Perspectives in Medicine (2014) 2, 79—90

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Perspectives in Medicine

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EINGELADENER ÜBERSICHTSARTIKEL

Anwendung der Platinspeziation zumNachweis einer Aktivierung oderInhibierung von Pt enthaltendenKrebsmedikamenten�

Bernhard Michalke ∗

Helmholtz-Zentrum München — Deutsches Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit, AbteilungAnalytische BioGeoChemie, Ingolstädter Landstr. 1, 85764 Neuherberg, Deutschland

Eingegangen am 3. August 2009; angenommen am 11. Januar 2010

SCHLÜSSELWÖRTERPlatinspeziation;Krebsmedikamente;Cisplatin;Carboplatin;Oxaliplatin

Zusammenfassung Dieser Artikel gibt einen Überblick über die Platinspeziation im Hin-blick auf Pt-haltige Medikamente, die zur Krebstherapie eingesetzt werden. Zunächst werdendie verfügbaren Medikamente auf Platin-Basis vorgestellt und ihr vermuteter Reaktionsme-chanismus wird beschrieben. Inzwischen ist allgemein akzeptiert, dass diese Pt-Komplexeihre therapeutische Wirkung durch koordinative Bindung an die DNA entfalten, was zurBiegung der DNA-Struktur und zur Inhibierung der DNA-Polymerasereaktion führt. Dosislimi-tierende Nebenwirkungen, wie z. B. Nephrotoxizität und Resistenz gegenüber einigen dieserPt-Verbindungen, stellen jedoch immer immer noch ein erhebliches Problem dar. Die Platin-speziation rückte immer mehr in das Zentrum des Interesses, als bekannt wurde, dass (1) dieaktiven Wirkstoffen nicht die ursprünglich verabreichten Medikamente selbst, sondern derenHydrolyseprodukte sind und dass (2) die gleichzeitige Bildung inaktiver Pt-Proteinkomplexe,die die Wirksamkeit der antitumoralen Pt-Medikamente zusätzlich reduzieren, mit der Bil-dung der zytotoxischen Pt-DNA-Läsionen konkurrieren. Es wurden auf Chromatographie oderKapillarelektrophorese beruhende Methoden der Speziationsanalyse eingesetzt und jeweils inKombination mit Massenspektrometrie (MS) mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP) oder mit

Elektrospray-Ionisation-(ESI-)Massenspektrometrie angewendet.

Im Artikel werden diese Pt-Speziationsexperimente beschrieben, die mit Untersuchungenzur Hydrolysekinetik in wässriger Lösung ihren Anfang nahmen. Auf diese Experimente folg-ten Speziationsuntersuchungen in Modelllösungen, die Proteine oder schwefelhaltige Ligandenenthielten, welche ebenfalls für die Deaktivierung des Pt-Wirkstoffs in vivo verantwortlichsein könnten. Die Experimente führten zu einem besseren Verständnis der metabolischen

DOI von Original Artikel: http://dx.doi.org/10.1016/j.jtemb.2010.01.006.� Dieser Artikel wurde in Englisch als Invited Review im Journal of Trace Elements in Medicine and Biology 24 (2010) 69—77 publi-

ziert. Aus dem Englischen von: Cornelia Schmutzler. E-Mail-Adresse: CABSchmutzler@aol.com. Deutsche Version online verfügbar seit:20. November 2013.

∗ Tel.: +49 89 3187 4206; fax: +49 89 3187 3348.E-Mail-Adresse: bernhard.michalke@helmholtz-muenchen.de

2211-968X/$ — see front matter © 2014 Published by Elsevier GmbH.http://dx.doi.org/10.1016/j.permed.2013.09.005

80 B. Michalke

Form, in der der Metallkomplex in die Tumorzellen gelangt. Außerdem wurde mit ihnengeklärt, ob der metabolisierte Komplex zu diesem Zeitpunkt schon inaktiviert ist und, wennja, auf welche Weise. Beispielsweise wurde die Kinetik der Reaktion von Cisplatin (cis-[Diammindichloroplatin(II)]) mit Albumin, Transferrin, Myoglobin, Ubiquitin und Metallothioneinuntersucht und die Reaktionsprodukte wurden speziiert.Darüber hinaus führten verschiedene Forschungsgruppen Pt-Speziationsuntersuchungen im Serumbehandelter Krebspatienten durch, die im Abschnitt ,,Untersuchungen in Serum oder Plasma’’dargestellt sind.Der Abschnitt ,,Untersuchungen im Urin behandelter Krebspatienten’’ befasst sich mit Spe-ziationsexperimenten an denjenigen Metaboliten der Pt-Komplexe, die vom Organismusausgeschieden werden. Auf diese Weise könnte sich eine Beurteilung des in-vivo-MetabolismusPt-haltiger Medikamente durchführen lassen. Schließlich werden im letzten Abschnitt des Artikelsanalytische Techniken beschrieben, die für die Entwicklung neuer metallhaltiger Krebsmedika-

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mente erforderlich sind.© 2014 Published by Elsevier GmbH.

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Einleitung: Pt-haltige Medikamente und Wirkmechanismus ................................................................ 80Speziationsuntersuchungen................................................................................................ 82

Speziation von Hydrolysaten: Untersuchungen in wässriger Lösung ................................................... 82Untersuchungen in Modelllösungen, die Proteine und/oder andere schwefelhaltige Liganden enthalten .............. 83

Interaktionen mit Proteinen ................................................................................... 83Interaktionen mit kleinen Liganden ............................................................................ 84Interaktionen mit Nukleotiden ................................................................................. 85

Untersuchungen in Serum oder Plasma ............................................................................... 85Untersuchungen im Urin behandelter Krebspatienten................................................................. 87Untersuchungen an neuen Pt-haltigen Medikamenten................................................................. 87

Schlussfolgerungen ........................................................................................................ 87Offenlegung von Interessenkonflikten ..................................................................................... 88Danksagung ............................................................................................................... 88

inleitung: Pt-haltige Medikamente undirkmechanismus

orschungsarbeiten über Platin waren hauptsächlich durcheine Verwendung in Arzneimitteln und seine Emission inie Umwelt motiviert. Historisch gesehen wurde die Platin-peziation anfangs wegen der Akkumulation des Edelmetallsn der Umwelt durchgeführt, insbesondere nach Einfüh-ung von Katalysatoren auf Pt-Basis für Kraftfahrzeuge.edoch wurde die Pt-Speziation bald auf biologische undlinische Fragestellungen ausgedehnt, da Pt Allergien aus-ösen kann und weil es - seine interessanteste Eigenschaft -as Schlüsselmetall in vielen Krebsmedikamenten ist. Seineharmakologische Anwendung bei der Krebstherapie, seineirkungskinetik in vivo und sein Vorliegen im Abwasser vonliniken veranlasste die Speziation von Pt insbesondere iminblick auf den Grad der Aktivierung und Inaktivierung vont-Verbindungen während der Krebstherapie. Hauptsächlichiese pharmakologischen Aspekte der Pt-Speziation werdenn diesem Artikel besprochen.

Der Antitumor-Mechanismus von Platin: Bei verschie-enen Tumorarten kann die Mortalitätsrate durch dienwendung hochaktiver Medikamente, die häufig Metal-atome enthalten, dramatisch gesenkt werden. Dies gilt

inhibieren, ein Befund, der für die Krebstherapie vonhöchster Bedeutung war und 1965 von Rosenberg et al.erstmals publiziert wurde [1]. Inzwischen wurde für eineReihe von Pt-haltigen Verbindungen gezeigt, dass sieantitumorale Aktivität oder in dieser Hinsicht zumindestvielversprechende Eigenschaften aufweisen. Einige davon,z. B. Cisplatin und Carboplatin ({(SP-4-2)-Diammin[1,1-cyclobutandi(-carboxylato-�O)-(2-)]platin(II)}), werden zurChemotherapie von Hoden-, Ovarial-, Kopf-, Hals-, Blasen-und Lungenkarzinomen eingesetzt. Cisplatin war das erstePt-haltige Medikament, das bei der Krebsbehandlung ange-wendet wurde, und kann als die Stammverbindung dieserKlasse von Antitumor-Wirkstoffen gelten [2].

