Aus dem Institut für Bakteriologie und Mykologie der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig

Untersuchungen zur präbiotischen Wirkung von Lactulose auf die Mikroflora des Magen–Darm–Traktes von Sauen im peripartalen Zeitraum

Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Grades eines

Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.) durch die Veterinärmedizinische Fakultät

der Universität Leipzig

Eingereicht von Kemal Işık aus Sivas

Leipzig, 2004

Mit Genehmigung der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig Dekan: Prof. Dr. Gotthold Gäbel Betreuer: Prof. Dr. habil. Monika Krüger Gutachter: Prof. Dr. habil. Monika Krüger

Direktorin des Institutes für Bakteriologie und Mykologie der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig PD Dr. Manfred Fürll Medizinische Tierklinik der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig PD Dr. Herbert Nattermann Robert Koch-Institut, Zentrum für Biologische Sicherheit, Berlin

Tag der Verteidigung: 11. Oktober 2004

Für

Susam, Arda

und

meine Eltern

Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Bedeutung des Magen–Darm–Traktes 3 2.1.1 Eubiose und Dysbiose im Darm 3 2.1.2 Magen–Darm–Flora 5 2.1.2.1 Entwicklung der Magen–Darm–Flora 6 2.1.2.2 Besiedlung des Magen–Darm–Traktes 7 2.2 Magen–Darm–Flora der Schweine 8 2.2.1 Qualitative Zusammensetzung 8 2.2.2 Quantitative Zusammensetzung 9 2.3 Magen–Darm–Barriere 10 2.3.1 Unspezifische Abwehrmechanismen 10 2.3.1.1 Regulationsmechanismen des Magen–Darm–Traktes 11 2.3.1.2 Die autochthone Darmflora 14 2.3.2 Spezifische Abwehrmechanismen 15 2.3.2.1 Darmassoziierte Immunsystem (GALT) 16 2.4 Einflussfaktoren auf die Magen–Darm–Flora 17 2.4.1 Futterzusatzstoffe und Antibiotika 17 2.4.2 Probiotika 18 2.4.3 Präbiotika 19 2.4.3.1 Lactulose 20 2.4.3.2 Allgemeines 20 2.4.3.3 Chemisch–physikalische Eigenschaften der Lactulose 21 2.4.3.4 Wirkungen der Lactulose auf die Magen–Darm–Flora 22 2.4.3.5 Wirkungen der Lactulose auf das Immunsystem 25 2.4.3.6 Weitere Wirkungen der Lactulose 26 2.5 Bakterielle Translokationen 27 2.6 Puerperalstörungen bei den Sauen 29 2.6.1 Begriffsbestimmung 29 2.6.2 Ätiologie des MMA–Komplexes 30 2.6.2.1 Primäre Ursachen 30 2.6.2.2 Sekundäre Ursachen 31 2.6.2.3 Infektiöse Ursachen 32 2.6.2.4 Nicht–infektiöse Ursachen 33

Inhaltsverzeichnis 2.6.3 Pathogenese des MMA–Komplexes 33 2.6.4 Symptomatik und Diagnose 35 2.6.5 Prophylaxe und Metaphylaxe des MMA–Komplexes 35 2.6.6 Therapiemöglichkeiten 36 2.7 Auswirkungen des MMA–Komplexes auf die Ferkel 37 3 Material und Methoden 39 3.1 Tiermaterial, Gruppenaufteilung und –kennzeichnung 39 3.1.1 Sauen 39 3.1.2 Ferkel 39 3.1.3 Lactulose 40 3.2 Probengewinnung 42 3.2.1 Kotproben 42 3.2.2 Milchproben 43 3.2.3 Futterproben 43 3.3 Auswertungsmethodik der Leistungsparameter 44 3.4 Mikrobiologische Untersuchung und Auswertung 44 3.4.1 Aerobe Gesamtkeimzahl 46 3.4.2 Aerobe Keimzahl Gram–negativer Bakterien 46 3.4.3 Keimzahl an Clostridium perfringens 47 3.4.4 Keimzahl an Bdellovibrionen 48 3.5 Enzymologische Untersuchungen 50 3.5.1 Alkalische Phosphathase 50 3.6 Immunologische Untersuchungen 50 3.7 Statistische Analysen 51 4 Ergebnisse 52 4.1 Ergebnisse der bakteriologischen Untersuchengen 52 4.1.1 Ergebnisse der aeroben Gesamtkeimzahl 52 4.1.2 Ergebnisse der aeroben Keimzahl Gram–negativer Bakterien 53 4.1.3 Ergebnisse der Keimzahl an Clostridium perfringens 53 4.1.4 Ergebnisse der Keimzahl an Bdellovibrionen 54 4.2 Ergebnisse der enzymologischen Untersuchungen 57 4.2.1 Ergebnisse der Alkalischen Phosphathase–Bestimmung 57 4.3 Ergebnisse der immunologischen Untersuchungen 58

Inhaltsverzeichnis 4.3.1 C–reaktives Protein 58 4.3.2 Anti–Phospholipase C–Antikörper von C. perfringens 59 4.3.3 Anti–LPS–Antikörper 60 4.4 Leistungsparameter 61 4.4.1 Reproduktions– und Aufzuchtleistung der Sauen 61 4.4.2 Ferkelleistungen 64 5 Diskussion 65 5.1 Untersuchte Substrate 65 5.1.1 Kot 65 5.1.2 Milch 65 5.2 Auswahl der bakteriologischen Untersuchungsparameter 65 5.3 Auswahl der immunologischen Parameter 66 5.4 MMA–Komplex und seine Regulierung 67 5.5 Einfluss der Lactulose auf die bakteriologischen Parameter 69 5.5.1 Aerobe Gesamtkeimzahl 70 5.5.2 Aerobe Keimzahl Gram–negativer Bakterien 70 5.5.3 Clostridium perfringens 71 5.5.4 Bdellovibrionen 71 5.6 Enzymologische Parameter 72 5.6.1 Alkalische Phosphathase 72 5.7 Einfluss der Lactulose auf immunologische Parameter 72 5.7.1 C–reaktives Protein 72 5.7.2 Gehalt an Anti–Phospholipase C–Antikörpern 73 5.7.3 Gehalt an Anti–LPS–Antikörpern 74 5.8 Leistungsparameter 75 6 Schlussfolgerungen 76 7 Zusammenfassung 77 8 Summary 79 9 Literaturverzeichnis 81 Danksagung

Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung(en) AGF Abgesetzte Ferkel a.p ante partum AP Alkalische Phosphathase B. bifidum Bifidobacterium bifidum BdO Bdellovihrio–Oberschichtagar BdU Bdellovibrio–Unterschichtagar C Komplement Ca Calcium CD cluster of differentiation CRP C–reaktives Protein C. perfringens Clostridium perfringens d Tag E. coli Escherichia coli EDKRÜ Edao–Krüger–Medium ELISA enzyme linked immunsorbent assay g Gramm GALT Gut associated lymphoid tissue GIT Gastrointestinaltrakt GKZ Gesamtkeimzahl h Stunde HM–Puffer Hepespuffer mit Mg2+ Ig Immunglobulin K Kotproben in der Kontrollgruppe K1 Erster Zeitpunkt der Kotprobenentnahme in K K2 Zweiter Zeitpunkt der Kotprobenentnahme in K K3 Dritter Zeitpunkt der Kotprobenentnahme in K K4 Vierter Zeitpunkt der Kotprobenentnahme in K KbE Kolonie bildende Einheit kg Kilogramm KR Kolonisations–Resistenz KZg– Keimzahl grammnegativer Bakterien L Lactulosesirup l Liter LGF Lebend geborene Ferkel LM Lebendmasse LPS Lipopolysaccharid IL Interleukin

Abkürzungsverzeichnis

M Milchproben m2 Quadratmeter mg Milligramm MHC Major–Histokompatibilität–Komplex MDT Magen–Darm–Trakt min Minute ml Milliliter µm Mikrometer MMA Metritis–Mastitis–Agalaktie n Anzahl p Irrtumswahrscheinlichkeit PbE Plaque bildende Einheit PLC Phospholipase C pNPP para–Nitro–Phenyl–Phosphathase p.p. post partum OD optische Dichte spp. Spezies Tab. Tabelle TG Transportgefäß TGF Tot geborene Ferkel TNF Tumornekrosefaktor U Unit V Kotproben in der Versuchsgruppe V1 Erster Zeitpunkt der Kotprobenentnahme in V V2 Zweiter Zeitpunkt der Kotprobenentnahme in V V3 Dritter Zeitpunkt der Kotprobenentnahme in V V4 Vierter Zeitpunkt der Kotprobenentnahme in V W Gewicht

Abbildungsverzeichnis Abbildung Titel Seite 1 Überblick über die physikalischen und chemischen Barrieren

der Darmmukosa 11 2 Isomerisierung der Laktose zu Lactulose 22 3 Schematische Übersicht zur Ätiologie, Pathogenese und Folgen des

MMA–Komplexes 30 4 Darstellung der ausgewählten Zitzen auf der Gesäugeleiste der

Sauen für die Milchprobenentnahme 42 5 Aerobe Gesamtkeimzahl auf Einfachagar 46 6 Aerobe Keimzahl Gram–negativer Bakterien

auf MacConkey–Agar 47 7 Schafblutagar mit Neomycin– und Polymyxinzusatz zur

Keimzahlbestimmung von C.perfringens 48 8 Lyseaktivität der Bdellovibrio–Isolate auf Bdellovibrio–

Unterschichtagarplatten nach der Tropfmethode 49 9 Vergleich der Dynamik der GKZ der Kontroll– und Versuchsgruppen

