Physikpraktikum für PharmazeutenUniversität RegensburgFakultät Physik

9. Versuch: Spektralphotometer

1 Einführung

Im achten Versuch haben wir gelernt, dass ein Lichtstrahl, welcher durch ein Ensemblevon Streuzentren propagiert, exponentiell seine Intensität verliert. Das heißt die Inten-sität folgt der e-Funktion I = I0e

−x/l. Die Dämpfungskonstante l (welche wir als ε · cidentifizierten) gibt uns dabei die Länge an bei der das Licht um den Faktor e gedämpftwurde. Diese hängt dabei von den speziellen Streumolekülen und deren Konzentrationab. Wie erwartet machten wir im vorherigen Versuch eine sehr grobe Näherung, die wirin diesem neu betrachten wollen: Wir hatten alle Frequenzen des sichtbaren Spektrumsin der selben Weise betrachtet. In anderen Worten haben wir angenommen, dass dasLicht, welches durch die Substanz scheint, einfach nur gedimmt wird und dabei weißbleibt.Wie Sie bereits wissen sind die meisten Substanzen, die Licht streuen, farbig. Das ist einklares Indiz darauf, dass die „Konstante“ ε gar keine Konstante, sondern eine Funktionder Frequenz ist. Dies sind gute Neuigkeiten. Eine Funktion beinhaltet mehr Informatio-nen als eine Konstante. Die Funktion ε(ω) (wobei ω die Lichtfrequenz ist, bzw. äquivalentε(λ) mit der Wellenlänge λ) stellt in der Analyse einen nützlichen Fingerabdruck der Sub-stanz dar, weswegen die Spektroskopie in der Biologie und Chemie so wichtig ist. DieFunktion ε wird Extinktionskoeffizient genannt. Manchmal wird auch ein anderer Ko-effizient, nämlich der Absorptionskoeffizient, genutzt. Der Unterschied zwischen beidenKonzepten ist nur gering. Die Moleküle der Zielsubstanz können Licht absorbieren oderstreuen. Beides, Streuung und Absorption, führt zur Extinktion (Dämpfung) des trans-mittierten Lichts, welche die Größe ist, die wir messen. In vielen Situationen (wie z.B.im heutigen Fall) ist die Streuung des Lichts vernachlässigbar, wodurch die Absorptionund die Extinktion im Wesentlichen zu austauschbaren Begriffen werden.Daher müssen Sie sich merken, dass alles was wir im letzten Versuch gelernt haben, nurfür eine spezifische Frequenz ihre Richtigkeit behält. In diesem Versuch werden wir einespezielle Apparatur - ein Spektralphotometer - benutzten, um eine einzelne Wellenlängeauszuwählen und so ε(λ) zu studieren. Nachdem wir verstanden haben wie ein Spek-tralphotometer funktioniert, werden wir das vielleicht wichtigste Molekül untersuchen,welches Licht absorbiert: das Chlorophyll.

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2 Theorie

2.1 Lambert’sches GesetzIm vorherigen Versuch haben Sie bereits die Lichtschwächung durch eine Lösung vonChlorophyll in Ethanol als Funktion der Konzentration der Chlorophyll gemessen. Wirhaben das Lambert-Beer Gesetz benutzt:

I(x) = I0 · e−x·c·ε (2.1)

wobei I die Lichtintensität als Funktion der Position x, I0 = I(x = 0) die Lichtinten-sität vor der Küvette, c die Konzentration der gelösten Substanz und ε der molareExtinktion- oder Absorptionskoeffizient, eine Materialkonstante, die die Absorp-tionseigenschaften1 eines Materials beschreibt, sind. Der molare Absorptionskoeffizienthat dementsprechend die Einheit [l/(mol· cm)].Oft nennt man das Produkt x · c · ε Absorptionskoeffizient2 E . Wir können dann die

Gl. 2.1 so schreiben

E = ε · c · x = − ln(I

I0

). (2.2)

Bei Chemikern wird handelsüblich der Faktor E nicht auf den natürlichen, sondern aufden dekadischen Logarithmus bezogen3

Edec = − log10

(I

I0

). (2.3)

1Pro Einheit der Konzentration, das heißt der Absorptionskoeffizient für eine 1 mol/cm3 Lösung.2Eigentlich ist E ≡ c · ε, aber hier ist x = 1 [cm], deswegen sind beide Definitionen gleichwertig. E istder Absorptionskoeffizient, während ε der molare Absorptionskoeffizient ist.

3D.h., der Extinktionskoeffizient ε wird in der Literatur durch Gl. 2.3 statt Gl. 2.2 definiert.