In den letzten drei Jahrzehnten wurden vielerlei Anstren-gungen im Hinblick auf die Synthese und die Erprobungder tumorinhibierenden Eigenschaften neuer Metallkom-plexe unternommen, die u. a. Pt, Ru oder Pd enthalten,mit dem Hauptziel, neue Krebsmedikamente zu entwickeln.Von diesen erhofft man sich bessere Wirksamkeit, höhereSelektivität für Tumorgewebe, geringere Toxizität, einbreiteres Aktivitätsspektrum, weniger Resistenzentwicklungdurch die Tumorzellen und günstigere pharmakologischeEigenschaften (z. B. die Möglichkeit der oralen Einnahme)im Vergleich zu Cisplatin. Jedoch wurde bisher von Tau-

nsbesondere für Medikamente auf Platin-Basis, die beier Behandlung einer Vielzahl von Malignomen zu denffektivsten Wirkstoffen gehören. In den 1960er Jahrenntdeckte Roberts, dass Pt-Komplexe die Zellteilung

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enden getesteter metallhaltiger Verbindungen nur eineringer Teil, etwa 30, in klinischen Studien geprüft,nd nur wenige der Pt-haltigen Wirkstoffe sind weltweitugelassen worden [3,4]. Beispielsweise ist für Cisplatin

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Anwendung der Platinspeziation

und Carboplatin gleichermaßen bekannt, dass die cis-Diamminplatin(II)-Spezies zytotoxische Aktivität aufweisen,die trans-Diamminplatin(II)-Spezies dagegen nicht. DerUnterschied zwischen den beiden Isomeren hinsichtlichder Antitumor-Aktivität wird der Tatsache zugeschrie-ben, dass das trans-Isomer aufgrund des 180◦-Winkelszwischen seinen semi-labilen Chlorid- bzw. Carboxylat-Liganden keine 1,2-GpG-Intrastrangvernetzungen ausbildenkann [5]. Weiterführende Untersuchungen konzentriertensich auf Oxaliplatin {(SP-4-2)-[(1R,2R)Cyclohexandiamin-�2N,N’][(ethandioato(2-)-�2O1,O2]-platin(II)}, das in Frank-reich zur Behandlung von Kolorektalkarzinomen zugelassenist. Bei Tests an Cisplatin-resistenten Tumoren wies Oxali-platin keine Kreuzresistenz mit Cisplatin auf und zeigte auchnur geringe Nephrotoxizität.

Derzeit werden drei intravenös zu verabreichendePt(II)-Komplexe, Cisplatin, Carboplatin und Oxaliplatin,weltweit in der klinischen Praxis eingesetzt [6]. Abgesehenvon diesen drei Medikamenten haben Nedaplatin {(SP-4-3)-diammin[(hydroxyl-�O)acetat(2-)-�O]platin(II)}, Lobaplatin{(SP-4-3)-[(1R,2R)-1,2-cyclobutandimethanamin-�N,�N’][(2S)-2-(hydroxy-�O)propanoato(2-)�O]platin}und Heptaplatin {(SP-4-2)-[(4R,5R)-2-(1-methylethyl)-1,2-dioxolan-4,5-dimethanamin-�N4,�N5][propandioato(2-)-�O1,�O3]platin} ausschließlich lokal begrenzte Anwendungals Krebsmedikamente in Japan, China bzw. Südkoreagefunden [4,7—9]. Weiterhin werden etwa 10 Platinver-bindungen in klinischen Studien getestet, darunter deroral zu verabreichende Pt(IV)-komplex Satraplatin {(OC-6-43)-bis(acetato-�O)ammindichloro(cyclohexanamin-

�N)platin(IV),JM216}[7,10]. In Abb. 1 ist die chemischeStruktur von vier wichtigen Pt-haltigen Medikamentendargestellt.

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Abb. 1 Die chemischen Strukturen von Cisplatin (a), Carboplatin (bmit freundlicher Genehmigung von Elsevier.

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Roberts und Pascoe haben als erste die Interaktion zwi-chen Pt und DNA nachgewiesen - inzwischen das allgemeinkzeptierte Konzept für die therapeutische Wirkung nichtur von Cisplatin sondern auch von allen anderen derben erwähnten Metallkomplexe. Diese Pt-Spezies gehenine koordinative Bindung mit der DNA ein, was zu eineriegung der DNA-Struktur um 30◦ bis 40◦ führt [11—13].chließlich wird, als Konsequenz der Inhibierung der DNA-olymerasereaktion [14], Apoptose bzw. Nekrose in derrebszelle induziert [15]. Die Addukte aus Platin und DNAder (Oligo-)Nukleotiden sind ausführlich charakterisiertorden [4,10,16—18]. Als bevorzugtes Ziel in der DNA wur-en die Guanin-Reste identifiziert, mit denen die meistenntrastrang-Addukte zwischen den Pt-Komplexen und derNA ausgebildet werden. Unglücklicherweise sind alle dieset-haltigen Medikamente jeweils nur gegen eine begrenztenzahl von Tumorarten chemotherapeutisch wirksam undie Behandlung selbst ist von erheblichen Nebenwirkun-en begleitet. Zu diesen dosislimitierenden Nebenwirkungenehört auch Nephrotoxizität, die zwar in Pt-basiertenedikamenten der zweiten Generation wie Carboplatin

eduziert ist, jedoch immer noch ein großes Problem beier Krebstherapie darstellt. Schließlich verhindert auch dieon den Krebszellen entwickelte Resistenz gegen Cispla-in und verwandte Verbindungen eine wirksame Behandlungestimmter Arten von Neoplasien.

Die Effizienz, mit der Pt-haltige Medikamente eine koor-inative Bindung an die DNA eingehen, ist von zweierleibhängig: einerseits von der Bildung des tatsächlich aktivenydrolyseprodukts und andererseits davon, ob es durch Bin-

ung an Serumproteine oder schwefelhaltige Aminosäurender Peptide inaktiviert wird. Die genaue Rolle, die Pt-roteinkomplexe bei der Aktivität der Medikamente spielen,

), Lobaplatin (c) und Oxaliplatin (d). Aus Timerbaev et al. [25],

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uss jedoch noch geklärt werden. In einigen Publikatio-en wurde vorgeschlagen, dass Cisplatin-bindende Proteineie Ursache für viele der Nebenwirkungen des Medikamentsein könnten [19]. Inzwischen ist klar, dass die Bildungon Pt-Proteinkomplexen, die effektiv mit der Bildung derytotxischen Pt-DNA-Läsionen kompetiert, die Wirksamkeiton Pt-haltigen Krebsmedikamenten reduzieren kann undass der Pt-Proteinkomplex keine signifikante Antitumor-ktivität aufweist [5].

Da der Abbau der Pt-haltigen Medikamente zu den akti-en Hydrolysaten erster Ordnung zeitabhängig ist, richtetich die Reaktivität der Medikamente nach der Hydroly-ekinetik. Diese Hydrolysekinetik wiederum wird negativeeinflusst durch parallel ablaufende Inaktivierungsreak-ionen, die durch die Bindung des Pt-Medikaments anerumproteine und -peptide, zumeist über Schwefelgrup-en, ausgelöst werden.

Daher muss Interaktionen des metallhaltigen Medika-ents mit makromolekularen Komponenten des Blutesesondere Aufmerksamkeit gewidmet werden. Solcheakromoleüle können anschließend vom Tumorgewebe auf-enommen werden und darin akkumulieren. In diesemusammenhang stellt die Bindung an Serumproteine einenichtigen Aspekt dar, wenn diese Proteine, also z. B. Albu-in oder Transferrin, eine Funktion beim Pt-Transportaben könnten. Solche Interaktionen bestimmen auch dieesamtverteilung und Exkretion des Medikaments sowienterschiede bei Wirksamkeit, Aktivität und Toxizität [20].

Folglich war es das Ziel der Forscher, den Wirkmecha-ismus von Pt-haltigen Medikamenten aufzudecken, indemie deren Speziation nach Aktivierung durch Hydrolyse oderach Inhibierung durch Serumproteine untersuchten. Dieingesetzten Methoden der Speziationsanalyse basiertenuf Chromatographie oder Kapillarelektrophorese undurden jeweils in Kombination mit Massenspektrome-

rie (MS) mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP) oderit Elektrospray-Ionisierungs-(ESI-)Massenspektrometrie

ngewendet.Die Arbeiten begannen mit der Untersuchung der

ydrolysekinetik der Pt-haltigen Medikamente in wässri-er Lösung (Abschnitt ,,Speziation von Hydrolysaten:ntersuchungen in wässriger Lösung’’), gefolgt von Expe-imenten zur Hydrolysekinetik in Modelllösungen, dieroteine und/oder schwefelhaltige Liganden enthieltenAbschnitt ,,Untersuchungen in Modelllösungen, die Prote-ne und/oder andere schwefelhaltige Liganden enthalten’’).on den letzteren Experimenten erwartete man sich wei-ere Informationen zu den komplexen Wechselwirkungenwischen der Hydrolyse/Aktivierung und der Inaktivie-ung/Elimination der Pt-Medikamente aus dem reaktivenool. Unterstützende Untersuchungen wurden anschlie-end im Serum (Abschnitt ,,Untersuchungen in Serumder Plasma’’) und Urin (Abschnitt ,,Untersuchungenm Urin behandelter Krebspatienten’’) von Patientenurchgeführt.

In Urinproben kann auch die zeitabhängige Pt-Speziationach kompletter Metabolisierung und Exkretion unter-ucht werden. Darüber hinaus kann die Pt-Speziation zur

bschätzung von möglichen Risiken durch Krankenhaus-bwasser beitragen. Schließlich wurde dieselbe Analyse-trategie auch bei der Entwicklung neuer Pt-Medikamentengewendet.

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B. Michalke

peziationsuntersuchungen

peziation von Hydrolysaten: Untersuchungen inässriger Lösung

ann et al. [21] setzten die HPLC-ICP-MS zur Spezia-ion von Cisplatin und seinen Abbauprodukten in Wasserei verschiedenen Chloridkonzentrationen ein. Diese Studieasierte auf dem Befund, dass die Kinetik des Cisplatinab-aus zu hydrolysierten, aktiven Formen langsam erfolgtnd anscheinend von der Cl--Konzentration abhängig ist.n Anwesenheit von flüssigem Medium, das nur geringeonzentrationen an Chlorid enthielt, bildeten sich sowohler Monohydratkomplex cis-[PtCl(NH3)2(H2O)]+ als auch derihydratkomplex cis-[Pt(NH3)2(H2O)2]2+. Der Monohydrat-omplex hat sich als die zytotoxischere Spezies von deneiden Cisplatin-Hydraten herausgestellt. Beide hydratisier-en Spezies binden über Intra- und Interstrang-Crosslinks anen Guanosin-Rest der DNA [22].