(Lactuloseapplikation) bei Sauen im Puerperalzeitraum 52 10 Vergleich der Dynamik der KZg– von Kontroll- und Versuchsgruppen

(Lactuloseapplikation) im Puerperalzeitraum bei Sauen 53 11 Vergleich der Dynamik von C. perfringens. der Kontroll- und

Versuchsgruppen (Lactuloseapplikation) im Puerperalzeitraum bei Sauen 54

12 Vergleich der Bdellovibrionen der Kontroll- und Versuchsgruppe (Lactuloseapplikation) im Puerperalzeitraum bei Sauen 55

13 Beziehung zwischen Bdellovibrionen (Bdello) und C. perfringens bei Sauen der Versuchsgruppe 56

14 Beziehung zwischen Bdellovibrionen und C. perfringens bei Sauen der Kontrollgruppe 56

15 Alkalische Phosphathase–Aktivität in den Kotproben der Kontroll– und Versuchsgruppe nach Lactuloseapplikation 57

16 Gehalt an CRP in der Milch von Sauen nach Lactuloseapplikation im Puerperalzeitraum 58

17 Gehalt an IgG–anti–Phospholipase C–Antikörpern (C. perfringens ) in Sauenmilch nach Applikation von Lactulose 59

Abbildungsverzeichnis 18 Gehalt an IgM–anti–Phospholipase C–Antikörpern (C. perfringens )

in Sauenmilch nach Applikation von Lactulose 60 19 Gehalt an IgG–anti–LPS (E. coli, Rc-Mutante) in Sauenmilch

nach Lactuloseapplikation 61

Tabellenverzeichnis Tabelle Titel Seite 1 Keimarten der Intestinalflora von Mensch, Nutztier und

Huhn im Überblick 7 2 Quantitative Zusammensetzung der Fäkalflora bei klinisch

gesunden Schweinen (Keimzahlangaben in log/g Kot) 9 3 Faktoren, die regulierend auf die Zusammensetzung

der Darmflora wirken 12 4 Lactuloseabbau durch verschiedene Darmbakterienarten 23 5 Relative hydrolytische Aktivität von duodenalen Schleimhaut-

homogenaten von Mensch, Kalb und Schwein gegenüber Lactulose 24

6 Versuchsablauf und Dokumentation der Daten von Sauen 40 7 Versuchsablauf und Dokumentation der Daten von Ferkeln 41 8 Beprobungsplan 42 9a Charakteristika der eingesetzten Futtermittel–Ferkel 43 9b Charakteristika der eingesetzten Futtermittel–Sauen 44 10 Leistungsparameter 45 11 Reproduktions– und Aufzuchtleistung der Sauen 62 12 Ferkelleistung 63

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1 Einleitung Im Puerperalzeitraum treten häufig gesundheitliche Störungen und damit verbundene wirtschaftliche Schäden auf, die sowohl die Sauen als auch die Ferkel betreffen. In der Vergangenheit wurden zur Beherrschung dieser Probleme auch Leistungs-förderer eingesetzt, deren Akzeptanz aber weitestgehend zurückgegangen ist bzw. ihr Einsatz vom Gesetzgeber deutlich reglementiert wurde. Seit September 1999 stehen besonders in der Ferkelaufzucht eingesetzte antibiotische Futterzusätze (z.B. Olaquindox) nicht mehr zur Verfügung. Nur noch wenige Fütterungsantibiotika besitzen eine Zulassung (ANON. 1999). Um aber das Leistungsniveau der Tiere zu halten bzw. deren Gesundheitsstatus zu verbessern, wurden in den letzten Jahren große Anstrengungun unternommen, alternative Möglichkeiten zur Beeinflussung genannter Faktoren zu finden. Seit langem ist aus der Humanmedizin bekannt, dass dickdarmgängige Lactulose Gram–negative Bakterien im Darm unterdrückt und den Wirt fördernde Mikroorganismen unterstützt. Lactulosezusatz in präbiotischer Konzentration führt zu einer Volumenvergrößerung der Bakterienmasse, zur Stickstofffixierung sowie zur Erhöhung energiereicher Stoffwechselprodukte im Dickdarm. Lactulose stabilisiert auf diese Weise die Magen–Darm–Flora (KRÜGER et al. 2002). Für Lactulose sind auch antiinflammatorische Effekte beschrieben worden, so z.B. die Hemmung proinflammatorischer Zytokine (TNFα) von Makrophagen und Mikrophagen. Fruktose in Lactulose hemmt zudem die Fimbrienadhäsion bei Gram–negativen Bakterien. Dadurch können diese Mikroorganismen nicht mehr an die Zielzelle anbinden und die Kolonisation bleibt aus (GREVE et al. 1990). Anliegen der vorliegenden Untersuchung war es deshalb, die positiven Wirkungen der Lactulose bei Sauen aufzuzeigen. Gerade im peripartalen Zeitraum findet man fütterungs– und haltungsinduzierte Gesundheitsstörungen, deren Ausmaß durch psychische Belastungen noch verstärkt wird. SEIDLER (1998) konnte zeigen, dass unter Stress u.a. Translokationen von Bakterien und Endotoxin aus dem Darm stattfinden können. Diese oftmals Gram–negativen Bakterien greifen mit ihren Lipopolysacchariden (syn. Endotoxine) massiv in Körperfunktionen ein. Neben ihrer Wirkung als Pyrogen beeinflussen sie den Kohlenhydrat– und Fettstoffwechsel sowie das endokrine System und das Immunsystem. Endotoxine reichern sich nach Translokationsprozessen im peripartalen Zeitraum verstärkt in der Milch an und können so das Immunsystem der Neonaten beeinflussen.

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Aus diesen Gründen hat die Zusammensetzung der Milch auf den Gesundheitsstatus der Ferkel einen entscheidenden Einfluss, da die Ferkel erst mit dem Kolostrum die maternalen Antikörper aufnehmen. Es ist daher sinnvoll, Möglichkeiten aufzuzeigen, Belastungen im Körper wie z.B. durch die Endotoxine zu reduzieren. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, inwieweit Lactulosesirup (Solvay Pharmaceuticals) einen Effekt auf bakteriologische und immunologische Parameter der Magen–Darm–Flora der Sauen sowie auf den Gesundheitsstatus und die Leistungsparameter von Sauen und Ferkeln hat. Dazu wurde im Betrieb S eine Untersuchung bei Sauen in peripartalen Zeitraum mit Lactulose durchgeführt. Lactulose wurde 10 d vor der Geburt bis 10 d nach der Geburt oral in einer Dosis von 45 ml/Tier und Tag appliziert. Zehn Tage vor dem errechneten Geburtstermin beginnend, wurden im Abstand von 10 Tagen Kot– und Milchproben bei Sauen entnommen. Das Ziel der Untersuchungen bestand darin, durch die Lactuloseapplikation geburtsassoziierte Störungen bei Sauen wie Koprostase, Fieber und Milchmangel positiv zu beeinflussen. Als Parameter zur Visualisierung des Einflusses der Lactulose auf die Gesundheit der Tiere wurden bakteriologische, immunologische und enzymologische Parameter im Kot und in der Milch der Sauen untersucht. Gleichzeitig wurden die Leistungsparameter der Sauen und Ferkeln erfasst.

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2 Literaturübersicht

2.1 Bedeutung des Magen–Darm–Traktes Der Magen–Darm–Trakt (MDT) ist ein offenes ökologisches System, das als „Außenmilieu“ im Organismus betrachtet wird (SAVAGE 1977, SONNENBORN u. GRIENWALD 1991). KOLLATH (1948) definiert den MDT als „innere Umwelt“ des Körpers. Das Darmepithel übt wie die Haut eine Barrierefunktion aus, um das Eindringen von makromolekularen antigenen Nahrungsbestandteilen und Mikroorganismen ins Körperinnere zu verhindern. Neben seiner Barrierefunktion erfüllt der MDT die Aufgabe der sekretorischen und absorptiven Aktivitäten der Nahrungsverwertung des Körpers (SONNENBORN u. GRIENWALD 1991). Die Oberfläche des MDTs von Menschen wird mit mehr als 200 m2 angegeben und ist ständig mit einer Darmflora von insgesamt 1013–1014 Mikroorganismen aus mehr als 400 verschiedenen Bakterienarten konfrontiert, während ca. 1013 körpereigene Zellen gegenüber stehen (SAWAGE 1977, AUTENRIETH 2000). Der MDT ist nicht nur ein Verdauungsorgan, sondern auch ein Immunorgan. Es befinden sich etwa 20% der Lymphozyten des Wirtes im Darm (AUTENRIETH 2000). Der MDT ist ständig mit Mikroorganismen, Futter, Stoffwechselprodukten und Chemikalien belastet, so dass zwischen GALT (Gut associated lymphoid tissue) und diesen antigenen Substanzen eine dauerhafte Auseinandersetzung besteht (GEBBERS et al. 1995). Allein diese enorm großen Zahlen können darauf hindeuten, dass sowohl abnorme Veränderungen der Darmmukosa als auch Dysbiosen im Darm die physiologische Homöostase des Gesamtorganismus tiefgreifend beeinflussen können (SONNENBORN u. GRIENWALD 1991, SIMON u. GORBACH 1984).

