Zur Vorbereitung für die Zellkultur wurden die Deckgläser 15 Minuten in

konzentrierter Salzsäure inkubiert, zweimal mit Wasser und einmal mit 70%igem

Ethanol gewaschen und anschließend über Nacht bei 180 °C getrocknet und

sterilisiert. Für die Immunfluoreszenzanalyse von Suspensionszellen wurden die


42

Deckgläser in eine sterile 12-Loch-Platte überführt, zweimal mit sterilem PBS

gewaschen und für 30 Minuten mit Poly-L-Lysin (100 µg/ml in PBS) bei 37 °C

beschichtet. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden 1-2x106 Zellen auf die

vorbereiteten Deckgläser überführt und 10 Minuten auf Eis inkubiert. Durch

vorsichtiges Abnehmen des Kulturmediums wurden nicht-adhärente Zellen entfernt.

Die Fixierung haftender Zellen erfolgte durch Zugabe von 3% PFA in PEM-Puffer

über 5 Minuten und anschließender Inkubation mit 3% PFA in Borat-Puffer über

10 Minuten. Für Analysen intrazellulärer Proteine wurden die Zellen durch Zugabe

von 1% Triton X-100 in PBS für 15 Minuten permeabilisiert. Anschließend wurden die

Zellen dreimal mit PBS gewaschen und dann zur Reduktion freier Aldehydgruppen,

was eine Reduktion der Hintergrundfärbungen bewirkt, zweimal für 10 Minuten mit

Natriumborhydrid (1 mg/ml in Wasser) inkubiert. Nach erneutem dreimaligem

Waschen mit PBS erfolgte die Blockierung unspezifischer Bindungsstellen mit

1% BSA in PBS für eine Stunde. Die Antikörper wurden in 60 µl Blockierungslösung

entsprechend verdünnt und auf Parafilm gegeben. Anschließend wurden die Zellen

auf die vorgelegten Primärantikörper gegeben und über Nacht bei 4 °C gefärbt. Nach

zweimaligem Waschen mit PBS wurden mit direkt konjugierten Antikörpern gefärbte

Proben einmal mit destilliertem Wasser gewaschen und auf Objektträger mit 14 µl

Eindeckelmedium gebracht. Hierdurch wurden die Zellkerne mit DAPI sichtbar

gemacht und die Deckgläser fixiert. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur erfolgte

die Lagerung der Proben bei 4 °C bis zur konfokalen Analyse mit dem LSM 510 (Carl

Zeiss, Jena). Die Auswertung erfolgte mittels LSM Image Explorer Software.

4.1.5.2 Durchflusszytometrie

4.1.5.2.1 Detektion von Zelloberflächenmolekülen

Durchflusszytometrische Analysen zur Detektion von Proteinen basieren auf der

Verwendung fluoreszenzmarkierter Antikörper, die Antigene auf der Zelloberfläche

selektiv färben oder nach Permeabilisierung der Zellen auch intrazelluläre Antigene

detektieren können. In dieser Arbeit wurden lediglich Oberflächenfärbungen

durchgeführt. Hierbei wurden 2-4x105 unbehandelte oder stimulierte Zellen in

einzelne Kavitäten einer 96-Loch-Spitzbodenplatte überführt, pelletiert und einmal mit

100 µl kaltem FACS-Waschpuffer (FWP) gewaschen (1000 rpm, 2 min, 4 °C). Der

Primärantikörper bzw. die entsprechende Isotypkontrolle wurde in FWP verdünnt. Die

Zellpellets wurden in 10 µl der Antikörperlösung resuspendiert und lichtgeschützt 20-


43

45 Minuten bei 4 °C inkubiert. Bei Verwendung direkt konjugierter Primärantikörper

wurden die Zellen anschließend zweimal mit FWP gewaschen, in 100 µl 1% PFA in

PBS resuspendiert und in FACS-Röhrchen überführt. Bei Färbungen mit

unkonjugierten Primärantikörpern wurden die Zellen zweimal mit FWP gewaschen

und für 20 Minuten mit einem geeigneten Sekundärantikörper bei 4 °C im Dunkeln

inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit FWP wurden die Zellen in 100 µl 1%igem

PFA in PBS aufgenommen und in FACS-Röhrchen überführt. Bis zur Analyse am

Durchflusszytometer (FACSCalibur, BD Biosciences, Heidelberg) wurden die Proben

bei 4 °C lichtgeschützt gelagert. Die Auswertung erfolgte mit dem Programm

CellQuestPro (BD Biosciences).

4.1.5.2.2 Zelltodanalyse mittels Propidiumiodidfärbung

Propidiumiodid (PI) durchdringt die Zellmembran toter Zellen und interkaliert in die

DNA. Diese Eigenschaft wird bei der durchflusszytometrischen Bestimmung des

Anteils toter Zellen genutzt. Die Zellen wurden vor der Färbung einmal mit kaltem

PBS gewaschen (1000 rpm, 2 min, 4 °C), das Zellpellet anschließend in 100 µl PI-

Lösung (2 µg/ml) resuspendiert und in FACS-Röhrchen überführt. Die Messung

wurde direkt im Anschluss an einem FACSCalibur (BD Biosciences) durchgeführt.

Der Wert PI-negativer, lebender Zellen wurde von 100% subtrahiert, um den Anteil

toter Zellen zu erhalten.

4.1.6 Stimulation von Zellen

Zur Stimulation von PHA-Blasten und CD4+-T-Zellen mit Phorbolester (12-O-

tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA), und dem Kalziumionophor Ionomycin

wurden die Zellen in Kulturmedium mit rIL-2 und einer finalen Konzentration von

10 ng/ml TPA und 500 ng/ml Ionomycin inkubiert. Für eine Aktivierung des T-

Zellrezeptors in Suspension wurden PHA-Blasten, CD4+-T-Zellen und JFL-Zellen mit

10 µg/ml des monoklonalen Antikörpers gegen CD3 (OKT3) und dem

kreuzvernetzenden Kaninchen-anti-Maus-Antikörper (RaM, 1,2 µg/ml) inkubiert. Die

Zellen wurden in der Antikörpersuspension resuspendiert und 3 Minuten bei 37 °C

inkubiert. Anschließend wurden sie einmal mit PBS gewaschen und lysiert. Für

plattengebundene T-Zellrezeptorstimulation wurden 96-Loch-Platten mit 50 µl bzw.

24-Loch-Platten mit 250 µl PBS mit anti-CD3 (2 µg/ml) und anti-CD28 (5 µg/ml)

3 Stunden bei 37 °C inkubiert, zweimal mit PBS gewaschen und bis zur Stimulation,


44

aber nicht länger als über Nacht, bei 4 °C gelagert. Die Zellen wurden in einer

definierten Zellzahl in Zellkulturmedium auf die Kavitäten gegeben. Nach Ablauf der

Stimulation wurden die Überstände bei -20 °C eingefroren und die Zellen lysiert bzw.

für die Durchflusszytometrie vorbereitet.

Teilweise wurden vor der Stimulation von Zellen verschiedene Inhibitoren eingesetzt.

Für die Inhibierung von Src-Kinasen wurde der Inhibitor PP1 mit einer Konzentration

von 10 µM eingesetzt. Cholesteroldepletion erfolgte unter Einsatz von 5-10 mM

Methyl--Cyclodextrin (MbCD). Inhibierung von Palmitoylierungen wurde durch

100 µM 2-Brompalmitat (2BP) erreicht. Für die Inhibierung von Myristoylierungen

wurden 100 µM 2-Hydroxymyristylsäure (2HMA) eingesetzt. Die Zugabe der

Inhibitoren erfolgte direkt ins Zellkulturmedium vor der Stimulation mit den

Antikörpern. Für MbCD geschah dies 30 Minuten, für PP1 1 Stunde und für 2BP bzw.

2HMA 2 Stunden vor der Stimulation mit anschließender Inkubation bei 37 °C.

4.2 Molekularbiologische Methoden

4.2.1 RNA-Isolierung

Die Isolation von RNA aus T-Zellen wurde mit dem RNeasy® Miniprep Kit nach

Herstellerprotokoll durchgeführt. 2x106 Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen,

pelletiert und anschließend in 350 µl RLT-Puffer mit 3,5 µl -Mercaptoethanol

resuspendiert. Lyse der Zellen erfolgte durch Einfrieren der Probe bei -80 °C. Nach

Zugabe von 350 µl 70%igem Ethanol wurde das Lysat auf eine Filtersäule gegeben

und zentrifugiert (10000 rpm, 15 sek). Nach einem Waschschritt mit 700 µl RW1-

Waschpuffer und zwei weiteren Waschschritten mit je 500 µl RPE-Puffer wurde die

RNA mit RNase-freiem Wasser aus der Säulenmatrix gelöst und der RNA-Gehalt

bestimmt (Nanodrop). Die RNA wurde bei -80 °C gelagert.

4.2.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

4.2.2.1 RT-PCR

Die Herstellung von cDNA aus RNA erfolgte mit dem First Strand cDNA Synthesis

Kit. Hierfür wurde 1 µg RNA mit 1 µl Random Hexamer Primer und RNase-freiem

Wasser auf ein Volumen von 12 µl gebracht und 5 Minuten bei 65 °C inkubiert.


45

Anschließend erfolgte die Zugabe von 4 µl 5x Reaction Buffer, 2 µl dNTP Mix

(10 mM), 1 µl RiboLock RNase Inhibitor (20 U/µl) und 2 µl M-MuLV Reverse

Transcriptase (20 U/µl). Die Proben wurden nun im PCR-Gerät inkubiert (5 min,

25 °C; 60 min, 37 °C; 5 min, 70 °C). Die Lagerung der cDNA erfolgte bei -20 °C.

4.2.2.2 Konventionelle PCR

Für die Vervielfältigung einer DNA-Sequenz aus cDNA wurde die DreamTaq-

Polymerase eingesetzt. Ein Gesamtvolumen von 20 µl ergaben sich aus 2 µl

DreamTaq-Puffer (10x), 1 µl der beiden Vorwärts- bzw. Rückwärtsprimer

(10 pmol/µl), 0,5 µl dNTPs (10 mM), 0,2 µl DreamTaq-Polymerase, 1 µl cDNA und

14,3 µl sterilem Wasser. Die Aktivierung der DreamTaq-Polymerase erfolgte über

3 Minuten bei 95 °C. Anschließend wurden 20-30 Zyklen zur Amplifikation der cDNA

durchgeführt mit je 30 Sekunden bei 95 °C, 30 Sekunden mit der

Anlagerungstemperatur der Primer entsprechenden Temperatur und 30-

60 Sekunden bei 72 °C für die Elongation des Amplifikats. Nach 5 Minuten bei 72 °C

wurde die PCR beendet und die Proben bei 4 °C bis zur Analyse mittels Agarose-

Gelelektrophorese gelagert.

Für Klonierungs-PCRs wurde für eine korrekte Amplifikation der DNA-Sequenz eine

Polymerase mit Korrekturlese-Funktion, die Pfu-Polymerase, benutzt. Das

Gesamtvolumen von 50 µl setzte sich hier zusammen aus 5 µl 10x Pfu-Polymerase-

Puffer, 2,5 µl der entsprechenden Primer (10 pmol/µl), 1 µl dNTPs, 0,5 µl Pfu-

Polymerase, 2 µl cDNA und 36,5 µl sterilem Wasser. Das PCR-Programm wurde mit

3 Minuten bei 95 °C begonnen. Nach 30-35 Zyklen zur Amplifikation (30 Sekunden

bei 95 °C, 30 Sekunden bei der Primer-spezifischen Temperatur, 30-60 Sekunden

bei 72 °C) wurde die Klonierungs-PCR für 5 Minuten bei 72 °C beendet.

Für eine Überprüfung der erfolgreichen Insertion eines verdauten Amplifikats in ein

Plasmid wurden sogenannte Kolonie-PCRs durchgeführt. Hierbei wurde ein

Mastermix bestehend aus 1 µl DreamTaq-Puffer (10x), 0,4 µl Primer (3‘ und 5‘),

0,05 µl DreamTaq-Polymerase, 0,2 µl dNTPs (10 mM) und 7,95 µl Wasser je Ansatz

hergestellt. In PCR-Reaktionsgefäße wurden je 10 µl Mastermix vorgelegt und mit

einer sterilen Pipettenspitze in Einzelkolonien gepickt und in dem Mastermix

eingetaucht. Anschließend wurde das entsprechende PCR-Programm (siehe oben)


46

durchgeführt und die Proben anschließend auf eine Amplifikation der

entsprechenden DNA-Sequenz und somit positive Insertion in das Plasmid überprüft.

4.2.3 Agarose-Gelelektrophorese

Zur Analyse der PCR-Amplifikate bzw. Produkte eines Restriktionsverdaus wurden

Agarose-Gelelektrophoresen durchgeführt. Hierfür wurde 1-2% Agarose in TAE-

Puffer aufgekocht und mit 0,5 µg/ml Ethidiumbromid versetzt. Die DNA wurde mit 10x

Ladepuffer versetzt und ihrem Molekulargewicht entsprechend aufgetrennt und unter

UV-Licht analysiert.

4.2.4 Restriktionsverdau

Das Produkt einer Klonierungs-PCR wurde mit dem QIAquick® PCR Purification Kit

(Qiagen) aufgereinigt und zusammen mit dem Zielvektor mit den jeweiligen

Restriktionsenzymen der eingebauten Schnittstellen aufgeschlossen (32 µl PCR-

Produkt bzw. 5 µg Leervektor, 3 µl NEB-Puffer, 0,5 µl der beiden Enzyme, 0,3 µl BSA

(100x), mit sterilem Wasser auf 40 µl Gesamtvolumen). Der Verdau wurde 2-

4 Stunden bei 37 °C inkubiert und anschließend über Agarose-Gelelektrophorese

aufgetrennt. Die Produkte des Restriktionsverdaus wurden mit einem sterilen Skalpell

ausgeschnitten und mit dem QIAquick® Gel Extraction Kit (Qiagen) eluiert.

4.2.5 Ligation

Die Ligation von aufgeschlossenem Vektor und zu insertierender DNA erfolgte mittels

T4-DNA-Ligase. Um zu verhindern, dass sich der aufgeschlossene Vektor ohne

Insert wieder schließt, wurde der Vektor mit alkalischer Shrimp-Phosphatase (SAP)

behandelt. Hierfür wurde 1 µg DNA mit 2 µl SAP-Puffer und 1 µl (1 Unit) SAP

versetzt und mit sterilem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 20 µl gebracht. Nach

einer Inkubationszeit von 30 Minuten bei 37 °C und anschließender Inaktivierung des

Enzyms über 15 Minuten bei 65 °C erfolgte die Ligation. Die zu klonierende DNA

wurde in dreifach höherer Konzentration zu 100 ng aufgeschlossenem Vektor

gegeben und mit 2 µl 10x Ligase-Puffer, 1 µl T4-Ligase und sterilem Wasser auf ein

Volumen von 20 µl gebracht und über Nacht bei 16 °C inkubiert.


47

4.2.6 Transformation hitzeschockkompetenter Bakterien

Je Transformation wurden 100 µl hitzeschockkompetente Bakterien (E. coli: DH5

bzw. BL-21) auf Eis aufgetaut und 10 µl des Ligationsproduktes bzw. 0,5-1 µg

aufgereinigte Plasmid-DNA zugegeben. Nach 30minütiger Inkubation auf Eis wurden

die Bakterien 30 Sekunden bei 42 °C und 2 Minuten auf Eis inkubiert, bevor 1 ml

Circle-Grow-Medium zugegeben wurde und die Bakterien eine Stunde bei 37 °C bei

300 rpm inkubierten. 50 µl der Bakteriensuspension wurde auf Antibiotika-haltigen

Agarplatten mit einem Drigalskispatel ausplattiert. Der Rest der Bakterien wurde

pelletiert (2000 rpm, 5 min) und der Überstand bis auf 50 µl verworfen. Die restlichen

50 µl der Bakterienlösung wurden auf einer weiteren Agarplatte mit Antibiotikum

ausgestrichen. Die Agarplatten wurden bei 37 °C über Nacht inkubiert und

transformierte Antibiotika-resistente Kolonien am folgenden Tag mittels Kolonie-PCR

bzw. Restriktionsverdau analysiert.

4.2.7 Aufreinigung von Plasmid-DNA aus Bakterien

Die Aufreinigung von Plasmid-DNA aus transformierten Bakterien erfolgte mittels

QIAprep® Spin Miniprep Kit bzw. QIAGEN® Plasmid Maxi Kit nach dem

Herstellerprotokoll. Für kleine Mengen wurden 3 ml LB-Medium, versetzt mit

50 µg/ml des entsprechenden Antibiotikums, in ein Schüttelröhrchen gegeben und

mit einer Einzelkolonie beimpft. Die Inkubation erfolgte bei 37 °C und 250 rpm über

Nacht. Nach Pelletieren der Kultur (3500 rpm, 10 min) und Verwerfen des

Überstandes wurde das Pellet in 250 µl P1-Puffer resuspendiert. Nach Zugabe von

250 µl P2-Puffer und 350 µl N3-Puffer mit anschließender Zentrifugation (13000 rpm,

10 min) wurde der Überstand auf eine Filtersäule gegeben. Die Säule wurde einmal

mit 750 µl PE-Puffer gewaschen und anschließend gebundene DNA mit sterilem

Wasser eluiert. Mittels Nanodrop wurde der DNA-Gehalt bestimmt.

Für die Aufreinigung großer Mengen Plasmid-DNA wurden 350 ml LB-Medium mit

Antibiotikum beimpft und über Nacht bei 250 rpm und 37 °C inkubiert. Am nächsten

Tag wurde die Kultur pelletiert (6000 g, 15 min, 4 °C), der Überstand verworfen und

das Pellet in 10 ml Puffer P1 resuspendiert. Nach Zugabe von 10 ml Puffer P2,

fünfmaligem Schwenken und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 Minuten wurden

10 ml Puffer P3 zugegeben, erneut fünfmal geschwenkt und 20 Minuten bei

Raumtemperatur inkubiert. Nachfolgend wurde das Lysat nach Zentrifugation


48

(13000 rpm, 15 min, 4 °C) auf mit QBT-Puffer equilibrierte Filtersäulen gegeben.

Nach Bindung der DNA wurden die Filtersäulen zweimal mit je 30 ml QC-Puffer

gewaschen und die DNA durch Zugabe von 15 ml QF-Puffer eluiert. Die Präzipitation

der DNA erfolgte durch Zugabe von 10,5 ml Isopropanol und anschließender

Zentrifugation (15000 g, 30 min, 4 °C). Das DNA-Pellet wurde zweimal mit 5 ml

70%igem Ethanol gewaschen und in je 500 µl sterilem Wasser gelöst. Die

Bestimmung des DNA-Gehalts erfolgte mittels Nanodrop-Messung.

4.2.8 Sequenzierung und Sequenzierungsanalyse

Sequenzierungen zur Analyse erfolgreicher Klonierungen bzw. zur Identifizierung von

SH3-Domänen des Phage Display Screenings wurden mit dem BigDye® Terminator

Kit v1.1 durchgeführt. Für eine Sequenzierung wurden 0,5 µg DNA mit 4 µl

Reaktionspuffer, 2 µl Reaktionsmix und 3,2 pmol eines Sequenzierungsprimers

versetzt und mit sterilem Wasser auf ein Volumen von 20 µl gebracht. Der PCR-

Verlauf begann bei 96 °C für 1 Minute, anschließend erfolgten 25 Zyklen über

15 Sekunden bei 96 °C, 10 Sekunden bei 55 °C und 4 Minuten bei 60 °C. Nach

Aufreinigung der Probe mit dem DyeEx 2.0 Kit (Qiagen) erfolgte die Lagerung bei

4 °C bis zur Messung am Genetic Analyser 3130 (Applied Biosystems). Die Analyse

erfolgte mit der Vector NTI® 10 Software (Life Technologies).

4.2.9 Glycerolstocks

Die Lagerung transformierter Bakterien erfolgte bei -80 °C. Hierfür wurden 500 µl der

Ampicillin-selektierten Bakterienkultur mit 500 µl Glycerol vermischt und bei -80 °C

eingefroren.

4.2.10 Identifizierung interagierender SH3-Domänen mittels Phagenbibliothek

Die Transduktionskompetenz der TG1-Bakterien wurde in vorhergehenden Arbeiten

durch M13K08-Helferphagen sichergestellt (Diplomarbeit H. Oberdoerster, 2010).

Kompetente Bakterien wurden bei -80 °C gelagert. Zur Identifizierung von

potentiellen Interaktionspartnern von ADAM10 wurde eine kommerziell erhältliche

Phagenbibliothek mit allen bekannten humanen SH3-Domänen (All SH3 Domain

Phager®) verwendet. Zunächst wurden für das Kontrollprotein GST und das

Zielprotein GST-ADAM10cyt(697-748) jeweils 100 µl magnetische Beads

(Dynabeads® M-270 Epoxy) in Reaktionsgefäße überführt und dreimal mit je 100 µl


49

Natriumphosphatpuffer gewaschen. Nun erfolgte die Zugabe von 10 µg

Fusionsprotein in Natriumphosphatpuffer, kurzes Vortexen der Beads und nach der

Zugabe von 50 µl Ammoniumsulfatlösung rotierten die Beads langsam über Nacht

bei 4 °C, um eine Bindung der Proteine zu ermöglichen. Anschließend wurden die

Beads pelletiert und nach Entfernen der Proteinlösung wurden unspezifische

Bindungsstellen durch Zugabe von 200 µl Blockierungspuffer über eine Stunde bei

Raumtemperatur bei leichtem Schwenken abgedeckt. Im Anschluss wurden die

Beads dreimal mit PBS gewaschen und in 200 µl Phage-Solution, bestehend aus

100 l Blockierungspuffer und 100 l Phage Display Library Solution

(6x 1010 PFU/ml), resuspendiert. Nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur

wurde der Überstand abgenommen und die Beads mit Waschpuffer zehnmal

gewaschen. Nach Elution gebundener Phagen durch Zugabe von 150 µl

Elutionspuffer und 10-15 Minuten bei Raumtemperatur und leichtem Schwenken der

Beads wurde das Eluat in neue Reaktionsgefäße überführt und mit 1 M Trispuffer

(pH 9,0) neutralisiert. Mit sterilem LB-Medium wurde aus der Phagensuspension eine

Verdünnungsreihe erstellt und je 500 µl TG1-Bakterien in LB-Medium mit 5 µl der

jeweiligen Verdünnung versetzt. Die Bakterien wurden kurz zentrifugiert und

anschließend 30 Minuten ruhend bei 37 °C inkubiert. Auf Ampicillin-versetzten

SOBAG-Platten wurden je 100 µl der Lösung ausgestrichen und über Nacht bei

37 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurden transduzierte Klone gezählt und der Titer

bestimmt. Zur nachfolgenden Sequenzierung und Identifizierung gebundener Phagen

wurden 3 ml steriles LB-Medium mit Ampicillin mit einem Klon beimpft, über Nacht

bei 250 rpm und 37 °C inkubiert, die DNA extrahiert und mit Hilfe der

Sequenzierprimer H-305 und J-55 sequenziert. Die zwischen den Schnittstellen

BssHII und NotI befindliche Sequenz wurde translatiert und mittels Swissprot-Server

über Protein BLAST identifiziert. Von allen Klonen wurden vorsorglich Glycerolstocks

angelegt.


50

4.3 Biochemische Methoden

4.3.1 Expression und Aufreinigung rekombinanter GST-Fusionsproteine

Die Herstellung rekombinanter Fusionsproteine erfolgte durch heterologe Expression

in E. coli. Diese wurden zuvor mit dem Konstrukt transformiert und konnten sich

durch die erworbene Antibiotika-Resistenz in Ampicillin-enthaltendem Medium

vervielfältigen. Zur Herstellung der GST-Fusionsproteine im großen Maßstab wurden

100 ml LB-Medium mit Ampicillin mit Bakterien beimpft und über Nacht bei 37 °C und

250 rpm inkubiert. Anschließend erfolgte die Zugabe von 33 ml der Vorkultur zu

300 ml frischem LB-Medium mit Ampicillin bei 37 °C für eine Stunde. Nun wurden

333 µl IPTG (100 µM) zur Induktion der Expression zugegeben und für weitere 4-

7 Stunden bei 250 rpm und 37 °C inkubiert. Die Bakterien wurden pelletiert

(5000 rpm, 10 min, 4 °C) und in 27 ml kaltem PBS resuspendiert. Der Aufschluss der

Bakterien erfolgte durch Ultraschallbehandlung (3x5 Sekunden) und Zugabe von 3 ml

10% (v/v) Triton X-100 in PBS. Nach der Lyse (30 min, auf Eis) und anschließender

Zentrifugation (13000 rpm, 4 °C) wurden die Lysate abgenommen und zu 1 ml

Glutathion-4B-Sepharosebeads gegeben (1:2 in PBS). Nach einstündiger Rotation

bei Raumtemperatur bzw. Rotation über Nacht bei 4 °C wurde das Gemisch

zentrifugiert (3500 rpm, 10 min, 4 °C), der Überstand verworfen und die Beads

dreimal mit PBS gewaschen. Nach Zugabe von 1 ml Elutionspuffer und Rotation der

Beads für 10 Minuten bei Raumtemperatur wurde das Fusionsprotein von den Beads

gelöst. Nach kurzer Zentrifugation konnte das Eluat abgenommen und der

Proteingehalt bestimmt werden. Die Elution wurde wiederholt, bis kein Fusionsprotein

im Überstand zu detektieren war. Die Eluate wurden vereinigt, auf eine Filtersäule

(Amicon® Ultra) gegeben und der Elutionspuffer durch Zentrifugation bei 2000 rpm

und 4 °C durch PBS ersetzt. Das aufgereinigte Protein wurde auf eine Konzentration

von 1 mg/ml eingestellt, sterilfiltriert und bei -80 °C gelagert. 25 µg wurden mittels

SDS-Gelelektrophorese analysiert.

Für die Expression kleiner Mengen eines Fusionsproteins wurden 3 ml LB-Medium

mit Ampicillin mit den entsprechenden Bakterien beimpft, über Nacht bei 37 °C und

250 rpm inkubiert und anschließend 4,5 ml frisches LB-Medium mit Ampicillin mit

500 µl der Vorkultur beimpft. Nach einer Stunde bei 37 °C und 250 rpm wurden 5 µl

IPTG (100 µM) zugesetzt und weitere 4-5 Stunden inkubiert (37 °C, 250 rpm). Die

Bakterien wurden pelletiert, in 0,9 ml kaltem PBS resuspendiert und durch


51

Ultraschallbehandlung (2x3 sek) und Zugabe von 100 µl 10% (v/v) Triton X-100 in

PBS aufgeschlossen (30 min, auf Eis). Nach Zentrifugieren (13000 rpm, 10 min,

4 °C) wurden die Überstände zu je 30 µl Glutathion-4B-Sepharosebeads (1:2 in PBS)

gegeben und 10-20 Minuten bei Raumtemperatur rotiert. Die Beads wurden dreimal

mit PBS gewaschen, mit PBS und Probenpuffer versetzt und 5 Minuten bei 100 °C

denaturiert. Die Analyse erfolgte mittels SDS-Gelelektrophorese und anschließender

Coomassie-Färbung.

4.3.2 Herstellung von Zelllysaten und Bestimmung des Proteingehalts

Die Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen und das Zellpellet anschließend in

1% (v/v) NP-40 Lysepuffer, versetzt mit Proteaseinhibitoren (1 mM AEBSF, 2 µg/ml

Aprotinin, 2 µg/ml Leupeptin, 2 µg/ml Pepstatin A) und gegebenenfalls

Phosphataseinhibitoren (1 mM Natriumorthovanadate, 10 mM Natriumfluorid, 1 mM

Natriumpyrophosphat) resuspendiert. Nach 20minütiger Lyse auf Eis wurden

Zellrückstände pelletiert (14000 rpm, 10 min, 4 °C), Lysate abgenommen und

eventuell der Proteingehalt des Lysats mittels Bradford-Test photometrisch bestimmt.

4.3.3 Detektion von löslichem FasL in Zellkulturüberständen (ELISA)

Löslicher FasL in Zellkulturüberständen wurde mittels „Enzyme Linked

Immunosorbent Assay“ (ELISA) quantitativ bestimmt (Human FasL DuoSet). Die

Durchführung erfolgte nach Anleitung des Herstellers. Die densitometrische

Auswertung erfolgte mit einem Infinite® M200 Microplate Reader bei einer

Wellenlänge von 450 nm und einer Referenzwellenlänge von 540 nm.

4.3.4 Pull-Down mit rekombinanten GST-Fusionsproteinen

Die Verifizierung von Protein-Protein-Interaktionen kann über die Verwendung von

GST-Fusionsproteinen mittels Pull-Down erfolgen. Hierfür wurden Zelllysate auf

Glutathion-4B-Sepharosebeads (1:2 in NP-40-Puffer), versetzt mit 10-25 µg eines

GST-Fusionsproteins, gegeben und 2 Stunden bei 4 °C rotiert. Nach Zentrifugation

wurden die Beads fünfmal mit NP-40-Puffer ohne Inhibitoren und zweimal mit PBS

gewaschen. Anschließend wurden die Beads mit einer Kanüle (27 Gauge)

trockengesaugt, mit Wasser und Probenpuffer versetzt und für die Analyse über

SDS-Gelelektrophorese vorbereitet.


