AngewandteChemie

Untersuchung einzelner PolymereDOI: 10.1002/ange.200907098

Abziehen eines einzelnen Polymers von einem Substraterschließt thermodynamische Parameter der Kosolut-bindung**Michael Geisler, Roland R. Netz und Thorsten Hugel*

Zuschriften

4838 � 2010 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim Angew. Chem. 2010, 122, 4838 –4841

Kosolute wie Ionen, Liganden oder kleine Biomolek�lek�nnen die Faltung eines Proteins in seine biologisch funk-tionale Form, die Assoziation, die Adh�sion oder Desorptionan einer Grenzschicht oder sogar die �nderung seiner me-chanischen Eigenschaften bewirken.[1–5] Gleichzeitig wird dieWechselwirkung von Kosoluten mit Makromolek�len wieProteinen, Lipiden und DNA ihrerseits durch �nderungender Umgebung, insbesondere durch die Bindung an Ober-fl�chen wie die der Zellmembran oder die Oberfl�che vonHistonen und Mikrotubuli beeinflusst.[6, 7] Wir kombinierenEinzelmolek�l-Kraftspektroskopie mit thermodynamischerModellierung und bestimmen dadurch die Parameter derBindung der Kosolute an Makromolek�le in L�sung und imoberfl�chenadsorbierten Zustand. Wir erhalten Werte f�r dieL�nge einer Bindungsstelle (inverse maximale Liniendichte)und die Assoziationskonstanten. Die betr�chtliche Auswir-kung des Substrats auf die Kosolutbindung wird anhand vonGlucose als Kosolut, Poly(allylamin) als Polymer und chir-urgischem Edelstahl sowie oxidiertem Diamant als Substra-ten demonstriert.

Unl�ngst wurde die Thermodynamik der Ligandenbin-dung an ein Polymer mithilfe einer eindimensionalen Gibbs-Adsorptionsisotherme diskutiert.[8] In dieser Ausf�hrung derklassischen Adsorptionsisotherme[9] sind die Oberfl�chen-spannung durch eine Linienspannung t und der GibbsscheGrenzfl�chen�berschuss pro Fl�che durch einen Linien�ber-schuss pro L�nge, G, ersetzt. F�r ein einzelnes Polymer unterEinwirkung einer konstanten mechanischen Kraft FDes ist dieBeziehung zwischen G und t durch Gleichung (1) gegeben.

G ¼ q

d¼ � @t

@m

����

FDes

ð1Þ

Dabei ist m das chemische Potential der Liganden. Um eineanschauliche Vorstellung des Adsorptionsprozesses zu be-kommen, teilen wir G in einen dimensionslosen Anteil vonmit Liganden besetzten Bindungsstellen, q, und Bindungs-stellenl�nge d.[9] Durch Verkn�pfen von Gleichung (1) mit

der Langmuir-Isothermen q = aK/(1+aK)[10] erhalten wirGleichung (2) f�r den durch Ligandenbindung induziertenLinienspannungszuwachs.

t ¼ �d�1kBT lnð1þ aKÞ ð2Þ

Hier sind a = exp(m/kB T) die Ligandenaktivit�t, kB dieBoltzmann-Konstante, T die Temperatur und K die Assozia-tionskonstante. Wir definieren a und K als einheitenlos be-zogen auf die Stoffmengenkonzentrationen (f�r Einzelheitensiehe Hintergrundinformationen). Dabei entspricht die Lini-enspannung t der Freien Energie, um das Polymer um eineEinheitsl�nge zu strecken, und ist deshalb nicht mit der me-chanischen Kraft FDes gleichzusetzen.

In unserem Einzelmolek�l-Desorptionsexperiment be-finden sich die oberfl�chenadsorbierten und die desorbiertenPolymerteile im mechanischen Gleichgewicht.[11–13] Deshalbm�ssen der Zustand als adsorbiertes Polymer, der durch dieAssoziationskonstante Ks der Liganden und die Bindungs-stellenl�nge ds charakterisiert ist, und der Zustand als Poly-mer in L�sung, charakterisiert durch Kb und db, unterschiedenwerden. Dies f�hrt zu einem Beitrag zum Linienspannungs-unterschied Dt zwischen L�sungs- und Oberfl�chenzustand,der von der Ligandenaktivit�t abh�ngig ist [Gleichung (3)].

