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Analytische Methoden der Biologie SS097 Klonierung und Gentechnik

Modul 2303-021 1

Institut für PhysiologieFachgebiet Biosensorik

7 Klonierung und Gentechnik


Restriktion und Ligation:Restriktion und Ligation:Grundlagen der Klonierung


Modul 2303-021 2


Restriktion und LigationVerknüpfung von Fragmenten unterschiedlicher DNA‐Herkunft


Restriktion und LigationDie Ligationsreaktion

3‘ 5‘3‘‐OH

HO‐3‘

5‘P‐

‐P5‘

3‘‐OH 5‘‐OH


Modul 2303-021 3


Restriktion und LigationDer Ligationsansatz

• 50 ng geschnittener, aufgereinigter Plasmidvektor• 4‐5 x (stöchiometrisch) Insert• Ligasepuffer (mit ATP)• Ligase• mit Wasser auf 12 µl auffüllen

Inkubation über Nacht bei 16 °C


DNA‐Moleküle können rekombiniert werdenKlonierung von rekombinanter DNA

Ausplattieren


Modul 2303-021 4


Restriktion und LigationDie MCS des Plasmids pUC18


in silico‐Planung von Klonierungen

http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php


Modul 2303-021 5








Modul 2303-021 6





NukleinsäurehybridisierungNukleinsäurehybridisierung


Modul 2303-021 7


NukleinsäurehybridisierungDenaturierung und Renaturierung


NukleinsäurehybridisierungFISH: Fluorescent in situ Hybridization

• dient der chromosomalen Lokalisation von Sequenzabschnitten

• Verwendung fluoreszenzgekoppelter Markersonden

Menschliche Metaphasechromosomen;Anfärbung spezifischer Regionen des Chromosomenpaars 22

http://www.kompetenznetz‐leukaemie.de/sites/kompetenznetz‐leukaemie/content/e50/e3922/e5218/e10615/e11136/e11195/molzytabb1.gif


Modul 2303-021 8


NukleinsäureblottingKapillarblot


NukleinsäureblottingZoo‐Blot

(Fotografie von Dr. Marion Jurk)


Modul 2303-021 9


NukleinsäureblottingAufbau einer Slot‐ und Dot‐Blotapparatur


DNA‐Microarrays

• Prinzip der Hybridisierung liegt zugrundePrinzip der Hybridisierung liegt zugrunde

• gleichzeitige Untersuchung der Expression vieler Gene in einer Probe


Modul 2303-021 10


DNA‐MicroarraysAufbau eines Microarrays

A AA A

ATTA

AC

CG

GA

AAT

TAA

CC

GG

AA

ATTA

AC

CG

GA

A

ATTA

AC

AG

GA

ATA

AC

AG

GA

AAT

TAA

CA

GG

AA

ATTT

AC

AG

GA

AAT

TTA

CA

GG

AA

ATTT

AC

AG

GA

A

ATC

TAC

AG

GA

ATC

TAC

AG

GA

AAT

CTA

CA

GG

AA

A AA AA

ATC

TAC

CC

AG

GA

AAT

CTA

CC

CA

GG

AAT

CTA

CC

CA

GG

AA

TCTA

CG

CC

AG

GA

ATC

TAC

GC

CA

GG

AA

TCTA

CG

CC

AG

GA

A

GG

AA

GG

AA

GG

AA

1

GAT

AT GG

AT

AAT

T AAT

A

ATTT

AC

AG

GA

AAT

CTA

CA

GG

AAT

CTA

CA

GG

A AT AT AT

AA

CG

CC

AG

AA

CG

CC

AG

TAA

CG

CC

AG

A B C

2

3

ATTA

AC

AG

ATTA

AC

AG

GA

ATTA

AC

AG


DNA‐MicroarraysDurchführung eines DNA‐Microarray‐Experiments

Isolierender mRNA

cDNA‐Synthese


Modul 2303-021 11


Synthese von cDNA

• cDNA = copy DNA

• mRNA‐Sequenz in Form von DNA

• keine Introns



Microarray

Isolierender mRNA

Fluoreszierende cDNA mit dem Microarray hybridisieren

Markierung dercDNA mit Fluoreszenz‐

farbstoffen

cDNA‐Synthese


Modul 2303-021 12



Scannen Datenanalyse

LegendUnflaggedNorm & UnflaggedGoodNorm & GoodBadNorm & BadAbsentNorm & AbsentNot FoundNorm & Not FoundSelectedNorm & Selected

F635

Med

ian

100

1000

10000

100000

F532 Median100 1000 10000 100000


DNA‐MicroarraysVerschiedene Arten von Microarrays


Modul 2303-021 13


MutageneseMutagenese


Mutageneseortsgerichtete Mutagenese• die zu mutagenisierende Sequenz muss bereits bekannt sein• die zu mutagenisierende Sequenz muss bereits bekannt sein• man sollte wissen, welche Mutation man einführen will• es funktioniert am besten, Punktmutationen einzuführen, da man mit Primernarbeitet:

