1 ZUSAMMENFASSUNGLateralwurzeln vergrößern die Oberfläche des Wurzelstocks beträchtlich und sind deshalb für die Maispflanze (Zea mays L.) sowohl zur Verankerung im Boden wie auch zur optimalen Nährstoffaufnahme äußerst wichtig. Bislang ist nur wenig über die molekularen Netzwerke, die der Bildung des komplexen Wurzelsystems bei Mais zugrunde liegen, bekannt. Die Verfügbarkeit spezifischer Mutanten der Lateralwurzelinitiation bei Mais und die molekularbiologische Untersuchung dieser Mutanten können zum verbesserten Verständnis der genetischen und molekularen Vorgänge während der Lateralwurzelbildung beitragen.Im Rahmen dieser Arbeit wurden in einem Screening zuvor mit dem Mutator (Mu)-Transposonsystem mutagenisierte F2-Familien nach neuen Lateralwurzelmutanten durchmustert. Dabei wurde die monogen, rezessiv vererbte Mutante rum1 (rootless with undetectable meristems 1) isoliert, die weder Lateral- noch Seminalwurzeln bildet. Die Mutante rum1 ist in der späten embryonalen und der frühen postembryonalen Phase der Wurzelentwicklung gestört, was sie von bisher identifizierten Wurzelmutanten bei Mais unterscheidet. Histologische Untersuchungen der Mutante rum1 zeigten, dass die Mutante vor Initiation der Primordien für Lateral- und Seminalwurzeln betroffen ist. Physiologische Analysen wiesen darauf hin, dass die Reaktion auf exogen appliziertes Auxin sowie der polare Auxintransport in der Primärwurzel der Mutante gestört ist. Zudem war die gravitrope Reaktion der Primärwurzel der Mutante verzögert. Genetische Untersuchungen durch Auskreuzung der Mutante in verschiedene Maisinzuchtlinien demonstrierten die Stabilität und Penetranz der Mutation. Alleltests von rum1 mit anderen Maiswurzelmutanten zeigten, dass es sich bei rum1 um eine neue Mutante handelt. Die Doppelmutante von rum1 mit der Lateral¬wurzelinitiationsmutante lrt1 (lateral rootless1) zeigte einen neuartigen Phänotyp und weist somit auf Interaktion der beiden Gene hin. Demgegenüber war die Doppelmutante von rum1 und der Mutante der sprossbürtigen Wurzelbildung rtcs (rootless concerning the crown and seminal roots) additiv, was auf eine unabhängige Bildung der Lateralwurzeln und der sprossbürtigen Wurzeln schließen lässt. Grobkartierung der Mutation rum1 mit BA-Translokationslinien lokalisierten die Mutation auf dem kurzen Arm von Chromosom 1.Die Initiation der Lateralwurzeln findet im Perizykel statt. Eine molekulare Charakterisierung der Mutante rum1 wurde mit zelltypspezifischen Transkriptomanalysen von Perizykelzellen kurz vor Initiation der Lateralwurzeln mittels Laser Capture Microdissection (LCM) in Kombination mit Microarrayexperimenten durchgeführt. Dabei wurden sowohl Transkriptionsprofile von Perizykelzellen im Vergleich zu Nicht-Perizykelzellen in der Maisinzuchtlinie B73 als auch Transkriptionsprofile von Perizykelzellen der Mutante rum1 im Vergleich mit dem Perizykel des entsprechenden Wildtyps erstellt. Dabei waren 210 Gene präferentiell im Perizykel im Vergleich zu Nicht-Perizykelzellen exprimiert. Der Vergleich des Trans¬kriptoms von Wildtyp mit rum1 Perizykelzellen führte zur Identifizierung von 163 Genen, die bevorzugt im Wildtypperizykel exprimiert waren und zu 116 Genen, die präferentiell im rum1 Perizykel exprimiert waren. Die dabei identifizierten differentiell exprimierten Gene wurden funktionell annotiert. Eine überwiegende Anzahl der präferentiell im Perizykel akkumulierten Transkripte wurde der Klasse der Proteinsynthese und der Transkription zugeordnet, was darauf hinweist, dass diese

Vorgänge bereits kurz vor der Initiation der Zellteilung im Perizykel aktiviert werden. Zusätzlich konnten Transkripte als differentiell im Perizykel exprimiert identifiziert werden, die mit der Auxinantwort in Verbindung stehen und daher vermutlich eine wichtige Rolle in der Lateralwurzelbildung einnehmen. Beim Vergleich der Genexpression im Perizykel des Wildtyps gegenüber der Mutante rum1 waren viele der bevorzugt im Wildtyp akkumulierten Gene der Transkriptionsregulation zugeordnet. Diese scheinen zusammen mit Zellzyklus regulierenden Genen, die ebenfalls im Wildtyp präferentiell transkribiert wurden, eine wichtige Rolle bei der Lateralwurzelinitiation zu spielen. Die Identifizierung und Charakterisierung der neuen Wurzelmutante rum1 zusammen mit vergleichenden zelltypspezifischenTranskriptomanalysen des Perizykels kurz vor der Initiation der Lateralwurzeln können zum besseren Verständnis der genetischen und molekularen Netzwerke beitragen, die der Lateralwurzelbildung zugrunde liegen.

2 EINLEITUNGMais (Zea mays L.) liefert mit einem Ertrag von etwa 636 Millionen Tonnen pro Jahr weltweit noch vor Reis und Weizen die höchsten Erträge aller Getreide (Deutsches Maiskomitee e.V., 2003; http://www.maiskomitee.de) und nimmt somit eine entscheidende Rolle bei der Ernährung von Menschen und Tieren ein. Zur Produktion dieser enormen Menge an Biomasse ist neben einem optimierten Photo¬synthese¬system und einer effektiven Anpassung an variable Umweltbedingungen die Aufnahme von Wasser und Nährstoffen und gerade bei Mais die Verankerung und Stabilisierung der Pflanze im Boden von großer Bedeutung (AIKEN and SMUCKER, 1996). Diese vielfältigen Anforderungen werden im Wesentlichen durch das bei Mais stark ausgeprägte Wurzelsystem erreicht.

