5 - Nucleotide und Nucleinsäuren

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5 Nucleotide und Nucleinsäuren Matthias Montenarh, Georg Löffler

5.1 Nucleoside und Nucleotide – 1425.1.1 Aufbau von Nucleosiden und Nucleotiden – 1425.1.2 Funktionen von Nucleosiden und Nucleotiden – 144

5.2 Zusammensetzung und Primärstruktur der Nucleinsäuren – 146

5.3 Aufbau der DNA – 1475.3.1 Die DNA-Doppelhelix – 1475.3.2 Topologie der DNA – 1495.3.3 Die Struktur des Chromatins – 1525.3.4 Aufbau und Funktion der Chromosomen – 154

5.4 DNA als Trägerin der Erbinformation – 1585.4.1 Die Erhaltung und Realisierung der in der DNA gespeicherten

Information – 1585.4.2 Aufbau von Genomen – 1595.4.3 Das humane Genom – 159

5.5 Struktur und biologische Bedeutung der RNA – 162

5.6 Chemische und physikalische Eigenschaften von Nucleinsäuren – 165

5.6.1 Reinigung und Charakterisierung von Nucleinsäuren – 1655.6.2 Sequenzierung von DNA – 170

Literatur – 172

142

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Kapitel 5 · Nucleotide und Nucleinsäuren

>> Einleitung

Mononucleotide sind Verbindungen aus einer heterozyklischen Base, Ribose und Phosphat. In Form ihrer Triphosphate stellen sie eine universelle Form von Energie dar. Die Triphosphate sind zudem Phosphatdonoren und damit Aktivatoren oder Inakti-vatoren vieler enzymatischer Reaktionen. Nucleotide sind Bestandteile von Coenzymen und an der Wirkung einiger Hormone und Signalsubstanzen beteiligt. Außerdem nehmen sie an der Biosynthese von Proteinen, Kohlenhydraten oder Lipiden teil.

Nucleinsäuren wie DNA und RNA sind polymere Verbindungen, die aus Nucleotiden aufgebaut werden. Sie sind Träger der genetischen Information. Bei Eukaryoten ist die DNA im Zellkern enthalten, wo sie zusammen mit den Histonproteinen den wesentlichen Teil des Chromatins ausmacht. RNA spielt eine entscheidende Rolle bei der Proteinbiosynthese. Sie ist Baustein der Ribosomen, Trägerin von aktivierten Aminosäuren und dient als Matrize.

5.1 Nucleoside und Nucleotide

5.1.1 Aufbau von Nucleosiden und Nucleotiden

! Nucleotide bestehen aus einer heterozyklischen Base, einer Pentose und Phosphatresten.

Wie aus . Abb. 5.1 hervorgeht, sind Nucleotide aus drei verschiedenen Komponenten aufgebaut:4 einer stickstoffhaltigen, heterozyklischen Base, deren

chemische Struktur einem Purin- oder Pyrimidinderi-vat entspricht

4 einer Pentose, entweder Ribose oder Desoxyribose und

4 einem oder mehreren Phosphatresten

Fehlen die Phosphatreste, so handelt es sich um Nucleo-side.

! Nucleoside und Nucleotide enthalten Purin- oder Pyri-midinbasen.

Die häufigsten in Nucleotiden und Nucleosiden vorkom-menden Purinbasen sind Adenin (A) und Guanin (G), die häufigsten Pyrimidinbasen Cytosin (C), Thymin (T) und Uracil (U) (. Abb. 5.2a,b).

Oxypurine und Oxypyrimidine zeigen das Phänomen der Keto-Enol-Tautomerie, wie in . Abb. 5.3 am Bei-spiel des Thymins dargestellt ist. Das Gleichgewicht liegt dabei stark auf der Seite der Ketoform. Für die korrekte Infor mationsübertragung bei Replikation und Trans-kription (7 Kap. 7.2, 8) muss die Ketoform vorliegen, da durch die Enolform Fehlablesungen zustande kommen können.

Nucleotide sind besser wasserlöslich als Nucleoside und diese wiederum besser als die freien Basen. Nucleotide können durch verschiedene Techniken wie Dünnschicht-chromatographie, Elektrophorese oder Ionenaustausch-chromatographie von einander getrennt werden. Purin- und Pyrimidinbasen zeigen eine starke UV-Absorption mit einem Absorptionsmaximum bei 260 nm.

Da auch die Nucleinsäuren (DNA und RNA, 7 u.) aus Nucleotiden zusammengesetzt sind, enthalten sie ebenfalls

. Abb. 5.1. Aufbau von Nucleosiden und Nucleotiden

. Abb. 5.2. Strukturformeln häufiger Purin- und Pyrimidinbasen. oben Die Purinbasen Adenin und Guanin; unten die Pyrimidinbasen Cytosin, Thymin und Uracil

. Abb. 5.3. Keto-Enol Tautomerie von Thymin

Purin- und Pyrimidinbasen. Dabei ist allerdings zu be-achten, dass4 Thymin hauptsächlich in der DNA4 Uracil hauptsächlich in der RNA vorkommt, während4 Cytosin, Adenin und Guanin Bestandteile sowohl der

DNA als auch der RNA sind

5.1 · Nucleoside und Nucleotide5143

In ribosomalen RNAs und in Transfer-RNAs kommen weitere, häufig methylierte Purin- und Pyrimidinbasen vor. Dabei erfolgt die Methylierung erst nach Einbau der Basen in die Nucleinsäuren.

! Ribose oder Desoxyribose sind die in Nucleosiden und Nucleotiden vorkommenden Pentosen.

Als Zuckerbestandteil finden sich in Mono- bzw. Poly-nucleotiden sowie in Nucleosiden ausschließlich die Pen-tosen d-Ribose bzw. die am C-Atom 2 reduzierte Pentose 2-Desoxy-d-Ribose (. Abb. 5.4). Dem entsprechend wer-den Nucleoside in Ribo- bzw. Desoxyribonucleoside und Nucleotide in Ribo- bzw. Desoxyribonucleotide eingeteilt. Da Nucleinsäuren Polymere aus Nucleotiden sind, werden sie auch als Polynucleotide bezeichnet:4 Für eine aus Ribonucleotiden bestehende Nucleinsäure

wird die Bezeichnung Polyribonucleotid oder Ribo-nucleinsäure (RNA, ribonucleic acid) verwendet

4 für eine aus Desoxyribonucleotiden bestehende Nu-cleinsäure die Bezeichnung Polydesoxyribonucleotid oder Desoxyribonucleinsäure (DNA, deoxyribonucleic acid)

Wichtig ist, dass in einem Polynucleotid niemals Ribose und Desoxyribose als Zucker nebeneinander vorkommen.

! In Nucleotiden und Nucleosiden ist die Base durch eine N-glycosidische Bindung mit der Pentose verknüpft.

Zwischen dem halbacetalischen C-Atom 1 einer Pentose (Ribose bzw. Desoxyribose) und dem jeweiligen N-Atom der Base liegt die für Nucleoside und Nucleotide typische N-glycosidische C-N-Bindung. Im Allgemeinen binden die Purinbasen über das N-Atom 9 an das C-1 -Atom des Zuckers, die Pyrimidinbasen über das N-Atom 1 an das C-Atom 1 der Ribose. Eine Ausnahme bildet Pseudouri-din (Ψ). Bei ihm ist die Ribose mit dem C-Atom 5 von Uracil verbunden, wobei statt einer C-N-Bindung eine C-C-Bindung entsteht (. Abb. 5.5).

! Die Benennung der Nucleoside leitet sich von den jeweiligen Basenbestandteilen ab.

Wie aus . Tabelle 5.1 hervorgeht, wird bei Pyrimidinbasen meist die Endung -idin, bei Purinbasen die Endung -osin angehängt.

! Nucleotide sind die Phosphatester von Nucleosiden.

Durch Veresterung einer Hydroxylgruppe der Pentose ei-nes Nucleosids mit Phosphat entsteht aus einem Nucleosid ein Nucleotid (. Abb. 5.1). Die Veresterung erfolgt dabei in der Regel am C-Atom 5 der Pentose, seltener am C-Atom 3 . . Tabelle 5.2 zeigt am Beispiel der Adeninnucleotide die übliche Nomenklatur. In analoger Weise erfolgt die Benen-nung der Guanin-, Cytosin-, Uracil- und Thyminnucleo-tide. Ein Adeninnucleotid wird demnach als Adenosin-5 -Monophosphat bezeichnet, wenn der Phosphorsäurerest am C-Atom 5 der Ribose sitzt. Wenn Desoxyribose die

* Zur eindeutigen Unterscheidung der Atome in Nucleotiden und Nucleosiden werden diejenigen der heterocyclischen Basen ohne Apostroph, diejenigen der Pentose mit einem Apostroph markiert.

. Abb. 5.4. Ribose und Desoxyribose

. Abb. 5.5. Pseudouridin

. Tabelle 5.1. Nomenklatur der Nucleoside

Base Abkür-zung

Pentose Nucleosid Abkür-zung

Cytosin Cyt RiboseDesoxyribose

CytidinDesoxycytidin

CdC

Thymin Thy RiboseDesoxyribose

ThymidinDesoxythymidin

TdT

Uracil Ura RiboseDesoxyribose

UridinDesoxyuridin

UdU

Adenin Ade RiboseDesoxyribose

AdenosinDesoxyadenosin

AdA

Guanin Gua RiboseDesoxyribose

GuanosinDesoxyguanosin

GdG

Hypo-xanthin

Hyp RiboseDesoxyribose

InosinDesoxyinosin

IdI

Xanthin Xan RiboseDesoxyribose

XanthosinDesoxyxanthosin

XdX

144

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Pentose im Adeninnucleotid ist, wird es als Desoxyadeno-sin-5 -Monophosphat bezeichnet. Meist wird eine abge-kürzte Schreibweise für die Nucleotide verwendet, wobei die Buchstaben A, G, C, T oder U zur Benennung des je-weiligen Nucleosids verwendet werden. Das Präfix d muss angefügt werden, wenn die Desoxyribose als Zucker dient. Kommt ein Nucleotid in seiner freien Form vor, wird die Bezeichnung Monophosphat (-MP) hinzugefügt. In . Ab-bildung 5.6 sind die Strukturen einiger häufiger Mono-nucleotide dargestellt. Es hat sich außerdem eingebürgert, bei der Notierung von DNA- bzw. RNA-Sequenzen die o.g. Einbuchstabenabkürzungen auch für die Benennung der in der jeweiligen Sequenz vorkommenden Nucleotide zu benutzen.

5.1.2 Funktionen von Nucleosiden und Nucleotiden

! Nucleoside entstehen im Intestinaltrakt beim Abbau der Nucleinsäuren der Nahrung sowie in den Geweben beim Abbau von Nucleotiden.

Nucleoside entstehen im Intestinaltrakt bei der Verdauung der in den Nahrungsstoffen enthaltenen Nucleinsäuren, sind jedoch zum Teil auch in erheblicher Konzentration be-reits in bestimmten Nahrungsmitteln enthalten. Be sonders

nucleosidreich ist z.B. die Muttermilch. Durch spe zifische Transportsysteme im Intestinaltrakt werden diese Nucleo-side resorbiert und anschließend auf die ver schie denen Ge-webe verteilt. Dort dienen sie hauptsächlich der Synthese von Nucleotiden und Nucleinsäuren (7 Kap. 5.1), darüber hinaus als Signalmoleküle der Reifung und Dif ferenzierung der Epithelzellen des Intestinaltrakts. Diese Funktion ist besonders bei Säuglingen von Bedeutung.

Purinnucleoside und hierbei besonders das Adeno-sin spielen eine wichtige Rolle als extrazelluläre Signal-mole küle. Adenosin führt zu einer Relaxation der glatten Gefäßmuskulatur und steigert die Durchblutung vieler Gewebe. Außerdem hat es eine stark antilipolytische Wirkung.

Die Tatsache, dass viele Zellen spezifische Transportsy-steme (Carrier) für die Aufnahme von Nucleosiden be-sitzen, hat erhebliche medizinische Bedeutung. Derartige Carrier sind nämlich imstande, auch chemisch modifi zierte Nucleoside aufzunehmen und dann intrazellulär in die ent-sprechenden Nucleosidtriphosphate umzuwandeln. Diese dienen dann häufig als Hemmstoffe der Purin-, bzw. Pyri-midinsynthese sowie der Nucleinsäuresynthese. Aus die-sem Grund werden derartige Verbindungen zur Therapie von Tumor- oder Viruserkrankungen eingesetzt (7 Kapi-tel 10.5, 19.1.5).

! Nucleotide sind Träger energiereicher Phosphate.

Durch Anlagerung weiterer Phosphatmoleküle entstehen aus Nucleosidmonophosphaten Nucleosiddi- und Nucle-osidtriphosphate. Eine besondere Bedeutung als univer-seller Energiedonor für eine Vielzahl von Reaktionen hat das in . Abb. 5.7 dargestellte Adenosin-5�-Triphosphat (ATP). Die Bindung zwischen dem α- und β- sowie dem β- und γ-Phosphat des ATP ist energiereich, da es sich je-weils um eine Phosphorsäureanhydrid-Bindung handelt. Nucleosiddiphosphate und -triphosphate gibt es in ana loger Weise von allen Nucleotiden.