Primer-Templat-Duplex

5'-cgatcccattggcgccaagcgctcctc-3'||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||

gaggctagggtaaccgaggttcgcgaggaggta

Serin Alanin

• man untersucht also die Auswirkungen von einzelnen oder wenigenAS‐Austauschen


Modul 2303-021 14


Mutageneseortsgerichtete Mutagenese


MutageneseZufällige Mutagenese mittels mutagener Substanzen

• wird häufig verwendet, wenn man Gene finden will, die an einem bestimmtenProzess beteiligt sind

• Problem: Mutationen sind zufällig und deshalb müssen viele mutagenisierteIndividuen untersucht werden

• Vorbereitung der Versuche teilweise aufwendig• Substanzen, die für die Mutagenese eingesetzt werden, sind stark gesundheits‐

hädli hschädlich


Modul 2303-021 15


MutageneseZufällige Mutagenese mittels mutagener Substanzen

+/+* x +/+Ethylmethansulfonat (EMS):Punktmutationen von G nach A oder C nach T

+/+

+/+* x +/+*

+*/+*

nach A oder C nach T

Screening


Einbringen von DNA in Zellen:Einbringen von DNA in Zellen: Transformation und Transfektion


Modul 2303-021 16


Einbringen von DNA in Bakterien: TransformationTransformation chemisch kompetenter Zellen

Plasmid‐DNA zukompetenten Zellen

geben10 min auf Eis

1 min 42 °CHitzeschock

Zugabe vonMedium

1 h 37 °C

geben

37 °C über NachtAusplattieren


Einbringen von DNA in Bakterien: TransformationTransformation durch Elektroporation

Stromquelle

Deckel

Küvette

ElektrodenElektroden

elektrische Kontakte

Zellsuspension

http://en.wikipedia.org/wiki/Electroporation


Modul 2303-021 17


Einbringen von DNA in eukaryotische Zellen: Transfektionchemische Reagenzien: DEAE‐Dextran

• DEAE‐Dextran: kationisches Polymer• assoziiert mit negativ geladener DNA• die positiven Ladungen erlauben der negativ geladenen Zellmembran zu kommen

• Aufnahme wahrscheinlich durchAufnahme wahrscheinlich durch Endocytose


Einbringen von DNA in eukaryotische Zellen: Transfektionchemische Reagenzien: Calciumphosphat

Plasmid‐DNACalciumchlorid

Phosphat‐Puffer

• Calciumphosphat bildet mit DNA ein Präzipitat

• das Präzipitat wird von den Zellen über Endozytose oder Phagocytoseaufgenommen

• Calciumphosphat hemmt möglicher‐weise Nukleasen

20 min 2 – 12 Std.Untersuchung


Modul 2303-021 18


Einbringen von DNA in eukaryotische Zellen: Transfektionchemische Reagenzien: Liposomenmethode

EndozytosePlasmid-vektor-DNA

Endosom freigesetzteDNA

Zellmembran

Lipofection-Reagenz

DNA-Lipid-Komplex


Einbringen von DNA in eukaryotische Zellen: Transfektionphysikalische Methoden:

• direkte Mikroinjektion

• Elektroporation

• biolistische Methode mittels Genegun


Modul 2303-021 19


Einbringen von DNA in eukaryotische Zellen: TransfektionTransiente und stabile Transfektion

transiente Transfektion: Vektor wird nicht in das Wirtsgenom integriert, Transgenwird nur transient exprimiert

stabile Transfektion: Transgen integriert ins Wirtsgenom; das ist selten und wird durch Cotransfektion mit einem Resistenzgen erreicht


Einbringen von DNA in eukaryotische Zellen: TransfektionMit einem GFP‐Vektor transfizierte S2‐Zellen


Modul 2303-021 20


Einbringen von DNA in Organismen:Einbringen von DNA in Organismen: Herstellung transgener Tiere


Einbringen von DNA in OrganismenHerstellung transgener Tiere am Beispiel von Drosophila

Duplikation der Insertionsstelle

Transposase

Helferplasmid5‘ Repeat

3‘ Repeat+

Insertionsstelle

Transgen Marker

Transposition

P‐Element‐Vektor


Modul 2303-021 21



Syncytium

Polzellen-Knospung

Helferplasmid undP-Element-Vektor mitwhite+-Markergen

http://dev.biologists.org

Zellularisierung

x




Modul 2303-021 22


Einbringen von DNA in OrganismenHerstellung transgener Tiere am Beispiel der Maus

PCR‐Analyse oder Southern Blot der DNA


k k d k k d h ikknock‐out‐ und knock‐down‐Techniken


Modul 2303-021 23


knock‐out und knock‐down Technikenknock‐out durch homologe Rekombination

neo: vermittelt Neomycin‐Resistenztk (Thymidinkinase): vermitteltSensitivität gegenüber Ganciclovir


knock‐out und knock‐down Technikenknock‐out durch homologe Rekombination


Modul 2303-021 24


knock‐out und knock‐down TechnikenRNAi (RNA interference)


knock‐out und knock‐down TechnikenRNAi (RNA interference)

http://www.nature.com/focus/rnai/animations/index.htl

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