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Anmerkung: Innerhalb von neun Monaten nach Bekanntmachung des Hinweises auf die Erteilung des europäischenPatents im Europäischen Patentblatt kann jedermann nach Maßgabe der Ausführungsordnung beim EuropäischenPatentamt gegen dieses Patent Einspruch einlegen. Der Einspruch gilt erst als eingelegt, wenn die Einspruchsgebührentrichtet worden ist. (Art. 99(1) Europäisches Patentübereinkommen).

Printed by Jouve, 75001 PARIS (FR)

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(12) EUROPÄISCHE PATENTSCHRIFT

(45) Veröffentlichungstag und Bekanntmachung des Hinweises auf die Patenterteilung: 13.03.2019 Patentblatt 2019/11

(21) Anmeldenummer: 16825323.5

(22) Anmeldetag: 25.11.2016

(51) Int Cl.:G01N 30/86 (2006.01) G01N 30/88 (2006.01)

G01N 30/46 (2006.01)

(86) Internationale Anmeldenummer: PCT/EP2016/001995

(87) Internationale Veröffentlichungsnummer: WO 2017/088979 (01.06.2017 Gazette 2017/22)

(54) VERFAHREN ZUR STEUERUNG KONTINUIERLICHER CHROMATOGRAPHIE UND MULTISÄULEN-CHROMATOGRAPHIE-ANORDNUNG

METHOD FOR CONTROLLING CONTINUOUS CHROMATOGRAPHY AND MULTI-COLUMN CHROMATOGRAPHY ASSEMBLY

PROCEDE DE COMMANDE DE CHROMATOGRAPHIE EN CONTINU ET AGENCEMENT DE CHROMATOGRAPHIE MULTICOLONNE

(84) Benannte Vertragsstaaten: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR

(30) Priorität: 26.11.2015 EP 15196599

(43) Veröffentlichungstag der Anmeldung: 15.11.2017 Patentblatt 2017/46

(73) Patentinhaber: Karlsruher Institut für Technologie76131 Karlsruhe (DE)

(72) Erfinder: • HUBBUCH, Jürgen

76327 Pfinztal (DE)• BRESTRICH, Nina

4057 Basel (CH)• RÜDT, Matthias

76137 Karlsruhe (DE)• ROLINGER, Laura

66706 Perl (DE)

(74) Vertreter: Müller-Boré & Partner Patentanwälte PartG mbBFriedenheimer Brücke 2180639 München (DE)

(56) Entgegenhaltungen: WO-A1-00/45929 WO-A1-2004/106915DE-A1-102010 047 427 US-A1- 2014 251 913

• BORTOLATO SANTIAGO A ET AL: "Chemometric processing of second-order liquid chromatographic data with UV-vis and fluorescence detection. A comparison of multivariate curve resolution and parallel factor analys", ANALYTICA CHIMICA ACTA, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, Bd. 842, 14. Juli 2014 (2014-07-14), Seiten 11-19, XP029045047, ISSN: 0003-2670, DOI: 10.1016/J.ACA.2014.07.007

• GARCIA-MARTIN S ET AL: "Solid-phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry (HS-SPME-GC-MS) determination of volatile compounds in orujo spirits: Multivariate chemometric characterisation", FOOD CHEMISTRY, ELSEVIER LTD, NL, Bd. 118, Nr. 2, 15. Januar 2010 (2010-01-15), Seiten 456-461, XP026497695, ISSN: 0308-8146, DOI: 10.1016/J.FOODCHEM.2009.04.105 [gefunden am 2009-05-03]

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Beschreibung

[0001] Der Gegenstand der vorliegenden Erfindungbetrifft ein Verfahren zur Steuerung kontinuierlicherChromatographie durch Auswertung multivariater Signa-le mit mathematischen Methoden. Das Verfahren ist imBereich der Aufreinigung von Biopharmazeutika an-wendbar. Die Aufreinigung von Biopharmazeutika wirdgrößtenteils mittels chromatographischer Trennverfah-ren durchgeführt, da sie hohe Produktreinheiten beigleichzeitig hohen Ausbeuten erlauben. Gegenwärtig fin-det in der Biopharmaindustrie ein Wandel von batch-ba-sierten zu kontinuierlichen Prozessen statt.Eine Herausforderung stellt dabei dar, dass biopharma-zeutische Prozess im Vergleich zu chemischen Verfah-ren einer hohen Variabilität unterliegen. Um bei einemkontinuierlichen biopharmazeutischen Prozess den sta-tionären Zustand aufrecht zu erhalten, ist daher eine ef-fiziente Prozesskontrolle zentral.Gegenwärtig beschränkt sich die Online-Prozessüber-wachung bei chromatographischen Verfahren auf univa-riate Prozessparameter, wie pH-Wert, Leitfähigkeit oderAbsorption des Effluents. Erst in Offline-Analysen wer-den zentrale Prozessparameter, beispielsweise Zielpro-teingehalt, Konzentration an koeluierenden Kontamina-ten, etc. bestimmt. Für die Kontrolle eines kontinuierli-chen chromatographischen Verfahrens werden dieseProzessparameter jedoch in Echtzeit benötigt.WO 2014/154331 A1 offenbart ein Verfahren zur infra-rotspektoskopischen Massenbestimmung von Protein-gemischen in Proben, welche Biomoleküle beinhalten.Die Quantifizierung benötigt weniger Zeit, keine zusätz-lichen Puffer oder Eluenten und auch weniger Proben-volumen als herkömmliche bekannte Verfahren.Jedoch ist es mit diesem Verfahren nicht möglich, wäh-rend des chromatographischen Prozesses direkt bzw.online spektroskopische Messungen durchzuführen unddas Verfahren ist zudem nur auf die Quantifizierung vonProteinaggregaten auf einem zusätzlichen Trägermate-rial mittels Fourier-Transform-Infrarotspektrometie aus-gerichtet.[0002] WO 2010151214 A1 offenbart ein Verfahren zurMessung der Beladung sowie die Prozesskontrolle derBeladungsphasen in einer Ein- oder Mehrsäulen-Chro-matographie-Anordnung. Hierzu wird ein Signal vor undnach der Säule aufgezeichnet und über die Differenz aufdie beladene Masse an bindenden Spezies geschlossen.[0003] Dieses Verfahren benötigt jedoch unbedingtzwei Detektoren, wobei sich einer vor und einer hinterder Säule befindet. Zudem ist die Detektion auf Diffe-renzsignale und auf daraus berechnete Prozessparame-ter wie Saturierung der Säule, prozentualer Durchbruchdes Produkts limitiert.[0004] Ferner offenbart die Druckschrift WO 00/45929A1 ein chromatographisches System zur Bestimmungphysikochemischer Eigenschaften einer oder mehrererVerbindungen.[0005] Die Druckschrift von Santiago A. Bortolato et

al. mit dem Titel "Chemometric processing of second-order liquid chromatographic data with UV-vis and fluo-rescence detection. A comparison of multivariate curveresolution and parallel factor analysis 2", aus AnalyticaChimica Acta, Volume 842, 2014, Pages 11-19, ISSN0003-2670, ht-tp://dx.doi.org/10.1016/j.aca.2014.07.007, offenbart einChromatographie-Verfahren, wobei gemessene Datenvon einem chemomentrischen Verfahren verarbeitetwerden.[0006] Außerdem offenbart die Druckschrift von S.García-Martín et al. mit dem Titel "Solidphase microex-traction gas chromatography-mass spectrometry (HS-SPME-GC-MS) determination of volatile compounds inspirits: Multivariate chemometric characterisation" ausFood Chemistry, Volume 118, Issue 2, 2010, Pages456-461, ISSN 0308-8146, ht-tp://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2009.04.105, einFestphasen-Mikroextraktions-Gaschromatographie-Massenspektrometrieverfahren.[0007] In WO 2004/106915 A1 wird ein Verfahren of-fenbart zur Verringerung eines Satzes von gesammeltenLC-MS- oder LC-MS / MS-Daten, so dass echte chroma-tographische und MS-Peaks für die Verwendung in Me-tabonomika identifiziert werden können.[0008] Die Druckschrift DE 10 2010 047427 A1 offen-bart ein Verfahren zur selektiven Quantifizierung einzel-ner Proteine in einem Proteingemisch.[0009] Es ist deshalb die Aufgabe der vorliegenden Er-findung, ein Verfahren bereitzustellen, welches kontinu-ierliches Aufreinigen von Biopharmazeutika ermöglichtund dabei schnell, robust, produktiv und kosteneffektivist.Die Aufgabe wird durch die Gegenstände der unabhän-gigen Ansprüche gelöst. Bevorzugte Weiterbildungen er-geben sich aus den Unteransprüchen.Ein Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Re-geln zumindest einer Multisäulen-Chromatographie-An-ordnung zum kontinuierlichen Prozess des Aufreinigensvon Biopharmazeutika ggf. umfassend Virenfragmenteund/oder Viren und/oder Proteinen bzw. Proteingemi-schen und/oder Gemische beinhaltend Viren, vorzugs-weise in Lösung ggf. mit weiteren Komponenten in Lö-sung, aufweisend:

- Einbringen eines Multikomponentengemisches ineine Säule der Multisäulen-Chromatographie-An-ordnung,

- Erfassen von mindestens einem multivariaten Signalmittels zumindest eines Detektors,

- Berechnen von zumindest einem Prozessparameterbasierend auf dem multivariaten Signal mittels zu-mindest eines Datenverarbeitungsprogramms einerRecheneinheit durch Anwendung einer chemomet-rischen Methode und

- Regeln zumindest eines regelbaren Stellelementsauf Basis des zumindest einen Prozessparameterszum Regeln des Aufreinigungsprozesses.

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[0010] Vorteilhafterweise wurde gemäß der vorliegen-den Erfindung erkannt, dass chemometrische Verfahrenbzw. Methoden auch für Biopharmazeutika, insbesonde-re Proteingemische verwendet werden können, um an-hand der multivariaten Signale, d.h. insbesondere einesoder mehrerer Spektren eine Datenauswertung durch-führen zu können, obwohl die multivariaten Signale sehrähnlich bzw. nahezu identisch sind. Insbesondere wurdeerkannt, dass die chemometrischen Verfahren in einemkontinuierlichen Prozess eingesetzt werden können,auch wenn Gemische aufgereinigt werden, die derenEinzelkomponenten ähnliche oder nahezu identischemultivariate Signale aufweisen.[0011] Dabei steht im Vordergrund der vorliegendenErfindung, dass es sich insbesondere um ein tatsächlichkontinuierliches Verfahren handelt, welches im Gegen-satz zum Batch-Betrieb auch einer hohen Anzahl indivi-dueller Proben besonders vorteilhaft für die Biopharma-zeutische Industrie ist. Der Ausdruck "kontinuierlich"schließt gemäß der vorliegenden Erfindung insbesonde-re ein, dass sowohl die Zu- als auch Abfuhr des Multi-Komponentengemischs bzw. des Produktes kontinuier-lich ist. Die vorliegende Erfindung betrifft dabei bevorzugtdie präparative Chromatographie, d.h. die Aufreinigungvon Produktgemischen in produktionstechnischenMaßstäben - im Gegensatz zu einer rein analytischenChromatographie.[0012] Vorzugsweise kann das Verfahren die weiterenSchritte umfassen:

- Vergleichen des zumindest einen Prozessparame-ters mit zumindest einem Referenzparameter und

- Ermitteln zumindest eines Stellsignals auf Basis desProzessparameters.

