Adenoviren und DNA-Tumorviren

Rainer G. Ulrich

Friedrich-Loeffler-Institut

Institut für neue und neuartige Tierseuchenerreger

D-17493 Greifswald - Insel Riems

rainer.ulrich@fli.de

Vorlesung: „Molekulare Virologie“, WS 2018/2019

1. EINLEITUNG

(Nichttaxonomische) Klassifizierung von Viren

nach infiziertem Wirt: Bakterien, Pflanzen, Pilze, Tiere, Mensch

DNA-Viren bei Wirbellosen und Wirbeltieren

Struktur und Klassifizierung von DNA-Viren

Klassifikation von Viren nach der Art der mRNA-

Synthese (Baltimore-Klassifikation)

Gruppe I: dsDNA. Genomform aller

Lebewesen (Papilloma-,

Polyoma-, Adeno-, Herpes-,

Poxviridae)

Gruppe II: ssDNA. Enthält DNA sowohl

positiver als auch negativer

Polarität (Parvoviridae)

Gruppe III: dsRNA (Reoviridae)

Gruppe IV: (+)ssRNA. Sie wirkt direkt als

mRNA (Picorna-, Toga-, Flavi-,

Calici-, Coronaviridae)

Gruppe V: (-)ssRNA. Sie wirkt als Matrize

zur mRNA-Synthese (Bunya-,

Arena-, Rhabdo-, Paramyxo-,

Orthomyxo-, Filoviridae)

Gruppe VI: (+)ssRNA, die in DNA

zurückgeschrieben und ins

Zellgenom eingebaut wird

(Retroviridae)

Kleine DNA-Viren und Adenoviren: Übersichtstabelle

Virusfamilie Parvoviridae Polyomaviridae Papillomaviridae Adenoviridae

Virusgröße 18-26 nm 40-45 nm 55 nm 80-110 nm

Genom ssDNA, linear dsDNA, zirkulär dsDNA, zirkulär dsDNA, linear

Genomlänge 4,8-5,6 kB ca. 5,2 kBp ca. 8 kBp 36-38 kBp

Kodierungs-strategie

eine Leserichtung, überlappende ORF

ambisense, überlappende ORF

eine Leserichtung, überlappende ORF

ambisense, überlappende ORF

Hülle keine keine keine keine

Kapsid ikosaedrisch, VP1, VP2, (VP3)

ikosaedrisch, VP1, VP2, VP3

ikosaedrisch, L1, L2

ikosaedrisch, Pentonbasisprotein (pIII), Fiberprotein (pIV), Hexonprotein (pII), u.a.

Replikation „rolling hairpin“-Modell

bidirektional, semikonservativ

bidirektional, semikonservativ

semikonservativ

Replikationsort Zellkern Zellkern Zellkern Zellkern

Replikations-enzym

zelluläre DNA-Polymerase

zelluläre DNA-Polymerase

zelluläre DNA-Polymerase

virale DNA- Polymerase

Übertragung Tröpfchen, fäkal-oral, vertikal, Blutprodukte

Schmierinfektion Hautkontakt, sexuell, perinatal

Aerosol, fäkal-oral, kontaminierte Gegenstände und Flüssigkeiten

Wirtsspezifität hoch (hoch) hoch niedrig

Humanpatho-gene Vertreter

Parvovirus B19, Humanes Bocavirus, (Parv4)

JCPyV, BKPyV, WU-PyV, KI-PyV, MCPyV und 9 weitere (3.1. 2018)

HPV 1-225 (4.12. 2018)

Arten (Subgenera) A-G, Genotypen (HAdV) 1-90 (7.1. 2019)

Erkrankungen Ringelröteln, Erkrankungen des Respirationstraktes und des Gastro- intestinaltraktes

PML bei HIV-Infektion, Organ-abstoßung nach Nierentransplan-tation

Papillome, Karzinome

Erkältungen und andere Erkrankungen des Respirationstraktes, gastrointestinale Erkran-kungen, Keratokonjunktivitis

2. FAMILIE ADENOVIRIDAE

Genus Mensch Tier

Mastadenovirus Spezies A-G, Adenoviren von Rind,

Serotypen Schwein, Hund, Affe, Pferd,

HAdV-1 bis -53 Nagetieren, Fledermäusen,

Delphin, Seelöwe

Aviadenovirus Vogel-Adenoviren (Ente)