2.1 Wurzelsysteme von mono- und dikotylen Modellpflanzen im Vergleich

Schon äußerlich sichtbar unterscheidet sich das homorhize Wurzelsystem von Mais, wie bei allen anderen monokotyledonen Pflanzen, von dem allorhizen Wurzelsystem der dikotylen Modellpflanze Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.. Bei Mais wird von Homorhizie gesprochen, da dieses Wurzelsystem von überwiegend gleich¬rangigen und ähnlich gestalteten Wurzeln aufgebaut ist. Dennoch variiert die Ausprägung der Homorhizie zwischen den Familien der monokotylen Pflanzen stark. Das komplexe Wurzelsystem von Mais besteht aus embryonalen und postembryonalen Wurzeln. Die Anlage für die embryonale Primärwurzel ist früh im Embryo schon etwa 9-15 Tage nach der Bestäubung sichtbar (INGRAM et al., 1999; FELDMANN, 1994). Etwa zwei Tage nach Keimung schiebt sich die Primärwurzel unter Ausprägung der sie schützen¬den Koleorhiza durch die Samenschale. Die zweite, in der späten embryonalen Entwicklungs¬phase angelegte Wurzelart, die Seminalwurzeln, sind je nach Maislinie in variabler Anzahl 22-40 Tage nach Bestäubung im Skutellarknoten angelegt (ERDELSKA and VIDOVENKOVA, 1993). Sie wachsen etwa fünf Tage nach Keimung aus dem Skutellarknoten aus. Zu den postembryonalen Wurzeln gehören die sprossbürtigen Kron- und Stützwurzeln. Diese entwickeln sich jeweils aus den Knoten und werden etwa 10 Tage nach Keimung sichtbar (HOCHHOLDINGER et al., 2004a und 2004b), wobei alle Wurzeln, die aus unterirdischen Knoten herauswachsen als Kronwurzeln und alle Wurzeln, die aus oberirdischen Knoten herauswachsen als Stützwurzeln bezeichnet werden. An den Stützwurzeln bilden sich Lateralwurzeln nur unterirdisch, nachdem die Stützwurzeln ins Erdreich eingewachsen sind. Die Bildung von Lateralwurzeln und Wurzelhaaren ist allen vier beschriebenen Wurzeltypen des Maiswurzelsystems gemeinsam. Diese tragen enorm zur Vergrößerung der Wurzeloberfläche und somit zur optimalen Versorgung der Pflanze mit Wasser und Nährstoffen bei (WANG et al., 1994). Anders hingegen sieht das Wurzelsystem bei dikotylen Pflanzen aus. Bei Arabidopsis entwickelt sich die Keimwurzel zur Primärwurzel, die hier auch Hauptwurzel genannt wird. Diese Primärwurzel bildet im Laufe der Entwicklung Seitenwurzeln (erster Ordnung), die wiederum Seitenwurzeln (zweiter Ordnung) bilden können. Lediglich durch Umwelteinflüsse wie zum Beispiel Verletzung oder exogene Hormoneinflüsse können bei dikotylen Pflanzen Adventivwurzeln gebildet werden (z.B. TAKAHASHI et al., 2003). Aufgrund dieser auch unter den Dikotyledonen einzigartigen Einfachheit im

Aufbau ist das Wurzelsystem von Arabidopsis bisher am detailliertesten untersucht und kann somit als Anhaltspunkt für die Analyse anderer Wurzelsysteme dienen.

2.2 Vergleich der Anatomie von Primärwurzeln mono- und dikotyler Pflanzen

Nicht nur morphologisch unterscheiden sich die Wurzelsysteme mono- und dikotyler Modellpflanzen voneinander. Auch beim Querschnitt durch die Primärwurzeln von Arabidopsis und Mais können gravierende Unterschiede in der Anatomie der Wurzeln festgestellt werden. Das Grundgewebe besteht im Querschnitt von Arabidopsis aus einer Cortexzellschicht, die in jungen Wurzeln aus 8 Zellen zusammengesetzt ist, während der Primärwurzelquerschnitt bei Mais aus 8-15 Cortexzellschichten mit unterschiedlicher Zellzahl besteht. Im Längsschnitt der Primärwurzel wird der klare Aufbau der Arabidopsiswurzel im Vergleich zum variableren Maiswurzelaufbau bei der Organisation des ruhenden Zentrums deutlich. Während das ruhende Zentrum bei Arabidopsis aus 4 Zellen besteht, machen bei Mais 800-1200 Zellen das ruhende Zentrum aus (JIANG et al., 2003). Allen Wurzeltypen gemeinsam ist deren longitudinaler Aufbau. Direkt an die Wurzelhaube schließt sich die Wurzelspitze an, die das meristematische und teilungsaktive Gewebe enthält. Weiter basal gelegen befinden sich die Elongationszone und schließlich die Differenzierungszone, die durch Wurzelhaare gekennzeichnet ist (ISHIKAWA and EVANS, 1995). In der Differenzierungszone findet auch die erste morphologisch sichtbare Zellteilung zur Initiation von Lateralwurzeln statt (DUBROVSKY et al., 2000). Die Bildung von Lateralwurzeln wird bei Arabidopsis in Perizykelzellen über Lateralwurzelmeristeme und Lateralwurzelprimordien initiiert (LASKOWSKI et al., 1995). Dabei treten bereits differenzierte Perizykelzellen, die in der G1-Phase des Zellzyklus arretiert sind wieder in den Zellzyklus ein und werden so zu Initialzellen für sich entwickelnde Lateralwurzelmeristeme und -primordien (BEECKMAN et al., 2001). Sie durchlaufen daraufhin ein definiertes Progamm orientierter Zellteilungen bis zur vollständigen Entwicklung der Lateralwurzel, die durch das Cortexgewebe hindurch wächst und schließlich äußerlich sichtbar wird (MALAMY and BENFEY, 1997; MALAMY and RYAN, 2001). Bei Mais wird angenommen, dass als Initiationsort von Lateralwurzeln neben dem Perizykel zusätzlich die Endodermis eine Rolle spielt (BELL and MCCULLY, 1970).