[0013] Das Verfahren der vorliegenden Erfindung er-hält über zumindest einen Detektor ein oder mehreremultivariate Signale aus der Multisäulen-Chromatogra-phie-Anordnung und nutzt mathematische Methoden,wie Partial-Least-Square-Regression, künstliche neuro-nale Netzwerke, Support-Vector-Regression, etc., umaus Berechnungen mit dem oder den multivariaten Sig-nalen Information bezüglich des mindestens einen Pro-zessparameters zu extrahieren. Diese Informationenwerden danach verwendet, um mittels zumindest einesregelbaren Stellelements den Prozess der Multisäulen-Chromatographie-Anordnung zu regeln, so dass einmöglichst optimales Ergebnis erreicht wird, insbesonde-re ein reines Produkt oder reine Komponenten.[0014] Gemäß einer weiteren Ausführungsform ver-wendet das erfindungsgemäße Verfahren mindestenszwei Detektoren. Die mindestens zwei Detektoren kön-nen je nach Zielsetzung gleicher Art oder voneinanderverschieden sein und unabhängige multivariate Signalebereitstellen.[0015] Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eineMultisäulen-Chromatographie-Anordnung verwendbarfür einen kontinuierlichen Prozess des Aufreinigens von

Biopharmazeutika, aufweisend:

a) mindestens eine erste Trennsäule und eine zweiteTrennsäule mit jeweils mindestens einem Eingangund jeweils mindestens einem Ausgang,b) mindestens eine erste Zufuhrvorrichtung, welchezum Befördern von mindestens einem ersten Multi-komponentengemisch geeignet ist, wobei die min-destens erste Zufuhrvorrichtung mit dem mindes-tens einen Eingang der ersten Trennsäule verbun-den ist,c) mindestens eine erste Abführvorrichtung, welchezum Ableiten eines zweiten Multikomponentengemi-sches geeignet ist, wobei die mindestens erste Ab-führvorrichtung mit dem mindestens einen Ausgangder ersten Trennsäule verbunden ist,d) mindestens eine zweite Zufuhrvorrichtung, wel-che zum Befördern von einem zweiten Multikompo-nentengemisch geeignet ist, wobei die mindestenszweite Zufuhrvorrichtung mit dem mindestens einenEingang einer zweiten Trennsäule verbunden ist,e) mindestens eine zweite Abführvorrichtung, wel-che zum Ableiten eines dritten Multikomponenten-gemisches geeignet ist, wobei die mindestens zwei-te Abführvorrichtung mit dem mindestens einen Aus-gang der zweiten Trennsäule verbunden ist,f) mindestens einen Detektor zum Detektieren einesmultivariaten Signals undg) mindestens eine Recheneinheit mit mindestenseinem Datenverarbeitungsprogramm mit mindes-tens einem chemometrischen Rechenverfahren,

wobei die mindestens eine erste Abführvorrichtung mitder mindestens einen zweiten Zufuhrvorrichtung verbun-den ist;wobei mindestens eine der ersten und zweiten Zufuhr-vorrichtungen und/oder mindestens eine der ersten undzweiten Abführvorrichtungen mindestens ein steuerba-res oder regelbares Stellelement aufweist;wobei der mindestens eine Detektor vor mindestens ei-nem Eingang und/oder nach mindestens einem Ausgangangeordnet ist; undwobei der mindestens eine Detektor mit der mindestenseinen Rechnereinheit gekoppelt ist; wobei die mindes-tens eine Recheneinheit, mit dem mindestens einensteuerbaren bzw. regelbaren Stellelement gekoppelt istund wobei die mindestens eine Recheneinheit ausgelegtist,

- den zumindest einen Prozessparameter basierendauf dem multivariaten Signal zu berechnen;

- zumindest einen Prozessparameters mit zumindesteinem Referenzparameter zu vergleichen;

- zumindest ein Stellsignal auf Basis des Prozesspa-rameters zu ermitteln; und

- zumindest ein regelbares Stellelement auf Basis desProzessparameters zum Regeln des Aufreinigungs-prozesses zu regeln.

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[0016] Vorteilhafterweise können mit einer derartigenMultisäulen-Chromatographie-Anordnung die für einkontinuierliches chromatographisches Verfahren benö-tigten Prozessparameter in Echtzeit bestimmt bzw. er-mittelt und geregelt werden. Dies hat weiter zum Vorteil,dass ein Aufreinigen eines Multikomponentengemischesin einem kontinuierlichen Verfahren ermöglicht wird undein möglichst optimales Ergebnis erreicht wird, insbeson-dere ein reines Produkt oder reine Komponenten auseinem Multikomponentengemisch.[0017] Wie erwähnt basiert die vorliegende Erfindungauf einem tatsächlich kontinuierlichen Verfahren, wel-ches insbesondere die präparative Chromatographie,d.h. die Aufreinigung von Produktgemischen in produk-tionstechnischen Maßstäben betrifft. Demnach ist diehierin definierte Multisäulen-Chromatographie-Anord-nung eingerichtet, ein derart kontinuierliches und vor-zugsweise präparatives Aufreinigungsverfahren zu ge-währleisten.[0018] Gemäß der vorliegenden Erfindung können dieMultikomponentengemische komplexe Mischungensein, insbesondere von Zellkulturüberständen und/oderÜberstände von Fermentationen.[0019] In Hinsicht auf diese Anmeldung können Bio-pharmazeutika Arzneistoffe sein, die mit Mitteln der Bi-otechnologie und gentechnisch veränderten Organis-men hergestellt werden. Biopharmazeutika können dieoben genannten Multikomponentengemische umfassenbzw. daraus bestehen. Biopharmazeutika können Virenund/oder Virenfragmente als einzige Komponente odereine Komponente von mehreren Komponenten umfas-sen. Alternativ oder zusätzlich können BiopharmazeutikaProteine und/oder Polypeptide als einzige Komponenteoder eine Komponente von mehreren Komponenten um-fassen.[0020] Ebenso kann ein Proteingemisch, das aufge-reinigt wird, die oben genannten Multikomponentenge-mische umfassen bzw. daraus bestehen.[0021] Die Aufzeichnung eines oder mehrerer Signalein der Multisäulen-Chromatographie-Anordnung erfolgtdurch den mindestens einen Detektor, welcher in einemBereich des Zuflusses und/oder des Abflusses einerTrennsäule angeordnet sein kann. Der mindestens eineDetektor ist mit mindestens einer Recheneinheit signal-technisch verbunden. Die von dem Detektor detektiertenbzw. aufgezeichneten Signale können mittels eines vor-zugsweise chemometrischen Modells bzw. einer chemo-metrischen Methode von zumindest einem Datenverar-beitungsprogramm der Recheneinheit verarbeitet wer-den.[0022] Gemäß einer weiteren Ausführungsform um-fasst die erfindungsgemäße Multisäulen-Chromatogra-phie-Anordnung mindestens zwei Detektoren. Die min-destens zwei Detektoren können je nach Zielsetzunggleicher Art oder voneinander verschieden sein und un-abhängige multivariate Signale bereitstellen.[0023] Die Chemometrie umfasst mathematische undstatistische Methoden zur Planung und Auswahl optima-

ler Messverfahren und Experimente, und wird auch zurGewinnung maximaler chemischer Information bei derAnalyse chemischer Daten verwendet. Neben den sta-tistisch-mathematischen Methoden gehören auch Pro-bleme eines computergestützten, vernetzten Labors,Methoden zur Verwaltung von chemischen und spektro-skopischen Datenbanken sowie Verfahren der künstli-chen Intelligenz zum Gegenstand der Chemometrie (CA,Römpp-Online; http://d-nb.info/gnd/4299578-4).[0024] Die entsprechende Auswertung kann beispiels-weise die Berechnung der Einzelkonzentrationenund/oder Klassierung nach richtig oder falsch beinhalten.Die Prozessentscheidung bzw. Prozesskontrolle bzw.Prozesssteuerung erfolgt dann aufgrund des Resultatesder Auswertung der beispielsweise chemometrischenMethode. So können beispielsweise die Verschaltungder Säulen untereinander verändert, quantitative Signaleabgegriffen, die Dauer bestimmter Phasen eines Prozes-ses festgelegt und/oder Robustheitskontrollen durchge-führt werden.[0025] Eine derartige Prozesskontrolle kann insbeson-dere in kontinuierlichen Chromatographieprozessen vonVorteil sein, da sie schnell und robust ist. Die weiterenVorteile sind zum einen die Durchführbarkeit des Verfah-rens in Echtzeit, zum anderen die Möglichkeit zur quan-titativen Auswertung und Robustheitsanalyse. Der Be-griff Echtzeit charakterisiert den Betrieb informati-onstechnischer Systeme, die bestimmte Ergebnisse zu-verlässig innerhalb einer vorbestimmten Zeitspanne,zum Beispiel in einem festen Zeitraster, liefern können.[0026] Die Zeitspanne kann vorzugsweise unter 1 Mi-nute, weiter bevorzugt weniger als 30 Sekunden, auchbevorzugt weniger als 10 Sekunden, noch weiter bevor-zugt weniger als 5 Sekunden und am bevorzugtestenweniger als eine Sekunde sein.[0027] In der kontinuierlichen Chromatographie wer-den mehrere Trennsäulen in einer Anordnung derart mit-einander verbunden, so dass je nach Anforderungen dieSäulen parallel und/oder in Reihe geschaltet werden kön-nen und/oder dass jede Säule mit jeder anderen Säuleder Multisäulen-Chromatographie-Anordnung verschal-tet sein kann. So kann ein chromatographischer Lauf bei-spielsweise mit einer Säule, mit mehreren oder mit allenSäulen gleichzeitig durchgeführt werden.[0028] Bei herkömmlichen chromatographischen Ver-fahren besteht ein Chromatographie-Zyklus aus mehre-ren aufeinanderfolgenden Schritten, wie das Beladen,Waschen, Eluieren und Regenerieren der Säule. In derkontinuierlichen Chromatographie werden üblicherweisemehrere identische Säulen verwendet. Die oben ge-nannten Schritte können somit beispielsweise gleichzei-tig stattfinden, wobei in der Regel zur gleichen Zeit injeder einzelnen Säule ein anderer Schritt stattfindet.[0029] Somit kann mit der kontinuierlichen Chromato-graphie die Verarbeitungszeit verkürzt werden. Dadurchist das Verfahren verglichen mit herkömmlichen Batch-Verfahren wesentlich wirtschaftlicher und effizienter.[0030] Die Multisäulen-Chromatographie-Anordnung

