ABS Basic Köln 2019 Präanalytik Mikrobiologische Methoden · Streptococcus agalactiae. Harte...

20.09.2018 Köln| E. Piepenbrock | IMMIH

ABS Basic Köln 2019 Präanalytik Mikrobiologische Methoden

20.09.2018 2 Köln| E. Piepenbrock | IMMIH

Inhalt 1. Präanalytik a) Allgemeine Prinzipien

b) Blutkulturen

c) Tupfer und Punktate

d) Knochenmaterial und Herzklappen

2. Materialanlage a) Allgemeine Prinzipien

b) Kulturmedien

c) Anaerobier

3. Diagnosemethoden von Mikroorganismen a) Mikroskopie

b) Kulturelle Identifikation

c) Molekularbiologische Identifikation

4. Resistenztestung a) Automatisiert- AES

b) Etest und Antibiotikablättchen

c) Dilutionsmethoden


1. Präanalytik – a) Allgemeine Prinzipien

- Auswahl des richtigen Probenmaterials zur Diagnose der Erkrankung:

z. B. Typhus: Blutkulturen und Stuhl einsenden. Pertussis Serologie nach aktueller Impfung positiv.

- Mehr Patientenmaterial- höhere Wahrscheinlichkeit den Erreger zu kultivieren. Besser Nativmaterial (Abszess, Sekret) als Tupfer oder Abstriche einsenden.

- Transport- und Konservierungsmedien bei anspruchsvollen Erregern.

z. B. für Neisseria gonorrhoeae: Holzkohletupfer oder E-swab.

- Transportzeiten so gering wie möglich halten, um das Absterben von Anaerobiern und die Vorbebrütung von Blutkulturen zu vermeiden.

- geeignete Probengefäße verwenden: Sterile Gefäße; keine ZVK Spitzen in Gelabstrichröhrchen oder Spritzen einsenden.


BD Bactec Blutkultur Bebrütungssystem Fehlerquellen

- Positivitätsrate steigt mit dem Volumen Erwachsene: 10-20

ml, Kinder (Peds): 1-5 ml.

- BD Blutkulturmedium: Casein-Soja-Pepton Bouillon mit

Kunstharzen.

- Blutkulturdiagnostik nach Beginn der Antiinfektiva-Therapie.

- Nur eine Probe bei intermittierender Bakteriämie.

- Keine bakterielle Infektion.

Präanalytik - b) Blutkulturen


1. Präanalytik - b) Blutkulturen: Falsch negative Ergebnisse

Falsche Lagerungs- und Transportbedingungen (Transportdauer Soll: -4h).

2 4 6 8 10 12 14 16

Δ CO 2 Signal

Zeit (h)

CO2-Entwicklung (F-units)

0.1

0.3

0.5

0.7

0.9


1. Präanalytik b) Blutkulturen Detektionszeiten von Erregern (h) Langsam wachsender Erreger: Anaerobier, Pilze.

28,7

10.7 9.5

57.7

34.6

28.7

Gram + Gram - Anaerobier Candida

E.coli

Kontaminanten

CoNS

17.0

6.5


1. Präanalytik c) Tupfer und Punktat

Flüssigkeiten: Abstriche und Tupfer sind ungeeignet, da sehr saugfähig aber wenig Abgabe

- Bei größeren Punktatmengen Einsendung in sterilen Röhrchen - Kleine Punktatmengen in Blutkulturflaschen überimpfen (PEDS-Flasche) - Umgehender Transport ist wichtig - Lagerung: evtl. über Nacht im Kühlschrank


- Knochenmaterialien aus Gelenk/ Wirbelsäuleproben: Orthopädie gesonderter Einsendeschein (5 Proben, davon 1 in TBC Kultur, 1 in PCR und 3 in kulturelle Anlage).

- MIQ 18: Weniger virulente Erreger (Propionibacterium sp., CNS) müssen in mindestens 2 Proben nachweisbar sein, um als relevant für die Erkrankung zu gelten.

- Knochenmaterial wird in Thioglycollatbouillon angereichert und bei einliegendem Fremdmaterial zwei Wochen lang weiterbebrütet und dann erneut ausgestrichen um Anaerobier wie z. B. Propionibacterium acnes zu kultivieren.

- Aus kulturnegativen Herzklappen erfolgt immer einer Staphylococcus aureus sowie bei negativem S. aureus Ergebnis eine eubakterielle PCR.