Bei ihrer grundlegenden Arbeit wendeten Hann und Mitar-eiter zur exakten Quantifizierung die spezies-unspezifischeost-column-Isotopenverdünnungsanalyse in Verbindung mitCP-MS zur Bestimmung der Isotopen 194Pt und 196Pt an [21].ur Beurteilung des kinetischen Profils wurden frisch her-estellte Cisplatin-Lösungen mit einer Konzentration von

mg/l (in 0, 50 und 100 mg/l Cl−) sofort sowie anschließend8 Stunden lang in regelmäßigen Abständen von 1,6 Stun-en und zuletzt noch einmal nach 48 Stunden analysiert.ie Kinetik der Hydratation von Cisplatin wurde, unter dernnahme, dass die Chloridkonzentration in der 50-mg/l- under 100-mg/l-Lösung konstant blieb, als pseudo-erster Ord-ung angesehen. Bei diesen hohen Chloridkonzentrationenar die Bildung neuer, unbekannter Verbindungen ausge-

chlossen, da die Summe der Konzentrationen von Cisplatin,onoaqua-Cisplatin und Diaqua-Cisplatin während der Mes-

ungen stets konstant blieb [21].Darüber hinaus waren die Autoren in der Lage, milli-

olare Mengen von Cisplatin in ausschließlich wässrigerösung zu inkubieren und Chlorid in ihr kinetisches Modellu integrieren. Diese Modellhydrolyse von Cisplatin undonoaqua-Cisplatin konnte ebenfalls als Reaktion ersterrdnung behandelt werden, im Gegensatz zu den früherenodellen mit Cisplatin in Lösungen hoher Chloridkonzen-

ration nahm jedoch die Summe der Konzentrationen vonisplatin, Monoaqua-Cisplatin und Diaqua-Cisplatin wäh-end der Reaktion ab, während die Summe unbekanntert-Spezies zunahm. Die errechneten Reaktionsgeschwindig-eiten betrugen 1,79 x 10-5/s, 1,68 x 10-5/s und 2,06 x 10-5/sei einer Chloridkonzentration von 0, 50 bzw. 100 mg/l,eweils für den ersten Aquationsschritt. Die Geschwindig-eitskonstanten der Reaktionen wurden in das kinetischeodell eingeführt und am Computer wurden Ausgleichskur-en berechnet. Dies ist in Abb. 2 dargestellt.

Es sollte angemerkt werden, dass der Versuchsaufbauffenbar zuverlässig funktionierte und anderen überlegenar, da bei dem System zur Auftrennung der Spezies Pro-leme vermieden worden waren, die andere Autoren mit

rganischen Elutionsmitteln wie Acetonitril beobachtet hat-en (z. B. [23]).

Wenclawiak und Wollmann [24] präsentierten einennderen analytischen Ansatz zur Auftrennung verschiedener

Anwendung der Platinspeziation

Abb. 2 Abbau von Cisplatin bei einer Chloridkonzentrationvon 0 mM. Die durchgezogenen Linien geben die Ausgleichskur-

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ven der Reaktionsgeschwindigkeiten an. Aus Hann et al. [21],mit freundlicher Genehmigung der Royal Society of Chemistry.

Platin-Medikamente und ihrer Hydrolyseprodukte. IhreArbeit zielte auf die kinetische Messung der Stabiliät vonPt-Komplexen in wässriger Lösung mithilfe der Kapillar-elektrophorese. Die SDS-Konzentration und der pH-Wertdes Hintergrundelektrolyten sowie die angelegte Span-nung und die Probeninjektionsbedingungen wurden sooptimiert, dass die Trennung von Cisplatin, [cis-Diammin-aquachloroplatin]+ und [cis-Diammin-diaquaplatin]2+ ineinem Lauf durchgeführt werden konnte. Die Methodeerlaubte die Untersuchung der Stabilität von Cisplatin inWasser oder in Natriumchloridlösungen mit Konzentratio-nen von 100 mM oder 4 mM (der Konzentration im Blutbzw. Zytoplasma) durch Verfolgen der relativen Abnahmeder Peak-Fläche des Medikaments [25]. Außerdem war derAbbau von Cisplatin von der Chloridkonzentration abhängig.Die kinetischen Kurven waren den von Hann et al. beschrie-benen ähnlich [21].

Zhang et al., die sich auf die Aquation zweierzweikerniger antitumoraler Pt-Komplexverbindungenin 15 mM Perchlorat-, Acetat- oder Phosphatlösungenkonzentrierten, wandten bei ihrer Studie die NMR-Spektroskopie an [26]. Die Geschwindigkeitskonstantedes ersten Aquationsschrittes war für [{cis-PtCl(NH3)(2)}(2)(mu-NH2(CH2)(6)NH2)](2+) halb so großwie für [{trans-PtCl(NH3)(2)}(2)(mu-NH2(CH2)(6)NH2)](2+),jedoch waren die Geschwindigkeitskonstanten für die Hin-und die Rückreaktionen mit Acetat und Phosphat bei beidenVerbindungen recht ähnlich, so dass sich nur langsam, näm-lich erst nach etwa 80-100 h Gleichgewichtsbedingungeneinstellten.

Nygren et al. entwickelten eine neue Methode zurPt-Speziation hydrophiler und hydrophober Verbindungenin einem einzigen Lauf, indem sie hydrophile Interakti-onschromatographie (HILIC) mit ICP-Massenspektrometriekombinierten [23]. Die Methoden erforderten wenigerLösungsmittel bei der ICP-MS, was die Sensitivität fürden Analyten und die Robustheit des Verfahrens verbes-serte. Die Methode bot eine wertvolle Alternative zur

raschen Analyse freier und intakter Krebsmedikamente aufPlatin-Basis. Dieser Erfolg motivierte Falta et al. [27], dasVerfahren zur Quantifizierung von Platin-haltigen Medika-menten in gespikten Proben von Humanplasma einzusetzen.

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iese Experimente werden im Abschnitt ,,Untersuchungenn Serum oder Plasma’’ beschrieben.

ntersuchungen in Modelllösungen, die Proteinend/oder andere schwefelhaltige Ligandennthalten

nteraktionen mit Proteineniner der kritischsten Engpässe bei der Entwicklung neueretallhaltiger Krebsmedikamente besteht in der Notwen-igkeit genauerer Informationen über die metabolischeorm, in der der Metallkomplex in die Tumorzellen gelangtder darüber, ob dieser metabolisierte Komplex zu die-em Zeitpunkt schon inaktiviert ist und, wenn ja, aufelche Weise. Publizierten Daten zufolge [15] sind Pt-altige Medikamente bereits kurz nach der Verabreichungum größten Teil an extra- und intrazelluläre Proteineebunden. Ein typischer Ansatz zur Untersuchung vonrotein-Medikamenten-Interaktionen und ihrer jeweiligeninetik besteht in der Speziation ungebundener und gebun-ener Fraktionen des Pt-haltigen Medikaments mittels SEC28—30]. Solche Untersuchungen werden v. a. unter Ver-endung von Albumin als Interaktionspartner für Cisplatinurchgeführt, es wurden jedoch auch Experimente mit-Globulin oder sogar Cytochrom c beschrieben [6]. Einemeinsames Ergebnis verschiedener SEC-Studien ist dieweistufige Natur des Bindungsprozesses, wobei der erstechritt schneller abläuft.

In einer Arbeit von Timerbaev et al. [31] wurde CE ange-endet, um die Interaktionen von Cisplatin mit Albuminus Humanserum (HSA) zu untersuchen. Sie fanden, dassie Reaktionsgeschwindigkeit höher ist, wenn das molareerhältnis Cisplatin/HSA erhöht wird. Die kinetische Kurveeigte ein Maximum bei einem 20-fachen Überschuss vonisplatin, wobei 10 Mol Platin pro Mol Protein gebundenaren. Dies zeigte eine starke Metall-Protein-Koordinationn verschiedenen Bindungsstellen im HSA an und anschei-end nicht nur Bindung an einen Cystein-Rest des Proteins31]. Auch die Kombination von CE und ICP-MS wurde ver-endet, um die Kinetik der Cisplatin-Albumin-Reaktion zuessen und die Anzahl der an das Protein gebundenen Medi-

amentenmoleküle zu bestimmen [25]. Wenn das molareerhältnis Medikament/Protein anstieg, stieg auch die Reak-ionsgeschwindigkeit; das Maximum der kinetischen Kurveurde bei einem 20-fachen Überschuss von Cisplatin beitwa 50 h erreicht. Die Reaktion wurde als pseudo-ersterrdnung mit k = 5,5 x 10-5/s charakterisiert. Dieses kineti-che Verhalten wie auch die Beobachtung, dass ein größerereil des Pt gebunden war, widersprach früheren Ergebnissen,ie anhand der Trennung der Pt-Spezies durch Größen-usschlusschromatographie erhaltenen worden waren. Eineögliche Erklärung könnte ein generelles Problem beier Speziationsanalyse sein: die Stabilität des Komple-es (der Spezies) während der Trennung an stationärenhasen. Da nämlich bei der KapillarzonenelektrophoreseCZE) zur Trennung der Pt-Spezies deren unterschiedlicheanderungsgeschwindigkeiten im elektrischen Feld, ent-

prechend ihren unterschiedlichen m/z-Werten, genutzterden anstatt der Interaktion mit der stationären Phase,ilt es als gesichert, dass die Stabilität der Spezies beier CZE besser gewahrt bleibt als bei der Trennung durch

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C (z. B. SEC) [32]. Die abweichenden Ergebnisse der frü-eren, SEC-basierten Experimente wurden daher in dieserublikation mit einem Verlust der Bindung während deselfiltrationsverfahrens erklärt, das zur Abtrennung desngebundenen Platins verwendet worden war [30].