2.1.1 Eubiose und Dysbiose im Darm Jedes Lebewesen befindet sich mit seiner Umgebung ständig in einer Auseinandersetzung. Solange der Körper sein Gleichgewicht hält, spricht man von einer Homöostase. BICKHARDT (1992) definiert die Homöostase als den Zustand der Ausgeglichenheit der regulativen Mechanismen eines Lebewesens, wobei die inneren Funktionsgrößen innerhalb ihrer Toleranzbereiche liegen sollen oder ohne Nachteil

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für den Organismus binnen kurzer Zeit der physiologische Zustand wiederherzustellen ist. Was den Gesamtorganismus betrifft, gilt auch für das Mikroökosystem, welches sich zwischen Wirtsorganismus und Darmflora entwickelt hat. Es herrscht unter normalen Bedingungen ein stabiles Gleichgewicht innerhalb dieses Mikroökosystems. Die statistische Norm der kultivierbaren Darmflora wird von GRÜTTE und HAENEL (1968) als „Eubiose“ definiert. Unter physiologischen Umständen besteht diese Flora zu über 90% aus einer Hauptflora anaerober Keime, bis zu 10% aus einer Begleitflora aerober Keime und zu 0,01% aus einer Restflora aerober und anaerober Keime und Pilze (GEDEK 1993). Die Regelmechanismen sind verantwortlich für die Aufrechterhaltung eines stabilen ökologischen Gleichgewichtes innerhalb der Darmflora. Allgemeine Milieufaktoren begrenzen oder begünstigen die Entwicklung von Mikroorganismen durch Beeinflussung des Darmmilieus wie Nährstoffzufuhr, Temperatur, Feuchtigkeit, pH–Wert, Sauerstoffkonzentration, osmotischer Druck oder auch Stressfaktoren (ROSLER 1994). Die speziellen Milieufaktoren wie Darmmotilität, die Bildung antimikrobieller Stoffe oder lokale Abwehrmechanismen spielen eine bedeutende Rolle bei Darmfloraregulationen. Die Eubiose hängt von den Synergismen und Antagonismen der Darmflora untereinander und von den Interaktionen zwischen Wirtsorganismus und Mikroflora ab (ANON. 2001). Nach FRITSCHE (1998) führt das Versagen einzelner oder mehrerer Regelmechanismen zu einer Störung des ökologischen Gleichgewichtes. Abweichungen von der Eubiose gelten als Dysbiose, die durch Beeinträchtigung des stabilen ökologischen Gleichgewichtes innerhalb der Darmflora entsteht. Als Erster definierte NISSLE (1935) die Darmflorastörungen als Dysbakterie. Durch das Fehlen antagonistisch aktiver E. coli–Stämme kann es zu Verschiebungen im Spektrum der aeroben bzw. der fakultativ anaeroben Flora des Dickdarms kommen. HAENEL und BENDIG (1975) definieren Dysbiose als „Verschiebungen größeren Ausmaßes der vorgegebenen Relationen, die Artenverminderung und das Überwuchern von Pilzen involvieren“. SONNENBORN und GRIENWALD (1991) bevorzugen den allgemein gehaltenen Begriff „Störungen der Darmflora“ und verstehen darunter:

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• Veränderungen der Gesamtkeimzahlen, • Veränderungen im Keimspektrum, • Veränderungen mikrobieller Stoffwechselaktivitäten und • Veränderungen von Besiedlungsstandorten im Magen–Darm–Trakt.

Im deutschsprachigen Raum wird der Begriff „ Dysbiose“ verwendet, der nicht nur auf die E. coli–Keime, sondern auch auf die gesamte Verschiebung in der Darmflora bezogen wird (HAENEL u. BENDIG 1975, LINZENMEIER u. HARALAMBIE 1980). AWAD–MASALMEH und WILLINGER (1981) schreiben, dass ein Zusammenhang zwischen den Magen–Darm–Erkrankungen des Absetzerferkels und dem massenhaften Auftreten bestimmter Serotypen enterotoxischer und meist hämolysierender E. coli im Darm des Tieres, die sie als Dysbiose bezeichnen, besteht. Nach den gleichen Autoren kann diese Dysbiose als Indikator für das Vorliegen störender Umwelteinflüsse angesehen werden. Die prädisponierenden Faktoren wie Fehler in der Qualität und der Zusammensetzung des Futters, in der Fütterungstechnik, das Absetzen der Muttermilch oder subklinische Virusinfektionen werden von den Autoren dafür verantwortlich gemacht.

2.1.2 Magen–Darm–Flora Tiere und Menschen sind auf ein enges Zusammenleben mit einer riesigen Zahl von Mikroorganismen auf der Haut, den Schleimhäuten und in den Hohlorganen angewiesen, so dass die indigene (autochtone) Mikroflora, das Futter/ die Nahrung und der Wirt ein sich gegenseitig beeinflussendes Mikroökosystem bilden. Pansen und Dickdarm verfügen über die größte und in ihrer Vielfalt umfangreichste Mikroorganismenpopulation (KRÜGER u. SCHRÖDL 2000 und 2004). HACKER et al. (2000) betrachten Mikroorganismen als frühe Formen des Lebens, die sich im Zuge der Evolution vor über 3 Milliarden Jahren gebildet haben. Um überleben zu können, haben Bakterien, aber auch Protozoen und Pilze im Wirtsorganismus eine Reihe von Faktoren gebildet, die auf kommensaler, pathogener oder symbiotischer Grundlage beruhen. Im Sinne der antagonistischen Prinzipien produzieren Bakterien Wirkstoffe, wie Bakteriozine und Mikrozine, die Vertreter der gleichen Spezies oder andere Arten im Wachstum hemmen und sogar töten können (HEESEMANN 2000, HACKER et al. 2000). Untersuchungen an gnotobiotischen Tieren geben wichtige Hinweise darauf, welche Bedeutung die residente Darmflora für den Wirtsorganismus hat. Die keimfrei

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gezüchteten Tiere zeigen Fehlentwicklungen an der Darmwand, verringerte Darmmotilität und Mangel an kurzkettigen Fettsäuren (MIDTVEDT 1993). Gnotobiotische Studien erklären auch, wie notwendig die residente Mikroflora für die Entwicklung des GALT (Gut associated lymphoid tissue) ist. Die Induktion von Major–Histokompatibilität–Komplex–Klasse–II–Molekülen (MHC II), die Entwicklung der Peyer’schen Platten, die Förderung der IgA–Produktion bzw. die Aufrecht-erhaltung der oralen Toleranz erfolgen hauptsächlich unter Anwesenheit der Mikroflora (UMESAKI u. SETOYAMA 2000).

2.1.2.1 Entwicklung der Magen–Darm–Flora Die Entwicklung der Magen–Darm–Flora beginnt bei den Neugeborenen mit der Geburt über die Besiedlung der Mund–Maul–Höhle, welche die Keime des Geburtsweges, der unmittelbaren mütterlichen Umwelt, der Milchdrüse und die in der direkten Umgebung des Neugeborenen zufälligerweise vorkommenden Keimarten umfasst. Unmittelbar nach der Geburt treten vor allem grampositive Bakterien im MDT auf. Bereits wenige Tage nach der Geburt dominieren Streptokokken, Koliforme, Hefen, bei einigen Tierarten (z.B. Schwein) Klostridien und Laktobazillen. Die Erstbesiedler des Neugeborenen sind aerobe Mikroorganismen, welche als „Milieuvorbereiter“ für die nachfolgende Ansiedlung anaerober Keime dienen (SONNENBORN u. GRIENWALD 1991, KRÜGER u. SCHRÖDL 2000). Die Erstbesiedlung des MDT bestimmt die späteren Stoffwechselaktivitäten im Darm über Jahre hinweg. ALAM et al. (1988) konnten zeigen, dass die Darmflora von Nordamerikanern und von Einwohnern Bangladeschs hinsichtlich der Digoxin–Metabolisierung unterschiedlich war. Abhängig von der maternalen Versorgung der Neugeborenen mit Nährstoffen, Antikörpern, Oligosacchariden, Fettsäuren, Proteinaseinhibitoren, antiinflamma-torischen Faktoren wie Kolostrinine, IL–10, IL–4 oder löslichen Rezeptoren etc. etabliert sich die autochthone Mikroflora, die sowohl von den transienten, mit der Nahrung aufgenommenen Keimen als auch durch deren Zusammensetzung wie Kohlenhydrate, Fette, Proteine, Mineralstoffe etc. stark beeinflusst wird (KRÜGER u. SCHRÖDL 2000). Nach SAVAGE (1977) ändert sich der Aufbau der intestinalen Flora um die Absetzzeit, vermutlich wegen der drastischen Änderungen in den Fütterungs– und Haltungsbedingungen der Haustiere. Ausgenommen von besonderen Belastungen

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Tab. 1: Keimarten der Intestinalflora von Mensch, Nutztier und Huhn im Überblick (nach RICHTER 1999) Mensch 1) Nutztier

(Rind/ Schwein) 2) Huhn 3)

obligat anaerob

Bacteroides-Keime

Bifidobakterien Eubakterien

Klostridien Laktobazillen Klostridien

Hauptflora, >90%

Eubakterien Bacterides-Keime Fusobakterien

fakultativ anaerob

Enterobakterien E. coli Enterokokken Enterokokken Enterokokken PeptostreptokokkenEntamöba Propionibakterien

Begleitflora, <1%

Giardia Staphylokokken Klostridien Pseudomonaden Pseudomonden Proteus Pilze Pilze Staphylokokken

Restflora, <0,01%

Apath. Koryne- bakterien

Pseudomonaden

1) nach ROLLE und MAYR (1993) 2) nach WIESMANN (1986) 3) nach GÜRTLER (1989) wie Stress, Transport oder rasche Futterumstellungen bleibt die Florazusammen-setzung bei Erwachsenen in einem ökologischen Gleichgewicht.