52

4.3.5 Immunpräzipitation

Die Analyse von Protein-Protein-Interaktionen kann weiterhin über (Co-)

Immunpräzipitationen erfolgen. Lysate wurden auf Protein-G-Sepharosebeads (1:2 in

NP-40-Puffer), versetzt mit 1-2 µg des entsprechenden Antikörpers, gegeben und

2 Stunden bei 4 °C rotiert. Die Beads wurden fünfmal mit Lysepuffer (ohne

Inhibitoren) und zweimal mit PBS gewaschen, bevor sie mit einer Kanüle

trockengesaugt und für die Analyse über SDS-Gelelektrophorese vorbereitet wurden.

4.3.6 Isolation sekretorischer Granula

Die Extraktion sekretorischer Lysosomen wurde mit Hilfe des Lysosome Isolation Kits

durchgeführt. Vorhergehenden Protokollen der Arbeitsgruppe entsprechend wurden

5-8x108 PHA-Blasten (unstimuliert oder mit anti-CD3 aktiviert) einmal mit kaltem PBS

gewaschen und das Volumen des Pellets abgeschätzt. Nach erneuter Zentrifugation

(1400 rpm, 5 min) wurden die Zellen in dem 2,7fachen Volumen Extraktionspuffer mit

Protease- und Phosphataseinhibitoren resuspendiert. Durch 30-40 Stöße in einem

Dounce-Homogenisator wurden die Zellen aufgeschlossen und der Aufschluss

mittels Trypanblau-Färbung überprüft. Bei 80-90% Zelltod wurde die Zellsuspension

in Reaktionsgefäße überführt und Zellorganellen durch differentielle Zentrifugation

angereichert. Nach einem ersten Zentrifugationsschritt (1000 g, 10 min, 4 °C) wurde

der Überstand in ein neues Gefäß überführt und erneut zentrifugiert (20000 g,

20 min, 4 °C). Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in Extraktionspuffer

resuspendiert und auf einen Gehalt von 19% (v/v) OptiPrepTM eingestellt.

Anschließend wurde ein diskontinuierlicher Gradient hergestellt. Auf den Boden des

Zentrifugenröhrchens wurden 0,4 ml 27% OptiPrepTM gegeben und mit 0,7 ml 22,5%,

0,9 ml 19% (enthielt die Probe), 0,7 ml 16%, 0,8 ml 12% und 0,9 ml 8%

OptiPrepTM (v/v) überlagert. Der Gradient wurde nun 5 Stunden bei 148000 g bei

4 °C zentrifugiert (ohne Bremse, Rotor SW60Ti). Letztlich wurden 6 Fraktionen

abgenommen, der Proteingehalt der einzelnen Fraktionen bestimmt und je 4 µg

Protein über Gelelektrophorese aufgetrennt (Bis-Tris NuPAGE®).

4.3.7 Isolation Detergenz-resistenter Membranen

Für die Isolation Detergenz-resistenter Membranen wurden Zellen (je Ansatz

100x106 PHA-Blasten bzw. 80x106 Jurkat-Zellen) unbehandelt inkubiert bzw. mit

verschiedenen Inhibitoren vorbehandelt. Anschließend wurden sie in reinem


53

Zellkulturmedium oder in Zellkulturmedium versetzt mit einem monoklonalen

Antikörper gegen CD3 und einem quervernetzenden Kaninchen-anti-Maus-Antikörper

inkubiert. Nach einmaligem Waschen mit kaltem PBS wurden die Zellen in 1 ml TNE-

Puffer (25 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 7,5) mit 1% Triton X-100 und

Protease- sowie Phosphataseinhibitoren lysiert. Nach fünf-zehnfachem Drücken

durch eine 27G-Kanüle wurde das Lysat mit 1 ml 85%iger Sucrose in TNE-Puffer

gemischt und auf den Boden des Ultrazentrifugenröhrchens gegeben. Nun wurde

das Lysat mit 6 ml 30%iger Sucrose und 5%iger Sucrose in TNE-Puffer

überschichtet. Nach dem Überlagern mit 2 ml TNE-Puffer wurde der Gradient 14-

18 Stunden bei 29000 rpm und 4 °C ohne Bremse zentrifugiert (Rotor SW32Ti).

14 Fraktionen à 1 ml wurden von oben nach unten abgenommen und je 20 µl mittels

Western Blot analysiert.

4.3.8 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)

Die Auftrennung der Proteine nach ihrem Molekulargewicht erfolgt durch die SDS-

Polyacrylamidgelelektrophorese, bei der die Proteine zuerst durch

Sodiumdodecylsulfat (SDS) denaturiert und negativ geladen werden. Durch die

mögliche Zugabe von -Mercaptoethanol im Probenpuffer werden Disulfidbrücken

gespalten und die Probe reduziert. Die Auftrennung erfolgte entweder mit dem

Protean II-System oder mit dem NuPAGE®-System. Bei dem Protean II-System von

Bio-Rad wurden je nach gewünschter Auftrennung 10-15% Acrylamidgehalt des

Trenngels verwendet. Nach Überschichtung des Trenngels mit 96%igem Ethanol für

eine ebene Trennlinie und vollständiger Polymerisierung wurde das Ethanol

verworfen, dreimal mit destilliertem Wasser gespült und das Sammelgel darüber

gegossen. Der Probenkamm wurde eingesetzt und eine Polymerisation abgewartet.

Pro Probe wurden 25-50 µg Protein bzw. 1,5-2,5x106 Zellen eingesetzt. Die Proben

wurden mit einem Drittel reduzierendem Probenpuffer versetzt und erhitzt (5 min,

95 °C). Anschließend wurden die Proben mit Kolibrispitzen in die mit Laufpuffer

gefüllten Geltaschen pipettiert. Nach Auffüllen der inneren Kammer mit Laufpuffer

erfolgte die Auftrennung der Proteine bei 60-80 V über Nacht. Bei dem NuPAGE®-

System wurden 4-12% Bis-Tris-Fertiggele in einem MES-Puffersystem verwendet. 5-

10 µg der Probe bzw. 20 µl der Fraktionen eines Sucrosegradienten wurden mit

einem Drittel des Probenpuffers versetzt (reduzierend oder nicht-reduzierend) und

bei 95 °C für 5 Minuten inkubiert. Die Proben wurden vorsichtig in die gespülten


54

Geltaschen gegeben und der Gellauf erfolgte bei 200 V für 50-55 Minuten. Der

Gellauf wurde gestoppt, wenn die Lauffront das untere Ende des Gels erreicht hatte.

4.3.9 Coomassie-Färbung von Proteinen in SDS-Polyacrylamidgelen

Für eine Coomassie-Färbung aufgetrennter Proteine in einem Polyacrylamidgel

wurde das Gel nach dem Gellauf mit destilliertem Wasser gespült und eine Stunde

bei Raumtemperatur mit Coomassie-Färbelösung inkubiert. Anschließend wurde das

Gel über Nacht mit Coomassie-Entfärbelösung geschwenkt und entfärbt. Das Gel

wurde nachfolgend gescannt bzw. getrocknet.

4.3.10 Western Blot

Im Anschluss an die Auftrennung von Proteinen mittels SDS-Gelelektrophorese

wurden die Proteine auf Nitrozellulosemembranen (0,2 µm bzw. 0,45 µm

Porengröße) transferiert. Dies erfolgte unter Verwendung der Trans-Blot-Kammern

bei 4 °C und 0,8 A für 2 Stunden bei dem Protean II-System bzw. mit kleinen

Gelkassetten bei 100 V über eine Stunde mit Eiskühlung bei dem NuPAGE-System.

Alle Komponenten des Transfers wurden vorerst in Transferpuffer equilibriert. Der

Zusammenbau erfolgte von der Kathode zur Anode wie folgt: ein Schwamm, zwei

Whatman-Papiere, Gel, Nitrozellulosemembran, zwei Whatman-Papiere und ein

Schwamm. Nach dem Transfer wurde die Membran mit Wasser gespült und zur

Überprüfung der Transfereffizienz reversibel mit Ponceau S gefärbt. Nach der

Entfärbung der Membran mit TBS und anschließender Blockierung unspezifischer

Bindungsstellen mit 5% BSA in TBS-T bzw. 5% Milchpulver in TBS-T über eine

Stunde bei Raumtemperatur wurde die Membran eine Stunde bei Raumtemperatur

oder über Nacht bei 4 °C mit dem Primärantikörper, verdünnt in TBS-T, inkubiert.

Nach dreimaligem Waschen mit TBS-T wurde die Nitrozellulosemembran mit einem

HRP-konjugierten Sekundärantikörper, ebenfalls verdünnt in TBS-T, für 45-

60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss an dreimaliges Waschen

der Membran mit TBS-T wurden markierte Proteine durch Schwenken der Membran

in ECL-Detektionsreagenz und nachfolgender Belichtung von Hyperfilm-ECL-Filmen

detektiert.

Ergebnisse

55

5. Ergebnisse

5.1 ADAM10 reguliert die Expression des Fas-Liganden

5.1.1 Oberflächenexpression und Aktivität von ADAM10

Phorbolester (TPA) und Kalziumionophor (Ionomycin) werden oft verwendet, um die

Aktivität von ADAM10 und ADAM17 zu steigern und die Proteolyse ihrer Substrate zu

induzieren. In der vorliegenden Arbeit sollte zunächst untersucht werden, welche der

beiden Stimuli für die ADAM10-vermittelte Proteolyse des FasL verantwortlich ist und

ob bei einer Stimulation Änderungen der Oberflächendichte von membranständigem

ADAM10 (mADAM10) auftreten. In vorhergehenden Arbeiten innerhalb der

Arbeitsgruppe (Diplomarbeit A. Schröder, 2012) konnte gezeigt werden, dass

ADAM10 auf allen getesteten T-Zellpopulationen und Tumorzelllinien in hoher Dichte

exprimiert ist. Die Stimulation mit TPA/Ionomycin hatte bei den meisten Zelllinien

keinen signifikanten Einfluss auf die Oberflächenexpression von ADAM10, die über

drei Stunden nahezu konstant blieb (Ebsen et al., 2013). Lediglich bei der Stimulation

von PHA-Blasten und frisch isolierten T-Zellen fiel auf, dass die

Oberflächenexpression von ADAM10 im Verlauf der Zeit leicht, aber kontinuierlich

abfiel. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden basierend auf den Vorbefunden

erneut PHA-Blasten mit TPA/Ionomycin stimuliert und membranständiges ADAM10

durchflusszytometrisch analysiert (Abbildung 5.1).

Abb. 5.1: Kinetik der ADAM10-Oberflächenexpression auf TPA/Ionomycin-stimulierten PHA-Blasten. Die Zellen wurden nach den angegebenen Zeitpunkten mit einem monoklonalen Antikörper gegen ADAM10 (AD214Y) gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert.

0

100

200

300

400

500

600

0 10 30 60 90 120 150 180

TPA/Ionomycin [min]

mADAM10

Flu

ore

sze

nzin

ten

sit

ät

(x g

eo

mea

n)

Ergebnisse

56

Auf unstimulierten PHA-Blasten war ADAM10 hoch exprimiert (geo mean: 503,88).

Zehn Minuten nach Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) über TPA und

Kalziumeinstrom durch Ionomycin stieg die Expression leicht an (geo mean: 528,34)

und nahm im Verlauf der dreistündigen Stimulation langsam ab (geo mean

180 Minuten: 388,46; Abbildung 5.1). Eine ähnliche Reduktion von ADAM10 auf

Gesamtproteinebene konnte auch mittels Western Blot-Analyse nachgewiesen

werden. Auch hier war in Zelllysaten stimulierter PHA-Blasten nach drei Stunden eine

leichte Abnahme der reifen Form von ADAM10 (60 kDa) festzustellen, während die

Ladekontrolle GAPDH konstant blieb (Abbildung 5.2). Als Kontrolle der Spezifität des

ADAM10-Antikörpers diente Lysat von Zellen, in denen ADAM10 durch siRNA-

Transfektion herunterreguliert war.

Abb. 5.2: Expression von ADAM10 nach TPA/Ionomycin-Stimulation. PHA-Blasten wurden zu den angegebenen Zeitpunkten stimuliert, anschließend lysiert und die Zelllysate elektrophoretisch aufgetrennt. Mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers (11G2) konnte endogenes ADAM10 detektiert werden (oben).Die densitometrische Auswertung des Western Blots ist in der mittleren Teil der Abbildung dargestellt. Das Lysat siRNA-transfizierter Zellen wurde als Kontrolle der Spezifität aufgetrennt. GAPDH wurde als Ladekontrolle detektiert (unten).

Ergebnisse

57

Um zu untersuchen, ob die leicht verringerte ADAM10-Expression während der

Stimulation mit TPA/Ionomycin einen Einfluss auf das FasL-Shedding hat, wurde

einerseits die Oberflächendichte des FasL auf PHA-Blasten durchflusszytometrisch

analysiert und andererseits die Generierung des löslichen FasL mittels ELISA zur

Beurteilung der proteolytischen Aktivität untersucht. Mit einem direkt-markierten

monoklonalen Antikörper, der den extrazellulären Teil des FasL erkennt, konnte ein

rapider Anstieg der Oberflächenexpression des FasL innerhalb der ersten zehn

Minuten der Stimulation detektiert werden (Abbildung 5.3). Anschließend sank die

FasL-Expression wieder ab, um nach 90 Minuten erneut anzusteigen. Dies entspricht

der zuvor innerhalb der Arbeitsgruppe beschriebenen Kinetik der FasL-Expression

auf der Oberfläche nach TPA/Ionomycin-Stimulation (Lettau et al., 2004).

Abb. 5.3: Kinetik der TPA/Ionomycin-induzierten FasL-Oberflächenexpression. PHA-Blasten wurden mit TPA und Ionomycin stimuliert und nach den angegebenen Zeitpunkten mit einem monoklonalen Antikörper gegen den FasL gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert.

Die Detektion des löslichen FasL (soluble FasL, sFasL) in den Zellkulturüberständen

der mit TPA/Ionomycin-stimulierten PHA-Blasten ergab eine kontinuierlich steigende

Menge an löslichem FasL über die Inkubationszeit von drei Stunden (Abbildung 5.4).

0

3

6

9

12

0 30 60 90 120 150 180

Flu

ore

sze

nzin

ten

sit

ät

(x g

eo

me

an

)

TPA/Ionomycin [min]

mFasL

Ergebnisse

58

Abb. 5.4: TPA/Ionomycin-induzierte Proteolyse des FasL führt zur Generation des löslichen Fragments (sFasL). PHA-Blasten wurden über die angegebenen Zeitpunkte mit TPA und Ionomycin stimuliert. sFasL wurde in den Überständen quantitativ mittels ELISA analysiert. Die angegebenen Werte entsprechen den Durchschnittswerten von Triplikaten mit Standardabweichung.

Nachfolgend sollte untersucht werden, welche der beiden Stimuli die Aktivierung von

ADAM10 bewirkt und wie sie sich einzeln oder in Kombination auf die ADAM10- und

FasL-Oberflächenexpression auswirken. Aus diesem Grund wurden PHA-Blasten

entweder mit TPA, mit Ionomycin oder der Kombination beider Faktoren im

Zellkulturmedium inkubiert. Die Oberflächenexpression von ADAM10 wurde mit Hilfe

des monoklonalen Antikörpers AD214Y analysiert (Abbildung 5.5).

Abb. 5.5: Unterschiede der ADAM10-Oberflächenexpression nach Stimulation von PHA-Blasten mit TPA, Ionomycin oder TPA/Ionomycin. Die Zellen wurden entweder mit TPA, mit Ionomycin oder TPA in Kombination mit Ionomycin über die angegebenen Zeiträume stimuliert und anschließend mit einem monoklonalen Antikörper gegen ADAM10 (AD214Y) durchflusszytometrisch analysiert.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 10 30 60 90 120 150 180

OD

(45

0 n

m/5

40

nm

)

TPA/Ionomycin [min]

sFasL

50

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0 30 60 90 120 150 180[min]

TPAIonomycinTPA/Ionomycin

mADAM10

Flu

ore

sze

nzin

ten

sit

ät

(x g

eo

mea

n)

Ergebnisse

59

Während TPA nach 10 Minuten einen leichten Anstieg von membranständigem

ADAM10 auf der Zelloberfläche bewirkte, der anschließend wieder abfiel und sich

dann auf einem konstanten Level einpendelte, blieb bei der Stimulation mit

Ionomycin die Höhe an membranständigen ADAM10 über drei Stunden nahezu

konstant. Nur der Einsatz beider Agentien resultierte in der zuvor beschriebenen

langsamen und stetigen Reduktion von ADAM10 auf der Oberfläche (Abbildung 5.5).

Zu bemerken ist, dass bei diesem Versuch im Vergleich zu den sonstigen

Abbildungen Isotypkontrollen einer anderen Firma verwendet wurden. Obwohl die

Konzentrationen von Isotypkontrolle und spezifischen ADAM10-Antikörpern

angeglichen wurden, traten bei Verwendung verschiedener Isotypen Unterschiede

bezüglich der berechneten Fluoreszenzintensitäten auf.

Gleichzeitig zu ADAM10 wurde mit einem direkt-konjugierten FasL-Antikörper die

Dichte an FasL auf der Oberfläche gemessen. Das biphasische Expressionsprofil

war sowohl bei Ionomycin allein, als auch bei der Kombination aus TPA und

Ionomycin ausgeprägt, wobei die Inkubation mit Ionomycin eine relativ etwas

geringere FasL-Expression zur Folge hatte. Die Behandlung mit TPA führte nach 10

Minuten zu einem kurzen Anstieg des FasL, anschließend blieb die Expression auf

der Zelloberfläche über die Dauer der Stimulation konstant (Abbildung 5.6).

Abb. 5.6: TPA/Ionomycin-induzierter Verlauf der FasL-Oberflächenexpression. PHA-Blasten wurden entweder mit TPA, Ionomycin oder TPA in Kombination mit Ionomycin stimuliert und nach den angegebenen Zeitpunkten mit einem direkt-markierten monoklonalen Antikörper gegen den FasL durchflusszytometrisch analysiert.

0

1

2

3

4

0 30 60 90 120 150 180[min]

TPA

Ionomycin

TPA/Ionomycin

mFasL

Flu

ore

sze

nzin

ten

sit

ät

(x g

eo

mea

n)

Ergebnisse

60

Die Analyse der Zellkulturüberstände mittels ELISA ergab eine nur geringe Induktion

der FasL-Proteolyse nach Stimulation mit TPA, während Inkubation mit Ionomycin zu

einem leichten Anstieg des löslichen FasL führte (Abbildung 5.7). Die Kombination

von TPA und Ionomycin dagegen resultierte in einer starken Akkumulation von

löslichem FasL in den Überständen.

Abb. 5.7: Induzierte Proteolyse des FasL. PHA-Blasten wurden über die angegebenen Zeitpunkte mit TPA oder Ionomycin oder beidem in Kombination stimuliert. Löslicher FasL (sFasL) wurde in den Überständen quantitativ mittels ELISA analysiert. Gezeigt sind die Durchschnittswerte von Triplikaten mit Standardabweichung.

Bezüglich ADAM17 konnte innerhalb der Arbeitsgruppe gezeigt werden, dass die

konstitutive Oberflächenexpression dieser Protease auf Tumorzellen und

verschiedenen T-Zellen verglichen mit ADAM10 sehr gering war. Es wurde allerdings

festgestellt, dass die ADAM17-Expression auf verschiedenen T-Zellpopulationen

nach zehnminütiger Stimulation mit TPA/Ionomycin transient anstieg (Diplomarbeit A.

Schröder; Ebsen et al., 2013). Dieser Anstieg wurde in abgeschwächter Form auch

dann beobachtet, wenn TPA allein eingesetzt wurde, jedoch nur bei der Kombination

aus TPA und Ionomycin kam es zu dem deutlichen Anstieg. Dieser konnte durch

pharmakologische Inhibitoren der Aktin-Polymerisation (Latrunculin A, Cytochalasin

D) inhibiert werden, nicht jedoch durch Inhibierung der Proteinbiosynthese

(Cycloheximid) oder des Proteintransports (Brefeldin A, Monensin) (Ebsen et al.,

2013). Um zu überprüfen, ob Herunterregulation von ADAM17 den Anstieg

verhindert, wurden PHA-Blasten im Rahmen der vorliegenden Arbeit transient mit

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0 10 30 60 90 120 150 180

OD

(45

0 n

m/5

40

nm

)

[min]

TPA

Ionomycin

TPA/Ionomycin

sFasL

Ergebnisse

61

siRNA gegen ADAM17 transfiziert. Bei Stimulation mit TPA/Ionomycin zeigten diese

Zellen nur eine leichte Erhöhung von ADAM17 auf der Zelloberfläche nach

10 Minuten (Abbildung 5.8). Mit Kontroll-RNA transfizierte Zellen (scrRNA) zeigten

eine leicht verringerte Induktion von ADAM17 auf der Oberfläche verglichen mit

untransfizierten Zellen, während mit der Positivkontrolle (siRNA GAPDH) transfizierte

PHA-Blasten sogar höhere induzierte Expressionslevel an ADAM17 aufwiesen.

Abb. 5.8: Transfektion von PHA-Blasten mit siRNA gegen ADAM17 reduziert induzierbaren Anstieg der ADAM17-Oberflächenexpression nach TPA/Ionomycin-Stimulation. Zellen wurden transient mit siRNAs transfiziert oder untransfiziert inkubiert. 72 Stunden später wurden sie mit TPA/Ionomycin zur angegebenen Zeit stimuliert und durchflusszytometrisch mit einem monoklonalen Antikörper gegen humanes ADAM17 (A300E) analysiert.

Die erfolgreiche Herunterregulation von ADAM17 wurde mittels Western Blot

überprüft. Mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers gegen humanes ADAM17 (A318)

wurde gezeigt, dass ADAM17 spezifisch herunterreguliert war und nur in den

Kontrollen (untransfiziert bzw. Positiv- (siRNA GAPDH) und Negativkontrollen

(scrRNA ADAM17)) detektiert werden konnte, nicht jedoch in Zellen, die mit siRNA

gegen ADAM17 transfiziert wurden (Abbildung 5.9).

0

2

4

6

8

10

0 30 60 90 120 150 180

Flu

ore

sze

nzin

ten

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ät

(x g

eo

me

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)

TPA/Ionomycin [min]

untransfiziert

siRNA GAPDH

scrRNA ADAM17

siRNA ADAM17

mADAM17

Ergebnisse

62

Abb. 5.9: Die Herunterregulation von ADAM17 in PHA-Blasten mittels spezifischer siRNA. Zellen wurden transient transfiziert, 72 Stunden später lysiert und gelelektrophoretisch aufgetrennt. Mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers gegen humanes ADAM17 (A318) wurde die Proteinexpression von ADAM17 analysiert.

5.1.2 ADAM10 ist die Haupt-Sheddase des FasL bei TPA/Ionomycin-induzierter

Proteolyse

Da bisherige Analysen zur Identifizierung der verantwortlichen Protease des FasL-

Sheddings im Wesentlichen auf der Verwendung mehr oder weniger spezifischer

Inhibitoren basierten, sollte über die spezifische Herunterregulation von ADAM10 und

ADAM17 durch siRNAs überprüft werden, ob ADAM10 die wichtigste Protease im

Kontext des FasL-Sheddings ist. PHA-Blasten wurden mit einer Kombination aus drei

verschiedenen siRNAs gegen ADAM10 bzw. ADAM17 transient transfiziert. Als

Kontrollen wurden untransfizierte bzw. Kontroll-RNA-transfizierte PHA-Blasten

verwendet. 72 Stunden später wurden die Zellen mit TPA/Ionomycin stimuliert und

mittels Western Blot und ELISA die proteolytische Prozessierung des FasL

analysiert. Außerdem wurden Zelllysate auf die effektive Herunterregulation von

ADAM10 (Abbildung 5.10) bzw. ADAM17 (Abbildung 5.9) überprüft. In der

durchflusszytometrischen Analyse der ADAM10-Expression (Abbildung 5.10A) wurde

eine starke Reduktion von ADAM10 in siADAM10-transfizierten Zellen detektiert (geo

mean 33,75), verglichen mit untransfizierten Zellen (geo mean 125,99), während die

Negativkontrolle (scrRNA ADAM10), sowie mit ADAM17-siRNA-transfizierte Zellen

Ergebnisse

63

sogar leicht erhöhte Level ADAM10 aufwiesen (geo mean 147,06 bzw. 138,28). In

den Zelllysaten war sowohl die reife als auch die unreife Form von ADAM10 in

ADAM10-siRNA-transfizierten Zellen nicht mehr detektierbar, während die

Transfektion mit Positiv- (siRNA GAPDH) und Negativkontrolle (scrRNA ADAM10)

keinen Einfluss auf die Expression von ADAM10 zeigte (Abbildung 5.10B). Lediglich

bei der Transfektion von spezifisch gegen ADAM17 gerichteten siRNAs (siRNA

ADAM17) wurde bei Betrachtung des Gesamtproteingehalts ein geringer Einfluss auf

die Proteinexpression von ADAM10 deutlich (Abbildung 5.10B).

Abb. 5.10: Reduktion von endogenem ADAM10 durch transiente Transfektion mit spezifischer siRNA. (A) Die Effizienz der Herunterregulation durch ADAM10-spezifische siRNAs wurde durchflusszytometrisch mit einem monoklonalen Antikörper (AD214Y) analysiert (a, Isotypkontrolle; b, siRNA ADAM10; c, untransfizierte Zellen; d, Negativkontrolle scrRNA ADAM10; e, siRNA ADAM17). (B) Zusätzlich wurde die Reduktion von reifem (~60 kDa) und unreifem (~80 kDa) ADAM10 in ADAM10-spezifisch transfizierten PHA-Blasten auch über eine Western Blot-Analyse in Zelllysaten von untransfizierten bzw. siRNA-transfizierten Zellen nachgewiesen.

Die Analyse von löslichem FasL in Zellkulturüberständen mittels ELISA ließ deutlich

erkennen, dass sich die Herunterregulation von ADAM10 negativ auf die

proteolytische Prozessierung des FasL nach Stimulation mit TPA/Ionomycin auswirkt

und die Zellen die geringsten Mengen löslichen FasL produzierten (Abbildung 5.11).

Auch die Transfektion der Zellen mit der Kontroll-RNA (scrRNA) und siRNA gegen

ADAM17 bewirkte eine leichte Reduktion der FasL-Proteolyse, verglichen mit den

untransfizierten Kontrollzellen. Dies lag jedoch an der Transfektionsprozedur, wobei

Ergebnisse

64

nur die Herunterregulation von ADAM10 die Bildung von löslichem FasL spezifisch

verringerte (Abbildung 5.11).

Abb. 5.11: Die Herunterregulation von ADAM10 mittels siRNA reduziert die TPA/Ionomycin-induzierte Proteolyse des FasL. PHA-Blasten wurden nicht oder transient mit siRNAs gegen ADAM10 oder ADAM17 bzw. Kontroll-RNA (scrRNA ADAM10) transfiziert und nach 72 Stunden mit TPA/Ionomycin stimuliert. In den Zellkulturüberständen wurden die Mengen löslichen FasL mittels ELISA quantifiziert. Gezeigt sind die Durchschnittswerte von Triplikaten mit Standardabweichung.

Die proteolytische Prozessierung des FasL nach Transfektion mit ADAM10-

spezifischer siRNA bzw. Kontroll-RNA und anschließender TPA/Ionomycin-

Stimulation wurde zusätzlich mittels Western Blot analysiert. In Zellen, die mit der

Negativkontroll-RNA (scrRNA ADAM10) transfiziert wurden, zeigte sich nach

60 Minuten ein Anstieg des unprozessierten FasL mit einem Molekulargewicht von

circa 38 kDa. Die größten Mengen wurden bereits nach 90 Minuten Stimulation

beobachtet (Abbildung 5.12). Nach 90-120 Minuten sah man die Akkumulation des

N-terminalen Fragments (NTFs) auf einer Höhe von 15 kDa. Bei Zellen, die mit

ADAM10-siRNA transfiziert wurden, konnte nach 60-90 Minuten ebenfalls ein Anstieg

des ungespaltenen FasL detektiert werden. Bei anhaltender Stimulation akkumulierte

der FasL zunehmend und nach 180 Minuten wurde hier die größte Menge detektiert

(Abbildung 5.12). Auch in den mit siRNA gegen ADAM10 transfizierten Zellen konnte

nach 60-90 Minuten die Generation von NTFs beobachtet werden, allerdings zu

einem geringeren Ausmaß als in den Kontrollzellen (Abbildung 5.12).