Die Gruppe um Sanz-Medel [15] verfolgte einen ,,Bottom-p’’-Ansatz bei der Untersuchung der Interaktionen zwi-chen Pt-Medikamenten und Proteinen. HSA, TransferrinTF) und Immunglobulin G (IgG) wurden mit Cisplatin inteigenden Konzentrationen inkubiert und dann mittelsPLC—ICP-MS analysiert. Die Autoren waren in der Lage,

nnerhalb von 40 min nicht gebundenes Cisplatin, Cisplatin-F und Cisplatin-HSA nachzuweisen. Im Fall von TF wurdenarallel auch die Schwefel- und Eisen-Peaks untersucht.SA zeigte innerhalb von 24 h völlige Komplexierung, dangenommen wurde, dass 80 % des Medikaments exkretiertder anderswo gespeichert wurden. Die berechnete moleku-are Stöchiometrie betrug Pt:HSA = 4:1. Transferrin bildetebenfalls Komplexe mit Pt. Dies war an den parallel eluie-enden Peaks für S (TF-Apoprotein), Fe (eisenbeladenesF) und Pt ersichtlich. Das Addukt wies eine Stöchiome-rie von 1:1 auf. Pt ersetzte offenbar nicht das Eisenn seiner spezifischen Bindungsstelle im Transferrin. Ininem zweiten Schritt ihres Bottom-up-Ansatzes wurden dieisplatin-Protein-Interaktionen durch ESI-Q-TOF-MS charak-erisiert [15]. Durch diese Experimente konnte zum erstenal gezeigt werden, dass Cisplatin zu einer Spaltung vonisulfidbrücken im HSA mit der Möglichkeit einer intermole-ularen Quervernetzung des Proteinmoleküls führt.

Xie et al. [5] untersuchten die Reaktionsprodukte nachnkubation von Carboplatin mit HSA und �-Globulin, daeide Proteine zusammen mehr als 80 % des gesamten Plas-aproteins ausmachen. Innerhalb einiger Tage nahm derarboplatin-Peak signifikant ab und stattdessen nahm eineuer Peak zu, der Carboplatin-HSA zugeschrieben wurde.ach 21 Tagen waren mehr als 70 % des Carboplatin mit HSAomplexiert, wohingegen �-Globulin in diesem Zeitraum zuinem Komplex mit einer 1:1-Stöchiometrie reagierte.

Tatsächlich wurde von Ivanov et al. [33] mittels NMRethionin als das primäre Ziel im HSA bestätigt. Sie

dentifizierten Methionin (nicht dagegen Cystein) als dieauptsächliche schwefelhaltige Bindungsstelle bei der Inter-ktion von Cisplatin mit verschiedenen Arten von Albumin.n derselben Arbeit wurde ein an der Bildung eines S,N-akrochelats beteiligter stickstoffhaltiger Ligand entdeckt.ndererseits wurde mittels NMR kein Beleg dafür gefunden,ass Histidinreste bei der Bindung von Cisplatin an Albuminls N-Donoren eine Rolle spielen.

Andere Proteine, die im Hinblick auf die Bindungsrate anisplatin untersucht wurden, waren Myoglobin, Ubiquitin,etallothionein und noch einmal Transferrin [6]. Die Kine-

ik der Bindung von Cisplatin an zelluläres Metallothioneinar pseudo-erster Ordnung und die Geschwindigkeitskon-

tante betrug 6,3 x 10-4/s 1 (�1/2 = 18 min). Cox et al.34] dagegen wiesen durch NMR-Messungen einen imesentlichen zweiphasigen kinetischen Prozess für dieeaktion zwischen Cisplatin und Apotransferrin nach.ie schlugen vor, dass zelluläres Metallothionein erheb-

iche Mengen an Cisplatin abfangen kann und deshalbesentlich zur Resistenz gegen Cisplatin beitragen kann.hnliche Interaktionen mit Albumin wurden auch für Pt-altige Medikamente der dritten Generation wie z. B.

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B. Michalke

xaliplatin gezeigt [50]. Dieser Wirkstoff wird zunächsturch sequenzielle Abspaltung des Oxalat-Liganden inine ,,Pt-CHXN’’-Spezies [CHXN = (1R,2R)-Cyclohexan-1,2-iamin] überführt. Der aktive Metabolit ,,Pt-CHXN’’ reagiertasch mit Schwefelfunktionen in kleinen Biomolekülen wielutathion, Cystein und Methionin und daraufhin mit Pro-einen, Albumin und �-Globuline, unter Ausbildung einerovalenten Bindung [6].

nteraktionen mit kleinen Ligandenisplatin und Carboplatin wurden auch im Hinblick auf

hre Reaktivität mit S-haltigen Liganden getestet, ins-esondere mit L-Methionin (L-Met). Zur Trennung unddentifizierung der Pt-Spezies wurde LC-MS eingesetzt.ie endgültigen Reaktionsprodukte, [(NH3)2(Met)]Pt undwei Isomere, [(Met)2]Pt, waren in beiden Fällen iden-isch (Cisplatin und Carboplatin) [35]. Die Isomere wiesennterschiedliche chromatographische Retentionszeitenuf. In Gegenwart einer Natriumchloridlösung (150 mM)eagierte sowohl Carboplatin als auch Cisplatin mit L-et zu fünf Methionin-Platin-Addukten. Dieser Befund

tützte Ergebnisse von Studien anderer Arbeitsgrup-en, denen zufolge Carboplatin in diesem Medium inisplatin umgewandelt wird [22]. Weitere Untersuchun-en konzentrierten sich auf Oxaliplatin. Luo et al. [36]eschrieben eine HPLC-Methode zur Untersuchung deriotransformationsprodukte von Oxaliplatin unter Verwen-ung von 3H-markiertem Oxaliplatin und 35S-markiertenukleophilen (z. B. Glutathion, Cystein, Methionin,arnstoff, Aspartat, Creatinin und einige andere) zumachweis von ,,Pt-DACH’’-BiotransformationsproduktenPt-Komplexe, die 1,2-Diaminocyclohexan-Carrierligandennthalten, werden als ,,DACH’’-Komplexe bezeichnet)22]. Als hauptsächliche Biotransformationsprodukteurden ein Pt-DACH-Biscysteinkomplex, ein Pt-DACH-onomethioninkomplex und freies DACH identifiziert.eniger häufige Produkte waren u. a. ein Pt-DACH-ichlorokomplex, ein Pt-DACH-Diglutathionkomplex und eint-DACH-Monoglutathionkomplex.

Die Interaktionen von Cisplatin, Carboplatin und ihrennaloga mit Nukleosid-Monophosphaten, Di- und Trinukleo-iden wurden von Keppler und Mitarbeitern mittels CEn Kombination mit einem Diodenarray-Detektor systema-isch untersucht [37—40]. Die Adduktbildung führte beien modifizierten Nukleotiden im Vergleich zu den freienukleotiden zu einer deutlichen Verschiebung von �max ininen niedrigeren Energiebereich. Daher konnte die Iden-ifizierung der einzelnen Platin-Nukleotid-Addukte auf derrundlage sowohl der charakteristischen UV-Spektren alsuch der Unterschiede im elektrophoretischen Verhaltenrfolgen. Die Kinetik der Bindungseigenschaften von 5’-GMPn Cisplatin unter simulierten physiologischen Bedingun-en wurde von derselben Gruppe untersucht, wobei derhloridkonzentration im Inter- und Intrazellulärraum beson-ere Aufmerksamkeit gewidmet wurde [38]. Es konnteachgewiesen werden, dass die Bildung von Addukten deut-ich durch die Anwesenheit von Chloridionen beeinflusst

ird. Darüber hinaus wurde der Einfluss der schwefelhalti-en �-Aminosäuren L-Methionin und L-Cystein untersucht,ie eine starke Interaktion mit Pt-haltigen Chemothera-eutika zeigten. Unglücklicherweise liefert die Analyse

85

Abb. 3 Chromatogramme einer Serumprobe nach 5 min,3 h und 24 h Inkubation mit Cisplatin, analysiert auf einerGrößenausschluss-Chromatographiesäule Die SignalintensitätbG

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Anwendung der Platinspeziation

mittels UV-spektroskopischer Detektion allein nur begrenzteStrukturinformationen für die Platin-DNA-Addukte. Datenzur Struktur wurden jedoch mittels ESI-MS-Detektion beider Charakterisierung platinierter DNA-Nukleotide erhal-ten [41]. In zwei weiteren Arbeiten schlug Reedijk vor,dass in Proteine eingebaute Pt-Methionin-Addukte als Platin-Reservoir für die spätere DNA-Platinierung dienen könnten[42].

