This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

VIRUS UND ENZYMATISCHE EIGENSCHAFTEN 781

Virus und enzymatische EigenschaftenÜ ber ein A denosind iph osp hat sp alten d es E n zym und seine A ssoziation m it dem Influenza-V irus

Von O l a f K l a m e r t h

Aus dem Institut für Virusforschung Heidelberg (Z. Naturforschg. 16 b, 781—785 [1961]; eingegangen am 3. August 1961)

Associated with the virus of influenza group B is an adenosine diphosphate splitting enzyme(ADPase), which presumably is located in the normal component of the virus particle. As regardsits characteristics, this ADPase corresponds to the enzyme contained in the allantois fluid of non­infected eggs. The effectiveness of both is destroyed by ether or butanol treatment.

Im Verlaufe unserer Untersuchungen von Gewe­ben auf ihren Gehalt an Polynucleotidphosphorylase vor und zu verschiedenen Stadien nach Beimpfung des Gewebes mit Influenza-Virus, beobachteten wir, daß den Zellen bzw. der Kultur zugesetztes ADP unmittelbar nach der Infektion mit massiven Virus­dosen unter Bildung von AMP verschwindet. Das Ausmaß dieses ADP-Schwundes war beträchtlich höher als in den nicht infizierten Kontrollen.

Da die gesteigerte Spaltung noch innerhalb der Eklipse d. h. vor der Bildung neuer Virusgeneratio­nen eintrat, war anzunehmen, daß dafür eine mit dem Impfvorgang unmittelbar verknüpfte Reaktion verantwortlich ist. Es könnte sich dabei um eine durch den Eintritt der Viren in die Zelle hervor­gerufene Aktivierung zelleigener Fermente oder um die Blockierung eines Fermenthemmers handeln. Es kann aber auch dem Virus selbst enzymatische Akti­vität zukommen. Wir haben diese Hypothese weiter verfolgt und festgestellt, daß die Viruspartikel die Fähigkeit zur enzymatischen Spaltung von ADP besitzen.

Material und M ethoden

Die Versuche wurden mit dem Influenza-Stamm B- Crawley (Rundform) (Hygiene-Institut d. Univ. Heidel­berg) sowie dem Stamm N-WS-F „Kilbourne“ (Istituto Superiore di Sanitä Roma)*, einer filamentösen Form des Influenza-Virus, durchgeführt. Die Viruskonzentrate wurden aus der Allantoisflüssigkeit 11-tägiger bebrüte­ter und befruchteter Hühnereier, die mit etwa 101 bis 102 ID50 infiziert waren, meist durch einen zweimaligen Adsorptions-Elutions-Zyklus an mehrfach gewaschenen Hühnererythrozyten (mit RDE-Zusatz bei der Elution)

* Für die Überlassung des Virusstammes möchte ich auch an dieser Stelle Herrn Professor B a b u d i e r i (Rom) herzlich danken.

1 H. J. F . C a i r n s u . S. F a z e k a s d e St. G r o t h , Immunology 78, 191 [1957].

und nachfolgendes mehrmaliges hoch- und niedertouri- ges Zentrifugieren der Anreicherung gewonnen. Schließ­lich wurde in TRIS-NaCl-Puffer pH 7,2 aufgenommen.

Die Bestimmung des Hämagglutinations-Titers er­folgt in üblicher Weise, die ID50 wurde nach der Me­thode von F a z e k a s 1 im „on shell“-Test durchgeführt **.

Zur Gewinnung gewebseigener ADPase wurde die Allantoisflüssigkeit 13-tägiger befruchteter und bebrü­teter, aber nicht infizierter Hühnereier, verwendet. Durch zweimaliges hochtouriges Zentrifugieren (78 000 g bzw. 50 000 g 1 Stde.) des gegen 0,05-m. TRIS-Puffer ph 7 dialysierten 5000-g-Überstandes erhielt man ein gelati­nöses Sediment, welches nach Aufnehmen in Puffer und nochmaligem niedertourigem Zentrifugieren als Enzym­quelle diente. Protein wurde nach L o w r y 2, anorg. Phos­phat bzw. säurelabiler Phosphor nach M a r s h 3 ermittelt.

