McConkey-Agarplatten zeigen Verlust von F' lac+ Plasmid an

! Lactose & pH-Indikator Neutralrot zum Nachweis von Lactoseabbau (Produktion von Säuren durch Gemischtsäuregärung) » Bakterien mit F'lac Plasmid bilden rote Kolonien » Bakterien bilden Kolonien

E. coli W1023 lacchr (F' lac+) mit Acridinorange behandelt

I.A. Plasmid-Curing Auswertung

Acridinorange begünstigt einen Plasmidverlust

! bevorzugte Interkalation in stark superspiralisierte Plasmid-DNA » selektive Hemmung der Replikation der Plasmid-DNA

Resistenz gegen Infektion durch fd-Phagen in Abwesenheit der Fertilitätsgene

I.B F-Plasmid-Nachweis Auswertung

! dieser male specific Phage kann nur über einen Sex-Pilus an die Bakterienzelle adsorbieren

Phagengenetik

Doppelinfektion mit Phagen verschiedenen Genotyps:

Cistron = genetische Einheit, in der keine Komplementation auftritt

S. Benzer (1957): cis-trans Test am rII -Locus von T4 (rIIA, rIIB)

Komplementationsgruppe

rII-Locus

Lyse

Lyse

keine Lyse

keine Lyse

I.C. cis-trans Test Auswertung

! durch Mischen mit Phagen bekannter Mutationen können unbekannte Mutationen kartiert werden

Rekombination in der rII Region von T4

I.C. cis-trans Test Auswertung

L

L

L

L

L

L

P

P

P

I.C. cis-trans Test Auswertung

Komplementations-Test mit rII-Mutanten des Phagen T4

I.C. cis-trans Test Auswertung

I.D. STR-Analyse Auswertung

Amelogenin: - Geschlechtsmarker in PAR - X: 106 bp, Y: 112 bp PCR-Produkt - A5: XX - B5, C5: XY

Was könnte bei B5 und C5 die Ursache für die unterschiedliche Intensität der X- und Y- spezifischen Banden sein?

TH01: - mindestens 3 versch. Allele sichtbar - B5: vermutlich homozygot

Short Tandem Repeats (STRs)

7 Wiederholungen

8 Wiederholungen

STR-Analyse, Kurs B

I.D. STR-Analyse Auswertung

II.A Titerbestimmung Auswertung

KursA_vordere Hälfte; Ausreißer in rot; hieraus ergeben sich...

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II.A Titerbestimmung Auswertung

Titerbestimmung (cfu/ml; x108)

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Trübungsmessung (OD578nm)

! Warum ist die SD bei der Titer- bestimmung größer als bei der Trübungsmessung?

! Wie könnte die relativ hohe SD bei der letzten Trübungsmessung zu erklären sein?

II.A Titerbestimmung Auswertung

KursA_hintere Hälfte; Ausreißer in rot; hieraus ergeben sich...

II.A Titerbestimmung Auswertung

OD578nm = 0,29 entspricht Titer [cfu/ml] = 2,6 x 108

<=> OD578nm = 1 entspricht 9 x 108 cfu/ml

Eine OD von 1 entspricht etwa welcher Bakteriendichte...?

Negative und positive Kontrolle des lac Operons

II.B !-Galaktosidase-Test Auswertung

II.B !-Galaktosidase-Test

!

Bakterientiter = "OD578#

V

v# 9 $10

8 Bakterien

ml Kultur

Ihr Meßwert

in Versuch II.A ermittelt

Gesamtvolumen in Küvette

eingesetztes Kulturvolumen

Zelldichte [cfu/ml]:

pkat/ml cfu/ml

= pkat/cfu

kat = Maßeinheit für Enzymaktivität

[Mol umgesetztes Substrat pro s]

1 pkat = 10-12 kat = 1 pmol/s

!E405 = Extinktion bei 405 nm

" = molarer Extinktionskoeffizent

= 18,5 x 106 ml/(mol x cm)

d = Schichtdicke [cm]

t = Reaktionszeit in Sekunden

V = Gesamtvolumen

v = Probenvolumen

Enzymaktivität:

!

kat/ml ="E

405

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v%V

v

Ihr Meßwert Verdünnungen durch:

"Toluol-Extr." "Extinkt."

Theoretische Erwartung:

II.B !-Galaktosidase-Test Auswertung

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WT ohne Zusätze

WT mit IPTG WT mit IPTG & Glc.

lacI- ohne Zusätze lacI- mit Glc.

II.B !-Galaktosidase-Test Auswertung

Kurs A

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II.B !-Galaktosidase-Test Auswertung

Kurs B; A-Gruppen

III.A. Auxotrophie-Mutanten Auswertung

Identifikation von Auxotrophie-Mutanten

Wenn Ihre Platten nicht dieser Erwartung entsprechen...

» Was sind mögliche Fehlerursachen?

Vollmedium Minimalmedium

III.A. Auxotrophie-Mutanten Auswertung

Auxanographie

HB101 Pro, Met

Pro

Met

Pro, Leu

His od. His, Leu (nicht eindeutig)

Auxotrophie?

X340:

S17-1:

LE392:

HB101:

15:

Wachstum um ein Plättchen Wachstum zwischen zwei Plättchen

III.B Transposon Mutagenese Auswertung

Nachweis der Transposon-Mutagenese des Plasmids pTS115

Transposon mit CamR

chromosomale DNA

xylE

AmpR ori

pTS115

E. coli Ru4404:

1. Transposition

2. Plasmidisolation 3. Transformation in DH5" und Selektion auf LB/Cam/Amp

DH5"

farbloses Catechol "-Muconsäuresemialdehyd XylE

4. Catecholsprühtest:

III.B Transposon Mutagenese Auswertung

Ermitteln Sie den Anteil der weißen Klone und berechnen Sie hieraus die Größe des xylE-Gens!