2.1.2.2 Besiedlung des Magen–Darm–Traktes Auf Grund der unterschiedlichen anatomischen und physiologischen Gegebenheiten des Verdauungskanals bestehen innerhalb der einzelnen Abschnitte erhebliche

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Unterschiede, was die quantitative und qualitative Zusammensetzung der Mikroflora betrifft (AMTSBERG 1984). Grundsätzlich sind Magen und Duodenum relativ keimarm, da die durch Nahrung aufgenommenen Mikroorganismen durch freie Salzsäure im Magen überwiegend abgetötet werden. Der Nahrungsbrei erhöht den pH–Wert, so dass die Ansäuerung nur temporär schützt. Im Mukus vorkommende Lactobazillen übernehmen die Schutzfunktion. Sie sind dominant, während nur wenige Staphylokokken– und Streptokokkenarten nachweisbar sind (SONNENBORN u GREINWALD 1991). Die mikrobielle Besiedlung des Dünndarms stellt die physiologische Grenze zwischen dem keimarmen Magen und dem mit einer üppigen Mikroflora ausgestatteten Kolon dar. Im Kolon kann die Gesamtkeimzahl bis 1011/g Darminhalt erreichen, welche überwiegend aus den strikt anaeroben Bakterien der Gattung Bacteroides besteht (vgl. Tab.1). Die am häufigsten vorkommenden Gattungen sind Lactobacillus, Bacteroides, Streptococcus, Escherichia und Clostridium (SAVAGE 1977, AMTSBERG 1984, SONNENBORN u. GREINWALD 1991).

2.2 Magen–Darm–Flora der Schweine Obwohl sich durch unterschiedliche Ernährungsweise bei den einzelnen Tierarten eine spezifische Magen–Darm–Flora entwickelt hat (SAVAGE 1977), zeigen diese Floren bei monogastrischen Säugetieren einige Gemeinsamkeiten. Die Keimzahl des gesunden Schweines wird auf insgesamt 1014 geschätzt, die sich aus ca. 250 verschiedenen Spezies und Subspezies zusammen setzt.

2.2.1 Qualitative Zusammensetzung Der Magen und der Dünndarm des Schweines sind wie beim Menschen relativ keimarm. Laktobazillen sind hier mit höheren Keimzahlen vertreten, während Streptokokken auch in geringem Maße nachweisbar sind. Ab dem Ileum treten die typischen Dickdarmkeime auf. Im Dickdarm überwiegen die strikt anaeroben Bakterien aus der Gattung Bacteroides. Hier sind auch E. coli, Laktobazillen und Streptokokken in höheren Keimzahlen anzutreffen. Die häufigsten im Darmkanal des Schweines ständig anzutreffenden (residenten) Bakteriengattungen sind Lactobacillus, Bacteroides, Streptococcus, Bifidobacterium, Eubacterium, Escherichia und Clostridium. Daneben kommen noch zahlreiche andere Bakteriengattungen wie Micrococcus, Campylobacter sowie Hefen vor, die

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teilweise zum transienten Anteil der Darmflora gerechnet werden (SCHULZE 1987, AMTSBERG 1984, GEDEK 1989).

2.2.2 Quantitative Zusammensetzung In der Literatur existieren meist unterschiedliche Angaben über die quantitative Zusammensetzung der Darmflora der Schweine (SCHULZE 1987, KRAUSE et al. 1995, BINDER et al. 1984, GEDEK 1989). Die kulturell erfasste quantitative Zusammensetzung der Magen–Darm–Flora hängt einerseits davon ab, inwieweit die Bakterien kultivierbar sind und welche Nährböden verwendet werden, andererseits vom Alter, den Haltungssystemen bzw. dem Fütterungsregime. Tabelle 2 gibt einen Überblick über die Zusammensetzung der Fäkalflora der Schweine nach Haltungsgruppen. Während ORBAN et al. (1997) als aerobe Gesamtkeimzahl des Ferkels log 8.69 KbE/g und Koliforme–Keime log 6.59 KbE/g ermitteln, stellen KRAUSE et al. (1995) log 10.10 KbE/g in Zäkuminhalt des Ferkels kurz vor dem Absetzen fest.

Tab. 2: Quantitative Zusammensetzung der Fäkalflora bei klinisch gesunden

Schweinen (Keimzahlangaben in log/g Kot, nach BINDER et al. 1984) Altersgruppe/ Gewichtsklasse

n

(Gesamtzahl der Analysen)

Gesamtkeimzahl

aerob anaerob

E. coli

Gram–negative Anaero-bier

20 (55)

9,0 (7,0–10,9)

8,9 (7,6–0,8)

8,3 (7,0–9,6)

8,1 (7,0–10,5)

Absetzferkel u. Läuferschweine (etwa 15–25 kg) Mastschweine 8 (24) 9,3 9,9 8,7 9,0 (etwa 25–50 kg) (8,3–10,6) (8,9–10,8) (7,6–9,9) 7,8–10,0)

Mastschweine 8 (20) 8,6 9,8 8,0 8,5 (etwa 50–80 kg) (7,0–9,5) (9,0–10,8) (7,0–9,3) (7,5–9,4)

Mastschweine (etwa 80–110 kg)

8 (20) 9,1 (8,0–10,5)

10,4 (8,8–11,1)

8,9 (8,0–10,4)

9,3 (7,3–10,6)

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AMTSBERG (1984) gibt die aerobe Gesamtkeimzahl vom Schwein zwischen 107 und 1010 KbE/g und die anaerobe Gesamtkeimzahl zwischen 108 bis 1011 an. Die anaerobe Gesamtkeimzahl liegt meist eine Potenz höher als die aerobe. Diese geringfügige Überlegenheit zu Gunsten anaerober Bakterien lassen sich durch sowohl aerobes als auch anaerobes Wachstum von Laktobazillen erklären (SCHULZE 1987). Aus Untersuchungen von GEDEK (1989) an Mastschweinen gehen im Caecum und in den Faeces 5,5 x 109 bzw. 4,1 x 109 KbE/g anaerobe Keime und 1,4 x 108 bzw. 2,4 x 108 KbE/g aerobe Keime hervor. NEMCOV´A et al. (1999) geben bei Absetzferkeln die aerobe GKZ mit 8 log/g Kot und die anaerobe GKZ mit 9.8 log/g Kot an, während Clostridien mit 8.1 log/g Kot ermittelt wurden.

2.3 Magen–Darm–Barriere 2.3.1 Unspezifische Abwehrmechanismen Die Haut und die Schleimhäute sind die ersten mechanischen Barrieren, die Mikroorganismen überwinden müssen, um in tiefere Gewebeschichten eindringen zu können. Physikalische und chemische Barrieren der Darmmukosa kontrollieren die Vermehrung der autochthonen Mikroflora (Homöostase). M–Zellen können Mikroorganismen subepithelial translozieren. Humorale und zelluläre Komponenten der unspezifischen Immunabwehr können harmlose Mikroorganismen eliminieren, nicht aber enteropathogene Erreger. Die Effektivität dieser Barrieren wird durch den Sekretfluss und die darin enthaltenen antimikrobiell wirksamen Substanzen wie Lysozym, Proteasen, Gallensäuren, Peptide oder natürliche Antikörper unterstützt (vgl. Abb.1). Gegen die antigen wirkenden Substanzen von Bakterienzellwand-komponenten wie LPS, Teichonsäuren und Peptidoglykan oder Mannan von Pilzen sowie Cytoplasmakomponenten, auch „pathogen associated molekular pattern“ genannt, werden durch das angeborene Immunsystem lösliche und zellgebundene Erkennungsproteine wie Collektine sezerniert. Diese Erkennungsproteine können mit Kohlenhydratkomponenten von Mikroorganismen interagieren. Dadurch wird die Aktivierung des Komplementsystems oder die Bindung an Rezeptoren ermöglicht. Die Magensäure (HCl), Proteasen, Gallensäuren, kurzkettige Fettsäuren, Lactoferrin und die Schleimhaut selbst gehören zu den mechanischen Barrieren des Verdauungstraktes. Außerdem enthalten diese Sekrete kleine basische Peptide mit mikrobizider Wirkung, die als Defensine bezeichnet werden (HEESEMANN 2000).

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Abb. 1: Überblick über die physikalischen und chemischen Barrieren der Darmmukosa (nach HEESEMANN 2000)

Stäbchenbakterien = enteropathogene Bakterien; Polymorphkerniger Neutrophiler (PMN); Komplementfaktoren C3a-C3b: Ο┐▄; C3a- Rezeptor: o; C3b-Rezeptor: ■; FMP-Rezeptor: Y; FMP:▼; Collectin:Ỹ. Weiterhin bilden die wandständige Mikroflora, die Peristaltik, die dem Darmepithel lumenseitig aufgelagerte Muzinschicht sowie das Epithel die unspezifischen Abwehrkomponenten des Organismus (SONNENBORN u. GREINWALD 1991).