1. Präanalytik d) Knochenmaterial und Herzklappen

Lebowitz D., Kressmann B., Gjoni S., Zenelaj B., Grosgurin O., Marti C., Zingg M., and Uckay I., (2017) Clinical features of anaerobic orthopaedic infections. Infect Dis (Lond). 49(2): 137-140. Becker, Karsten; Berner, Reinhard; Eckmann, Christian et al (2014): MIQ 18: Mikrobiologische Diagnostik der Arthritis und Osteomyelitis (MIQ). München: Elsevier Urban & Fischer Verlag.


1. Präanalytik d) Knochenmaterial


Die kulturelle Anlage des Materials erfolgt nach SOP für die jeweilige Lokalisation, z. B. “hochwertige Materialien” wie Biopsien, Liquor.

Es werden Rückstellproben für eventuelle weitere Diagnostik erstellt, die eine Woche aufbewahrt werden.

Die Materialanlage erfolgt gemäß Einsenderangabe. Z. B. Unterscheidung: Ableitungsliquor und Punktionsliquor, da nur bei Punktionsliquor “ambulant erworbene Meningitis und Neugeborenen Sepsis” PCR: Neisseria meningitisdis, Listeria monocytogenes, E. coli, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus inf. b, Streptococcus agalactiae.

Harte Materialien werden homogenisiert und dann auf Agarplatten ausgestrichen, Katheter werden nach Maki über die Agarplatte gerollt.

2. Materialanlage – a) Allgemeine Prinzipien


2. Materialanlage – b) Kulturmedien

(Neumeister B, 2008)

- Universalmedien: Schafblutagar, Brain-Heart-Infusion.

- Optimalmedien: supplementierter Schokoladenagar (Kochblut mit NAD, Faktor V für z.B. Haemophilus influenzae)

- Selektivmedien: Thayer-Martin-Agar für Neisseriaceae (braun), Salmonella-Shigella Hektoen Agar (grün).

- Differenzialmedien: MacConkey Agar mit Lactose und Neutralrot (rosa) zur Unterscheidung zw. Lactose spaltenden Enterobakterien und Nonfermentern.

- Chromogenemedien: Candida Agar (transparent).

- Screeningmedien: MRSA, ESBL, Carbapenemase.

- Anaerobiermedien: Thioglycollatbouillon.


3. Materialanlage- c) Anaerobier

(Neumeister B, 2008)

Fakultative Anaerobier: Enterobacterales, Haemophilus inf., Staph. aureus, Streptokokken

Obligate Anaerobier: Finegoldia magna, Clostridioides difficile, Veillonella parvla, Bacteroides fragilis und viele andere Spezies.

Lokalisation: Orale Flora sowie im unteren Gastrointestinal- oder Urogenitaltrakt nachweisbar, in Bissverletzungen oder tiefen Wunden.

Bebrütung erfolgt unter anaerober Atmosphäre.

Nur Tiefe oder intraoperative Abstriche, Punktat, Blutkultur, Liquor, Abszess, Sekret, Biopsie, Herzklappe, Aszites wird anaerob kultiviert.


3. Diagnosemethoden von Mikroorganismen - Mikroskopie


3. Diagnosemethoden von Mikroorganismen - Mikroskopie

- Lichtmikroskopie nach Gram- , Methylenblau- (Blutkultur) oder Lactophenol-färbung (Schimmelpilze) oder SAF- Anreicherung (Parasiten Eier Stuhl), Ziel-Neelsen-Färbung (Atemwegsmaterial/V. a. Tbc, NTM) oder Auramin/Giemsa- Färbung für Parasiten (Blut, Stuhl).

- Fluoreszenzmikroskopie mit KOH und Blancofluor für Pilze (Ergosterol) und Parasiten (Chitin) aus Atemwegsmaterial bei Aplasiepatienten.

Probleme:

- Hefen zum Teil nicht im Ausstrich, wenn vor Allem Pseudomyzel (groß!) in der Kulturflasche.

- Gramlabile Erreger wechselnd Grampositiv oder -negativ (Prevotella sp., Porphyromonas sp., Clostridium sp.)

- Morphologie und Lagerung nicht immer eindeutig: Haemophilus sp. kokkoid, Ketten- vs. Haufenkokken)

- Lactophenolpräparat nur bei Sporulation gut auswertbar, sonst „steriles Myzel“.