! Nucleotide sind an einer Vielzahl biochemischer Pro-zesse beteiligt.

. Abb. 5.6. Strukturformeln wichtiger Nucleotide. (Auswahl)

. Tabelle 5.2. Nomenklatur der Adeninnucleotide

Nucleosid VerestertesC-Atom

Nucleotid Abkürzung

Adenosin 5 Adenosin-5 -Mono-phosphat

(5 -)AMP

3 Adenosin-3 -Mono-phosphat

3 -AMP

Desoxy-adenosin

5 Desoxyadenosin-5 -Monophosphat

5 -dAMP

3 Desoxyadenosin-3 -Monophosphat

3 -dAMP

5.1 · Nucleoside und Nucleotide5145

Nucleotide haben eine außerordentliche Bedeutung für die Aufrechterhaltung der Lebensvorgänge in Zellen, da sie an vielen entscheidenden biochemischen Vorgängen be-teiligt sind:4 Sie sind universelle Energieträger, da durch Substrat-

ketten-Phosphorylierung und bei der Reoxidation was-serstoffübertragender Coenzyme ATP oder GTP ent-stehen. Diese liefern dann die Energie für alle zellulären Aktivitäten, z.B. Biosynthesen, Transportvorgänge oder Motilität

4 Sie sind die aktivierten Vorstufen für die DNA- und RNA-Biosynthese (7 Kap. 7 und 8)

4 Nucleotide bilden die für viele Biosynthesen benöti-gten aktivierten Zwischenprodukte. Hierzu gehören:5 die UDP-Glucose (. Abb. 5.8) für die Glycogen-

biosynthese5 das CDP-Cholin (. Abb. 5.9) für die Phospholi-

pidsynthese sowie das5 Aminoacyl-Adenylat für die Proteinbiosynthese

(7 Kap. 9.1.3)4 Adeninnucleotide sind Bestandteile der Coenzyme

5 Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid (NAD+)5 Flavin-Adenin-Dinucleotid (FAD)5 Coenzym A (CoA-SH) (7 Kap. 23.3.6)

! Nucleosidcyclosphosphate sind intrazelluläre Signal-moleküle.

Wichtige Derivate von ATP und GTP sind das zyklische Adenosin-3�-5�-Monophosphat (3 , 5 -cyclo-AMP, cAMP) (. Abb. 5.10) sowie das zyklische Guanosin-3�,5�-Mono-phosphat (3 ,5 -cyclo-GMP, cGMP). Beide Nucleotide ent-stehen intrazellulär unter Pyrophosphat-Abspaltung durch

. Abb. 5.7. Adenosin-5�-Triphosphat . Abb. 5.8. Uridindiphosphat-Glucose. Das durch UMP reaktions-fähig gemachte Glucose-1-Phosphat ist rot hervorgehoben

. Abb. 5.9. Cytidindiphosphat-Cholin

In Kürze

4 Nucleoside bestehen aus je einer von vier Basen, die über N-glycosidische Bindungen mit Ribose, seltener Desoxyribose verknüpft sind

4 Durch Veresterung der Hydroxylgruppe am C-Atom 3 oder häufiger am C-Atom 5 der Ribose bzw. Desoxyri-bose mit Phosphorsäure werden aus Nucleosiden die entsprechenden Nucleotide gebildet

4 Durch die Anlagerung weiterer Phosphate entstehen aus Nucleosid-Monophosphaten die entsprechenden Di- und Triphosphate. Sie enthalten energiereiche Phosphorsäureanhydrid-Bindungen, deren Hydrolyse endergone Reaktionen ermöglicht

4 Durch Verbindungen mit Nucleosid-Diphosphaten werden Zwischenprodukte des Intermediärstoffwech-sels aktiviert

. Abb. 5.10. Zyklisches Adenosin-3�,5�-Monophosphat (3�,5�-cyclo-AMP, cAMP)

die Einwirkung spezifischer Cyclasen. Sie dienen als intra-zelluläre Signalmoleküle (second messenger) und haben wichtige Funktionen bei der Regulation von Zellstoffwech-sel, Wachstum und Differenzierung (7 Kap. 25.4.5).

146

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5.2 Zusammensetzung und Primär-struktur der Nucleinsäuren

1869 beschrieb Friedrich Miescher, dass im Zellkern eine phosphathaltige proteinfreie Substanz vorkommt, die er Nuclein nannte. In späteren Jahren vermutete er, dass sie etwas mit dem Fertilisierungsvorgang zu tun haben müsste. 1889 prägte Richard Altmann den Begriff Nucleinsäure, 1893 identifizierte Albrecht Kossel die in Nucleinsäuren vorkommenden Basen und Zuckerkomponenten.

! Nucleinsäuren sind Polymere, die aus Ketten von Nucleo-tiden bestehen, die untereinander durch Phosphodies-terbindungen verknüpft sind.

In . Abb. 5.11 ist ein hypothetisches Tetranucleotid aus je einem DNA- bzw. RNA-Strang dargestellt. Dabei gelten fol-gende Besonderheiten:4 Nach Konvention wird das 5�-Phosphatende der Kette

(links) an den Anfang, das 3�-OH-Ende (rechts) an das Ende der Kette geschrieben

. Abb. 5.11. Primärstruktur eines hypothetischen RNA- bzw. DNA-Tetranucleotids

5147

4 Die stickstoffhaltigen Purin- oder Pyrimidinbasen sind stets über eine N-glycosidische Bindung an das C1 -Atom der Pentose gebunden (Ausnahme Pseudo-uridin)

4 Die Verbindung zwischen den einzelnen Mononu-cleotiden erfolgt durch eine Phosphodiesterbindung zwischen dem C-Atom 3 der einen Pentose und dem C-Atom 5 der nächsten. In der DNA ist diese 3 ,5 -Bin-dung die einzig mögliche, da in der Desoxyribose keine weiteren Hydroxylgruppen für die Bindung von Phos-phatestern zur Verfügung stehen. Auch in der RNA kommen am häufigsten 3 ,5 -Bindungen vor, obwohl auch 2 ,5 -Bindungen möglich sind

Die Struktur einer Nucleinsäurekette kann in abgekürzter Form angegeben werden:4 Die Buchstaben A, G, C und U oder T dienen dabei als

Symbole für die Basen4 Der Buchstabe p bezeichnet Phosphat. p auf der linken

Seite der Nucleosidabkürzung stellt eine 5 -Zucker-phosphatbindung dar, auf der rechten Seite der Nucleo-sidabkürzung eine 3 -Zuckerphosphatbindung

4 Mit dem Präfix d wird zum Ausdruck gebracht, dass es sich um ein Desoxyribonucleotid handelt

So wird beispielsweise mit dem Ausdruck dpG Desoxy-guanosin-5 -Phosphat bezeichnet. Ein dGp steht dagegen für Desoxyguanosin-3 -Phosphat. Die in . Abb. 5.11 darge-stellten Tetranucleotide würden in der Kurzschreibweise als d(pT-A-C-G) bzw. pU-A-C-G bezeichnet werden. Damit werden als Verknüpfung Phosphodiesterbindungen zwi-schen dem C-Atom 3 des einen Zuckermoleküls und dem C-Atom 5 des nächsten angenommen.

Infolge der Phosphatgruppen sind Nucleinsäuren starke mehrbasische Säuren, die bei pH-Werten über 4 vollständig dissoziiert sind. DNA und RNA unterscheiden sich nicht nur durch die Art der als Basenbestandteile ver-wendeten Zucker, sondern auch durch die Basenzusam-mensetzung:4 In der DNA kommen Adenin, Guanin, Thymin und

Cytosin vor4 In der RNA findet sich dagegen meistens statt der Pyri-

midinbase Thymin das Uracil

In Kürze

Nucleotidbausteine bilden durch Verknüpfung über Phos-phorsäurediesterbrücken zwischen den C-Atomen 3’ und 5’ der Ribose bzw. Desoxyribose lange kettenförmige Moleküle, die Nucleinsäuren. In DNA-Molekülen kommen

ausschließlich Desoxyribonucleotide vor, in RNA-Molekülen Ribonucleotide. DNA und RNA unterscheiden sich auch durch die Basenzusammensetzung.

5.3 Aufbau der DNA

5.3.1 Die DNA-Doppelhelix

Erst 1944, also 75 Jahre nach der Erstbeschreibung der Nucleinsäuren, entdeckte Oswald Theodore Avery, dass DNA Trägerin der Erbmerkmale ist. Bis 1950 hatte schließ-lich Erwin Chargaff eine Reihe wichtiger Eigenschaften der DNA aufgeklärt:4 Die Basenzusammensetzung der DNA ist speziesspe-

zifisch4 Aus verschiedenen Geweben der gleichen Art isolierte

DNA-Proben haben immer die gleiche Zusammenset-zung

4 Innerhalb einer bestimmten Spezies ist die Basen-zusammensetzung der DNA konstant und nicht vom Alter, Ernährungszustand oder Veränderungen der Umgebung abhängig

4 In allen untersuchten DNA-Proben ist die Anzahl der Adeninreste gleich der Anzahl der Thyminreste. Eben-so ist die Anzahl der Guaninreste stets gleich der An-zahl der Cytosinreste. Daraus folgt, dass die Summe der Purinnucleotide gleich der Summe der Pyrimidin-nucleotide sein muss

Trotz dieser Erkenntnisse waren der DNA-Aufbau und der Mechanismus der Informationsspeicherung und Wie-dergabe durch die DNA völlig rätselhaft. Rosalind Franklin und Maurice Wilkins stellten als Erste röntgenkristallo-graphische Untersuchungen über die DNA an und schlos-sen auf eine spiralige Struktur. Erst James Watson und Francis Crick gingen von der Annahme aus, dass im DNA-Molekül Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Ba-sen vorhanden sind und kamen 1993 auf ein Modell der DNA-Struktur, das sich schließlich als richtig erwies.

Es handelt sich um die B-DNA. Ihre Struktur ergibt sich aufgrund von Wasserstoffbrückenbindungen und hydro-phoben Wechselwirkungen (. Abb. 5.12):4 B-DNA besteht aus zwei helicalen Polydesoxynucleo-

tid-Strängen, die sich um eine gemeinsame Achse win-den. Dabei verlaufen die Stränge in entgegengesetzter Richtung, sind also antiparallel

4 B-DNA bildet eine rechtsgängige Doppelhelix mit etwa 10 Basenpaaren pro Wendelgang auf einer Länge von 3,3 nm. Der Durchmesser dieser Helix liegt bei 2,37 nm

4 B-DNA weist eine große Furche (Breite 1–2 nm) sowie eine kleine Furche (Breite 0,6 nm) auf

4 Die Basen zeigen in das Innere der Helix, die Zucker-Phosphat-Reste sind jedoch nach außen orientiert

5.3 · Aufbau der DNA

148

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. Abb. 5.12. Struktur der DNA-Dop-pelhelix Typ B. a Atommodell, oben in der Aufsicht, unten Seitenansicht. Die Basen sind violett, das Rückgrat aus Des-oxyribose und Phosphat ist grün gefärbt; b schema tische Darstellung, die Pfeilspit-zen geben die Richtung der Stränge an. (grün) Guaninnucleotide, (blau) Cytosin-nucleotide; (rot) Adeninnucleo tide; (gelb)Thyminnucleotide. Quelle: Biocomputing-Gruppe, Institut für Molekulare Biotech-nologie, Jenaer Zentrum für Bioinformatik, http://www.imb-jena.de/jcb/download/dna_50_jahre.pdf

. Abb. 5.13. Ausbildung von Wasser-stoffbrücken (Basenpaarungen) zwi-schen Adenin und Thymin bzw. Cytosin und Guanin

5149

4 Benachbarte Basen entlang der Helixachse sind 0,34 nm voneinander entfernt und um 36° gegeneinander ver-dreht

4 Die beiden DNA-Einzelstränge werden durch Wasser-stoffbrückenbindungen zwischen jeweils zwei Basen zu-sammengehalten. Dabei paart Adenin immer mit Thy-min und Guanin immer mit Cytosin (. Abb. 5.13)

4 Guanin und Cytosin können drei, Adenin und Thymin zwei Wasserstoffbrücken ausbilden

Der größte Teil der DNA liegt in vivo als B-DNA vor. Grund-sätzlich anders aufgebaut ist die Z-DNA (. Abb. 5.14). Bei dieser DNA-Form handelt es sich um eine linksgängige Doppelhelix mit einer Ganghöhe von 4,56 nm und 12 Ba-senpaaren pro Windung. Z-DNA findet sich v.a. in GC-reichen DNA-Sequenzen und macht insgesamt nur einen sehr kleinen Teil der zellulären DNA aus. Ihr Auftreten hängt mit der Transkription spezifischer Gene zusammen, wobei eine wichtige Rolle der Z-DNA beim RNA-Editing (7 Kap. 8.5.4) erwiesen ist. Die A-DNA (. Abb. 5.14) ent-steht nur bei experimenteller Dehydratisierung der B-DNA. Sie ist breiter als diese, ein Wendelgang umfasst 11 Basen-paare. Wahrscheinlich kommt die A-DNA in vivo nicht vor, jedoch nehmen DNA-RNA-Doppelhelices die A-Konfor-mation an.