Die ADPase-Aktivität wurde mit einem ADP-Präpa- rat (Fa. Sigma bzw. Böhringer) ca. 3 — 4% AMP ent­haltend, bei pn 8,2 (in einigen Fällen bei pH 7,4) be­stimmt. Vgl. dazu die Angaben in den Legenden zu den Tabellen.

Die Auftrennung der säurelöslichen Nucleotide er­folgte papierchromatographisch im Buttersäure/NH3/W- System. Zur Bestimmung wurden die Nucleotid-Flecken nach dem Photoprint-Verfahren lokalisiert und nach dem Ausschneiden mit 0,02-n. Salzsäure eluiert. Durch Extinktions-Messung der Eluate bei 260 m/u gegen einen gleichbehandelten Papier-Blindwert wurden die gebildeten Adenosin-Nucleotide quantitativ bestimmt (£amp/2öo = 15 000).

In der neueren Literatur wurde dem Influenza- Virus des öfteren Phosphatase-Wirkung zugeschrie­ben, obwohl sich bei Überprüfung der Ergebnisse herausgestellt hat, daß diese Fermentwirkung auf einer Verunreinigung durch beigemengte Zellpartikel beruht und nicht eine dem Virus inhärente Eigen­schaft ist. Immerhin haben wir, um einem solchen Einwand zu begegnen, die Virus-Präparationen be-

** Zum Vergleich mit der üblichen „Ganz-Ei“-Methode mußte ein Korrektur-Faktor angebracht werden.

2 O. H. L o w r y , N. I. R o s e n b r o u g h , A. L . F a h r u . R . I. R a n ­d a l l , J. biol. Chemistry 193, 1 [1951].

3 B. B. M a r s h , Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 32, 357 [1959].

782 0 . KLAMERTH

sonders sorgfältig gereinigt, indem wir der mehr­fach hoch- und niedertourigen Zentrifugation einen zweimaligen Adsorptions- und Elutions-Zyklus voran­gehen ließen.

Dieses hoch- und niedertourige Zentrifugieren wurde solange fortgesetzt, bis das Verhältnis von Proteinwert und Infektiosität konstant blieb. Dies war gewöhnlich nach zwei- bis dreimaligem Ultra­zentrifugieren (40 000 g 30 Min.) erreicht. Das bei der Ultrazentrifugation erhaltene Sediment wurde vermittels eines kleinen Teflon-Homogeni- sators in TRIS-Kochsalz-Puffer rehomogenisiert und 10 Min. bei 2500 g zentrifugiert. Der nun­mehr erhaltene leicht opalisierende Uberstand diente als Enzymquelle. Daß wir durch diese Operatio­nen tatsächlich nicht nur Ballast-Protein entfernen konnten, sondern auch enzymatisch wirksames Ma­terial, ist aus der Tab. 1 ersichtlich. Vor der 1. Ultra­zentrifugation besitzt das Präparat noch beträchtliche ADP-Kinase sowie geringe Ribonucleotidphospory- lase-Aktivität (letztere ist in der graphischen Darst. nicht aufgenommen), während das zweimal zentri­fugierte V irus-Präparat keine dieser Enzymaktivi­täten mehr aufweist, obwohl die ADPase-Wirkung voll erhalten ist. Es muß betont werden, daß wir in den gereinigten Präparaten keine Phosphatase-Wir­kung mit 5-AMP bzw. ,/?-Glycerophosphat als Sub­strat feststellen konnten.

Die Fehlergrenze dieser Methode liegt bei weniger als 3 Prozent. Sie ist immerhin zeitraubend und zum

Tab. 1. Einwirkung von Virus B-Crawley Präparationen ver­schiedenen Reinheitsgrades auf ADP. Das Reaktionsgemisch enthielt in 1.25 m l: 200 /tM ole TRIS/HC1 (pn 8,2), 0,25 ,mMo1 EDTA, 2,5 //M ole MgCl2 , 5,0 ,«Mole ADP und eine 250 ,ug Protein entsprechende Menge an Virus. Beendigung der Reak­tion nach 60 Min. bei 37° durch Zusatz von 1,0 ml eiskalter, 0,9-n. HC104 . Nach Stehen bei 0°, Versetzen des 1500-g-Uber- standes mit 1,0 ml 10-proz. inakt. Norit. Nach Entfernen der nicht adsorbierten Salze durch Waschen wurden die Nucleotide aus dem Norit-Sediment mit 50-proz. Äthanol (z. UV-Spektro- skopie) pH 10 (durch NH4OH) quantitativ eluiert und ehro-

m atographiert.