2.3 Genetische Analyse der WurzelentwicklungDie Modellpflanze Arabidopsis zeichnet sich durch günstige anatomische und entwicklungsgenetische Eigenschaften wie die geringe Größe und kurze Generationsdauer, konstante Zellabstammung von bestimmten Initialzellen, Transparenz der Gewebe (BENFEY and SCHIEFELBEIN, 1994) und einfache radiale Organisation im Aufbau der Wurzeln (DOLAN et al., 1993) aus. Diese günstigen Eigenschaften führten zur Isolierung einer Vielzahl von Wurzelmutanten. Bei Arabidopsis sind mehr als zehn Mutanten beschrieben, die in der Entwicklung der Lateralwurzeln betroffen sind. Darunter sind zwei Mutanten, die in der Lateralwurzelinitiation beeinträchtigt sind. In den Mutanten alf4 (aberrant lateral root formation4; CELENZA et al., 1995) und Slr (solitary root; FUKAKI et al., 2002) werden keine Lateralwurzeln initiiert und es können keine Lateralwurzelprimordien nachgewiesen werden. Die Gene dieser beiden Mutanten alf4 und Slr wurden bereits kloniert. Das alf4-Gen kodiert für ein 69.2 kD-Protein, das im

Pflanzenreich konserviert auftritt, für das jedoch keine Homologie außerhalb des Pflanzenreichs bekannt ist (DIDONATO et al., 2004). Das slr-Gen kodiert für das Protein IAA14, ein Mitglied der Aux/IAA Proteinfamilie. Proteine der Aux/IAA-Familie sind an der Regulation der auxinverantwortlichen Transkription in den Wurzeln beteiligt (ABEL et al., 1994). Die konkrete Rolle der beiden Gene bei der Lateralwurzelinitiation blieb bisher jedoch ungeklärt. Zusätzlich zu den Mutanten, die unter standardisierten Umweltbedingungen gefunden wurden, wurden bei Arabidopsis Untersuchungen zum Einfluss von Nährstoffen auf die Lateralwurzelinitiation durchgeführt. Unter Nährstoffverhältnissen, die die Lateralwurzelinitiation inhibieren, wurde die Mutante lin1 (lateral root initiation 1) identifiziert. Diese Mutante bildet trotz der inhibierenden Nährstoffverhältnisse Lateral¬wurzeln (MALAMY and RYAN, 2001). Bei Mais beschränkt sich aufgrund der komplexen Wurzelorganisation und der erst kürzlich begonnenen gezielten Suche nach Maiswurzelmutanten die Anzahl der Mutanten, die in der Entwicklung von Lateralwurzeln beeinträchtigt sind, auf drei Mutanten. Neben den zwei Mutanten slr1 und slr2, die in der Lateralwurzelelongation gestört sind (short lateral roots1 und 2; HOCHHOLDINGER et al., 2001), wurde die Mutante lrt1 (lateral rootless1) isoliert, bei der die Initiation der Lateralwurzeln gestört ist (HOCHHOLDINGER and FEIX, 1998). Mutanten sind ein geeignetes Hilfsmittel, um Einblicke in die genetische Regulation der Wurzelentwicklung zu bekommen. In klassisch genetischen Ansätzen („forward genetics“) wird zunächst vom Phänotyp ausgehend eine Mutante isoliert und dann das mutierte Gen durch genetische und molekularbiologische Experimente kloniert. Dadurch kann diesem Gen eine direkte oder indirekte Funktion zugeschrieben werden. Bei Mais macht man sich zur Mutagenisierung das Vorhandensein von mobilen genetischen Elementen bekannter Struktur, die Transposons, zu Nutze. Ein häufig zur Mutagenese bei Mais eingesetztes Transposonsystem ist die Familie der Mutator-Transposons (Mu). Aktive Mais-Mutatorlinien besitzen autonome Mu-Elemente in ihrem Genom, sogenannte MuDR-Elemente (BENNETZEN, 1996), die für Transposasen (MURA und MURB; ONO et al., 2002) kodieren. Die Transposasen regulieren auch die Transposition der nichtautonomen Mu1-Mu8 Elemente. Das Mu-Transposonsystem ist besonders zur Mutagenisierung geeignet, da die Transposons nicht nur in die direkte Nachbarschaft, wie bei anderen Transposonsystemen (LISCH et al., 1995), sondern im ganzen Genom vorwiegend in single-copy Genbereiche integrieren (CRESSE et al., 1995) und eine höhere Transpositionsfrequenz als andere Mais Transposonsysteme besitzen (BENNETZEN et al., 1996). Wird eine aktive Mutatorlinie mit einer Inzuchtlinie von Mais gekreuzt und kommt es dabei durch Insertion eines Mu-Transposons in ein Gen zu einer monogen, rezessiv vererbten Mutation, so liegt diese in der F1-Generation heterozygot vor. Nach Selbstung der F1-Pflanze erscheint die Mutation entsprechend der Mendelschen Gesetze in 25% der F2-Nachkommen homozygot und wird damit phänotypisch sichtbar.

2.4 Zelltypspezifische TranskriptomanalysenDie Klonierung von Genen, die für phänotypische Mutationen verantwortlich sind, trägt zum Verständnis der molekularen Prozesse bei der Maiswurzelentwicklung bei. Genklonierungen sind bei Mais wegen des hohen Anteils an repetitiver DNA im Maisgenom allerdings immer noch sehr zeitaufwendig. Globale