Wichtige strukturelle Eigenschaften der verschiedenen DNA-Formen sind in . Tabelle 5.3 zusammengestellt.

Der DNA-Gehalt von Säugetierzellen liegt je nach Spe-zies zwischen 4 und 8 pg/Zelle. Dies ist mehr als tausend-mal so viel wie der DNA-Gehalt von Mikroorganismen. Die höchsten DNA-Gehalte zeigen die Zellen höherer Pflanzen mit mehr als dem 104-fachen des DNA-Gehaltes von Bak-terienzellen. Dementsprechend variabel ist auch die sog.

Konturlänge der DNA. Dieser Wert ergibt sich unter der Annahme, dass die gesamte DNA einer Zelle als lineares Makromolekül vorliegen würde. E. coli hätte demnach eine Konturlänge von 1,36 μm, die diploide humane DNA da-gegen eine von etwa 1,8 m! Im Allgemeinen ist es jedoch üblich, die Größe von DNA-Abschnitten mit Hilfe der Zahl der Basen (base, b) oder Basenpaare (base pairs, bp) anzu-geben. Ein DNA-Einzelstrang von 1 kb Größe wäre dem-nach aus 103 Basen zusammengesetzt, einer von 1 Mb aus 106 Basen usw.

5.3.2 Topologie der DNA

Die verschiedenen Funktionen der DNA machen es notwen-dig, dass temporär eine Reihe von Änderungen der oben geschilderten helikalen Strukturen auftreten. Diese sind wichtig für Replikation, Transkription, Transposition, Inte-gration viraler DNA und das Auftreten von Mutationen.

! Umgekehrte Wiederholungssequenzen können zu kreuzförmigen Strukturen führen.

Gelegentlich kommen in DNA-Sequenzen so genannte Palindrome vor. Man versteht hierunter generell Sätze, die egal ob von links nach rechts oder von rechts nach links gelesen, immer die gleiche Buchstabenreihenfolge ergeben. Ein Beispiel hierfür ist etwa »Anni meide die Minna«. Wie in . Abbildung 5.15 gezeigt, sind derartige DNA-Be reiche mit sich selbst komplementär, da sie umgekehrte Wieder-holungssequenzen (inverted repeats) enthalten. Sie sind unter bestimmten Bedingungen imstande, kreuzförmige Strukturen auszubilden.

Inverted repeats findet man in den DNA-Bindungs-regionen von Rezeptoren der Steroidhormon-Familie. Sie sind an der DNA-Rekombination beteiligt, können darüber hinaus auch potentiell Mutationen auslösen.

! Durch Superspiralisierung entstehen kompaktere DNA-Formen.

Die bisher beschriebenen Doppelhelices sind Spiralen aus zwei Einzelsträngen mit einer gemeinsamen Längsachse. Dies trifft sowohl für die ringförmigen DNA-Moleküle von Prokaryonten als auch für die sehr langen linearen DNA-Stücke in eukaryotischen Chromosomen zu.

Bei der DNA-Replikation und -Transkription, aber auch bei anderen Reaktionen der DNA muss der Doppel-strang lokal entwunden werden. In . Abb. 5.16 ist die hier-bei auftretende Problematik in schematischer Form dar-gestellt. Ausgangspunkt ist die lineare B-Doppelhelix mit 10 Basenpaaren pro Wendelgang. Stellt man sich den Dop-pelstrang an einem Ende fixiert vor, so muss die DNA ein-mal um ihre Längsachse gedreht werden, um die Lösung der Wasserstoffbrücken von 10 Basenpaaren zu erreichen (. Abb. 5.16a). Wesentlich komplizierter sind die Verhält-nisse, wenn beide Enden des DNA-Doppelstrangs fixiert

. Tabelle 5.3. Struktureigenschaften idealer A-, B- und Z-DNA

A B Z

helicaler Drehsinn rechts-gängig

rechts-gängig

linksgängig

Durchmesser ca. 2,6 nm ca. 2 nm ca. 1,8 nm

Basenpaare pro he-licale Windung

11 10 12 (6 Dimere)

helicale Windung pro Basenpaar

33° 36° 60° (pro Dimer)

helicale Ganghöhe (Anstieg/Windung)

2,8 nm 3,4 nm 4,5 nm

helicaler Anstieg pro Basenpaar

0,26 nm 0,34 nm 0,37 nm

Basenneigung zur Helixachse

20° 6° 7°

große Furche eng und tief

breit und tief

flach

kleine Furche breit und flach

eng und tief

eng und tief


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5


. Abb. 5.14. Strukturen von A-, B- und Z-DNA in Aufsicht und Seiten-ansicht. a raumfüllende Kalotten-modelle; b Darstellung der räumlichen Beziehungen der Basen. Das Zucker-Phosphat-Rückgrat ist als Doppellinie dargestellt

a

b

5151

sind oder es sich um einen zirkulären Doppelstrang han-delt (im Bild nicht dargestellt). In diesem Fall wird durch die Öffnung der Helix um 10 Basenpaare eine Torsions-spannung auf den verbleibenden Teil der Helix ausgeübt. Um diese zu kompensieren, muss entweder die Zahl der Basenpaare pro Wendelgang erhöht oder die Achse des Doppelstrangs verdrillt werden. Im geschilderten Fall ent-steht eine Superhelix (. Abb. 5.16b). Nach Konvention werden Super helices, die aufgrund der Entwindung des Doppelstrangs entstanden sind, als negative Superhelices bezeichnet.

Ein besonderes Problem entsteht dann, wenn eine loka-le Entwindung des Strangs sich über einen linearen Doppel-strang bewegt (. Abb. 5.16c). Dies ist beispielsweise bei der Replikation aber auch bei der Transkription der Fall. In Richtung der Bewegung des für diese Vorgänge verantwort-lichen Proteinkomplexes kommt es zu einem »Stau« der Helixwindungen, die positive Superhelices auslösen, hin-ter dem für die Entwindung verantwortlichen Enzymkom-plex oder Proteinkomplex dagegen zu einer Reduktion der Zahl der Helixwindungen mit entsprechendem Auftreten von negativen Superhelices.

! Topoisomerasen sind für die Entwindung superhelica-ler Strukturen verantwortlich.

Es leuchtet ein, dass die durch lokale Entwindungen aus-gelösten negativen und positiven Superhelices sich nicht unbegrenzt entwickeln dürfen, sondern dass die DNA über Möglichkeiten verfügen muss, die Abweichungen vom nor-malen Windungszustand zu beheben. Die hierfür verant-

. Abb. 5.15. Ausbildung von haarnadel- bzw. kreuzförmigen Strukturen. a In einzelsträngiger DNA können selbstkomplemen-täre Sequenzen Haarnadelstrukturen ausbilden, b in doppelsträngi-ger DNA entstehen aus inverted repeats kreuzförmige Strukturen; N = Nucleotid

. Abb. 5.16. Superspiralisierung von DNA. a Bei einer DNA mit einem freien Ende genügt je eine Drehung um die Längsachse, um die Wasserstoffbrücken zwischen 10 Basenpaaren zu lösen; b Bei einer DNA mit fixierten Enden führt die Lösung der Wasserstoffbrücken von 10 Basepaaren zur Ausbildung einer Superspirale; c Wandert eine lokale Entwindung durch eine DNA-Doppel-helix, so kommt es vor der Entwin-dungsstelle zu positiven, dahinter zu negativen Superhelices. (Weitere Einzelheiten 7 Text)


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wortlichen Enzyme werden Topoisomerasen genannt, von denen es zwei unterschiedliche Formen gibt:4 Topoisomerase I: Dieses Enzym dient vor allem dazu,

negative Superhelices zu entspannen. Hierfür wird der DNA-Doppelstrang vom Enzym gebunden. Ein Tyro-sylrest des Enzyms greift anschließend die Phospho-diesterbindung in einem der beiden Stränge an und erzeugt auf diese Weise einen Einzelstrangbruch. Die benachbarten Enden der Doppelhelix können sich nun bis zur Entspannung gegeneinander drehen, anschlie-ßend werden die Strang-Enden wieder miteinander verknüpft (. Abb. 5.17)

4 Topoisomerase II: Topoisomerasen des Typs II können Superspiralisierungen dadurch beheben, dass sie in einer ATP-abhängigen Reaktion beide Stränge durch-trennen, die DNA entspannen und anschließend wie-der miteinander verknüpfen

Ein Sonderfall sind die bakteriellen Topoisomerasen II, die auch als Gyrasen bezeichnet werden. Diese Klasse von Enzymen ist imstande, unter ATP-Verbrauch negative Superhelices in ringförmige DNA-Moleküle einzuführen. Ein gewisser Grad an Superspiralisierung ist nämlich bei Prokaryonten eine Voraussetzung dafür, dass Replikation und Transkription korrekt ablaufen können. Der Grund hierfür ist möglicherweise, dass die Superspiralisierung die notwendige Strangtrennung erleichtert. Hemmstoffe der bakteriellen Gyrase werden als Antibiotika verwendet (7 Kap. 7.2.3).

5.3.3 Die Struktur des Chromatins

Die DNA prokaryoter Mikroorganismen ist meist ring-förmig als stark gefaltetes Gebilde im Cytoplasma lokali-siert. Im Gegensatz dazu befindet sich die DNA aller eu-karyoten Zellen mit Ausnahme der mitochondrialen DNA (7 Kap. 6.2.9) im Zellkern. Sie bildet dort einen Komplex mit verschiedenen Proteinen, der als Chromatin bezeich-

net wird. In Anbetracht der erheblichen Konturlänge (beim Menschen etwa 1,8 m DNA pro Zelle) muss die DNA sehr stark kondensiert sein. Hierfür ist ihre Assoziation mit den Histonproteinen unter Bildung von Nucleosomen von be-sonderer Bedeutung.

! Histone sind DNA-bindende Proteine.

Histone (. Tabelle 5.4) kommen in fünf unterschiedlichen Formen vor und zeichnen sich durch einen hohen Gehalt an basischen Aminosäuren aus. Die Histone H2A, H2B, H3 und H4 sind besonders hoch konservierte Proteine, d.h., sie unterscheiden sich beim Vergleich zwischen verschie-denartigsten Spezies nur durch sehr wenige Aminosäuren. Diese Tatsache spricht für ihre besondere Bedeutung bei der DNA-Kondensation im Zellkern. Das gehäufte Vor-kommen basischer Aminosäurereste in den genannten His-tonproteinen dient der Neutralisierung des polyanionischen DNA-Rückgrats und erleichtert so die Faltung von Nucleo-somen zu höheren Strukturordnungen.

Da inzwischen die Histonproteine ganz unterschied-licher Spezies kloniert und sequenziert wurden, sind ge sicherte Daten über ihre Raumstruktur vorhanden. Die Histone H2A, H2B, H3 und H4 zeigen einen sehr ähn-lichen Aufbau. C-terminal befinden sich α-helicale Ab-schnitte, von denen je 3 eine Domäne bilden, die mit DNA interagieren kann und auch als histone fold be-zeichnet wird. Etwa 25% der Histonmasse wird von den sog. «Schwanz«-Domänen gebildet. Diese sind im N-ter-

. Abb. 5.17. Reaktionsmechanismus der Topoisomerase I. (Einzelheiten 7 Text)

. Tabelle 5.4. Die 5 Histonproteine

Bezeichnung % Arginin % Lysin Molekülmasse(kDa)

H1 1 29 19–23

H2A 9 11 14

H2B 6 16 14

H3 13 10 15

H4 14 11 11

5153

minalen Abschnitt aller 4 Histonproteine lokalisiert, da-rüber hinaus auch noch am C-Terminus des Histons H2A. Schwanz-Domänen der Histone spielen eine wich-tige Rolle bei den regulierten Änderungen der Nucleo-somenstruktur während Replikation und Transkription (7 Kap. 8.5.1).

! Nucleosomen sind die unterste Organisationsebene des Chromatins.

Die Erkenntnisse über den Aufbau der Histonproteine haben zu einer molekularen Beschreibung des bereits 1974 von Roger G.R. Kornberg beschriebenen Nucleosoms geführt (. Abb. 5.18). Nucleosomen enthalten ein aus den Histon-proteinen gebildetes sog. Nucleosomencore, um welches DNA gewunden ist:4 Die Bildung eines stabilen Nucleosomencores beginnt

mit der Heterodimerisierung der Histonproteine H3 und H4. Zwei derartige Dimere bilden anschließend ein (H3, H4)2-Tetramer

4 Die Histone H2A und H2B bilden ebenfalls ein Hetero-dimer, welches auf beiden Seiten des (H3, H4)2-Tetra-mers angelagert wird

4 Das auf diese Weise gebildete Histonoctamer der Zu-sam mensetzung (H2A/H2B)-(H4/H3)-(H3/H4) (H2B/H2A) bildet eine scheibchenförmige Struktur, um die 146–147 Basenpaare DNA gewunden sind. Die DNA bildet dabei eine flache linksgängige Superhelix mit 1,8 Windungen

Das Histon H1 nimmt nicht an der Bildung des Nucleosoms teil, ist jedoch für die Stabilisierung der Nucleosomen und die Aufrechterhaltungen höherer Ordnungen der Chroma-tinstruktur von Bedeutung. H1-Histone bilden eine Familie von sog. linker-Histonen (engl. Verbindungs-Histone) und sind mit den DNA-Zwischenstücken zwischen den Nuc-leosomen (linker-DNA) assoziiert.