Zweck der ADPase-Bestimmung allein genügt die Erfassung des abgespaltenen anorganischen Phos­phats vollauf, insbesondere da wir festgestellt haben, daß neben ADPase keine anderen Nucleotidasen, z. B. AMP-Nucleotidase, in nennenswerter Menge vorliegen. Wir haben daher in den folgenden Experi-

Influenza B-Crawley

P räp ara tionP ro te in

e in ­gesetzt

abge­spaltene pg A t Pi

spez. A k tiv itä t

(pg A t P i/? Prot-)

niedertourig zentri- 1. fugiertes E ry th ro cy t.- 2. E lu a t

300600

0,1270,365

4360

2m al adsorbiert 2m alU Z ID 50/H A = 5 ,6

432 0,330 76

2m al adsorbiert 3m al UZ ID 50/H A = 6 ,2

250 0,235 94

4m al UZ ID 50/H A = 6 ,8 110 0.119 108

Influenza N -W S-F K ilbourne

A llantoisflüssigkeit 700 0,157 22

2m al adsobiert 5m alU Z ID 50/H A = 5 ,0

190 0,520 268

Tab.2. Spez. Aktivität der ADPase in Viruspräparationen ver­schiedenen Reinheitsgrades. Der Reaktionsansatz enthielt in 0,65 ml: 5 //Mole MgCl2, 0,5 //M ol EDTA, 50 //M ole TRIS PH 8,2, 2,5 //M ole ADP sowie die dem angegebenen Protein­wert entsprechende Virusmenge. Die 4- bzw. 5-mal ultrazentri­fugierten V iruspräparate entstammten gewaschenen 80 000-g- (18.5 pi) Sedimenten, welche nach dem W iederauf nehmen im Puffer und niedertourigem Abschleudern (2000 g ) 30 Min. bei 30 000 g (6,9 pi) und 26 500 g (6,1 pi) sedimentiert wor­den waren. Die angegebenen ID50/HA Quotienten sind nach

F a z e k a s bestimmte, korrigierte Werte.

Abb. 1. pn-Abhängigkeit von Virus ADPase ( • ) sowie ADPase unbeim pfter Eier (Allantoisflüssigkeit) (o ).

VIRUS UND ENZYMATISCHE EIGENSCHAFTEN 783

menten nur die Bestimmung des anorganischen Phosphats vorgenommen (Tab. 2 ).

Die Abb. 1 zeigt die pn-Abhängigkeit des Virus- Ferment-Assoziates. Es ist die übliche Kurve mit einem deutlichen Maximum bei pn 8,2.

Die Bestimmung der M i c h a e l i s - Konstanten ergab 3,1 — 3,3 • 10-4 Mol ADP//. Fast dieselben Werte wurden für das aus der Allantoisflüssigkeit unbeimpfter Eier gewonnene ADPase-Konzentrat erhalten (XM = 3,5 • IO“ 4 Mol ADP//) (Abb. 2 ).

Abb. 2. Bestimmung der M i c h a e l i s - K onstanten: □ = ADPase in der Allantoisflüssigkeit unbeim pfter E ier (2000 g Uberstand des homogenisierten 50 000-g-Sedimentes), x =

ADPase im Virus B-Crawley-Ultrazentrifugat (4-mal U Z ).

Um einen Einblick zu gewinnen, wo die Enzym- Aktivität lokalisiert sein könnte, haben wir eine Spaltung des Virus mit peroxyd-freiem Äther nach H e n l e 4 vorgenommen. Dabei zeigte sich jedoch, daß die Wirkung der ADPase fast vollkommen verloren ging. Im löslichen Antigen-Anteil konnten wir nur eine ganz geringe Rest-Aktivität nachweisen; der das Hämagglutinin enthaltenden Fraktion fehlte jegliche ADPase-Wirkung.