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der vorliegenden Erfindung kann eine handelsüblicheMultisäulen-Chromatographie-Anordnung und/oder ei-ne Anordnung einzelner Einzelsäulen-Chromatogra-phie-Anordnungen sein. Der Einfachheit halber werdenin dieser Anmeldung die Chromatographiesäulen bzw.Trennsäulen mit Säulen bezeichnet. Weiter kann eineSäule aber auch eine Membrananordnung oder ein Mo-nolith sein. Monolithe sind Trennungsmedien in einerForm, die mit einem einzigen großen Partikel verglichenwerden kann und welche keine zwischenpartikulärenHohlräume aufweist. Mit Säule kann auch ein Bett mitgepackten Fasern gemeint sein, wobei die Fasern her-kömmlicherweise funktionalisiert sind. Auch ein Bett ge-packt mit Adsorberpartikel kann hier mit Säule gemeintsein.[0031] Die jeweiligen Säulen haben vorzugsweise ei-nen Eingang und vorzugsweise einen Ausgang. Es kannjedoch auch vorgesehen sein, dass eine oder mehrereSäulen auch eine Mehrzahl an Eingängen und/oder Aus-gängen aufweisen können.[0032] Das Einbringen eines Multikomponentengemi-sches in eine Säule der Multisäulen-Chromatographie-Anordnung erfolgt über eine Zufuhrvorrichtung. An jederSäule ist mindestens eine Zufuhrvorrichtung angeordnet.Es kann jedoch auch vorgesehen sein, dass Lösungs-mittel und/oder Reinigungslösungen eingeleitet werdenkönnen.[0033] Die zumindest eine Zufuhrvorrichtung kann der-art ausgestaltet sein, so dass insbesondere Biopharma-zeutika, beispielsweise Multikomponentengemische ausProteinen, in die Säule zugeführt werden können.[0034] Die Zufuhrvorrichtung kann mit einer Produkti-onskette für Biopharmazeutika, beispielsweise einem Bi-oreaktor verbunden sein. Weiter kann die Zufuhrvorrich-tung auch zumindest eine Pumpe umfassen, welche einMultikomponentengemisch über die Zufuhrvorrichtung indie Säule einführt bzw. leitet. Ein Multikomponentenge-misch kann mit einer mobilen Phase gemischt bzw. ver-dünnt werden. Die Verdünnung des Multikomponenten-gemisches kann beispielsweise vor der Zufuhrvorrich-tung erfolgen. Es kann jedoch auch vorgesehen sein,dass das Mischen des Multikomponentengemisches mitder mobilen Phase in der Zufuhrvorrichtung erfolgt.[0035] Das Multikomponentengemisch kann jedochauch vor der Chromatographie aufkonzentriert werden,so dass eine mögliche Verschiebung eines Absorptions-gewichts vermieden werden kann.[0036] Aufgrund der unterschiedlichen Wechselwir-kung der einzelnen Komponenten eines Multikomponen-tengemisches mit der stationären und der mobilen Phaseder Säule, werden die einzelnen Komponenten währenddes chromatographischen Laufs räumlich aufgetrennt.[0037] Nach bzw. hinter zumindest einer Säule derMultisäulen-Chromatographie-Anordnung ist ein Detek-tor angeordnet. Dies kann jedoch auch bedeuten, dassder Detektor vor einer nächsten Säule angeordnet seinkann bzw. zwischen zwei Säulen angeordnet sein kann.Der Detektor kann auch vor einer Säule angeordnet sein

und ein weiterer Detektor nach der Säule. Es könnenauch mehrere Detektoren vor und nach jeder Säule an-geordnet sein. Der zumindest eine Detektor ist ausge-legt, um multivariate Signale zu erfassen. Der Detektordetektiert ein multivariates Signal auf, sobald eine Kom-ponente bzw. ein Komponentengemisch des ursprüng-lichen Multikomponentengemisches den Detektor pas-siert.[0038] Bevorzugt ist ein Detektor nach einer erstenSäule der Multisäulen-Chromatographie-Anordnung an-geordnet. Weiter bevorzugt ist nach mehreren oder nachjeder Säule ein Detektor angeordnet. Bei der Verwen-dung von mindestens zwei Detektoren können diese jenach Bedarf und Prozessführung an verschiedenen Po-sitionen der Multisäulen-Chromatographie-Anordnungangeordnet sein.[0039] Vorzugsweise ist der mindestens eine Detektorein Detektor, welcher mindestens ein multivariates UV-,Vis-, Fluoreszens-, Streulicht-, Infrarot- und/oder Ra-mansignal detektieren kann. Der zumindest eine Detek-tor ist mit zumindest einer Recheneinheit gekoppelt bzw.signaltechnisch verbunden bzw. datentechnisch verbun-den. Ein multivariates Signal kann somit beispielsweiseein Spektrum sein, wie zum Beispiel ein Absorptions-spektrum, ein Infrarotspektrum und/oder ein Fluores-zensspektrum. In anderen Worten kann ein mulitvariatesSignal Strahlungsintensitäten als Funktion der Wellen-länge der Strahlung beinhalten, wohingegen ein univa-riates Signal lediglich genau eine Strahlungsintensitätbei genau einer Wellenlänge beinhaltet. Bei der Verwed-nung von mindestens zwei Detektoren können diese Si-gnale gleicher Art (bspw. jeweils UV-Signale) oder Sig-nale verschiedener Art (bspw. UV- und IR-Signale) be-reitstellen.[0040] Mit einem multivariaten Signal wird hier ein Si-gnal bezeichnet, dass im Gegensatz zum univariaten Si-gnal nicht nur aus einem Wert besteht, sondern auf vielenunabhängigen Signalen, z. B. zeitaufgelöste Spektralda-ten. Diese Signale können also (stark) korrelieren. An-dere denkbare multivariate Signale können Signale sein,welche beispielsweise mittels UV-, Vis-, Fluoreszens-,Infrarot-, Ramanspektroskopie und/oder Streulicht erhal-ten können.[0041] Das zumindest eine multivariate Signal wirddann zur Berechnung von zumindest einem Prozesspa-rameter verwendet. Das durch den Detektor detektiertemultivariate Signal kann von der zumindest einen Re-cheneinheit empfangen werden. Die zumindest eine Re-cheneinheit umfasst zumindest ein Datenverarbeitungs-programm mit einem chemometrischen Verfahren/Me-thode und/oder führt ein Datenverarbeitungsprogrammmit einem chemometrischen Verfahren/Methode aus.Das Berechnen des zumindest einen Prozessparame-ters wird mittels des mindestens einen Datenverarbei-tungsprogramms durchgeführt.[0042] Prozessparameter kann einer der folgendenParameter oder können mehrere der folgenden Parame-ter sein oder umfassen:

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- pH-Wert,- Leitfähigkeit,- Absorption des Effluenten,- Zielproteingehalt,- Konzentration an koeluierenden Kontaminaten,- Produktkonzentration,- Reinheit,- Ausbeute,- Produktionsrate und- In and out of specification.

[0043] Mit anderen Worten können Prozessparameteralle Parameter sein, welche im Prozess überwacht, ge-regelt und/oder gesteuert werden können, insbesondereKonzentrationen, Reinheiten und/oder ob der Prozessinnerhalb der Spezifikationen abläuft.[0044] Vorzugsweise kann das zumindest eine Daten-verarbeitungsprogramm Prozessparameter wie bei-spielsweise die Konzentration mindestens einer odermehrerer oder aller Komponenten eines Multikomponen-tengemisches berechnen. Weiter bevorzugt kann der zu-mindest eine Prozessparameter beispielsweise auch dieProduktreinheit, Ausbeute, Produktionsrate, Wirtschaft-lichkeit der Anlage und/oder In and out of specification(Einhaltung von Qualitätsrichtlinien) sein.[0045] Der bzw. die Prozessparameter werden dannmit zumindest einem Referenzparameter verglichen. Mitanderen Worten können die ermittelten Prozessparame-ter (beispielsweise zugehörig zu Fraktionen) auf die Kon-zentration an relevanten Spezies untersucht werden.Beispielsweise können Absorptionsspektren entspre-chend der Zeitdauer einer Fraktion gemittelt werden.[0046] Ein auf diese Weise dekonvoliertes Signal kanndazu verwendet werden, die chromatographische Auf-reinigung zu regeln. Hierbei wird, je nach Anwendung,das dekonvolierte Signal dazu verwendet, Ventileund/oder Pumpen oder andere steuerbare bzw. regelba-re Elemente der Multisäulen-Chromatographie-Anord-nung zu regeln.[0047] Mit anderen Worten kann das Verfahren dervorliegenden Erfindung auch die Schritte umfassen:

- Ermitteln der Produktkonzentration im Multikompo-nentengemisch an der Zufuhrvorrichtung mittels desSignals des Detektors, welcher vorzugsweise an ei-nem Ausgang einer Säule angeordnet ist,

- Berechnen der aktuellen Produktmasse mittels derermittelten Produktkonzentration und einer aktuel-len Flussrate,

- Vergleichen der aktuell geladenen Produktmassemit einem Stellwert, und

- Regeln des mindestens einen Stellelements, um ins-besondere die Verschaltung der Säulen basierendauf dem Vergleich der aktuell geladenen Masse undden Stellwert einzustellen.