Interaktionen mit NukleotidenAlle oben dargestellten Untersuchungen haben gezeigt,dass sich bei Patienten, die mit Pt-haltigen Medikamen-ten behandelt werden, eine große Anzahl von Pt-Adduktenbildet, und dass die Bildung von DNA-Addukten mit Cispla-tin ein entscheidender pharmakokinetischer Parameter ist,der bei einer Krebstherapie, die sich auf Pt-haltige Medika-mente stützt, in jedem Fall optimiert werden muss. Daherist nicht nur die Identifizierung von Pt-DNA-Adduktspeziessondern auch die Quantifizierung der DNA-Addukte mit Cis-platin außerordentlich wichtig. Folglich haben Sar et al.[43] eine Studie durchgeführt, bei der DNA-Nukleotidenach in-vitro-Inkubation mit Cisplatin mittels ESI-Q-TOF-MSuntersucht wurden. Es gelang die strukturelle Charakterisie-rung der zwischen reinem Guanosinmonophosphat (dGMP)und Cisplatin gebildeten Komplexe. Anschließend wurdendie DNA-Addukte mittels HPLC—ICP-MS quantifiziert, wobeidas DNA-Rückgrat anhand des 31P in P-Peptiden detektiertwurde. Dies war möglich durch den Einsatz einer Kollisions-zelle oder einer dynamischen Reaktionszelle. Gleichzeitigwurde das 195Pt-Isotop gemessen, um Cisplatin-DNA-Adduktenachzuweisen. Mit diesem Ansatz war eine Schätzung derKonzentration der Cisplatin-DNA-Addukte in in-vivo-DNA-Proben möglich [43]. Auf das Nukleotid GMP konzentriertensich auch Arbeiten von Gammelgaard et al. [44] und Hannet al. [45]. Ihre Studien waren durch die Tatsache motiviert,dass die Antitumor-Aktivität von Pt-haltigen Medikamentenim Allgemeinen auf ihrer koordinativen Bindung an freieElektronenpaare, insbesondere am Guanin, beruht. Daheruntersuchten beide Gruppen die zeitaufgelöste Interaktionvon Cisplatin mit Guanosin-Monophosphat, wobei sie sichinsbesondere auf die Bildung der Mono- und Bis-Addukte zwi-schen dem Pt-Medikament und GMP konzentrierten. Hannund Mitarbeiter verfolgten den Ablauf der zeitabhängigenReaktion zwischen Cisplatin und 5’-GMP mittels HPLC-ICP-MS. Aufgrund des zweistufigen Mechanismus wurdezusammen mit dem Hauptprodukt, dem Bis-Addukt cis-[Pt(NH3)2(GMP)2]2− ein Mono-Addukt als Zwischenproduktbeobachtet. Darüber hinaus lieferte die HPLC—ICP-sf-MSeindeutige stöchiometrische Informationen über das GMP-Hauptaddukt. Zu diesem Zweck wurde das Pt/P-Verhältnisdurch simultane Messung von 31P und 195Pt bestimmt. Dasermittelte Pt/P-Signalverhältnis von 1/2 stimmt mit demmolaren Verhältnis im Bis-Addukt cis-[Pt(NH3)2(GMP)2]2−

überein.

Untersuchungen in Serum oder Plasma

Cisplatin ist unter den zur Chemotherapie von Hoden- oderEierstockkrebs angewendeten Medikamenten immer nochdie erste Wahl [3,4,46]. Seine Nephrotoxizität und dieEntwicklung zellulärer Resistenz [47,48] können jedoch zu

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ezieht sich auf 195Pt. Aus Szpunar et al. [51], mit freundlicherenehmigung von Elsevier.

omplikationen führen, und nach sehr hoher Dosierung kanns zu karzinogenen und genotoxischen Effekten kommen, dieas Risiko für sekundäre Malignome deutlich erhöhen. Dieseebenwirkungen von Cisplatin sind die Folge von Reaktio-en des Medikaments mit Serumkomponenten, insbesondereroteinen und schwefelhaltigen Aminosäuren. Daher wurdeie Untersuchung von Biotransformationsprodukten imerum als grundlegende Voraussetzung für eine systemati-che Krebstherapie und als der logische nächste Schritt nacher Untersuchung der Pt-Protein-Interaktionen in Modelllö-ungen angesehen. Da es sich bei diesen Experimenten umie Weiterführung der oben beschriebenen Versuchen zuen aktiven Pt-CHXN-Komplexen mit S-haltigen Proteinenandelt (siehe Abschnitt ,,Untersuchungen in Modelllösun-en, die Proteine und/oder andere schwefelhaltige Ligandennthalten’’), wurden sie anschließend mit Plasma durchge-ührt. Dabei wurde festgestellt, dass etwa 85 % des gesamtenlatins z. B. von Oxaliplatin innerhalb von 5 Stunden Inkuba-ion an Plasmaproteine gebunden waren. Ähnliche Resultateurden erhalten, wenn die Interaktion des Medikamentsit Gesamtplasma oder nur mit Albumin untersucht wurde

[49,50]. Jedoch ließ sich im Fall von Oxaliplatin keinekkumulation von Pt beobachten, was z. T. die fehlendeephrotoxizität sowie die verzögerte und reversible Neuro-oxizität erklären könnte.

Szpunar et al. [15] waren die ersten, die mit SEC—ICP-S kombinierte Speziationsverfahren einsetzten, um die

nteraktion von Cisplatin mit Serum zu untersuchen. Abb. zeigt die zeitabhängigen Veränderungen in Chromato-rammen einer Serumprobe, die mit Cisplatin inkubierturde. Nach 3 h Inkubation waren noch etwa 80 % desedikaments ungebunden; dieser Wert liegt etwas nied-

iger als der, welcher in früheren, mittels Ultrafiltrationurchgeführten Studien beobachtet worden war. Auchelegte dieses mittels SEC erhaltene Ergebnis (60 ± 10 kDaür den Hauptbindungspartner von Pt) deutlicher, dassSA (66,5 kDa) ein Pt-Bindungsprotein ist, als die mit-

els Ultrafiltration erhaltenen Resultate. Darüber hinausot die Kombinationsmethode im Hinblick auf Geschwin-igkeit, Zweckmäßigkeit, Selektivität und Genauigkeit bei

86

Abb. 4 MECK-Elektropherogramm von mit Cisplatin gespik-tem Serum (Peak 1). Elektrolyt: 110 mM SDS, 50 mM NaH2PO4, pH7,4. Die MECK-Methode war optimiert worden mit dem Ziel, diePt-Spezies von den Serum-Matrixkomponenten zu trennen. Diesresultierte auch in der gewünschten Separation von Cisplatinvon seinen Hydrolyseprodukten (Peaks zwischen 9 und 23 min)iG

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n den Serumproben. Aus Huang et al. [52], mit freundlicherenehmigung von Elsevier.

er Unterscheidung zwischen den verschiedenen Protein-etallkomplex-Konjugaten erhebliche Vorteile im Vergleichu Methoden auf der Grundlage von Ultrafiltration undnschließender off-line durchgeführter Metallbestimmung.edoch stellte die irreversible Adsorption von Cisplatin odereiner Hydrolyseprodukte an das Säulenmaterial ein Problemar [6] (siehe Abschnitt ,,Untersuchungen in Modelllösun-en, die Proteine und/oder andere schwefelhaltige Ligandennthalten’’).

Huang et al. [52] führten, unter Einsatz der mizellarenlektrokinetischen Kapillarchromatographie (MECK) und dersotachophorese (ITP) mit indirekter UV-Detektion, eine wei-ere Studie zur Interaktion von Cisplatin und Serum sowie zuruantifizierung von Hydrolyse- und Biotransformationspro-ukten von Cisplatin durch. Bei dieser Vorgehensweise lagie Nachweisgrenze (limit of detection, LoD) für Pt-Speziesei 2-5 mMol/l, was für die Untersuchung von Pt-Spezies imerum nach partieller Biotransformation von intravenös ver-breichtem Cisplatin als ausreichend angesehen wurde [52].ei dieser Arbeit stellte sich heraus, dass ein zuvor beschrie-enes CE-Puffersystem mit 50 mM SDS, das zur Trennung vonydrolyseprodukten von Cisplatin in Modelllösungen ausrei-hend gewesen war, eine nur unzureichende Trennung vont-Spezies in Serumproben ergab. Daher wurde die MECK-ethode im Hinblick auf die Separation der Analytspezieson den Matrixkomponenten im Serum optimiert. Bei einerDS-Konzentration von > 110 mM wurde die Pt-Spezies zufrie-enstellend von den Serumkompontenten getrennt. Dadurcherbesserte sich die gewünschte Auflösung zwischen Cis-latin und seinen Hydrolyseprodukten in Serumproben.eiterhin beeinflusste auch die Phosphatkonzentration die

rennung von Cisplatin von seinen Hydrolyseprodukten undusste sorgfältig optimiert werden. Abb. 4 zeigt die Ana-

yse von Cisplatin in gespiktem Serum nach Optimierung derECK-Methode.