Atadenovirus Adenoviren von Schlange,

Eidechse, Ente, Papageien,

Opossum, Schaf, Rind

Siadenovirus Adenoviren von Frosch,

Pute, Fasan, Pinguin,

Kohlmeise

Ichtadenovirus Störadenovirus

Familie Adenoviridae

Phylogenetische Verwandtschaft von Adenoviren

Neuer Adenovirusserotyp – HAdV-52

Aufbau und Größe:

Membran:

Capsid:

Genom:

Wirtsspezifität:

Ikosaedrisch

ca. 80-110 nm

Nicht vorhanden

252 Capsomere:

240 Hexone

12 Pentone + Fiber

Lineare dsDNA, 35-38 kbp

Hohe genetische Stabilität

niedrig

Adenoviren: Eigenschaften

Adenoviren: Struktur des Kapsids

Adenoviren: Struktur des Kapsids

Adenoviren: Strukturproteine

Genomorganisation

Genomorganisation: Ambisense-Kodierung

Genomorganisation bei den AdV-Genera

Splicing früher mRNAs

Replikationszyklus der Adenoviren: Übersicht

Replikationszyklus der Adenoviren

DNA-Replikation der Adenoviren

Hauptprodukte der E1-Region (IE-Region)

Eigenschaften und Funktionen von Adenovirusproteinen

Vorläuferprotein des terminalen Proteins; TP ist kovalent gebunden;

wirkt als Primer bei der Initiation der DNA-Synthese

Virale DNA-Polymerase

80 kD

140 kD

E2B

Bindet an einzelsträngige DNA; aktiv bei DNA-Replikation phosphoryliert 72 kD E2A

Sehr frühes Protein; Bindung an p53, Transformation zusammen mit

E1A; Regulation des RNA-Transports zusammen mit E4/34 kD

phosphoryliert 1.55 kD E1B

Sehr frühes Protein; Transaktivator, Zinkfingermotiv, Bindung an

Histon-Acetyltransferasen; Bindung an Tumorsuppressorprotein

Rb105; Transformation zusammen mit E1B

phosphoryliert 1.40 kD E1A

Funktion Modifikation Molekular

gewicht

Proteine

Wirkt zusammen mit E4-ORF6 und E1B/55 kD bei der Regulation des

mRNA-Transports

11 kD E4-ORF3

Cytoplasmatisches Protein; Funktion unbekannt 17 kD

136 AS

E4-ORF2

Induktion von Mammatumoren bei HAdV-9 infizierten Ratten 125 AS E4-ORF1

Interaktion mit E1B/55 kD und Abbau von p53, Regulation des mRNA-

Transports vom Kern ins Cytoplasma; verstärkt die E1A- und E1B-

vermittelte Transformation

34 kD E4-ORF6

Bindet an Proteinphosphatase 2A, beeinflusst Phosphorylierung zellulärer

und viraler Proteine, wirkt so regulierend auf die Transkription zellulärer

und viraler Proteine

14 kD E4-ORF4

E3-Region: Funktion der Proteinprodukte

Eigenschaften und Funktionen von Adenovirusproteinen

Vorläuferprotein des terminalen Proteins; TP ist kovalent gebunden; wirkt

als Primer bei der Initiation der DNA-Synthese

Virale DNA-Polymerase

80 kD

140 kD

E2B

Bindet an einzelsträngige DNA; aktiv bei DNA-Replikation phosphoryliert 72 kD E2A

Sehr frühes Protein; Bindung an p53, Transformation zusammen mit E1A;

Regulation des RNA-Transports zusammen mit E4/34 kD

phosphoryliert 1.55 kD E1B

Sehr frühes Protein; Transaktivator, Zinkfingermotiv, Bindung an Histon-

Acetyltransferasen; Bindung an Tumorsuppressorprotein Rb105;