3

3 Versuchsaufbau

3.1 Prinzip des Photometers

D

Glühlampe

weißes Licht

Se

Sa

Hohlspiegel

Hohlspiegel

planebene Spiegel

Gitter

Detektor

Küvette (mit der gelösten Substanz)

Küvette (ohne die gelöste Substanz)

monochromatisches Licht

10

11

2

3

4

5 6

7

9

12

8 13

Abbildung 3.1: Plan des Spektralphotometers.

Die Küvettenwand und das Lösungsmittel sind nie perfekt transparent. Deswegenmuss man zwei Küvetten messen, wenn man den Absorptionskoeffizient bestimmen will,eine mit und eine ohne die gelöste Substanz. Dann werden die zwei gemessene Werteverglichen, um nur den Effekt der gelösten Substanz zu ermitteln (wie in Absatz 4erklärt). In dem Gerät hat man die Möglichkeit, verschiedene Küvetten zu bewegen unddie jeweils Gewünschte im Strahlengang zu positionieren.Das weiße Licht einer Glühlampe wird mit Hilfe eines Hohlspiegels L1 auf den Ein-

trittsspalt Se fokussiert. Der planebene Spiegel lenkt das Licht auf den zweiten Hohl-spiegel. Dieser Hohlspiegel macht das divergente Strahlbündel parallel. Dieses paralleleund weiße Strahlbündel trifft das Gitter. Über das Gitter werden verschiedene Wellen-längen des Lichts in unterschiedlichen Richtungen durch Interferenz gebeugt. Nur daskonvergente Lichtbündel einer bestimmen Wellenlänge (Farbe) trifft auf die Öffnung desAustrittsspalt Sa und wird durchgelassen. Lichtbündel mit anderen Wellenlängen treffen

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auf die Spaltbacken und werden ausgeblendet (durch Verschieben des Austrittsspaltskönnte man eine andere Farbe auswählen). Die durch den Austrittsspalt durchgelasseneLichtintensität wird, nachdem sie die Küvette mit der zu vermessenden Lösung durch-strahlt hat, mit einem Photometer (Silizium-Photodiode) gemessen. Man kann bis zuvier verschiedene Küvetten im Küvettenständer positionieren. Anstatt den Austrittss-trahl seitlich zu verschieben, um eine andere Wellenlänge auszuwählen, wird beim Git-termonochromator das Gitter gedreht: es wird dann Licht einer anderen Wellenlänge aufden fest montierten Austrittsspalt fokussiert und anschließend durch die Probe geschickt.

3.2 Aufbau des PhotometersDas Photometer besteht aus mehreren Einzelteilen, um einen optimalen Strahlengangzu ermöglichen. Der Aufbau ist in Abb.3.2 gezeigt. Rechts oben im Bild befindet sichdie Glühbirne (2) und ein Spiegel (3). Das Licht der Glühlampe breitet sich in alle Rich-tungen aus und nur ein kleiner Teil trifft auf den Hohlspiegel (3), der das Licht aufden Eintrittspalt Se (4) fokussiert. Der planebene Spiegel (5) hinter dem Eintrittsspaltdient lediglich dazu, den Lichtstrahl umzulenken, sodass das gesamte Photometer aufeinem engeren Raum montiert werden kann. Über den Hohlspiegel (6) wird das divergen-te Lichtbündel konvergent gemacht und auf den Gittermonochromator (7) gelenkt. DerLichtstrahl wird vom Gitter reflektiert. Jede Farbe wird auf eine verschiedene Richtungreflektiert. Die gewünschte Farbe wird links zur Probenkammer geleitet.

Abbildung 3.2: Geöffnetes Spektralphotometer.

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(a) (b)

Abbildung 3.3: (a) Das neue Spektralphotometer. Der Deckel der Probekammer wurdegeöffnet um den Küvettenständer (b) zu zeigen.

Diese ist, ebenso wie der Strahlengang, beim Betrieb des Photometers abgedeckt,damit die Messung nicht durch Tageslicht gestört wird. Die Probekammer enthält einenintegrierten Küvettenständer, der in unserem Beispiel eine Referenzküvette mit Ethanol(transparent, 10) und die Probenküvette mit Chlorophyll-Lösung (grün, 11) enthält. Miteinem Schieber (12) schaltet man von außen zwischen Referenz- und Probenküvette hinund her ohne dass die Kammer (Abb. 3.3) geöffnet werden muss.Der abgeschwächte Lichtstrom, der hinter der im Strahlengang stehenden Küvette

noch vorhanden ist, wird von einer Photodiode gemessen. Der erzeugte Strom fließtdurch einen Arbeitswiderstand und erzeugt dort einen Spannungsabfall, der vom Keit-hley Multimeter angezeigt wird. Die neue Version des Spektralphotometers zeigt direktdie Transmission oder die Absorption durch ein digitales Display.