! Nucleosomen ordnen sich zu einer linksgängigen Helix, der Nucleosomenfaser.

Wie aus . Abbildung 5.19 zu entnehmen ist, bilden Nucleo-somen eine perlschnurartige Struktur, wobei die zwischen den einzelnen Nucleosomenpartikeln gelegene sog. Verbin-dungs-DNA (linker-DNA) in der Regel etwa 50–60 Basen-paare lang ist. Das Histon H1 verschließt gewissermaßen das Nucleosom und bestimmt die Länge der Verbindungs-DNA.

Bei physiologischen Salzkonzentrationen bildet die Nucleosomenkette eine 30 nm dicke Faser, die dadurch ent-steht, dass die Nucleosomenfaser sich spulenförmig aufwi-ckelt, wobei jede Windung etwa 6 Nucleosomen enthält. Auch dieses sog. Solenoid wird durch die H1-Moleküle stabilisiert.

Die 30 nm-Faser faltet sich schließlich zu vielen Schlei-fen, an deren Bildung so genannte Nicht-Histonproteine beteiligt sind, die insgesamt etwa 10% der Proteinmenge von Chromosomen ausmachen. Über die weitere Struktur-bildung zu den Chromosomen, die im Vergleich zur DNA-

. Abb. 5.18. Struktur eines Nucleosomen-Core-Partikels. a An-sicht entlang der Achse der DNA-Superhelix. Die histone fold-Domä-nen der Histone H2A, H2B, H3 und H4 sind gelb, rot, blau bzw. grüneingefärbt, die Schwanzdomänen und andere Histonbestandteile

hellgrau. Die DNA-Superhelix ist hellblau. b Ansicht derselben Struktur nach einer Drehung um 90° um die senkrechte Achse. (Weitere Einzel-heiten 7 Text. Modifiziert nach Luger 2003)


ba

154

5


Doppelhelix etwa um den Faktor 8000 kondensiert sein müssen, ist so gut wie nichts bekannt.

Bei Replikation und Transkription muss die Struktur der Nucleosomen aufgelöst werden (7 Kap. 7.2, 8.3).

5.3.4 Aufbau und Funktion der Chromo somen

! Chromosomen zeigen für Mitose und Meiose spezifi-sche Strukturen.

Mit der Entwicklung der modernen Genetik zu Beginn des letzten Jahrhunderts wurde klar, dass die ursprünglich von Gregor Mendel postulierten Faktoren oder Gene auf Chro-mosomen lokalisiert sind, die allerdings nur während der

Zellteilung gut zu beobachten sind. Ihre Zahl ist in somati-schen Zellen speziesspezifisch festgelegt. Somatische Zellen enthalten darüber hinaus normalerweise zwei Kopien jedes Chromosoms, Gameten jedoch nur eine, weswegen man den somatischen Chromosomensatz als diploid, denjenigen der Gameten als haploid bezeichnet. Humane somatische Zellen enthalten den aus 46 Chromosomen bestehenden diploiden, humane Gameten dagegen den aus 23 Chromo-somen bestehenden haploiden Chromosomensatz.

Mitose. Bei der als Mitose bezeichneten Teilung soma-tischer Zellen machen die Chromosomen eine Reihe charakteristischer Veränderungen durch (. Abb. 5.20. Vor der Mitose kommt es in der S-Phase des Zellzyklus (7 Kap. 7.1.1) zur Verdopplung jedes einzelnen Chromosoms. Die beiden entstehenden Schwesterchromosomen oder

. Abb. 5.19. Schematische Darstellung des DNA-Histon-Kom p lexes im Chromatin. Nucleosomen sind zur 30 nm Faser verdrillt, die ihrer-seits intensiv gefaltet ist. (Weitere Einzel heiten 7 Text)

5155

Schwes terchromatiden bleiben am Centromer mitei-nander verbunden. Während der Mitose heften sich die Schwesterchromosomen mit den Centromeren (7 u.) an die Mi tosespindel, ordnen sich dann während der Meta-phase äqua torial in der Zelle an und werden dann so auf die entstehenden Tochterzellen verteilt, dass jede wieder den diploiden Chromosomensatz enthält (näheres 7 Lehr-bücher der Biologie und Humangenetik).

Die in der medizinischen Diagnostik häufig durchge-führten Chromosomenuntersuchungen basieren auf der Analyse der Metaphasechromosomen (. Abb. 5.21). Zu diesem Zeitpunkt hat die DNA-Verdoppelung bereits stattgefunden, weswegen jedes Chromosom aus 2 Schwes-terchromatiden besteht, die nur noch am Centromer zusammenhängen. Von diesem ausgehend finden sich bei allen Chromosomen die kurzen p-Arme und die langen q-Arme. Die Enden der Chromatiden werden auch als Telomere bezeichnet und enthalten die für diese Position spezifischen DNA-Sequenzen (7 Kap. 7.2.3). Durch An-färben mit Giemsa-Lösung bzw. Quinacrin entstehen die G- bzw. die an gleicher Stelle liegenden Q-Banden. Es ist zwar nicht bekannt, welche spezifischen chromosomalen

. Abb. 5.20. Darstellung der einzelnen Phasen der Mitose. Dar-gestellt ist eine diploide Zelle mit jeweils einem mütterlichen (rot) und väterlichen (blau) Chromosom. In der S-Phase entstehen aus diesen die entsprechenden Schwesterchromatiden, die in der Anaphase getrennt und auf die durch die Zellteilung entstehenden Zellen ver-teilt werden. (Einzelheiten 7 Text)

. Abb. 5.21. Schematische Darstellung der menschlichen Chro-mosomen 1, 2, 21 und 22 in der Metaphase. Man erkennt jeweils die beiden Schwesterchromatiden, die durch das Centromer zusam-mengehalten werden. Die Bandenbildung nach Giemsa-Färbung erlaubt die Zuordnung von Genen bzw. Gengruppen auf definierte Positionen der p- bzw. q-Arme der Chromosomen


156

5


. Abb. 5.22. Phasen der Meiose. Ausgangspunkt ist eine Zelle mit je zwei maternalen (rot) bzw. paternalen (blau) Chromosomen. Nach der ersten meiotischen Teilung werden maternale und paternale

Chromatiden statistisch verteilt, sodass vier unterschiedliche Tochter-zellen entstehen, die nach der zweiten meiotischen Teilung den haploiden Chromosomensatz erhalten. (Einzelheiten 7 Text)

5157

Eigenschaften für die Bandenbildung verantwortlich sind, aber da sie für jedes Chromosom typisch sind, eignen sie sich zur Orientierung. So können Gene oder Gengruppen bestimmten Banden zugeordnet oder, unter meist patho-logischen Bedingun gen, der Austausch genetischen Mate-rials zwischen ein zelnen Chromosomen festgestellt werden (Translokation, 7 Kap. 35.3.2, 35.6).

Meiose. Zweck der als Meiose bezeichneten Teilung der Keimzellen ist die Reduktion des diploiden Chromoso-mensatzes auf den haploiden. Hierzu werden zwei Zell-teilun gen ohne dazwischenliegende Replikation durchge-führt. Während der ersten Teilung kommt es zur Trennung der homologen Chromosomen, bei der zweiten Teilung zur Trennung der Schwesterchromatiden, sodass jeweils vier Zellen mit dem haploiden Chromosomensatz entstehen (. Abb. 5.22).

! Der Allelaustausch während der Meiose ist die Grund-lage der biologischen Vielfalt.

Zwei mit der Meiose verknüpfte Mechanismen sind für das Zustandekommen der biologischen Vielfalt bei den Nachkommen eines Elternpaares verantwortlich:4 Bei der ersten meiotischen Teilung werden die väter-

lichen und mütterlichen Chromatiden statistisch auf die entstehenden Zellen verteilt. Dies bildet die erste Stufe der genetischen Variation. Bei den 23 humanen Chromosomen ergeben sich 223 (ca. 8,39 Millionen) Kombinationsmöglichkeiten

4 In der meiotischen Prophase kommt es zum Austausch von Genen auf homologen Chromosomen, was auch als homologe Rekombination bezeichnet wird (. Abb. 5.23). Homologe Chromosomen ordnen sich zu Beginn der Meiose parallel an und umschlingen sich (crossing over). Dabei kommt es zum Austausch chromosomalen Materials zwischen homologen Chromosomen

. Abb. 5.23. Rekombination homologer Chromosomen bei der Meiose. (Einzelheiten 7 Text)

In Kürze

DNA zeigt folgende Strukturmerkmale:4 Der DNA-Einzelstrang ist ein Polydesoxyribo nucleotid4 Sein Rückgrat wird von Desoxyribosemolekülen

gebildet, die durch Phosphodiesterbindungen ver-knüpft sind

4 Jede Desoxyribose trägt in N-glycosidischer Bindung eine der vier Basen Adenin, Guanin, Thymin oder Cytosin

4 DNA liegt als Doppelhelix vor. Diese Struktur wird aus zwei antiparallel verlaufenden DNA-Einzelsträngen

gebildet und durch die Basenpaarung von Adenin mit Thymin sowie Guanin mit Cytosin stabilisiert

4 Bei Eukaryoten liegt die DNA im Zellkern als Komplex mit Histon- und Nichthistonproteinen vor. Diese Struk-tur wird als Chromatin bezeichnet

4 Die Grundeinheit des Chromatins ist das Nucleosom, dessen Kern ein aus den Histonproteinen H2A, H2B, H3 und H4 gebildetes Octamer ist, um das die DNA ge-wunden ist


158

5


5.4 DNA als Trägerin der Erb in formation

4 Die Identifizierung der DNA als Trägerin genetischer Informationen und ihre anschließende Strukturauf-klärung gehört zu den aufregendsten Kapiteln der Bio-wissenschaften. Es kam zur Entwicklung der Moleku-larbiologie, welche die molekulare Basis für die Genetik bereitstellte. Die Verfahren der Gentechnik erweiterten schließlich das den genannten Fächern zur Verfügung stehende Arsenal von Methoden: Sie haben zur Auf-klärung der Struktur nicht nur einfacher bakterieller Genome, sondern in jüngster Zeit auch der des kom-plexesten bisher untersuchten Genoms, des menschli-chen Genoms, geführt

4 Für die Medizin ermöglichen sie eine große Zahl diag-nostischer Verfahren

4 Dank Molekularbiologie und Gentechnologie können in einfach zu handhabenden Organismen medizinisch wichtige Verbindungen wie Hormone, Wachstumsfak-toren, Antikörper etc. hergestellt werden, die für die Therapie vieler Erkrankungen wichtig sind

4 Gentechnische Verfahren bieten die Möglichkeiten, Pflanzen und Tiere so zu modifizieren, dass die Versor-gung der ständig wachsenden Weltbevölkerung mit Nahrungsmitteln verbessert werden kann

4 Die Heilung von sonst nur schwer zu behandelnden Erbkrankheiten durch gentechnische Verfahren er-scheint in naher Zukunft vorstellbar

All diese Möglichkeiten gehen damit einher, dass das gene-tische Material der verschiedensten Organismen – im Ex-tremfall auch des Menschen – gentechnisch verändert wird. Da im Einzelfall die damit verbundenen Konsequenzen nicht vollständig abzusehen sind, wird die Gentechnik in der Gesellschaft kontrovers diskutiert.

5.4.1 Die Erhaltung und Realisierung der in der DNA gespeicherten Information

! Bei jeder Zellteilung wird das Genom vollständig ver-doppelt.

Bei der Zellteilung und Fortpflanzung ist es von großer Be-deutung, dass eine möglichst genaue Kopie der gesamten DNA einer parentalen Zelle in den entstehenden Tochter-zellen gebildet wird. Dieser Vorgang wird als Replikation bezeichnet und findet bei eukaryoten Zellen während der S-Phase des Zellzyklus statt. Humane Zellen benötigen für die DNA-Replikation etwa 8 Stunden. Die Einzelheiten dieses Vorgangs sind in 7 Kap. 7.2 beschrieben.

! Zur Expression von Genen werden diese in RNA tran-skribiert.

Um die als Basensequenz auf der DNA codierte Informa-tion in Form von Proteinen zu realisieren, werden nur Einzelteile des DNA-Strangs benötigt. Dies gilt sowohl für die Biosynthese der verschiedenen RNA-Spezies als auch für die Proteinbiosynthese. Der erste Schritt der Umsetzung der genetischen Information besteht in jedem Fall in einer Kopie eines entsprechenden Gens der DNA in ein RNA-Molekül. Dieser Vorgang wird als Transkription bezeich-net und ist in 7 Kap. 8.1 beschrieben. Die Gesamtheit der transkribierten Gene eines Organismus wird auch als Tran-s kriptom bezeichnet.

! Durch den Vorgang der Translation wird die in der messenger-RNA-Kette enthaltene Information in eine Aminosäuresequenz übersetzt.