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B. Michalke

Mit den Bedingungen der transienten ITP, die derECK-Trennung vorgeschaltet war, wurde eine vorherigeufkonzentrierung der Pt-Spezies ungeachtet der Leitfä-igkeit der Probe erreicht. Die gleichzeitige Anwendungieser Methode entweder auf Cisplatin-Proben in wässri-er, chloridhaltiger Lösung oder auf Cisplatin-Proben inerum ergab vollkommen verschiedene (zeitabhängige)isplatin/Monoaqua-Cisplatin-Quotienten, wobei diese inisplatin-Serum-Proben etwa 200-mal höher waren (Ver-ältnis 3,15-4,04). Insgesamt gesehen zeigte die Kinetik inerum eine ähnliche Zeitabhängigkeit wie die in chloridhal-iger Lösung (siehe [21]), jedoch lagen die Reaktionskon-tanten deutlich niedriger. In einer aktuellen Arbeit unter-uchten Moller et al. erstmals die Anwendbarkeit zweierE—ICP-MS-Zerstäuber auf Pt-Speziationsexperimente [53].

hren Ergebnissen zufolge zeigte der CEI-100-Zerstäuberine fünffach höhere Sensitivität und wurde daher für Expe-imente zur Bindung von Carboplatin an Serumproteine, v. a.SA, verwendet. Mit steigender Inkubationszeit nahm dereak des freien Wirkstoffs ab und es erschien ein Pt-HSA-eak. Die Wiederfindung lag nach 5-minütiger Inkubationei nahezu 100 % im Vergleich zu einem internen Standard,obei aus Gründen der Qualitätskontrolle zwei Pt-Isotopeemessen wurden. Nach 24 h lag der mittlere Prozentsatzes freien Carboplatin bei etwa 70 % und nach 48 h bei etwa0 %.

Xie et al. [5] verwendeten eine ähnliche SEC—ICP-MS-echnik wie Szpunar et al. [51] und untersuchten dieeitabhängige Reaktion von Carboplatin mit Serumprote-nen. In dieser Arbeit beobachteten sie den Zeitverlaufer Pt-Speziation in Plasmaproben von Patienten, dieich einer Chemotherapie unterzogen, und fanden, dassie Konzentration von Carboplatin abnahm, währendarboplatin-HSA gebildet wurde. Der Grund dafür war derirekte Austausch von Pt-Liganden in Carboplatin durchreie Sulfhydryl–(Thiol-)Gruppen von Cysteinresten in der-Helix des HSA. Außerdem wurde Carboplatin-�-Globulinntersucht.

In einer kürzlich publizierten Arbeit setzten Falta et al.27] HILIC in Kombination mit ICP-Massenspektrometrie zuruantifizierung von Cisplatin, Carboplatin und Oxaliplatin

n gespikten humanen Plasmaproben ein. Zunächst unter-uchten die Autoren die Verteilung dieser Pt-Medikamenten verschiedenen Blutkompartimenten wie Vollblut, Plasma-elletfraktion, Plasma-Ultrafiltrat und Protein-Restfraktion.s stellte sich heraus, dass die Verteilung unabhängig voner anfänglichen Konzentration, aber abhängig vom verwen-eten Medikament war. Der im Ultrafiltrat vorgefundenet-Anteil betrug 16,8 %, 56,8 % und 10,4 % im Fall vonisplatin, Carboplatin bzw. Oxaliplatin. Mit dem HILIC—ICP-S-Ansatz ließ sich schließlich zeigen, dass 88 ± 12 % desisplatins und 106 ± 7 % des Carboplatins als Ausgangssub-tanz vorlagen, Oxaliplatin dagegen blieb nur zu 34 ± 0,4 %nverändert.

Es ist erwähnenswert, dass die Nebenwirkungen von Cis-latin nicht nur auf Reaktionen mit Proteinen im Serumeschränkt sind, sondern auch Komponenten im Zielge-ebe betreffen. Daher wird die Charakterisierung von

iotransformationsprodukten in Gewebe als weiterführendentersuchung zum Verständnis der systematischen Problemeei der Krebstherapie angesehen und hier ebenfalls kurzrwähnt.

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Anwendung der Platinspeziation

Esteban-Fernández et al. [54] führten In-vivo-Experimente an Ratten aus, denen Pt-Medikamenteinjiziert wurden. Die Autoren untersuchten die Bindungvon Platin an Proteine in der Niere und im Innenohr,um die nephrotoxischen und ototoxischen Effekte vonPt-Medikamenten zu charakterisieren. Nach Behandlungvon Ratten mit Cisplatin, Carboplatin und Oxaliplatin wurdedie Pt-Akkumulation in den beiden Organen analysiert. DieErgebnisse zeigten deutlich, dass nicht nur der (Gesamt-) Pt-Gehalt, sondern vielmehr die Struktur des Medikaments (dietatsächliche Pt-Spezies) für die Änderung der Organfunk-tion verantwortlich ist. Speziationsstudien an Proben derNiere und des Innenohrs mittels 2D-Flüssigchromatographie(Größenausschlusschromatographie + FPLC) in Kombinationmit ICP-MS demonstrierten eine vollständige Bindung desPlatin an Proteine. Ein Metallothionein-Standard eluiertebei derselben Retentionszeit wie einige der cytosolischenPt-Biomoleküle. Peaks des freien Pt-Medikaments wurdennicht beobachtet.

Untersuchungen im Urin behandelterKrebspatienten

Urin wird als Matrix für das Pt-Biomonitoring verwendet,um den Zeitverlauf der Pt-Exkretion nach der Verabreichungzu verfolgen und die biologische Halbwertszeit zu bestim-men. Außerdem lassen sich die Pt-Metaboliten (Spezies), dieletztlich vom Organismus ausgeschieden werden, charakte-risieren. Auf diese Weise könnte sich eine Beurteilung desin-vivo-Metabolismus Pt-haltiger Medikamente durchführenlassen.

Speziation des Urins von Krebspatienten zeigt, dass etwa40 % der Ausgangssubstanz (Cisplatin) in hydrolysierter Formals Monoaqua-Cisplatin exkretiert werden [21]. Der restli-che Teil wird als (natives) Cisplatin exkretiert, das dannentsprechend der für hohe Chloridkonzentrationen ermit-telten Kinetik hydrolysiert wird. In einer weiteren Arbeit,durchgeführt von Tang et al. [55], wurde die Speziation vonPlatinverbindungen in Urin von Patienten, die mit Cisplatinbehandelt worden waren, mittels HPLC— ICP-MS untersucht.Bei der Analyse trat als Hauptkomponente Cisplatin auf,jedoch wurden auch ein Monoaqua-Cisplatinkomplex und einPt-Creatininkomplex im Verhältnis 1:1 identifiziert. Letzte-rer, so wurde festgestellt, war die zweithäufigste Pt-Speziesim Urin. Weitere Peaks entsprachen Cisplatin-Harnstoffund Cisplatin-Harnsäure, die beide durch Vergleich ihrerRetentionszeiten mit der von Standardsubstanzen identifi-ziert wurden. Bei einem parallel durchgeführten Experimentwurde Urin von Carboplatin-behandelten Patienten unter-sucht. In diesem Fall war die hauptsächliche Pt-Speziesim Urin die Ausgangssubstanz Carboplatin [55]. Keine derseltener auftretenden Spezies stimmte mit einer derjeni-gen überein, die sich in Proben nachweisen ließen, welchenach einer Cisplatin Behandlung genommen worden waren.Drei Wochen nach der Behandlung war es anscheinendzur Transformation gekommen, da eine der Proben sowohlCisplatin als auch dessen Monoaqua-Komplex enthielt. Koel-

lensperger et al. [56] entwickelten eine spezies-spezifischeIDMS-Methode zur genauen Quantifizierung von Carbopla-tin in Urin mittels LC—ESI-TOF-MS und LC—ICP-MS. Bei derIDMS wurde mit 194Pt angereichertes Carboplatin eingesetzt.

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87

ur Trennung der Spezies musste ein Kompromiss zwischenusreichender Trennung und einer Zusammensetzung deslutionsmittels gefunden werden, das sowohl für die ES-ls auch für die ICP-Ionisierung geeignet ist. Mit dieserethode waren die Autoren in der Lage, Carboplatin in Urinbzutrennen und genau zu quantifizieren. Die kombinierte,nalytische Gesamtunsicherheit betrug 5,7%.

Untersuchungen am Abwasser onkologischer Stationen,as den Urin der Patienten enthielt, sind in [21] beschrie-en. Solche Proben enthalten Metaboliten von Pt-haltigenedikamenten sowie die exkretierten restlichen nativen Pt-edikamente aus dem Urin der Patienten, darüber hinaus

edoch wahrscheinlich auch zusätzliche Reaktionsproduktees Abwassers mit Pt-Spezies aus dem Urin. Diese Messungenrgaben, dass der Anteil des exkretierten intakten Cispla-ins etwa ebenso hoch war wie der von Monoaqua-CisplatinPt-Gesamtkonzentration: 60 �g/l). Anders bei Carboplatin:ufgrund seiner Stabiliät erreichte Carboplatin die Abwas-eraufbereitung intakt [57], wohingegen Messungen im Fallon Oxaliplatin mehr als 15 verschiedene Metaboliten erga-en sowie nur einen geringen Anteil der Ausgangssubstanz58].

ntersuchungen an neuen Pt-haltigenedikamenten

m Fall neu entwickelter metallhaltiger Krebsmedikamenteind die dargestellten analytischen Techniken erforder-ich, um die Interaktion des intakten Wirkstoffs mitiologisch relevanten Molekülen sowie seine Umwandlungnter physiologischen Bedingungen zu untersuchen. Vac-hina et al. [59] entwickelten daher auf der Basis derationenaustausch-HPLC-ICP-MS eine Methode zum Nach-eis des neuen Triplatinkomplexes ,,BBT 3464’’ (als freiirkulierendes Medikament) und seiner Metaboliten imerum. Die LoD war sehr niedrig, 0,5 �g/l Pt bzw. 0,15 �g/lt nach vorheriger Aufkonzentrierung. Diese Methode wurdeberprüft und als geeignet für die Bestimmung von unverän-ertem ,,BBR 3464’’ in humanem Plasma bei einer klinischenhase-II-Studie befunden.