Genexpressions¬analysen sind nach Isolierung neuer Mutanten relativ bald etablierbar, vermitteln einen Einblick über die koordinierte Expression bestimmter Gene und lassen somit Rückschlüsse auf regulatorische Netzwerke zu, die an bestimmten Entwicklungsphasen beteiligt sind.Neue molekularbiologische Methoden ermöglichen globale Transkriptomanalysen von mehreren tausend Genen gleichzeitig (ZHU, 2003). Bei der Microarraytechnologie werden PCR-Produkte verschiedener cDNAs auf Objektträger gedruckt und diese mit zwei unterschiedlich fluoreszenzmarkierten cDNAs hybridisiert, die miteinander verglichen werden sollen (RICHMOND and SOMMERVILLE, 2000; AHARONI and VORST, 2002). Bis vor kurzem konnte nur die mRNA aus kompletten Pflanzenorganen oder Organteilen analysiert werden, die aus einer Vielzahl verschiedener Zelltypen mit unterschiedlichen Genexpressionsmustern aufgebaut sind. Bei einem Transkriptomvergleich mit Micro¬arraychips wird dabei möglicherweise das Expressionsprofil eines Zelltyps durch die Expressionsprofile der zusätzlich in diesem Organ befindlichen Zelltypen überlagert (SCHNABLE et al., 2004). Deshalb wurden verschiedene Methoden entwickelt, um spezifische Zelltypen aus dem Gewebeverband zu isolieren. Mit der Mikrokapillar¬methode konnten lediglich spezifische Zelltypen, die an der Organoberfläche liegen, angereichert werden. Jedoch ist es oft schwierig aus derartig isolierten Zellen RNA zu extrahieren und zu amplifizieren (KARRER et al., 1995). Eine weitere Methode, mit der protoplastierte Zellen von zelltypspezifischen GFP-Markerlinien mittels eines Fluoreszenzsorters von anderen getrennt und in hoher Anzahl gewonnen werden, wurde vor kurzem zur Analyse von Genexpressionsprofilen fünf verschiedener Zelltypen in Arabidopsiswurzeln angewandt (BIRNBAUM et al., 2003). Bei Mais stehen nur wenige zelltypspezifische Promotoren zur Verfügung, um sich diese Methode zur Erstellung zelltypspezifischer Transkriptionsprofile zu Nutze zu machen. Bei tierischen Geweben wird die Technik der LCM in Kombination mit Microarrayanalysen angewandt, um dieses Problem zu umgehen (EMMERT-BUCK et al., 1996; LUO et al., 1999). Diese Methode ermöglicht es, einzelne Zellen aus dem Gewebeverband herauszulösen und die geringe Menge der darin enthaltenen mRNA zu isolieren. Nach linearer Amplifikation der mRNA kann diese für Microarrayanalysen eingesetzt werden, was erstmals von NAKAZONO et al. (2003) auch an pflanzlichen Geweben demonstriert wurde. Diese technischen Fortschritte sind vielversprechend, um in Zukunft neue Informationen über Genexpressionsmuster in spezifischen Zellen zu erlangen (SCHNABLE et al., 2004). Eine ausführliche Einführung in das Gebiet der genetischen und molekularen Analyse der Maiswurzelentwicklung wird in den Übersichtsartikeln im Anhang 6.1.3 - 6.1.5 gegeben.

2.5 Ziel der ArbeitZiel dieser Arbeit war die Isolierung und Charakterisierung neuer Mutanten, die spezifisch in der Lateralwurzelbildung gestört sind. Dazu wurden zunächst etwa 2.000 mit dem Mutator (Mu)-Transposonsystem mutagenisierte F2-Familien unter standardisierten Bedingungen für 14 Tage in Papierrollen gekeimt und auf neue Wurzel¬mutanten durchmustert. Nach genetischer Bestätigung monogen rezessiver Defekte der dabei isolierten Wurzelmutanten sollte eine ausgewählte, neue Mutante eingehend charakterisiert werden. Diese Untersuchungen sollten morphologische, histologische, physiologische, genetische und molekularbiologische Analysen umfassen.

Morphologische Untersuchungen sollten über die gesamte Wurzelentwicklung durchgeführt werden, wobei auch das ältere Maiswurzelsystem der Mutante und deren Reaktion auf Nährstoffe in verschiedenen Konzentrationen mittels hydroponischer Kultur einbezogen werden sollte. Weiterhin sollten mikroskopische Analysen von Gewebeschnitten einen detaillierteren Aufschluss auf die histologischen Defekte der neu isolierten Mutante geben. Bei der genetischen Charakterisierung sollte diese Mutante zur Betrachtung der Stabilität und Penetranz der Mutation in andere Maislinien ausgekreuzt, sowie mit bereits bekannten Maiswurzelmutanten Alleltests durchgeführt und Doppelmutanten hergestellt werden. Eine BA-Translokationsanalyse zur Grobkartierung des in der Mutante betroffenen Genlocus und die Generierung neuer unabhängig induzierter Allele sollten als Vorbereitung für eine spätere Genklonierung durchgeführt werden.Zur molekularbiologischen Charakterisierung der ausgewählten Mutante standen bei dieser Arbeit die Technik der Laser Capture Microdissection und maisspezifische 12k cDNA-Microarrays zur Verfügung. Mit Hilfe der LCM sollten spezifisch die Perizykel¬zellen, in denen Lateralwurzelinitiation stattfindet, isoliert werden. RNA dieser Zellen sollte zur differentiellen Transkriptomanalyse des Perizykels mit Microarray-Hybridsierungsexperimenten untersucht werden. Die dabei gewonnenen differentiellen Expressionsmuster sollten somit einen besseren Einblick in die molekulare Regulation der Lateralwurzelinitiation bei Mais geben.

3 ERGEBNISSEWurzelsysteme müssen funktionellen Anforderungen der Pflanze wie der Versorgung mit Nährstoffen und Wasser als auch der Verankerung im Boden gerecht werden. Bisher ist nur wenig über die genetischen und molekularen Prozesse bekannt, die der Wurzelentwicklung der monokotylen Getreidearten zugrunde liegen. Unter den weltweit für die Ernährung wichtigen Getreiden ist Mais das am besten untersuchte genetische System (CHANDLER and BRENDEL, 2002). Wurzelmutanten bei Mais und die molekularbiologische Untersuchung dieser Mutanten können deshalb zum verbesserten Verständnis der genetischen und molekularen Vorgänge während der Wurzelbildung bei Monokotyledonen beitragen.