2.3.1.1 Regulationsmechanismen des Magen–Darm–Traktes Nach AMTSBERG (1984) können die an den Regulationsvorgängen der Magen–Darm–Flora beteiligten Faktoren in allogene und autogene geteilt werden (vgl. Tab. 3). Seit langem wurde der Einfluss der Nahrung auf die Zusammensetzung und/ oder die Stoffwechselaktivität der Mikroflora diskutiert (NOACK–LOEBEL et al. 1983, SAVAGE 1977). Von den allogenen Faktoren stehen die im Futter enthaltenen

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Tab. 3: Faktoren, die regulierend auf die Zusammensetzung der Darmflora wirken (nach AMTSBERG 1984)

Faktoren Wirtsorganismus

allogen Darmflora autogen

Verfügbare Nährstoffe + + Konkurrenz um Nährstoffe + + pH-Wert + + Redoxpotential + + Gallensäuren + + Peristaltik + Temperatur + Turnover der Epithelzellen + Antikörper + Phagozytose + Muzin + Lysozym + Langkettige Fettsäuren + Kurzkettige Fettsäuren + Schwefelwasserstoff + Bacteriocine + Bacteriophagen +

Nährstoffe an erster Stelle, welche als Substrat zum Wachstum der Mikroorganismen dienen. Die verfügbaren Nährstoffe werden unter idealen Bedingungen durch die residente Flora verbraucht und dadurch die Vermehrung transienter Bakterien verhindert (ROSLER 1994). Im Falle eines plötzlichen Futterwechsels kann eine Verdrängung residenter Bakterienarten und eine Überwucherung durch pathogene Bakterien erfolgen. Solange Saugferkel ausschließlich mit Muttermilch ernährt werden, tritt C. perfringens in höheren Keimzahlen auf, sinkt jedoch stark ab, wenn pflanzliches Futter aufgenommen wird (AMTSBERG 1984). In den letzten Jahren konnte der Einfluss ballaststoffreicher Nahrung sowohl auf die intestinale Mikroflora als auch auf die Physiologie des Kolons nachgewiesen werden (NOACK–LOEBEL et al. 1983, ELSAYED 2002).

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Speichel stellt im weiteren Sinne das erste Hindernis dar. Der Speichel des Menschen enthält Immunglobuline, Lysozym, Lipase und bakterielle Antagonismen. Die Speichelabsonderung beim Schwein beträgt bis zu 15 l pro Tag (KIRCHGESS-NER 1992, SONNENBORN u. GREINWALD 1991). Der pH–Wert in den einzelnen Darmabschnitten wirkt regulierend auf die Mikroflora. Im Magen der neugeborenen Ferkel ist dieser Wert wesentlich höher als bei älteren Tieren, wodurch die erste Keimbesiedlung ermöglicht wird. Im Magen von Läuferschweinen herrschen dann Werte um 3,6 vor, wobei sich nun hauptsächlich säuretolerante Laktobazillen etablieren können. Im Dünn– und Dickdarm liegt pH–Wert bei dieser Altersgruppe im schwach sauren bis schwach alkalischen Bereich. Das Oxidations–Reduktions–Potential des Milieus und die Mikroflora haben auch einen Einfluss auf die Darmregulation (SCHULZE 1987). Weiterhin übt die Darmperistaltik, die unter dem Einfluss des Rohfasergehaltes des Futters steht, eine regulierende Funktion aus, so dass transiente Bakterien innerhalb kurzer Zeit in den Dickdarm befördert werden können. Dauerhafte Störungen der Darmperistaltik können zu einer übermäßigen Besiedlung des Dünndarmes führen, was Malabsorption zur Folge hat (KNOKE u. BERNHARDT 1981). Aus Glykoprotein bestehende Muzine werden von allen epithelialen Zellen des Verdauungskanals sezerniert. Sie befinden sich im Lumen zum Teil in wasserlöslicher und auf den Epithelialzellen zum Teil in wasserunlöslicher Form. Die Zusammensetzung der Muzine unterscheidet sich in den einzelnen Magen–Darm–Abschnitten. Sie bilden eine schützende Schicht auf den Ephitelzellen, wodurch die darunter liegenden Zellen vor Selbstverdauung geschützt werden (SHARMA u. SCHUMACHER 2001). Diese Schutzschicht verhindert nicht nur die Kolonisation von Bakterien auf den Enterocyten sondern fängt auch Bakterien ein und wirkt bei der Phagozytose mit (KATAYAMA et al. 1997). Einige Bakterienarten wie Klostridien und Bacteroides sind in der Lage, Gallensäuren zu dekonjugieren. Infolge von Überwucherungen des Dünndarmes mit Dickdarmbakterien werden beim Menschen Gallensäuren dekonjugiert. Dabei entstandene freie sekundäre Gallensäuren verursachen nicht nur eine verminderte Fettresorption und Wasserrückresorption, sondern wirken auch toxisch auf die Dünndarmschleimhaut (SONNENBORN u. GRIENWALD 1991).

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2.3.1.2 Die autochthone Darmflora Die autochthone Darmflora hat eine Reihe von Funktionen, die für die Homöostase sehr bedeutsam sind. Es ist vorwiegend die Rede von der Lebensnotwendigkeit der Mikroflora für den Wirtsorganismus (ROSLER 1994). Barrierefunktion Ansiedlung und Vermehrung pathogener Erreger an der Darmschleimhaut werden durch die autochthone Darmflora verhindert, indem die Rezeptoren der Schleimhaut besetzt oder das Wachstum der transienten Mikroorganismen durch antibakterielle und/oder toxische Substanzen wie dekonjugierte Gallensäuren und H2S gehemmt werden. Zum größten Teil sind Bifidobakterien und Laktobazillen aber auch aerobe Keime wie E.coli daran beteiligt (ROSLER 1994). Dieser Widerstand gegen eindringende Keime wird von VAN DER WAAIJ (1984) als „Kolonisations–Resistenz“ (KR) bezeichnet. Nach SCHMIDT (2000) sind die Mukosa der Atemwege, des Gastrointestinal- und des Urogenitaltrakts das erste Ziel für eindringende pathogene Mikroorganismen. Der Autor hält es für sinnvoll, die Abwehr der Erreger unmittelbar auf diesen Grenzflächen zu stabilisieren, um die Kolonisation und eine Überwindung der Barriere durch Pathogene zu verhindern. Stimulierung und Differenzierung lymphatischer Organe Nach Untersuchungen an gnotobiotischen Tieren ist die Bedeutung der autochthonen Darmflora für die Entwicklung und Differenzierung des GALT verdeutlicht geworden. Bei diesen Tieren sind u. a. Milz und Lymphknoten verkleinert, intraepitheliale T–Lymphozytenpopulationen verringert und die Serumimmunglobulinkonzentration stark erniedrigt (MIDTVEDT 1993, HEESEMANN 2000). Der Körper wird durch das ständige Training in Abwehrbereitschaft gehalten, indem ca. 1% der im Dünndarm vorkommenden Keime über die Peyer’schen Platten aufgenommen werden, um gegen Gefahren angemessen und rechtzeitig reagieren zu können (ROSLER 1994). UMESAKI u. SETOYAMA (2000) fassten die immunologischen Effekte der autochthonen Darmflora wie folgt zusammen:

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• Induktion der MHC II–Moleküle auf den Dünndarmepithelzellen, • Entwicklung der Peyer’schen Platten, • Steigern der Superoxid–Anion–Produktion bei Neutrophilien und

Makrophagen, • Induktion und Aufrechterhaltung der Oral–Toleranz in der Immunantwort, • Induktion von Fucosyl–Glycoconjugaten an den intestinalen Epithellzellen und • Einströmen von IgA–produzierenden Zellen in die Lamina propria.

Stoffwechselaktivitäten Unverdauliche Nahrungsbestandteile gelangen intakt in den Dickdarm, wo sie durch intestinale Bakterien zu kurzkettigen Fettsäuren (short chain fatty acids, SCFA) abgebaut werden. Dadurch werden bis zu 50% des Energiebedarfs der Darmepithelzellen gedeckt (HALTMEIER 1993). Die vorwiegend von Laktobazillen und Bifidobakterien produzierte L(+)–Milchsäure aber auch Propion–, Butter–, und Essigsäure verhindern durch Ansäuern des Milieus das Wachstum von Fäulniskeimen (ROSLER 1994). Beim Menschen ist die Bildung von Vitamin K erst bei Anwesenheit von Kolibakterien möglich. Einige Laktobazillen sind in der Lage, Vitamin B12 zu bilden. Auch einige Klostridienarten sind fähig, Pantothensäure, Nikotinsäureamid und Folsäure zu synthetisieren (ANON. 2001).

2.3.2 Spezifische Abwehrmechanismen Nach der Überwindung der unspezifischen Abwehrmechanismen durch pathogene Erreger kommt die spezifische Immunabwehr ins Spiel. Während die B–Lymphozyten für die spezifische humorale Immunität verantwortlich sind, erfüllen die T–Lymphozyten die Aufgaben der zellulären Immunität durch Regulation von Lymphozyten und Phagozyten über Zytokine und durch Lyse von infizierten Zellen und Erregern. Nach DIKER (1998) kann die spezifische Immunantwort gegen Bakterien hauptsächlich auf fünf Wegen erfolgen:

• Neutralisation durch Antikörper, • Abtötung von Bakterien durch Antikörper und Komplement, • Opsonisierung zur Phagozytose, • Phagozytose und Abtötung von Bakterien durch aktivierte Makrophagen und • Abtötung von Bakterien durch zytolytische T–Lymphozyten und NK–Zellen.

Während die IgM–und IgG–Antikörperklassen bei der Aktivierung von Komplement und bei der Opsonisierung eine Rolle spielen, erfüllt die IgA–Antikörperklasse auf der

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Schleimhaut die Aufgabe, Bakterien und Toxine zu neutralisieren. So verhindert zB. die Bindung von Antikörpern an E. coli K88 die Haftung dieses Erregers an Schleimhautzellen.