[0048] Dies ist besonders vorteilhaft, da somit ein Auf-reinigungsprozess optimiert und die Ausbeute gesteigert

werden kann.[0049] Ein Training und eine Validierung des mathe-matischen Modells können anhand eines statistischenVerfahrens erfolgen. Hierbei kann beispielsweise derStrom aus Multikomponentengemisch in einer mobilenPhase, der in dieser Anmeldung als Feed bezeichnetwird, mit variablen Anteilen an Produkt und Kontaminan-ten versetzt sein, um Prozessvariation während eineskontinuierlichen Prozesses nachzustellen. Zusätzlichkann eine Verweilzeit des Produktes in der Säule wäh-rend der Beladungsphase variiert werden.[0050] Vorzugsweise kann die Berechnung des zumin-dest einen Prozessparameters mittels des zumindest ei-nen Datenverarbeitungsprogramms durchgeführt wer-den, wobei das Datenverarbeitungsprogramm ein che-mometrisches Verfahren umfassen oder ausführenkann. Das chemometrische Verfahren kann unter ande-rem beispielsweise Multiple Lineare Regression, Princip-le Component Regression, Partial Least Squares (PLS)Regression, Principal Component Analysis, Berechnun-gen mittels Neuronaler Netze (NN), Support Vector Ma-chines und/oder Multivariate Curve Resolution sein oderumfassen. Es ist auch eine Kombination dieser Verfah-ren denkbar.[0051] Ein Training und eine Validierung eines mathe-matischen Modells können anhand mehrerer Chromato-graphieläufe mit beispielsweise variabler Länge vonSalzgradienten in einem Kationentauscherschritt erfol-gen. Zum Training können Komponentenkonzentratio-nen mittels analytischer Verfahren genau bestimmt wer-den.[0052] Der Begriff Kationenaustauscherschritt ist einAufreinigungsschritt basierend auf Kationenaustausch-chromatographie.[0053] Hierbei können die Variationen der Gradienten-länge zu unterschiedlichen Konzentrationsverhältnissender Spezies im Effluenten, die den Kalibrierungsraumaufspannen, führen. Zusätzlich kann innerhalb diesesRaums ein Validierungsschritt durchgeführt werden. Ausden Daten können beispielsweise sowohl ein PartialLeast Squares Regression Modell als auch beispielswei-se ein Künstliches Neuronales Netzwerk kalibriert wer-den.[0054] Beispielsweise kann ein kalibriertes PLS Modelldazu verwendet werden, die Fraktionierung eines Ziel-proteins in Echtzeit in einem Polishing Schritt zu regeln.Da sich bei herkömmlichen Verfahren die Auftrennungvon Produkt und Kontaminanten von Batch zu Batch auf-grund von Prozessschwankungen bei der Herstellungdes Multikomponentengemischs verändern kann undProdukt und Kontaminanten nicht selektiv detektiert wer-den können, führt dies zu schwankender Produktqualität.Gemäß der vorliegenden Erfindung kann mit Hilfe desdekonvolierten multivariaten Signals vorteilhafterweiseauch bei Prozesschwankungen bei der Herstellung desMultikomponentengemischs selektiv detektiert werden,zu welchem Zeitpunkt die gewünscht Produktqualität er-reicht ist und mit Hilfe dieser Information ein regelbares

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Stellelement, beispielsweise ein Ventil der Multisäulen-Chromatographie-Anordnung zur optimierten Fraktionie-rung des Produktes geregelt werden.[0055] Insgesamt kann das Verfahren der vorliegen-den Erfindung zur Prozessüberwachung und -kontrolledazu verwendet werden, dass eine chromatographischeAuftrennungen von Multikomponentengemischen gere-gelt wird. Dies ist insbesondere für kontinuierliche Pro-zesse zentral, da hier der Prozess nicht für eine offlineAnalytik angehalten werden kann und sich Fehler vonZyklus zu Zyklus aufaddieren können. Mit Hilfe des Ver-fahrens der vorliegenden Erfindung kann jedoch der sta-tionäre Zustand einfach und ohne Unterbrechung für off-line Analytik kontrolliert werden.[0056] Das Verfahren der vorliegenden Erfindung istinsbesondere für einen kontinuierlichen Prozess desAufreinigens von insbesondere Biopharmazeutika ge-eignet. Die detektierten Signale und die Auswertung mit-tels mathematischer Methoden ist hierbei insbesonderevon Vorteil, da die daraus berechneten Prozessparame-ter in Echtzeit erhalten werden und ein erfindungsgemä-ßes kontinuierliches chromatographisches Verfahren,somit schnell, robust und effizient ist. Dies hat weiter zumVorteil, dass beim Aufreinigen eines Multikomponenten-gemisches ein optimales Ergebnis erreicht wird, insbe-sondere ein im Wesentlichen reines Produkt oder im We-sentlichen reine Komponenten aus einem Multikompo-nentengemisch.[0057] Die Verwendung des Begriffs "reines Produkt"bzw. des Begriffs "rein" hängt prinzipiell vom beispiels-weise verarbeiteten Protein und Prozess ab. Auch hatsich die Bedeutung "rein" in den Fachkreisen über dievergangenen Jahre verändert. Zwischen verschiedenenKontaminanten werden ebenfalls Unterschiede ge-macht. Besonders Viren und Host Cell Proteins müssensehr stark abgereinigt werden.[0058] Je nach Anwendungsfall können Detektoren anunterschiedlichen Stellen in der Multisäulen-Chromato-graphie-Anordnung angebracht und geregelt werden.[0059] Vorzugsweise kann das Verfahren der vorlie-genden Erfindung die weiteren Schritte umfassen:

- Auswerten eines multivariaten Signals des mindes-tens einen Detektors mittels der zumindest einen Re-cheneinheit, wobei der Detektor vorzugsweise an ei-nem Ausgang einer Säule angeordnet ist, so dassdie Komponentenkonzentration im Multikomponen-tengemisch an der Abführvorrichtung ermittelt wird,

- Bestimmen der Saturierung und/oder des Durch-bruchspunktes der mindestens einen Säule mittelsder ermittelten Komponentenkonzentration und

- Regeln des mindestens einen Stellelements, um dieVerschaltung der Säulen einzustellen basierend aufder ermittelten Saturierung und/oder dem Durch-bruchspunkt.

[0060] Beispielsweise kann das Verfahren angewen-det werden, um die Beladungsdauer im kontinuierlichen

Prozess zu regeln. Bei der kontinuierlichen Produktionvon Biopharmazeutika kann die Produktkonzentrationdurch Variabilität im Upstream schwanken. Jedoch kanndie Feedkonzentration mit herkömmlichen, univariatenDetektoren nicht in der Feedleitung detektiert werden.Da die Säulen im Regelfall jedoch eine begrenzte Kapa-zität aufweisen, die sich zudem durch Säulenalterungändern kann, ist eine Ermittlung der geladenen Produkt-masse von zentraler Wichtigkeit. Dies kann mit Hilfe derdekonvolierten, multivariaten Signale aus beispielsweisezwei Detektoren, welche jeweils vor und nach zumindesteiner Säule geschaltet werden können, in Echtzeit er-reicht werden.[0061] Beispielsweise, wird der Feed bzw. der Stromaus Multikomponentengemisch in einer mobilen Phaseüber einen ersten Detektor bzw. an einem ersten Detek-tor vorbei, welcher vor einer ersten Säule angeordnet ist,auf die erste Säule geleitet. Anschließend wird der Feedüber bzw. an einen zweiten Detektor vorbei auf eine zwei-te Säule geleitet, wobei der zweite Detektor nach derersten Säule angeordnet ist. Durch die Integration desdekonvolierten multivariaten Signals des ersten Detek-tors kann fortlaufend, d.h. kontinuierlich bzw. online dieaufgegebene Produktmasse berechnet werden. Da sichdie Kapazität der Säulen durch Alterung verändern kann,erfolgt die Regelung der Säulenverschaltung mit Hilfedes dekonvolierten, multivariaten Signals aus dem zwei-ten Detektor. Dieser befindet sich in diesem Beispiel im-mer auf der Downstreamseite der Säule. Wird ein be-stimmter Grenzwert der Produktkonzentration am Aus-gang der ersten Säule erreicht, kann die Stellung einesStellelements, beispielsweise eines Ventils bzw. einerPumpe, so verändert werden, dass der Feed auf die zwei-te Säule gepumpt bzw. geleitet und über den zweitenDetektor auf eine dritte Säule geleitet wird. Der oben be-schriebene Prozess kann fortwährend für alle Säulen zy-klisch wiederholt werden.[0062] Vorzugsweise kann das Verfahren der vorlie-genden Erfindung die weiteren Schritte umfassen:

- Ermitteln der Konzentration der Einzelkomponen-ten, und zwar beispielsweise einer, mehrerer bevor-zugt aller Einzelkomponenten, durch Auswertungdes zumindest einen multivariaten Signals zumin-dest eines Detektors mittels der mindestens einenRecheneinheit, wobei der zumindest eine Detektorzwischen zwei Säulen angeordnet ist,

- Berechnen eines Massenanteils von mindestens ei-ner Komponente,

- Vergleichen des ermittelten Massenanteils mit ei-nem Stellwert mittels der Recheneinheit und

- Regeln des mindestens einen Stellelements, um dieVerschaltung der Säulen einzustellen und/oderFraktionierung eines Produktes und/oder Verwerfenvon Fraktionen basierend auf den Stellwert.

[0063] Beispielsweise kann das Verfahren angewen-det werden, um die Fraktionierung eines Multikomponen-

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tengemisches im kontinuierlichen Prozess durchzufüh-ren. Bei der Produktelution von der Säule im kontinuier-lichen Verfahren muss über ein Ventil, welches vorzugs-weise nach den Säulen einer Multisäulen-Chromatogra-phie-Anordnung angeordnet ist, die Entscheidung getrof-fen werden, ob der Effluent fraktioniert, rezykliert oderverworfen wird.[0064] Mit anderen Worten kann das Verfahren dervorliegenden Erfindung weiter ein Kontrollieren einer Re-zyklierung von unvollständig aufgetrennten Bereichenumfassen.[0065] Durch Prozessschwankungen kann sich dieAuftrennung von Produkt und Kontaminanten im konti-nuierlichen Prozess verändern.[0066] Da Produkt und Kontaminanten mit herkömm-lichen Methoden nicht selektiv detektiert werden können,kann eine prozessorientierte Regelung des oben be-schriebenen Ventils als Stellelement über univariateMessmethoden komplex sein. Hierdurch können sich imschlechtesten Fall Fehler aufaddieren und der Prozesskann instabil werden. Dies kann sich negativ auf die Pro-duktqualität und die Ausbeute auswirken.[0067] Mit Hilfe des dekonvolierten multivariaten Sig-nals aus einem Detektor, welches vorzugsweise nachden Säulen des Multisäulen-Chromatographie-Anord-nung und vor dem Ventil als Stellelement angeordnet ist,kann dagegen selektiv detektiert werden, zu welchemZeitpunkt die gewünschte Produktqualität oder Ausbeutegegeben ist. Mit Hilfe dieser Information kann das Ventilgeregelt werden.[0068] Mit anderen Worten kann das Verfahren dervorliegenden Erfindung vorzugsweise weiter die Schritteumfassen:

- Berechnen neuer optimierter Prozessparameter mit-tels eines mathematischen Modells der Rechenein-heit anhand des zumindest einen berechneten Pro-zessparameters und

- Einstellen des Stellelements auf Basis der berech-neten Prozessparameter, um neue optimierte Pro-zessparameter zu erhalten.

[0069] Der Gegenstand der Erfindung wird nachfol-gend anhand von Ausführungsbeispielen beschrieben.