Darüber hinaus ergab eine Auswertung der Literatur zueuen metallhaltigen Krebsmedikamenten nur wenige neueandidaten für Chemotherapeutika. Diese enthielten jedochlle Rutheniumkomplexe, die nicht Thema dieses Über-ichtsartikels sind.

chlussfolgerungen

rebsmedikamente auf Platin-Basis sind wirksame Chemo-herapeutika und im Fall der meisten Malignome immeroch die am häufigsten eingesetzten Wirkstoffe. Ihr Wirk-echanismus hängt ab von der Interaktion mit DNA under Inhibition der DNA-Polymerasereaktion, was letztlich zurpoptose der Tumorzelle führt. Beim Transport Pt-haltigeredikamente sowie ihrem Wirkmechanismus spielen Serum-roteine eine wichtige Rolle. Es hat sich herausgestellt, dassei der Ausbildung von Bindungen an Bioliganden insbeson-

ere schwefelhaltige Peptide und Proteine von Bedeutungind.

In diesen wichtigen Bereich der Forschung zurnwendung und zum Wirkmechanismus von Pt-haltigen

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hemotherapeutika wurden effiziente analytische Spezia-ionsmethoden eingeführt. Die meisten Methoden stützenich auf verschiedene HPLC-Trenntechniken in direkterombination mit sensitiven und selektiven Detektionsme-hoden. Die ICP-Massenspektrometrie nimmt inzwischenine herausragende Stellung als eine solche Detektions-ethode ein, da sich mit ihr vergleichsweise einfacht-spezifische Signale von Krebsmedikamenten und ihrenydrolyseprodukten online messen lassen. Die mittelsPLC-ICP-MS erhaltenen Ergebnisse wurden durch Struk-urinformationen, z. B. aus ESI-MS-Experimenten, weiterestützt. Bei der Aufklärung rascher kinetischer Verän-erungen wurden zur raschen Trennung von Pt-Speziesogar Kapillarelektrophoresetechniken eingesetzt. Aufiese Weise haben Methoden der Platinspeziation erheblichum Verständnis der Aktivierung der Medikamente durchydrolyse bzw. zu ihrer Inaktivierung durch Bindung anroteine beigetragen. Solche Untersuchungen wurden nichtur in sorgfältig kontrollierten Modellen, sondern auch inerumproben von Patienten durchgeführt. Die Ergebnisseer letzteren Experimente bestätigten die anhand vonodelllösungen gewonnenen Einsichten. Die Speziationon Urinproben von Patienten erbrachte Informationenum Zeitverlauf der Pt-Exkretion und über die biologischealbwertszeit. Weiterhin ermöglichte die Pt-Speziation inrin den Nachweis von Pt-Metaboliten, die letztlich vomrganismus ausgeschieden wurden, und damit die Beur-eilung des Metabolismus der Pt-Medikamente in vivo. Diergebnisse der Pt-Speziation wurden auch zur Beurteilunger Wirksamkeit neuer Chemotherapeutika auf Platin-Basisngewendet und erbrachten frühzeitige Informationen zuhrer möglichen Affinität, Reaktionen mit deaktivierendeniganden einzugehen.

Es besteht kein Zweifel, dass die Platinspeziation vonen interessanten Entwicklungen auf dem Gebiet derpeziationsmethoden insgesamt profitieren wird. Daraufufbauend kann sie dazu beitragen, weitere Problemeei der Forschung über Pt-haltige Medikamente zu lösen,nd diesem wichtigen Forschungsfeld einige starke Impulseeben.

ffenlegung von Interessenkonflikten

eim Autor besteht kein Interessenkonflikt.

anksagung

er Autor möchte Herrn Prof. Dr. S. Halbach für die kritischeurchsicht des Manuskripts danken.

Dieser Review ist Teil der Serie von Übersichtsartikelnber Spurenelemente in dieser Zeitschrift, die von deresellschaft für Mineralstoffe und Spurenelemente e. V.

nitiiert wurde.

iteratur

[1] Rosenberg B, van Camp L, Krigas T. Inhibition of cell divisionin Escherichia coli by electrolysis products from a platinumelectrode. Nature 1965;205:698—9.

[

B. Michalke

[2] Rosenberg B. The start platinum complexes for the treatmentof cancer: why the search goes on. In: Lippert B, editor. Cispla-tin: chemistry and biochemistry of a leading anticancer drug,vol. 4. Zurich: Helvetica Chimica Acta; 1999. p. 3—30.

[3] Wong E, Giandomenico DM. Current status of platinum-basedanti-tumor drugs. Chem Rev 1999;99:2451—66.

[4] Galanski M, Arion VB, Jakupec MA, Keppler BK. Recent develop-ments in the field of tumor-inhibiting metal complexes. CurrPharm Des 2003;9:2078—89.

[5] Xie R, Johnson W, Rodriguez L, Gounder M, Hall GS, BuckleyB. A study of the interactions between carboplatin and bloodplasma proteins using size exclusion chromatography coupledto inductively coupled plasma mass spectrometry. Anal BioanalChem 2007;387:2815—22.

[6] Timerbaev AR, Hartinger ChG, Aleksenko SS, Keppler BK.Interactions of antitumor metallodrugs with serum proteins:advances in characterization using modern analytical metho-dology. Chem Rev 2006;106:2224—48.

[7] Jakupec MA, Galanski M, Keppler BK. Tumour-inhibiting plati-num complexes — state of the art and future perspectives. RevPhysiol Biochem Pharmacol 2003;146:1—53.

[8] McKeage MJ. Lobaplatin: a new antitumour platinum drug.Expert Opin Invest Drugs 2001;10:119—28.

[9] Galanski M, Jakupec MA, Keppler BK. Update of the preclinicalsituation of anticancer platinum complexes: novel design stra-tegies and innovative analytical approaches. Curr Med Chem2005;12:2075—94.

10] Guo Z, Sadler PJ. Metals in medicine. Angew Chem Int Ed1999;38:1513—31.

11] Takahara PM, Frederick CA, Lippard SJ. Crystal structure of theanticancer drug cisplatin bound to duplex DNA. J Am Chem Soc1996;118:12309—12.

12] Takahara PM, Rosenzweig AC, Frederick CA, Lippard SJ. Crystal-structure of double-stranded DNA containing the major adductof the anticancer drug cisplatin. Nature 1995;377:649—52.

13] Silverman AP, Bu W, Cohen SM, Lippard SJ. 2.4-A cry-stal structure of the asymmetric platinum complex{Pt(ammine)(cyclohexylamine)}(2+) bound to a dodecamerDNA complex. J Biol Chem 2002;277(51):49743—9.

14] Gelasco A, Lippart SJ. NMR solution structure of a DNA dode-camer duplex containing a cis-diammineplatinum(II) d(GpG)intrastrand cross-link, the major adduct of the anticancer drugcisplatin. Biochemistry 1998;37(26):9230—9.

15] Esteban-Fernández D, Montes-Bayon M, Gonzales EB, GomezGomez MM, Palacios MA, Sanz-Medel A. Atomic (HPLC—ICP-MS)and molecular mass spectrometry (ESI-Q-TOF) to study cispla-tin interactions with serum proteins. J Anal Atom Spectrom2008;23:378—84.

16] Reedijk J. New clues for platinum antitumor chemistry: kineti-cally controlled metal binding to DNA. Proc Natl Acad Sci USA2003;100:3611—6.

17] Reedijk J. Medicinal applications of heavy-metal compounds.Curr Opin Chem Biol 1999;3:236—40.

18] Guo Z, Sadler PJ. Medicinal inorganic chemistry. Adv InorgChem 2000;49:183—306.

19] Appleton TG. Donor atom preferences in complexes of platinumand palladium with amino acids and related molecules. CoordChem Rev 1997;166:313—59.

20] Kratz R, Keppler BK, Hartmann M, Messori L, Berger MR.Comparison of the antiproliferative activity of two antitu-mour ruthenium(III) complexes with their apotransferrin andtransferrin-bound forms in a human colon cancer cell line. MetBased Drugs 1996;3(1):15—23.

21] Hann S, Koellensperger G, Zs Stefánka, Stineder G, FürhackerM, Buchberger W, Mader RM. Application of HPLC—ICP-MS to

speciation of cisplatin and its degradation products in watercontaining different chloride concentrations and in humanurine. J Anal Atom Spectrom 2003;18:1391—5.

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

Anwendung der Platinspeziation

[22] Barefoot RR. Speciation of platinum compounds: a review ofrecent applications in studies of platinum anticancer drugs. JChromatogr B 2001;751:205—11.