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 10 30 60 90 120 150 180

OD

(45

0 n

m/5

40

nm

)

TPA/Ionomycin [min]

untransfiziert

scrRNA ADAM10

siRNA ADAM10

siRNA ADAM17

sFasL

Ergebnisse

65

Abb. 5.12: Transfektion mit siRNA gegen ADAM10 reduziert die Proteolyse des FasL. Um den Einfluss von ADAM10 auf die proteolytische Prozessierung des FasL zu untersuchen, wurden PHA-Blasten mit Kontroll-siRNA (scrRNA ADAM10) bzw. spezifisch gegen ADAM10 gerichtete siRNAs transfiziert, 72 Stunden später mit TPA/Ionomycin stimuliert und anschließend mittels Western Blot analysiert. Der FasL wurde mit einem monoklonalen Antikörper gegen die intrazelluläre Domäne detektiert (FasLcytoII; oben). Die effiziente Herunterregulation wurde durch Inkubation der Membran mit einem polyklonalen ADAM10-Antiserum (Tier 1) überprüft (Mitte). Die reversible Färbung mit Ponceau S zeigte eine einheitliche Beladung an Gesamtprotein (unten). Abkürzungen: VL, volle Länge; NTF, N-terminales Fragment.

Da über Inhibitoren für die weitere Proteolyse der FasL-NTFs in der Plasmamembran

eine mögliche Beteiligung der Protease SPPL2a (signal peptide peptidase like 2a)

gezeigt wurde, wurden zur Verifizierung PHA-Blasten mit spezifischen siRNAs gegen

das Protein transfiziert. Als Kontrolle wurden Zellen mit Kontroll-RNA transfiziert und

mittels Western Blot analysiert (Abbildung 5.13). Im Vergleich zu Zellen, die mit

Ergebnisse

66

Kontroll-RNA transfiziert wurden (scrRNA SPPL2a), zeigten siRNA-transfizierte

Zellen, bei denen SPPL2a herunterreguliert war (siRNA SPPL2a), eine deutliche

Akkumulation von NTFs.

Abb. 5.13: Die Herunterregulation von SPPL2a resultiert in einer Akkumulation des N-terminalen Fragments des FasL. Um den Einfluss von SPPL2a auf die proteolytische Prozessierung des FasL zu untersuchen, wurden PHA-Blasten mit Kontroll-siRNA (scrRNA SPPL2a) bzw. spezifisch gegen SPPL2a gerichtete siRNA transfiziert. Nach 72 Stunden wurden die Zellen mit TPA/Ionomycin stimuliert, zu den angegebenen Zeitpunkten lysiert und mittels Western Blot analysiert. Der FasL wurde mit einem polyklonalen Antikörper gegen die intrazelluläre Domäne detektiert (FasL N20; oben). Abkürzungen: VL, volle Länge; NTF, N-terminales Fragment.

5.1.3 Die Stimulation des T-Zellrezeptors induziert die Proteolyse des FasL

Eine Stimulation von Zellen mit TPA und Ionomycin wird häufig zur Induktion der

proteolytischen Aktivität von ADAM-Proteasen verwendet. Allerdings umgehen diese

beiden Stimuli physiologische Mechanismen und führen in der Zelle zu einer Vielzahl

von Reaktionen und Signalkaskaden, die nach wie vor vielfach unzureichend

verstanden sind. Deshalb sollte im Hinblick auf die induzierbare FasL-Proteolyse in

T-Zellen analysiert werden, ob auch die Aktivierung des T-Zellrezeptors (TZR) zu

einer Verstärkung des FasL-Sheddings führt. Eine Aktivierung des TZR/CD3-

Ergebnisse

67

Komplexes kann durch Verwendung eines monoklonalen Antikörpers (OKT3) erreicht

werden, der an die TZR-assoziierte CD3ε-Untereinheit bindet und zur Auslösung der

TZR-CD3-abhängigen Signalkaskade führt (Signal 1). Als zusätzlicher Stimulus

wurde ein monoklonaler Antikörper gegen CD28 verwendet. CD28 ist ebenfalls auf T-

Zellen exprimiert und Bindung des Antikörpers bzw. der natürlichen Liganden

(CD80/CD86) führt zur Auslösung eines zweiten Signals, welches essentiell für die

vollständige Aktivierung ruhender T-Zellen ist (Signal 2). PHA-Blasten (Tag 14)

wurden über drei Stunden mit immobilisierten Antikörpern gegen CD3 und CD28

stimuliert. Anschließend wurden die Zellkulturüberstände für eine Untersuchung der

Mengen an löslichem FasL mittels ELISA abgenommen. Die Zellen wurden lysiert

und elektrophoretisch aufgetrennt. Als Kontrolle dienten PHA-Blasten, die parallel mit

TPA/Ionomycin stimuliert wurden. Wie erwartet, konnten in Lysaten der Kontrollzellen

nach 120-180 Minuten Stimulation mit TPA und Ionomycin deutlich FasL-NTFs bei

15 kDa nachgewiesen werden. Die Akkumulation von NTFs wurde wenngleich in

einem etwas geringeren Ausmaß auch bei der Aktivierung über CD3 und CD28

sichtbar (Abbildung 5.14).

Abb. 5.14: Stimulation von aktivierten T-Zellen mit monoklonalen Antikörpern gegen CD3 und CD28 resultiert in verstärkter Proteolyse des FasL. PHA-Blasten (Tag 14) wurden über einen Zeitraum von 0-180 Minuten entweder mit TPA/Ionomycin oder immobilisierten Antikörpern gegen CD3 und CD28 stimuliert, lysiert und anschließend mittels Western Blot analysiert. Durch Inkubation der Nitrozellulosemembran mit einem polyklonalen Antikörper gegen den intrazellulären Teil des FasL (N20) wurden N-terminale Fragmente des FasL detektiert. GAPDH diente als Ladekontrolle.

Ergebnisse

68

Zusätzlich zu der Analyse der membranständigen Fragmente wurde auch die

Entstehung von löslichem FasL in den Zellkulturüberständen mittels ELISA

analysiert. Hier wurde bei den Kontrollzellen der erwartete Anstieg von sFasL über

drei Stunden beobachtet. Die Inkubation der Zellen mit anti-CD3/anti-CD28

resultierte ebenfalls in einer Freisetzung von löslichem FasL, wenn auch mit einer

leicht verspäteten Kinetik und einer etwas verringerten Amplitude (Abbildung 5.15).

Abb. 5.15: Stimulation des TZR von PHA-Blasten führt zu verstärkter Produktion von löslichem FasL in Zellkulturüberständen. Die Zellen wurden zu den angegebenen Zeitpunkten mit TPA/Ionomycin bzw. monoklonalen Antikörpern gegen CD3/CD28 stimuliert und die Zellkulturüberstände anschließend mittels ELISA analysiert. Gezeigt ist ein repräsentatives Experiment von drei Versuchen mit den Mittelwerten aus Duplikaten.

Um den Einfluss der CD3/CD28-induzierten Aktivierung auf die

Oberflächenexpression vom ADAM10 zu untersuchen, wurden PHA-Blasten (Tag 8)

mit TPA/Ionomycin bzw. Antikörpern gegen CD3 und CD28 über 180 Minuten

stimuliert und anschließend mit Hilfe eines direkt-markierten ADAM10-Antikörpers

gefärbt. Die anschließende durchflusszytometrische Analyse zeigte bei mit

TPA/Ionomycin-stimulierten Kontrollzellen die erwartete Konstanz an ADAM10 auf

der Zelloberfläche mit leichtem Absenken nach 60 Minuten. Die Kinetik der

CD3/CD28-induzierten Oberflächenexpression zeigte einen sehr ähnlichen Verlauf,

mit einer leichten Reduktion im Laufe der Inkubationszeit (Abbildung 5.16).

0

0,1

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m/5

40

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[min]

TPA/Ionomycin

CD3/CD28

sFasL

Ergebnisse

69

Abb. 5.16: Die Oberflächenexpression von ADAM10 bleibt während der Stimulation mit Antikörpern gegen CD3/CD28 nahezu konstant. PHA-Blasten wurden mit TPA/Ionomycin und immobilisierten monoklonalen Antikörpern gegen CD3/CD28 stimuliert. Anschließend wurden die Zellen mit einem direkt-konjugierten Antikörper gegen ADAM10 (Klon SHM14) durchflusszytometrisch analysiert.

Da für ADAM17 gezeigt wurde, dass die kurzfristige Stimulation mit TPA/Ionomycin

nach 10 Minuten zu einem rapiden Anstieg auf der Zelloberfläche resultiert, wurde

die Oberflächenexpression von ADAM17 auf CD3/CD28-aktivierten PHA-Blasten

ebenfalls analysiert (Abbildung 5.17). Wie erwartet, stieg der Anteil an

membranständigem ADAM17 auf der Oberfläche nach 10-minütiger Stimulation mit

TPA/Ionomycin auf ein Maximum an, um in den nachfolgenden zwei Stunden stetig

zu sinken. Wurden die PHA-Blasten mit immobilisierten Antikörpern gegen CD3 und

CD28 stimuliert, wurde jedoch kein entsprechender Anstieg der ADAM17-Expression

beobachtet. Nach 120 bis 180 Minuten sank die Menge an ADAM17 auf der

Oberfläche ähnlich der TPA/Ionomycin-Kinetik ab. Nach drei Stunden wiesen TZR-

stimulierte Zellen gleiche Expressionslevel auf der Oberfläche auf, wie Zellen die mit

TPA/Ionomycin stimuliert wurden (Abbildung 5.17).

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Ergebnisse

70

Abb. 5.17: Kinetik der Oberflächenexpression von ADAM17 während TZR-Stimulation. PHA-Blasten wurden mit TPA/Ionomycin bzw. immobilisierten monoklonalen Antikörpern gegen CD3/CD28 stimuliert. Anschließend wurden die Zellen mit einem direkt-konjugierten Antikörper gegen ADAM17 (Klon 111633) durchflusszytometrisch analysiert.

Die Aktivierung des TZR nach CD3/CD28-Stimulation führt zu intrazellulären

Signalkaskaden, die durch Mitglieder der Src-Tyrosinkinasen, insbesondere Lck und

Fyn, ausgelöst werden. Der Inhibitor PP1 reduziert die Aktivität von Src-Kinasen und

wurde eingesetzt, um den Einfluss der Src-Kinasen auf das TZR-vermittelte

Shedding des FasL zu untersuchen. Hierfür wurden PHA-Blasten (Tag 16)

unbehandelt belassen oder für eine Stunde mit 10 µM PP1 inkubiert und

anschließend mit plattengebundenen Antikörpern gegen CD3/CD28 stimuliert. Zu

den angegebenen Zeitpunkten wurden die Zellen lysiert und mittels Western Blot

bzw. die Zellkulturüberstände über ELISA analysiert. Durch Verwendung eines

polyklonalen Antikörpers gegen den intrazellulären Teil des FasL (N20) konnte in

unbehandelten Zellen im Western Blot die zuvor beobachtete Akkumulation von

NTFs nach 90-180 Minuten detektiert werden (Abbildung 5.18, linke Hälfte). Bei

Zellen, die vor der Stimulation mit PP1 behandelt wurden, war über die gesamte Zeit

der Aktivierung keine Bildung von NTFs zu sehen (Abbildung 5.18, rechte Hälfte).

Auch die Analyse der Bildung des löslichen FasL wies auf eine Hemmung der

Proteolyse durch PP1 hin (Abbildung 5.19). In unbehandelten Zellen konnten nach

90 Minuten ansteigende Mengen sFasL gemessen werden. Nach 150-180 Minuten

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0 30 60 90 120 150 180

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[min]

TPA/Ionomycin

CD3/CD28

mADAM17

Ergebnisse

71

stieg die Konzentration löslichen FasL im Überstand weiter an. In Überständen PP1-

behandelter Zellen war die sFasL-Konzentration über die gesamte Dauer der

Stimulation konstant und es konnte keine proteolytische Aktivierung beobachtet

werden (Abbildung 5.19).

Abb. 5.18: Die Inhibition von Src-Kinasen verhindert die CD3/CD28-induzierte Proteolyse des FasL. PHA-Blasten (Tag 16) wurden unbehandelt oder mit 10 µM PP1 inkubiert und anschließend mit plattengebundenen CD3/CD28-Antikörpern stimuliert. Nach den angegebenen Zeitintervallen wurden die Zellen lysiert und die Lysate elektrophoretisch aufgetrennt. Die Detektion des FasL erfolgte mit einem polyklonalen Antikörper gegen den intrazellulären Teil (N20). GAPDH diente als Ladekontrolle.

Abb. 5.19: Die Inhibition von Src-Kinasen verhindert die CD3/CD28-induzierte Proteolyse des FasL. PHA-Blasten (Tag 16) wurden unbehandelt oder mit 10 µM PP1 inkubiert und anschließend mit plattengebundenen CD3/CD28-Antikörpern stimuliert. Die Zellkulturüberstände wurden zu den angegebenen Zeitpunkten wurden mittels ELISA analysiert. Gezeigt ist ein repräsentatives Experiment mit den Mittelwerten aus Duplikaten.

0

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0 10 30 60 90 120 150 180

OD

(45

0 n

m/5

40

nm

)

CD3/CD28 [min]

sFasL

unbehandelt

PP1-behandelt

Ergebnisse

72

Die Aktivierung von T-Zellen mit monoklonalen Antikörpern gegen CD3 und CD28

resultierte in einem ähnlichen Anstieg der FasL-Proteolyse wie die Inkubation der

Zellen mit TPA und Ionomycin. Um zu analysieren, ob auch bei der TZR-vermittelten

Induktion des Sheddings ADAM10 die hauptverantwortliche Protease darstellt,

wurden PHA-Blasten transient mit siRNAs gegen ADAM10 und/oder ADAM17

transfiziert. Als Kontrollen dienten untransfizierte Zellen bzw. PHA-Blasten, die mit

Kontroll-RNA (scrRNA ADAM10) transfiziert wurden. 72 Stunden nach der

Transfektion wurden die Zellen mit immobilisierten Antikörpern gegen CD3/CD28

aktiviert. Nach 0, 60, 120 und 180 Minuten wurden die Zellen lysiert und

elektrophoretisch aufgetrennt. Die Bildung von NTFs wurde im Western Blot durch

Inkubation mit einem polyklonalen Antikörper gegen den intrazellulären Teil von FasL

(N20) überprüft (Abbildung 5.20).

Abb. 5.20: Die Herunterregulation von ADAM10 und ADAM17 reduziert die TZR-induzierte Proteolyse des FasL. PHA-Blasten wurden transient mit siRNA gegen ADAM10 und/oder ADAM17 bzw. mit Kontroll-RNA (scrRNA ADAM10) transfiziert. Nach 72 Stunden wurden die Zellen mit Hilfe von CD3/CD28-Antikörpern aktiviert, lysiert und über SDS-PAGE aufgetrennt. Die Detektion des FasL erfolgte mit einem polyklonalen Antikörper (N20). Die gleichmäßige Beladung wurde über den Nachweis von GAPDH überprüft.

Die Induktion der FasL-Proteolyse über CD3/CD28 führte in den untransfizierten und

Kontroll-transfizierten Zellen (scrRNA ADAM10) zu einer Anreicherung von NTFs in

den Lysaten innerhalb der dreistündigen Stimulation (Abbildung 5.20). Bei den

scrRNA-transfizierten Zellen wurden tendenziell mehr NTFs detektiert. Die

Ergebnisse

73

Transfektion von siRNAs gegen ADAM10 reduzierte die Bildung der NTFs verglichen

mit den beiden Kontrollen und resultierte in einer Akkumulation der unprozessierten

Form des FasL (37 kDa). Die Transfektion von spezifisch gegen ADAM17 gerichteten

siRNAs resultierte in einer stärkeren Minderung der FasL-Proteolyse und nach

180 Minuten war nur eine schwache Bande auf Höhe der NTFs detektierbar. Wurden

ADAM10- und ADAM17-spezifische siRNAs in Kombination transfiziert, wurde ein

additiver Effekt sichtbar und die Bildung von FasL-NTFs war deutlich verringert.

Sowohl bei ADAM17-siRNA als auch doppelt-transfizierten Zellen wurde keine

Akkumulation von der unprozessierten Form des FasL bei 37 kDa beobachtet

(Abbildung 5.20).

Die erfolgreiche Herunterregulation von ADAM10 und/oder ADAM17 wurde durch

Western Blot-Analysen der Lysate gezeigt (Abbildung 5.21). Während sowohl die

unreife als auch mature Form von ADAM10 in Lysaten ADAM10-siRNA-transfizierter

Zellen nahezu komplett herunterreguliert war, zeigte sich in Lysaten ADAM17-siRNA-

transfizierter Zellen hauptsächlich die Reduktion von unreifem ADAM17, während die

reife Form noch deutlich nachweisbar war (Abbildung 5.21).

Abb. 5.21: Effiziente Herunterregulation von ADAM10 und ADAM17 in siRNA-transfizierten PHA-Blasten. 72 h nach der Transfektion von siRNAs gegen ADAM10 bzw. ADAM17 und Kontroll-RNA (scrRNA) wurden die Zellen lysiert und elektrophoretisch aufgetrennt. Monoklonale Antikörper gegen ADAM10 (11G2), ADAM17 (A318) und ein polyklonales Antiserum gegen GAPDH (6C5) wurden zur Detektion eingesetzt.

Die Zellkulturüberstände wurden parallel mittels ELISA auf das Vorhandensein von

löslichem FasL überprüft (Abbildung 5.22). Wie erwartet wurde eine Induktion der

Proteolyse bei den Kontrollzellen nach 120-180 min beobachtet und der Gehalt

Ergebnisse

74

löslichen FasL in den Überständen stieg an. Zellen, in denen ADAM10

herunterreguliert war, generierten weniger sFasL. Die Reduktion der sFasL-

Produktion war erstaunlicherweise bei Behandlung mit ADAM17-siRNA verstärkt.

Nach Transfektion mit siRNAs gegen ADAM10 und ADAM17 war in den Überständen

die geringste Menge sFasL enthalten. Im Gegensatz zur Analyse der Zelllysate

(Abbildung 5.20) konnte in diesem Experiment für untransfizierte Zellen die höchste

Proteolyse des FasL gezeigt werden (Abbildung 5.22).

Abb. 5.22: Die Herunterregulation von ADAM10 und ADAM17 bewirkt eine Reduktion der FasL-Proteolyse. PHA-Blasten wurden nicht oder transient mit siRNA gegen ADAM10 und/oder ADAM17 bzw. mit Kontroll-RNA (scrRNA ADAM10) transfiziert. Nach 72 Stunden wurden die Zellen mit Hilfe von CD3/CD28-Antikörpern aktiviert. Löslicher FasL (sFasL) wurde in Zellkulturüberständen mittels ELISA detektiert. Gezeigt ist repräsentativ ein Experiment von drei Versuchen mit den Mittelwerten aus Duplikaten.

Zusammenfassung

Die Analyse der Expression und Aktivität von ADAM10 zeigte deutlich, dass eine

Stimulation von PHA-Blasten mit Phorbolester (TPA) und Kalziumionophor

(Ionomycin) nur wenig Einfluss auf die Oberflächenexpression nimmt. Lediglich ein

geringes Absinken wurde innerhalb der dreistündigen Stimulation gezeigt. Die

Aktivität von ADAM10 steigt durch die Stimulation jedoch und die verstärkte

proteolytische Prozessierung des FasL konnte über Bildung von sFasL und FasL-

NTFs nachgewiesen werden. Für die beobachtete Kinetik und den Anstieg der FasL-

Proteolyse müssen TPA und Ionomycin in Kombination eingesetzt werden, da die

einzelne Verwendung der beiden Stimuli nur geringe Änderungen bewirken. Für die

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 60 120 180

OD

(45

0 n

m/5

40

nm

)

CD3/CD28 [min]

untransfiziert

scrRNA

siRNA ADAM10

siRNA ADAM17

siRNA ADAM10+17

sFasL

Ergebnisse

75

Kinetik der ADAM17-Oberflächenexpression wurde ein rapider Anstieg nach

zehnminütiger Stimulation beobachtet, welche durch siRNA-Transfektion inhibiert

werden konnte. Durch Herunterregulation von ADAM10 und ADAM17 wurde zudem

verifiziert, dass ADAM10 im TPA/Ionomycin-induzierten Shedding die

hauptverantwortliche Protease des FasL darstellt. Durch Aktivierung des

TZR/CD3/CD28-Komplexes konnte weiterhin ein zusätzlicher Stimulus der

induzierten FasL-Proteolyse identifiziert werden. Diese Induktion kann durch

Hemmung von Src-Tyrosinkinasen blockiert werden. Im Falle des TZR-induzierten

FasL-Sheddings wurde durch siRNA-Transfektion nachgewiesen, dass sowohl

ADAM10 als auch ADAM17 eine Rolle als verantwortliche Protease bei der Spaltung

des FasL einnehmen.

5.2 Lokalisation von ADAM10, ADAM17 und FasL in T-Zellen

5.2.1 Lokalisation in sekretorischen Lysosomen

Der genaue Mechanismus der proteolytischen Prozessierung des FasL ist bisher

ungeklärt. Es ist bekannt, dass der FasL intrazellulär in Speichervesikeln, den

sogenannten sekretorischen Lysosomen, lokalisiert ist. Im Fall einer Aktivierung wird

der FasL aktinabhängig auf die Zelloberfläche transportiert und trägt in der

immunologischen Synapse zur Eliminierung der Zielzelle bei (Lettau et al., 2006).

Eine wichtige Frage ist, wann und wo sich Enzym (ADAM10/ADAM17) und Substrat

(FasL) treffen. Um eine mögliche intrazelluläre Kolokalisation von ADAM10 in

sekretorischen Lysosomen zu analysieren, wurden Organellen von PHA-Blasten

(Tag 17) durch differentielle Zentrifugation angereichert und nachfolgend eine

Dichtegradientenzentrifugation unterzogen. Nach der Zentrifugation konnten sechs

Fraktionen abgenommen werden, von denen jeweils 4 µg Protein mittels Western

Blot analysiert wurden. Die Fraktionen wurden einerseits auf die auf die Präsenz von

ADAM10 und ADAM17 überprüft, andererseits wurden einige Kompartiment-

spezifische Markerproteine angefärbt (Abbildung 5.23). Als Marker für sekretorische

Lysosomen diente der FasL (Lettau et al., 2007; Schmidt et al., 2009). Als weitere

Marker für Lysosomen wurden LAMP-1 sowie die zytotoxischen Proteine Granulysin

und Granzym B detektiert. Als Markerprotein des endoplasmatischen Retikulums

wurde BiP/Grp78 gefärbt. Peroxisomen wurde über Katalase und Mitochondrien über

CoxIV nachgewiesen (Abbildung 5.23).

Ergebnisse

76

Abb. 5.23: Nachweis von ADAM10 und ADAM17 in angereicherten sekretorischen Lysosomen. PHA-Blasten (Tag 17) wurden verwendet, um Organellen durch differentielle Zentrifugation anzureichern und durch eine anschließende Dichtegradientenzentrifugation zu fraktionieren. 4 µg der jeweiligen Fraktion bzw. des Gesamtlysates (GL) bzw. der angereicherten Organellen (AO) wurden mittels Western Blot analysiert.

Die differentielle Zentrifugation mit anschließendem Dichtegradienten resultierte in

der Separation sekretorischer Lysosomen in den oberen Fraktionen. Der FasL war in

der 2 nachweisbar, in denen auch ADAM10 und ADAM17 angereichert waren.

Weitere Markerproteine (LAMP-1, Granulysin) waren ebenfalls in Fraktion 2

vorhanden, wobei im Falle von Granulysin hier nur die unreife Form von 15 kDa

detektiert wurde. Die reife Form (9 kDa) war am stärksten in Fraktion 3,4 und 6 zu

sehen. Das zytotoxische Protein Granzym B wurde am stärksten in Fraktion 6

nachgewiesen und zu geringem Anteil in den Fraktionen 3 und 4. Die Anreicherung

sekretorischer Granula in Fraktion 1 und 2 wurde durch den Nachweis von

BiP/Grp78, CoxIV und Katalase überprüft. Das ER-Protein BiP/Grp78 war

hauptsächlich in Fraktion 3 lokalisiert, der Mitochondrien-Marker CoxIV zeigte die

stärkste Bande wie erwartet in Fraktion 5 (Schmidt et al., 2009) und geringer

ausgeprägte Banden in Fraktionen 4 und 6. Färben der Nitrozellulosemembran mit

Ergebnisse

77

einem Antikörper gegen den Peroxisomen-Marker Katalase führte zu leichten

Banden in allen Fraktionen, die stärkste Akkumulation war jedoch in Fraktion 4 zu

beobachten (Abbildung 5.23).

Um eventuelle Änderungen der Lokalisation von ADAM10, ADAM17 und des FasL in

sekretorischen Lysosomen nach TZR-Aktivierung zu untersuchen, wurden PHA-

Blasten vor der Lysosomenisolierung für 3 Minuten bei 37 °C mit anti-CD3 (OKT3)

und einem quervernetzenden Kaninchen-anti-Maus-Antikörper stimuliert. Nach der

Auftrennung in einzelne Fraktionen über einen Dichtegradienten wurden je 4 µg

Protein elektrophoretisch aufgetrennt und auf Nitrozellulosemembranen transferiert.

Anschließend erfolgte die Detektion von ADAM10, ADAM17 und der Markerproteine

für einzelne Fraktionen (hier FasL für sekretorische Lysosomen; Granzym B für

Lysosomen; CoxIV für Mitochondrien). Auch in diesen Gradienten wurde die

Lokalisation von ADAM10 in den Fraktionen 1-3 gezeigt. ADAM17 wurde

hauptsächlich in Fraktion 1 detektiert und auch der FasL zeigte hier die stärkste

Lokalisation (Abbildung 5.24A/B).

Abb. 5.24: Lokalisation von ADAM10 und ADAM17 in sekretorischen Lysosomen nach T-Zellrezeptorstimulation. PHA-Blasten (Tag 16) wurden mit anti-CD3 und dem kreuzvernetzenden Kaninchen-anti-Maus-Antikörper stimuliert (B). Anschließend wurden Organellen durch differentielle Zentrifugation angereichert und durch Dichtegradientenzentrifugation fraktioniert. Als Kontrolle wurden unstimulierte Zellen untersucht (A). 4 µg der jeweiligen Fraktion bzw. der angereicherten Organellen

(AO) bzw. des Gesamtlysates (GL) wurden mittels Western Blot analysiert.

Ergebnisse

78

Wurde der TZR der PHA-Blasten zuvor stimuliert, wurden bei der Detektion von

ADAM10 zusätzliche Banden bei etwa 150 kDa. Die Verteilung der reifen Form von

ADAM10 in den Fraktionen 1-3 änderte sich unter Stimulationsbedingungen nicht.

Reifes ADAM17 (80 kDa) wurde wie auch in den unstimulierten Zellen hauptsächlich

in der 1. Fraktion nachgewiesen, bei Stimulation der Zellen trat jedoch eine

zusätzliche Bande bei etwa 50 kDa in den Fraktionen 1-3 auf. Der FasL und die

anderen Markerproteine änderten ihre Lokalisation nicht (Abbildung 5.24B).

Zusammenfassung

Durch Verwendung eines OptiPrepTM-basierten Extraktionskit zur Anreicherung

sekretorischer Granula konnte gezeigt werden, dass ADAM10 und ADAM17 mit

Vesikeln der Fraktionen 1 und 2 assoziiert waren, die auch den FasL enthielten.

Durch den Nachweis verschiedener Markerproteine konnten weitere Fraktionen

spezifischen Organellen zugeordnet werden (CoxIV: Mitochondrien/Fraktion 5;

Granzym B, reifes Granulysin: dichte Granula/Fraktion 6). Basierend auf diesen

Ergebnissen könnte ein lysosomales Kompartiment bei einer intrazellulären

Prozessierung des FasL durch ADAM10/17 in Betracht gezogen werden.

5.2.2 Aktivierungsinduzierte Änderungen der Lokalisation

Da sowohl der FasL, als auch ADAM-Proteasen membranständig auf der Oberfläche

exprimiert werden, wird in den meisten Modellen als möglicher Ort der Proteolyse die

Zelloberfläche favorisiert. Während der Stimulation von T-Zellen mit TPA/Ionomycin

bzw. CD3/CD28-Antikörpern bleibt die Menge an membranständigem ADAM10

nahezu unverändert, die Aktivität jedoch steigt. Dies legte in Analogie zu Berichten in

der Literatur die Vermutung nahe, dass es aktivierungsinduzierte Änderungen der

Lokalisation von ADAM10 auf der Zelloberfläche geben könnte. Für den FasL wurde

bereits eine Lokalisation in Lipidmikrodomänen gezeigt, insbesondere im

Zusammenhang mit der Fas-Interaktion und Auslösung der Apoptose (Guardiola-

Serrano et al., 2010). Auch für Mitglieder der ADAM-Familie wurde berichtet, dass

eine differentielle Lokalisation von Substrat und Proteasen in verschiedenen

Bereichen der Plasmamembran die Proteolyserate beeinflusst. Für die Prozessierung

des FasL durch ADAM10 war bisher nicht bekannt, in welchen Bereichen der

Ergebnisse

79

Membran und unter welchen Umständen Enzym und Substrat aufeinandertreffen.