Die Aufklärung des Codes, mit dem die fortlaufende Se-quenz der Basen auf der DNA mit der Aminosäure-Sequenz eines Peptids oder Proteins verknüpft ist, gehört zu den großen Leistungen der biochemischen Forschung.

Die DNA ist durch die festgelegte Sequenz der vier Basen Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin gekennzeich-net. Nimmt man an, dass aus ihnen ein »Alphabet« mit den vier Buchstaben A, T, G und C gebildet wird, so lässt sich leicht berechnen, wie viele Basen für die Festlegung einer Aminosäure benötigt werden. Bausteine aller Proteine sind die 20 unterschiedlichen proteinogenen Aminosäuren. Wenn eine Folge von je 2 Basen eine Aminosäure beschrei-ben würde, so wäre der Code unvollständig, da mit ihm nur 42 = 16 Worte geschrieben werden könnten. In der DNA wird also eine Sequenz von mindestens drei Basen benötigt, um für eine Aminosäure zu codieren. Allerdings können mit drei Zeichen pro Wort schon 43 = 64 Worte geschrieben werden. Wie man heute weiß, gibt es eine Reihe von Aminosäuren, die durch unterschiedliche Codeworte determiniert sind. Dieses Phänomen wird auch als Degene-ration des Codes bezeichnet (7 Kap. 9.1.2). Unter Zugrun-delegung dieser Codierung ist es möglich, in einem Gen die Aminosäuresequenz eines Polypeptids und in der Gesamt-menge aller DNA-Moleküle eines Organismus die Sequenz aller in ihm vorkommenden Proteine aufzuzeichnen. Die kleinste Informationseinheit ist dann eine Sequenz aus drei Basen, ein sog. Basentriplett, das auch als Codon bezeich-net wird.

Das in . Abb. 5.24 dargestellte zentrale Dogma der Molekularbiologie formuliert die Beziehungen des Nu-cleinsäurestoffwechsels zu den wesentlichen zellulären Vor-gängen und legt die Richtung des Informationsflusses fest. Entscheidend dabei ist, dass beim Vorgang der Infor-mationsübertragung zwischen DNA und Protein nur die Richtung von der DNA zum Protein, nicht aber die umge-kehrte Richtung, eingeschlagen wird. In einem Protein-molekül kann also nicht die Information zur DNA-Biosyn-these gespeichert sein. Eine Vielzahl von Beobachtungen hat die Richtigkeit des zentralen Dogmas bestätigt. Aller-dings ist zumindest bei bestimmten Viren, den Retroviren,

5159

eine Informationsübertragung von RNA in DNA möglich (7 Kap. 10.2.4, 10.2.5).

5.4.2 Aufbau von Genomen

Nach der Entdeckung, dass genetisch fixierte Eigenschaften von Organismen in der DNA verschlüsselt sind, war es na-türlich von großem Interesse, wie die vielen für einen Orga-nismus typischen Gene in der Gesamtmenge seiner DNA, seinem Genom, angeordnet sind. In Bakterien liegen die verschiedenen lebensnotwendigen Gene in linearer Se-quenz auf der DNA. Sie codieren für RNA bzw. für Proteine, wobei im letzteren Fall auch sog. polycistronische Gene vorkommen. Bei diesen codiert ein Gen für mehrere Pro-teine. Bei Eukaryoten sind die für Proteine codierenden Gene immer monocistronisch, d.h. sie codieren nur für ein Protein. Überlappende Gene sind selten, kommen jedoch bei Viren häufiger vor (7 Abb. 10.9 in Kap. 10.2.4).

Die kleinsten bisher gefundenen Genome gehören zu parasitär intrazellulär lebenden Bakterien. Ein Beispiel ist Mycoplasma genitalium, dessen Genom 580 kb umfasst und nur 468 für Proteine codierende Gene enthält. Mit derartigen Organismen wird zurzeit untersucht, wie viele Gene minimal für einen autonom lebenden Organismus benötigt werden. Die derzeitigen Schätzungen gehen von etwa 250 Genen aus!

! Nahezu alle Gene eukaryoter Organismen sind auf der chromosalen DNA lokalisiert.

Mit dem Fortschritt der technischen Möglichkeiten konnte die genetische und strukturelle DNA-Analyse auch auf die wesentlich komplexer aufgebauten Genome zunächst ein-facher, später auch komplexer eukaryoter Organismen ein-schließlich des Menschen ausgeweitet werden. Die dabei gewonnenen Erkenntnisse lassen sich folgendermaßen zu-sammenfassen:4 Auf der DNA sind die unterschiedlichen Gene in einer

linearen Sequenz angeordnet. Überlappende Gene kommen bei höheren Organismen nur sehr selten vor

4 Die auf der DNA lokalisierten Gene codieren für dieverschiedenen RNAs sowie für Proteine

4 Außer im Zellkern kommt in tierischen Zellen DNA noch in Mitochondrien vor. Die mitochondriale DNA codiert für wenige mitochondriale Proteine (7 Kap. 6.2.9) und macht nur einen sehr kleinen Bruch-teil der gesamten DNA aus.

! Die Zahl der Gene in eukaryoten Organismen ist nicht proportional der DNA-Menge und spiegelt nicht unbe-dingt die Komplexität eines Organismus wider.

Die bis heute durchgeführten Totalsequenzierungen der Genome verschiedener Organismen haben eine Reihe überraschender Befunde erbracht, die in . Tabelle 5.5 zu-sammengefasst sind. Das Genom eines komplexen Orga-nismus wie des Menschen ist etwa 1500 größer als eines einfachen Bakteriums. Auch die anderen untersuchten Vielzeller haben im Vergleich zur Bakterienzelle um das 50–100-fache größere Genome. Diese markanten Größen-unterschiede spiegeln sich jedoch nicht in der Zahl der bei den einzelnen Organismen nachgewiesenen Gene wider. Im Vergleich zur Bakterienzelle verfügt der Mensch ledig-lich über 20- bis 25-mal mehr Gene. Besonders augenfällig ist der geringe Unterschied in der Zahl der Gene beim Ver-gleich des Menschen mit dem Fadenwurm oder der Tau-fliege. Aus diesen Beobachtungen muss man also schließen, dass die Komplexität eines u.a. mit einem komplizierten zentralen Nervensystem ausgestatteten vielzelligen Säuge-tiers sich nicht ohne weiteres aus der Zahl seiner Gene ab-lesen lässt.

5.4.3 Das humane Genom

! Die Sequenzierung des menschlichen Genoms hat zu neuen Erkenntnissen über die Zusammenhänge von Genzahl und Genexpression geführt.

. Abb. 5.24. Das zentrale Dogma der Molekularbiologie

. Tabelle 5.5. Genomgröße und Genzahl verschiedener Organis-men

Organismus Genomgröße (Megabasen)

Zahl der Gene

Hämophilus influenzae (Bakterium)

1,8 1740

Saccharomyces cerevisiae (Bierhefe)

12,1 6034

Caenorhabditis elegans (Fadenwurm)

97 19099

Arabidopsis thaliana (Blattpflanze)

100 25000

Drosophila melanogaster (Taufliege)

180 13061

Homo sapiens (Mensch) 3200 ca. 35000

5.4 · DNA als Trägerin der Erbinformation

160

5


Das humane Genom umfasst ca. 3200 Megabasen (Mb). Diese sind inzwischen vollständig sequenziert, sodass die Zuordnung der etwa 30000–35000 menschlichen Gene zu den verschiedenen Chromosomen möglich ist. Als Beispiel hierfür ist in . Abb. 5.25 ein Teil der Genkarte eines be-sonders kleinen humanen Chromosoms, nämlich des Chromosoms 21 dargestellt. Eine Liste aller dort lokalisier-ten Sequenzen kann im Internet unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/ (National Center for Biotechnology Information, Stand Januar 2006) gefunden werden.

Erkenntnisse aus der Sequenzierung des humanen Genoms sind:4 Nur etwa 1,5% des Genoms codieren für Proteine,

jedoch wird wahrscheinlich mehr als das 10-fache in RNA transkribiert. Zum Teil handelt es sich dabei um die etwa 3000 RNA-Gene, z.T. aber auch um die etwa 20000 Pseudogene. Insgesamt ist die Ermittlung der Genom-Transkription, also die Bestimmung des Trans-kriptoms, noch sehr unsicher

4 Die Gendichte des menschlichen Genoms liegt bei etwa 10/106 Basen. Einfachere Organismen wie die Pflanze Arabidopsis thaliana, der Fadenwurm C. elegans oder die Taufliege Drosophila melanogaster enthalten dage-gen 100–250 Gene/106 Basen

4 Die meisten für Proteine codierenden Gene im mensch-lichen Genom sind – ähnlich wie in den Genomen anderer höherer Organismen – diskontinuierlich an-geordnet: für mRNA codierende Bereiche, sog. Exons, werden durch nicht codierende Bereiche, sog. Introns unterbrochen (7 Kap. 8.3.3)

4 Ein durchschnittliches für Proteine codierendes Gen erstreckt sich über 27 kb und enthält etwa 9 Exons. Die codierende Sequenz besteht im Durchschnitt aus etwa 1350 Basenpaaren, d.h. codiert für ein Protein mit 450 Aminosäuren, was einer molekularen Masse von etwa 50 kDa entspricht

4 Die Prä-mRNA von etwa einem Drittel aller Gene kann alternativ gespleißt werden (7 Kap. 8.5.3). Im mensch-lichen Genom wird also die unerwartet geringe Gen-zahl dadurch kompensiert, dass aus einem einzigen Gen durch alternatives Spleißen verschiedene Proteine erzeugt werden

Die Analyse der für Proteine codierenden Gene ergibt eine klare Einteilung in eine Reihe unterschiedlicher Protein-familien (. Abb. 5.26). Etwa 40% der vorhergesagten Pro-teine lassen sich allerdings bisher noch nicht zuordnen. Im Vergleich zu einfacheren Organismen finden sich beim Menschen viele regulatorische Faktoren, die an Trans-kription, Spleißen und mRNA-Modifikationen beteiligt sind.

! Das menschliche Genom enthält verschiedene Arten von repetitiven Sequenzen.

Mehr als 50% des nicht codierenden Teils des Human-genoms besteht aus Sequenzen mit einem hohen Grad an Wiederholungen, sog. repetitiven Sequenzen. Ein Teil von diesen wird nach seinem Auftreten bei der Dichtegradien-ten-Zentrifugation auch als Satelliten-DNA bezeichnet. Man unterscheidet im Einzelnen:4 Klassische Satelliten-DNA: Repetitive Sequenzen bis

zu 170 bp Länge wiederholen sich in Bereichen von 100 kb bis zu mehreren mb

4 Minisatelliten-DNA: Repetitive Sequenzen von 9–64 bp wiederholen sich in Bereichen von 0,1 bis 20 kb

4 Mikrosatelliten-DNA: Repetitive Sequenzen von 2–10 bp wiederholen sich in Bereichen von <100 bp

Besonders die Sequenzen der Mikrosatelliten-DNA, von denen das menschliche Genom zwischen 50.000 und 100.000 enthält, bilden ein wichtiges genetisches Mar-kersystem, obwohl ihre Funktion nicht bekannt ist.

. Abb. 5.25. Genkarte des humanen Chromosoms 21. Die je -weiligen Abkürzungen stehen für in der angegebenen Region lokali-sierte Krankheitsgene (z. B. AML1 akute myeloische Leukämie,

HCHWAD hereditäre Amyloidose VIb). Weitere Angaben sind unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/ zu finden

5161

Weitere repetitive DNA-Sequenzen werden als SINE (short interspersed nuclear elements) bzw. LINE (long inters-persed nuclear elements) bezeichnet. Zum Teil haben sie Ähnlichkeiten mit sog. Transposons (7 Lehrbücher der Genetik), z.T. ist ihre Funktion unbekannt.

! Einzelnucleotid-Polymorphismen sind die häufigste DNA-Sequenzvariation des Humangenoms.