[23] Nygren Y, Hemstroem P, Astot C, Naredi P, Bjoern E. Hydrophilicinteraction liquid chromatography (HILIC) coupled to induc-tively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) utilizing amobile phase with a low-volatile organic modifier for determi-nation of cisplatin, and its monohydrolyzed metabolite. J AnalAtom Spectrom 2008;23(7):948—54.

[24] Wenclawiak BW, Wollmann W. Separation of platinum(II)anti-tumour drugs by micellar electrokinetic capillary chroma-tography. J Chromatogr A 1996;724:317—26.

[25] Timerbaev ARK, ung A, Keppler BK. Capillary electrophoresis ofplatinum group elements — analytical speciation and bioche-mical studies. J Chomatogr A 2002;945:25—44.

[26] Zhang J, Thomas DS, Davies MS, Berners-Price SJ, FarrellN. Effects of geometric isomerism in dinuclear platinumantitumor complexes on aquation reactions in the presenceof perchlorate, acetate and phosphate. J Biol Inorg Chem2005;10(6):652—66.

[27] Falta Th, Koellensperger G, Standler A, Buchberger W, MaderRM, Hann S. Quantification of cisplatin, carboplatin andoxaliplatin in spiked human plasma samples by ICP—SFMSand hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)combined with ICP-MS detection. J Anal Atom Spectrom2009;24:1336—42.

[28] Chen D, Ohta N, Ukai M, Masuda M, Yotsuyanagi T.Binding and aggregation of human gamma-globulin by cis-diamminedichloroplatinum(II) through disulfide bond. BiolPharm Bull 1994;17(12):1561—6.

[29] Trynda-Lemiesz L, Kozlowski H, Keppler BK. Effect of cis-,trans-diamminedi-chloro-platinum(II) and DBP on human serumalbumin. J Inorg Biochem 1999;77:141—6.

[30] Yotsuyanagi T, Ohta N, Futo T, Ito S, Chen D, Ikeda K. Multipleand irreversible binding of cis-diamminedichloroplatinum(ii) tohuman serum-albumin and its effect on warfarin-binding. ChemPharm Bull 1991;39:3003—6.

[31] Timerbaev AR, Aleksenko SS, Polec-Pawlak K, Ruzik R, Seme-nova O, Hartinger CG, Oszwaldowski S, Galanski M, JaroszM, Keppler BK. Platinum metallo-drug—protein binding stu-dies by capillary electrophoresis-inductively coupled plasmamass spectrometry: characterization of interactions betweenPt(II) complexes and human serum albumin. Electrophoresis2004;25:1988—95.

[32] Michalke B. The coupling of LC to ICP-MS in element speciation:1. General aspects. Trends Anal Chem 2002;21(2):142—53.

[33] Ivanov AI, Christodoulou J, Parkinson JA, Barnham KJ, TuckerA, Woodrow J, Sadler PJ. Cisplatin binding sites on human albu-min. J Biol Chem 1998;273:14721—30.

[34] Cox MC, Barnham KJ, Frenkiel TA, Hoeschele JD, Mason AB,He QY, Woodworth RC, Sadler PJ. Identification of platinationsites on human serum transferrin using C-13 and N-15 NMRspectroscopy. J Biol Inorg Chem 1999;4:621—31.

[35] Heudi O, Mercier-Jobard S, Cailleux A, Allan P. Mechanisms ofreaction of L-methionine with carboplatin and oxaliplatin indifferent media: a comparison with cisplatin. Biopharm DrugDispos 1999;20:107—16.

[36] Luo FR, Yen TY, Wyrick SD, Chaney SG. High-performance liquidchromatographic separation of the biotransformation productsof oxaliplatin. J Chromatogr B 1999;724:345—56.

[37] Zenker A, Galanski M, Bereuter TL, Keppler BK, Linder W.Capillary electrophoretic study of cisplatin interaction withnucleoside monopho-sphates, di- and trinucleotides. J Chro-matogr A 1999;852:337—46.

[38] Zenker A, Galanski M, Bereuter TL, Keppler BK, Linder W.

Kinetics of binding properties of 5’-GMP with cisplatin undersimulated physiological conditions by capillary electrophoresis.J Chromatogr B 2000;745:211—9.

[

89

39] Zenker A, Galanski M, Bereuter TL, Keppler BK, LinderW. Time-dependent interactions of platinum(II) complexeswith 5’-GMP under simulated physiological conditions stu-died by capillary electrophoresis. J Biol Inorg Chem 2000;5:498—504.

40] Küng A, Zenker A, Galanski M, Keppler BK. Capillary electro-phoretic study of carboplatin and analogues with nucleosidemonophosphates, di- and trinucleotides. J Inorg Biochem2001;83:181—6.

41] Warnke U, Gysler J, Hofte B, Tjaden UR, Van der GreefJ, Kloft C, Schunack W, Jaehde U. Separation and iden-tification of platinum adducts with DNA nucleotides bycapillary zone electrophoresis and capillary zone electropho-resis coupled to mass spectrometry. Electrophoresis 2001;22:97—103.

42] Reedijk J. Why does cisplatin reach guanine-N7 with com-peting S-donor ligands available in the cell? Chem Rev1999;99:2499—510.

43] Sar DG, Montes Bayon M, Gonzales EB, Sanz-Medel A.Speciation studies of cisplatin adducts with DNA nucleo-tides via elemental specific detection (P and Pt) usingliquid chromatography—inductively coupled plasma massspectrometry and structural characterization by electro-spray mass spectrometry. J Anal Atom Spectrom 2006;21:861—8.

44] Gammelgaard B, Hansen HR, St urup S, Moller Ch. The use ofinductively coupled plasma mass spectrometry as a detectorin drug metabolism studies. Expert Opin Drug Metab Toxicol2008;4(9):1187—207.

45] Hann S, Zenker A, Galanski M, Bereuter TL, Stingeder G,Keppler BK. HPLC-UV—ICP-SFMS study of the interaction of cis-platin with guanosine monopho-sphate. Fresenius J Anal Chem2001;370(5):581—6.

46] Lippart B. Cisplatin chemistry and biochemistry of a leadinganticancer drug. Zurich: Helvetica Chimica Acta;; 1999.

47] O’Dwyer PJ, Stevenson JP, Johnson SW. Clinical status of cis-platin, carboplatin and other platinum based antitumor drugs.In: Lippart B, editor. Cisplatin: chemistry and biochemistry of aleading anticancer drug. Zurich: Helvetica Chimica Acta; 1999.p. 31—71.

48] McKeage MJ. Clinical toxicology of platinum-based cancerchemotherapeutic agents. In: Kelland LR, Farrel N, editors.Platinum-based drugs in cancer therapy. Totawa, NJ: HumanaPress; 2000. p. 251—75.

49] Biosdron-Celle M, Lebouil A, Allain P, Gamelin E. Pharma-cokinetic properties of platinium derivatives. Bull Cancer2001;88:S14—9.

50] Graham MA, Lockwood GF, Greenslade D, Brienza S, Bayssas M,Gamelin E. Clinical pharmacokinetics of oxaliplatin: a criticalreview. Clin Cancer Res 2000;6:1205—18.

51] Szpunar J, Makorov A, Pieper T, Keppler BK, Łobinski R. Inve-stigation of metallodrug—protein interactions by size-exclusionchromatography coupled with inductively coupled plasma massspectrometry (ICP-MS). Anal Chim Acta 1999;387:135—44.

52] Huang Z, Timerbaev AR, Keppler BK, Hirokawa T. Determi-nation of cisplatin and its hydrolytic metabolite in humanserum by capillary electrophoresis techniques. J ChromatogrA 2006;1106:75—9.

53] Moller Ch, Stürup S, Hansen HR, Gammelgaard B. Comparisonof two CE—ICP-MS interfaces and quantitative measurementsof carboplatin in plasma samples using an internal standard. JAnalyt Atom Spectrom 2009;24(9):1208—12.

54] Esteban-Fernández D, Gómez-Gómez MM, Canas B, Verda-guer JM, Ramirez R, Palacios MA. Speciation analysis ofplatinum antitumoral drugs in impacted tissues. Talanta

2007;72(2):768—73.

55] Tang X, Hayes II JW, Schroder L, Cacini W, Depta G, DorseyJ, Edler RC, Tepperman K. Determination of biotransformation

9

[

[

[

[specific monitoring of a new triplatinum anti-cancer drug

0

products of platinum drugs in rat and human urine. Met BasedDrugs 1997;4:97—101.

56] Koellensperger G, Zs Stefanka, Meelich K, Galanski M, KepplerBK, Stingerder G, Hann S. Species specific IDMS for accuratequantification of carboplatin in urine by LC—ESI-TOFMS andLC—ICP-QMS. J Anal Atom Spectrom 2008;23:29—36.

57] Lenz K, Köllensperger G, Hann S, Weissenbacher N, Mahnik SN,Fuehrhacker M. Fate of cancerostatic platinum compounds inbiological wastewater treatment of hospital effluents. Chemo-sphere 2007;69:1765—74.

B. Michalke

58] Hann S, Zs Stefanka, Lenz K, Stingeder G. Novel separa-tion method for highly sensitive speciation of cancerostaticplatinum compounds by HPLC—ICP-MS. Anal Bioanal Chem2005;381:405—12.

59] Vacchina V, Torti L, Allievi C, Łobinski R. Sensitive species-

and its potential related compounds in spiked human plasmaby cation-exchange HPLC—ICP-MS. J Anal Atom Spectrom2003;18:884—90.