Transformation zusammen mit E1B

phosphoryliert 1.40 kD E1A

Funktion Modifikation Molekular

gewicht

Proteine

Wirkt zusammen mit E4-ORF6 und E1B/55 kD bei der Regulation des

mRNA-Transports

11 kD E4-ORF3

Cytoplasmatisches Protein; Funktion unbekannt 17 kD

136 AS

E4-ORF2

Induktion von Mammatumoren bei HAdV-9 infizierten Ratten 125 AS E4-ORF1

Interaktion mit E1B/55kD und Abbau von p53, Regulation des mRNA-

Transports vom Kern ins Cytoplasma; verstärkt die E1A- und E1B-

vermittelte Transformation

34 kD E4-ORF6

Bindet an Proteinphosphatase 2A, beeinflusst Phosphorylierung

zellulärer und viraler Proteine, wirkt so regulierend auf die

Transkription zellulärer und viraler Proteine

14 kD E4-ORF4

Proteine Molekular

gewicht

Modifikation Funktion

L-Bereich

L3-pII 120 kD Hexonprotein, im Capsomer als Trimer; induziert Bildung gruppen-

spezifischer Antikörper

L2-pIII 80 kD Pentonbasisprotein, Homopentamer

L3-pIIIa 66 kD phosphoryliert Pentonassoziiertes Protein

L5-pIV 62 kD glycosyliert Fiberprotein; liegt in der Fiber als Trimer vor; induziert Bildung

virusspezifischer Antikörper

L2-pV 48.5 kD phosphoryliert Nukleocapsidkomponente; interagiert mit dem Genom und der

Innenseite des Capsids

L3-pVI 23.4 kD phosphoryliert Hexonassoziiertes Protein; an der Innenseite des Capsids lokalisiert

L3 Protease

(Adenain)

23 kD Cysteinprotease; Freisetzung der Viruspartikel aus dem Endosom

pIX 11.5 kD Hexonassoziiert; an den Kontaktstellen der Hexoncapsomere

pXI/pXII 4.5/3 kD Hexonassoziiert; an den Kontaktstellen der Hexoncapsomere

Nichtstruktur

proteine

L4-100 kD Spätes Nichtstrukturprotein; Chaperon, aktiv bei Hexonassembly

pIVa2 50 kD Spätes Nichtstrukturprotein; Chaperon, aktiv bei Morphogenese

33 kD Spätes Nichtstrukturprotein; Chaperon, aktiv bei Morphogenese

Eigenschaften und Funktionen von Adenovirusproteinen

Adenovirus-assoziierte RNA

VA-RNA: ● zwei Gene für kleine, nicht Protein kodierende RNAs (VA-

RNA I und VA-RNA II)

● durch RNA-Polymerase III transkribiert

●160 nt lange RNAs mit ausgeprägter Sekundärstruktur

● VA-RNA I hemmt die zelluläre Proteinkinase R

(PKR, dsRNA-aktivierte Proteinkinase) und reguliert darüber

die Translation viraler Polypeptide

● VA-RNA I und VA-RNA II hemmen in der späten

Phase des Infektionszyklus die Regulation durch RNA-

Interferenz (mivaRNAs)

Adenovirus-assoziierte RNA

Humane AdV: Epidemiologie und Übertragung

Epidemiologie: ● weltweit verbreitet

● epidemisches, endemisches und

sporadisches Auftreten

Übertragung: ● Aerosole

● Kontaminierte Gegenstände und

Flüssigkeiten

● Fäkal-oral

Humane Adenoviren

Pathogenese: - infizieren bevorzugt Epithelzellen des Pharynx,

Dünndarms sowie Konjunktivalzellen

- Persistenz einiger Serotypen in Tonsillen und

benachbarten Lymphknoten

Klinik: - Erkältungen und andere Erkrankungen des

Respirationstraktes, Keratokonjunktivitis,

gastrointestinale Erkrankungen

- 50% der Infektionen verlaufen asymptomatisch

- Bedeutung bei immunsupprimierten Patienten

Humane Adenoviren: Diagnostik

1. Virusnachweis in Zellkultur

2. Nachweis von IgM-Antikörpern gegen die

viralen Strukturproteine

3. Nachweis Spezies-spezifischer Antikörper

mittels Immunoblot

4. Nachweis Serotyp-spezifischer Antikörper

mittels NT und HHT

5. Nachweis viraler Nukleinsäure mittels PCR

Humane Adenoviren: Prophylaxe und Therapie

Impfstoffe: Impfung gegen HAdV-4 und -7 beim

Personal des US-Militärs (Lebendvakzine,

nur für US-Streitkräfte zugelassen)