Figur 1 zeigt einen Versuchsaufbau im Batchmoduseiner Chromatographie-Anordnung (schematischeDarstellung eines Äkta pure der Firma GE Health-care, Chalfont St. Giles, UK) mit einem Dioden ArrayDetektor (DAD).Figur 2 zeigt einen beispielhaften Informationsflussfür die Kalibrierung eines mathematischen Modells.Figur 3 zeigt einen beispielhaften statistischen Ver-suchsplan zur Modellkalibrierung und Validierung fürdie Regelung der Beladungsdauer.Figur 4 zeigt einen beispielhaften Vergleich einerPLS-Modellvorhersage mit einer Referenzanalytik.Figur 5 zeigt einen beispielhaften Vergleich einer

NN-Modellvorhersage mit der Referenzanalytik.Figur 6 zeigt einen beispielhaften Vergleich einerPLS-Modellvorhersage mit der Referenzanalytik.Figur 7 zeigt einen beispielhaften Vergleich der NN-Modellvorhersage mit der Referenzanalytik.Figur 8 zeigt ein Rohrleitungs- und Instrumenten-fließschema zur Kontrolle kontinuierlicher Chroma-tographie.Figur 9 zeigt ein Flussdiagramm für allgemeine Vor-arbeiten.Figur 10 zeigt ein Flussdiagramm für ein allgemeinesBeispiel für eine Prozesskontrolle.Figur 11 zeigt ein Flussdiagramm eines spezifischenBeispiels für eine Vorarbeit.Figur 12 zeigt ein Flussdiagramm für ein spezifi-sches Beispiel für eine Prozesskontrolle.Figur 13 zeigt zwei Absorptionsspektren von Anti-körper und Antikörper-Aggregaten.Figur 14 zeigt den spektralen Unterschied im UV Be-reich zwischen Antikörper und Antikörper-Aggrega-ten (A) und ein zugehöriges Differenzspektrum (B).

[0070] Figur 1 zeigt einen Versuchsaufbau für ein Ex-periment mit einer Chromatographie-Anordnung imBatchmodus. Zu sehen ist ein Vorrat von einer mobilenPhase 6, ein Stellelement 4, eine Säule 2, eine Zufuhr-vorrichtung 8, interne Detektoren 10, ein DiodenarrayDetektor (DAD) 12 und eine Fraktionsvorrichtung 14. Diehier beispielhaft beschriebene Chromatographie-Anord-nung ist unter der Bezeichnung Äkta pure von GE Health-care, Chalfont St. Giles, UK vertrieben Chromatogra-phie-Anordnung. Zusätzlich ist ein DAD 12 in der Chro-matographie-Anordnung angeordnet, welcher unter derBezeichnung Ultimate 3000 von Dionex, Fisher Scienti-fic, USA, vertrieben wird. Wie bereits oben beschrieben,können für das Training und die Validierung der verwen-deten mathematischen Modelle mehrere chromatogra-phische Auftrennungen unter verschiedenen Bedingun-gen durchgeführt werden. Der Effluent der Säule 2 wirddabei bei allen Experimenten über den DAD 12 geleitetund anschließend fraktioniert. Dabei greift der DAD 12kontinuierlich Absorptionsspektren ab.[0071] Wie in Figur 2 dargestellt können die Fraktionen20 dann mit einer externen Referenzanalytik 18 (analy-tische Chromatographie) auf die Konzentration an rele-vanten Spezies untersucht werden. Die Absorptions-spektren 16 wurden entsprechend der Zeitdauer einerFraktion 20 gemittelt. Anschließend werden die mathe-matischen Modelle mit den Trainingsdaten kalibriert undanhand der Validierungsdaten überprüft.[0072] Ein erstes Anwendungsbeispiel zeigt die Rege-lung der Beladungsdauer. Das Training und die Validie-rung des mathematischen Modells erfolgen anhand ei-nes statistischen Versuchsplans, gezeigt in Figur 3. Hier-bei wird der Feed mit variablen Anteilen an Produkt undKontaminanten versetzt, um Prozessvariation währendeines kontinuierlichen Prozesses nachzustellen. Zusätz-lich werden die Verweilzeit des Produktes in der Säule

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2 während der Beladungsphase variiert. Der Zentrums-punkt des statistischen Versuchsplans stellt den Validie-rungslauf dar.[0073] Aus den Daten werden sowohl ein Partial LeastSquares Regression (PLS) Modell als auch ein Künstli-ches Neuronales Netzwerk (NN) kalibriert bzw. trainiert.Ein Vergleich der Modellvorhersage und der Referenz-analytik für die Trainings- und Validierungsdaten ist inFigur 4 für das PLS-Modell, bzw. in Figur 5 für das NNgezeigt.[0074] Das kalibrierte PLS-Model kann im Anschlussdazu verwendet werden, die Beladungsphase währendeiner Protein Chromatographie zu steuern. Vorteilhafthierbei ist, dass das kalibrierte PLS-Model für die Online-Prozessüberwachung verwendet werden kann und somiteine kontinuierliche Aufreinigung von Multikomponen-tengemischen ermöglicht, ohne dass eine offline Analytikdes Feeds notwendig ist. Da die Produktkonzentrationgleichzeitig variabel ist und sich auch die Kapazität derSäule durch Alterung verändern kann, muss bei jedemneuen Batch der Titer zunächst offline ermittelt werden,bevor der Prozess weitergefahren werden kann.[0075] Zusätzlich müssen aufwendige Studien durch-geführt werden, um die Säulenalterung zu untersuchen.Mit Hilfe des dekonvolierten multivariaten Signals kanndagegen am Ausgang der Säule ermittelt werden, wenndas Produkt durchbricht. Mit Hilfe dieser Informationkann ein entsprechendes Ventil als Stellelement ge-schaltet und der Pumpvorgang des Feeds zu einem ge-eigneten Zeitpunkt beendet werden.[0076] Ein weiteres beispielhaftes Anwendungsbei-spiel ist die Steuerung der Fraktionierung eines Zielpro-duktes.[0077] Das Training und die Validierung des mathe-matischen Modells erfolgen anhand mehrerer Chroma-tographieläufe mit variabler Länge der Salzgradienten(1, 3, 5, 7 Säulenvolumen [CV]) in einem Kationentau-scherschritt. Hierbei führt die Variation der Gradienten-länge zu unterschiedlichen Konzentrationsverhältnissender Spezies im Effluent, die den Kalibrierungsraum auf-spannen. Zusätzlich wird ein Validierungslauf innerhalbdieses Raums durchgeführt.[0078] Aus den Daten werden sowohl ein Partial LeastSquares Regression (PLS) Modell als auch ein Künstli-ches Neuronales Netzwerk (NN) kalibriert. Ein Vergleichder Modellvorhersage und der Referenzanalytik für dieTrainings- und Validierungsdaten ist in Figur 6 für dasPLS-Modell, bzw. in Figur 7 für das NN gezeigt.[0079] Das kalibrierte PLS-Modell wird im Anschlussdazu verwendet, die Fraktionierung eines Zielproteins inEchtzeit in einem Polishing Schritt zu regeln und hier-durch zu optimieren. Das Problem, welches hierbei ge-löst wird, ist dass sich die Auftrennung von Produkt undKontaminanten von Batch zu Batch aufgrund von Pro-zessschwankungen verändern kann. Da Produkt undKontaminanten nicht selektiv detektiert werden können,führt dies zu schwankender Produktqualität. Mit Hilfe desdekonvolierten multivariaten Signals kann dagegen se-

lektiv detektiert werden, zu welchem Zeitpunkt die ge-wünscht Produktqualität erreicht ist und mit Hilfe dieserInformation das Ventil zur Fraktionierung des Produktesgesteuert werden.[0080] Insgesamt kann das erfindungsgemäße Ver-fahren zur Prozessüberwachung und -kontrolle dazu ver-wendet werden, chromatographische Auftrennungen zusteuern. Dies ist insbesondere für kontinuierliche Pro-zesse zentral, da hier der Prozess nicht für eine Offline-Analytik angehalten werden kann und sich Fehler vonZyklus zu Zyklus aufaddieren können. Mit Hilfe des Ver-fahrens der vorliegenden Erfindung kann jedoch der sta-tionäre Zustand einfach kontrolliert werden.[0081] Im Folgenden wird beispielhaft die Durchfüh-rung der Anwendungsbeispiele in kontinuierlicher Chro-matographie beschrieben.[0082] Das oben beschriebene Verfahren zur Prozess-kontrolle kann in kontinuierlicher Chromatographie ver-wendet werden. Die detektierten Signale und die Aus-wertung mittels mathematischer Methoden bleibt hierbeiidentisch zum Batch Modus. Allerdings verändert sich,wie das dekonvolierte Signal zur Steuerung der Ventileverwendet wird. Ein derartiges Konzept ist in Figur 8 dar-gestellt. Je nach Anwendungsfall werden Detektoren anunterschiedlichen Stellen in die Rohrleitungen 22 derMultisäulen-Chromatographie-Anordnung integriert.[0083] Beispielhaft kann das Verfahren zur Regelungder Beladungsdauer im kontinuierlichen Prozess ange-wendet werden. Bei der kontinuierlichen Produktion vonBiopharmazeutika kann die Produktkonzentration durchVariabilität im Upstream schwanken und mit herkömm-lichen, univariaten Detektoren nicht in der Feedleitungdetektiert werden. Da die Säulen 26, 28, 30 jedoch einebegrenzte Kapazität aufweisen, die sich zudem durchSäulenalterung ändern kann, ist eine Ermittlung der ge-ladenen Produktmasse zentral. Dies kann mit Hilfe derdekonvolierten, multivariaten Signale aus Detektor 32und 34 in Figur 8 in Echtzeit erreicht werden.[0084] Angenommen der Feed wird über Detektor 32auf die Säule 26 gepumpt und anschließend über denDetektor 34 auf die Säule 28 geleitet. Durch die Integra-tion des dekonvolierten multivariaten Signals des Detek-tors 32 kann fortlaufend die aufgegebene Produktmasseberechnet werden.[0085] Da sich die Kapazität der Säulen durch Alterungverändern kann, erfolgt die Regelung der Säulenver-schaltung mit Hilfe des dekonvolierten, multivariaten Si-gnals aus Detektor 34. Dieser befindet sich immer zwi-schen beladener und auffangender Säule. Ist ein be-stimmter Grenzwert der Produktkonzentration am Aus-gang von Säule 26 erreicht, wird die Stellung von Ventil36 und 38 so verändert, dass der Feed auf Säule 28 undüber bzw. an Detektor 34 vorbei auf Säule 30 geleitetwird. Der oben beschriebene Prozess wird fortwährendfür alle Säulen 26, 28, 30 zyklisch wiederholt.[0086] Ein weiteres Beispiel für eine Anwendung desVerfahrens der vorliegenden Erfindung ist die Regelungder Fraktionierung im kontinuierlichen Prozess.