Wir haben auch die Behandlung mit Butanol ver­sucht, von der bekannt ist, daß sie bei vielen Lipo- proteiden ohne Denaturierung zum Ziel führt.

Leider büßt unter den angewandten Bedingungen (wasser-gesättigtes Butanol bei 0°, 1/2 Stde. Rühren) die ADPase ihre Aktivität ein. Modellversuche mit zelleigenen ADPase-Anreicherungen haben ebenfalls zu völliger Inaktivität geführt.

Auch auf andere Weise ist es uns nicht gelungen, die ADPase-Wirkung vom Virus zu trennen. Ein

4 F. S. L i e f u . W. H e n l e , Virology 2, 7 7 2 [ 1 9 5 6 ] .

Versuch, Virusanreicherungen an Hydroxylapatit- Säulen chromatographisch zu trennen, lieferte unter großen Verlusten bei der Elution wieder mit ADPase-vergesellschaftete Viren. Durch fraktionier­tes Ultrazentrifugieren ließ sich eine Trennung der Aktivität vom Virus ebenfalls nicht erzielen.

Bei der Einwirkung tryptischer Fermente verhält sich die virus-gebundene ADPase ähnlich der unge­bundenen aus unbeimpfter Allantoisflüssigkeit. Nach1-stdg. Einwirkung von Subtilisin bei 37° und Ph 8,2 gehen ca. 70% der ADPase-Aktivität ver­loren (vgl. Abb. 3 ). Bemerkenswert ist die deutlich größere Resistenz gegen dieses tryptische Ferment als sie bei ADPase-Anreicherungen in Extrakten von B. coli zu beobachten ist, in denen 1-stdg. Sub- tilisinbehandlung schon bei pn 7,2 — 7,4 zu völligem Verlust der Aktivität führt. Von der Verwendung von Trypsin haben wir Abstand genommen, da auch die reinsten kristallisierten Präparate starke RNAse- W irkung aufweisen und durch die abgespaltenen Obligonucleotide die Ergebnisse verfälscht werden.

■IO'3 -IO'2

Abb. 3. Einwirkung von Subtilisin auf Influenzavirus-Konzen- trat (mehrfach differentialzentrifugiertes 26 500-g-Sediment) und ADPase-Anreicherung (50 000-g-Sediment dialysierter Allantoisflüssigkeit) aus unbeimpften Eiern. • = Viruskon­zentrat vor Subtilisinbehandlung (linke O rdinate), 0 = Virus­konzentrat nach Subtilisinbehandlung, ■ = ADPase-Anreiche­rung vor Subtilisinbehandlung (rechte O rdinate), A = AD P­

ase-Anreicherung nach Subtilisinbehandlung.

Den Einwand, es handele sich bei der beobachte­ten Adenosindiphosphatase-Eigenschaft der Influ­enza-Viren um eine bloße Adsorption wirts-eigener Fermente, die erst nach Austritt des Virus aus der Zelle an der Virusoberfläche adsorbiert sind, glau­ben wir durch folgenden Versuch widerlegen zu können:

Gleiche Volummengen an entsprechend vorgerei­nigtem Viruskonzentrat wurden mit ADPase-An­reicherung vereinigt und das Gemisch nach etwa 20 Min. Stehen bei Zimmertemperatur mit einer be­stimmten Menge mehrmals gewaschener Hühner-

784 0 . KLAMERTH

erythrozyten versetzt. Nach 1/ 2-stdg. Stehen bei 0° wurden die Erythrozyten niedertourig abzentrifu­giert und die im Überstand verbliebene ADPase- Aktivität gemessen.