Unter einem Einzelnucleotid-Polymorphismus (single nucleotide polymorphism, SNP) versteht man einen DNA-Abschnitt, innerhalb dessen sich zwei Individuen durch eine Nucleotidbase unterscheiden. SNPs machen etwa 90% der genetischen Unterschiede zwischen Individuen aus. Liegt ein SNP innerhalb eines klar definierten DNA-Ab-schnittes, so kann er als genetischer Marker dienen, dessen Vererbung von Generation zu Generation verfolgt werden

. Abb. 5.26. Verteilung der Funktionen von 26383 für Proteine codierenden Genen des humanen Genoms. (Nach Venter et al. 2001)

InfoboxGeschichte eines gewaltigen Projektes1985 Charles De Lisi, Department of Energy, USA,

diskutiert die Möglichkeiten der Sequenzierung des menschlichen Genoms

1988 James Watson gründet das Office of Human Genome Research, später National Center for Human Genome Research und beginnt mit der Einwerbung öffentlicher Mittel

1990 Man ist sich einig, dass das menschliche Ge-nom vor der Sequenzierung kartiert werden muss

1992 Francis Collins löst James Watson als Leiter des Projektes ab. Verschiedene internationale Gruppen schließen sich an

1997 Die internationalen Partner des Genomprojektes einigen sich während einer Tagung in Bermuda über die Bedingungen des öffentlichen Zugangs zu den Sequenzdaten und verpflichten sich,

Daten innerhalb 24 Stunden zugänglich zu ma-chen (Bermudaprinzipien)

1998 Craig Venter gründet die Firma Celera und kündigt die kommerzielle Sequenzierung des mensch-lichen Genoms nach einem einfacheren Verfahren an. Celera wird sich nicht an die Bermuda-Prinzi-pien halten

1999– Durch internationale Kollaboration von Gruppen2000 in den USA, Japan und Europa gelingt die voll-

ständige Sequenzierung der menschlichen Chro-mosomen 22 und 21

2001 Zeitgleich wird die erste Rohsequenz des menschlichen Genoms von der öffentlich geför-derten Gruppe in der Zeitschrift Nature und von Craig Venter, Celera, in der Zeitschrift Science veröffentlicht, die etwa 90% des Genoms umfasst

2003 Abschluss der Sequenzierung des humanen Ge-noms

5.4 · DNA als Trägerin der Erbinformation

162

5


kann. Man kennt inzwischen mehrere Millionen SNPs, von denen einige 10000 in codierenden Regionen liegen. Sie können, müssen aber nicht Aminosäuresubstitutionen ver-ursachen. Liegen SNPs innerhalb von regulatorischen Re-

gionen, so können sie Unterschiede in der Proteinexpres-sion hervorrufen. Zurzeit wird intensiv versucht, anhand derartiger Phänomene die individuelle Anfälligkeit für be-stimmte Erkrankungen zu analysieren.

In Kürze

Auf dem DNA-Doppelstrang sind die Gene in linearer Sequenz lokalisiert. Während Bakterien über ein einziges ringförmiges DNA-Molekül verfügen, sind die DNA-Mole-küle eukaryoter Organismen auf die für jeden Organismus in charakteristischer Zahl vorliegenden Chromosomen verteilt, die allerdings erst während der Mitose sichtbar werden. Somatische Zellen von Wirbeltieren enthalten einen diploiden, Gameten dagegen nur einen haploiden Chromosomensatz. Durch die Fortschritte der molekularbiologischen Verfahren ist es inzwischen gelungen, die Genome einer

Reihe von Organismen einschließlich des Menschen voll-ständig zu analysieren. Als wichtiger Befund hat sich dabei ergeben, dass keine direkte Beziehung zwischen der Kom-plexität eines Organismus und der Zahl seiner Gene besteht. Nur weniger als 2% des menschlichen Genoms codieren für Proteine, der Rest sind nicht codierende Se -quenzen, zu mehr als 50% repetitive Sequenzen. Die gesamte DNA einer Zelle macht deren Genom aus, die Menge der in RNA transkribierten Gene das Trans-kriptom und die Menge der in Proteine translatierten Gene das Proteom.

5.5 Struktur und biologische Bedeutung der RNA

Zellen enthalten wesentlich mehr RNA als DNA, außerdem sind die Funktionen der RNA wesentlich vielfältiger als die der DNA:4 Aufgrund ihrer Fähigkeit zur spezifischen Basenpaa-

rung nimmt RNA an der Codierung und Decodierung genetischer Information teil und ist damit ein essentiel-ler Bestandteil der Transkriptions- und Translations-maschinerie

4 Im Gegensatz zur DNA verfügen RNA-Moleküle über wichtige strukturgebende Eigenschaften und sind Be-standteile der Ribosomen, der Telomerase oder des signal recognition particle (SRP) (7 Kap. 6.2.11, 9.2.2)

4 RNA-Moleküle dienen als Katalysatoren. Sie knüpfen die Peptidbindung bei der ribosomalen Proteinbio-synthese, und sind am Vorgang des Spleißens der Prä-mRNA sowie der Prä-tRNA beteiligt

4 Eine Erkenntnis der letzten Jahre ist schließlich, dass RNA-Moleküle eine große Zahl regulatorischer Aufga-ben wahrnehmen, die sich auf alle Aspekte der Gen ex-pression erstrecken

. Tabelle 5.6 zeigt eine Einteilung der RNA-Moleküle nach funktionellen Gesichtspunkten. Dabei wird zunächst zwischen codierender und nichtcodierender RNA unter-schieden.

Codierende RNA. Messenger-RNAs (mRNA) dienen als Matrize bei der Proteinbiosynthese. Sie entstehen aus den Prä-mRNAs, den primären Transkripten der für Pro teine codierenden Gene (beim Menschen ca. 30.000–35.000). Die einzelnen Schritte dieser Reaktionsfolge sind komplex, da sie nicht nur die Anheftung einer Kappen-Gruppe und ei-

nes Poly-A-Endes beinhalten, sondern auch die Entfernung der Introns, die nicht für Proteine codieren (7 Kap. 8.3.3).

Nichtcodierende RNA mit strukturell/katalytischen Funk-tionen. Diese umfangreiche, nicht für Proteine co dierende Gruppe von RNA-Molekülen (noncoding RNA, ncRNA) nimmt entweder als struktureller Bestandteil oder als Kata-lysator an verschiedenen Aspekten der Genexpression teil:4 Transfer-RNAs (tRNAs) dienen nach Beladung mit

der jeweiligen Aminosäure als Adaptermolekül für die Proteinbiosynthese (7 Kap. 9.1.3). Da in Proteinen ins-gesamt 20 unterschiedliche Aminosäuren vorkommen können, muss die Minimalausstattung einer Zelle aus wenigstens 20 tRNA-Molekülen bestehen. In Wirklich-keit liegt diese Zahl aber höher, da für die einzelnen Aminosäuren eine unterschiedliche Zahl von Codons (Degeneration des genetischen Codes) vorkommt. Allen tRNA-Molekülen liegt ein gemeinsamer Bauplan zu-grunde. Sie bestehen aus je 65–110 Nucleotiden. Unter der Annahme, dass die maximal möglichen Basen-paarungen innerhalb eines einkettigen tRNA-Moleküls stattfinden, ergibt sich eine kleeblattförmige Struktur (. Abb. 5.27). Aus Röntgenstrukturanalysen weiß man allerdings, dass die verschiedenen Schleifen sehr eng anliegen, sodass sich insgesamt das Bild eines L-för-migen Stäbchens ergibt (7 Abb. 9.6 in Kap. 9.1.3)

4 Ribosomale RNA (rRNA) kommt in verschiedenen Fraktionen mit Sedimentationskoeffizienten zwischen 5 und 28 S und entsprechend unterschiedlichen Mole-kulargewichten vor. Sie ist ein integrierender Bestand-teil der Ribosomen und katalysieren bei der ribosoma-len Proteinbiosynthese die Knüpfung der Peptidbin-dung (7 Kap. 9.1.4 ). . Abbildung 5.28 zeigt als Beispiel die vollständige Basensequenz der 5 S rRNA der Ribo-somen menschlicher Zellen. Man erkennt, dass es sich

5163

. Tabelle 5.6. Klassifizierung der RNA

Typ Bezeichnung Funktion Besprochen in Kapitel

Codierende RNA Messenger RNA (mRNA) Matrize bei der Proteinbiosynthese 8.3, 9.1

Nicht codierende RNA (ncRNA)Strukturell katalytische Funktion

Transfer RNA (tRNA) Translation der genetischen Information 8.3.4, 9.1.3

Ribosomale RNA (rRNA) Strukturelement der Ribosomen 9.1.4

Katalysator bei der Knüpfung der Pep-tidbindung

9.1.4

small nuclear RNA (snRNA) Spleißen der Prä-mRNA 8.3.3

Strukturelement der Spleißosomen 8.3.3

small nucleolar RNA (snoRNA) Modifikation von RNA 5.5

7S-RNA im signal recognition particle-RNA (SRP)

Intrazellulärer Proteintransport 9.22, 6.2.11

Ribonuclease P-RNA Reifung der Prä-tRNA 8.3.4

Telomerase-RNA DNA-Synthese an den Telomeren 7.2.3

Nicht codierende RNA (ncRNA) Mikro-RNA (miRNA)small interfering RNA (siRNA)

Abbau von mRNA undHemmung der Translation

8.5.5, 7.4.4

Regulatorische Funktion Natürliche antisense-Transkription von Protein codierenden Genen (NAT’s)

Regulation der Genexpression 5.5

Xist-RNA Inaktivierung des X-Chromosoms 5.5

. Abb. 5.27. Schematische Darstel-lung der Struktur einer tRNA. Da die einzelnen Arme eng anliegen, ergibt sich in Wirklichkeit eher das Bild eines stäb-chenförmigen Gebildes. Pu = Purin; Py = Pyrimidin; DHU = Dihydrouridin;

= Pseudouridin; grün: Anticodon

5.5 · Struktur und biologische Bedeutung der RNA

164

5


hier um ein stäbchenförmiges Gebilde mit insgesamt 4 Schleifen handelt, wobei ein beträchtlicher Teil der Basen in gepaarter Form vorliegt

4 Small nuclear RNAs (snRNA) sind eine Klasse kleiner RNA-Moleküle aus je einigen hundert Nucleotiden), die sich im Zellkern befinden. Sie sind an den ver schiedens-ten Vorgängen beteiligt, vor allem am Spleißen der Prä-mRNA (7 Kap. 8.3.3). Sie sind immer mit Proteinen, zu small nuclear ribonucleoproteins (snRNP’s) assoziiert

4 Small nucleolar RNAs (snoRNA) sind eine Klasse kleiner RNA-Moleküle, die im Nucleolus lokalisiert sind. Zusammen mit Proteinen sind sie an der Modi-fikation von RNA-Molekülen beteiligt. Hierzu gehört die 2 -O-Methylierung von Riboseresten oder die Ein-fügung von Pseudouridinen

4 Die Ribonuclease P-RNA sowie die Telomerase-RNA dienen katalytischen Zwecken bei der Reifung der rRNA sowie der Verlängerung der Telomeren-DNA (7 Kap. 7.2.3)

Nicht codierende RNA mit regulatorischen Funktionen. Die Erkenntnis, dass nicht codierende RNA-Moleküle eine

Vielzahl von regulatorischen Funktionen im gesamten Be-reich der Genexpression haben können, ist neu. Aus der stän-dig wachsenden Zahl derartiger regulatorischer ncRNAs sollen stellvertretend vier Gruppen besprochen werden:4 Mikro-RNA (miRNA) sowie small interfering RNA

(siRNA) sind kleine, aus 20–30 Nucleotiden bestehende RNA-Moleküle, die aus größeren Vorläufern geschnit-ten werden. Sie dienen der Regulation der mRNA-Sta-bilität bzw. der Hemmung der Translation (7 Kap. 8.5.5)

4 Natürliche antisense-Transkripte (NAT’s) sind Trans-kripte von proteincodierenden Genen, die in antisense-Richtung synthetisiert wurden. Bisher sind im mensch-lichen Genom einige tausend derartiger Transkripte nachgewiesen worden. Man geht davon aus, dass sie die Gen expression der entsprechenden Gene regulieren können

4 Xist-RNA wird benötigt, um bei weiblichen Individuen eines der beiden X-Chromosome zu inaktivieren

Neben diesen im Zellkern codierten RNA-Spezies findet sich in geringen Mengen noch mitochondriale mRNA, rRNA und tRNA.

. Abb. 5.28. 5S rRNA menschlicher Zellen

In Kürze

Zur Expression der auf der DNA codierten Information ist deren Transkription notwendig. Die dabei entstehende RNA wird in verschiedene Klassen eingeteilt:4 mRNA entsteht aus den als Prä-mRNA bezeich neten

Transkripten der proteincodierenden Gene und dient als Matrize bei der Proteinbiosynthese

4 Nicht codierende RNAs mit strukturellen/kata-lytischen Funktionen. Zu ihnen gehören v.a. die als Adapter der Proteinbiosynthese dienende tRNA sowie die ribosomale RNA. snRNA sowie snoRNA haben katalytische Funktionen beim Spleißvorgang sowie der RNA-Modifikation. Ebenfalls kata lytisch aktiv ist die RNA der Ribonuclease P sowie der Telo-

merase. Die SRP-RNA ist am intrazellulären Protein-transport beteiligt

4 Nicht codierende RNAs mit regulatorischen Funk-tionen. Eine große Zahl nicht codierender RNAs hat regulatorische Funktionen. miRNA und siRNA sind kleine RNAs, die den Abbau von mRNA regulieren sowie die Translation hemmen können. Antisense-Transkripte von proteincodierenden Genen sind große RNA-Transkripte, die für die Regulation der Gen-expression benötigt werden. Darüber hinaus gibt es weitere große regulatorische RNAs, z.B. für die Inakti-vierung von X-Chromosomen

5165

5.6 Chemische und physikalische Eigenschaften von Nucleinsäuren

5.6.1 Reinigung und Charakterisierung von Nucleinsäuren

! Nucleinsäuren müssen in hochreiner Form aus Zellen extrahiert werden.

Nucleinsäuren liegen immer als Komplexe mit Proteinen vor. Die Abtrennung von den Proteinen kann durch Ex-traktion mit einer Phenol-Lösung erreicht werden, wobei die Proteine ausfallen und durch Zentrifugation entfernt werden können. Alternativ können Nucleinsäuren von Pro teinen auch durch Detergenzien wie Guanidinium-Hydrochlorid oder Salze in hohen Konzentrationen ab-getrennt werden. In allen Fällen werden die Nuclein-säuren anschließend durch Ausfällen mit Ethanol iso-liert. Alternativ lassen sich die Proteine auch enzyma-tisch mit Hilfe von Proteasen von den Nucleinsäuren abtrennen.