Therapie: Cidofovir

Interferon-β (bei schwerer Keratokonjunktivitis)

Ribavirin (für alle Vertreter der Spezies C, die

meisten Vertreter der Spezies A, B und D)

Gentherapievektoren: Vor- und Nachteile

Charakteristika Retrovirus Adenovirus Adeno-assoziiertes

Virus

Wildtypvirus Einzelsträngige

RNA, 9.2 kb

Doppelsträngige

DNA, 36 kb

Einzelsträngige DNA,

5 kb

Insertionsgröße 8 kb 7.5 kb 4.5 kb

Titer (colony forming

units/ml)

106-10

7 10

8-10

10 10

6-10

8

Zielzellen Nur

teilungsfähige

Zellen

Teilungsfähige und

nicht teilungsfähige

Zellen

Teilungsfähige und

nicht teilungsfähige

Zellen

Genexpressionsdauer Langfristig Transient Transient bis

langfristig

Genexpressionsausmaß Mäßig Hoch Mäßig

Mögliche Hürden Mutationen nach

Insertion

Immunantwort des

Wirtes

Toxizität viraler

Proteine, Mutationen

nach Insertion

Mögliche

Wirtsimmunität

Nein Ja Ja

Replikationskompetent Nein Eventuell Ja

Virale Proteinexpression Nein Ja Nein

Entnommen aus N. Grewe (2005). Dissertation, Charité, Berlin

Adenoviren als Vektoren

- Deletion der E1-Region (Einbau heterologer Gene von

bis zu 4,7 kbp)

- Verpackungszelllinie (E1-Transkomplementation)

Problem: Bildung replikationsfähiger Adenoviren

Adenoviren als Vektoren: 1. Generation

Adenoviren als Vektoren: 2. Generation

- Umbau des E1-Deletionsvektors (E4-Region upstream von E1)

- bei Rekombination Verlust von E4

- nur inverted terminal repeats (ITR) und Signale für die

Verpackung der Virus-DNA im Vektor

ABER: - viele virale Genprodukte bei Überexpression

für Zellen toxisch

- Problem bei der Etablierung von Verpackungs-

zelllinien, die stabil rekombinante Viren

produzieren

Adenoviren als Vektoren: 3. Generation

Herstellung von Adenovirusvektoren

Kleine DNA-Viren und Adenoviren: Übersichtstabelle

Virusfamilie Parvoviridae Polyomaviridae Papillomaviridae Adenoviridae

Virusgröße 18-26 nm 40-45 nm 55 nm 80-110 nm

Genom ssDNA, linear dsDNA, zirkulär dsDNA, zirkulär dsDNA, linear

Genomlänge 4,8-5,6 kB ca. 5,2 kBp ca. 8 kBp 36-38 kBp

Kodierungs-strategie

eine Leserichtung, überlappende ORF

ambisense, überlappende ORF

eine Leserichtung, überlappende ORF

ambisense, überlappende ORF

Hülle keine keine keine keine

Kapsid ikosaedrisch, VP1, VP2, (VP3)

ikosaedrisch, VP1, VP2, VP3

ikosaedrisch, L1, L2

ikosaedrisch, Pentonbasisprotein (pIII), Fiberprotein (pIV), Hexonprotein (pII), u.a.

Replikation „rolling hairpin“-Modell

bidirektional, semikonservativ

bidirektional, semikonservativ

semikonservativ

Replikationsort Zellkern Zellkern Zellkern Zellkern

Replikations-enzym

zelluläre DNA-Polymerase

zelluläre DNA-Polymerase

zelluläre DNA-Polymerase

virale DNA- Polymerase

Übertragung Tröpfchen, fäkal-oral, vertikal, Blutprodukte

Schmierinfektion Hautkontakt, sexuell, perinatal

Aerosol, fäkal-oral, kontaminierte Gegenstände und Flüssigkeiten

Wirtsspezifität hoch (hoch) hoch niedrig

Humanpatho-gene Vertreter

Parvovirus B19, Humanes Bocavirus, (Parv4)

JCPyV, BKPyV, WU-PyV, KI-PyV, MCPyV und 9 weitere (3.1. 2018)

HPV 1-225 (4.12. 2018)

Arten (Subgenera) A-G Genotypen (HAdV) 1-90 (7.1. 2019)

Erkrankungen Ringelröteln, Erkrankungen des Respirationstraktes und des Gastro- intestinaltraktes

PML bei HIV-Infektion, Organ-abstoßung nach Nierentransplan-tation

Papillome, Karzinome

Erkältungen und andere Erkrankungen des Respirationstraktes, gastrointestinale Erkran-kungen, Keratokonjunktivitis

3. DNA-TUMORVIREN

Onkogene Viren

Viren, die – neben ihren charakteristischen

Viruseigenschaften -

die Fähigkeit besitzen, normale Zellen in Tumorzellen

umzuwandeln.