3.1 Isolierung und morphologische Charakterisierung der Lateral¬wurzel¬mutante rum1

Zur Isolation neuer Wurzelmutanten wurden mit dem Papierrollentest (nach HETZ et al., 1996; Abb. 2) etwa 40.000 Maiskeimlinge, die aus knapp 2.000 ver¬schiedenen mit Mu-Transposons mutagenisierten F2-Familien stammten, unter standardisierten Klimakammerbedingungen gekeimt. 14 Tage nach Keimung wurde das Wurzelsystem der Keimlinge phänotypisch analysiert. Durch Selbstung der dabei gefundenen putativen Mutanten konnte bei diesem Screening eine neue, rezessiv vererbte monogene Maiswurzelmutante genetisch bestätigt werden. Diese Maismutante rum1 (rootless with undetectable meristems 1) ist in der Initiation der embryonal angelegten Seminalwurzeln und der postembryonal angelegten Lateralwurzeln der Primärwurzel gestört (Abb. 3). Die Primordien für Lateral- und Seminalwurzeln fehlen komplett, wie durch histologische Analysen gezeigt wurde. Dabei sind sowohl die Lateralwurzelinitiation an sprossbürtigen, postembryonalen Wurzeln als auch die Entwicklung der oberirdischen Organe bei dieser Mutante nicht beeinträchtigt. Nährstoffe wie Nitrat oder Phosphat, die im Wildtyp in erhöhten Konzentra¬tionen die Bildung von Lateralwurzeln fördern, zeigen keine Wirkung auf die Lateralwurzel¬initiation bei in hydroponischer Nährlösung gehaltenen 30 Tage alten Pflanzen der Mutante rum1. Auch das in ver¬schiedenen Konzentrationen exogen applizierte Pflanzen¬hormon Auxin (α-NAA) bewirkt keine Bildung von Lateral¬wurzeln, wie es im Wildtyp der Fall ist. Zudem weist diese Mutante im Vergleich zum Wildtyp eine verzögerte Reaktion auf gravitrope Stimulierung auf. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass der Auxintransport in der Primärwurzel der Mutante rum1 stark reduziert ist. Daher wurde die Expression der Maishomologe bekannter putativer Auxintransporter von Arabidopsis der pin- und aux1-Genfamilie untersucht. Jedoch wurden keine Expressions¬unterschiede dieser Gene zwischen Wildtyp und rum1 in der Primärwurzel nachgewiesen. Weitere morphologische Unterschiede der Mutante rum1 zum Wildtyp sind, dass sie eine signifikant kürzere Primärwurzel und im Dunkeln gewachsen zudem ein längeres Mesokotyl und längere Koleoptilen besitzt. Diese Beobachtungen lassen vermuten, dass das rum1-Gen eine Rolle bei der Regulation des Auxintransports in der Primärwurzel bzw. der Auxinaufnahme im Perizykel spielt. Da der Auxintransport in der Koleoptile bei der

Mutante rum1 nicht beeinträchtigt ist, kann man annehmen, dass der Auxintransport in rum1-Keimlingen zwischen Spross und Wurzel unterbrochen ist.

3.2 Genetische Charakterisierung der Lateralwurzelmutante rum1

Zur genetischen Analyse wurde die rum1 Mutation durch Rückkreuzungen in verschiedene genetische Maislinien eingeführt. Bei den reziprok durchgeführten Rückkreuzungen wurde kein Unterschied für maternale oder paternale Herkunft der Mutation festgestellt. Die Erzeugung von Doppelmutanten durch Kreuzung mit anderen, ähnlichen Phänotypen dient zur Analyse der Interaktion verschiedener Gene. Dabei kann es zu epistatischen, additiven oder neuartigen Phänotypen in der Doppelmutante kommen. Die Doppelmutante von rum1 mit der bereits charakterisierten Lateral¬wurzelinitiationsmutante lrt1 (HOCHHOLDINGER and FEIX, 1998) zeigte einen neuartigen Phänotyp mit stark verkürzter Primärwurzel und fehlenden Lateralwurzeln, was auf die Interaktion der betroffenen Gene hinweist. Da die Zellelongation in dieser Doppelmutante nicht beeinträchtigt scheint, kann man daraus schließen, dass die meristematische Aktivität in der Doppelmutante reduziert oder gehemmt ist. Im Gegensatz zu dem neuartigen Phänotyp dieser Doppelmutante ist der Phänotyp der Doppelmutante von rum1 mit der Kronwurzelinitiationsmutante rtcs (HETZ et al., 1996) additiv. Die Merkmale der beiden Mutanten sind in der Doppelmutante rum1/rtcs vereint, sie bildet also ausschließlich eine Primärwurzel, aber keine Seminal-, Kron-, Stütz- oder Lateralwurzeln. Dies zeigt, dass die mutierten Gene unabhängig voneinander wirken. Sowohl die Doppelmutanten rum1/lrt1 als auch die Doppelmutante rum1/rtcs sterben nach dem Transfer ins Gewächshaus und sind nicht vermehrungsfähig. Da ein langfristiges Ziel die Isolation des mutierten rum1-Gens sein wird, wurden in dieser Arbeit Vorleistungen zur Klonierung des rum1-Locus erbracht. Zum einen wurden homozygote rum1-Mutanten mit aktiven Mutatorlinien gekreuzt und 52.800 Keimlinge der F1-Generation auf rum1-Phänotypen zur Identifizierung neuer rum1-Allele hin durchsucht. Die dabei gefundenen acht Allele waren phänotypisch dem Referenzmutantenallel gleich und wurden im Gewächshaus durch Selbstung vermehrt. Zum anderen sollte eine Grobkartierung des Gens auf einem der 20 Chromosomenarme von Mais zur Erleichterung der Klonierung beitragen. Dazu wurde die Mutante rum1 mit BA-Translokationslinien gekreuzt, bei denen jeweils ein bestimmter Chromosomenarm durch einen informationslosen Abschnitt eines B-Chromosoms ersetzt ist. Erscheint die Mutation in der F1-Generation bei einer bestimmten Kreuzung, so kann man darauf schließen, dass das mutierte Gen auf dem Chromosomenarm lokalisiert ist, der in der zur Kreuzung eingesetzten Linie informationslos ist. So konnte bei der Mutante rum1 das mutierte Gen durch Kreuzungen auf dem kurzen Chromosomenarm von Chromosom 1 lokalisiert werden. Eine detaillierte Charakterisierung der Mutante rum1 wird im Manuskript in Kapitel 6.1.1 gegeben.

