1Roche Applied Science

21.09.049.00 – 12.30 Uhr

Schülerkongress GBM-Tagung in Münster

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Tagesablauf

1. Einführung 5. Elektrophorese 45 min

2. Gelvorbereitung 30 min 6. Färben der DNA im Agarose- Gel 40 min

3. Schneiden des Plasmids 45 min 7. Auswertung

4. Vorbereitung der Proben für die 8. Vorstellung weiterer Ergebnisse

Gelelektrophorese 20 min

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Pipettenbedienung

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Gelvorbereitung

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Schneiden des Plasmids

pUCD-lacZ mit BanII

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Elektrophoretische Trennung

der geschnittenen DNA

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Escherichia coli

Bewegliches StäbchenbakteriumNatürliches Habit: Intestinaltrakt von Warmblütlern (Darm)Wasserindikator für fäkale Verunreinigungen

Haustier der WissenschaftVerwendeter Stamm in Experimenten:Sicherheitsstamm K12 (JM109)

Außerhalb Labor nicht lebensfähig(bestimmte Eigenschaften fehlen)Kein genetisch veränderter Mikroorganismus(natürliches Vorkommen des lacZ-Gens)

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Weitere Bakterien

Vibrio cholerae

Leptospira ssp. Salmonella enteriditis

Desulfovibrio sp.

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Was ist DNA/DNS?

DesoxyriboNucleinSäureHelikaler Doppelstrang4 BasenAdenin, Thymin Guanin, CytosinGene: informationstragende Abschnittefür Proteinbiosynthese1 Codon aus 3 Nukleotiden entspricht1 Aminosäure

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Proteinbiosynthese:Vom Gen zum Protein

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Was sind Restriktionsenyzme?

Proteine (Eiweiße)Schneiden DNA an spezifischenErkennungssequenzen (oft Palindrome)

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Was sind Plasmide?

Schematische Karte des Plasmids pUCD-lacZAmpr: Ampicillinresistenz-GenOri: Replikationsursprung

Neben chromosomaler DNAoft zirkuläre DNA-Fragmente in Bakterien

Sicherheitsplasmide: Keine Weitergabe von Zelle zu Zelle

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Historie

1865 Mendel

1869 Miescher

1944 Entdeckung der DNA als Trägersubstanz des Erbguts (Avery)

1953 Entdeckung der doppelhelikalen Struktur der DNA (Watson und Crick)

1973 1. rekombinantes Bakterium von Boyer, Cohen und Chang

1977 Gentransfer eines humanen Gens auf ein Bakterium (Insulingen)

1982 Insulin als 1. gentechnisches Produkt auf Markt

1983 1. Gentransfer eines bakteriellen Gens auf eine Pflanze (Tabak)

1985 PCR (Mullis)

1988 Gründung von HUGO (Human Genome Project)

2000 Entschlüssung des humanen Genoms von Craig Venter

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Bedeutsamkeit

Rekombinante Proteine in therapeutischen und diagnostischen Anwendungsgebieten:

- RecHormon (Erythropoietin=blutbildendes Hormon)

-- Reteplase (tPA=Plasminogen Aktivator )

-- Insulin

-- Glucose Oxidase (Blutzuckermonitoring)

-- Teststreifen für Urin

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Analyse von DNA

Agarosegel (molekularer

Sieb):

kleinere Fragmente wandern

schneller als größere

Fragmente durch das

Agarosesieb.

Negative Ladung =>

Wanderung im

Spannungsfeld zur Anode (pos.

Pol)

Wanderungsgeschwindigkeit

linearer

doppelsträngiger DNA- Moleküle

umgekehrt proportional

zum Logarithmus ihrer Größe

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Auswertung

Vergleich mit bekanntem BandenmusterDNA- Fragmente (DNA-Molekulargewichtsstandard)

BanII schneidet 3x in Plasmid pUCD-lacZ (5669 bp)

3 Fragmente erwartetBerechnung der Größe anhand Plasmidkarte2504 bp, 2116 bp, 1049 bp

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erwartete Ergebnisse

21226

5480+4732+42683530

2027+190415841375

947831

564

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Weitere Experimente von Blue Genes (2. Teil)

Klonierung eines DNA-Fragments (= Einschleusung eines Gens in eine Bakterienzelle mit Hilfe eines Plasmids), Weitergabe an Nachkommen, 1 Klon entsteht:

1. Plasmidschneiden, Einfügen von Fragment, Ligation

2. Transformation in E.coli Sicherheitsstamm (nur 1 von 10 000 nimmt Plasmid auf), dessen lacZ-Gen defekt ist

3. Selektion über Antibiotikum Ampicillin (Plasmid enthalten)und über X-Gal (Spaltung zu blauem Farbstoff, Gen

erfolgreich eingeschleust)

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Klonierung vonDNA-Fragmenten

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Tipps und Tricks zur Versuchsplanung

Lagerungs- und Unterbrechungsmöglichkeiten:•Restriktionsansatz nach Inkubation bei 37 °C

mehrere Wochen bei – 20 °C •1x Elektrophoresepuffer mehrere Wochen bei RT •Nicht verwendetes Gel eingepackt in Folie

ca. 1 Woche im Kühlschrank•Nicht verwendetes Gel in Elektrophoresekammer

mit Puffer überschichtet 2 bis 3 Tage•Proben bereits mit Elektrophoresepuffer versetzt

mehrere Wochen bei – 20 °C•Elektrophoresekammer mit Puffer gefüllt 2 bis 3 Tage•Färbelösung in Flasche mit Alufolie verdunkelt

mehrere Woche bei RT•Gelaufenes Gel über Nacht in Wasser, ebenso gefärbtes (Achtung! Entfärbung!)