Qualität Untersucherabhängig.


3. Diagnosemethoden von Mikroorganismen – Kulturelle Identifikation

- MALDI-ToF MS: Automatisierte, datenbankbasierte Identifikationsmethode.

- Kuratierte Datenbank wird circa halbjährlich am Endgerät aktualisiert.

- Historisch Spektren zum Teil falsch hinterlegt: K. variicola.

- Eng verwandte Mikroorganismen schwer differenzierbar. S. mitis/oralis, S. pneumoniae.

- Identifikation nur aus Reinkultur möglich.

- Salmonella enterica nur biochemisch und serologisch differenzierbar. (Vitek ID).

6903 Spektren: - 37 Hefen - 75 Mykobakterien - 150 Aspergillus sp.


3. Diagnosemethoden von Mikroorganismen Molekularbiologische Identifikation

(Kronefeld, Kampen, Sassnau, & Werner, 2014)

- PCR wird nach Sterilität des Materials ausgewählt:

- Quantitative PCR- Spezifische Primer: Tox A/B bei C. dif. oder Carbapenemase Gene auch aus Stuhl möglich. RT PCR schnell, da keine manuelle Extraktion der DNA des Materials nötig.

- Qualitative PCR- Eubakerielle und Panfungale PCR nur aus primär sterilem Material möglich, hier langsamer da Aufreinigung und falls PCR Produkt Sequenzierung.

- Indiziert wenn Toxine pathogenes Agens (PVL, Diphtherietoxin, toxigene E. coli)

- Kommerzielle Panels (Gastroenteritis oder Meningitis Erreger) oder Inhouse PCRs.

- Wenn kulturelles Wachstum von Kontaminanten oder Erregern, Qual. PCR nicht möglich.

- CT-Werte je nach Assay verschieden. Zum Teil Aussage über die Menge der initial vorhandenen DNA möglich (C. dif.).


MRSA- rtPCR, Kultur Cefoxitin Screening, PBP2A lateral flow assay


4. Resistenztestung - Automatisiert- AES - Automatisierte Endpunktmessung mit Vitek AST-Karten

- aerobe Inkubation der Erreger mit Antiinfektiva in 4 MHK Stufen, aus Wachstumskurven abgeleitete Resistenz der anderen MHKs (18 h)

- Advanced Expert System nicht für alle Spezies vorhanden

Agardiffusionstest

Anaerobier, Blutkultur, anspruchsvolle Erreger

- Etest (Epsilometer Test)

- Antibiotikablättchen Test (Sirscan)

- Mikro-/Makrobouillondilution

- Pilze, NTM, Colistin

Makrobouillondilution standardisierte Forschungsmethode

MHK: Minimale Hemmkonzentration, nach EUCAST als klinischer Breakpoint angegeben. Nur für definierte antimikrobielle Substanzen bei dem jeweiligen Erreger.

ECOFFS: Epidemiologische Antibiotika und Antimykotika Cutoffs, die zwischen einer erworbenen Resistenz und der Wildtyppopulation einer Spezies unterscheiden.


4. Resistenztestung - Etest und Antibiotikablättchen

Probleme mit Nonfermentern bei Vitek Resistenztestung, da langsames Wachstum.

(Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanii)

- Daher Antibiotikablättchentest oder E-test.

- Aber: Auch Antibiotikablättchen und E-test für P. aeruginosa für z. B. TZP nicht gut.

- Candida sp. besser mit Mikrobouillondilution getestet. Problem: Zeitintensiv.

Resistenztestung von Carbapenemase bildenden Enterobakterien:

Etest. Da Ertapenem Screeningsubstanz für OXA 48 (auch Resistenz bei ampC Bildnern), wird Imipenem und Meropenem Etest MHK auf Befund angegeben.

Problem der Angabe von sensibel getesteten Substanzen bei Carbapenemase Nachweis. Substanz wird als sensibel bei Hochdosistherapie interpretiert je nach Datenlage zur Wirksamkeit abgeleitet aus dem Hydrolyseverhalten der jeweiligen Carbapenemase. (blaOXA48: Ceftazidim, Meropenem, Imipenem S)

Etest Ablesung von Spezies und von Antibiotikum (bakterizid, bakteriostatisch) abhängig.

(Stenotrophomonas maltophilia, 80 % Inhibition).


Vielen Dank für die Aufmerksamkeit!

Fotos: @junge_dghm

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