3.3 Transkriptomanalyse der perizykelspezifischen Genexpression

Die Mutante rum1 ist in der Lateral- und Seminalwurzelinitiation gestört. Lateralwurzeln werden durch Dedifferenzierung von Perizykelzellen und anschließen¬der Teilung dieser Zellen während der postembryonalen Entwicklung initiiert. Zur molekularbiologischen

Analyse der Mutante wurden mit Hilfe von Microarray-Hybridisierungen vergleichende Transkriptomprofile von Perizykelzellen erstellt. Zunächst wurden Versuche mit der Maisinzuchtlinie B73 durchgeführt, um die Technik der Laser Capture Microdissection (LCM) auf pflanzliches Wurzelgewebe anzupassen, und um die Genexpression im Perizykel im Vergleich zu den umliegenden Nicht¬perizykelzellen zu untersuchen. Bei der Analyse der Genexpression in Perizykelzellen 64 Stunden nach Keimung und somit kurz vor der ersten Zellteilung zur Lateral¬wurzelinitiation sollten Gene, die an der Initiation der Lateralwurzeln beteiligt sind, erfasst werden. Perizykelzellen können mittels LCM aus dem Gewebeverband isoliert werden. Um das Genexpressionsmuster der Perizykelzellen im Vergleich zu den Nicht¬perizykelzellen des Wurzelquerschnitts miteinander mittels Microarrayanalyse vergleichen zu können, wurden für ein biologisches Replikat je mindestens 13.000 Perizykel- und Nichtperizykelzellen gesammelt. Diese hohe Anzahl an Zellen berücksichtigt die Variabilität der Genexpression einzelner Zellen, zum anderen ist diese Anzahl nötig, um genügend RNA zur weiteren Amplifikation der mRNA extrahieren zu können. Sechs unabhängige biologische Replikate des Transkriptoms von Perizykel- und Nichtperizykelzellen wurden durch entsprechende Amplifikation, Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen und Hybridisierung von 12k cDNA Mais-Microarrays miteinander verglichen. Die statistische Auswertung dieser Microarray-Experimente ergab, dass 210 Gene im Perizykel differentiell stärker exprimiert sind. Hierbei wurde als Grenzwert für differentielle Genexpression ein p-Wert von <0,01 und eine Änderung des Expressionsniveaus von mindestens einem Faktor von 2 festgesetzt. 18 der differentiell exprimierten Gene wurden mit Hilfe von quantitativen real-time PCR-Experimenten als im Perizykel überexprimiert bestätigt. Die differentiell exprimierten Gene wurden nach Homologievergleichen mit bereits bekannten Proteinen (Blastx-Analysen nach ALTSCHUL et al., 1997) entsprechend der MIPS-Datenbank (http://mips.gsf.de/proj/thal/db) in funktionelle Kategorien klassifiziert. Dabei waren 34% Proteine mit unbekannter Funktion, 19% gehörten zur funktionellen Kategorie der Proteinsynthese oder waren Proteine, die zur Synthese von Zellwandbestandteilen nötig sind. Weiterhin wurden 14 Transkriptionsfaktoren und drei Gene, die mit der Reaktion auf Auxin in Verbindung stehen, als präferentiell im Perizykel exprimiert identifiziert. Dies gibt einen Hinweis darauf, welche Gene 64 Stunden nach Keimung spezifisch im Perizykel aktiv sind, dort koordiniert exprimiert werden und deshalb möglicherweise einen Einfluss auf die Lateralwurzelinitiation haben. Details zu dieser Analyse sind im Manuskript im Anhang 6.1.2 gegeben.

3.4 Vergleichende Transkriptomuntersuchung von Perizykelzellen der Lateralwurzelmutante rum1 mit dem Wildtyp

Neben der Analyse von Genen, die im Perizykel stärker exprimiert sind als in den umliegenden Zellen wurde die Kombination von LCM und anschließender Microarray-Hybridisierung angewandt, um die Genexpression im Perizykel von Wildtyp-Pflanzen mit der Genexpression im Perizykel der Lateralwurzelmutante rum1 zu vergleichen. Auch hier wurden mehr als 13.000 Perizykelzellen je biologischem Replikat vor Initiation der Lateralwurzeln isoliert. 12k cDNA Mais-Microarraychips wurden mit vier biologischen Replikaten hybridisiert. Von jeder Hybridisierung wurden drei Scans bei

verschiedenen Lasereinstellungen angefertigt, die separat statistisch ausgewertet wurden. 163 Gene wurden als präferentiell im Wildtyp, 116 Gene als stärker im rum1-Perizykel exprimiert ermittelt. Die höchste Scaneinstellung ergab dabei die größte Anzahl differentiell exprimierter Gene (112 von 163 bzw. 64 von 116), die beiden niedrigeren Scaneinstellungen gaben die zusätzlichen differentiell exprimierten Gene zu etwa gleichen Teilen. Diese differentiell exprimierten Gene wurden ebenso mittels einer Blastx-Analyse und der MIPS-Datenbank funktionell annotiert. Dabei zeigte sich, dass fast ein Viertel der im Wildtyp-Perizykel überexprimierten Gene der Kategorie des Metabolismus zugehören (22 von 90 annotierten Proteinen) und 19% der annotierten Proteine mit der Transkriptionsregulation in Verbindung stehen. Diese im Wildtyp stark vertretene funktionelle Proteinklassen ist im Perizykel der Mutante rum1 mit 6% der annotierten Proteine eher unterrepräsentiert. Im Wildtyp liegt ein Netzwerk von Transkriptionsfaktoren vor, das in der Mutante gestört ist. Diese scheinen zusammen mit im Wildtyp gleichzeitig überexprimierten Zellzyklus-regulierenden Genen wichtig zu sein, um schließlich die Bildung der Lateralwurzeln zu initiieren. Details zu dieser Analyse sind im Manuskript in Kapitel 6.1.2 gegeben.

3.5 Analyse der Wurzelspezifität differentiell exprimierter GeneAlle Gene, die bei den Microarrayexperimenten als differentiell exprimiert identifiziert wurden, wurden einer MPSS (Massively Parallel Signature Sequencing) Datenbankanalyse unterzogen. Die von der Firma DuPont bereitgestellte MPSS-Datenbank ermöglicht, die quantitative Expression eines Gens in verschiedenen Maisgeweben bzw. Entwicklungsstadien in silico zu analysieren (BRENNER et al., 2000). Dabei wurde herausgefunden, dass elf der in der Inzuchtlinie B73 perizykel¬spezifisch exprimierten Gene zusätzlich überwiegend in Wurzeln exprimiert werden. 13% (21/163) der Gene, die im Perizykel von Wildtyp höher exprimiert sind als im Perizykel der Mutante rum1 und 5% (6/116) der Gene, die in der Mutante höher exprimiert sind als beim Wildtyp wurden durch die MPSS-Daten als wurzelspezifisch identifiziert. Dies wurde für ausgewählte Gene mittels Northern Blot Analyse bestätigt. Die MPSS-Daten dienen als Grundlage für weitere Untersuchungen zur zusätzlichen Bestätigung von wurzelspezifischen Genen, die vermutlich an der Lateral¬wurzelinduktion beteiligt sind.