Gereinigte DNA und RNA müssen wegen des ubiqui-tären Vorkommens vor DNasen und RNasen vor uner-wünschtem Abbau geschützt werden. Daher werden die für die Handhabung der Nucleinsäuren benötigten Gefäße mit Chemikalien wie DEPC (Diethylpyrocarbonat) behandelt und autoklaviert, um so die DNasen und RNasen zu inak-tivieren.

Benötigt man reine DNA, so wird die Kontamination mit RNA durch Behandlung mit RNasen entfernt, benötigt man dagegen reine RNA, wird die Probe mit DNasen be-handelt.

! Für ihre Charakterisierung müssen Nucleinsäuren nach ihrer Größe aufgetrennt werden.

Die Auftrennung von Nucleinsäuren entsprechend ihrer Größe erfolgt durch Elektrophorese in plattenförmigen Agarosegelen. Hierbei ist die elektrophoretische Mobilität umgekehrt proportional zur molaren Masse der Nuclein-säuren. Das Prinzip des Verfahrens ist in . Abbildung 5.29a,b dargestellt.

Die einzelnen DNA-Banden können im Gel durch aro-matische Kationen wie z.B. Ethidiumbromid (. Abb. 5.29c) angefärbt werden.

! Nucleinsäuren können denaturiert und renaturiert werden.

Für ihre Rolle bei der Speicherung der genetischen Infor-mation muss die DNA eine große Stabilität aufweisen, die u.a. durch die Basenpaarungen in der Doppelhelix zustande kommt. Auch bei der RNA-Struktur spielen Basenpaarun-gen, allerdings innerhalb eines Einzelstrangs, eine wichtige Rolle. Andererseits sind strukturelle Veränderungen der DNA und RNA für die Erhaltung und Weitergabe der gene-tischen Information dringend erforderlich. Hierzu zählt die Trennung der DNA-Doppelstränge in Einzelstränge.

. Abb. 5.29a,b,c. Experimentelles Vorgehen bei der Agarose-Gelelektro-phorese. a Plattenförmige Agarosegele dienen als Träger für die elektrophore-tische Auftrennung von DNA-Stücken entsprechend ihrer Größe. Nach Been-digung der Elektrophorese wird das Gel in eine Lösung mit Ethidiumbromid getaucht, anschließend werden im UV-Licht die DNA-Banden sichtbar gemacht. b Mit Ethidiumbromid angefärbte DNA-Bruchstücke, die durch Behandlung der DNA des Phagen mit den Restriktions-endonucleasen HindIII (linke Spur),StaVIII (mittlere Spur) und AluI (rechte Spur) entstehen. c Struktur von Ethidium-bromid

5.6 · Chemische und physikalische Eigenschaften von Nucleinsäuren

166

5


Während in vivo diese Auftrennung durch spezifische Proteine vermittelt wird (7 Kap. 7.2.2, 8.3.2), ist dies bei ge-reinigten Nucleinsäuren durch physikalische Maßnahmen möglich. So können die Wasserstoffbrückenbindungen durch Erhitzen der DNA zum Schmelzen gebracht werden. Dieser Vorgang wird auch als Denaturierung bezeichnet (. Abb. 5.30). Auch in stark alkalischer Lösung kommt es zur DNA-Denaturierung. Die Schmelztemperatur der DNA hängt vom G/C-Ge-halt ab, da G/C-Paare drei, A/T-Paare aber nur zwei Was-serstoffbrück enbindungen ausbilden können. Die Schmelz-temperatur ist darüber hinaus von der Art des Lösungsmit-tels, der Ionenkonzentration und vom pH-Wert der Lösung abhängig.

Das Schmelzen der DNA geht einher mit einer Zu-nahme der UV-Absorption, was als hyperchromer Effekt bezeichnet wird. Aufgrund der vorhandenen π-Elektronen in den heterozyklischen Basen absorbiert DNA UV-Licht bei einer Wellenlänge von 260 nm. In der DNA-Doppel-helix ergeben sich Wechselwirkungen zwischen den Elek-tronen der übereinander liegenden Basen, was zu einer Verminderung der Absorption führt. Bei der Denaturie-rung gehen diese Wechselwirkungen verloren und die UV-Absorption entspricht dann derjenigen von Mononucleo-tiden. Denaturierung und Renaturierung der DNA kann daher bei 260 nm im Photometer verfolgt werden und ergibt das typische Bild einer DNA-Schmelzkurve (. Abb. 5.31). Als Schmelztemperatur Tm ist dabei diejenige Tem-peratur definiert, bei der die Hälfte der maximalen Absorp-tionszunahme erfolgt ist.

Beim raschen Abkühlen einer denaturierten DNA-Lösung bleibt die DNA denaturiert. Nur über allenfalls kurze Strecken können sich korrekte komplementäre Be-

reiche ausbilden und werden durch die rasche Tempera-turabsenkung quasi eingefroren. Hält man jedoch die Tem peratur der DNA-Lösung etwa 20–25°C unter der Tm-Temperatur, so können sich fehlerhaft gebildete Komple-mentärbereiche wieder trennen und erneut nach Partnern für die Basenpaarung suchen. Steht genügend Zeit für diesen Prozess zur Verfügung, so kommt es zur Ausbildung immer längerer komplementärer Bereiche und schließlich zur vollständigen korrekten Reassoziation zum DNA-Dop-pelstrang. Dieser Vorgang wird als DNA-Renaturierung bezeichnet.

Wasserstoffbrückenbindungen können nicht nur inter-molekular zwischen zwei DNA-Einzelsträngen, sondern auch intramolekular zwischen komplementären RNA-Be-reichen oder zwischen DNA und RNA ausgebildet werden. Grundsätzlich gelten die Regeln über das Schmelzen und Renaturieren der DNA auch für diese Wasserstoffbrücken-bindungen.

! Durch Blotten und Hybridisieren können Nucleinsäure-sequenzen identifiziert werden.

Die Ausbildung von Wasserstoffbrücken zwischen zwei komplementären DNA-Strängen, zwischen einem DNA-Einzelstrang und einem komplementären RNA-Strang oder zwischen zwei komplementären RNA-Strängen kann dazu benutzt werden, um komplementäre Bereiche oder ähn-

. Abb. 5.30. Denaturierung (Schmelzen) und Renaturierung der DNA

. Abb. 5.31. Schmelzkurve einer typischen DNA. Beim Erwärmen einer DNA-Lösung ergibt sich in einem Temperaturbereich zwischen 55° und 75°C eine Zunahme der Absorption bei 260 nm, gemessen als Extinktion E. Dieser Vorgang ist Ausdruck einer DNA-Denaturierung, die in diesem Temperaturbereich erfolgt

5167

liche Sequenzen in zwei unterschiedlichen Spezies oder in Geweben der gleichen Spezies aufzuspüren. Die reversible Ausbildung von Wasserstoffbrücken zwischen komple-mentären DNA- oder RNA-Abschnitten, die Hybridisie-rung, spielt in der modernen Molekularbiologie und damit in der Diagnostik von Erkrankungen, aber auch in der forensischen Medizin eine ganz wichtige Rolle.

Die Identifizierung einer bestimmten DNA-Sequenz oder eines bestimmten Gens unter vielen anderen Sequen-zen ist dann möglich, wenn man über eine komplementäre DNA-Sequenz verfügt, die für diese Zwecke speziell mar-kiert wurde. Dabei kann diese Sequenz aus einer anderen Spezies stammen oder auch für diese speziellen Zwecke im Labor synthetisch hergestellt werden. Die Identifizierung einer DNA mit einer DNA-Sonde wird nach Edwin Southern auch als Southern-Blot bezeichnet. Das Verfah-ren ist schematisch in . Abb. 5.32 dargestellt und umfasst folgende Schritte:4 Die nach erfolgter Elektrophorese im Agarosegel be-

findliche DNA wird mit Natronlauge denaturiert4 Anschließend wird das Gel mit einem Blatt Nitrozel-

lulosefolie bedeckt und mit einem Gewicht beschwert. Dadurch wird die Flüssigkeit aus dem Agarosegel zu-sammen mit der DNA durch die Nitrozellulose gepresst. Auf diese Weise entsteht ein naturgetreuer Abklatsch (blot) des Agarosegels auf der Nitrozellulose. Die nun einzelsträngige DNA ist auf der Nitrozellulose fest fixiert und lässt sich auch durch Waschen mit verschie-denen Puffern nicht mehr ablösen

4 Zum Auffinden einer spezifischen Sequenz der zu untersuchenden DNA wird die Nitrozellulose in einer Lösung inkubiert, die als Sonde eine markierte einzel-strängige DNA (oder RNA) mit der komplementären Sequenz zur gesuchten DNA enthält. Wenn die für die Hybridisierung notwendige Renaturierungstemperatur mehrere Stunden eingehalten wird, kann die markierte

. Abb. 5.32. Experimentelles Vorgehen bei der Herstellung und Entwicklung eines Southern-Blot. Ein DNA-Gemisch wird durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt. Das Agarosegel wird danach in Natronlauge gewaschen und die DNA auf Nitrocellu lose transfe-

riert. Der Nachweis einer gesuchten DNA-Sequenz (rot) wird durch Hybridisierung in einer Lösung durchgeführt, die eine komplementäre Sequenz als markierte Sonde enthält. Das dadurch entstehende Hybrid kann anhand der spezifischen Markierung nachgewiesen werden

Sonde an die gesuchten Sequenzen auf der Nitrozel-ulose binden und lässt sich dann anhand ihrer spezi-fischen Markierung leicht nachweisen. Sehr häufig verwendet man als Sonde DNA-Moleküle, in die das radio aktive Isotop 32P eingebaut ist. Nicht-radioaktive Ver fahren beruhen auf der Markierung mit verschie-denen Chromophoren

Die für die oben beschriebene Hybridisierung verwen-deten Sonden können Isolate aus entsprechenden Gen-banken (7 Kap. 7.4.3) sein. Ein sehr erfolgreiches Verfahren zur Herstellung spezifischer Sonden ist schließlich die Ver stärkung der gewünschten DNA-Abschnitte aus bio-logischem Material durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR, 7 Kap. 7.4.3). Schließlich ist es auch möglich, che-misch synthetisierte Oligonucleotide einzusetzen, die auto-matisiert hergestellt werden.

Die Hybridisierungstechnik kann auch dazu benutzt werden, um RNA-Moleküle zu identifizieren. Eine solche Variante wird als Northern-Blot bezeichnet.

! Nucleasen sind Nucleinsäure-abbauende Enzyme.

Enzyme, die Nucleinsäuren abbauen, sind Phosphodies-terasen, da sie die Phosphodiesterbindungen zwischen zwei Nucleotiden spalten. Man bezeichnet diese Enzyme auch als Nucleasen oder wenn sie für DNA spezifisch sind, als DNasen, wenn sie für RNA spezifisch sind als RNasen. Nucleasen werden in Endonucleasen und Exonuclea-sen eingeteilt (. Abb. 5.33):4 Endonucleasen können die Nucleinsäure an jeder be-

liebigen Stelle in kleinere Bruchstücke spalten4 Exonucleasen bauen die Nucleinsäure von einem Ende

des Moleküls her ab. Sie unterscheiden sich in ihrer Spezifität, indem sie die Nucleotide entweder in 5 -3 - oder nur in 3 -5 - Richtung abspalten


168

5


Je nachdem ob eine Nuclease proximal (p) oder distal (d) zu dem Nucleotid spaltet, welches an der 3 -Position der attackierten Bindung lokalisiert ist, unterscheidet man Nucleasen des p- bzw. d-Typs. Beim d-Typ entstehen Nu-cleotide mit einem 3 -Phosphatende, beim p-Typ solche mit einem 5 -Phosphatende.

Nucleasen werden bei der Verdauung der Nahrungs-Nucleinsäuren im Intestinaltrakt benötigt, aber auch für den Abbau intrazellulärer Nucleinsäuren. Sie spielen ferner eine wichtige Rolle bei der Apoptose, dem programmierten Zelltod, bei dem massiv DNA abgebaut wird.

Der Verdau von DNA mit Endonucleasen kann für die Isolierung und Identifizierung derjenigen DNA-Sequenzen verwendet werden, an die spezifische DNA-bindende

Proteine, z.B. Transkriptionsfaktoren, binden. Das hierbei verwendete Verfahren wird als DNase protection assay be-zeichnet (DNase footprinting, . Abb. 5.34). Zu diesem Zweck wird das infrage kommende DNA-Stück an einem Ende mit dem radioaktiven Isotop 32P markiert und an-schließend eine Hälfte der Probe mit dem Transkriptions-faktor inkubiert. Anschließend werden beide Hälften der Probe für eine begrenzte Zeit mit DNase I behandelt. Da diese Endonuclease DNA statistisch spaltet, ergibt sich ein Gemisch aus verschieden langen Bruchstücken. Diese kön-nen mit Hilfe der Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und anhand der radioaktiven Markierung durch Autoradio-graphie nachgewiesen werden. In dem nicht vorbehan delten Ansatz findet sich deshalb das Bild einer »Leiter«. In dem mit dem DNA-bindenden Protein vorbehandelten Ansatz zeigt sich in der »Leiter« eine Lücke, da das Bindeprotein die DNA vor dem Abbau durch die DNase geschützt hat.