3.3 Messung des Absorptionsspektrums einer FarblösungBeim Einstrahlphotometer muss zunächst die von der Referenzküvette (enthält nur dasLösungsmittel, d.h. Ethanol) durchgelassene Intensität IEth(x) = AI010−xcε gemessenwerden, wobei A der Absorption des Glases und des Ethanols entspricht1. Da die Kon-zentration c Null ist (es gibt nur das Lösungsmittel ohne die gelöste Substanz), gilt:c = 0 =⇒ I(x) = AI0.Dann wird die von der Probenküvette durchgelassene Intensität IChl(x) = I0A10−xcε,

in der sich das Lösungsmittel und der gelöste Farbstoff (d.h. Chlorophyll) befinden,gemessen. Da c > 0 =⇒ 10−xcε < 1 und IChl(x) < IEth(x). Wir wollen den ExponentE ≡ xcε berechnen. Um E zu erhalten, nutzt man den Quotienten (IChl/IEth) = 10−E ,

1Hier haben wir den dekadischen statt den natürlichen Logarithmus genommen (Gl. 2.3).

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alsoE = − log10

(IChl

IEth

). (3.1)

Das Verhältnis IChl/IEth ist die Transmission T des gelösten Farbstoffs bei der einge-stellten Wellenlänge. Der Faktor E ist proportional zu ε. Ein Absorptionsspektrum istdie Kurve für ε als Funktion der Wellenlänge λ.Da sich bei einer anderen Wellenlänge sowohl I0 (=̂IEth) als auch I (=̂IChl) ändern,

müssen bei jeder am Monochromator neu eingestellten Wellenlänge beide Intensitätenneu gemessen werden. Tragen Sie die Messwerte am besten gleich in eine QTI-Plot Ta-belle ein und berechnen Sie dort die Transmission T und den Faktor E mit anschließendergraphischer Darstellung des Absorptionsspektrums (→Absatz 4).Wir interessieren uns für die Konzentration c. Wenn wir nur eine gelöste Substanz

haben, ist die Rechnung einfach: c = E/εx, wobei x für unsere Küvetten immer x = 1 cmist. Wenn wir zwei verschiedene Substanzen (z.B. A und B) haben, müssen wir einenTrick anwenden. Wir messen E durch Gl. 3.1 für zwei verschiedene Wellenlängen λ1 undλ2. Nun muss das folgende Gleichungssystem gelöst werden, um cA und cB zu erhalten:

E1 = cA · εA(λ1) + cB · εB(λ1) (3.2)

E2 = cA · εA(λ2) + cB · εB(λ2), (3.3)

wobei man εA(λ1), εA(λ2), εB(λ1), und εB(λ2) in der Literatur findet und E1 und E2durch Gl. 3.1 von den gemessenen Werten IChl/IEth für λ1 und λ2 berechnet werden.

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4 Aufgaben

4.1 Info: Herstellung einer Chlorophyll-RohextraktlösungZur Herstellung der Lösung wer-den frische, grüne Blätter benö-tigt. Diese haben Ihre Betreuer inder Regel bereits vorbereitet undin einer Reibschale in Ethanolzermörsert, damit die Zellwän-de aufgebrochen werden und dasChlorophyll in die Lösung über-gehen kann. Zusätzlich wurde derLösung 10Tropfen CaCO3 hinzu-gefügt, um die frei werdende or-ganische Säure zu neutralisieren.Dadurch wird verhindert, dassdurch die Säure das Magnesiu-mion aus dem Phorphyrin-Ringdes Chlorophylls gelöst wird. Dieso entstandene Rohextraktlösungwurde durch Dekantieren oderFiltrieren von den Blattresten ge-trennt.

4.2 Allgemeineszum MessvorgangBevor der Messvorgang gestartetwerden darf, muss das Spektralphotometer bereits 20min in Betrieb sein um eine stabileMessung zu gewährleisten. In der Regel ist dies Aufgabe der Betreuer, das Gerät 20minvor Praktikumsbeginn anzuschalten. Sprechen Sie Ihren Betreuer darauf an.Für die Messung des Spektrums verwenden wir zwei gleiche Glasküvetten mit 1 cm

Schichtdicke. Die Probenküvette wird mit Ethanol und 10 Tropfen des Chlorophyll-Rohextrakt gefüllt, die Vergleichsküvette nur mit dem Lösungsmittel Ethanol. Dannwerden beide Küvetten in die Halterung des Spektralphotometers gestellt.Achten Sie bitte darauf, dass die Küvetten sauber sind und nur an den

matten Wänden angefasst werden sollen. Ebenfalls sollen die Küvetten so in dem

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Spektrometer positioniert werden, dass das Messlicht durch die klaren Wände der Kü-vetten strahlt.