Mittels Dichtegradientenzentrifugation sollte deshalb untersucht werden, ob ADAM10

in T-Zellen eine Lokalisation in sogenannten Detergenz-resistenten Membranen

(DRMs, auch Lipid Rafts genannt) nachzuweisen ist und ob es

aktivierungsabhängige Änderungen der Lokalisation gibt. Nach einer Reihe von

widersprüchlichen Ergebnissen unter Verwendung kommerziell verfügbarer DRM-

Isolierungskits wurde die Isolation nach der im Material- und Methodenteil

beschriebenen klassischen Dichtegradientenzentrifugation durchgeführt. PHA-

Blasten (Tag 14) wurden hierfür unstimuliert oder nach vorheriger dreiminütiger

Stimulation mit dem monoklonalen anti-CD3-Antikörper (OKT3) und einem

quervernetzenden Zweitantikörper (rabbit-anti-mouse; RaM) in Lysepuffer mit Triton

X-100 lysiert. Nach Auftrennung über einen Sukrose-Dichtegradienten wurden

14 Fraktionen abgenommen und je 20 µl elektrophoretisch aufgetrennt. Nach

Transfer auf Nitrozellulosemembranen wurden ADAM10, ADAM17, FasL sowie

verschiedene Marker für leichte und schwere Membranfraktionen (DRM-Marker: Lck,

LAT (Linker for Activation of T cells); Nicht-DRM-Marker: GAPDH) detektiert.

Während in unstimulierten PHA-Blasten ADAM10 und ADAM17 nur in den unteren

Fraktionen größerer Dichte detektiert werden konnten (Abbildung 5.25A), zeigte sich

nach Stimulation des TZR eine Verschiebung zu den Fraktionen 7 und 8, die eine

geringere Dichte aufweisen (Abbildung 5.25B). Dies war sowohl für die reifen als

auch die unreifen Formen der Proteasen zu beobachten. Auch für den FasL konnte

gezeigt werden, dass nach TZR-Aktivierung mehr FasL in den leichten Fraktionen 6-

8 auftrat, während in unstimulierten Zellen hier nur relativ wenig FasL detektiert

werden konnte. Als Marker für DRMs diente die Tyrosinkinase Lck, die

bekannterweise mit leichten Fraktionen assoziiert ist, ebenso wie der DRM-Marker

LAT. GAPDH wird dagegen häufig als Markerprotein für schwere Fraktionen

verwendet. Beide DRM-Marker waren sowohl in unstimulierten als auch CD3-

stimulierten Proben in den leichten Fraktionen nachzuweisen (Abbildung 5.25A/B).

Die Aktivierung des TZR änderte die Verteilung innerhalb des Gradienten nicht. Der

Nicht-DRM-Marker GAPDH war in unstimulierten Zellen wie erwartet nur in den

schweren Fraktionen lokalisiert. Nach Stimulation mit anti-CD3 wurde jedoch auch für

GAPDH ein Auftreten in leichten Fraktionen beobachtet. Diese Verschiebung wurde

jedoch in nur wenigen Experimenten mit PHA-Blasten beobachtet.

Ergebnisse

80

Abb. 5.25: CD3-induzierte TZR-Stimulation führt zu einer aktivierungsinduzierten Verschiebung von ADAM10 und ADAM17 zu Detergenz-resistenten Membranen (DRMs). PHA-Blasten (Tag 14) wurden unstimuliert (A) oder nach Stimulation mit anti-CD3 und einem Kaninchen-anti-Maus-Antikörper (B) lysiert und über einen Sukrose-Dichtegradienten elektrophoretisch aufgetrennt. Über geeignete Antikörper wurden ADAM10 (11G2), ADAM17 (A318), FasL (N20), Lck (4/215), LAT (9166) und GAPDH (6C5) detektiert.

Auch in stabil mit dem FasL transfizierten Jurkat-Zellen (JFL) konnte eine

aktivierungsinduzierte Änderung der ADAM10-Lokalisation nachgewiesen werden. In

unstimulierten Zellen wurde ADAM10 hauptsächlich in Fraktionen mit großer Dichte

am Boden des Gradienten und nur in geringem Maß in den leichten Fraktionen 6-8

detektiert (Abbildung 5.26A). Durch Stimulation des TZR konnte eine verstärkte

Lokalisation von ADAM10 in Fraktionen geringerer Dichte beobachtet werden

(Abbildung 5.26B). In beiden Gradienten wurde lediglich die reife, aktive Form von

ADAM10 detektiert. Da in den verwendeten JFL-Zellen der FasL stabil überexprimiert

wird, ist er permanent der Proteolyse durch ADAM-Proteasen ausgesetzt und man

findet sowohl NTFs in Zelllysaten als auch löslichen FasL in den

Zellkulturüberständen (nicht gezeigt). Aus diesem Grund wurden in den Gradienten

größere Mengen FasL-NTFs und auch das unprozessierte Protein in den leichten

Fraktionen 6-8 nachgewiesen (Abbildung 5.26A). Nach Stimulation der Zellen wurde

eine starke Zunahme beider Formen des FasL in den leichten Fraktionen beobachtet.

Interessanterweise wurde zusätzlich zu dem verstärkten Vorkommen in Fraktion 6-8

auch ein Auftreten der NTFs in den Fraktionen 2 und 3 detektiert (Abbildung 5.26B).

Der DRM-Marker Lck zeigte sich sowohl in unstimulierten als auch stimulierten Zellen

Ergebnisse

81

in den Fraktionen 6-8 und der Nicht-DRM-Marker GAPDH wurde in beiden Ansätzen

nur in den hinteren Fraktionen 13 und 14 nachgewiesen.

Abb. 5.26: Aktivierungsinduzierte Lokalisation von ADAM10 und FasL zu Detergenz-resistenten Membranen (DRMs). Stabil mit FasL transfizierte Jurkat-Zellen (JFL) wurden mit anti-CD3 (OKT3) und einem Kaninchen-anti-Maus-Antikörper stimuliert (B). Kontrollzellen wurden in Zellkulturmedium inkubiert (A). Nach der Auftrennung über Sukrose-Dichtegradienten wurden die Fraktionen mittels Western Blot analysiert. Über geeignete Antikörper wurden ADAM10 (11G2), FasL (N20), Lck (4/215) und GAPDH (6C5) detektiert.

Da zuvor gezeigt wurde, dass der Src-Inhibitor PP1 die induzierte Proteolyse des

FasL verhindern kann und dass Src-verwandte Tyrosinkinasen vermehrt an der

inneren Plasmamembran assoziieren, sollte im Folgenden analysiert werden, ob die

aktivierungsinduzierte Änderung der Lokalisation von ADAM10, ADAM17 und des

FasL ebenfalls durch PP1 blockiert wird. JFL-Zellen wurden dazu entweder

unbehandelt oder mit 10 µM PP1 eine Stunde bei 37 °C inkubiert und anschließend

wie zuvor beschrieben stimuliert. Nach der Lyse und Fraktionierung über

Dichtegradienten wurden die erhaltenen Fraktionen mittels Western Blot analysiert.

Die CD3-bedingte Änderung der Lokalisation von ADAM10, ADAM17 und des FasL

wurde in diesem Versuch verifiziert, da erneut eine Verschiebung von den schweren

(11-14) zu leichteren Fraktionen (6-9) zu beobachten war (Abbildung 5.27A/B). Dies

war besonders deutlich im Fall der reifen Form von ADAM10 zu sehen, jedoch wurde

auch die unreife Form in den Fraktionen 7 und 8 detektiert. ADAM17 wurde in

diesem Experiment auch in unstimulierten Zellen in DRM-Fraktionen detektiert, nach

Aktivierung des TZR jedoch deutlich vermehrt (Abbildung 5.27A/B).

Ergebnisse

82

Abb. 5.27: Die Inhibition von Src-Kinasen verhindert anti-CD3-induzierte Lokalisationsänderungen von ADAM10 und FasL. JFL-Zellen wurden in Medium (B) oder mit 10 µM PP1 vorinkubiert (C) und anschließend mit anti-CD3 (OKT3) und Kaninchen-anti-Maus stimuliert. Als Kontrolle dienten unbehandelte, unstimulierte Zellen (A). Nach der Auftrennung über Sukrose-Dichtegradienten wurden die Fraktionen im Western Blot durch geeignete Antikörper auf Vorhandensein von ADAM10 (11G2), ADAM17 (H300), FasL (N20), Lck (4/215) und GAPDH (6C5) überprüft.

Ergebnisse

83

Auch der unprozessierte FasL wurde nach Stimulation der Zellen mit OKT3 verstärkt

in Fraktionen geringerer Dichte nachgewiesen (7-9) und NTFs wurden schwach in

den Fraktionen 6 und 7 detektiert (Abbildung 5.27B).Durch die Vorbehandlung der

Zellen mit PP1 fiel die aktivierungsinduzierte Verschiebung in leichte Fraktionen

weniger stark aus und reifes ADAM10 sowie ADAM17 waren (waren bis auf leichte

Banden in den Fraktionen 6 und 7) kaum noch nachzuweisen. Unreifes ADAM10

wurde nicht detektiert (Abbildung 5.27C). Auch der unprozessierte FasL war in den

leichten Fraktionen 6 und 7 reduziert, NTFs wurden nicht mehr detektiert. Der DRM-

Marker Lck wurde in allen drei Gradienten in leichten Fraktionen nachgewiesen und

zeigte durch PP1-Behandlung keine Änderung der Verteilung. GAPDH zeigte eine

leichte Verschiebung zu leichteren Fraktionen nach Stimulation (Abbildung 5.27).

5.2.3 Einfluss der Cholesteroldepletion und Inhibierung posttranslationaler

Modifikationen auf die CD3/CD28-vermittelte Proteolyse des FasL

Nach der Aktivierung von T-Zellen konnte eine Verschiebung von ADAM10, ADAM17

und FasL von schweren Fraktionen zu leichten Lipidmikrodomänen beobachtet

werden. Diese Domänen zeichnen sich durch eine Anreicherung von Cholesterol und

Sphingolipiden aus. Voraussetzungen einer Lokalisation von Proteinen in lipidreichen

Regionen (Lipid Rafts) sind unter anderem posttranslationale Modifikationen wie z.B.

Palmitoylierung (Addition einer Palmitinsäure/Palmitat an Cysteinreste),

Myristoylierungen (Addition einer Myristinsäure/Myristat an N-terminale Glycinreste)

oder GPI-Anker (Addition eines Glycosylphosphatidylinositol-Ankers an den C-

Terminus eines Proteins). Um die aktivierungsinduzierte Translokation von ADAM10

und FasL näher zu untersuchen, wurde einerseits der Effekt der Cholesteroldepletion

durch Methyl--Cyclodextrin (MβCD) analysiert und weiterhin Inhibitoren der

Palmitoylierung und Myristoylierung verwendet. Dadurch sollten posttranslationale

Modifikationen identifiziert werden, die für die Lokalisation des FasL, ADAM10 und

ADAM17 in Lipidmikrodomänen von Bedeutung sind.

Um sicherzustellen, dass es sich bei den gezeigten leichten Fraktionen der

Dichtegradienten um lipidhaltige, Cholesterol-angereicherte Bereiche der

Zellmembran handelt, wurden Zellen vor der Stimulation mit MβCD behandelt und

anschließend stimuliert. MβCD depletiert zelluläres Cholesterol aus der Zellmembran

Ergebnisse

84

und führt hierdurch zur Auflösung der Signalplattformen. JFL-Zellen wurden in An-

oder Abwesenheit von 10 mM MβCD bei 37 °C vorinkubiert. Anschließend wurden

die Zellen stimuliert und lysiert. Als Kontrolle dienten Zellen, die weder behandelt

noch stimuliert wurden. Nach Auftrennung der Lysate über Dichtegradienten wurden

die einzelnen Fraktionen mittels Western Blot analysiert. Bereits in unstimulierten,

unbehandelten T-Zellen (hier FasL-transfizierte Jurkat-Zellen) wurde ADAM10 und

auch die verschiedenen Formen des FasL in leichten Fraktionen detektiert (Abb.

5.28A).

Abb. 5.28: Depletion von Cholesterol reduziert die induzierte DRM-Lokalisation von ADAM10

und FasL. JFL-Zellen wurden in Medium (B) oder mit 10 mM MCD inkubiert (C) und anschließend mit anti-CD3 (OKT3) und Kaninchen-anti-Maus stimuliert. Als Kontrolle dienten unbehandelte, unstimulierte Zellen (A). Nach der Auftrennung über Sukrose-Dichtegradienten wurden die Fraktionen im Western Blot durch geeignete Antikörper auf Vorhandensein von ADAM10 (11G2), FasL (N20) und Lck (4/215) überprüft.

Ergebnisse

85

Wie zuvor beschrieben (Abbildung 5.26) zeigte sich in unbehandelten Zellen, die mit

OKT3 stimuliert wurden, eine Anreicherung von ADAM10 und dem FasL (volle Länge

und NTFs) in den Fraktionen 6-8 (Abbildung 5.28B). Wurden die Zellen jedoch vor

der Stimulation mit MβCD behandelt, wurde eine geringere aktivierungsinduzierte

Änderung der Lokalisation detektiert. Die erfolgreiche MβCD-Behandlung mit

Cholesteroldepletion und Auflösung der Lipidplattformen konnte durch Detektion des

DRM-Markers Lck in MβCD-behandelten Zellen nachgewiesen werden. Hier wurde

im Vergleich zu unbehandelten Zellen weniger Lck in leichten Fraktionen und mehr in

schweren Fraktionen am Boden des Gradienten detektiert (Abbildung 5.28C).

In vorhergehenden Studien wurde gezeigt, dass die Lokalisation des FasL in Lipid

Rafts stark von seinem Palmitoylierungszustand abhängt (Guardiola-Serrano et al.,

2010). 2-Brompalmitat (2BP) inhibiert die Addition von Palmitinsäuren durch

Palmitoyltransferasen, was eventuell den Verlust der Raft-Lokalisation zur Folge hat.

Der Einfluss der fehlenden Palmitoylierung nach Zugabe von 2BP auf die CD3-

induzierten Lokalisationsänderungen von ADAM10, ADAM17 und FasL in DRMs

sollte im Folgenden analysiert werden. PHA-Blasten (Tag 14) wurden für 2 Stunden

entweder in Medium oder mit 100 µM 2BP bei 37 °C vorinkubiert. Anschließend

wurde der TZR über Verwendung des monoklonalen Antikörpers OKT3 aktiviert. Als

Kontrolle wurden unbehandelte, unstimulierte Zellen verwendet. Nach der Sukrose-

Dichtegradientenzentrifugation wurden die erhaltenen Fraktionen mittels Western

Blot analysiert (Abbildung 5.29). In Kontrollzellen wurden ADAM10 und ADAM17

wieder hauptsächlich in schweren Fraktionen detektiert, während der FasL deutlich in

leichten Fraktionen (7, 8), sowie der DRM-Marker Lck in den Fraktionen 6-8

nachweisbar war (Abbildung 5.29A). Nach Stimulation der Zellen wurde die zuvor

beschriebene Lokalisationsänderung von ADAM10, ADAM17 und dem FasL

beobachtet und die drei Proteine traten verstärkt in leichten Fraktionen auf

(Abbildung 5.29B). Die Behandlung der Zellen mit 2BP ergab nach TZR-Aktivierung

keine Veränderung der Positionierung. Die Src-Kinase Lck zeigte hingegen eine

weitaus geringere Abundanz in leichten Fraktionen (Abbildung 5.29C).

Ergebnisse

86

Abb. 5.29: Die Inhibition der Palmitoylierung reduziert die Translokation von ADAM10 zu DRMs. PHA-Blasten (Tag 14) wurden in Medium (B) oder mit 100 µM 2-Brompalmitat (2BP) (C) inkubiert und anschließend mit anti-CD3 (OKT3) und Kaninchen-anti-Maus stimuliert. Als Kontrolle dienten unbehandelte, unstimulierte Zellen (A). Nach der Auftrennung über Sukrose-Dichtegradienten wurden die Fraktionen im Western Blot durch geeignete Antikörper auf Vorhandensein von ADAM10 (11G2), FasL (N20) und Lck (4/215) überprüft.

Eine weitere posttranslationale Modifikation, die die Lokalisation von

Transmembranproteinen in Lipidmikrodomänen fördern kann, ist die Addition eines

Myristats an N-terminale Glycinreste. Diese Modifikation kann durch 2-

Hydroxymyristylsäure (2HMA) blockiert werden. Um den Effekt fehlender

Myristoylierungen auf die CD3-induzierte Lokalisation von ADAM10 und dem FasL in

DRMs zu untersuchen, wurden CD4+-T-Zellen (Klon 12632) entweder in

Ergebnisse

87

Zellkulturmedium oder in Medium mit 100 µM 2HMA über zwei Stunden bei 37 °C

inkubiert, bevor sie mit OKT3 stimuliert wurden. Als Kontrolle dienten unbehandelte,

unstimulierte Zellen. Nach Auftrennung in einzelne Fraktionen über Dichtegradienten

wurden ADAM10, FasL, Lck und GAPDH mit Hilfe geeigneter Antikörper detektiert

(Abbildung 5.30).

Abb. 5.30: Effekt der Inhibition von Myristoylierungen auf die CD3-induzierte Translokation von ADAM10 und dem FasL zu DRMs. CD4

+-T-Zellen (Klon 12632) wurden in Medium (B) oder mit

100 µM 2-Hydroxymyristylsäure (2HMA) (C) für 2 h bei 37 °C inkubiert, bevor sie mit anti-CD3 (OKT3) und Kaninchen-anti-Maus stimuliert wurden. Als Kontrolle dienten unbehandelte, unstimulierte Zellen (A). Nach der Auftrennung über Dichtegradienten wurden die Fraktionen im Western Blot durch geeignete Antikörper auf Vorhandensein von ADAM10 (11G2), FasL (N20), Lck (4/215) und GAPDH (6C5) überprüft.

Ergebnisse

88

In unbehandelten, unstimulierten Zellen wurde unreifes ADAM10 ausschließlich und

reifes ADAM10 hauptsächlich in Fraktionen hoher Dichte am Boden des Gradienten

detektiert. Lediglich eine schwache Bande wies auf die mögliche Lokalisation von

reifem ADAM10 in leichten Fraktionen hin. Der FasL und der DRM-Marker Lck

hingegen wurden deutlich in Fraktionen geringerer Dichte nachgewiesen. Der Nicht-

DRM-Marker GAPDH wurde nur in schweren Fraktionen detektiert

(Abbildung 5.30A). Wie zuvor für PHA-Blasten und Jurkat-Zellen gezeigt, wurde auch

bei dem CD4+-T-Zellklon nach Stimulation mit anti-CD3 eine Verschiebung von

ADAM10 von schweren zu leichten Fraktionen beobachtet und auch der FasL zeigte

eine verstärkte Lokalisation in oberen Schichten des Gradientes. Interessanterweise

wurde in stimulierten Zellen bei der Detektion von ADAM10 eine Doppelbande bei

etwa 180 kDa sichtbar. Die Verteilung von Lck und GAPDH änderte sich durch die

Aktivierung des TZR nicht wesentlich (Abbildung 5.30A/B). Wurden die CD4+-T-

Zellen vor der Stimulation mit 2HMA behandelt, wurde die aktivierungsinduzierte

Translokation von ADAM10 und FasL dennoch beobachtet, sie schien sogar leicht

verstärkt zu sein (Abbildung 5.30C). Auch Lck wies ein verstärktes Vorkommen in

Fraktionen geringer Dichte auf. Die Verteilung von GAPDH änderte sich auch unter

diesen Bedingungen nicht (Abbildung 5.30C).

Die verschiedenen Inhibitoren zeigten auf die CD3-induzierte Translokation von

ADAM10 und dem FasL unterschiedliche Auswirkungen. MβCD und 2BP reduzierten

die Lokalisation in leichten Fraktionen in stimulierten Zellen, während 2HMA keinen

oder sogar verstärkenden Einfluss nahm. In der Folge sollte daher geklärt werden, ob

der Einsatz derselben Inhibitoren zu einer veränderten Proteolyserate führt. CD4+-T-

Zellen (Klon 12632) wurden 30 Minuten mit 5 mM MβCD bzw. 2 Stunden mit 100 µM

2BP oder 100 µM 2HMA oder je 100 µM 2BP und 2HMA in Kombination inkubiert.

Als Kontrolle wurden Zellen verwendet, die in Kulturmedium bzw. DMSO verdünnt in

Medium über dieselbe Zeit inkubiert wurden. Anschließend wurden je 2,5x106 Zellen

auf plattengebundene anti-CD3/CD28-Antikörper gegeben und über die angegeben

Zeitintervalle stimuliert. Die Zellen wurden lysiert und elektrophoretisch aufgetrennt.

Nach dem Transfer auf eine Nitrozellulosemembran wurde der FasL mit Hilfe eines

polyklonalen Antikörpers (N20) detektiert (Abbildung 5.31). Die entsprechenden

Zellkulturüberstände wurden mittels ELISA analysiert (Abbildung 5.32). Von jedem

Ansatz wurde zudem die Vitalität unstimulierter Zellen und von Zellen nach

180 Minuten Stimulation mittels Propidiumiodid-(PI-)Färbung überprüft

Ergebnisse

89

(Abbildung 5.33). Die Western Blot-Analyse der Zelllysate ergab hohe Levels an

FasL-NTFs in unbehandelten, DMSO- und 2HMA-behandelten Zellen nach

120 Minuten mit einem Maximum nach 180 Minuten (Abbildung 5.31). Im Vergleich

hierzu waren bei MβCD- und 2BP-behandelten Zellen weniger FasL-NTFs

nachweisbar, wobei die Behandlung von MβCD die Proteolyse des FasL deutlicher

reduzierte und nur wenig NTFs detektiert werden konnten. Die Kombination aus 2BP

und 2HMA resultierte in der größten Hemmung der FasL-Prozessierung, da hier

nahezu keine Bildung von FasL-NTFs beobachtet werden konnte (Abbildung 5.31).

Abb. 5.31: Effekt verschiedener Inhibitoren auf die CD3-induzierte Proteolyse des FasL. CD4+-

T-Zellen (Klon 12632) wurden mit 5 mM Methyl-β-Cyclodextrin (MβCD), 100 µM 2-Hydroxymyristylsäure (2HMA), 100 µM 2-Brompalmitat (2BP) oder je 100 µM 2HMA und 2BP behandelt, bevor sie mit immobilisiertem anti-CD3 und anti-CD28 stimuliert wurden. Als Kontrolle dienten unbehandelte bzw. DMSO-behandelte Zellen. Nach den angegebenen Zeitintervallen wurden die Zellen lysiert und mittels Western Blot analysiert. FasL wurde mit einem polyklonalen Antikörper (N20) detektiert. GAPDH (Antikörper 6C5) diente als Ladekontrolle.

Die quantitative Auswertung von löslichem FasL in den Zellkulturüberständen

bestätigte das Ergebnis. In den Kontrollen und 2HMA-behandelten Zellen wurden

große Mengen sFasL detektiert, bei MβCD-behandelten Cholesterol-depletierten

Zellen war diese Menge reduziert. Zellen, bei denen durch 2BP die Palmitoylierung

inhibiert worden war, produzierten noch geringere Mengen löslichen FasL und bei

der Kombination von 2BP mit 2HMA war die stärkste Inhibition der Proteolyse zu

vermuten (Abbildung 5.32).

Ergebnisse

90

Abb. 5.32: Cholesteroldepletion und Hemmung von Palmitoylierung reduzieren die Proteolyse des FasL. PHA-Blasten wurden unbehandelt, mit 5 mM Methyl-beta-Cyclodextrin (MβCD), 100 µM 2-Bromopalmitat (2BP), 100 µM 2-Hydroxymyristylsäure (2HMA) oder je 100 µM 2BP und 2HMA zusammen inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit immobilisierten anti-CD3/CD28-Antikörpern zu den angegebenen Zeitintervallen stimuliert. Löslicher FasL (sFasL) wurde in Zellkulturüberständen mittels ELISA detektiert. Gezeigt ist repräsentativ ein Experiment von drei Versuchen mit den Mittelwerten aus Duplikaten.

Um zu überprüfen, ob die Inhibitoren und die anschließende Aktivierung des TZR zur

Apoptose der Zellen führen und dadurch das Ergebnis verfälscht werden könnte,

sollte mittels PI-Färbung der Anteil toter Zellen bestimmt werden. Unstimulierte

Zellen bzw. Zellen, die 180 Minuten stimuliert wurden, wurden mit PI-Lösung

inkubiert und anschließend durchflusszytometrisch gemessen (Abbildung 5.33). Die

Analyse zeigte, dass bereits in unbehandelten und DMSO-behandelten Zellen ein

minimaler Anstieg der Apoptose durch die CD3/CD28-Behandlung erfolgt. Wurden

die Zellen mit 5 mM MβCD behandelt, waren bereits nach der Vorinkubation doppelt

so viele tote Zellen nachweisbar. Die Stimulation MβCD-behandelter Zellen durch

anti-CD3/anti-CD28 steigerte die Zelltodrate allerdings nicht. Die Inkubation mit dem

Myristoylierungsinhibitor 2HMA führte nur zu leicht verstärktem Zelltod in

unstimulierten Zellen. Nach dreistündiger Stimulation mit anti-CD3/anti-CD28

verdoppelte sich jedoch auch dieser Wert. Einen negativen Effekt auf die Vitalität

zeigte auch die Behandlung mit dem Palmitoylierungsinhibitor 2BP, der in

unstimulierten Zellen zu einer Verdopplung der Anzahl toter Zellen führte. Nach drei

Stunden CD3/CD28-Stimulation verstärkte sich dieser Effekt jedoch nur leicht.

Interessanterweise resultierte die kombinierte Verwendung von 2BP und 2HMA nur

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 60 120 180

OD

(45

0 n

m/5

40

nm

)

CD3/CD28 [min]

unbehandelt DMSO

MβCD 2HMA

2BP 2HMA+2BP

sFasL

Ergebnisse

91

in einem geringen Anstieg der PI-positiven Zellen und auch die Stimulation mit anti-

CD3/CD28 erhöhte die Apoptose in den 2BP-/2HMA-behandelten Zellen nur leicht

(Abbildung 5.33). Insgesamt lässt sich festhalten, dass die Inhibitoren einen

moderaten Einfluss auf die Zellvitalität über den Zeitraum der Stimulation hatten.

Abb. 5.33: Einfluss von Cholesteroldepletion und Inhibitoren von Palmitoylierung und Myristoylierung auf die Viabilität von PHA-Blasten. Die Zellen wurden mit 5 mM Methyl-beta-

Cyclodextrin (M CD), 100 µM 2-Hydroxymyristylsäure (2HMA), 100 µM 2-Brompalmitat (2BP) oder der Kombination aus 2HMA und 2BP behandelt und anschließend 180 Minuten mit monoklonalen Antikörpern gegen CD3 und CD28 stimuliert. Unbehandelte und DMSO-behandelte Zellen wurden als Kontrollen analysiert. Der Anteil toter Zellen wurde mittels Propidiumiodid-Färbung durchflusszytometrisch ermittelt.

Die Behandlung von T-Zellen mit den verschiedenen Inhibitoren hatte außerdem

keinen Einfluss auf die Aktivierbarkeit des TZR/CD3/CD28-Komplexes, wie durch

Analyse des Phosphorylierungsstatus mittels Western Blot nachgewiesen wurde

(Abbildung 5.34). CD4+-T-Zellen, die mit den entsprechenden Inhibitoren vorinkubiert

wurden, zeigten bei kurzzeitiger Stimulation durch Verwendung des anti-CD3-

Antikörpers (OKT3) und quervernetzenden Kaninchen-anti-Maus-Antikörpers

ähnliche Bandenmuster phosphorylierter Tyrosine wie unbehandelte Zellen

(Abbildung 5.34). Wurden die Zellen zur Kontrolle mit Medium oder nur mit dem

Kaninchen-anti-Maus-Antikörper stimuliert, gab es keine bzw. wenig Änderungen

bezüglich des Phosphorylierungsstatus.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Ve

rlu

st

der

Mem

bra

nin

teg

ritä

t [%

]

Ergebnisse

92

Abb. 5.34: Einfluss von Cholesteroldepletion und Inhibitoren von Palmitoylierung und Myristoylierung auf die Aktivierbarkeit des TZR/CD3-Komplexes. CD4

+-T-Zellen (Klon 12632)

wurden mit 5 mM Methyl-beta-Cyclodextrin (M CD), 100 µM 2-Hydroxymyristylsäure (2HMA), 100 µM 2-Brompalmitat (2BP) oder der Kombination aus 2HMA und 2BP behandelt und anschließend über die angegeben Zeitintervalle mit anti-CD3 (OKT3) und Kaninchen-anti-Maus stimuliert. Als Negativkontrollen wurden die Zellen mit Medium bzw. Kaninchen-anti-Maus inkubiert.