2.3.2.1 Darmassoziiertes Immunsystem (GALT) Die Magen–Darm–Flora mit ihrer vielfältigen Zusammensetzung und den auf sie einwirkenden Faktoren beeinflussen die Funktion und die Prägung der Immunabwehr und somit die Aufrechterhaltung der Gesundheit des Wirtsorganismus entscheidend. Die Interaktionen zwischen Mikroorganismen und dem darmassoziierten Immunsystem sind für das physiologische Gleichgewicht und für die individuelle Abwehr von besonderer Bedeutung (SCHRÖDL u. KRÜGER 2001). Die Lymphozytenpopulationen des Darmes unterscheiden sich in Struktur und Funktion von denen des peripheren Immunsystems in vielerlei Hinsicht, so dass man in diesem Zusammenhang auch vom darmassoziierten Immunsystem (GALT) spricht (AUTENRIETH 2000). Das GALT umfasst vier lymphoide Hauptbestandteile, die zum Teil zu den organisierten und zum Teil zu den nicht–organisierten Strukturen des GALT gehören. Plasmazellen, Lymphozyten, Makrophagen der Lamina propria mucosae, intraepitheliale T–Lymphozyten und antigenpräsentierende dendritische Zellen zählen zu den nicht–organisierten Strukturen des GALT, während Lymphfollikel und die Peyer’schen Plaques die organisierten Strukturen des GALT bilden (GEBBERS et al. 1995). Die beiden Systeme bleiben untereinander im Kontakt, so dass Mikroorganismen und/oder ihre antigen wirksamen Bestandteile beispielweise über M–Zellen in die Peyer’schen Platten oder in Lymphfollikel des Dickdarmes gelangen und dort eine Immunantwort induzieren. Die Zirkulation von Lymphozyten aus den Lymphfollikeln zu den mesenterialen Lymphknoten, wo sie sich proliferieren und von dort aus über den Ductus thoracicus in die Blutzirkulation gelangen und zurück in die Lamina propria, werden als „Homing“ bezeichnet. Dadurch wird eine spezifische Immunantwort wie die Sekretion von IgA durch Plasmazellen induziert (AUTENRIETH 2000). Die proliferative Aktivität der Schleimhautleukozyten ist auf die Keimzentren des Lymphfollikels beschränkt, die von einem Mantel schmaler B–Lymphozyten umgeben sind. In der T–Zell–Zone befinden sich hauptsächlich kleine CD4+ Zellen. CD8+ T–Zellen besiedeln die Epithelschicht (GEBBERS et al. 1995).

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2.4 Einflussfaktoren auf die Magen–Darm–Flora Im Kapitel 2.3.1.1 bzw. 2.3.1.2 wurde bereits über die natürlich vorkommenden Einflussfaktoren auf die Magen–Darm–Flora berichtet. In diesem Kapitel wird vor allem auf substituierbare Faktoren eingegangen. 2.4.1 Futterzusatzstoffe und Antibiotika Am 7. März 1906 erhielt der Deutsche Paul Ehrlich den Medizin–Nobelpreis als Erfinder der Chemotherapie. Seitdem werden Antibiotika in Human– und Veterinärmedizin zur Bekämpfung bakterieller Krankheiten erfolgreich eingesetzt. Durch unsachgemäßen Gebrauch (Breitbandantibiotika, subtherapeutische Wirkspiegel bei human– und tiermedizinischem Einsatz, aber auch durch das enorme Anpassungspotential von Mikroorganismen) entstanden Resistenzen gegen Antibiotika (MAYRHOFER 1998). Weiterhin führte auch die Verwendung antimikrobieller Futterzusatzstoffe in der Tiermast zur Ausbildung von Resistenzen. Resistenzentwicklung bedeutet, dass die Keime auf die minimale Hemmstoffkonzentration nicht mehr reagieren. Dabei wird zwischen Primärresistenzen und erworbenen Resistenzen unterschieden. Primärresistenzen sind speziesbedingt, d.h., ein bestimmter Wirkstoff ist bei einer bestimmten Bakterienart unwirksam. Sekundärresistenzen (erworbene Resistenzen) entstehen entweder durch ungerichtete, spontane Mutation mit nachfolgender gerichteter Selektion oder durch Aufnahme zusätzlicher Resistenzgene mittels Transduktion, Konjugation und Transformation (MAYRHOFER 1998). In der Tierernährung eingesetzte antibakterielle Wirkstoffe, die für die Prophylaxe, Therapie und als Leistungsförderer zum Einsatz kommen, werden letztendlich vom Makroorganismus ausgeschieden. In das Abwasser, die Kläranlagen und ihre Abläufe gelangte Konzentrationen von antibakteriellen Wirkstoffen liegen weit unter den minimalen Hemmkonzentrationen für Bakterien (HIRSCH et al. 1998). In der Humanmedizin werden die Infektionen mit Methicillin– bzw. Oxacillin– resistenten Staphylococcus aureus–Stämmen mit Glykopeptid–Antibiotika (Vancomycin und Teicoplanin) behandelt. Die Enterokokken haben gegen in der Tiermast eingesetztes Avoparcin aus der Gruppe der Glykopeptid–Antibiotika erhebliche Resistenzen gebildet. Die Infektionen mit diesen Erregern können nicht mehr effektiv behandelt werden, da derzeit keine wirksamen Antibiotika mehr verfügbar sind (AWMF ONLINE 2001, RICHTER 1999).

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Seit Dänemark verbietet, dem Tierfutter Antibiotika zuzusetzen, ist dort die Anzahl Antibiotika–resistenter Bakterien bei Hühnern und Schweinen drastisch gesunken. Bei Schweinen sank die Resistenz von Enterococcus faecalis gegen das Antibiotikum Tylosin von 94% auf 28% (AARESTRUP 1995).

2.4.2 Probiotika Diese Bezeichnung wurde erstmals durch finnische Tierärzte verwendet. Von Altgriechisch bzw. Englisch „probiotics“ (die Lebensfreundlichen) abgeleitet, wird der Begriff eingedeutscht als „Probiotikum“ verwendet. Das sind lebendige mikrobielle Futterzusätze, die gesundheitsschädigende Keime im Darm verdrängen, das Gleichgewicht der Darmflora positiv beeinflussen und die Gesundheit insgesamt fördern. Als Probiotika benutzte Bakterien müssen in der Lage sein, Magensäuren, Gallensalzen und Verdauungsenzymen zu widerstehen, um während der Magen–Darm–Passage nicht abgetötet zu werden. Sie müssen sich gegenüber der etablierten Darmflora behaupten und gesundheitsfördernde Wirkungen ausüben können. Solche Eigenschaften besitzen unter anderem in fermentierten Milchprodukten eingesetzte Bakterien wie Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Streptococcus salivarius subsp. termophilus, L. acidophilus, L. casei, Enterococcus faecium und verschiedene Bifidobakterien (VRESE 1997, FULLER u. GIBSON 1997). Nachdem neuere Erkenntnisse zum mikrobiellen Antagonismus gewonnen wurden, bestehen Möglichkeiten, zur Erzielung eines Optimums an Leistung und zur Vermeidung von Tierverlusten bioregulativ in die Besiedlung mit Mikroorganismen einzugreifen. Die verbesserte Haltungshygiene, optimale Futterzusammensetzung, Verwendung von Futterzusatzstoffen zur Leistungssteigerung, Medikamenteneinsatz und orale Schluckimpfungen sind noch lange davon entfernt, die wirtschaftlichen Schäden infektiöser Darmerkrankungen sowie funktioneller Darmstörungen als Folge von Stress, Umweltbelastungen, ernährungsbedingten Noxen und Haltungsfehlern unter den Bedingungen der modernen Tierproduktion zu beseitigen (GEDEK 1993). Probiotische Arzneimittel besitzen einige Fähigkeiten, die sowohl für den Makroorganismus als auch für die Mikroflora vorteilhaft sind. Der E. coli Stamm Nissle 1917 (Mutaflor) gehört zu den Ersten, der als Probiotikum im Einsatz war. Durch die direkte antagonistische und zugleich immunstimulierende Wirkung verdrängt er pathogene Keime aus dem Darm (DEMLING 1993). Es gibt weitere Untersuchungen, diesen Stamm als einen Lebendvakzinevektor zu benutzen, wenn er Antigene auf seiner Oberfläche trägt oder sezerniert (HEES et al.

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1996). STEIDLER et al. (2000) setzten bei Mäusen mit Colitis ulcerosa einen gentechnisch veränderten, den IL–10 sezernierenden Lactococcus lactis–Stamm ein und konnten eine Verbesserung der geschädigten Mikrovilli der Enterozyten feststellen. Als einen weiteren probiotischen Stamm stellt sich Bacillus cereus var. toyoi (ToyoCerin) dar. JADAMUS et al. (2002) gaben Ferkeln in der Absetzperiode ToyoCerin als Futterzusatz und stellten eine signifikante Reduzierung von Enterobacteriaceae im Kot fest, während sie keine Korrelation zwischen Enterobakterien und SCFA fanden. Inzwischen sind bis 2002 insgesamt 19 probiotische Präparate für Haustiere durch die Europäische Union zugelassen. Neuere Untersuchungen zu Bdellovibrionen lassen hoffen, dass sie weitere Kandidaten sind, bioregulativ für die Stabilisierung der Magen–Darm–Flora eingesetzt und probiotisch verwendet werden zu können. Bdellovibrionen sind 0,2 bis 0,5 µm breite und 0,5 bis 1 µm lange gramnegative Stäbchen, die aerob wachsen und eine optimale Temperatur von 28 bis 32 ºC bevorzugen. Sie werden gegenwärtig unter der Gattung Bdellovibrio in der Familie Sprillaceae klassifiziert (STOLP u. STARR 1963). Es gibt fünf bekannte Arten (EDAO 2001). Bdellovibrionen lysieren Gram–negative Bakterien, indem sie an der Zellwand anheften und in die Zelle penetrieren, sich im periplasmatischen Raum vermehren und den gesamten Zellinhalt auflösen (BURGER et al. 1968). Nachdem STOLP und STARR (1963) das ubiquitäre Vorkommen der Bdellovibrionen im Boden und Gewässern nachgewiesen hatten, konnte in mehreren Arbeitsgruppen bestätigt werden, dass Bdellovibrionen auch im Magen–Darm–Trakt von Schweinen, Pferden, Rindern und Enten vorkommen (IBRAGIMOV 1980, EDAO 2001). EDAO (2001) wies darauf hin, dass die Bdellovibrionen bei der Erhaltung des ökologischen Gleichgewichtes im Darm eine Rolle spielen können, da bei Tieren und Menschen, die gastrointestinale Entzündungsprozesse aufwiesen, Bdellovibrionen nicht oder nur vereinzelt gefunden worden sind.