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[0087] Bei der Produktelution der Säule 26, 28, 30 imkontinuierlichen Verfahren muss über Ventil 40 die Ent-scheidung getroffen werden, ob der Effluent fraktioniert,rezykliert oder verworfen wird. Durch Prozessschwan-kungen kann sich die Auftrennung von Produkt und Kon-taminanten im kontinuierlichen Prozess verändern.[0088] Da Produkt und Kontaminanten mit herkömm-lichen Methoden nicht selektiv detektiert werden können,kann eine prozessorientierte Regelung von Ventil 40über univariate Messmethoden komplex sein. Hierdurchkönnen sich im schlechtesten Fall Fehler aufaddierenund der Prozess kann instabil werden. Dies kann sichnegativ auf die Produktqualität oder die Ausbeute aus-wirken. Mit Hilfe des dekonvolierten multivariaten Signalsaus Detektor 42 kann dagegen selektiv detektiert wer-den, zu welchem Zeitpunkt die gewünschte Produktqua-lität oder Ausbeute als bevorzugter Prozessparametergegeben ist. Mit Hilfe dieser Information kann Ventil 40gesteuert werden.[0089] Figuren 9 und 10 zeigen beispielhafte Flussdi-agramme für die Vorarbeit und für die Prozesskontrollefür einen beispielhaften spezifischen Fall. Gegebenen-falls wird eine Kalibrierung eines chemometrischen Mo-dells vorgenommen. Dies entfällt bei der Verwendungeiner Multivariate Curve Resolution. Die Kalibrierung fin-det zunächst im Batch-Modus statt und unter der Ver-wendung einer Offline-Referenzanalytik.[0090] Anhand der Kalibrierung ist es somit möglicheine Zielfunktion zu definieren und die dazugehörigenGrenzwerte, beispielsweise eine bestimmte Reinheitund/oder die maximal zu ladende Masse, festzulegen.[0091] Die somit erhaltenen Daten werden dann für diekontinuierliche Multisäulen-Chromatographie zur Aufrei-nigung von Biopharmazeutika verwendet (Figur 10). Zu-mindest ein multivariates Signal in einer Multisäulen-Chromatographie-Anordnung wird aufgezeichnet. DieAufzeichnung findet mittels Detektoren im Zuflussund/oder Abfluss der Säulen statt.[0092] Das zumindest eine aufgezeichnete multivari-ate Signal wird dann mittels zumindest eines chemome-trischen Modells bzw. einer chemometrischen Methodeausgewertet, beispielsweise in einer Berechnung derEinzelkonzentrationen und/oder Klassierung nach richtigoder falsch.[0093] Aufgrund der Resultate der chemometrischenMethode erfolgt die Prozessentscheidung, beispielswei-se eine Änderung der Säulenverschaltung und/oder derFlussrate und/oder des Gradienten.[0094] Figuren 11 zeigt ein beispielhaftes Flußdia-gramm für die Vorarbeit für einen beispielhaften allge-meinen Fall.[0095] Die Kalibrierung des chemometrischen Modellsfür einen komplexen Feed aus beispielsweise einem Bi-oreaktor wird zunächst mittels Kalibrierungsversuche imBatchmodus ermöglicht. Ein Feed aus beispielsweise ei-nem Bioreaktor weist herkömmlicherweise eine variie-rende Produktkonzentration und Qualität auf. Bei den Ka-librierungsversuchen im Batchmodus werden daher

wichtige Parameter variiert, zum Beispiel die Konzentra-tion des Produktproteins, Menge und Zusammensetzungder Kontaminanten. Weiter wird die maximale Bela-dungsmasse auf eine Säule festgesetzt. Diese Variatio-nen werden anhand von Vorversuchen, Prozessver-ständnis, etc. festgesetzt. Daraufhin wird die Verände-rung der effektiven Säulenverschaltung festgelegt.[0096] Figur 12 zeigt ein beispielhaftes Flußdiagrammfür die Prozesskontrolle für einen beispielhaften allge-meinen Fall.[0097] Die erste Säule einer Multi-Säulen-Chromato-graphieanordung wird mit einem komplexen Gemisch mitvariablen Produktkonzentrationen beladen. Ein multiva-riates Signal wird in der Zufuhr zur Säule detektiert. DasSignal wird daraufhin mittels des trainierten Modells aus-gewertet und somit beispielsweise die Produktkonzent-ration ermittelt. Als weiterer Schritt folgt das Aufsummie-ren bzw. die Integration der Massen der einzelnen Kom-ponenten des Gemisches.[0098] Der Begriff Masse bezieht sich hier auf die ak-tuell geladene Produktmasse auf der ersten Säule. Wei-terhin wird in dem konkret beschriebenen Beispiel nurdie Produktkonzentration und geladene Produktmassebestimmt.[0099] Als nächstes folgt der Wechsel auf eine zweiteSäule der Multi-Säulen-Chromatographieanordung,wenn die Masse den vordefinierten Stellwert überschrei-tet. Der Vorgang kann dann im Anschluss für die zweiteSäule wiederholt werden.[0100] Figur 13 zeigt zwei beispielhafte Absorptions-spektren. Ein Absorptionsspektrum betrifft einen Antikör-pern, und ist in Figur 13 als durchgezogene Linie darge-stellt. Das in Figur 13 als gepunktete Linie dargestellteSpektrum betrifft ein Antikörper-Aggregat. Es ist deutlichzu sehen, wie gering die Unterschiede zwischen denSpektren sind. Insbesondere wurde vor der Erfindungangenommen, dass aufgrund der geringen Unterschiedezwischen solchen Spektren derartige Spektren nicht zurRegelung einer kontinuierlichen Multi-Säulen-Chroma-tographie herangezogen werden können. Gemäß dervorliegenden Erfindung wurde jedoch erkannt, dass mit-tels chemometrischer Verfahren, insbesondere PLSund/oder neuronaler Netze möglich ist, aufgrund der ge-ring jedoch vorhandenen spektralen Unterschiede einekontinuierlichen Multi-Säulen-Chromatographie derartzu regeln, insbesondere Prozessentescheidungen zutreffen, um einen Aufreinigungsprozess derart zu regeln,dass ein Biopharmazeutikum und/oder Protein und/oderProteingemisch und/oder ein anderweitiges gesuchtesProdukt mit ausreichender Reinheit zu extrahieren. Sokann beispielsweise ein gesuchter Antikörper in Multi-komponentengemische selektiv quantifiziert werdenbzw. daraus extrahiert, d.h. aufgereinigt werden, obwohlsich die Spektren nur im mAU-Bereich unterscheidenkönnen.[0101] Figur 14a zeigt die UV Spektren zweier Kom-ponenten in einem Komponentengemisch, die als IgG-01 und IgG02 bezeichnet werden. Figur 14b zeigt ein

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Differenzspektrum der beiden Spektren von Fig. 14a. Mit-tels des erfindungsgemäßen Verfahrens können die bei-den Antikörper IgG-01 und IgG-02 in einem Gemisch se-lektiv quantifiziert werden und jeweils aus dem Gemischextrahiert, d.h. jeweils aufgereinigt werden, obwohl, wiein Fig. 14b ersichtlich, die spektralen Unterschiede umetwa drei Grössenordnungen kleiner sind, als die nor-mierten Spektrumintensitäten.

Patentansprüche

1. Verfahren zum Regeln zumindest einer Multisäulen-Chromatographie-Anordnung zum kontinuierlichenProzess des Aufreinigens von Biopharmazeutika,aufweisend:

- Einbringen eines ersten Multikomponentenge-misches in eine Säule (2; 26, 28, 30) der Multi-säulen-Chromatographie-Anordnung,- Erfassen von mindestens einem multivariatenSignal mittels zumindest eines Detektors (10,12; 32, 34, 42),- Berechnen von zumindest einem Prozesspa-rameter basierend auf dem multivariaten Signalmittels zumindest eines Datenverarbeitungs-programms einer Recheneinheit durch Anwen-dung eines chemometrischen Verfahrens und- Regeln des Aufreinigungsprozesses durch Re-geln zumindest eines regelbaren Stellelements(4) auf Basis des zumindest einen Prozesspa-rameters.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahrendie weiteren Schritte umfasst:

- Vergleichen des zumindest einen Prozesspa-rameters mit zumindest einem Referenzpara-meter und- Ermitteln zumindest eines Stellsignals auf Ba-sis des Prozessparameters und wobei der Auf-reinigungsprozess durch Regeln des Stellsig-nals geregelt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das zu-mindest eine Datenverarbeitungsprogramm als Pro-zessparameter die Konzentration zumindest einerKomponente des zumindest einen Multikomponen-tengemisches berechnet.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobeidas zumindest eine Datenverarbeitungsprogrammzumindest einen der folgenden Prozessparameterberechnet:

- pH-Wert,- Leitfähigkeit,- Absorption des Effluenten,

- Zielproteingehalt,- Konzentration an koeluierenden Kontamina-ten,- Produktkonzentration,- Reinheit,- Ausbeute,- Produktionsrate und- In and out of specification.

5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprü-che, wobei der zumindest eine Detektor (10, 12; 32,34, 42) ausgelegt ist, zumindest ein multivariates Si-gnal aufzuzeichnen, wobei das multivariate Signalein oder mehrere der folgenden Signale umfasst:

- UV-Spektroskopiesignal,- Vis-Spektroskopiesignal,- Fluoreszensspektroskopiesignal,- Streulichtsignal,- IR-Spektroskopiesignal und- Ramanspektroskopiesignal.

6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprü-che, wobei das Berechnen von zumindest einemProzessparameter mittels des einen Datenverarbei-tungsprogramms mit zumindest einem der folgen-den chemometrischen Verfahren durchgeführt wird:Partial Least Squares Regression und/oder Berech-nungen mittels eines neuronalen Netzes.

7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprü-che, wobei das Verfahren weiter umfasst:

a) Ermitteln der Produktkonzentration im Multi-komponentengemisch an der Zufuhrvorrichtung(8) mittels des Detektors (10, 12; 32, 34, 42),welcher vorzugsweise an einem Ausgang einerSäule (2; 26, 28, 30) angeordnet ist,b) Berechnen der aktuellen auf eine Säule (2;26, 28, 30) geladenen Produktmasse mittels derermittelten Produktkonzentration und einer ak-tuellen Flussrate,c) Vergleichen der aktuell geladenen Produkt-masse mit einem Stellwert undd) Regeln zumindest eines regelbaren Stellele-ments (4) auf Basis der aktuell geladenen Pro-duktmasse zum Regeln des Aufreinigungspro-zesses, wobei das zumindest eine regelbareStellelement (4) bevorzugt ein Ventil oder einePumpe ist.


a) Auswerten eines multivariaten Signals desmindestens einen Detektors (10, 12; 32, 34, 42)mittels der zumindest einen Recheneinheit, wo-bei der Detektor (10, 12; 32, 34, 42) an einem

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Ausgang einer Säule (2; 26, 28, 30) angeordnetist, so dass die Komponentenkonzentration imMultikomponentengemisch an der Abführvor-richtung ermittelt wird,b) Bestimmen der Saturierung und/oder desDurchbruchspunktes der mindestens einenSäule (2; 26, 28, 30) mittels der ermittelten Kom-ponentenkonzentration undc) Regeln des mindestens einen Stellelements(4), um die Verschaltung der Säulen (2; 26, 28,30) einzustellen basierend auf der ermitteltenSaturierung und/oder dem Durchbruchspunkt.


a) Ermitteln der Konzentration einer oder meh-rerer, insbesondere aller Einzelkomponentendurch Auswertung des zumindest einen multi-variaten Signals zumindest eines Detektors (10,12; 32, 34, 42) mittels der mindestens einen Re-cheneinheit, wobei der zumindest eine Detektor(10, 12; 32, 34, 42) zwischen zwei Säulen (2;26, 28, 30) angeordnet ist,b) Berechnen eines Massenanteils von mindes-tens einer Komponente,c) Vergleichen des ermittelten Massenanteilsmit einem Stellwert mittels der Recheneinheitundd) Regeln des mindestens einen Stellelements(4), um die Verschaltung der Säulen (2; 26, 28,30) und/oder die Fraktionierung eines Produk-tes und/oder das Verwerfen von Fraktionen ba-sierend auf dem Stellwert einzustellen.