4 DISKUSSIONEine systematische Analyse des Maiswurzelsystems wurde aufgrund seiner komplexen Organisation, seiner Variabilität und der schweren Zugänglichkeit erst kürzlich initiiert (zusammengefasst in HOCHHOLDINGER et al., 2004a und 2004b). Über die genetische Regulation der Vorgänge, die zur Bildung des komplexen Wurzelsystems führen, ist bislang nur wenig bekannt. Die Isolation neuer Wurzel¬mutanten kann einen Beitrag zum Verständnis der Regulation der Wurzelbildung leisten. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde die monogen, resessiv vererbte Maiswurzelmutante rum1 isoliert, die in der Initiation von Seminal- und Lateralwurzeln gestört ist. Damit ist die Mutante rum1 die erste bisher beschriebene Maiswurzelmutante, die phänotypisch sowohl in der späten embryonalen als auch in der frühen postembryonalen Wurzelentwicklung beeinträchtigt ist. Bei Arabidopsis wurde eine solche Mutante nicht beschrieben, da das einfache Wurzelsystem von Arabidopsis, das ausschließlich aus der Primärwurzel und deren Lateralwurzeln besteht, eine differenziertere Unterteilung in diese Entwicklungsphasen nicht zulässt. Eine monogene Mutation, bei der sowohl die embryonale als auch die postembryonale Wurzelentwicklung betroffen ist, bestätigt, dass die embryonalen und postembryonalen Entwicklungsprogramme der Wurzelentwicklung ineinander greifen (HETZ et al., 1996). Die Doppelmutante von rum1 mit lrt1 (HOCHHOLDINGER and FEIX, 1998) zeigt einen neuartigen Phänotyp auf. Doppelmutanten von rum1/lrt1 sind sehr klein und bilden einzig eine stark verkürzte Primärwurzel. Die Zellorganisation in der Doppelmutante ist nicht gestört, was darauf hinweist, dass die beiden Gene rum1 und lrt1 zusammen wirken und einen Einfluss auf die meristematische Aktivität in der Primärwurzel haben. Die Doppelmutante der beiden Lateralwurzel¬elongationsmutanten slr1 und slr2 (HOCHHOLDINGER et al., 2001) zeigt ebenfalls einen neuartigen Phänotyp der nicht die additive Kombination der beiden einzelnen Mutanten widerspiegelt. Untersuchungen der slr1/slr2-Doppelmutante führten zur Schlussfolgerung, dass die Gene slr1 und slr2 in der Zellorganisation der Primärwurzel und der Lateralwurzelelongation zusammen wirken (HOCHHOLDINGER et al., 2001). Im Gegensatz dazu weist die Doppelmutante von rum1 und der Kronwurzelmutante rtcs (HETZ et al., 1996) einen additiven Phänotyp auf, der sich dadurch auszeichnet, dass diese Pflanze weder Seminal- noch Lateral- und Kronwurzeln bildet. Dies lässt darauf schließen, dass die Initiation von Kron- und Stützwurzeln unabhängig von der Initiation der Lateralwurzeln ist, und dass sowohl das rum1-Gen als auch das rtcs-Gen Einfluss auf die Initiation von Seminalwurzeln haben. Dies bestätigt die bisherigen Untersuchungen, in denen alle Doppelmutanten der zuvor isolierten Lateralwurzelmutanten lrt1 (HOCHHOLDINGER und FEIX, 1998), slr1 und slr2 (HOCHHOLDINGER et al., 2001) mit rtcs einen additiven Phänotyp zeigten (HOCHHOLDINGER et al., 2004b), was auf eine generelle Entkopplung der sprossbür¬tigen von der Lateralwurzelbildung schließen lässt. Es ist bekannt, dass exogen appliziertes Auxin Lateralwurzeln induziert (REED et al., 1998). Bei der Mutante rum1 wurden jedoch durch exogen appliziertes Auxin keine Lateralwurzeln ausgebildet. Zudem ist der Auxintransport in der Primärwurzel gehemmt, welches auch die verzögerte gravitrope Reaktion erklärt, die durch lokal unterschiedliche Auxinkonzentrationen gesteuert wird. Eine andere Maismutante, die auch im Auxintransport beeinträchtigt ist, ist die Mutante semaphore1 (sem1) (SCANLON et al.,