2.4.3 Präbiotika Im Gegensatz zu Probiotika sind Präbiotika unverdauliche Nahrungsmittel-bestandteile, die durch die selektive Stimulation von Wachstum und Aktivität einzelner oder einer begrenzten Zahl „positiver“ Dickdarmbakterien einen gesundheitsfördernden Effekt auf den Wirt ausüben (GIBSON u. ROBERFROID

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1994). Derartige Stoffe müssen den oberen Bereich des Magen–Darm–Traktes unverdaut passieren und in den Dickdarm gelangen, wo sie als fermentierbares Substrat bzw. als Wuchsstoff für einzelne Bakterienstämme mit gesundheitsfördernden Eigenschaften wie Lactobazillen, Bifidobacterien und Eubakterien dienen. Infolge der positiven Beeinflussung der Mikroflora wird ein systemisch gesundheitsfördernder Effekt auf den Wirt erzielt. Zu diesen Substanzen gehören u.a. pflanzliche Fasern, Inulin, Frukto– und Galaktooligosaccharide, Lactulose und Zuckeralkohole (VRESE 1997). Nach FULLER und GIBSON (1997) können Probiotika und Präbiotika auf verschiedene Weise einen Effekt auf die Darmflora ausüben, die wie folgt gegliedert werden:

• Direkter Antagonismus, • Konkurrenz um die Nahrung, • Immunstimulation und • Kompetitive Rezeptorblockade auf den Epithelzellen.

2.4.3.1 Lactulose

2.4.3.2 Allgemeines

Lactulose ist ein halbsynthetisches Disaccharid, das durch eine chemische Reaktion aus Laktose entsteht. In der Natur kommt Lactulose nicht vor und entsteht in hitzebehandelten Milchprodukten durch die Isomerisierung der Laktose (SCHUMANN 2002). Als erste berichteten MONTGOMERY und HUDSON (1930) über Lactulose, die sie aus einer gesättigten Ca(OH)2–Lösung mit Laktose isolierten, welche 36 h bei 35°C inkubiert wurde. Die erste Bestimmung der Lactulose in Milch erfolgte von ADACHI und PATTON (1961). Ihnen gelang es Lactulose erst in Kondensmilch, später in autoklavierter Milch nachzuweisen. Erste klinische Erfahrungen über Lactulose sammelte PETUELY (1958). Bei einem Versuch an Säuglingen beobachtete er ein starkes Ansteigen von B. bifidum in den Stuhlproben, was er als präbifidogene Wirkung bezeichnete. BIRCHER et al. (1966) legten erste Beweise vor, dass Lactulose bei der Behandlung von hepatischen Encephalopathien einsetzbar sei. Durch Säuglingsmilchnahrung mit Lactulose–Zusatz erreichten GRÜTTE und HAENEL (1968) eine deutliche pH–Wert–Senkung im Stuhl und eine Stuhlflora, die Brustmilchernährten ähnlich war. HOFFMANN (1975) untersuchte die Wirksamkeit

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von Lactulose bei Salmonellendauerausscheidern. Er stellte eine drastische pH–Senkung im Dickdarm fest, welche die Vermehrung von Salmonellen erschwert. Anfang der achtziger Jahre wurde über anti–endotoxinämische Effekte der Lactulose berichtet. LIEHR und HEINE (1981) hatten bei Ratten eine experimentelle Hepatitis durch intravenöse Applikation von D–Galactosamin induziert. Endotoxin von E. coli wurde mit Lactulose inkubiert. 24 Stunden nach der Applikation wurde festgestellt, dass Lactulose die Mortalitätsrate der Ratten reduzierte. HARJU (1986) konnte herausfinden, dass Lactulose kein Substrat für die ß–Galactosidase von Enterobakterien und Enterokokken war. Nachdem das Vorkommen von Lactulose in autoklavierter Milch nachgewiesen worden war, wurde Lactulose häufig als Parameter zum Nachweis für die Hitzebehandlung von Milch und Milchprodukten verwendet (KUHLMANN 1993). Über die Anwendungen der Lactulose bei der Prävention von bakteriellen Translokationen beim obstruktiven Ikterus berichten VAGIANOS et al. (1995). Nach experimenteller Induktion von obstruktivem Ikterus bei Ratten wurden die aeroben Keimzahlen der mesenterialen Lymphknoten und der Leber für bakterielle Translokationen und das portale und systemische Blut auf Endotoxin untersucht. Während eine signifikante Abnahme von Endotoxin–Translokationen im Vergleich zur Kontrolle festgestellt worden war, ließ sich keine Reduktion von bakteriellen Translokationen nachweisen.

2.4.3.3 Chemisch–physikalische Eigenschaften der Lactulose Die chemische Bezeichnung der Lactulose (Summenformel C12H22O11) lautet 4–O–ß–D–Galaktopyranosyl–D–Fruktose. Sie ist das Isomerisierungsprodukt aus Laktose, wobei alkalische Hydroxide und Borsäure als Katalysatoren für diese Isomerisierung verwendet werden. Die flüssige Lactulose ist ein gelblicher, geruchloser und klarer Sirup mit süßlichem Geschmack (SCHUMANN 2002). Die enzymatische Isomerisierung von Laktose zur Lactulosegewinnung beschreiben VAHERI und KAUPPINEN (1978). Nach der Laktosespaltung mit ß–Galaktosidase aus Saccharomyces fragilis entsteht Lactulose durch eine Galactosyl–Transfer–Reaktion auf Fructose. Lactulose kommt nicht per se vor, sie entsteht aber natürlicherweise durch äußere

Einflüsse (z.B. Hitze). Außerdem tritt an Protein gebundene Lactulose durch die

22

Abb. 2: Isomerisierung der Laktose zu Lactulose (nach VETTER 1998)

Amadori–Umlagerung als Intermediärprodukt der so genannten Maillard–Reaktion auf. Lactulose bildet sich im alkalischen Milieu aus Laktose durch Isomerisierung gemäß der so genannten Lobry de Bruyn–Alberda von Ekenstein–Umlagerung (VETTER 1988, vgl. Abb. 2).

2.4.3.4 Wirkungen der Lactulose auf die Magen–Darm–Flora

Lactulose kommt natürlicherweise nur in sehr begrenzten Mengen vor. Unter-suchungen haben gezeigt, dass weder Menschen noch Tiere über ein Enzym im Dünndarm verfügen, das Lactulose in seine beiden Monosacharide spalten kann (HOFFMANN et al. 1964). Oral aufgenommene Lactulose gelangt in unveränderter Form in den Dickdarm, wo sie durch bakterielle Enzyme in Fruktose und Galaktose gespalten wird (vgl. Tab. 4). Fruktose und Galaktose werden hier weiter zu kurzkettigen Fettsäuren, vor allem zu Milch– und Essigsäure, sowie Methan und

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Wasserstoff verstoffwechselt, was mit einer erheblichen Senkung des Kot–pH–Wertes bis auf 4,8 einher geht. Durch die Senkung des pH–Wertes kommt es zur Förderung azidophiler Keime, die Darmpassage beschleunigt sich und pathogene Keime wie Salmonellen werden verdrängt, da Salmonellen ein neutrales oder leicht alkalisches Milieu bevorzugen (SALMINEN u. SALMINEN 1997). TANAKA (1962) stellte fest, dass Lactulose nach oraler Gabe zu geringerem Teil ungespalten im Dünndarm resorbiert wird, während der größere Teil ebenfalls ungespalten die Ileozäkalregion erreicht. In einem Versuch an Hunden wurde unzerlegte Lactulose nach der Resorption in der oberen Mesenterialvene und in der Leber nachgewiesen. Bei Säuglingen, die Lactulose intravenös erhielten, ließ sich

Tab. 4: Lactuloseabbau durch verschiedene Darmbakterienarten (nach HOFFMANN et al. 1964)

Stamm

n

1.

Tag

2.

Tag

3.

Tag

4.

Tag

5.

Tag

6.

Tag

7.

Tag

8.