Dt

kBT¼ d�1

S lnð1þ aKSÞ � d�1b lnð1þ aKbÞ ð3Þ

Dieser Linienspannungsunterschied bildet den Haupt-beitrag zu der von der Ligandenaktivit�t abh�ngigen De-sorptionskraft, d.h. FDes(a) = FDes(a=0) + Dt. Die Anpas-sung von Gleichung (3) an die gemessenen Kr�fte als Funk-tion von a erm�glicht die Bestimmung der vier Parameter db,ds, Kb und Ks, insbesondere wenn die Ergebnisse f�r unter-schiedliche Oberfl�chen mit der zus�tzlichen Einschr�nkung,dass Kb und db unabh�ngig von der Art der Oberfl�che sind,als Grundlage dienen.

Im Folgenden wird demonstriert, dass uns die vorgestellteMethode in die Lage versetzt, das Binden von Kosoluten anein Polymer in beiden Zust�nden zu quantifizieren: 1) ad-sorbiert an der Oberfl�che und 2) gestreckt in L�sung (Ab-bildung 1). Als molekularen Sensor verwenden wir ein ein-zelnes Poly(allyamin)-Molek�l (PAAm), das an die Spitzeeiner AFM-Blattfeder angebunden ist (siehe die Hinter-grundinformationen f�r experimentelle Einzelheiten). Diekovalente Bindung des Polymers an die AFM-Spitze �bereine lange flexible Poly(ethylenglycol)-Kette liefert dieLangzeitstabilit�t,[11] die notwendig ist, um ein und dasselbeSondenmolek�l auf verschiedenen Substratmaterialien inw�ssrigen L�sungen mit unterschiedlichen d-Glucose-Kon-zentrationen zwischen 0 und 1m zu vermessen. Dar�berhinaus wurde die Temperatur variiert, um deren Einfluss aufdie Bindungsthermodynamik von Glucose zu bestimmen(siehe Abbildung S1 der Hintergrundinformationen).

Das Polymer an der Spitze wurde in Kontakt mit derfesten Oberfl�che gebracht und innerhalb einer Sekundeadsorbiert. Die nachfolgende Desorption des PAAm-Mole-k�ls durch Zur�ckziehen der Blattfeder mit einer konstantenGeschwindigkeit von 1 mm s�1 erfolgte unter Gleichgewichts-

[*] Dr. M. Geisler, Prof. Dr. T. HugelFakult�t f�r Physik, IMETUMTechnische Universit�t M�nchen, CeNSundCenter for Integrated Protein ScienceBoltzmannstraße 11, 85748 Garching (Deutschland)Fax: (+ 49)89-289-10805E-Mail : thorsten.hugel@ph.tum.deHomepage: http://cell.e22.physik.tu-muenchen.de/Hugel

Prof. Dr. R. R. NetzFakult�t f�r Physik, CeNSTechnische Universit�t M�nchen (Deutschland)

[**] Wir danken der DFG (HU 997/4, NE 810/4, NE 810/7, SFB 863),NIM und dem Fonds der Chemischen Industrie f�r die finanzielleUnterst�tzung. Wir bedanken uns bei Simon Q. Lud und Jose A.Garrido f�r die �berlassung von Diamantsubstraten. M.G. wurdedurch Stipendien des Elitenetzwerk CompInt und der Stiftung In-dustrieforschung unterst�tzt. Wir bedanken uns bei Nolan B. Hol-land, Jeffrey R. Moffitt, Dominik Horinek und Matthias Erdmann f�rhilfreiche Diskussionen.

Hintergrundinformationen zu diesem Beitrag sind im WWW unterhttp://dx.doi.org/10.1002/ange.200907098 zu finden.

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bedingungen, was anhand der beobachteten geschwindig-keitsunabh�ngigen Kraftplateaus ersichtlich ist[14] (Abbil-dung 2).

Kraft-Abstand-Kurven wurden an unterschiedlichenStellen mithilfe des Verbiegungs-Piezoweg-Signals erhalten,wie bereits an anderer Stelle beschrieben.[15] (Eine vollst�n-dige Kraft-Abstand-Kurve zeigt Abbildung S2 der Hinter-grundinformationen.)