! Restriktionsendonucleasen schneiden die DNA an definierten Positionen.

Eine besondere Bedeutung als Werkzeuge im Rahmen der Gentechnologie haben die sog. Restriktionsendonucleasenerlangt, die nur bei Bakterien vorkommen. Bakterien schüt-zen sich mit Hilfe dieser Enzyme vor dem Eindringen frem-der DNA. Ihre eigene DNA wird nämlich mit Hilfe einer Reihe spezifischer Methylasen durch Anheftung von Me-thylgruppen modifiziert. Fremde, in die Bakterienzellen eingedrungene DNA (z.B. durch Viren) unterliegt dieser Modifikation nicht und wird infolgedessen durch die von bakteriel len Zellen gebildeten Restriktionsendonucleasen abgebaut.

Restriktionsendonucleasen sind für die Gentechnologie besonders interessant, weil sie innerhalb einer Sequenz von 4 bis 8 Nucleotiden hochspezifisch schneiden. Oft handelt

P

P P

. Abb. 5.34. Vorgehen beim DNase protec-tion assay. Bei diesem auch als DNase foot-printing bezeichneten Verfahren wird die zu untersuchende DNA zunächst radioaktiv markiert und danach in An- bzw. Abwesen-heit eines DNA-bindenden Proteins mit DNase I verdaut. Da die Bindung von Protein die DNA vor dem Verdau schützt, ergibt sich im anschließenden Trenngel eine Lücke. (Weitere Einzelheiten 7 Text)

. Abb. 5.33. Spaltungsspezifität von Nucleasen.(Einzelheiten 7 Text)

5169

es sich bei der Erkennungssequenz um ein Palindrom (7 Kap. 5.3.2). In einem palindromischen Bereich eines DNA-Doppelstrangs ist die Nucleotidsequenz, jeweils vom 5 -Ende gelesen, in jedem Einzelstrang gleich und der DNA-Abschnitt besitzt eine zweizählige Symmetrieachse . Abb. 5.35).

Der besondere Vorteil von Restriktionsendonucleasen ist, dass DNA-Präparationen mit ihrer Hilfe in Bruchstücke gespalten werden können, bei denen die Basensequenzen an den Enden entsprechend ihrer jeweiligen Spezifität ge-nau definiert sind. Sind die Schnittstellen der Restriktions-endonucleasen versetzt, entstehen DNA-Fragmente mit überhängenden Einzelstrangbereichen (sticky ends). Diese können mit anderen DNA-Fragmenten assoziieren, die mit demselben Restriktionsenzym geschnitten wurden. Einige Restriktionsenzyme spalten die DNA an der Symmetrie-achse und produzieren dadurch DNA-Fragmente mit glatten Enden (blunt ends). Über die Verwendung von Restriktionsendonucleasen in der Gentechnologie 7 Kap. 7.4.

Restriktionsenzyme werden in der forensischen Me-dizin aber auch in der genetischen Diagnostik eingesetzt, um schnell Sequenzpolymorphismen (kleine Veränderun-gen in sonst hochkonservierten Sequenzen) oder Punkt-mutationen nachzuweisen. Wenn man Restriktionsenzyme benutzt, die in diesen Bereichen schneiden, werden sie bei Punktmutationen in der Erkennungssequenz nicht mehr schneiden. Die daraus resultierenden Größenunterschiede in den DNA-Fragmenten lassen Rückschlüsse auf die Iden-tität bzw. Verschiedenheit der DNA zu.

! Restriktionsendonucleasen sind für die Kartierung großer DNA-Stücke wichtig.

. Abb. 5.35. Schnittstellen und Symmetrieachsen für einige Restriktionsenzyme. Die Namen der Restriktionsendonucleasen leiten sich von den Bakterienstämmen ab, aus denen sie isoliert wurden (z.B. EcoRI aus einem entsprechenden Stamm von E. coli).Die Pfeile geben die Schnittstellen wieder, die Punkte die Symmetrie-achsen

Größere DNA-Stücke müssen häufig »kartiert« werden, um sie entsprechend ihrer Sequenz zuordnen zu können. Das geschieht durch Verdauung mit Restriktionsendonuklea-sen. Das Problem der Zuordnung der dabei entstehenden Bruchstücke in die richtige Reihenfolge wird dadurch gelöst, dass das für eine Direktsequenzierung zu große DNA-Stück zunächst mit Hilfe mehrerer Restriktionsendo -nucleasen in definierte Bruchstücke gespalten wird. Diese werden mit Hilfe der Agarose-Gelelektrophorese entspre-chend ihrer Größe separiert. Aus dem Muster der Bruch-stücke werden sog. Restriktionskarten erstellt, die die Bruch-stücke relativ zueinander zuordnen. (. Abb. 5.36). . Abb. 5.37 zeigt eine Restriktionskarte für das 5243 Basenpaare um-fassende Genom des DNA Virus SV40. Restrik tionskarten liefern das Gerüst, um spezielle Basensequenzen oder Gene

. Abb. 5.36. Vorbehandlung einer DNA zur Sequenzaufklärung.Die zu sequenzierende DNA wird mit wenigstens zwei unterschied-lichen Restriktionsendonucleasen einzeln und im Doppelverdau geschnitten und die einzelnen Bruchstücke durch Agarose-Gelelektro-phorese separiert. Anhand der Fragmentgrößen kann dann die rela-tive Lage der Bruchstücke zueinander bestimmt werden. Nach der Sequenzierung der Bruchstücke kann anschließend die komplette Sequenz anhand der überlappenden Partialsequenzen ermittelt werden


170

5


zu lokalisieren, aber auch um nützliche Informationen zur Sequenzierung kompletter Genome zu erhalten.

5.6.2 Sequenzierung von DNA

! Basensequenzen der DNA werden mit Hilfe der Ketten-abbruchmethode bestimmt.

Für die Sequenzaufklärung auch sehr großer DNA-Stücke wurde durch Alan Maxam und Walter Gilbert ein chemisches und durch Frederick Sanger ein enzyma-tisches Verfahren eingeführt. Das enzymatischer Verfah-ren hat sich inzwischen durchgesetzt und kann automa-tisiert werden, weswegen auch sehr große Genome wie das menschliche in relativ kurzer Zeit sequenziert werden konnte.

Die DNA-Sequenzierung nach der von Frederick Sanger entwickelten enzymatischen Kettenabbruchmethode um-fasst folgende Schritte (. Abb. 5.38):

4 Der zu sequenzierende DNA-Abschnitt wird an seinem 3 -Ende mit einer komplementären DNA-Matrize, einem sog. Primer, hybridisiert. Dieser sollte eine Länge von 15–20 Basen haben

4 Mit Hilfe der DNA-Polymerase I (7 Kap. 7.2.3) wird an den Primer ein zum sequenzierenden DNA-Abschnitt komplementärer Strang synthetisiert. Hierzu werden die vier benötigten Basen als Desoxyribonucleosidtri-phosphate zugesetzt

4 Ein sequenzspezifischer Kettenabbruch wird dadurch erzwungen, dass der Sequenzierungsansatz in vier gleiche Teile geteilt wird und in jeden Ansatz eine ge-ringe Menge eines entsprechenden 2 ,3 -Didesoxyri bo-nu c leosid triphosphats gegeben wird . Abb. 5.39. Wird dieses Nucleotid anstelle des normalen Nu cleotids in die wachsende Polynucleotidkette eingebaut, so wird das Kettenwachstum beendet, da keine freie 3 -OH-Gruppe für die Polymerisierung mehr vorhanden ist

4 Ist die Menge an Didesoxyribonucleosidtriphosphat gering genug, so entsteht ein ganzer Satz verkürzter Ket-

. Abb. 5.37. Restriktionskarte des Simian Virus 40 (SV40). Der innerste Ring zeigt die Schnittstellen von Restriktionsendonucleasen, die das Genom nur an einer Stelle schneiden. Bezugspunkt ist die

Schnittstelle von EcoRI (12 Uhr). In den anderen Ringen sind, der Größe nach alphabetisch geordnet, die Schnittstellen anderer Restrik-tionsendonucleasen dargestellt. (Nach Nathans D 1979)

5171

ten, welche auf einem Sequenziergel elektrophoretisch ihrer Länge nach aufgetrennt werden können

4 Zur Detektion ist eines der Desoxyribonucleosidtri-phosphate radioaktiv markiert. Durch Auflegen eines Röntgenfilms wird ein solches Sequenziergel entwickelt und anschließend die Sequenz abgelesen

Wegen der Verwendung der DNA-Polymerase ergibt sich mit der Kettenabbruchmethode allerdings die Sequenz des komplementären Strangs. . Abbildung 5.38 zeigt schema-tisch das Autoradiogramm eines derartigen Sequenziergels und die daraus abgeleitete Sequenz.

Für die automatisierte DNA-Sequenzierung ist eine spezielle Variante der Kettenabbruchmethode entwickelt worden (. Abb. 5.40). Sie beruht auf der Verwendung von primern, die mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind. Ver-wendet man für jedes der vier Nucleotide einen primer mit jeweils einem anderen Fluoreszenzfarbstoff, so genügt es, anschließend die vier Ansätze zu mischen und in einer Spur des Sequenziergels aufzutrennen. Mit einem spezifischen Laser-Photometer, welches zwischen den vier Fluoreszenz-farbstoffen unterscheiden kann, lässt sich dann die Sequenz automatisiert ablesen. Für Projekte wie die Sequenzierung des Genoms einfacher Eukaryoter oder aber des humanen Genoms war die Verwendung derartiger Techniken eine unabdingbare Voraussetzung.

. Abb. 5.39. Didesoxy-ATP als Beispiel für ein Didesoxynucleo-sidtriphosphat


. Abb. 5.38. Prinzip der DNA-Sequenzierungstechnik nach Sanger und Coulson. Einzelsträngige DNA mit einem bekannten 3 -Ende (Behandlung mit einer Restriktionsendonuclease) wird in vier Ansätze verteilt. In jeden Ansatz kommt ein dem 3 -Ende komplemen-täres Oligonucleotid, ein Gemisch aus dATP, dTTP, dCTP, dGTP sowie,

P-dATP zur radioaktiven Markierung. Anschließend wird zu jedem Ansatz eine genau bemessene Menge eines der vier Didesoxynucleo-sidtriphosphate zusammen mit DNA-Polymerase I gegeben. Dies führt bei der DNA-Polymerisierung zum Kettenabbruch an spezifi-schen Positionen. Die vier Ansätze werden anschließend in einem Sequenziergel getrennt und die Sequenz abgelesen

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5


In Kürze

Für die Molekularbiologie und Gentechnik stellt die Entwicklung geeigneter Methoden zur Reindarstellung von DNA- und RNA-Molekülen eine ganz wesentliche Voraussetzung dar. Nucleinsäuremoleküle können durch entsprechende Nucleasen in Bruchstücke fragmentiert werden, wobei für die DNA besonders die Spaltung mit Restriktionsendonucleasen von großer Bedeutung ist, da hierbei Enden mit definierter Basensequenz entstehen. Fragmente von Nucleinsäuren können elektrophoretisch mit Hilfe der Agarose-Ge lelektrophorese entsprechend ihrer Größe aufgetrennt werden. Mit Hilfe von markier-ten Sonden gelingt durch Hybridisierung die Lokalisa-tion spezifischer Basen sequenzen in diesen Fragmenten. Die hierfür gängigsten Verfahren sind der Southern-Blot und der Northern-Blot. Von besonderer Bedeutung sind Verfahren zur DNA-Sequenzierung. Bei der heute allge-mein üblichen Kettenabbruchmethode wird mit Hilfe der DNA-Polymerase eine Replikation des zu sequenzie-renden DNA-Stückes durchgeführt, wobei durch Zugabe von Didesoxynucleosidtriphosphaten sequenzspezifi-sche Bruchstücke erzeugt werden.

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Links im Netz7 www.lehrbuch-medizin.de/biochemie

. Abb. 5.40. Automatisierte DNA-Sequenzierung. Einzelsträngige DNA wird in 4 Ansätze verteilt. Zu jedem Ansatz werden anschließend ein mit einem jeweils unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoff markier-ter, zum 3 -Ende komplementärer Primer sowie ein Gemisch aus den 4 Desoxyribonucleosid-Triphosphaten gegeben. Nach anschließender Zugabe der Didesoxyribonucleosid-Triphosphate wie in . Abb. 5.38 wird die Reaktion mit DNA-Polymerase gestartet. Nach Beendigung der Reaktion werden die 4 Ansätze vereinigt, auf einer Spur des Se-quenziergels aufgetrennt und mittels eines speziellen Laser-Fluoro-meters die Fluoreszenz der einzelnen Bruchstücke vermessen. Die komplementäre Basensequenz kann direkt abgelesen werden

5 - Nucleotide und Nucleinsäuren

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