Die zuvor beobachteten Lokalisationsänderungen von ADAM10 und ADAM17 nach

T-Zellrezeptorstimulation sollten weiterhin durch Immunfluoreszenzanalysen belegt

werden. Für ADAM17 ist jedoch derzeit kein geeigneter direkt-markierter Antikörper

verfügbar, weshalb diesbezüglich bisher keine weiteren Analysen durchgeführt

Ergebnisse

93

werden konnten. Die Lokalisation von ADAM10 wurde in unstimulierten bzw. CD3-

aktivierten Jurkat-Zellen (JFL) mit einem monoklonalen Antikörper gegen ADAM10

gezeigt. Zur Stimulation wurden die Zellen 3 Minuten bei 37 °C mit OKT3 und

Kaninchen-α-Maus stimuliert. Die Färbung der Zellen erfolgte mit dem PE-

konjugierten ADAM10-spezifischen Antikörper bzw. einer entsprechenden

Isotypkontrolle. Anschließend erfolgte die Analyse am konfokalen Mikroskop

(Abbildung 5.35). In unstimulierten Zellen wurde wenig ADAM10 auf der

Zelloberfläche gefunden und eine diffuse Verteilung wurde beobachtet. Nach TZR-

Stimulation schien die Expression auf der Oberfläche verstärkt und ADAM10 wurde

in einzelnen kompakteren Arealen detektiert (Abbildung 5.35).

Abb. 5.35: Oberflächenexpression von ADAM10 in TZR-stimulierten Zellen. Membranständiges ADAM10 wurde in unstimulierten und CD3-stimulierten Jurkat-Zellen mit einem spezifischen Antikörper gegen humanes ADAM10 (SHM14) detektiert. Als Kontrolle wurden Zellen mit der entsprechenden Isotypkontrolle gefärbt. Maßstab 10 µM.

Ergebnisse

94

Zusammenfassung

In unstimulierten T-Zellen wurden ADAM10 und ADAM17 vor allem in Fraktionen

großer Dichte nachgewiesen (Nicht-DRMs). Nach Stimulation des TZR/CD3-

Komplexes jedoch wurde eine aktivierungsinduzierte Änderung der Lokalisation zu

Fraktionen geringer Dichte (DRMs) gezeigt. Diese Verschiebung ist abhängig von

Src-Kinasen, da der Einsatz des Inhibitors PP1 diese Lokalisationsänderung

unterbindet. Cholesteroldepletion durch MβCD führte zusätzlich zum Verlust der

Verschiebung in Analysen stimulierter Zellen. Inhibition von Palmitoylierungen (2BP)

oder Myristoylierungen (2HMA) konnte kein Effekt auf die Lokalisation von ADAM10,

ADAM17 und des FasL beobachtet werden. MβCD- und 2BP-behandelte Zellen

wiesen eine geringere proteolytische Prozessierung des FasL nach Stimulation mit

anti-CD3/CD28 auf, während 2HMA keinen Effekt zeigte.

5.3 Interaktionspartner der intrazellulären Domäne von ADAM10

5.3.1 Identifizierte präzipitierte SH3-Domänen einer Phagenbibliothek

ADAM10 enthält in seiner intrazellulären Domäne zwei Prolin-reiche Regionen (AS

708-717 und 722-728), die mögliche Interaktionen mit SH3-Domäne-Proteinen

nahelegen. In Vorarbeiten im Rahmen meiner Diplomarbeit wurde bereits ein erstes

Screening einer Phagenbibliothek zur Identifizierung interagierender SH3-Domänen

von ADAM10 durchgeführt (Diplomarbeit H. Oberdoerster, 2010). Die verwendete

Phagenbibliothek enthält alle 305 bekannten humanen SH3-Domänen, welche an

das Hüllprotein pVIII von M13-Phagen fusioniert sind und so auf der

Phagenoberfläche exprimiert werden. Durch Bindung der SH3-Domäne an das

Fusionsprotein GST-hADAM10(697-748), welches die gesamte intrazelluläre

Domäne von humanem ADAM10 enthält, werden Phagen mit interagierenden SH3-

Domäne präzipitiert und können anschließend durch Sequenzierung identifiziert

werden. Im ersten Ansatz konnten 22 SH3-Domänen als potentielle Interaktoren der

intrazellulären Region von ADAM10 identifiziert werden (Abbildung 1.4). In der

vorliegenden Arbeit sollte ein komplementäres Screening zur Verifizierung

durchgeführt werden. Magnetische Beads wurden mit GST-hADAM10(697-748) oder

GST als Kontrolle beschichtet und mit den Phagen inkubiert. Beads mit gebundenen

Phagen wurden pelletiert und nach stringentem Waschen wurden die Phagen eluiert

Ergebnisse

95

und kompetente TG1-Bakterien transduziert. Nach Isolation der DNA und

anschließender Sequenzierung konnten potentiell interagierende SH3-Domänen über

Verwendung des Swiss-Prot-Servers mit dem BLAST-Programm identifiziert werden.

In diesem Ansatz wurden insgesamt 133 Klone sequenziert und identifiziert, 37 Klone

von GST-Präzipitaten und 96 Klone von GST-hADAM10(697-748)-Präzipitaten.

Zusammen mit dem ersten Ansatz wurden 75 Sequenzierungen von Präzipitaten mit

dem GST-Kontrollprotein sowie 216 von Präzipitaten mit GST-hADAM10(697-748)

durchgeführt. Insgesamt wurden 38 SH3-Domänen identifiziert, die ausschließlich mit

GST-hADAM10(697-748), nicht aber mit dem GST-Kontrollprotein interagierten

(Abbildung 5.36; Tabelle 5.1). Einige SH3-Domänen wurden hierbei mehrmals,

andere jedoch nur ein- oder zweimal identifiziert.

Abb. 5.36: Mit dem Zielprotein GST-hADAM10(697-748) präzipitierte SH3-Domänen. Auf M13-Phagen exprimierte SH3-Domänen, die von GST-hADAM10(697-748) und nicht dem Kontrollprotein GST gebunden wurden, wurden sequenziert und identifiziert.

Am häufigsten wurde Endophilin-A2 (8 Klone), Lck (5 Klone) und ZDHHC6 (3 Klone)

identifiziert. Für das Kontrollprotein GST wurden auch eine Vielzahl von SH3-

Domänen präzipitiert (siehe Anhang Tabelle A1). In der weiteren Analyse wurden

jedoch potentielle Interaktionen mit SH3-Domänen, die mit GST allein und mit GST

und GST-hADAM10(697-748) präzipitiert worden waren, nicht weiter untersucht.

Ergebnisse

96

Tab. 5.1: GST-hADAM10(697-748)-präzipitierte SH3-Domänen: Funktionen und Lokalisation der jeweiligen potentiellen Bindungspartner (adaptiert von der UniProt-Protein-Datenbank (UniprotKB); modifiziert nach Ebsen et al., 2014).

Name des Proteins Uniprot-

Nr. Treffer Funktion des Proteins Lokalisation

Endophilin-A2 Q99961 8 Endozytose, Podosomen Zyt1, PM, Endo, Podo

Lck P06239 5 Src-Tyrosinkinase Zyt, PM, LR

ZDHHC6 Q9H6R6 3 Palmitoylierungstransferase ER

Growth factor receptor binding protein 2

P62993 2 Adapter (Ras-Signalweg) Zyt, Endo, Nuk, Golgi

HS1/HCLS1/LckBP1 P14317 2 Adapter (Lck-Signalweg) PM, Zyt, Mito

SH3 domain protein 7, HIP-55

Q9UJU6 2 Adapter, Endozytose Zyt, ZK, PM, Golgi, ER, Podo

Otoraplin Q9NRC9 2 unbekannt sekretiert

Dedicator of cytokinesis protein 4

Q8N1I0 2 Migration, GTP-Austauschfaktor

EMS, Zyt

SH3 domain protein 21 A4FU49 2 unbekannt unbekannt

RUN and SH3 domain-containing protein 1

Q9BVN2 2 Adapter, Zytoskelett Zyt, Endo, Golgi

Rho GEF 38 Q9NXL2 2 GTP-Austauschfaktor Zyt

PKC and CK substrate in neurons 3

Q9UKS6 1 Endozytose Zyt, PM

GRB2-related adaptor protein 2

O75791 1 Adapterprotein (LAT, SLP-76)

Zyt, Nuk, Endo

c-Src P12931 1 Tyrosinkinase Zyt, PM, Nuk, Mito

c-Abl P00519 1 Tyrosinkinase, Zytoskelett Zyt, Nuk, Mito

Sorting nexin 18 Q96RF0 1 Endozytose, Vesikeltransport

PM, Zyt, Endo

Adaptor protein crk (c-Crk)

P46108 1 Adapterprotein, Aktinzytoskelett

Zyt, PM

Rho GEF 19 Q8IW93 1 GTP-Austauschfaktor, Zytoskelett

Zyt

Peroxin-13 Q92968 1 peroxisomaler Import Peroxisomen

Ephexin-1 Q8N5V2 1 GTP-Austauschfaktor Zyt, PM, Wachstumskegel

Rho GAP 32, RICS protein

A7KAX9 1 GTPase-aktivierendes Protein

Zyt, ZK, PM, Golgi, ER, Endo

ARHGEF16, Ephexin-4 Q5VV41 1 GTP-Austauschfaktor Zyt

Growth arrest-specific protein 7

O60861 1 neuronale Differenzierung Zyt

unconventional myosin1E Q12965 1 Zytoskelett Zyt, ZK

Rho GEF 4 Q9NR80 1 GTP-Austauschfaktor Zyt, PM

Vinexin SH3 #2 O60504 1 Zytoskelett Zyt, ZK, Nuk

Vinexin SH3 #3 O60504 1 Zytoskelett Zyt, ZK, Nuk

Ergebnisse

97

RIMS Binding protein 3A Q9UFD9 1 unbekannt unbekannt

Rho GAP 33, Sorting nexin 26

O14559 1 Proteintransport Zyt, PM

LIM and SH3 domain protein 1

Q14847 1 Adhäsion, Zytoskelett Zyt

unconventional myosin VIIa

Q13402 1 Zytoskelett, intrazelluläre Bewegung

Zyt

Disks large homolog 1 Q12959 1 Scaffoldprotein ER; PM, ZK

Erythroid α spectrin P02549 1 Zellform, Aktinzytoskelett Zyt

non erythroid α spectrin (fodrin)

Q13813 1 Ca2+

-abhängige Bewegung Zyt

SH3 domain-containing protein 19, Eve-1

Q5HYK7 1 Zellmorphologie, Zytoskelett Zyt, Nuk

RIMS Binding protein 2 O15034 1 synaptische Transmission PM, ZK

peripheral PM protein CASK

O14936 1 Calmodulin-abhängige Serinkinase

PM, Zyt, Nuk

Dedicator of cytokinesis protein 2

Q92608 1 Migration, GTP-Austauschfaktor

EMS, PM, Zyt

1Abkürzungen: EMS, Endomembransystem; ER, Endoplasmatisches Retikulum; Endo, Endosomen;

GTP, Guanosintriphosphat; LR, Lipid Rafts; Mito, Mitochondrion; Nuk, Nukleus; PM, Plasmamembran;

Podo, Podosomen; ZK, Zellkontakt; Zyt, Zytosol.

Unter den 38 identifizierten SH3-Domänen, die mit der intrazellulären Domäne von

ADAM10 präzipitierten, gehören viele zu Proteinfamilien, die bereits für andere

ADAM-Proteasen als Interaktionspartner beschrieben wurden. In einigen Fällen

konnten regulatorische Funktionen im Rahmen der Kontrolle der ADAM-Aktivitäten

nachgewiesen werden. Einige der identifizierten SH3-Domäne-Proteine spielen bei

Endozytoseprozessen eine Rolle oder fungieren als Adapterproteine. Weiterhin

wurden Mitglieder der Src-Kinasen sowie die Palmitoylierungstransferase ZDHHC6

identifiziert. Im Folgenden wurde für ausgewählte potentielle Bindungspartner die

Interaktion mit der zytoplasmatischen Domäne von ADAM10 verifiziert. Für einige der

näher untersuchten Kandidaten wurde zunächst die Expression in T-Zellen analysiert

(Abbildung 5.37). Hierbei wurden Zelllysate von PHA-Blasten, CD4+-T-Zellen (Klon

12603) und Jurkat-Zellen mittels Western Blot analysiert. Endophilin-A2, Lck und

Grb2 wurden in allen getesteten Zellen nachgewiesen und können somit theoretisch

mit ADAM10 in T-Zellen interagieren.

Ergebnisse

98

Abb. 5.37: Expression potentieller Interaktoren von ADAM10 in T-Zellen. Zelllysate von PHA-Blasten, CD4

+-T-Zellen (Klon 12603) und Jurkat-Zellen (JE6-1) wurden auf das Vorhandensein

möglicher interagierender SH3-Domäne-Proteine durch Verwendung spezifischer Antikörper untersucht (ADAM10: 11G2; EEN: 2F5; Lck: 4/215; Grb2: C-23).

5.3.2 Verifizierung potentieller Interaktionen

Bevor mittels Pull-Down-Analyse und Immunpräzipitation eine Verifizierung der

Interaktionen und Immunpräzipitationen begonnen wurde, wurden zunächst für eine

Vielzahl potentieller Bindungspartner im Labor vorhandene GST-Fusionsproteine ihre

Reinheit und Konzentration überprüft, indem je 25 µg des entsprechenden

Fusionsproteins elektrophoretisch aufgetrennt und mit Coomassie-Färbelösung

detektiert wurden (siehe Anhang Abbildungen A1-3).

Endophilin-A2

Bei der Identifizierung interagierender SH3-Domänen mit Hilfe der Phagenbibliothek

wurde die SH3-Domäne von Endophilin-A2 (EEN, SH3GL1) acht Mal als potentieller

Bindungspartner von GST-hADAM10(697-748), jedoch nicht von GST, identifiziert

(Abbildung 5.36). Endophilin-A2/EEN gehört zur Familie der endozytotisch aktiven

Proteine der Endophiline und ist im Zytoplasma lokalisiert. Um eine Interaktion von

ADAM10 mit Endophilin-A2/EEN zu überprüfen, wurde ein GST-Fusionsprotein der

SH3-Domäne kloniert und für Pull-Down-Analysen verwendet. Mit Hilfe des

Ergebnisse

99

Fusionsproteins konnte ADAM10 aus Lysaten von PHA-Blasten (Tag 16) präzipitiert

werden (Abbildung 5.38A). Als Negativkontrolle wurde GST verwendet. Während bei

der Kontrolle kein präzipitiertes ADAM10 detektiert werden konnte, wurde im Pull-

Down mit GST-EEN SH3 die unreife Form von ADAM10 bei etwa 80 kDa

nachgewiesen. Reifes ADAM10 (60 kDa) konnte nicht detektiert werden, obwohl im

Zelllysat beide Formen deutlich nachgewiesen wurden (Abbildung 5.38A).

Abb. 5.38: Die zytoplasmatische Domäne von ADAM10 interagiert in vitro mit der SH3-Domäne von Endophilin-A2/EEN. (A) PHA-Blasten (Tag 16) wurden lysiert und für Pull-Down-Analysen mit GST als Kontrollprotein bzw. dem Fusionsprotein GST-EEN SH3 verwendet. Nach Auftrennung und Transfer auf eine Nitrozellulosemembran wurde ADAM10 detektiert (Klon 11G2). Zur Kontrolle der Spezifität der Färbung wurden 10 µg Lysat aufgetrennt. (B) Zur weiteren Verifizierung der Interaktion von ADAM10 und Endophilin-A2 wurden HEK293T-Zellen transient mit murinem HA-gekoppelten ADAM10 (mADAM10) oder mit mADAM10 in Kombination mit humanem Endophilin-A2/EEN transfiziert. 18 Stunden später wurden die Zellen lysiert und mit Hilfe monoklonaler Antikörper gegen HA (Klon 3F10) oder EEN (Klon 2F5) Immunpräzipitationen durchgeführt. Untransfizierte Zellen wurden als Negativkontrolle eingesetzt. Zur Kontrolle der Transfektionseffizienz wurden jeweils 10 µg Lysat aufgetrennt.

In einem weiteren Versuch wurden HEK293T-Zellen entweder mit murinem HA-

markiertem ADAM10 oder ADAM10 in Kombination mit humanem Endophilin-

A2/EEN transfiziert. Nach 18 Stunden wurden die Zellen lysiert und (Ko-)

Immunpräzipitationen durchgeführt. Da die intrazelluläre Domäne von ADAM10 im

Menschen sich nur in einer Aminosäure von der murinen zytoplasmatischen Domäne

unterscheidet, die zudem außerhalb der Prolin-reichen Region liegt, wurde das

murine Konstrukt verwendet. Die effiziente Transfektion der Konstrukte wurde in

Lysaten gezeigt (Abbildung 5.38B). Aus den Zelllysaten wurden

Immunpräzipitationen mit einem monoklonalen Antikörper gegen HA (Klon 3F10)

bzw. einem monoklonalen Antikörper gegen Endophilin-A2/EEN (Klon 2F5)

A B

Ergebnisse

100

durchgeführt. Die Präzipitation von mADAM10 mittels anti-HA-Antikörper aus

doppelt-transfizierten Zellen führte zur Ko-Immunpräzipitation von Endophilin-

A2/EEN, nachgewiesen mit dem monoklonalen anti-Endophilin-A2-Antikörper

(Abbildung 5.38B, oberer Teil, IP: HA). Zusätzlich wurde durch Präzipitation von

Endophilin-A2/EEN mADAM10 präzipitiert und mittels -HA-Antikörper nach längerer

Expositionszeit detektiert (Abbildung 5.38B, unterer Teil, IP: EEN). Die Präzipitation

von Endophilin-A2/EEN führte auch in untransfizierten Zellen zur Anreicherung von

endogenem Endophilin-A2/EEN (Abbildung 5.38B, oberer Teil, IP: EEN) und auch in

den Lysaten wurde nach längerer Belichtung endogenes Endophilin-A2/EEN

detektiert (nicht gezeigt).

Tyrosinkinasen: Mitglieder der Src-Familie und Abl

Bei der Identifizierung von interagierenden SH3-Domänen mittels Phagenbibliothek

wurden drei Tyrosinkinasen als potentielle Bindungspartner bestimmt. Aus der

Familie der Src-Kinasen wurde Lck hierbei am häufigsten mit GST-hADAM10(697-

748)-beladenen Beads präzipitiert (5 Treffer), während Src und die Tyrosinkinase Abl

jeweils einmal identifiziert wurden (Abbildung 5.36). Src-Kinasen und auch Abl sind

bei einer Vielzahl von Signaltransduktionsprozessen beteiligt und regulieren

Zellwachstum, -migration und -adhäsion. Auch für verschiedene ADAM-Mitglieder

wurden Interaktionen mit Src-Kinasen und Abl nachgewiesen. Im Rahmen der

vorliegenden Arbeit wurden zur Verifizierung der potentiellen Bindungen Pull-Down-

Analysen und Ko-Immunpräzipitationen durchgeführt. Stabil-transfizierte Jurkat-

Zellen (JFL) wurden lysiert und mit Glutathion-Beads und 10 µg Fusionsprotein der

jeweiligen SH3-Domäne verschiedener Kinasen versetzt. Nach elektrophoretischer

Auftrennung und Transfer auf eine Nitrozellulosemembran wurde ADAM10 durch

Inkubation mit einem Antikörper (Klon 11G2) detektiert. Als Kontrolle der Spezifität

dienten GST bzw. die SH2-Domänen der entsprechenden Kinase (Abbildung 5.39).

Ergebnisse

101

Abb. 5.39: SH3-Domänen von Src-verwandten Kinasen präzipitieren ADAM10. Jurkat-Zellen (JFL) wurden lysiert und für Pull-Down-Analysen mit SH2-oder SH3-Fusionsproteinen verschiedener Src-Kinasen eingesetzt. GST diente als Negativkontrolle. ADAM10 wurde mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers detektiert (Klon 11G2). Zur Kontrolle der Spezifität der Färbung wurden 10 µg Lysat aufgetrennt.

Im Lysat konnte die reife, aktive Form von ADAM10 deutlich bei 60 kDa detektiert

werden und auch die unreife Form (80 kDa) wurde als schwächere Bande

nachgewiesen. Während in der GST-Kontrolle und SH2-Domäne-Fusionsproteinen

kein reifes oder unreifes ADAM10 präzipitiert wurde, zeigte sich in Präzipitationen der

SH3-Domänen von Abl, Fyn, Src, Hck und Yes die reife Form von ADAM10

(Abbildung 5.39). Hierbei wurde für Abl die stärkste Interaktion mit ADAM10

beobachtet. In Präzipitaten mit der SH3-Domäne von Lck wurde bei kurzer

Belichtung zunächst kein ADAM10 detektiert, jedoch konnte nach längerer

Belichtungszeit auch für Lck-SH3 eine Interaktion mit ADAM10 nachgewiesen

werden (Daten nicht gezeigt).

Um die Interaktion von ADAM10 und der Src-Kinase Lck zusätzlich zu verifizieren,

wurden Immunpräzipitation mit monoklonalen Antikörpern gegen Lck (Klone 4/129

und 4/215) mit Lysaten von Jurkat-Zellen (JE6-1) durchgeführt. Durch die

Präzipitation von Lck konnte reifes und unreifes ADAM10 präzipitiert werden

(Abbildung 5.40). Als Positivkontrolle wurde eine Immunpräzipitation von ADAM10

mit dem Antikörper 11G2 durchgeführt.

Ergebnisse

102

Abb. 5.40: Lck kopräzipitiert ADAM10. Jurkat-Zellen (JE6-1) wurden lysiert und für Immunpräzipitationen mit monoklonalen Antikörpern gegen die Tyrosinkinase Lck verwendet (Klone 4/129 und 4/215; je 2 µg). Endogenes ADAM10 wurde mit dem Antikörper 11G2 detektiert. Als Positivkontrolle wurde eine Immunpräzipitation von ADAM10 (Klon 11G2, 2 µg) analysiert. Protein-G-Beads wurden als Kontrolle unspezifischer Bindungen eingesetzt.

Adapterproteine der Grb2-Familie

Adapterproteine sind für Protein-Protein-Interaktionen essentiell und an der

Formierung von Proteinkomplexen von beteiligt (Chardin et al., 1995; Leo et al.,

2002). Die Familie der Grb2- (Growth factor receptor-bound protein 2-)

Adapterproteine umfasst drei Mitglieder (Grb2, GRAP (Grb2-related adaptor protein),

GRAP2), die im Zytoplasma lokalisiert sind. Beim Screening interagierender SH3-

Domänen wurden zwei der drei Mitglieder als potentielle Interaktoren der

zytoplasmatischen Domäne von ADAM10 identifiziert (Abbildung 5.36; Grb2, zwei

Treffer; GRAP2, 1 Treffer). Eine Verifizierung der Interaktionen konnte durch Pull-

Down-Analysen unter Verwendung des Fusionsproteins GST-hADAM10(697-748)

und Ko-Immunpräzipitation mit dem monoklonalen Antikörper gegen ADAM10

(11G2) aus Jurkat-Zelllysaten (JE6-1) erbracht werden. Durch Inkubation der

Nitrozellulosemembran mit einem polyklonalen Antikörper gegen Grb2 (C-23) wurde

in GST-hADAM10(697-748)-Präzipitaten endogenes Grb2 detektiert, nicht jedoch in

der GST-Kontrolle. Zusätzlich führte die Immunpräzipitation von ADAM10 zur Ko-

Präzipitation von Grb2, welches in der Protein-G-Negativkontrolle nicht nachweisbar

war (Abbildung 5.41A, oben). Durch anschließendes Färben der Membran mit dem

Ergebnisse

103

polyklonalen Antiserum gegen humanes ADAM10 (Tier 1) konnte die erfolgreiche

Immunpräzipitation von ADAM10 aus dem Zelllysat gezeigt werden

(Abbildung 5.41A, unten).

Um zu untersuchen, ob auch die anderen Mitglieder der Grb2-Familie mit ADAM10

interagieren (GRAP2 wurde ebenfalls als potentielles interagierendes Protein

identifiziert), wurden weitere Pull-Down-Analysen durchgeführt. Hierbei wurde GST

bzw. die C- und N-terminalen SH3-Domänen von Grb2, GRAP und GRAP2

gekoppelt an GST verwendet, um aus Lysaten von Jurkat-Zellen (JFL) zu

präzipitieren. Die anschließende Detektion von ADAM10 mit Hilfe des Antikörpers

11G2 zeigte, dass reifes ADAM10 und (etwas schwächer) auch unreifes ADAM10 im

Wesentlichen an die C-terminalen SH3-Domänen aller Grb2-Familienmitglieder

bindet (Abbildung 5.41B). Unter Verwendung der N-terminalen Domänen dagegen

konnte eine Interaktion mit ADAM10 kaum beobachtet werden (Abbildung 5.41B).

Abb. 5.41: ADAM10 interagiert in vitro mit Adapterproteinen der Grb2-Familie. (A) Lysate von Jurkat-Zellen (JE6-1) wurden für Pull-Down-Analysen mit 10 µg des Fusionsproteins GST-ADAM10(697-748) bzw. GST als Negativkontrolle verwendet. Zusätzlich wurde mit dem monoklonalen anti-ADAM10-Antikörper 11G2 eine Immunpräzipitation durchgeführt. Protein-G diente als Kontrolle unspezifischer Bindungen. Präzipitiertes Grb2 wurde mit einem polyklonalen Antikörper (C-23) detektiert. Anschließend erfolgte die Detektion von ADAM10 mit einem polyklonalen Antiserum (Tier 1). (B) Jurkat-Zellen (JFL) wurden lysiert und für Pull-Down-Analysen mit Fusionsproteinen der N- bzw. C-terminalen SH3-Domänen von Grb2, GRAP und GRAP2 durchgeführt. Als Negativkontrolle wurde GST verwendet. Die Detektion von ADAM10 erfolgte mit dem Antikörper 11G2. Als Spezifitätskontrolle wurden 15 µg Gesamtlysat analysiert.

Ergebnisse

104

Mitglieder der PACSIN-Familie

PACSIN-Proteine gehören zur Familie der PCH-(Pombe Cdc15 homology-)Proteine

und stellen Adapterproteine dar, die bei Endo- und Exozytoseprozessen eine Rolle

spielen und auch am Vesikeltransport beteiligt sind (Chitu und Stanley, 2007;

Aspenström, 2009). Die drei Mitglieder der PACSIN-(Protein kinase C and casein

kinase substrate in neurons protein-)Familie besitzen je eine SH3-Domäne und es

konnte bereits gezeigt werden, dass verschiedene ADAM-Proteasen mit PACSINen

interagieren und dass diese Interaktionen die Expression oder Aktivität beeinflussen

(Cousin et al., 2000; Mori et al., 2003). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde

initial die SH3-Domäne von PACSIN3 mit dem Fusionsprotein GST-hADAM10(697-

748) präzipitiert (Abbildung 5.36). Zur Verifizierung der Interaktion von ADAM10 mit

PACSINen wurden Pull-Down-Analysen mit GST-Fusionsproteinen der SH3-

Domänen der drei PACSINe durchgeführt. Die Verwendung eines gegen ADAM10

gerichteten Antikörpers führte zur Detektion von reifem und unreifem ADAM10

(Abbildung 5.42).

Abb. 5.42: Interaktion von ADAM10 mit SH3-Domänen der PACSINe. Jurkat-Zellen (JFL) wurden lysiert und für Pull-Down-Analysen mit jeweils 15 µg GST-Fusionsproteinen der SH3-Domänen von PACSIN1-3 durchgeführt. Als Negativkontrolle wurde GST verwendet. Die Detektion von ADAM10 erfolgte mit dem Antikörper 11G2. Als Spezifitätskontrolle wurden 10 µg Gesamtlysat analysiert.

Ergebnisse

105

In einem zusätzlichen Experiment wurden HEK293T-Zellen mit myc-markiertem

PACSIN1, -2 und -3 transfiziert und nach 18 Stunden für Pull-Down-Analysen lysiert.

Als Negativkontrollen dienten untransfizierte bzw. Leervektor-transfizierte Zellen.

Durch Präzipitation mit dem GST-hADAM10(697-748)-Fusionsprotein konnten aus

Lysaten von PACSIN-Transfektanten alle drei PACSINe über Färbung mit einem

anti-myc-Antikörper detektiert werden (Abbildung 5.43). PACSIN3 zeigte hierbei die

stärkste Bande. Bei Präzipitaten aus Lysaten von Kontrollzellen konnte keine

Interaktion beobachtet werden. Der entsprechende Versuch wurde zudem mit dem

ADAM17- Fusionsprotein (GST-hADAM17(694-824)) durchgeführt und auch hier

wurde eine Interaktion der zytoplasmatischen Domäne von ADAM17 mit allen

PACSINen gezeigt. Die stärkste Interaktion konnte auch für ADAM17 mit PACSIN3

beobachtet werden (Abbildung 5.43). Bei Präzipitationen mit GST wurde hingegen

keine Bindung der PACSINe beobachtet.

Abb. 5.43: PACSINe interagieren mit ADAM10 und ADAM17. HEK293T-Zellen wurden mit myc-markiertem PACSIN1, -2 und -3 transfiziert. Als Kontrolle wurden untransfizierte bzw. Vektor-transfizierte (pcDNA3.1) Zellen verwendet. 18 Stunden später wurden die Zellen lysiert und Pull-Down-Analysen mit je 10 µg GST, GST-ADAM10(697-748) und GST-ADAM17(694-824) durchgeführt. Zur Kontrolle der Transfektionseffizienz wurden jeweils 5 µg Lysat aufgetrennt. Die Detektion der PACSINe erfolgte über einen monoklonalen Antikörper gegen den myc-Teil (Klon 46-0603).