10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprü-che, wobei das Verfahren weiter das Kontrolliereneiner Rezyklierung von unvollständig aufgetrenntenBereichen umfasst.


- Berechnen neuer optimierter Prozessparame-ter mittels eines mathematischen Modells an-hand des zumindest einen berechneten Prozes-sparameters; und- Einstellen des Stellelements (4) auf Basis derberechneten Prozessparameter, um neue opti-mierte Prozessparameter zu erhalten.

12. Multisäulen-Chromatographie-Anordnung ver-wendbar für einen kontinuierlichen Prozess des Auf-reinigens von Biopharmazeutika, aufweisend:

a) mindestens eine erste Trennsäule (2; 26, 28,30) und eine zweite Trennsäule (2; 26, 28, 30)mit jeweils mindestens einem Eingang und je-

weils mindestens einem Ausgang,b) mindestens eine erste Zufuhrvorrichtung (8),welche geeignet ist zum Befördern von mindes-tens einem ersten Multikomponentengemisch,wobei die mindestens erste Zufuhrvorrichtung(8) mit dem mindestens einen Eingang der ers-ten Trennsäule (2; 26, 28, 30) verbunden ist,c) mindestens eine erste Abführvorrichtung,welche geeignet ist zum Ableiten eines zweitenMultikomponentengemisches, wobei die min-destens erste Abführvorrichtung mit dem min-destens einen Ausgang der ersten Trennsäule(2; 26, 28, 30) verbunden ist,d) mindestens eine zweiten Zufuhrvorrichtung(8), welche geeignet ist zum Befördern von ei-nem zweiten Multikomponentengemisch, wobeidie mindestens zweite Zufuhrvorrichtung (8) mitdem mindestens einen Eingang einer zweitenTrennsäule (2; 26, 28, 30) verbunden ist,e) mindestens eine zweite Abführvorrichtung,welche geeignet ist zum Ableiten eines drittenMultikomponentengemisches, wobei die min-destens zweite Abführvorrichtung mit dem min-destens einen Ausgang der zweiten Trennsäule(2; 26, 28, 30) verbunden ist,f) mindestens einen Detektor (10, 12; 32, 34, 42)zum Detektieren eines multivariaten Signals,g) mindestens eine Recheneinheit mit mindes-tens einem Datenverarbeitungsprogramm mitmindestens einem chemometrischen Rechen-verfahren,

wobei die mindestens eine erste Abführvorrichtungmit der mindestens zweiten Zufuhrvorrichtung (8)verbunden ist,wobei mindestens eine der ersten und zweiten Zu-fuhrvorrichtungen (8) und/oder mindestens eine derersten und zweiten Abführvorrichtungen mindestensein steuerbares oder regelbares Stellelement (4)aufweist,wobei der mindestens eine Detektor (10, 12; 32, 34,42) nach mindestens einem Ausgang angeordnetist, undwobei der mindestens eine Detektor (10, 12; 32, 34,42) mit der mindestens einen Rechnereinheit gekop-pelt ist; wobei die mindestens eine Recheneinheitmit dem mindestens einen steuerbaren bzw. regel-baren Stellelement (4) gekoppelt ist und wobei diemindestens eine Recheneinheit ausgelegt ist,

- den zumindest einen Prozessparameter basie-rend auf dem multivariaten Signal zu berechnenund- zumindest ein regelbares Stellelement (4) aufBasis des zumindest einen Prozessparameterszu regeln.

13. Multisäulen-Chromatographie-Anordnung nach An-

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spruch 12, wobei die Recheneinheit weiter ausge-legt ist,

- zumindest einen Prozessparameter mit zumin-dest einem Referenzparameter zu vergleichen,- zumindest ein Stellsignal auf Basis des Pro-zessparameters zu ermitteln undden Aufreinigungsprozess durch Regeln desStellsignals zu regeln.

14. Multisäulen-Chromatographie-Anordnung nach An-spruch 12 oder 13, wobei das Stellelement (4) einVentil oder eine Pumpe ist.

15. Verwendung der Multisäulen-Chromatographie-An-ordnung nach einem der Ansprüche 12 bis 14, ineinem kontinuierlichen Prozess des Aufreinigensvon insbesondere Biopharmazeutika, wobei die Mul-tikomponentengemische komplexe Mischungen,insbesondere von Zellkulturüberständen und/oderÜberständen von Fermentationen sind.

Claims

1. Method for controlling at least one multi-columnchromatography arrangement for a continuous proc-ess of purification of biopharmaceuticals, compris-ing:

- introducing a first multi-component mixture intoa column (2; 26, 28, 30) of the multi-column chro-matography arrangement,- detecting at least one multivariate signal bymeans of at least one detector (10, 12; 32, 34,42),- calculating at least one process parameterbased on the multivariate signal by means of atleast one data processing program of a comput-ing unit by applying a chemometric method and- controlling the purification process by meansof controlling at least one controllable control el-ement (4) based on the at least one processparameter.

2. Method according to claim 1, wherein the methodcomprises the further steps of:

- comparing the at least one process parameterwith at least one reference parameter and- determining at least one control signal on thebasis of the process parameter and wherein thepurification process is controlled by controllingthe control signal.

3. Method according to claim 1 or 2, wherein the at leastone data processing program calculates the concen-tration of at least one component of the at least one

multi-component mixture as process parameter.

4. Method according to one of claims 1 to 3, whereinthe at least one data processing program calculatesat least one of the following process parameters:

- pH value,- conductivity,- absorption of the effluent,- target protein content,- concentration of coeluting contaminants,- product concentration,- purity,- yield,- production rate and- In and out of specification.

5. Method according to one of the previous claims,wherein the at least one detector (10, 12; 32, 34, 42)is designed to record at least one multivariate signal,wherein the multivariate signal comprises one ormore of the following signals:

- UV spectroscopy signal,- vis spectroscopy signal,- fluorescence spectroscopy signal,- scattered light signal,- infrared spectroscopy signal and- Raman spectroscopy signal.

6. Method according to one of the previous claims,wherein the calculation of at least one process pa-rameter by means of the one data processing pro-gram is carried out by means of at least one of thefollowing chemometric methods: Partial LeastSquares Regression and/or calculations by meansof a neural network.

7. Method according to one of the previous claims,wherein the method further comprises:

a) determining the product concentration in themulti-component mixture at the feed device (8)by means of the detector (10, 12; 32, 34, 42),which is preferably arranged at an output of acolumn (2; 26, 28, 30),b) calculating the current product mass loadedonto a column (2; 26, 28, 30) by means of thedetermined product concentration and a currentflow rate,c) comparing the currently loaded product masswith a control value, andd) controlling at least one controllable controlelement (4) based on the currently loaded massfor controlling the purification process, whereinthe at least one controllable control elementpreferably is a valve or a pump.

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a) evaluating a multivariate signal of the at leastone detector (10, 12; 32, 34, 42) by means ofthe at least one computing unit, wherein the de-tector is preferably arranged at an output of acolumn (2; 26, 28, 30) so that the componentconcentration in the multi-component mixture isdetected at the discharge device,b) determining the saturation and/or break-through point of the at least one column (2; 26,28, 30) by means of the detected componentconcentration andc) controlling the at least one control element (4)in order to set the interconnection of the columns(2; 26, 28, 30) based on the detected saturationand/or the breakthrough point.


a) detecting the concentration of one or several,in particular all single components by evaluatingthe at least one multivariate signal of at leastone detector (10, 12; 32, 34, 42) by means ofthe at least one computing unit, wherein the atleast one detector (10, 12; 32, 34, 42) is ar-ranged between two columns (2; 26, 28, 30),b) calculating a mass percent of at least onecomponent,c) comparing the determined mass percent witha control value by means of the computing unitandd) controlling the at least one control element(4) in order to set the interconnection of the col-umns (2; 26, 28, 30) and/or fractioning of a prod-uct and/or rejecting of fractions based on thecontrol value.

10. Method according to one of the previous claims,wherein the method further comprises the controllingof a recycling of incompletely separated areas.


- calculating new optimized process parametersby means of a mathematical model on the basisof the at least one calculated process parameter;and- setting the control element (4) on the basis ofthe calculated process parameters in order toobtain new optimized process parameters.

12. Multi-column chromatography arrangement usablefor a continuous process of purification of biophar-maceuticals, comprising:

a) at least one first separation column (2; 26, 28,30) and one second separation column (2; 26,28, 30), each with at least one input and eachwith at least one output,b) at least one first feed device (8) suitable fortransporting at least one first multi-componentmixture, wherein the at least one first feed device(8) is connected to the at least one input of thefirst separation column (2; 26, 28, 30),c) at least one first discharge device suitable fordischarging a second multi-component mixture,wherein the at least first discharge device is con-nected to the at least one output of the first sep-aration column (2; 26, 28, 30),d) at least one second feed device (8) suitablefor transporting a second multi-component mix-ture, wherein the at least second feed device (8)is connected to at least one input of a secondseparation column (2; 26, 28, 30),e) at least one second discharge device suitablefor discharging a third multi-component mixture,wherein the at least second discharge device isconnected to the at least one output of the sec-ond separation column (2; 26, 28, 30),f) at least one detector (10, 12; 32, 34, 42) fordetecting a multivariate signal, andg) at least one computing unit with at least onedata processing program with at least one che-mometric calculation method,

wherein the at least one first discharge device is con-nected to the at least one second feed device (8);wherein at least one of the first and second feed de-vices (8) and/or at least one of the first and seconddischarge devices have at least one controllable con-trol element (4);wherein the at least one detector (10, 12; 32, 34, 42)is arranged after at least one output; andwherein the at least one detector (10, 12; 32, 34, 42)is coupled to the at least one computing unit; whereinthe at least one computing unit is coupled to the atleast one controllable control element (4) and where-in the at least one computing unit is designed to

- calculate the at least one process parameterbased on the multivariate signal and- control at least one controllable control element(4) based on the at least one process parameter.