Influenza B-Crawley N -W S-F K ilbournelog ID 50/H A = 6 ,8* log ID 50/H A = 5 *

[JL At. P i freigesetztVirus 0,174 0,396A D Pase 0,305 0,390

V irus + A D Pase +E ry th ro zy ten 0,318 0,340ohne A D Pase 0,011 0,000ohne Virus 0,335 0,345

Tab. 3.ADPase-Aktivität vor und nach Inkubation mit Erythrocyten. Der Ansatz enthält alternativ: 0,4 ml Virus Konzentrat, entspr. 400y bzw. 145y Protein, 0,1 ml ADPase-Anr icherung (3,3 y Protein) bzw. NaCl-Puffer (0,135-m. NaCl/0,02-m. TRIS ph 7,2) sowie 1,0 ml gewaschene 50% in Puffer auf geschwemmte Erythrozyten. Nach 30 Min. Stehen bei 0° wurde die ADPase- Aktivität im 700-g-Erythrozytenüberstand gegen einen ent­sprechenden Leer- bzw. Kontrollwert gemessen. Der Reak­tionsansatz enthält in 1.35 ml: 2,5 aM ole ADP, 5,0 wMole MgCl, 0,5 jUMol EDTA, 50 /^Mole TRIS/HC1 ph 8,2. * ID50

Bestimmung nach F a z e k a s , korrigiert.

Wie aus der Tab. 3 ersichtlich, enthält der Über­stand nur die ADPase-Aktivität der unbeimpften Allantoisflüssigkeit, während die Enzym-Aktivität der Viren fast 100-proz. im Erythrozyten-Sediment verbleibt.

Diskussion der Ergebnisse

Die vorliegenden Untersuchungen haben gezeigt, daß den untersuchten Formen des Influenza-Virus (Rund- und Fadenform) im Prinzip die gleiche, wenn auch quantitativ etwas unterschiedliche Fer­mentwirkung einer ADPase zukommt, die auch nach weitgehender Reinigungsoperation nicht von den infektiösen Partikeln zu trennen ist. Die von man­chen anderen beobachtete Phosphatase-Aktivität konnte hingegen von uns nicht gefunden werden. Auch aus dem Adsorptionsversuch an Erythrozyten geht hervor, daß das Virus sich zumindest mit dem spaltenden Enzym in inniger Vergesellschaftung be­findet und mit den angewandten Methoden nicht da­von getrennt werden kann.

* J. W. B e a r d u . Mitarb., in : Biochemistry of Virus, S. liOß, VII. Symposium of the Fourth Internat. Congress of Bio­chemistry, Vienna 1958. Pergamon Press, London 1959.

6 J. R im a n u . B. T h o r e l l , Biochim. biophysica Acta [Amster­dam] 40, 565 [I960].

Der Adsorptionsversuch an Erythrozyten mit und ohne Zusatz zelleigener ADPase-Anreicherung, der mit beiden Virusarten mit gleichem Ergebnis an­gestellt wurde, zeigt ein unterschiedliches Verhalten der beiden, die ADPase-Wirkung tragenden Teil­chen. Ohne die Gegenwart von Virus besteht keine Adsorptions-Tendenz der „freien“ ADPase an Ery­throzyten. Andererseits nehmen Viren keine ADPase- Aktivität aus zugesetztem ADPase-wirksamen Ma­terial auf. Diese Tatsachen lassen, wenn auch nicht den zwingenden Schluß, so doch die Wahrscheinlich­keit zu, daß das Influenza-Virus mit dem Enzym ADPase gesättigt ist und keine weiteren Haftstellen in der Lipidhülle zur Verfügung stehen. Eine plan­lose Haftung am Virus scheint uns demnach nicht wahrscheinlich, vielmehr sind wir der Ansicht, daß die Assoziation des Influenza-Virus mit dem Enzym bereits intrazellulär und selektiv im Verlauf der Montage des inkompletten zum kompletten Virus vor sich geht. Ein Grund zur Selektion für das Fer­ment ADPase wäre sonst nicht gegeben, da Allantois- membranzellen und Allantoisflüssigkeit reich an einer ganzen Reihe anderer Enzyme sind, von denen keines im genügend gereinigten Virus gefunden wird.

Außer den von uns erhobenen Befunden über die Assoziation der ADPase mit dem Influenza-Virus wurde eine solche virus-verbundene enzymatische Wirksamkeit eigentlich nur vom ebenfalls dem RNA-Typ angehörigen Virus der Hühnermyelo- blastosis (fowl leukemia virus) berichtet5. Neben den genannten Enzymen soll diesem Tumorvirus noch Myokinase- und Ribonucleotidphosphorylase- Eigenschaft zukommen 6. Besonders letztere hätte bei der Tumorgenese eine wichtige Funktion zu erfüllen.