Die Plateaukr�fte, die auf Diamant erhalten wurden,wachsen mit steigender Glucosekonzentration, wohingegendie Werte auf Stahl eine nichtmonotone Abh�ngigkeit zeigen(Abbildung 3A). Der Schl�ssel zu unserem Anpassungsver-fahren, das zu den Ausgleichsfunktionen in Abbildung 3f�hrte, ist die Anwendung identischer Parameter f�r denL�sungszustand, d.h. wir passen an beide Datens�tze in Ab-bildung 3 gemeinsam an. Die erhaltenen L�ngen f�r eineGlucosebindungsstelle entlang des PAAm-Molek�ls, db undds, sowie die zugeh�rigen Assoziationskonstanten sind inTabelle 1 zusammengefasst.

Die dimensionslose L�sungs-AssoziationskonstanteKb ¼

Konb

Koffb¼1300 f�r Stahl entspricht Kb = 32m�1 in molaren

Einheiten oder einer Dissoziationskonstante in molarenEinheiten von Kdiss

b ¼ Koffb

Konb¼31 mm.

Im Fall des Diamantsubstrats bei 31 8C ist Ks etwa 8%gr�ßer als Kb und bei 46 8C sogar mehr als 20% gr�ßer, was ineiner verst�rkten Bindung von Glucosemolek�len an dasoberfl�chenadsorbierte Polymer begr�ndet ist. Des Weiterenist die Bindungsstellenl�nge im adsorbierten Zustand ds

kleiner als db, was bedeutet, dass mehr Glucose an das Poly-mer an der Oberfl�che binden kann. Diese Erkenntnis istrecht unerwartet, geht man von einer rein geometrischenBetrachtungsweise aus, d.h. von einer geringeren Zug�ng-lichkeit des Polymers an der Oberfl�che. In diesem Falldeuten die Ergebnisse auf ein ungew�hnliches Zusammen-spiel der Glucosebindung an der Oberfl�che und am Polymerhin. Beide Parameter verst�rken die Glucose-Polymer-Bin-dung an der Oberfl�che und erh�hen dadurch die Desorp-tionskraft mit steigender Glucosekonzentration.

Der nichtmonotone Verlauf der Kraftkurve f�r Stahl kanndurch einen Wettstreit zweier Faktoren begr�ndet werden:

Einerseits ist die Glucose-Polymer-Assoziation in L�sungst�rker als an der Oberfl�che, andererseits ist die Bindungs-stellenl�nge an der Oberfl�che kleiner. Infolgedessen bindet

Abbildung 1. Skizze der Glucosebindung an ein Polymer auf und ent-fernt von einer Oberfl�che: Die „on“- und „off“-Rate des Kosoluts Glu-cose an ein Polymer adsorbiert auf einem Substrat (Ks ; Bild 1) und inL�sung (Kb ; Bild 2) sind gezeigt. Die Gleichgewichtsassoziationskon-stante K= Kon/Koff und die L�nge einer Glucosebindungsstelle dk�nnen anhand der gemessenen Kr�fte als Funktion der Kosolutaktivi-t�t bestimmt werden.

Abbildung 2. Gleichgewichtsdesorption von PAAm von oxidiertem Dia-mant in 10 mm Glucosel�sung. A) �berlagerung von 20 typischenKraft-Abstand-Kurven, erhalten mit ein und demselben PAAm-Molek�lunter Gleichgewichtsbedingungen, wie aus den (geschwindigkeitsun-abh�ngigen) Kraftplateaus geschlossen werden kann. Vergleich vonVerteilungen der Desorptionsl�nge (B) und der Kr�fte (C) f�r jeweils100 Hin-R�ckfahrzyklen mit Gaußschen Ausgleichsfunktionen (gestri-chelte Linien).

Abbildung 3. Glucosebindung an PAAm auf verschiedenen Oberfl�-chen. A) Gezeigt sind die Desorptionskr�fte von PAAm mit ver�nderterGlucoseaktivit�t bei 31 8C. Die durchgezogenen Linien stellen eine ge-meinsame Anpassung beider Datens�tze gem�ß Gleichung (3) dar.B) Die Liniendichte assoziierter Glucosemolek�le am Polymer ab einerGlucosekonzentration von 0.2m in unmittelbarer N�he der Stahlober-fl�che (durchgezogene schwarze Linie) �bersteigt diejenige in L�sung(rote Strich-Punkt-Linie). Zum Vergleich ist auch die Zahl gebundenerGlucosemolek�le f�r das an Diamant adsorbierte Polymer dargestellt(blaue Linie).