Ergebnisse

106

Mitglieder der Sorting-Nexin-Familie

SNXe (Sorting nexins) regulieren den intrazellulären Transport von Proteinen, die

Signaltransduktion und auch die Endozytose. Sie werden ubiquitär exprimiert und

sind im Zytoplasma lokalisiert. Durch ihre Lipid-bindende Phox-(PX-)Domäne oder

durch Protein-Protein-Interaktionen über ihre SH3-Domänen können sie ähnlich wie

die PACSINe auch mit Membranen assoziieren. SNX9, SNX18 und SNX33 bilden die

SNX9-Subfamilie. Für andere ADAM-Mitglieder wurden bereits Interaktionen mit

SNX9 gezeigt. Beim Screening der Phagenbibliothek im Rahmen der vorliegenden

Arbeit wurde SNX18 als potentieller Interaktionspartner identifiziert (Abbildung 5.36).

Durch Überexpression der SNXe in HEK293T-Zellen konnte die Interaktion ebenfalls

verifiziert und auf die anderen Mitglieder SNX9 und SNX33 ausgeweitet werden. Zu

diesem Zweck wurden die Zellen transient mit HA-getaggten Konstrukten der SNXe

transfiziert und 18 Stunden später Pull-Down-Analysen mit den Fusionsproteinen

GST-ADAM10(697-748) und GST-ADAM17(694-824) bzw. GST als Kontrollprotein

durchgeführt (Abbildung 5.44).

Abb. 5.44: Sorting Nexins (SNXs) interagieren mit den zytoplasmatischen Domänen der Metalloproteasen ADAM10 und ADAM17. HEK293T-Zellen wurden mit HA-getaggtem SNX9, SNX18 und SNX33 transfiziert. Als Kontrolle wurden untransfizierte bzw. Vektor-transfizierte (p12linker) Zellen verwendet. 18 Stunden später wurden die Zellen lysiert und Pull-Down-Analysen mit je 25 µg GST, GST-ADAM10(697-748) und GST-ADAM17(694-824) durchgeführt. Zur Kontrolle der Transfektionseffizienz wurden jeweils 20 µg Lysat aufgetrennt. Die Detektion der SNXe erfolgte über einen monoklonalen Antikörper gegen den HA-Teil (Klon 3F10).

Ergebnisse

107

SNX9, SNX18 und SNX33 konnten mit den intrazellulären Domänen von ADAM10

und ADAM17 präzipitiert werden, nicht jedoch mit GST. Die stärkste Interaktion

wurde für ADAM10 und SNX9 beobachtet werden, aber auch der intrazelluläre Teil

von ADAM17 konnte SNX9 effektiv präzipitieren. SNX18 wurde ebenfalls stark von

ADAM10 und ADAM17 gebunden. Die Interaktion von SNX33 mit ADAM10 und

ADAM17 fiel dagegen schwach aus, war jedoch für ADAM10 stärker ausgeprägt.

Zusammenfassung

Durch die Analyse interagierender SH3-Domänen der zytoplasmatischen Domäne

von ADAM10 mittels Phagenbibliothek konnten 38 potentielle Interaktionspartner

identifiziert werden. Eine Verifizierung der Interaktion mit ADAM10 über Pull-Down

und/oder Immunpräzipitationen erfolgte für Endophilin-A2, Src-verwandte Kinasen

(Abl, Fyn, Hck, Lck, Src, Yes), Grb2-Adapterproteine (Grb2, GRAP, GRAP2), SNXe

(SNX9, SNX18, SNX33) und PACSINe (PACSIN1-3). Auch für ADAM17 konnten

einige der genannten Interaktion nachgewiesen werden (SNXe, PACSINe).

Diskussion

108

6. Diskussion

6.1 ADAM10 reguliert die Expression des Fas-Liganden

6.1.1 Oberflächenexpression und Aktivität von ADAM10

Der FasL stellt ein wichtiges regulatorisches Effektormolekül auf T- und NK-Zellen

dar. Durch Bindung an seinen Rezeptor Fas wird Apoptose in Fas-positiven Zellen

induziert. Die Expression des FasL muss auf Grund dieses zytotoxischen Potentials

streng kontrolliert werden. Dies wird neben transkriptionaler Kontrolle auch durch

verschiedene posttranslationale Modifikationen erreicht: die Speicherung des FasL in

sekretorischen Lysosomen und die aktivierungsinduzierte Mobilisierung auf die

Oberfläche sowie die proteolytische Prozessierung des FasL durch Metalloproteasen

dienen der regulierten Exposition des FasL auf der Zelloberfläche. Als

verantwortliche Protease wurde in Inhibitoren-basierenden Experimenten ADAM10

identifiziert (Schulte et al., 2007; Kirkin et al., 2007). Über die ADAM10-Expression in

T-Zellen waren jedoch bislang keine Details bekannt. Die Aktivität und Expression

von ADAM-Proteasen wird häufig durch Phorbolester (TPA) und/oder

Kalziumionophor (Ionomycin) gesteigert (Sanderson et al., 2005, Nagano et al.,

2004; Horiuchi et al., 2007; Guo et al., 2012). In diesem Zusammenhang sollte im

Rahmen dieser Arbeit zunächst der Einfluss von Phorbolester und Kalziumionophor

auf die ADAM10-Oberflächenexpression analysiert werden. PHA-aktivierte T-

Zellblasten wurden mit TPA und Ionomycin stimuliert und die Oberflächenexpression

von ADAM10 durchflusszytometrisch bestimmt. ADAM10 zeigte eine konstitutiv hohe

Expression auf der Zelloberfläche in unstimulierten Zellen. Nach 10 Minuten gab es

in einigen der untersuchten T-Zellpopulationen einen geringen Anstieg an

membranständigem ADAM10 und nach einer halben Stunde wurde in der Regel ein

Absinken von ADAM10 auf den Ausgangswert gemessen. Nach einstündiger

Stimulation verringerte sich die Expression etwas und während der folgenden zwei

Stunden wurde eine kontinuierliche, aber schwache Abnahme von ADAM10 auf der

Oberfläche beobachtet (Abbildung 5.1).

Carey und Kollegen zeigten über Biotinylierung von Membranproteinen, dass auf der

Plasmamembran vorwiegend reifes ADAM10 lokalisiert ist (Carey et al., 2011). Daher

ist davon auszugehen, dass die durchflusszytometrisch gemessene

Oberflächenexpression von ADAM10 die Menge an reifem ADAM10 auf der

Diskussion

109

Oberfläche darstellt. Der Verlauf der ADAM10-Oberflächenexpression konnte auch

durch die Analyse von Gesamtlysat stimulierter Zellen beobachtet werden. Die reife,

aktive Form von ADAM10, die ein Molekulargewicht von etwa 60 kDa aufweist,

konnte mittels Western Blot-Analyse detektiert werden und auch hier wurde eine

leichte, stetige Abnahme von ADAM10 während der dreistündigen Stimulation

beobachtet (Abbildung 5.2). Diese Reduktion könnte auf proteolytischer

Prozessierung von ADAM10 durch andere Mitglieder der ADAM-Familie (ADAM9 und

15) (Tousseyn et al., 2009) oder Internalisierung von ADAM10 beruhen. Eine

Clathrin-abhängige Internalisierung mit anschließendem Recycling in frühen

Endosomen bzw. proteosomaler Abbau in späten Endosomen wurde als

regulatorischer Mechanismus für ADAM12 gezeigt. Voraussetzung war dabei das

Vorhandensein einer zytoplasmatischen Domäne mit Prolin-reichen Regionen zur

Interaktion mit SH3-Domäne-Proteinen, im Speziellen mit dem Adapterprotein Grb2

(Stautz et al., 2012).

Parallel zur Kinetik von ADAM10 auf der Zelloberfläche wurde die

Oberflächenexpression des FasL während der TPA/Ionomycin-Stimulation analysiert.

Nach 10 Minuten konnte ein Maximum detektiert werden, anschließend sank die

Expression wieder ab. Nach 90 Minuten wurde ein zweiter Anstieg der FasL-

Expression auf der Zelloberfläche gemessen (Abbildung 5.3). Durch vorhergehende

Studien innerhalb der Arbeitsgruppe kann der biphasische Verlauf auf die schnelle

Mobilisierung aus sekretorischen Lysosomen in der ersten Phase und neu

synthetisiertem FasL in der zweiten Phase zurückgeführt werden (Lettau et al.,

2004). Die Freisetzung von löslichem FasL nach TPA/Ionomycin-Stimulation wurde

mittels ELISA analysiert (Abbildung 5.4).

In einigen Veröffentlichungen wurde berichtet, dass die Aktivität von ADAM10 durch

Kalziumionophor, nicht jedoch durch Phorbolester, gesteigert wird (Sahin et al., 2004;

Sanderson et al., 2005). Der genaue Effekt der einzelnen Agentien auf die

Oberflächenexpression von ADAM10 im Zusammenhang mit der Proteolyse des

FasL wurde jedoch bisher nicht detailliert untersucht. Im Folgenden sollte analysiert

werden, ob der Einsatz von Phorbolester bzw. Kalziumionophor allein zur induzierten

Prozessierung des FasL führen kann oder ob nur die Kombination beider Stimuli zur

effektiven Proteolyse führt. PHA-Blasten wurden mit TPA und/oder Ionomycin

stimuliert und anschließend wurde die ADAM10-Oberflächenexpression

Diskussion

110

durchflusszytometrisch analysiert (Abbildung 5.5). Wie schon zuvor beschrieben

zeigte sich bei dem kombinierten Einsatz von TPA und Ionomycin ein geringer

Anstieg von membranständigem ADAM10 in den ersten 30 Minuten und

anschließend eine stetige Reduktion über die dreistündige Stimulation. Bei der

Stimulation mit TPA allein wurde ebenfalls eine geringfügige Erhöhung von ADAM10

auf der Oberfläche nach 10 Minuten detektiert. Anschließend sank die Expression

wieder auf den ursprünglichen Wert, um während der folgenden zwei Stunden leicht

anzusteigen. Der Einsatz von Ionomycin resultierte in einem ähnlichen Anstieg nach

10 Minuten mit nachfolgend konstanter Expression von ADAM10 auf der

Zelloberfläche. Die durchflusszytometrische Analyse des membranständigen FasL

zeigte für die kombinierte Stimulation mit TPA und Ionomycin das zuvor

beschriebene biphasische Profil mit einem Anstieg nach 10 Minuten und einer

erneuten Erhöhung der Oberflächenexpression nach 120-150 Minuten

(Abbildung 5.6). Die Stimulation der Zellen mit Ionomycin allein resultierte in einem

nahezu konstanten Verlauf, lediglich nach 150 Minuten gab es eine geringe

Erhöhung. Bis auf einen leichten Anstieg der FasL-Expression auf der Oberfläche

führte auch die Stimulation mit TPA allein zu einer nahezu gleichbleibenden

Expression. Für den biphasischen Verlauf der FasL-Expression (durch Mobilisierung

der sekretorischen Lysosomen und de novo Proteinbiosynthese) benötigt man

demnach den gemeinsamen Einsatz von Phorbolester und Kalziumionophor. Auch in

dem anschließend durchgeführten ELISA mit Zellkulturüberständen stimulierter

Zellen wurde deutlich, dass nur die Kombination aus beiden Faktoren zur effektiven

Proteolyse des FasL führt. Wurden PHA-Blasten allein mit TPA stimuliert, konnte

nach dreistündiger Stimulation nur ein sehr geringer Anstieg löslichen FasL

gemessen werden (Abbildung 5.7). Inkubation mit Ionomycin hingegen verstärkte die

proteolytische Prozessierung des FasL um etwa das Doppelte. Nur die kombinierte

Verwendung von TPA und Ionomycin jedoch resultierte in einem deutlichen Anstieg

der Proteolyse und große Mengen an löslichem FasL konnten detektiert werden. Aus

diesen Experimenten lässt sich schlussfolgern, dass Ionomycin allein einen geringen

Effekt auf das Shedding des FasL nimmt, während TPA keinen Einfluss zu nehmen

scheint. Durch den Einsatz beider Stimuli zusammen konnte jedoch erst eine

signifikante Proteolyserate beobachtet werden. Unklar bleibt in diesem

Zusammenhang der genaue Effekt der jeweiligen Stimuli auf molekularer Ebene.

Augenscheinlich kommt es jedoch bei der kombinierten Verwendung zu einer

Diskussion

111

Verstärkung ihrer Wirkungsweisen und einer Potenzierung der Effekte auf die FasL-

Prozessierung.

Die Steigerung der Aktivität von verschiedenen ADAM-Proteasen und dessen

Einfluss auf die Proteolyse ihrer Substrate ist seit langem im Fokus der Forschung.

Eine Vielzahl an aktivierenden Stimuli konnte bisher identifiziert werden (Reiss und

Saftig, 2009; Rose-John, 2013). Hierzu zählen bakterielle Toxine wie Streptolysin O

und Hämolysin (Walev et al., 1996), das Auftreten von Apoptose (Chalaris et al.,

2007), die Aktivierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (Myers et al., 2009;

Yin und Yu, 2009), Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) (Horiuchi et al., 2007; Guo

et al., 2012; Kveiborg et al., 2011) und Kalziumeinstrom durch Kalziumionophor

(Sanderson et al., 2005; Guo et al., 2012). Weiterhin wird zwischen konstitutivem und

induzierbarem Shedding unterschieden, da bei der Induktion der Proteolyse über

Verwendung bestimmter Stimuli oft auch eine andere Protease impliziert ist als bei

der konstitutiven Proteolyse. Die differenzielle Aktivierung von ADAM10 und

ADAM17 durch Ionomycin bzw. TPA wurde für viele Substrate beschrieben. So wird

das Adhäsionsmolekül L1 konstitutiv von ADAM10 prozessiert, während nach

Aktivierung der PKC primär ADAM17 für die L1-Proteolyse verantwortlich ist

(Maretzky et al., 2005; Ludwig et al., 2005). Für Pro-Betacellulin (Pro-BTC) wurde

gezeigt, dass Kalziumeinstrom über Ionomycin eine Aktivitätssteigerung von

ADAM10 bewirkte und mehr reifes BTC nachgewiesen wurde, während die

Verwendung von Phorbolester (TPA) keine erhöhte Produktion von reifem BTC

bewirkte (Sanderson et al., 2005). Für das Adhäsionsmolekül CD44 wurde

beobachtet, dass Kalziumeinstrom zu einer erhöhten Aktivität von ADAM10 führte

und die Proteolyse von CD44 stieg. Dies wurde auf eine veränderte Assoziation von

Calmodulin mit ADAM10 zurückgeführt (Nagano et al., 2004). Die Aktivierung der

Proteinkinase C (PKC) mittels Phorbolester resultierte interessanterweise auch in

dem verstärktem Shedding von CD44 durch ADAM17 (Nagano et al., 2004). Horiuchi

und Kollegen zeigten weiterhin eine Beteiligung beider Proteasen bei der

proteolytischen Prozessierung der EGFR (epidermal growth factor receptor)-

Liganden. Auch hier resultierte Ionomycin-Behandlung in der Aktivierung von

ADAM10 und Stimulation der Zellen mit TPA in der Aktivierung von ADAM17

(Horiuchi et al., 2007). Die Kurzzeitbehandlung mit TPA bewirkte keinen Einfluss auf

die Reifung von ADAM17 oder den Transport auf die Zelloberfläche. Weiterhin wurde

in dieser Veröffentlichung das Vorhandensein der zytoplasmatischen Domäne und

Diskussion

112

der Transmembranregion als Voraussetzung der Aktivitätssteigerung durch

Phorbolester ausgeschlossen, da ohne die beiden Domänen TNF-α dennoch

vermehrt prozessiert wurde (Horiuchi et al., 2007). Auch für ADAM10 wurde in dieser

Publikation ein Einfluss von Ionomycin auf die Reifung und die subzelluläre

Lokalisation ausgeschlossen. Dennoch resultierte die Deletion der intrazellulären

Domäne in einem reduzierten Shedding von EGF (epidermal growth factor) und BTC

(Horiuchi et al., 2007). Weiterhin wurde auch bei der Prozessierung von CD16b

sowohl Ionomycin-induziertes Shedding durch ADAM10 nachgewiesen, wie auch

TPA-induzierte Proteolyse durch ADAM17 (Guo et al., 2012). Die Stimulation von

Zellen mit TPA und/oder Ionomycin resultiert häufig in der Erhöhung der ADAM-

Aktivität, die genauen Umstände der Aktivierung in Bezug auf

Konformationsänderungen und folglich eventuell erleichterte Proteolyse oder aber

Änderungen der Lokalisation von Protease und Substrat auf der Plasmamembran

sind unbekannt.

ADAM17 ist ein weiteres Mitglied der ADAM-Familie und wurde als Protease des

Zytokins TNF-α identifiziert (Black et al., 1997) und wird daher auch als TNF-α-

converting enyzme (TACE) bezeichnet. Zusammen mit ADAM10 spielt ADAM17 eine

große Rolle innerhalb des Immunsystems. Obwohl die beiden Proteasen als eng

miteinander verwandte Mitglieder mehrere Gemeinsamkeiten aufweisen, zeigen sie

bezüglich ihrer aktivierungsinduzierten Oberflächenexpression auf T-Zellen große

Unterschiede. In vorhergehenden Analysen innerhalb der Arbeitsgruppe konnte

gezeigt werden, dass ADAM17 im Gegensatz zu ADAM10 auf verschiedenen T-

Zellpopulationen und Tumorzellen konstitutiv gering exprimiert ist (Diplomarbeit A.

Schröder; Ebsen et al., 2013). Interessanterweise wird auf untransformierten T-Zellen

bei TPA/Ionomycin-Stimulation nach 10 Minuten ein Anstieg von ADAM17 auf der

Zelloberfläche deutlich, der anschließend wieder rapide abnimmt. Diese induzierte

Zunahme lässt sich durch Inhibitoren der Aktinpolymerisation (Cytochalasin D,

Latrunkulin A) unterbinden (Diplomarbeit A. Schröder, Ebsen et al., 2013). In der

vorliegenden Arbeit wurden PHA-Blasten mit siRNA transfiziert, um ADAM17

transient herunter zu regulieren. 72 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen

mit TPA und Ionomycin aktiviert und der zuvor beschriebene Anstieg an

membranständigem ADAM17 wurde in untransfizierten sowie Kontroll-RNA-

transfizierten Zellen deutlich (Abbildung 5.8). In ADAM17-siRNA-transfizierten Zellen

wurde nahezu kein Anstieg beobachtet. Die TPA/Ionomycin-induzierte

Diskussion

113

Oberflächenexpression von ADAM17 weicht völlig von der beobachteten ADAM10-

Kinetik ab, bei der über die dreistündige Stimulation fast keine Änderung gemessen

wurde. Obwohl sich beide Proteasen in ihren Fähigkeiten und Eigenschaften sonst

sehr ähneln, scheinen abweichende Regulationsmechanismen ihre induzierbare

Oberflächenexpression auf T-Zellen zu kontrollieren. Für ADAM17 ist auf Grund der

rapiden Zunahme zu Beginn der Stimulation eine Rekrutierung aus sekretorischen

Lysosomen denkbar, insbesondere da diese Mobilisierung durch Inhibitoren der

Aktinmaschinerie unterbunden werden kann. Außerdem ähneln diese

Beobachtungen sehr der Kinetik des FasL, welcher ebenfalls in Lysosomen

gespeichert und nach Aktivierung der Zellen in einem aktinabhängigen Prozess auf

die Oberfläche transportiert wird (Lettau et al., 2004). Für ADAM12 wurde gezeigt,

dass die intrazelluläre Domäne für die Speicherung im trans-Golgi-Netzwerk

vonnöten ist und das Fehlen dieser Domäne in einer verstärkten Expression auf der

Zelloberfläche resultiert (Hougaard et al., 2000). Sundberg und Kollegen berichteten

später von einer PKCε-induzierbaren Translokation von ADAM12 auf die Oberfläche

durch die Verwendung von Phorbolester (Sundberg et al., 2004). Auch für ADAM17

wurde der Effekt der PKC-Aktivierung ausgiebig analysiert. In einigen Studien konnte

kein Einfluss der Stimulation mit Phorbolester auf die Reifung und Lokalisation von

ADAM17 gezeigt werden (Doedens und Black, 2000; Schlöndorff et al., 2000;

Horiuchi et al., 2007). Nach einstündiger TPA-Stimulation wurde sogar eine

Reduktion von ADAM17 durch Internalisierung beobachtet (Doedens und Black,

2000). Andere Studien hingegen beschrieben eine schnelle Reifung und

Translokation von ADAM17 nach Phorbolesterstimulation durch Änderung des

Phosphorylierungsstatus der zytoplasmatischen Domäne (Soond et al., 2005; Göoz

et al., 2006; Bell und Göoz, 2010). Die unterschiedlichen Ergebnisse der ADAM17-

Expression nach Stimulation mit Phorbolester könnten auf der Analyse verschiedener

Zelllinien oder auch auf unterschiedlichen Einsatzkonzentrationen von TPA beruhen.

Ein weiterer Unterschied von ADAM10 und ADAM17 liegt in der differentiellen

Assoziation mit Tetraspaninen. Während ADAM10 mit einer Vielzahl von Mitgliedern

der Tetraspanin8-Subfamilie (Tspan5, Tspan10, Tspan14, Tspan15, Tspan17 und

Tspan33) und Tspan12 interagiert und von ihnen bezüglich Reifung, Expression und

Aktivität reguliert wird (Dornier et al., 2012; Haining et al., 2012; Xu et al., 2009),

wurde für ADAM17 nur die Interaktion mit CD9 nachgewiesen, welche regulierend

Diskussion

114

auf die proteolytische Aktivität wirkt (Gutiérrez-López et al., 2011). Dies könnte ein

weiterer Ansatzpunkt für die unterschiedlichen Kinetiken darstellen.

6.1.2 ADAM10 ist die Haupt-Sheddase des FasL bei TPA/Ionomycin-induzierter

Proteolyse

Der Nachweis, dass ADAM10 die hauptverantwortliche Protease des FasL ist, beruht

hauptsächlich auf mehr oder weniger spezifischen Inhibitoren und Untersuchungen

an transformierten Mauszellen, in denen beispielsweise die Proteasen

herunterreguliert wurden (Schulte et al., 2007; Kirkin et al., 2007). Die transiente

siRNA-Transfektion von ADAM10 und ADAM17 in untransformierten T-Zellen

erlaubte es nun, die Schlussfolgerungen zu überprüfen, indem spezifisch eine der

Proteasen reduziert wurde. PHA-Blasten wurden mit siRNA gegen ADAM10 bzw.

ADAM17 transfiziert und anschließend mit TPA/Ionomycin stimuliert. Die

durchflusszytometrische Analyse zeigte deutlich eine Reduktion von

membranständigem ADAM10 und auch in Gesamtlysaten ließ sich die effiziente

Herunterregulation nachweisen (Abbildung 5.10). Die Analyse von

Zellkulturüberständen von transfizierten, stimulierten Zellen zeigte eine verminderte

Proteolyse des FasL in ADAM10-reduzierten Zellen (Abbildung 5.11). Es wird

außerdem ersichtlich, dass allein die Transfektion der Zellen mit Kontroll-RNA bereits

zu einer verminderten Prozessierung führte, da auch hier verglichen mit den

untransfizierten Zellen weniger löslicher FasL detektiert wurde. Die

Herunterregulation von ADAM17 führte nach TPA/Ionomycin-Stimulation nicht zu

einer Reduktion der FasL-Proteolyse verglichen mit den Kontroll-transfizierten Zellen.

Auch bei der Analyse der N-terminalen Fragmente des FasL im Gesamtlysat

stimulierter Zellen wird deutlich, dass ADAM10 die Prozessierung des FasL

maßgeblich beeinflusst (Abbildung 5.12). Das Fehlen der Protease führt zu einer

Reduktion von NTFs, verglichen mit den anderen Zellen. Weiterhin akkumulieren

unprozessierte FasL-Moleküle, da sie weniger gespalten werden. Beide Experimente

zeigen, dass in TPA/Ionomycin-stimulierten Zellen ADAM10 die hauptverantwortliche

Protease darstellt. Dies steht im Einklang mit Veröffentlichungen, in denen ADAM10

als Haupt-Sheddase der konstitutiven und induzierten FasL-Proteolyse identifiziert

wurde (Kirkin et al., 2007; Schulte et al., 2007).

Diskussion

115

6.1.3 Intramembrane Proteolyse des FasL durch SPPL2a

ADAM10 schafft durch die proteolytische Spaltung des FasL auch die Möglichkeit der

regulierten intramembranen Proteolyse (RIP). In diesem Zusammenhang wurde

mittels Inhibitoren bzw. Überexpression mit anschließender Herunterregulation durch

siRNA-Transfektion SPPL2a als verantwortliche Protease nachgewiesen (Kirkin et

al., 2007). Für SPPL2a wurde als einziges Mitglied der SPPL-Familie die Lokalisation

in Lysosomen und späten Endosomen gezeigt. Dies wird durch ein Tyrosinmotiv am

C-terminalen Ende bedingt (Behnke et al., 2011). Um zu verifizieren, dass SPPL2a

an der Proteolyse der FasL-NTFs beteiligt ist, wurden PHA-Blasten mit siRNA gegen

SPPL2a transfiziert und nach 72 Stunden mit TPA und Ionomycin aktiviert. Die

nachfolgende Western Blot-Analyse (Abbildung 5.13) wies eine deutliche

Akkumulation von NTFs in Lysaten auf, bei denen SPPL2a herunterreguliert wurde.

Durch weitere Versuche mit der adhärent-wachsenden Zervixkarzinomzelllinie HeLa

konnten wir zeigen, dass die verwendeten siRNAs für die Herunterregulation von

SPPL2a geeignet sind. Allerdings waren die zugänglichen Antikörper gegen SPPL-

Proteine nicht für Analysen endogener Proteine in T-Zelllysaten geeignet, sodass die

effiziente Transfektion der Zellen nicht überprüft werden konnte. Da man aber einen

Effekt auf die FasL-Prozessierung beobachten konnte, lassen sich die Inhibitor-

basierenden Ergebnisse bezüglich des RIPpings durch SPPL2a zumindest

bekräftigen. Weitere Analysen müssten jedoch folgen, um die Spezifität der

einzelnen siRNAs zu verifizieren und um näher zu bestimmen, welche Rolle andere

Mitglieder der SPPL-Familie spielen.

6.1.4 Die Stimulation des T-Zellrezeptors induziert die Proteolyse des FasL

TPA und Ionomycin wurden bisher häufig für Analysen des FasL-Sheddings

verwendet, da dabei ein starker Anstieg der Proteolyse zu beobachten war. Die

Verwendung von TPA und Ionomycin jedoch resultiert in multiplen Reaktionen

innerhalb der Zelle, die im Detail weitgehend unverstanden sind. Durch die

Verwendung monoklonaler Antikörper lässt sich als physiologischer Stimulus gezielt

der TZR/CD3/CD28-Komplex von T-Zellen aktivieren. Die Verwendung des anti-CD3-

Antikörpers stellt hierbei das Signal 1 der T-Zellrezeptoraktivierung dar, während der

Antikörper gegen CD28 als zweites Signal fungiert. In einer vorhergehenden Studie

wurde eine Induktion der FasL-Proteolyse nach Stimulation von primären T-Zellen

mit anti-CD3 allein und in Kombination mit anti-CD28 gezeigt. Der Einsatz von anti-

Diskussion

116

CD28 allein hatte jedoch keinen Einfluss auf die FasL-Proteolyse (Kirkin et al., 2007).

Die Aktivierung des TZR resultiert außerdem in einem Anstieg an FasL-mRNA

(Dhein et al., 1995; Kirkin et al., 2007) und einem ansteigenden FasL-Gehalt in

CD4+- und CD8+-T-Zellen (Janssen et al., 2000b; Suda et al, 1995). In der

vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der TZR/CD3/CD28-Aktivierung auf die

Expression des FasL näher analysiert. Die Stimulation von T-Zellblasten mit

immobilisierten Antikörpern gegen CD3 und CD28 resultierte in einer Induktion des

FasL-Sheddings, welches vergleichbar mit der TPA/Ionomycin-induzierten Proteolyse

war (Abbildung 5.14/5.15). Die Kinetik der ADAM10-Oberflächenexpression zeigte

bei CD3/CD28-induzierter Aktivierung von PHA-Blasten ein ähnliches Profil wie bei

Stimulation der Zellen mit TPA/Ionomycin (Abbildung 5.16). Im Verlauf der

dreistündigen Stimulation blieb die Expression von membranständigem ADAM10

zunächst nahezu konstant. Anschließend wurde ein kontinuierlicher, leichter Abfall

über die letzten beiden Stunden gemessen. Die ADAM17-Oberflächenexpression

zeigte in den ersten zwei Stunden keinen Einfluss von anti-CD3/anti-CD28 und nahm

bis zum Ende der Stimulation konstant ab (Abbildung 5.17). Diese Kinetik steht im

Gegensatz zur TPA/Ionomycin-induzierten Expression von membranständigem

ADAM17, bei der nach 10 Minuten der zuvor beschriebene rapide Anstieg zu

beobachten war (siehe oben). Folglich wären unterschiedliche Reaktionswege bei

TPA/Ionomycin- und CD3/CD28-induzierter Stimulation denkbar. Die genauen

Bedingungen der beiden Aktivierungen müssten jedoch weiter analysiert werden, um

den Grund der unterschiedlich ausgeprägten induzierbaren Expression zu erklären.