Anzahl weißer Klone

Gesamtzahl aller Klone Größe xylE = x (6 - 0,9 - 0,4) kb # 0,9 kb

pTS115: 6 kb !-Lactamase-Gen: 0,9 kb ORI: 0,4 kb

Ames Test zur Identifikation mutagener Substanzen

Reversion von Mutationen im his Gen verschiedener Salmonella typhimurium

Stämme durch Behandlung mit mutagenen Substanzen

Zugabe von Rattenleber- extrakt: viele Carcinogene werden erst mutagen durch Metabolisierung in der Leber

III.C Ames Test

Welche Kontrollen fehlen hier?

Mutation

Reversion von Mutationen im his Gen verschiedener Salmonella typhimurium Stämme durch Behandlung mit mutagenen Substanzen

Salmonella typhimurium TA98: Rasterschubmutation

Salmonella typhimurium TA100: Basensubstitution

Im Praktikum verwendete Gifte:

2-Aminofluoren

Hydroxylierung durch Leberenzyme

» Addition an C8 von Desoxyguanosin (bulky addition)

Ames Test zur Identifikation mutagener Substanzen

4-Nitro-o-phenylendiamin (NPD) Wirkung?

Hem

mh

of

III.C Ames-Test Auswertung

Erwartung:

» 2-Aminofluoren ist ein Prä-Kanzerogen » 4-Nitro-o-phenylendiamin macht Indel Mutationen

IV Klonierung

Klonierung eines Genfragments - Übersicht

Isolierung genomischer DNA

PCR zur Amplifikation der rDNA

Schnitt mit KpnI und SacI

SacI KpnI

SacI KpnI

Ligation

Transformation

Klonierung eines Genfragments - Übersicht

Identifizierung positiver Klone:

Plasmidpräparation

Gelelektrophoretische Analyse

IV Klonierung

oder ???

!-Komplementation

lacZ! auf Plasmid kodiert für !-Peptid der "-Galaktosidase (Aminosäuren 1-26)

lacZ# im Genom von E. coli $M15 kodiert für "-Galaktosidase der die Aminosäuren 11-41 fehlen

Monomer der "-Galaktosidase

LacZ# und LacZ! komplementieren sich zu aktiver tetramerer "-Galaktosidase

Blau-Weiß-Screening

X-Gal

"-Gal

blaugrüner Farbstoff

IV Klonierung

Expressionsplasmid

Selektionsmarker: Antibiotikumsresistenz (z.B. AmpR: !-Lactamase)

Replikationsursprung (ori)

Promotor / Terminator

(Operator)

RBS / Start / Stop

Polylinker

- z.B. Produktion Humaninsulin seit 1982 Verfahren von Hoechst entwickelt, aber Verbot der Produktion in Deutschland, Zulassung seit 1987

IV Klonierung

Polymerase Kettenreaktion (PCR) Kary Banks Mullis, Nobelpreis 1993

... ATG GAG GAA TGT ACA GAA ATC GTG ....... CTC CTA GGA CCC AAA ATA TAA ...

... TAC CTC CTT ACA TGT CTT TAG CAC ....... GAG GAT CCT GGG TTT TAT ATT ...

GAT CCT GGG TTT TAT ATT AAGCTT

3‘ Primer HindIII

GAATTC ATG GAG GAA TGT ACA GAA

5‘ Primer EcoRI

Anhängen von Schnittstellen mittels 5' verlängerter Primer

IV.A PCR Auswertung

GelelektrophoreseGeltaschen

IV.B Gelelektrophorese

M: DNA‐Marker(1 kb F t )(1 kb Fermentas)

R: Reaktionsansatz

N: Negativkontrolle

R N R N R N R N R N

Gr.1 Gr.2 Gr.3 Gr.4 Gr.5

M M P

P: PositivkontrolleReihen: A, C, E, G

R N R N R N R N R NM M P

1 kb Marker:

Gr.1 Gr.2 Gr.3 Gr.4 Gr.5

Reihen: B, D, F, Hl k hElektrophorese‐richtung

+ Pol

IV.A PCR Auswertung

Ordnen Sie die Banden zu! Wo ist etwas schief gegangen? Mögliche Fehlerquellen?

Primer

PCR- Produkt

IV.A PCRAuswertung

Ergebnis – Gelelektrophorese der PCR‐Produkte

Gruppen A + B Gruppen C + D

PCR‐Produkt

P iPrimer

Gruppen E + F Gruppen G + H

IV. Projekt: Klonierung eines Genfragments

IV.E Plasmidpräparation

•! Von den Platten mit den Produktligationen zwei weiße und eine blaue Kolonie auf eine LB-Platte mit Ampicillin ausstreichen (beschriften, da kein X-Gal!)

IV.E Plasmid-Präparation Auswertung

! Wie kann man ein religiertes von einem Insert-tragenden Plasmid unterscheiden?

! Wie kann man DNA von RNA unterscheiden?

! Wie können Sie die versch. Formen eines Plasmids (ccc, oc, linear) experimentell den entsprechenden Banden zuordnen?

! Wie können Sie Plasmid-Di- od. –Multimere von kontaminierender genomischer DNA unterscheiden?

Kurs A

IV.E Plasmid-Präparation Auswertung

Kurs A

IV.E Plasmid-Präparation Auswertung