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bis zu einer Konzentration von 0.2m (a� 5 � 10�3) mehrGlucose an gel�stes als an adsorbiertes Polymer, d.h. die Zahlassoziierter Glucosemolek�le steigt durch die erzwungeneDesorption des Polymers an, und daher sinkt die Desorp-tionskraft mit wachsender Glucosekonzentration. F�r Kon-zentrationen jenseits von 0.2m hingegen ist die Lage geradeumgekehrt (Abbildung 3B). Die deutlich unterschiedlichenOberfl�chenparameter und insbesondere die sehr kleineBindungsstellenl�nge auf Stahl im Vergleich zu Diamantspiegeln h�chstwahrscheinlich unterschiedliche Affinit�tender blanken Substratmaterialien f�r Glucose wider.

Bis jetzt war die Ligandenadsorption in L�sung durchexperimentelle Methoden wie Kalorimetrie,[16] Densiome-trie[17] oder Gleichgewichtssedimentation[18] zug�nglich. Dasgebr�uchlichste Verfahren stellt die isotherme Titrationska-lorimetrie (ITC) dar, die hoher Konzentrationen an Poly-meren bedarf, die ihrerseits gut l�slich sein m�ssen und nichtzur Aggregation neigen d�rfen.[16] Der hier vorgestellteAnsatz mit Einzelmolek�l-AFM bietet eine erg�nzende Me-thode, die sogar f�r unl�sliche Polymere geeignet ist. F�r einPolymer, das sich in Kontakt mit einer Oberfl�che befindet,fehlte bislang eine �berzeugende Strategie zur Bestimmungder Ligandenbindung.

Zusammenfassend haben wir einen rasterkraftmikrosko-pischen Einzelmolek�lsensor entwickelt und gemeinsam mitthermodynamischer Modellierung die Bindungsstellenl�ngenund Assoziationskonstanten von Kosoluten bestimmt, diesowohl an ein gel�stes Makromolek�l binden, als auch andasselbe Molek�l, wenn es an einer Festk�rperoberfl�cheadsorbiert ist. Unsere Untersuchungen mit PAAm und Glu-cose offenbaren, dass Oberfl�chen einen entscheidendenEinfluss auf die Bindungsaffinit�ten kleiner Molek�le in

Kontakt mit Polymeren haben, der stark zwischen den un-terschiedlichen Oberfl�chen variiert. Unser Verfahren kannauf beliebige Zusammenstellungen von Polymeren, Kosolu-ten und einer großen Vielfalt von Grenzfl�chen, von Fest-fl�ssig- �ber Fl�ssig-gasf�rmig- bis hin zu weichen Grenzfl�-chen wie Lipiddoppelschichten, Zellmembranen oder mitHistonen bedeckte Oberfl�chen, angewendet werden. Daherist unser vereinter Ansatz mit Experiment und Theorie viel-seitig f�r das Studium der Wechselwirkungen von Kosolutenmit Makromolek�len in L�sung und an Grenzfl�chen ein-setzbar. Schließlich k�nnen Unterschiede von Ks und Kb oderds und db genutzt werden, um die Polymeradsorption durchVer�nderung der Kosolutkonzentration zu steuern, was wie-derum eine M�glichkeit zur Kontrolle von Makromolek�l-anordnungen an Oberfl�chen er�ffnet.

Eingegangen am 16. Dezember 2009,ver�nderte Fassung am 13. M�rz 2010Online ver�ffentlicht am 31. Mai 2010

.Stichw�rter: Adsorption · Einzelmolek�luntersuchungen ·Kraftspektroskopie · Ligandeneffekte · Polymere

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Tabelle 1: Bindungsparameter von d-Glucose an PAAm auf chirurgi-schem Edelstahl (316L) und oxidiertem Diamant (O-Diamant) bei un-terschiedlichen Temperaturen.[a]

Stahl 316L O-Diamant O-Diamant

Temperatur [8C] 31 31 46Kb 1300 1300 1400db [�] 2.40 2.40 2.68DGb [kJmol�1] 18.13 18.13 18.32KS 114 1404 1789dS [�] 0.99 2.15 2.55DGS [kJmol�1] 11.98 18.33 18.94

[a] DG ist die Gibbssche Freie Energie der Bindung an eine einzelneBindungsstelle, die mit der Temperatur T und der Gaskonstante R �berDG = R T lnK zusammenh�ngt. Wird K in molaren Einheiten verwendet,sind 9.4 kJmol�1 von den tabellierten Werten von DG zu subtrahieren.

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