Da die Aktivierung des TZR/CD3-Komplexes auf dem Vorhandensein aktiver Src-

Kinasen beruht, wurde der Einfluss des Src-Kinase-Inhibitors PP1 (Hanke et al.,

1996) auf die TZR/CD3/CD28-induzierte FasL-Proteolyse untersucht. Durch

Inhibition Src-verwandter Tyrosinkinasen mittels PP1 wurde die proteolytische

Prozessierung des FasL nach Stimulation mit anti-CD3 und anti-CD28 nahezu

komplett verhindert (Abbildung 5.18/5.19). In vorhergehenden Studien wurde bereits

gezeigt, dass bei einer Aktivierung des TZR/CD3-Komplexes ohne eine Beteiligung

der Src-Kinasen die induzierte Expression des FasL inhibiert wird (Dhein et al., 1995;

Oberg et al., 1997). Die TZR-induzierte Proteolyse des FasL setzt demnach das

Vorhandensein aktiver Src-Kinasen voraus. Die genaue Art der Interaktion von Src-

Kinasen mit dem FasL bzw. ADAM-Proteasen, z.B. über SH3-vermittelte

Wechselwirkungen, müssten in weiteren Analysen näher untersucht werden.

Diskussion

117

In vorhergehenden Studien und im Rahmen dieser Arbeit wurde ADAM10 bei

TPA/Ionomycin-Stimulation durch siRNA-Transfektion als verantwortliche Protease

identifiziert. Herunterregulation von ADAM17 zeigte hierbei keinen wesentlichen

Effekt auf die FasL-Proteolyse (Abbildung 5.11). Da ein Einfluss der Stimulation von

PHA-Blasten mit anti-CD3 und anti-CD28 auf die Expression des FasL

nachgewiesen wurde, sollte die verantwortliche Protease bezüglich des

TZR/CD3/CD28-induzierten Sheddings identifiziert werden. Spezifische

Herunterregulation mittels siRNA-Transfektion resultierte in der Reduktion von

löslichem FasL und FasL-NTFs. Interessanterweise führte auch die Transfektion von

ADAM17-siRNA zu einer noch deutlich verminderten Proteolyse

(Abbildung 5.20/5.22). Wurden ADAM10 und ADAM17 gemeinsam herunterreguliert,

wurde die geringste Prozessierung des FasL beobachtet. Im Gegensatz zur

TPA/Ionomycin-induzierten Proteolyse spielt ADAM17 beim TZR/CD3/CD28-

induzierten Shedding offensichtlich eine wesentliche Rolle und stellt hierbei eventuell

sogar die prominente Sheddase dar. Auch in diesen Versuchen wird deutlich, dass

die beiden verschiedenen Arten der Stimulation verschiedene Signalwege innerhalb

der Zelle auslösen und in der FasL-Proteolyse durch verschiedene ADAM-Proteasen

resultieren.

6.2 Lokalisation von ADAM10, ADAM17 und FasL in T-Zellen

6.2.1 Lokalisation in sekretorischen Lysosomen

Als Hauptort der Proteolyse von membranständigen Molekülen wird die

Zelloberfläche angesehen. Es wird aber auch vermutet, dass bereits in intrazellulären

Kompartimenten Shedding stattfinden kann. Für einige Substrate von ADAM-

Proteasen konnten bereits zusätzliche Orte der Proteolyse gezeigt werden. So wurde

für das Adhäsionsmolekül L1 konstitutives Shedding durch ADAM10 in

sekretorischen Vesikeln, die Exosomen ähneln, beobachtet (Gutwein et al., 2005).

Das amyloide Vorläuferprotein APP wird bekanntermaßen auf der Plasmamembran

prozessiert, aber auch das trans-Golgi-Netzwerk (TGN) wurde als Ort der APP-

Proteolyse identifiziert (Skovronsky et al., 2000). Weiterhin wurde für Neuregulin-1

(NRG) eine intrazelluläre Proteolyse durch ADAM19 (Meltrin-β) an Stelle der

Proteolyse auf der Zellmembran vermutet (Shirakabe et al., 2001).

Diskussion

118

Die TPA/Ionomycin-induzierte Erhöhung der ADAM17-Oberflächenexpression nach

10-30 Minuten legt die Speicherung von ADAM17 in lysosomalen Kompartimenten

nahe, insbesondere da dieser Vorgang durch Inhibitoren der Aktinmaschinerie

unterbunden werden kann (Ebsen et al., 2013). Für den FasL wurde eine

Speicherung in sekretorischen Lysosomen gezeigt, welche nach Kontakt mit der

Zielzelle in einem aktinabhängigen Vorgang zur immunologischen Synapse

transportiert werden (Bossi und Griffiths, 1999; Blott et al., 2001; Lettau et al., 2004).

Um eine mögliche intrazelluläre Kolokalisation der Proteasen mit dem FasL in

sekretorischen Lysosomen zu untersuchen, wurden OptiPrepTM-basierte

Dichtegradienten nach einem in der Arbeitsgruppe etablierten Protokoll zur

Anreicherung lysosomaler Kompartimente (Schmidt et al., 2009) aufgetrennt und die

erhaltenen Fraktionen anschließend charakterisiert. ADAM10 und ADAM17 wurden

beide in der Fraktion 2 nachgewiesen, wo auch der FasL als Marker für sekretorische

Lysosomen detektiert wurde (Abbildung 5.23). Die erfolgreiche Auftrennung der

Gradienten wurde weiterhin durch den Nachweis weiterer Markerproteine gezeigt

(Schmidt et al., 2009). In einem weiteren Versuch wurde analysiert, ob sich die

Stimulation des TZR/CD3-Komplexes mit anti-CD3 auf die Lokalisation von ADAM10,

ADAM17 oder des FasL auswirkt. Auch hier wurden ADAM10 und ADAM17 in

derselben Fraktion wie der FasL detektiert (Abbildung 5.24). Nach Stimulation mit

anti-CD3 änderte sich die Verteilung der Proteine in den Fraktionen nicht, es wurden

jedoch zusätzliche Banden für ADAM10 und ADAM17 beobachtet. Während für

ADAM10 eine Bande auftrat, die etwa das dreifache Molekulargewicht von reifem

ADAM10 aufwies und eventuell ein Trimer von ADAM10 darstellen könnte, wurden

bei Detektion von ADAM17 deutliche Banden mit einem geringeren Molekulargewicht

beobachtet. Die Stimulation der PHA-Blasten mit anti-CD3 könnte bezüglich

ADAM17 zu einer Prozessierung der Protease in lysosomalen Kompartimenten

führen.

Die Analysen der Dichtegradienten zeigten, dass sowohl ADAM10 als auch ADAM17

in T-Zellen in lysosomalen Kompartimenten lokalisiert sind und eventuell schon hier

mit dem FasL zusammentreffen. Ob diese Vesikel innerhalb der Zelle bereits Ort der

proteolytischen Prozessierung des FasL sein können, muss in weiteren Analysen

untersucht werden. Außerdem muss der Effekt der TZR/CD3-Aktivierung auf

ADAM10 und ADAM17 näher analysiert werden, um die Identität der entstehenden

Banden zu erklären.

Diskussion

119

6.2.2 Aktivierungsinduzierte Änderungen der Lokalisation

Wie für den FasL gezeigt wurde, hängt die Induktion von Apoptose von der

Lokalisation in Cholesterol-angereicherten Mikrodomänen (Lipid Rafts) ab und

dessen Auflösung führt zu verminderter Zytotoxizität (Scheel-Toellner et al., 2002;

Cahuzac et al., 2006; Nachbur et al., 2006). Für diese Lokalisation ist die

intrazelluläre Domäne des FasL essentiell, was eine Beteiligung von regulatorischen

SH3-Domäne-Proteinen wahrscheinlich macht (Cahuzac et al., 2006). Als weiterer

möglicher Ort der FasL-Proteolyse mit der prozessierenden ADAM-Protease wurde

deshalb eine Lokalisation in lipidhaltigen Signalplattformen der Plasmamembran

untersucht.

Diese Domänen zeichnen sich durch einen hohen Gehalt an Cholesterol und

Sphingolipiden aus und weisen folglich eine hohe Fluidität auf. Die Isolierung

lipidhaltiger Mikrodomänen kann durch Behandlung der Zellen mit kaltem Triton X-

100-Lysepuffer erfolgen. Als Detergenz-resistente Membranen (DRMs) wandern die

Lipid Rafts durch ihre geringe Dichte in einem Dichtegradienten in die leichteren

Fraktionen. In der vorliegenden Arbeit wurden Zellen in 1% Triton X-100 lysiert und

das Lysat anschließend über Sucrose-Dichtegradienten aufgetrennt. Die erhaltenen

Fraktionen wurden mittels Western Blot analysiert. In Lysaten unstimulierter T-Zellen

(PHA-Blasten und Jurkat-Zellen) wurde ADAM10 und ADAM17 ausschließlich in

Fraktionen großer Dichte am Boden des Gradienten nachgewiesen, während der

FasL zu einem geringen Anteil auch in Fraktionen geringer Dichte lokalisiert war

(Abbildung 5.25A/5.26A). Dies zeigt für unstimulierte Zellen eine räumliche Trennung

des FasL von den beiden Proteasen. Nach Stimulation des TZR/CD3-Komplexes

allerdings wurde eine Verschiebung von schweren zu leichten Fraktionen von

ADAM10, ADAM17 und auch dem FasL beobachtet (Abbildung 5.25B/5.26B). Die

Inhibierung von Src-Kinasen, die Raft-assoziiert sind und daher als Marker für DRMs

verwendet werden, resultierte in einer deutlichen Reduktion der Verschiebung nach

Behandlung der Zellen mit anti-CD3 (Abbildung 5.27). Dies zeigt, dass für die

aktivierungsinduzierte Translokation von ADAM10, ADAM17 und des FasL aktive

Src-Kinasen vorhanden sein müssen.

Zusätzlich wurden Zellen vor der Stimulation mit Methyl-β-Cyclodextrin (MβCD)

behandelt. MβCD führt zur Extraktion von Cholesterol aus den Zellen und

nachfolgend zur Zersetzung der Signalplattformen. Hierdurch kann sichergestellt

Diskussion

120

werden, dass es sich bei den isolierten Mikrodomänen um Cholesterol-angereicherte

Lipid Rafts handelt. Nach Behandlung der Zellen mit MβCD war eine reduzierte

Verschiebung von ADAM10 und dem FasL nachweisbar und auch der DRM-Marker

Lck wurde weniger abundant in leichten Fraktionen detektiert (Abbildung 5.28). Die

Behandlung der Zellen mit MβCD war demnach erfolgreich und es handelte sich bei

der Isolation um eine Anreicherung von DRMs. In einer vorhergehenden Studie

wurde der unprozessierte FasL in leichten und schweren Fraktionen detektiert,

während FasL-NTFs ausschließlich in Fraktionen geringer Dichte detektiert wurden.

Für ADAM10 konnte gezeigt werden, dass lediglich die reife Form in leichten

Fraktionen lokalisiert war. Zersetzung der Rafts durch Cholesteroloxidase resultierte

in einer geringeren Proteolyse des FasL und folglich weniger FasL-NTFs in leichten

Fraktionen (Guardiola-Serrano et al., 2010).

Zu den posttranslationalen Modifikationen, die die Lokalisation in Lipid Rafts

begünstigen, gehören die Addition von GPI-Ankern, Palmitoylierungen oder

Myristoylierungen. Es wurde bereits gezeigt, dass das FasL-Shedding die

Palmitoylierung der Aminosäure 82 voraussetzt, eine Interaktion von ADAM10 mit

dem FasL davon jedoch unabhängig ist (Guardiola-Serrano et al., 2010). In einem

weiteren Versuch wurde die Bedeutung von Palmitoylierungen auf die TZR/CD3-

induzierte Translokation der Proteasen und dem FasL analysiert, indem die Zellen

vor der Stimulation mit dem Palmitoylierungsinhibitor 2-Brompalmitat (2BP)

behandelt wurden. Trotz der Behandlung wurden ADAM10 und ADAM17 nach der

Stimulation mit anti-CD3 in leichten Fraktionen nachgewiesen und schienen sogar

leicht verstärkt in DRMs lokalisiert zu sein. Auch der FasL wurde nach der Inkubation

mit 2BP verstärkt in Fraktionen geringer Dichte detektiert (Abbildung 5.29). Lediglich

die Raft-assoziierte Src-Kinase Lck zeigte eine geringere Abundanz in 2BP-

behandelten Zellen. Es wurde bereits u.a. für Lck beschrieben, dass die Behandlung

mit 2BP zum Verlust der Raft-Assoziation führt, da die Palmitoylierung von Lck

essentiell für die Lokalisation in DRMs ist (Webb et al., 2000). Auch für die NKG2D-

Liganden MICA/B (MHC-class-I-related chain A/B) konnte eine reduzierte Proteolyse

nach 2BP-Behandlung nachgewiesen werden (Buotet et al., 2009; Agüera-González

et al., 2011). Der Einfluss von Palmitoylierungen auf die Proteolyse wurde auch für

TNF-α gezeigt, jedoch bewirkt sie in diesem Beispiel eine Inhibition des RIPpings des

membranständigen Fragments, nicht jedoch des Sheddings durch ADAM17 (Poggi et

al., 2013).

Diskussion

121

Eine weitere posttranslationale Modifikation, die zu einer Lokalisation von

Membranproteinen in lipidhaltigen Mikrodomänen beitragen kann, ist die Addition

einer Myristinsäure an N-terminale Glycinreste, auch Myristoylierung genannt. Diese

Modifikation kann durch die Zugabe von 2-Hydroxymyristylsäure (2HMA) inhibiert

werden. In der TZR/CD3-induzierten Translokation der betrachteten ADAM-

Proteasen und des FasL konnte jedoch eher eine Verstärkung der Lokalisation in

leichten Fraktionen nach 2HMA-Behandlung festgestellt werden (Abbildung 5.30).

Folglich scheinen Myristoylierungen nicht an der veränderten Lokalisation oder der

gesteigerten Aktivität der Proteasen beteiligt zu sein.

Der Einfluss der verschiedenen Inhibitoren sollte auch bezüglich der FasL-Proteolyse

analysiert werden. CD4+-T-Zellen wurden entsprechend behandelt und anschließend

mit anti-CD3/anti-CD28 stimuliert. Die FasL-Prozessierung wurde durch Detektion

von FasL-NTFs und sFasL analysiert. Cholesteroldepletion durch MβCD resultierte in

einer starken Verminderung von NTFs, ebenso wie die Inhibition von

Palmitoylierungen über 2BP (Abbildung 5.31/32). Die kombinierte Inhibition von

Myristoylierungen durch 2HMA und Palmitoylierung durch 2BP zeigte die stärkste

Reduktion der FasL-Fragmente, während die Inkubation mit 2HMA allein keinen

Effekt hatte (Abbildung 5.31/32). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass weder

Palmitoylierung noch Myristoylierung die Translokation von ADAM10, ADAM17 oder

des FasL bedingt, da die Inhibition einer der Modifikationen keine Änderung bewirkt.

Trotzdem scheinen Palmitoylierungen bei dem TZR/CD3/CD28-induziertem

Shedding eine Rolle zu spielen, da die Proteolyse des FasL bei 2BP-Behandlung

stark reduziert ist. Dies könnte jedoch auch sekundär bedingt an der verminderten

Raft-Assoziation der Kinase Lck oder anderer Mitglieder der Src-Familie liegen, die

bei der TZR-Aktivierung auch im Kontext des FasL-Sheddings eine wichtige Rolle

einnehmen.

Die Lokalisation und Aktivität der ADAM-Proteasen in Bezug auf ein bestimmtes

Substrat scheint stark zwischen verschiedenen Zelltypen zu variieren. So wurde für

eine Vielzahl von Substraten und deren ADAM-Proteasen eine differentielle

Lokalisation gezeigt. Häufig wurde für ADAM10 und ADAM17 eine Lokalisation

außerhalb und für die Substrate innerhalb der Cholesterol-angereicherten

Signalplattformen beobachtet. ADAM10 wurde im Zusammenhang mit dem

Adhäsionsmolekül CD44 in Triton X-100-löslichen Fraktionen detektiert (Murai et al.,

Diskussion

122

2011), ebenso wie in Bezug auf APP (Kojro et al., 2001), L1-CAM (Mechtersheimer

et al., 2001) und dem IL6R (Matthews et al., 2003). Auch ADAM17 wurde oft in

schweren Fraktionen getrennt von dem jeweiligen Substrat nachgewiesen, z.B. für

CD30 (von Tresckow et al., 2004), Kollagen XVII (Zimina et al., 2005) und dem IL6R

(Matthews et al., 2003). In den erwähnten Studien führte die Depletion von

Cholesterol stets zu einer Erhöhung der Proteolyse durch Aufhebung der räumlichen

Trennung von Substrat und Enzym. Für TNF-α und die beiden Rezeptoren TNFR1

und TNFR2 konnte das ADAM17-vermittelte Shedding ebenfalls als Raft-assoziiert

nachgewiesen werden, jedoch wurde hier ADAM17 auch in leichten Fraktionen

detektiert (Tellier et al., 2006; D’Alessio et al., 2012). ADAM19 (Meltrin-β) wurde

ebenfalls in Rafts lokalisiert und das Shedding von Neuregulin-1 als Raft-abhängiges

beschrieben (Wakatsuki et al., 2004). Parr-Sturguess und Kollegen wiesen auch ein

Vorkommen von ADAM17 in Lipid Rafts nach, jedoch ist die Proteolyse des Notch-

Liganden Jagged1 durch ADAM17 nicht Raft-assoziiert (Parr-Sturgess et al., 2010).

Die Proteolyse von CD154 (CD40-Ligand) wurde ebenfalls als Raft-unabhängig

beschrieben (Yacoub et al., 2013). Auch wenn die Lokalisationen von Substraten und

ADAM-Proteasen stark voneinander abweichen, zeigt der aufgeführte Vergleich eine

wichtige Beteiligung von lipidhaltigen Mikrodomänen zur Regulation des Sheddings

durch räumliche Trennung. In T-Zellen konnte ebenfalls eine große Rolle von Lipid

Rafts in der Prozessierung des FasL gezeigt werden, da bei ihrer Auflösung die CD3-

induzierte Proteolyse inhibiert wurde.

6.3 Interaktionspartner der intrazellulären Domäne von ADAM10

SH3-Domäne-Proteine ermöglichen durch Bindung an Proteine mit Prolin-reichen

Bindungsstellen die gezielte Regulierung der gebundenen Proteine in Bezug auf

dessen Expression, Lokalisierung und Aktivität. Für ADAM-Proteasen wurde bereits

eine Vielzahl von Interaktionspartnern mit SH3-Domänen identifiziert, die teilweise

regulatorisch auf die Protease wirken. Auch der FasL interagiert mit SH3-Domäne-

Proteinen, die seine subzelluläre Lokalisation beeinflussen (Voss et al., 2009).

Außerdem wurden für die unterschiedlichen Fragmente des FasL differentielle

Interaktionen mit PACSINen und SNXen nachgewiesen (Lettau et al., 2014). Im

Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden interagierende SH3-Domänen von ADAM10

analysiert. Humanes ADAM10 enthält in der intrazellulären Region zwei potentielle

SH3-Bindungsmotive (AS 708-717, PKLPPPKPLP; und AS 722-728, RRRPPQP;

Diskussion

123

siehe Abbildung 1.4) zur möglichen Interaktion mit SH3-Domänen. Durch die

Verwendung einer kommerziell erhältlichen Phagenbibliothek (All SH3 Domain

Phager®) mit allen 305 humanen SH3-Domänen konnten in zwei separaten Ansätzen

38 SH3-Domänen als potentielle Interaktionspartner der zytoplasmatischen Domäne

von ADAM10 identifiziert werden (Abbildung 5.36, Tabelle 5.1). Die meisten

Kandidaten wurden jedoch nur ein- (27 Klone) oder zweimal (8 Klone) identifiziert.

Am häufigsten wurde die SH3-Domäne des endozytotisch relevanten Proteins

Endophilin-A2 (8 Klone), der Src-verwandten Tyrosinkinase Lck (5 Klone) und der

Palmitoylierungstransferase ZDHHC6 (3 Klone) identifiziert. Die Anzahl identifizierter

Klone spiegelt nicht automatisch die Bindungsspezifität der SH3-Domäne an den

intrazellulären Teil von ADAM10 wieder. Theoretisch sollten alle Phagen mit den

entsprechenden SH3-Domänen in gleicher Zahl in der Phagenbibliothek vorhanden

sein, dennoch können Unterschiede in der Häufigkeit der Klone auftreten. Außerdem

wurde trotz stringentem Waschens der Beads eine Vielzahl verschiedener SH3-

Domänen nachgewiesen, die mit dem Kontrollprotein GST präzipitiert wurden. Dies

könnte an dem relativ großen Anteil GST (234 AS) im Verhältnis zur

zytoplasmatischen Domäne von ADAM10 (51 AS) liegen. SH3-Domänen, die mit

GST und GST-ADAM10(697-748) präzipitierten (Tabelle A1), wurden bei der

nachfolgenden Analyse zunächst nicht berücksichtigt. Die für ADAM10 identifizierten

SH3-Domänen gehören u.a. zu verschiedenen Familien von Adapterproteinen,

Tyrosinkinasen und Palmitoyltransferasen. Viele der Proteine wurden bereits in

vorhergehenden Studien als Interaktionspartner anderer ADAM-Proteasen

identifiziert.

Endophiline

Die SH3-Domäne von Endophilin-A2 (SH3GL1, EEN) wurde in 8 Klonen von GST-

hADAM10(697-748)-Präzipitaten nachgewiesen. Endophilin-A2 ist ein Mitglied der

Endophilin-Familie, die N-terminal eine Bin-Amphiphysin-Rvs-Domäne und C-

terminal eine SH3-Domäne aufweisen. Sie sind zytoplasmatische Proteine, die bei

Endozytoseprozessen über ihre N-BAR-Domäne die Krümmung der Membran

beeinflussen (de Heuvel et al., 1997; Ringstad et al., 1997; Peter et al., 2004; Gallop

et al., 2006). Endophilin-A2 wird im Gegensatz zu Endophilin-A1 und –A3 ubiquitär

exprimiert (Ringstad et al., 1997). Endophilin-A1 wurde in einem Yeast-Two-Hybrid-

Screen und nachfolgenden Pull-Down-Analysen und Ko-Immunpräzipitationen

Diskussion

124

bereits als Interaktionspartner von ADAM9 und ADAM15 identifiziert,

interessanterweise jedoch nur mit den unreifen Formen (Howard et al., 1999). In

diesem Zusammenhang wurde für Endophilin-A1 eine regulatorische Rolle bezüglich

der Reifung, Lokalisation und folglich der Aktivität der ADAM-Proteasen vermutet.

Zur Verifizierung der Interaktion von Endophilin-A2 mit der zytoplasmatischen

Domäne von ADAM10 wurden Pull-Down-Analysen mit der SH3-Domäne von

Endophilin-A2 durchgeführt. Die unreife Form von ADAM10 wurde mit der SH3-

Domäne von Endophilin-A2/EEN präzipitiert, die reife Form konnte jedoch nicht

nachgewiesen werden (Abbildung 38A). Wie zuvor für Endophilin-A1 und

ADAM9/ADAM15 gezeigt wurde, weist die Bindung von Endophilin-A2 an die unreife

Form von ADAM10 auf eine mögliche regulatorische Funktion bezüglich der Reifung

von ADAM10 hin. Die Interaktion wurde zusätzlich mit Ko-Immunpräzipitationen von

mADAM10- und EEN-transfizierten HEK293T-Zellen bekräftigt. Da die intrazelluläre

Domäne von murinem ADAM10 lediglich in einer Aminosäure außerhalb der Prolin-

reichen Region von der humanen Domäne abweicht, konnte für die Versuche das

vorhandene murine Konstrukt verwendet werden. ADAM10 konnte mit Endophilin-

A2/EEN präzipitiert werden und auch EEN wurde in Präzipitaten von ADAM10

nachgewiesen (Abbildung 5.38B). Die genaue Funktion der Interaktion, insbesondere

auf die Reifung von ADAM10, muss jedoch in weiteren Experimenten näher

analysiert werden.

Src-verwandte Tyrosinkinasen

In der Analyse interagierender SH3-Domänen der intrazellulären Region von

ADAM10 wurden die Tyrosinkinasen Lck, Src und Abl identifiziert. Die Src-Familie

umfasst neun Mitglieder (Blk, Fgr, Frk, Fyn, Hck, Lck, Lyn, Src, Yes), die zytosolisch

bzw. membranständig (assoziiert mit Lipid Rafts) lokalisiert sind und bei

verschiedenen Signaltransduktionsprozessen, u.a. der Aktivierung von T-und B-

Zellen, eine wichtige Rolle einnehmen (Lowell, 2011). Abl ist eine verwandte

Tyrosinkinase. Neben der Beteiligung bei Migration, Adhäsion und Apoptose von

Zellen trägt sie durch Phosphorylierungen von Rezeptortyrosinkinasen wie dem

EGFR zum TZR-Signalweg bei (Tanos und Pendergast, 2006; Gu et al., 2009). Die

Interaktion von ADAM10 mit verschiedenen Mitgliedern der Src-Familie und Abl

konnte durch Pull-Down-Experimente gezeigt werden (Abbildung 5.39). Zusätzlich

Diskussion

125

wurde aus T-Zelllysaten endogenes ADAM10 mit Lck immunpräzipitiert

(Abbildung 5.40).

Für mehrere ADAM-Proteasen sind bereits Interaktionen mit Src-Kinasen beobachtet

worden. So wurde für den intrazellulären Teil von ADAM12 eine Bindung von Src und

die Phosphorylierung durch Src nachgewiesen (Kang et al., 2000; Suzuki et al.,

2000). Weiterhin wurden Src, Lck, Fyn und Abl als Interaktionspartner der

zytoplasmatischen Region von ADAM15 identifiziert (Poghosyan et al., 2002). Durch

die Stimulation der Zellen mit Phorbolester wurde eine ansteigende Phosphorylierung

von ADAM15, assoziiert mit einer erhöhten Bindung der Kinasen, gezeigt.

Dephosphorylierung resultierte in einer verminderten Bindung von ADAM15 an die

Kinasen Lck, Hck und Fyn sowie das Adapterprotein Grb2. In diesem

Zusammenhang wurde die direkte Phosphorylierung von ADAM15 durch Hck und

Lck nachgewiesen (Poghosyan et al., 2002).

Die Palmitoylierungstransferase ZDHHC6

Die SH3-Domäne der Palmitoylierungstransferase ZDHHC6 (zink finger DHHC

domain-containing protein 6) wurde in der Analyse interagierender SH3-Domänen

dreimal identifiziert. ZDHHC6 gehört zu der wenig erforschten Familie der DHHC-

Palmitoylierungstransferasen. Wie bereits erwähnt kann Palmitoylierung als

posttranslationale Modifikation eine Lokalisation in lipidhaltigen Mikrodomänen

bewirken, aber auch die intrazelluläre Lokalisation von Proteinen wird hierdurch

beeinflusst. So wird das ER-Protein Calnexin durch die ZDHHC6 modifiziert und in

das raue ER transloziert (Lakkaraju et al., 2012) und auch für Abl wurde eine

Interaktion mit ZDHHC16 beschrieben (Li et al., 2002). Palmitoylierungen von ADAM-

Proteasen sind bisher nicht beschrieben. Wie jedoch im Rahmen dieser Arbeit

gezeigt wurde, spielt Palmitoylierung als posttranslationale Modifikation eine Rolle

bei der Prozessierung des FasL, da eine Inhibition durch 2BP zu einer Reduktion des

Sheddings führt. Weiterhin wurde in einer früheren Studie die Palmitoylierung der

Aminosäure 82 des FasL als essentiell für die Zytotoxizität und die Proteolyse durch

ADAM10 und SPPL2a nachgewiesen (Guardiola-Serrano et al., 2010). Auch für viele

andere Substrate von ADAM-Proteasen wurde der Einfluss von Palmitoylierungen

zur Regulation der Proteolyse deutlich. Die Prozessierung von MICA/B (MHC-class-I-

related chain A/B) durch die Lokalisation in Cholesterol-angereicherten

Mikrodomänen wird auch durch Palmitoylierung reguliert und die Inhibition von

Diskussion

126

Palmitoylierungen reduzierte die Proteolyse (Buotet et al., 2009; Agüera-Gonzalez et

al., 2011). In Bezug auf die Regulation von ADAM10 konnte beobachtet werden,

dass nur palmitoyliertes Tetraspanin12 an ADAM10 bindet und dessen Lokalisation

und Reifung beeinflusst, was wiederum die Proteolyse von APP beeinträchtigt (Xu et

al., 2009).