• Füllen Sie die Probenküvette bis auf 1 cm unter den Rand mit Ethanol

• Geben Sie 10Tropfen der Chlorophyll-Lösung bei und mischen Sie beide Flüssig-keiten gut!

• Als nächstes schieben Sie die Küvette mit purem Ethanol in den Strahlengangund setzen mit der T-Taste den Transmissionsmodus auf 100 % (Deckel bleibtgeschlossen!).

• Dann öffnen Sie den Deckel (kontrollieren Sie bitte, dass der Strahlengang blockiertist) und setzen 0 % für den blockierten Zustand.

Die Absorption im roten Spektralbereich bei 664 nm ist am höchsten. Die Transmissionder Probe sollte ungefähr noch etwa 5 % betragen, damit man eine für die Photodiodenoch nachweisbare Lichtintensität erhält. Die Lösung muss weiter verdünnt werden, wenndie Absorption bei 664 nm zu hoch ist, also die Transmission

T ≡ IChl

IEth

weniger als 0.05 beträgt.

• Schieben Sie die Referenzküvette (Ethanol) in den Strahlengang und stellen Siedie Wellenlänge auf den gewünschten Wert;

• Lesen Sie die Intensität IEth ab;

• Schieben Sie die Küvette mit Chlorophyll in den Strahlengang (die Wellenlängebleibt dieselbe!);

• Lesen Sie die Intensität IChl ab;

• Tragen Sie bei QTI (1) eine Spalte (X) mit der Wellenlänge ein, (2) eine Spalte(Y) mit IChl, (3) eine Spalte (Y) mit IEth.

Sie messen immer abwechselnd die Küvette mit Chlorophyll und direktdanach die Referenzküvette mit Ethanol bei der selben Wellenlänge, nichterst alle Wellenlängen mit einer Küvette!Der gesamte Absorptionskoeffizient E wird nach Gl. 3.1 berechnet.

EGes = − log10

(IChl

IEth

).

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4.2.1 Detaillierte MessungErgänzen Sie die oben durchgeführte Messung durch eine genauere Messung im Bereich

• von 400 bis 600 nm im Abstand von 5 nm

• von 600 bis 700 nm im Abstand von 2 nm

• von 700 bis 750 nm im Abstand von 10 nm

Fügen Sie bitte bei QTI eine vierte Spalte mit T = IChl/IEth und eine fünfte Spalte mitEGes = − log10 T hinzu. Dafür benutzen Sie die Spaltenwerte setzen-Funktion in QTI.

4.2.2 Bestimmung der Konzentration von Chlorophyll A und BDie Tatsache, dass sich die Extinktion EA eines Stoffes A und die Extinktion EB einesStoffes B zu einer Gesamtextinktion EGes = cAεA+cBεB addieren, macht es möglich, dieverschiedenen Komponenten einer Farbmischung quantitativ zu bestimmen. ErrechnenSie cA und cB nach (Absatz 3, Gl. 3.2 und 3.3).In unserem Beispiel enthält die Rohextrakt-Lösung (hauptsächlich) Chlorophyll A und

Chlorophyll B1, deren Absorptionsspektren bekannt sind. In Ethanol liegt das Absorp-tionsmaximum von Chlorophyll A nach Abb. 4.1 bei 664 nm und hat hier eine molareExtinktion ε von 89.0 l/(mol cm). Das Absorptionsmaximum von Chlorophyll B liegtbei 647 nm mit ε = 52.3 l/(mol cm). Die Absorptionen beider Moleküle überlagern sichadditiv für kleine Konzentrationen.

E664 = εA(664nm) · cA + εB(664 nm) · cB (4.1)E647 = εA(647nm) · cA + εB(647 nm) · cB (4.2)

Die Absorptionskoeffizienten E664 und E647 in der obigen Gleichungen können durchdie Messung bestimmt werden, sodass nur noch die Konzentrationen cA und cB alsUnbekannte übrig bleiben. Beachten Sie, dass es sich hierbei um Edec handelt.Sie müssen also die Umrechnung über den dekadischen Logarithmus log10vornehmen!

• Lösen Sie das Gleichungssystem nach den zwei Unbekannten

• Berechnen Sie die Konzentrationen ca und cb mithilfe Ihren Messwerten für E664und E647 und den εA und εB Werten aus Tab. 4.1.

1Es gibt verschiedene Arten des Chlorophylls. Je nach Art des Chlorophylls sind an das Grundmolekülverschiedene Seitenketten angehängt. Chlorophyll A und B sind die bekanntesten Formen.

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Abbildung 4.1: Das Absorptionsspektrum von Chlorophyll a und b in Propanol

Wellenlänge [cm] εa [l/(mol*cm)] εb [l/(mol*cm)]647 21,2 52,3664 89,0 10,2

Tabelle 4.1: Extinktion von Chlorophyll a und b für verschiedene Wellenlängen

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