Immortalisierung und maligne Transformation

Eigenschaften transformierter Zellen

I. RNA-Viren Retroviridae

- akut transformierende (transduzierende) Retroviren/Oncornaviren

- Genus Deltaretrovirus: Langsam transformierende Viren (HTLV-1, HTLV-2)

Flaviviridae (Hepatitis C-Virus)

II. DNA-Viren Hepadnaviridae (Hepatitis B-Virus)

Polyomaviridae (Merkelzell-Polyomavirus)

Papillomaviridae (z.B. HPV-16 und HPV-18)

Adenoviridae

Herpesviridae (EBV=HHV-4, KSHV=HHV-8)

Tumorviren: eine Übersicht

Humane RNA- und DNA-Tumorviren

Onkogenität von Adenoviren in Nagetieren

Spezies Serotyp Onkogenität (Tier) Zelltransformation

A 12, 18, 31 hoch (Sarkome) +

D 9, 10 hoch (Adenome) +

B 3, 7, 11 gering (Sarkome) +

C - F alle anderen keine +

Tumorentstehung: multifaktorieller und mehrstufiger Prozess

Chemikalien,

Strahlung,

virale Faktoren

Targetproteine für DNA-Virus-Onkogene

DNA-Tumorvirus-Protein-Interaktion

Zellzyklus

Tumorsuppressor-Proteine

Zellzyklus-kontrollierende Proteine.

Proteine, die in die negative Regulation des Zellzyklus

involviert sind (Halten in der G1-Phase).

50% der Tumoren, einschließlich der durch Viren induzierten,

werden durch veränderte Tumorsuppressorgene verursacht.

Bei einer Veränderung des Proteins (mit Funktionsverlust)

kommt es zu einer nicht gegenregulierten Wachstumsstimulation.

Tumorsuppressor-Proteine

Tumorsuppressor-Protein p53

- Aktivität in der späten G1-Phase des Zellzyklus

(G1-Arretierung): kein Übergang zur S-Phase

- Unterstützung der Einleitung der Apoptose

- Core-Domäne des p53 ist extrem sensitiv für Aminosäure-

austausche (Funktionsverlust)

- Funktionsverlust durch Aminosäureaustausche oder Wechsel-

wirkung mit viralen Proteinen

DNA-Virus-Onkogene und p53

DNA-Virus-Onkogene und Rb-Proteine

Funktionen der zellulären Tumorsuppressorproteine

Rb105/Rb107

in nicht infizierten Zellen

Zellzyklus

Funktionen der zellulären Tumorsuppressorproteine

Rb105/Rb107

in HPV/AdV/PyV-transformierten Zellen

Zellzyklus

Eigenschaften der onkogenen

DNA-Viren

- die für die Transformation verantwortlichen Gene haben kein

zelluläres Homolog

- Viren besitzen eine geringe Transformationsrate (10-5)

- die für die Transformation verantwortlichen viralen Proteine

besitzen meist eine Kernlokalisation

- entweder produktive Replikation (Lyse der Zelle) oder nicht-

produktive Infektion mit Transformation der Zelle

- virale DNA ist entweder ins zelluläre Genom eingebaut oder

liegt episomal vor

DNA-Virus-Tumorigenese: Virusprotein-

Wechselwirkung mit Tumorsuppressor-Proteinen

Funktionelle Domänen des großen

T- Antigens von Polyomaviren

E7-Protein von HPV-16

Tumorbildung durch Papillomviren (HPV-16/HPV-18)

• Virale DNA:

– entweder episomal (selten) oder

– integriert, dadurch E2 defekt (E6 und E7 immer intakt)

• Virale Proteine:

– E2: Repressor bindet an Promotoren von E6 und E7 und

zelluläre Enhancer, außerdem an mindestens 7 zelluläre Proteine

– E6: bindet an p53, Degradation von p53, keine Apoptose,

Übergang in S-Phase ohne ausreichende Reparatur

– E7: bindet an Rb, Aufhebung der Repression des E2F,

deregulierte Zellteilung

1. Integration des HBV-Genoms

- Bildung von HBsAg und HBx-Protein möglich

- Störung zellulärer Funktionen infolge Insertionsmutagenese

2. HBx-Protein

- wirkt transaktivierend auf zelluläre Promotoren

- induziert Expression des HBsAg, dadurch Abfangen von

Antikörpern möglich; erhöhte Chronizität der Infektion

- Interaktion mit p53, Deregulation der Zellzykluskontrolle

(verfrühter Eintritt in die S-Phase)

- Zellteilungsstimulation über Proteinkinase C

3. Kofaktoren

- Aflatoxine bewirken Mutationen im Wirtsgenom

Hepatitis B-Virus und HCC

Burkitt-Lymphom und Epstein Barr-Virus

- Krebserkrankung ausgehend von B-Lymphozyten

- größte Bedeutung hat das endemische Burkitt-Lymphom in

malariaverseuchten Gebieten Afrikas (Inzidenz: 10 pro 100 000)

- befällt bevorzugt Kinder im Alter von drei bis acht Jahren

- extrem schnell wachsender Tumor (Bauchhöhle und Gesicht)

- in frühen Stadien erfolgreiche Chemotherapie-Behandlung möglich

Epstein Barr-Virus kausal an der Entstehung dieses Tumors beteiligt.

Epstein Barr-Virus: Transformierende Proteine

in vitro Infektion von B-Lymphozyten und Transformation zu Blasten.

Expression von 6 “nuclear antigens” (EBNA1, EBNA2, EBNA3A,

EBNA3B, EBNA3C, EBNALP),

drei Membranproteinen (LMP1, LMP2A, LMP2B) und

EBV-kodierten RNAs (EBER1 und EBER2).

EBNA1 und LMP1 sind von Bedeutung für die Immortalisierung

von primären B-Lymphozyten

EBNA2 - essentiell für die Etablierung der Latenz und die

Immortalisierung

- verstärkt Synthese von Cytokinen und Wachstumsfaktoren

Epstein Barr-Virus: Latenzzustände und Tumoren

Nach der Infektion wird das Genom episomal latent etabliert.

3 Typen von Latenz:

Typ 1-Latenz: nur das EBNA1-Protein exprimiert

(Burkitt-Lymphom)

Typ 2-Latenz: EBNA1-Protein, LMP1, LMP2A, LMP2B

exprimiert (Nasopharyngealkarzinom)

Typ 3-Latenz: EBNA1, EBNA2, EBNA3A, EBNA3B, EBNA3C,

LMP1, LMP2A, LMP2B exprimiert

(Lymphome assoziiert mit Immunsuppression)

Humanes Herpesvirus 8 (HHV-8) Genus Rhadinovirus der Unterfamile g-Herpesvirinae

Humanes Herpesvirus 8 = Kaposi-Sarkom assoziiertes

Herpesvirus (KSHV)

Kaposi-Sarkom (KS): maligne, von den Gefäßendothelien

ausgehende Systemerkrankung.

Klinische Formen:

1. klassisches Kaposi-Sarkom (meist bei älteren Männern)

2. Kaposi-Sarkom bei Immunsuppression

3. afrikanisches endemisches Kaposi-Sarkom

4. epidemisches HIV-assoziiertes Kaposi-Sarkom

“latency-associated nuclear antigen” (LANA)

interagiert mit p53 und Rb.

Überleben der Zellen durch Interaktion von LANA mit p53

vermittelt

- durch Verhinderung der Apoptose und

- durch Aufhebung der Repression der Zellproliferation.

HHV-8: Latenz und Transformation

Viren als Erreger menschlicher Tumorerkrankungen

Polyomaviren

Papillomviren

Virus Tumor Kofaktoren

MCPyV

Merkelzell-Karzinom

DANKSAGUNG

Dr. G. Flunker, Greifswald

S. Drewes, Riems

Vielen Dank für Ihre

Aufmerksamkeit!