Die Palmitoylierungstransferase ZDHHC6 könnte demnach nicht nur direkt auf

ADAM10 Einfluss nehmen, sondern auch über verschiedene Substrate und

regulatorische Proteine. Durch das Fehlen geeigneter Antikörper und Reagenzien

konnte leider keine Verifizierung der Interaktion erfolgen und die Relevanz der

Interaktion von ADAM10 und ZDHHC6 kann nur hypothetisch analysiert werden.

Grb2-Adapterproteine

Adapterproteine fungieren in der Zelle bei Signaltransduktionsprozessen, indem sie

durch ihre verschiedenen Interaktionsmodule andere Proteine miteinander in

Verbindung bringen und so zur Formierung von Proteinkomplexen beitragen (Chardin

et al., 1995; Leo et al., 2002). Die Grb2-Proteinfamilie besteht aus drei Mitgliedern

(Grb2, GRAP und GRAP2). Während Grb2 in einer Vielzahl von Zellen exprimiert ist,

beschränkt sich die Expression von GRAP und GRAP2 auf hämatopoetische Zellen.

Alle drei Mitglieder sind aus zwei flankierenden SH3- und einer mittleren SH2-

Domäne aufgebaut, wodurch die gleichzeitige Interaktion mit mehreren Proteinen

ermöglicht wird (Chardin et al., 1995).

In der Analyse interagierender SH3-Domänen wurden die SH3-Domänen von Grb2

(2 Treffer) und GRAP2 (1 Treffer) in Präzipitaten des GST-hADAM10(697-748)-

Fusionsproteins identifiziert, nicht jedoch in Präzipitaten des Kontrollproteins GST.

Die Verifizierung der Interaktion erfolgte mittels Pull-Down und Ko-

Immunpräzipitationen (Abbildung 5.41). In der Pull-Down-Analyse wurde eine

bevorzugte Bindung von ADAM10 an die C-terminalen SH3-Domänen von Grb2,

GRAP und GRAP2 beobachtet. Auch für andere ADAM-Mitglieder wurde bereits eine

Interaktion mit Grb2-Proteinen nachgewiesen. In einer Studie konnte ADAM12 durch

Präzipitation von Grb2 kopräzipitiert werden (Suzuki et al., 2000). Später wurde die

Internalisierung von ADAM12 als Grb2-abhängig beschrieben (Stautz et al., 2012).

Auch ADAM15 wurde als Interaktionspartner von Grb2 identifiziert und

Dephosphorylierung resultierte in verminderter Bindung von Grb2 (Poghosyan et al.,

Diskussion

127

2002), was eventuell durch eine Beteiligung von SH2-Domänen zu erklären ist, da

diese phosphorylierte Tyrosingruppen binden.

PACSINe

Eine weitere Proteinfamilie, die an Exo- und Endozytoseprozessen beteiligt ist, ist die

PACSIN-(PKC and casein kinase substrate in neurons)Familie. In der Analyse

interagierender SH3-Domänen wurde PACSIN3 als potentiell interagierendes Protein

von ADAM10 identifiziert. PACSINe gehören zur Gruppe der PCH-(pombe Cdc15

homology-) Proteine. Sie weisen, ähnlich den Endophilinen, eine F-BAR-Domäne

auf, mit der sie die Membrankrümmung und folglich die Endo- und Exozytose

beeinflussen (Chitu und Stanley, 2007; Aspenström, 2009). Über Pull-Down-

Analysen wurde die Interaktion von ADAM10 mit den drei Mitgliedern der PACSIN-

Familie verifiziert (Abbildung 5.42/43). Interessanterweise fiel die Interaktion von

ADAM10 und ADAM17 mit PACSIN3 verstärkt aus. Eine bevorzugte Bindung an

PACSIN3 müsste jedoch in zusätzlichen Analysen näher untersucht werden.

Andere ADAM-Proteasen wurden zuvor ebenfalls als interagierende Proteine der

PACSINe beschrieben. Die erste Interaktion wurde für ADAM13 mit X-PACSIN2 in

Xenopus-Embryos gezeigt und die Überexpression von X-PACSIN2 konnte die

Defekte der Embryogenese durch die endogene Expression von ADAM13 aufheben

(Cousin et al., 2000). Weiterhin wurde eine Interaktion von PACSIN3 und ADAM12

zunächst in einem Yeast-Two-Hybrid-Screen gezeigt und anschließend durch Pull-

Down-Analysen und Immunpräzipitationen bekräftigt (Mori et al., 2003). Die

Überexpression von PACSIN3 resultierte in verstärkter Proteolyse des EGF-

ähnlichen Wachstumsfaktor (proHB-EGF); Herunterregulation reduzierte das

Shedding (Mori et al., 2003).

Sorting Nexine

Eine weitere Proteinfamilie, die im Rahmen dieser Arbeit analysiert wurde, ist die

Familie der Endozytose-relevanten Sorting Nexine (SNXe). Sie werden ubiquitär

exprimiert und fungieren als Adapterproteine zur Regulation der Endozytose,

Signaltransduktion und intrazellulären Lokalisation von Proteinen. Die SNX9-

Subfamilie besteht aus drei Mitgliedern (SNX9, SNX18, SNX33), die jeweils eine

SH3-Domäne und eine insgesamt hohe Sequenzhomologie aufweisen. Sie besitzen

wie die Endophiline eine N-BAR-Domäne, mit der sie die Membrankrümmung

Diskussion

128

beeinträchtigen (Cullen, 2008; Cullen und Korswagen, 2012). SNX9 trägt u.a. zur

Internalisierung des TNF-Rezeptors (TNFR) und dem Abbau des EGF-Rezeptors

nach Signaltransduktion über EGF (Lin et al., 2002).

In vorhergehenden Studien wurden bereits andere Mitglieder der SNXe als

Interaktionspartner von ADAM-Proteasen identifiziert. SNX9 interagierte ebenso wie

Endophilin-A1 mit den unreifen Formen von ADAM9 und ADAM15 (Howard et al.,

1999). In einer weiteren Veröffentlichung wurde von einer Interaktion von SNX33 mit

der Prolin-reichen Region von ADAM15 berichtet (Kleino et al., 2009). Auch im

Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein Mitglied der SNXe, SNX18, als

potentiellen Interaktionspartner der zytoplasmatischen Domäne von ADAM10

identifiziert. Die Interaktion von ADAM10 mit SNX18 und auch SNX9 und SNX33

konnte durch Pull-Down-Analysen mit Lysaten überexprimierter SNXe verifiziert

werden (Abbildung 5.44).

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine Vielzahl von SH3-Domäne-Proteinen

als Interaktionspartner verifiziert. Mehrere der in vitro mit ADAM10 interagierenden

SH3-Domäne-Proteine wurden in vorhergehenden Studien auch als

Interaktionspartner des FasL identifiziert. Dazu zählen die Tyrosinkinasen Fgr, Fyn,

Lyn, Src, Tec and Yes (Wenzel et al., 2001, Voss et al., 2009), Mitglieder der Grb2-

Adapterproteine (Wenzel et al., 2001; Ghadimi et al., 2002), PACSINe (Ghadimi et

al., 2002; Qian et al., 2006) und SNXe (Thornhill et al., 2007; Voss et al., 2009). Viele

dieser Interaktionen zeigen Einfluss auf die Speicherung des FasL in intrazellulären

Vesikeln oder sind bei der aktivierungsinduzierten Mobilisierung des FasL auf die

Zelloberfläche beteiligt (Baum et al., 2005; Qian et al., 2006; Lettau et al., 2006). Eine

gemeinsame Regulation des FasL mit der verantwortlichen ADAM-Protease wäre

denkbar, insbesondere auch da eine differentielle Interaktion der unprozessierten

Form des FasL und FasL-NTFs mit SNXen und PACSINen beobachtet wurde (Lettau

et al., 2014). In diesem Zusammenhang wäre interessant, ob das unprozessierte

ADAM10 ebenfalls andere Bindungen eingeht als die durch ADAM9 und ADAM15

gespaltenen Fragmente. Die funktionelle Relevanz der Bindungen für die Aktivität

von ADAM10 (und ADAM17) in T-Zellen muss insbesondere, auch bezüglich der

FasL-Proteolyse, nachfolgend durch z.B. Überexpressionsstudien oder

Herunterregulation der interagierenden Proteine analysiert werden.

Diskussion

129

6.4 Proteolyse als posttranslationale Modifikation kontrolliert die

Expression des FasL

Vor dem Hintergrund der im Rahmen dieser Arbeit erhaltenen Daten lässt sich

zusammenfassen, dass eine Regulation der Expression des FasL bei

TPA/Ionomycin-induzierter Proteolyse durch ADAM10 und bei anti-CD3/CD28-

induzierter Proteolyse durch ADAM10 und ADAM17 erfolgt. Die beiden

Metalloproteasen unterscheiden sich bezüglich ihrer Kinetiken nach Stimulation mit

TPA/Ionomycin, haben jedoch eine TZR/CD3-induzierte Translokation in Cholesterol-

angereicherte Mikrodomänen gemeinsam, wo sie auf den angereicherten FasL

treffen. Der Anstieg der FasL-Prozessierung lässt sich durch Cholesteroldepletion,

Inhibition von Src-Kinasen und Reduktion von Palmitoylierungen verringern.

Bei der Regulation der Oberflächenexpression von ADAM10 und ADAM17 nach

TPA/Ionomycin- bzw. TZR/CD3/CD28-Stimulation ist eine Rolle von SH3-Domäne-

Proteinen sehr wahrscheinlich. Viele der identifizierten SH3-Domänen gehören zu

Proteinfamilien, die als Adapterproteine bei Endo- und Exozytoseprozessen

fungieren. Dies könnte auf eine mögliche Regulation der ADAM-Proteasen durch

Internalisierung hindeuten. In einem weiteren Ansatz im Rahmen dieser Arbeit wurde

die intrazelluläre Speicherung der Proteasen in sekretorischen Lysosomen

untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass ADAM10 und auch ADAM17 in

derselben Fraktion wie der FasL lokalisiert sind, was auf eine Speicherung in

lysosomalen Kompartimenten hindeutet. Auch bei der Sortierung von ADAM10

und/oder ADAM17 in intrazelluläre Speicherorganellen könnten SH3-Domäne-

Proteine eine Rolle spielen.

Ein hypothetisches Szenario der in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse zur

Regulation des FasL durch Proteolyse als posttranslationale Modifikation ist in

Abbildung 6.1 dargestellt. Die detaillierte Charakterisierung der Proteolyse des FasL

durch ADAM10 und ADAM17 nach TZR-Aktivierung, insbesondere im Hinblick auf

subzelluläre Lokalisation, induzierte Oberflächenexpression und der Regulation der

Aktivität durch Interaktionen mit SH3-Domäne-Proteine sind vonnöten, um das

Wissen bei einer Fehlregulation des Fas/FasL-Systems für Therapiezwecke nutzen

zu können.

Diskussion

130

Abb. 6.1: Proteolyse als posttranslationale Modifikation reguliert die Expression des FasL. Nach der Translation im Nukleus wird die ADAM-Protease im Endoplasmatischen Retikulum (ER) translatiert und das Signalpeptid vor der Translokation in das trans-Golgi-Netzwerk (TGN) abgespalten. Zur weiteren Reifung wird die N-terminale Prodomäne durch Proproteinkonvertasen (z.B. Furin) proteolytisch entfernt. Eine mögliche Speicherung von ADAM10/17 könnte durch die Interaktion mit SH3-Domäne-Proteine in sekretorischen Lysosomen erfolgen, in denen auch der FasL lokalisiert ist. Auch der Transport auf die Zelloberfläche und die proteolytische Aktivität kann durch regulatorische Proteine mit SH3-Domänen kontrolliert werden. In Lipid Rafts oder Tetraspanin-Plattformen trifft ADAM10/17 wahrscheinlich auf den FasL. Nach der Proteolyse wird ein lösliches Fragment freigesetzt, das autokrin oder parakrin binden kann. Internalisierung von ADAM10/17, eventuell auch unter Beteiligung von SH3-Domäne-Proteinen, oder Shedding durch andere ADAM-Proteasen (z.B. von ADAM10) kann die Oberflächenexpression regulieren. Intramembrane Proteolyse des C-terminalen Fragments (CTF) resultiert in der Freisetzung der intrazellulären Domäne (ICD) in das Zytosol. Modifiziert nach: Ebsen et al., 2014.

Zusammenfassung

131

7. Zusammenfassung

Der Fas-Ligand besitzt als Todesfaktor der TNF-Familie die Fähigkeit, durch Bindung

an seinen Rezeptor Apoptose in Fas-tragenden Zellen zu induzieren. Die Expression

des FasL muss daher zu jedem Zeitpunkt streng reguliert werden. Proteolyse durch

die Metalloprotease ADAM10 wurde in vorhergehenden Studien als eine

posttranslationale Modifikation des FasL zur Kontrolle der Expression identifiziert.

Die Stimulation mit Phorbolester (TPA) und Kalziumionophor (Ionomycin) wird häufig

zur induzierten Proteolyse des FasL verwendet. Es konnte im Rahmen der

vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass nur die Kombination der beiden Faktoren

zu einer Abnahme von membranständigem/reifem ADAM10 und einem deutlichen

Anstieg der FasL-Proteolyse resultiert. Durch spezifische Herunterregulation von

ADAM10 oder ADAM17 wurde für die TPA/Ionomycin-induzierte FasL-Proteolyse

ADAM10 als verantwortliche Protease identifiziert.

Weiterhin wurde der Einfluss der physiologischen Stimulation des TZR/CD3-

Komplexes und CD28-Kostimulation auf die Prozessierung des FasL untersucht.

Eine Aktivierung mit Antikörpern gegen CD3/CD28 resultierte in dem verstärkten

Shedding des FasL, vergleichbar mit der Stimulation mit Phorbolester und

Kalziumionophor. Dieser proteolytische Anstieg konnte durch Inhibition von Src-

Kinasen verhindert werden. Zusätzlich wurde durch transiente Herunterregulation für

die TZR/CD3/CD28-induzierte Proteolyse eine Beteiligung von ADAM10 und von

ADAM17 nachgewiesen.

Die subzelluläre Lokalisation der endogenen Proteasen ADAM10 und ADAM17 in T-

Zellen wurde bislang unzureichend untersucht. Die aktinabhängige, TPA/Ionomycin-

induzierbare Erhöhung der ADAM17-Oberflächenexpression deuten auf intrazelluläre

Speichervesikel hin, in denen auch der FasL als Marker für sekretorische Lysosomen

lokalisiert ist. Um die eventuelle Speicherung von ADAM10 und/oder ADAM17 in

lysosomalen Kompartimenten und eine eventuelle intrazelluläre Kolokalisation des

FasL mit ADAM10/17 zu untersuchen, wurden sekretorische Granula aus T-Zellen

extrahiert und analysiert. Sowohl ADAM10 als auch ADAM17 wurden in denselben

Fraktionen nachgewiesen, in denen auch der FasL lokalisiert ist. Sekretorische

Lysosomen könnten folglich ein intrazelluläres Kompartiment darstellen, in welchem

Zusammenfassung

132

Enzyme und Substrat aufeinander treffen. Die TZR/CD3-Stimulation änderte nichts

an der Verteilung, jedoch wurden für ADAM10 und ADAM17 zusätzliche Banden

detektiert.

Die Beteiligung von Raft-assoziierten Src-Kinasen bei dem TZR/CD3/CD28-

induzierten Shedding und vorhergehende Studien zur Lokalisation des FasL auf der

Plasmamembran legten eine mögliche Kolokalisation der ADAM-Proteasen und des

FasL in lipidhaltigen Signalplattformen nahe. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit

wurden Detergenz-resistente Membranen isoliert und nachgewiesen, dass ADAM10

und ADAM17 in unstimulierten T-Zellen nahezu komplett von Cholesterol-

angereicherten Raft-Fraktionen ausgeschlossen sind, während geringe Mengen des

FasL nachgewiesen werden konnten. Durch Aktivierung des TZR/CD3-Komplexes

erfolgte eine Änderung der Lokalisation zu Detergenz-resistenten Lipid Rafts von

ADAM10 und ADAM17 und auch eine stärkere Abundanz des FasL wurde

beobachtet. Diese aktivierungsinduzierte Verschiebung lässt sich durch

Cholesteroldepletion und Inhibition von Src-Kinasen aufheben, was in einer

verminderten FasL-Proteolyse resultierte. Zusätzlich wurde durch Verwendung eines

Palmitoylierungsinhibitors gezeigt, dass Palmitoylierung als posttranslationale

Modifikation für die TZR/CD3-induzierte Prozessierung des FasL von wesentlicher

Bedeutung ist.

Da ADAM10 in der zytoplasmatischen Domäne zwei Prolin-reiche Bindungsmotive

zur potentiellen Interaktion mit SH3-Domänen aufweist, wurden ergänzend zu

eigenen Vorarbeiten mögliche Interaktionspartner von ADAM10 über die

Verwendung einer Phagenbibliothek mit allen 305 humanen SH3-Domänen

identifiziert. 38 potentiell interagierende SH3-Domänen konnten in Präzipitaten der

intrazellulären Domäne von ADAM10 identifiziert werden. Eine Interaktion von

Endophilin-A2, Src-verwandte Tyrosinkinasen (Abl, Fyn, Hck, Lck, Src, Yes), Grb2-

ähnlichen Adapterproteinen (Grb2, GRAP, GRAP2), PACSINen (PACSIN1-3) und

SNXen (SNX9, SNX18, SNX33) konnte durch Pull-Down-Analysen und/oder Ko-

Immunpräzipitationen nachgewiesen werden.

Summary

133

8. Summary

As a member of the TNF superfamily, the Fas-Ligand can induce apoptosis by

binding to its receptor on Fas-positive cells. Therefore, the expression of the FasL

has to be strictly regulated at any time. As a posttranslational modification,

proteolysis by the metalloprotease ADAM10 was shown to control FasL expression.

Stimulation with phorbol ester (TPA) and calcium ionophore (Ionomycin) is often used

in order to induce proteolytic processing of FasL. It could be shown that only the

combination of both stimuli results in a mild decline of membrane bound ADAM10

and a high increase of FasL proteolysis. Downregulation of either ADAM10 or

ADAM17 proved that ADAM10 is indeed the main responsible sheddase of the FasL

during TPA/Ionomycin-induced proteolysis.

Providing a more physiological stimulus of T cells by activating the TCR/CD3

complex and CD28 as a co-stimulatory signal, the influence on proteolytic cleavage

of FasL was analyzed. TCR/CD3/CD28-induced activation resulted in increased

production of soluble FasL and NTFs, comparable to TPA/Ionomycin-induced

shedding. This effect can be blocked by using the Src kinase inhibitor PP1. Transient

transfection with specific siRNAs against ADAM10 and/or ADAM17 revealed an

influence of both ADAM10 and ADAM17 in TCR/CD3/CD28-induced proteolysis.

Inducible surface expression of ADAM17 after TPA/Ionomycin treatment, which can

be blocked by inhibitors of actin filament formation, suggesting a storage of ADAM17

in vesicular compartments. In order to address an intracellular exposition of FasL with

the two proteases, secretory granules were isolated from T cells. Both ADAM10 and

ADAM17 were detected in the same organelle fractions, where also FasL as a

marker for secretory lysosomes was present. Activation of the TCR/CD3 complex did

not alter the distribution of ADAMs and FasL. Secretory lysosomes might therefore

reveal a putative intracellular storage compartment for enzymes and substrate.

Furthermore, localization of ADAM10/ADAM17 and FasL in cholesterol-enriched

microdomains was analyzed. In unstimulated T cells, both proteases were more or

less excluded from light raft fractions, whereas low amounts of FasL could also be

detected in lipid rafts. Activation of the TCR/CD3 complex resulted in increased

recruitment of ADAM10, ADAM17 and FasL to light fractions. This activation-induced

shift was prevented by inhibiting Src kinases or depletion of cholesterol., also leading

Summary

134

to reduced levels of sFasL and NTF formation. In addition, also the inhibition of

palmitoylation as a posttranslational modification was shown to reduce shedding

activity.

ADAM10 contains two proline-rich regions for SH3 domain-binding within the

cytoplasmic tail. In order to screen for interacting proteins, a phage display library

containing all human 305 SH3 domains was used. 38 putative interacting SH3

domains were identified from precipitates with the cytoplasmic portion of ADAM10.

Interactions were confirmed for Endophilin-A2, Src-related tyrosine kinases (Abl, Fyn,

Hck, Lck, Src, Yes), Grb2-related adapter proteins (Grb2, GRAP, GRAP2), PACSINs

(PACSIN1-3) and SNXs (SNX9, SNX18, SNX33) by pull down and/or co-

immunoprecipitations.

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135

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Anhang

152

10. Anhang

10.1 Publikationsliste

Originalarbeiten

Ebsen H, Schröder A, Kabelitz D, Janssen O.

Differential surface expression of ADAM10 and ADAM17 on human T lymphocytes and tumor cells.

PLoS One. 2013 Oct 9;8(10):e76853.

Lettau M, Voss M, Ebsen H, Kabelitz D, Janssen O.

Differential protein-protein interactions of full length human FasL and FasL fragments generated by proteolysis.

Exp Cell Res. 2014 Jan 15;320(2):290-301.

Ebsen H, Lettau M, Kabelitz D, Janssen O.

Identification of SH3 domain proteins interacting with the cytoplasmic tail of the a disintegrin and metalloprotease 10 (ADAM10).

PLoS One, Juli 2014, im Druck

Ebsen H, Lettau M, Kabelitz D, Janssen O.

Subcellular localization and activation of ADAM10-dependent FasL shedding in T lymphocytes.

eingereicht

Veröffentlichte Tagungsbeiträge

Oberdoerster H, Lettau M, Gelhaus C, Janssen O.

Identification of interaction partners for ADAM10.

14th Joint Meeting of the Signal Transduction Society (abstract)

Oberdoerster H, Schröder A, Janssen O.

Expression, Localisation and Interaction Partners of ADAM10.

IRTG Symposium CRC877 Proteases and Pathophysiology (abstract)



Joint Annual Meeting SIICA/DGFI 2011 (abstract)



15th Joint Meeting of the Signal Transduction Society 2011 (abstract)





Anhang

153

Oberdoerster H, Schönbeck B, Janssen O.

Controlling the death factor CD95L: role of the proteases ADAM10 and SPPL2a.


Ebsen H, Scherer G, Janssen O.

Activation-induced changes in the localisation and shedding process of CD95L and ADAM10.


Ebsen H, Lettau M, Kabelitz D. Janssen O.

Localization and activation requirements for ADAM10-mediated FasL shedding in human T cells.

44th Annual Meeting of the German Society for Immunology (abstract)

Vorträge

3rd Autumn School „Current Concepts in Immunology“

Proteolysis-dependent post-translational modifications in control of the death factor CD95L.

Oct. 9-14, 2011; Bad Schandau, Deutschland

Preise

2nd Poster prize

Controlling the death factor CD95L: role of the proteases ADAM10 and SPPL2a.

17th Joint Meeting of the Signal Transduction Society 2012

Anhang

154

10.2 Tabelle A1 GST/GST-hADAM10(697-748)- und GST-interagierende SH3-Domänen. Modifiziert nach Ebsen et al., 2014

1Anzahl sequenzierter Klone, präzipitiert mit GST-hADAM10(697-748) oder GST

SH3-Domäne (Genname)

Uniprot-Nr. hADAM10(697-748)

(n=216)1 GST

(n=75)1

ARHG9 O43307 72 27

IASPP Q8WUF5 21 5

NOXO1 Q8NFA2 10 2

Eps8R1 Q8TE68 7 1

ZO1 Q07157 6 2

SH3TC2 Q8TF17 4 3

SH3BP4 Q9P0V3 4 2

NCF1 P14598 4 1

SKAP1/55R Q86WV1 4 1

MYO15A Q9UKN7 3 1

DLG5 Q8TDM6 3 1

SH3RF3 Q8TEJ3 3 1

SH3PXD2B A1X283 2 2

SHANK1 Q9Y566 2 1

CACNB4 O00305 2 1

ARHGAP4 P98171 2 1

Eps8R3 Q8TE67 1 3

CACB3 P54284 1 2

MYO7B Q6PIF6 1 1

ASPP2 Q13625 1 1

SHANK2 Q9UPX8 1 1

MYO15B Q96JP2 1 1

MACC1 Q6ZN28 1 1

DOCK3 Q8IZD9 1 1

NOXA1 Q86UR1 - 2

MPP2 Q14168 - 2

FCSD1 Q86WN1 - 1

NPHP1 O15259 - 1

SKAP2 O75563 - 1

CSKI1 Q8WXD9 - 1

DLG3 Q92796 - 1

TXK P42681 - 1

DNMBP Q6XZF7 - 1

MATK P42679 - 1

Anhang

155

10.3 Abbildungen A1-3

Abbildung A1: Coomassie-Färbung der genutzten Fusionsproteine der Pull-Down-Analysen. Vor der Präzipitation aus Zelllysaten wurden die verwendeten Fusionsproteine getestet. Je 25 µg wurden über SDS-PAGE aufgetrennt und mit Coomassie-Färbelösung sichtbar gemacht.


Anhang

156


Anhang

157

10.4 Danksagung

Besonderer Dank gebührt meinem Betreuer Prof. Dr. rer. biol. hum. Ottmar Janßen für die Bereitstellung des interessanten Themas. Seine Unterstützung bei meiner wissenschaftlichen Arbeit und das entgegengebrachte Vertrauen förderten das Gelingen dieser Arbeit und trugen zum Voranschreiten des Projektes bei. Auch die Möglichkeit, eigene Daten auf verschiedenen Tagungen zu präsentieren und zu diskutieren, half bei der Weiterführung der Arbeit.

Für die Übernahme der Betreuung und des Referates meiner Arbeit vor der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Dr. h.c. Thomas Bosch herzlich bedanken.

Dank gilt ebenfalls dem Direktor des Institutes für Immunologie Prof. Dr. med. Dieter Kabelitz für die Möglichkeit, diese Arbeit anzufertigen. Auch den Mitarbeitern am Institut für Immunologie danke ich für die freundschaftliche Atmosphäre und Hilfestellungen während der letzten Jahre.

Mein besonderer Dank gilt Alyn Gerneth und Gudrun Scherer, die exzellente technische Unterstützung leisteten. Immer hilfsbereit und motiviert unterstützten sie mich im Rahmen dieser Arbeit in technischen Dingen. Auch Melanie Nebendahl, Signe Valentin, Benjamin Schönbeck und Marcus Lettau standen mir stets unterstützend zur Seite. Für die insgesamt angenehme und herzliche Zusammenarbeit möchte ich jetzigen und ehemaligen Kollegen der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Ottmar Janßen besonders danken.

Weiterer Dank gilt Susann Voigt und Guranda Chitadze für die Unterstützung im Rahmen dieser Arbeit und für ihre Freundschaft.

Mein ganz besonderer Dank gilt meiner Familie, meinem Mann Gerrit, meinen Eltern Urte und Thomas, meiner Schwester Anne sowie meiner Großmutter Ingeborg für ihre immerwährende Unterstützung, Aufmunterung, Liebe und ihr Interesse an meiner Arbeit.

Vielen Dank.

Anhang

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10.5 Wissenschaftlicher Werdegang

Zur Person:

Name: Henriette Ebsen, geb. Oberdoerster

Wohnort: Kanalufer 212 in 24768 Rendsburg

Geburtsdatum: 13. Juli 1986

Geburtsort: Berlin

Staatsangehörigkeit: deutsch

Promotion:

seit 09.2010 Promotionsarbeit zum Thema „Lokalisation und Aktivierung von ADAM-Proteasen im Kontext der Fas-Ligand-Proteolyse in T-Zellen“ im Rahmen des Sonderforschungsbereichs 877 („Proteolysis as a regulatory event in pathophysiology“) in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Ottmar Janßen, Christian-Albrechts-Universität zu Kiel (CAU)

Hochschulstudium:

01.2010 - 08.2010 Diplomarbeit zum Thema „Identifizierung von Interaktionspartnern von ADAM10“ in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Ottmar Janßen, CAU

10.2005 - 08.2010 Diplomstudium der Biologie an der CAU

Abschluss: Diplom

Schulbildung:

08.1998 - 07.2005 Archenhold Oberschule in Berlin

Abschluss: Allgemeine Hochschulreife

Anhang

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10.6 Eidesstattliche Erklärung

Hiermit erkläre ich an Eides statt gemäß § 8 der Promotionsordnung der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel vom 31. August 2012, dass ich die vorliegende Arbeit unter der wissenschaftlichen Leitung von Prof. Dr. Ottmar Janssen selbständig und ohne fremde Hilfe verfasst habe. Die Abhandlung ist nach Form und Inhalt, abgesehen von der Beratung durch Prof. Janssen, die eigene Arbeit. Weiterhin habe ich keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt und die den verwendeten Werken wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen als solche kenntlich gemacht. Die vorliegende Arbeit entstand unter Einhaltung der Regeln guter wissenschaftlicher Praxis der Deutschen Forschungsgemeinschaft. Auszüge der Dissertation wurden bereits in Fachzeitschriften veröffentlicht bzw. eingereicht.

Ich versichere, dass ich weder an der Universität Kiel noch anderweitig versucht habe, eine Dissertation einzureichen oder mich einer Promotionsprüfung zu unterziehen.

Kiel,

Henriette Ebsen

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