2002). Bei dieser Mutante ist im Gegensatz zu rum1 der Auxin¬transport im Mesokotyl betroffen, was sich pleiotrop auf mehrere Merkmale auswirkt, unter anderem auf die Ausprägung der Lateralwurzeln. So scheint sem1 im Gegensatz zu rum1 generell im Auxintransport betroffen zu sein, während rum1 spezifisch im Auxintransport in der Primärwurzel sowie in der Aufnahme des Auxinreizes und der entsprechenden Umsetzung des Auxinreizes durch Bildung von Lateralwurzeln beeinträchtigt ist. Übereinstimmungen durch Vergleiche zu bisher beschriebenen Lateralwurzelinitiationsmutanten bei Arabidopsis lassen sich nur schwer finden. Eine bei Arabidopsis bekannte Lateralwurzelinitiationsmutante ist die Mutante Slr (FUKAKI et al., 2002). Das slr-Gen wurde kloniert und gehört zur Familie der Aux/IAA Proteine. Die Transkription der Aux/IAA-Gene wird schnell durch Auxin induziert (THEOLOGIS et al., 1985) und Aux/IAA-Proteine vermitteln ein auxinreguliertes Wachstum wie unter anderem die Bildung von Lateralwurzeln. Deshalb ist es sehr unwahrscheinlich, dass das rum1-Gen der Lateralwurzelinitiationsmutante bei Mais dem slr-Gen der Lateralwurzelinitiationsmutante slr bei Arabidopsis entspricht. Die andere bisher beschriebene Lateral¬wurzel¬initiations¬mutante bei Arabidopsis ist die Mutante alf4 (CELENZA et al., 1995). Es wird angenommen, dass das Protein ALF4 erst nach der Auxinproduktion und dem Auxintransport funktionell aktiv ist und deshalb auch sehr wahrscheinlich nicht mit rum1, die im Auxintransport beeinträchtigt ist, korrespondiert. Daraus kann geschlossen werden, dass die Mutante rum1 in einer bisher unbekannten Regulationsstelle der Lateral- und Seminalwurzelinitiation betroffen ist, die über den Auxintransport und die Auxinperzeption reguliert wird. Eine endgültige Klärung der Funktion des rum1 Gens wird jedoch erst nach dessen Klonierung möglich sein.Auch bei anderen monokotylen Pflanzen mit komplexem Wurzelsystem wie Reis (Oryza sativa L.) gibt es bislang nur wenige genetische und molekulare Informationen über die Regulation der Lateralwurzelentwicklung (HOCHHOLDINGER et al., 2004a). Deshalb ist es für das Verständnis der Wurzelentwicklung monokotyler Pflanzen von großer Bedeutung, detaillierte molekulare Analysen der Wurzelbildung durchzuführen. Die in dieser Arbeit durch Microarrayanalysen ermittelten Expressionsmuster von Perizykelzellen im Vergleich zu Nichtperizykelzellen bzw. im Vergleich zum Perizykel der Lateralwurzel¬initiationsmutante rum1 können Aufschluss darauf geben, welche Gene vor der Initiation der Lateralwurzeln koordiniert exprimiert werden. Bei der Trans¬kriptom¬analyse der Perizykelzellen im Vergleich zum umliegenden Gewebe war die hohe Anzahl der Gene auffällig, die für ribosomale Proteine und Proteine, die an der Translation beteiligt sind, kodieren (19% der annotierten Proteine). Dies zeigt, dass die Proteinsynthese im Perizykel kurz vor der Lateralwurzelinitiation bedeutend höher ist als in den umliegenden Zellen. Zusätzlich waren der Metabolismus (11% der annotierten Gene) und die Produktion und Umsetzung von Zellwandkomponenten (41% der Proteine, die zu den metabolismusrelevanten Genen gehören) über¬repräsentiert. Dies ist konsistent mit der Tatsache, dass im Perizykel zur Lateral¬wurzelinitiation neue Zellen etabliert werden müssen und dazu im Vergleich zu den umliegenden Zellen mehr Zellwandmaterial produziert werden muss. Ferner ist bekannt, dass Auxin ein wichtiges Signalmolekül bei der Initiation von Lateralwurzeln ist (HIMANEM et al., 2004). Demzufolge liegt es nahe, dass im Perizykel Gene, die an der Umsetzung des Auxinreizes beteiligt sind, höher exprimiert sind als in den umliegenden Zellen. Differentiell im Perizykel exprimiert waren der Transkriptionsfaktor ARF1 (ULMASOV et al., 1997),

eine AUX1-ähnliche Permease (HOCHHOLDINGER et al., 2000) und ein Ubiquitin konjugierendes Enzym (GRAY and ESTELLE, 2000). Von allen drei Genen ist beschrieben, dass sie in die Auxinantwort involviert sind.Bei dem Vergleich des Expressionsmusters der Perizykelzellen des Wildtyps mit dem der Mutante rum1 wurden 163 Gene als stärker im Wildtyp, 116 Gene als stärker im rum1-Perizykel exprimiert ermittelt. Für diese Analyse wurden drei Scans mit ver¬schiedenen Scannereinstellungen durchgeführt (ROMUALDI et al., 2003). Dies erwies sich als hilfreich bei der zusätzlichen Identifizierung von differentiell exprimierten Genen. 24% der annotierten Gene, die im Perizykel des Wildtyps überexprimiert sind, sind der Kategorie des Metabolismus zuzuordnen. Diese Klasse ist auch im Perizykel von rum1 am stärksten repräsentiert (16%), wobei hier keine funktionelle Kategorie gegenüber den anderen Kategorien auffallend herausragt. Augenscheinlich ist die Diskrepanz zwischen Wildtyp und rum1-Perizykel in der Anzahl differentiell regulierter Gene, die Proteine für die Transkriptionsregulation kodieren (19% im Wildtyp gegenüber 6% in rum1). Transkriptionsfaktoren regulieren die differentielle Genaktivität, die eine entscheidende Rolle für unterschiedliche Entwicklungsvorgänge in der Pflanze spielt (Birnbaum and BENFEY, 2004). Die Vermutung liegt nahe, dass die hohe Anzahl an Transkriptionsfaktoren, die im Wildtyp überexprimiert und damit in der Mutante rum1 weniger stark exprimiert sind, ausschlaggebend ist, um zahlreiche Gene zu aktivieren, die schließlich die Bildung der Lateralwurzeln hervorrufen. Besonders zu erwähnen ist hier ein SCARECROW ähnliches Protein, von dem bekannt ist, dass es wesentlich zur Bestimmung des Wurzelradialmusters beiträgt (LIM et al., 2000). Ebenso sind zwei ß-Helix-Loop-Helix Proteine überexprimiert, die für die Kontrolle der Zellvermehrung und zur Entwicklung von zelltypspezifischen Ab¬stammungen verantwortlich sind (HEIM et al., 2003). Sowie das Protein ZmMET, von dem bekannt ist, dass Trankripte dieses Gens spezifisch in sich aktiv teilenden Zellen von Meristemen akkumulieren (STEWARD et al., 2000). Mit Hilfe der MPSS-Datenbankanalyse kann auf perizykel- und wurzelspezifische Gene geschlossen werden. Durch diese zusätzliche Information über die Wurzelspezifität wird die Fokussierung auf die Gene erleichtert, die tatsächlich an der Lateral¬wurzelinitiation beteiligt sein könnten. Mit diesen Informationen können ausgesuchte Gene des Weiteren zum Beispiel zur Identifizierung von Mutanten der entsprechenden Genloci mit Hilfe des revers genetischen TUSC-Systems (Trait Utility System of Corn) einge¬setzt werden. Die genauere Untersuchung der gefundenen Knock-out Mutanten sowie die aufwendige Klonierung des rum1-Gens, die in dieser Arbeit aus Zeitgründen nicht durchgeführt werden konnten, können zum besseren Verständnis des molekularen Netzwerks der Lateralwurzelinitiation bei Mais beitragen.

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6 ANLAGEN

6.1 Publikationen mit direktem Bezug zu dieser Arbei

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