13. Multi-column chromatography arrangement accord-ing to claim 12, wherein the computing unit is furtherdesigned to

- compare at least one process parameter withat least one reference parameter;- determine at least one control signal based onthe process parameter and- control the purification process by means of

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controlling the control signal.

14. Multi-column chromatography arrangement accord-ing to claim 12 or 13, wherein the control element(4) is a valve or a pump.

15. Use of a multi-column chromatography arrangementaccording to one of claims 12 to 14, in a continuousprocess of purification of in particular biopharmaceu-ticals, wherein the multi-component mixtures arecomplex mixtures, in particular of cell culture super-natants and/or supernatants of fermentations.

Revendications

1. Procédé de commande d’au moins un agencementde chromatographie multicolonne servant au pro-cessus continu du nettoyage de produits biopharma-ceutiques, présentant :

- la mise en place d’un premier mélange multi-composant dans une colonne (2 ; 26, 28, 30) del’agencement de chromatographie multicolon-ne,- l’acquisition d’au moins un signal multivarié aumoyen d’au moins un détecteur (10, 12 ; 32, 34,42),- le calcul d’au moins un paramètre de proces-sus reposant sur le signal multivarié au moyend’au moins un programme de traitement de don-nées d’une unité de calcul par l’application d’unprocédé chimiométrique et- la régulation du processus de nettoyage par lacommande d’au moins un élément de réglage(4) ajustable sur la base dudit paramètre de pro-cessus au moins.

2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le pro-cédé comprend les autres étapes :

- la comparaison dudit paramètre de processusau moins avec au moins un paramètre de réfé-rence et- la détermination d’au moins un signal de ré-glage sur la base du paramètre de processus etdans lequel le processus de nettoyage est ré-gulé par la commande du signal de réglage.

3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequelledit programme de traitement de données au moinscalcule la concentration d’au moins un composantdudit mélange multicomposant au moins comme pa-ramètre de processus.

4. Procédé selon l’une des revendications 1 à 3, danslequel ledit programme de traitement de données aumoins calcule au moins l’un des paramètres de pro-

cessus suivants :

- valeur de pH,- conductivité,- absorption de l’effluent,- teneur en protéines visée,- concentration de contaminants éluants,- concentration d’un produit,- pureté,- rendement,- cadence de production etdans les spécifications et hors spécifications.

5. Procédé selon l’une des revendications précéden-tes, dans lequel ledit détecteur au moins (10, 12 ;32, 34, 42) est conçu de manière à enregistrer aumoins un signal multivarié, dans lequel le signal mul-tivarié comprend un ou plusieurs des signauxsuivants :

- un signal de spectroscopie UV,- un signal de spectroscopie dans le visible,- un signal de spectroscopie de fluorescence,- un signal de lumière diffuse,- un signal de spectroscopie IR et- un signal de spectroscopie Raman.

6. Procédé selon l’une des revendications précéden-tes, dans lequel le calcul d’au moins un paramètrede processus est exécuté au moyen du programmede traitement de données avec au moins l’un desprocédés chimiométriques suivants : régression parles moindres carrés partiels (partial least squaresrégression = PLS) et/ou calculs au moyen d’un ré-seau neuronal.

7. Procédé selon l’une des revendications précéden-tes, dans lequel le procédé comprend encore :

a) la détermination de la concentration d’un pro-duit dans le mélange multicomposant sur le dis-positif d’alimentation (8) au moyen du détecteur(10, 12 ; 32, 34, 42), lequel est disposé de pré-férence à une sortie d’une colonne (2 ; 26, 28,30),b) le calcul de la masse de produit actuellementchargée sur une colonne (2 ; 26, 28, 30) aumoyen de la concentration de produit évaluéeet d’un débit actuel,c) la comparaison de la masse de produit ac-tuellement chargée avec une valeur de réglageetd) la commande d’au moins un élément de ré-glage (4) ajustable d’après la masse de produitactuellement chargée pour réguler le processusde nettoyage, dans lequel ledit élément de ré-glage (4) ajustable au moins est de préférenceune vanne ou une pompe.

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a) l’évaluation d’un signal multivarié dudit détec-teur au moins (10, 12 ; 32, 34, 42) au moyen deladite unité de calcul au moins, dans lequel ledétecteur (10, 12 ; 32, 34, 42) est disposé à unesortie d’une colonne (2 ; 26, 28, 30), si bien quela concentration des composants dans le mé-lange multicomposant est évaluée sur le dispo-sitif d’évacuation,b) la détermination de la saturation et/ou du pointde claquage de ladite colonne (2 ; 26, 28, 30)au moins au moyen de la concentration de pro-duit évaluée etc) la commande d’au moins un élément de ré-glage (4) pour ajuster le couplage des colonnes(2 ; 26, 28, 30) sur la base de la saturation éva-luée et/ou du point de claquage.


a) la détermination de la concentration d’un oude plusieurs, notamment de tous les compo-sants individuels par l’évaluation d’au moins unsignal multivarié d’au moins un détecteur (10,12 ; 32, 34, 42) au moyen de ladite unité de cal-cul au moins, dans lequel ledit détecteur aumoins (10, 12 ; 32, 34, 42) est disposé entredeux colonnes (2 ; 26, 28, 30),b) le calcul d’une fraction massique d’au moinsun composant,c) la comparaison de la fraction massique éva-luée avec une valeur de réglage au moyen del’unité de calcul etd) la commande d’au moins un élément de ré-glage (4) pour ajuster le couplage des colonnes(2 ; 26, 28, 30) et le fractionnement d’un produitet/ou le rejet de fractions d’après la valeur deréglage.

10. Procédé selon l’une des revendications précéden-tes, dans lequel le procédé comprend encore le con-trôle d’un recyclage de zones incomplètement frac-tionnées.


- le calcul de nouveaux paramètres de proces-sus optimisés au moyen d’un modèle mathéma-tique à l’aide d’au moins un paramètre de pro-cessus calculé ; et- l’ajustage de l’élément de réglage (4) sur labase du paramètre de processus calculé pourobtenir de nouveaux paramètres de processusoptimisés.

12. Agencement de chromatographie multicolonne pou-vant servir à un processus continu du nettoyage deproduits biopharmaceutiques, présentant : :

a) au moins une première colonne de séparation(2 ; 26, 28, 30) et une seconde colonne de sé-paration (2 ; 26, 28, 30) dotées chacune d’aumoins une entrée et chacune d’au moins unesortie,b) au moins un premier dispositif d’alimentation(8), lequel se prête à l’acheminement d’au moinsun premier mélange multicomposant, dans le-quel le premier dispositif d’alimentation (8) aumoins est relié à ladite entrée au moins de lapremière colonne de séparation (2 ; 26, 28, 30),c) au moins un premier dispositif d’évacuation,lequel se prête à la vidange d’un deuxième mé-lange multicomposant, dans lequel le premierdispositif d’évacuation au moins est relié à laditesortie au moins de la première colonne de sé-paration (2 ; 26, 28, 30),d) au moins un second dispositif d’alimentation(8), lequel se prête à l’acheminement d’au moinsun deuxième mélange multicomposant, dans le-quel le second dispositif d’alimentation (8) aumoins est relié à ladite entrée au moins d’uneseconde colonne de séparation (2 ; 26, 28, 30),e) au moins un second dispositif d’évacuation,lequel se prête à la vidange d’un troisième mé-lange multicomposant, dans lequel le seconddispositif d’évacuation au moins est relié à laditesortie au moins de la seconde colonne de sé-paration (2 ; 26, 28, 30),f) au moins un détecteur (10, 12 ; 32, 34, 42)servant à déceler un signal multivarié,g) au moins une unité de calcul dotée d’au moinsun programme de traitement de données avecau moins un procédé de calcul chimiométrique,

dans lequel ledit premier dispositif d’évacuation aumoins est relié au second dispositif d’alimentation(8) au moins,dans lequel au moins l’un des premier et seconddispositifs d’alimentation (8) et/ou l’un des premieret second dispositifs d’évacuation présentent aumoins un élément de réglage (4) ajustable ou com-mandable,dans lequel ledit détecteur (10, 12 ; 32, 34, 42) aumoins est disposé en aval d’une sortie, etdans lequel ledit détecteur (10, 12 ; 32, 34, 42) aumoins est connecté à ladite unité de calcul au moins ;dans lequel ladite unité de calcul au moins est con-nectée audit élément de réglage (4) ajustable oucommandable et dans lequel ladite unité de calculau moins est conçue de manière à

- calculer au moins un paramètre de processusreposant sur le signal multivarié et à

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- commander au moins un élément de réglage(4) ajustable sur la base dudit paramètre de pro-cessus au moins.

13. Agencement de chromatographie multicolonne se-lon la revendication 12, dans lequel l’unité de calculest encore conçue de manière à

- comparer au moins un paramètre de processusà un paramètre de référence au moins, à- déterminer au moins un signal de réglage surla base du paramètre de processus et à- réguler le processus de nettoyage par la com-mande du signal de réglage.

14. Agencement de chromatographie multicolonne se-lon la revendication 12 ou 13, dans lequel l’élémentde réglage (4) est une vanne ou une pompe.

15. Application de l’agencement de chromatographiemulticolonne selon l’une des revendications 12 à 14,dans un processus continu du nettoyage notammentde produits biopharmaceutiques, dans lequel lesmélanges multicomposant sont des mélanges com-plexes, en particulier des surnageants de culture cel-lulaire et/ou des surnageants de fermentations.

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IN DER BESCHREIBUNG AUFGEFÜHRTE DOKUMENTE

Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde ausschließlich zur Information des Lesers aufgenommenund ist nicht Bestandteil des europäischen Patentdokumentes. Sie wurde mit größter Sorgfalt zusammengestellt; dasEPA übernimmt jedoch keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.

In der Beschreibung aufgeführte Patentdokumente

• WO 2014154331 A1 [0001]• WO 2010151214 A1 [0002]• WO 0045929 A1 [0004]

• WO 2004106915 A1 [0007]• DE 102010047427 A1 [0008]

In der Beschreibung aufgeführte Nicht-Patentliteratur

• SANTIAGO A. BORTOLATO et al. Chemometricprocessing of second-order liquid chromatographicdata with UV-vis and fluorescence detection. A com-parison of multivariate curve resolution and parallelfactor analysis 2. Analytica Chimica Acta, 2014, vol.842, ISSN 0003-2670, 11-19, ht-tp://dx.doi.org/10.1016/j.aca.2014.07.007 [0005]

• S. GARCÍA-MARTÍN et al. Solidphase microextrac-tion gas chromatography-mass spectrometry(HS-SPME-GC-MS) determination of volatile com-pounds in spirits: Multivariate chemometric charac-terisation. Food Chemistry, 2010, vol. 118 (2), ISSN0308-8146, 456-461, ht-tp://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2009.04.105[0006]

(19) TZZ¥ ¥Z¥ T€¦ · Erst in Offline-Analysen wer-den zentrale Prozessparameter,...

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