Es ist naheliegend, unsere Ergebnisse mit den von R o tt und S c h ä f e r 7 publizierten zu vergleichen, nach denen die gefundene Enzymaktivität (Glucose- 6-Phosphatase) der zellgebundenen Hämagglutinine (ZGHA) infizierter Membranen die Annahme von der mikrosomalen Abkunft dieser Partikel zu be­stätigen scheint.

Die von obigen Autoren aus Eiflüssigkeit isolier­ten infektiösen Partikel besaßen diese enzymatische Wirksamkeit jedoch nicht. Audi den sogenannten

7 R . R o t t u . W. S c h ä f e r , Z. Naturforschg. 16 b, 310 [1961];vgl. auch W. S c h ä f e r , W. Z i l l i g u . K. M u n k , Z . N atur­forschg. 9 b, 329 [1954].

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inkompletten Formen nach M a g n u s fehlte sie völlig.

Da wir ausschließlich infizierte Allantoisflüssig- keit und nicht Chorioallantois-Membranen als Aus­gangsmaterial verwendeten, in denen ZGHA nach den Beobachtungen von S c h ä f e r u . Mitarb. nicht auftritt, scheint in unserem Fall eine Vergesellschaf­tung von infektiösen Teilchen mit solchen Viromikro- somen zumindest nicht wahrscheinlich. Trotzdem haben wir in einigen Fällen (vgl. Tab. 2) eine frak­tionierte Ultrazentrifugation zwischen pi 7,5 u. pi 18,5, welche eine Trennung von infektiösen Teil­chen ( S 600 —700) von solchen mit einem S-Wert um 250 (ZGHA) ermöglicht hätte, vorgenommen, wobei die ADPase-Aktivität voll im pi 7,5-Sediment erhalten blieb. Das auf den ersten Blick niedrig er­scheinende Verhältnis ID50/HA 3,8 —4,8 der bei pi 7,5 sedimentierenden Partikel erklärt sich durch die angewandte Methodik der ID50-Bestimmung „on shell“ nach F a z e k a s. Die danach gefundenen Werte liegen etwa 2-Zehnerpotenzen unter denen der sonst gebräuchlichen „Ganz-Ei“-Methode, sind aber sehr gut reproduzierbar*. Bei dem eingehaltenen

* Die in der Tabelle angeführten Zahlen sind bereits korri­gierte Werte.

Infektionsmodus waren auch „inkomplette Formen“ nach M a g n u s nicht zu erwarten.

Die von uns festgestellte ADPase ist wahrschein­lich in der Normalkomponente lokalisiert, die in der Außenschicht des Virus enthalten ist. S c h ä f e r (P ri­vatmitteilung) ** hat schon vor längerer Zeit fest­gestellt, daß die Normal-Komponente beim KP-Virus durch Adsorption/Elution und mehrfaches Waschen in der Ultrazentrifuge nicht zu entfernen ist. In der durch Ätherbehandlung erhaltenen Hämagglutinin- Fraktion sind nur noch Spuren davon vorhanden. Serologisch stimmt diese Normal-Komponente der Viruspartikel mit dem aus normaler Eiflüssigkeit isolierten Material überein. Nach S c h ä f e r hat die Normal-Komponente zusammen mit den aus der Wirtszelle stammenden Lipiden die Funktion eines Bindemittels zwischen g-Antigen und Hämagglutinin des Virusteilchens; ob man sie zum eigentlichen Virusmaterial rechnet, ist eine Frage der Definition.

Herrn Professor S c h ä f e r , Tübingen, danke ich herz­lich für die Lektüre des Manuskripts und kritische Deutung. Fräulein S . R i c h t e r hat mich in dankens­werter Weise bei der Durchführung der Versuche unter­stützt.

** Vgl. auch W. S c h ä f e r , W. Z i l l i g u . K. M u n k , 1. c. 7.