Tag B.bifidum (Erwachsene) B. bifidum (Säuglinge) L. acidophilus Typ 1 L. acidophilus Typ 2 Streptokokken der Lancefield–Gruppe D E. coli Salmonella Shigella sonnei Proteus Ristella (Bacteroides) C. perf. Staphylococcus aureus

7 3 3 1 7 5 5 1 2 10 3 6

–

–

– – +

– – – – –

+G –

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– – + – – – – –

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+–G – – – –

+G +–

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+

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+–G – – – –

+G +–

+

+

+ + +

+–G – – – –

+G +–

“+“ = deutlicher Indikatorumschlag zum Sauren; “+– “ = schwacher Indikatorumschlag zum Sauren; “– “ = kein Indikatorumschlag; “G“ = Gasbildung;

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der größte Teil im Urin wiederfinden. Die nach Sondenentnahme im Dünndarm ermittelte Lactulosemenge schien offenbar über die Galle zur Ausscheidung gelangt zu sein. Der genannte Autor fand auch, dass dieser synthetische Zucker vom Körper weder gespalten noch verwertet wird. Im Stuhl hingegen konnte er Lactulose nicht messen, weshalb er eine bakterielle Zersetzung im Ileocaecum und im Dickdarm vermutete. Ähnliche Versuche führten HOFFMANN et al. (1964) am Menschen durch. Nach einem Resorptionsversuch wurde festgestellt, dass oral aufgenommene Lactulose keinen Anstieg des Blutzuckerspiegels hervorrief. Die gleichen Autoren haben in vitro im Stuhl häufig vorkommende Bakterienarten auf ihre Fähigkeit zur Spaltung der Lactulose unter anaeroben Bedingungen geprüft. Die Ergebnisse werden in der Tabelle 4 dargestellt. HARJU (1986) testete die Effekte von Schleimhaut-homogenaten von Kälbern, Schweinen und Menschen auf die Hydrolyse der Lactulose. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass intestinale Schleimhauthomogenate von Menschen und Kälbern die Lactulose nicht hydrolysieren, während Schleimhaut-homogenate beim Schwein relativ hohe Lactulose–Spaltungsaktivitäten zeigen (vgl.Tab. 5).

Tab. 5: Relative hydrolytische Aktivität von duodenalen Schleimhaut-homogenaten von Mensch, Kalb und Schwein gegenüber Lactulose (nach HARJU 1986)

Ursprung der

Schleimhauthomogenate Relative Aktivität

für Lactulose Mensch 0,00

Kalb 0,00

Schwein 0,43

Die positiven Effekte der Lactulose auf den Kolonmetabolismus basieren hauptsächlich auf dem Wechsel der Zusammensetzung der mikrobiellen Flora. So fördert Lactulose das Wachstum von Milchsäurebakterien, Bifidobakterien und vor allem Lactobacillus acidophilus im Kolon. Die Entstehung von kurzkettigen Fettsäuren nach Lactulosefermentation hat eine Senkung des Kolon–pH zur Folge (SALMINEN u. SALMINEN 1997).

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BALLONGUE et al. (1997) haben die Effekte von Lactulose und Lactitol bei Patienten in einer Doppel–Blind–Studie untersucht und dabei eine Zunahme der Konzentration kurzkettiger Fettsäuren sowie von Milchsäurebakterien festgestellt, wobei der pH–Wert von 6,9 auf 5,8 sank. Ebenfalls verringerten sich die Keimzahlen an Klostridien, Bacteroides, koliformen Keimen und Eubakterien deutlich. Bifidobacterium und Lactobacillus sind in der Lage, Lactulose besser zu verstoffwechseln als die anderen Bakterienarten im Darm. Einige Bifidobacterium– und Lactobacillus–Spezies produzieren Bacteriozine, die gegen Gram–positive Bakterien wirksam sind (HAMDAN u. MIKOLAJCIK 1974). Durch die Zunahme von Bifidobakterien und Laktobazillen können die Adhäsionsmoleküle von Epithelzellen ihrerseits belegt werden, was die Adhäsion von anderen Bakterien verhindert (BERNET et al. 1993). Dadurch bleibt die Kolonisation von pathogenen Bakterienspezies aus. Über die osmoprotektive Wirkung der Lactulose berichten KRÜGER et al. (2002). Die genannten Autoren sind der Meinung, dass Lactulose die Darmbakterien vor Stressfaktoren schützt und somit die Bildung bakterieneigener Osmoprotektanten verhindert.

2.4.3.5 Wirkungen der Lactulose auf das Immunsystem Die geringfügige (0,25 bis 2%) Absorption von Lactulose im Dünndarm genügt, um immunologische Reaktionen auszulösen (SCHUMANN 2002). Zu den essentiellen äußeren Zellwandkomponenten von Gram–negativen Bakterien gehören Lipopolysaccharide (LPS; synonym „Endotoxine”). LPS bestehen aus einer vorwiegend hydrophoben Region (dem Lipid A) und einer kovalent gebundenen hydrophilen Poly– oder Oligosaccharidregion (ZÄHRINGER et al. 2000). Endotoxine werden zu den stärksten die Immunabwehr stimulierenden biologischen Substanzen gezählt. Sie können abhängig von der Tierart, der Dosis, der bakteriellen Herkunft sowie der Wirtstiersituation eine Reihe von Reaktionen auslösen. Diese Reaktionen können von immunstimulierend bis zu tödlichen Zusammenbrüchen unter Schock reichen (KRÜGER et al. 2001). LIEHR und HEINE (1981) hatten bei Ratten eine experimentelle Hepatitis durch intravenöse Applikation von D–Galactosamin induziert. Durch Bleiacetat wurden die Tiere für Endotoxin sensibilisiert. Endotoxin von E. coli wurde mit Lactulose inkubiert und ebenso i.v. appliziert. 24 Stunden nach der Applikation war festzustellen, dass Lactulose die Mortalitätsrate der Ratten reduzierte und dabei Nekrosen von

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Hepatozyten und Entzündungsreaktionen des Lebergewebes fast komplett verhinderte. GREVE et al. (1990) haben in vitro die Endotoxin–Neutralisationskapazität der Lactulose untersucht und einen beschränkten Effekt festgestellt. Dagegen konnten die gleichen Autoren eine signifikante Reduktion der Tumornekrosefaktor–Produktion (TNF) bei Monozyten, einen wichtigen Mediator der Endotoxin–Toxizität, messen. In Tiermodellen konnte gezeigt werden, dass die Blockierung von TNFα zu einer Reduzierung der Entzündungsreaktion im Darm führt (LIFRAK et al. 1995). Ähnliche Untersuchungen wurden von GARDINER et al. (1995) durchgeführt. Sie haben nach einer experimentellen Colitis durch die Gabe von 25 mg 2,4,6–Trinitrobenzenesulphonsäure (gelöst in 0,25 ml 30%igem Ethanol) die Ratten mit Lactulose oder Colistin behandelt und festgestellt, dass die Lactulose eine signifikante Reduktion der systemischen Endotoxämie bewirkt. Der wesentlichste Antikörper im Intestinaltrakt ist das IgA, das üblicherweise in einer dimeren Form vorkommt und gegen Proteolyse widerstandsfähig ist, was besonders für IgA2 zutrifft. Im Gegensatz zu dem wesentlichsten systemischen IgG verursacht IgA keine Entzündungsreaktionen (HELGELAND u. BRANDTZAEG 1999). In Versuchen an Ratten konnte erstmals ein Lactuloseeffekt auf die IgA–Sekretion im Intestinaltrakt nachgewiesen werden. KUDOH et al. (1999) verabreichten Ratten Lactulose sowie unverdauliche Saccharide oral und stellten eine signifikante Erhöhung des IgA–Spiegels im Koloninhalt fest. Ebenfalls konnten sie eine signifikante Zunahme von IgA–präsentierenden Lymphozyten messen.

2.4.3.6 Weitere Wirkungen der Lactulose Antibakterieller Effekt SANDER–TRESKE und CZERMAK (1981) haben Lactulose als eine Alternative zur antibiotischen Chemotherapie an 120 Jugendlichen und Erwachsenen, die Salmonellendauerausscheider waren, eingesetzt und festgestellt, dass die Lactulose ähnlich wie die Antibiotikaanwendung einen positiven Effekt ausübte. Sie schlussfolgerten, dass wegen ausbleibender Resistenzbildung und nur geringer Nebenwirkungen einer Lactulosetherapie der Vorzug gegenüber einer antibiotischen Behandlung gegeben werden sollte.

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Ähnliche Untersuchungen aus der Tiermedizin in einem salmonellenausscheidenden Mastschweinebestand haben gezeigt, dass sich nach siebentägiger Lactulose-applikation die Anzahl von Salmonellenausscheidern von 34% auf 4% reduzierte (WIEMER 1999). Stimulation der Calcium–Absorption Calcium ist essentiell für die Erregungsübertragung an den neuromuskulären Synapsen. Mangel an Calcium kann nach PLONAIT und BICKHARDT (1997) unter anderem die primäre Ursache von Wehenschwächen sein. Nach ROSSOW et al. (1994) wird die Gebärparese des Rindes hauptsächlich durch Hypokalzämie hervorgerufen. Hypokalzämie kann entstehen, wenn extrazelluläres Calcium mit der Milch in großem Maße ausgeschieden und durch intestinale Calcium–Absorption oder ossäre Calcium–Mobilisation nicht ausgeglichen werden kann. Eine proteinüberschüssige Fütterung verursacht vermehrte Ammoniakbildung, was eine pH–Wert–Erhöhung zur Folge hat. Dieser erhöhte pH–Wert verringert unter anderem die Calcium–Absorption aus dem Futter. VAN den HEUVEL et al. (1999) haben den Einfluss der Lactulose auf die Calcium-absorption getestet. Nachdem zwölf postmenopausalen Frauen über 9 Tage zum Frühstück 5 g oder 10 g Lactulose gegeben worden waren, wurde im Urin der Ca-Gehalt gemessen. In Abhängigkeit von der Lactulosedosis konnte eine signifikante Zunahme der Calciumabsorption gemessen werden. 2.5 Bakterielle Translokationen Die intestinale Schleimhaut ist nicht nur ein Ort der Verdauung sondern auch ein bedeutsames metabolisches und immunologisches System, das unter normalen Umständen eine effektive Barrierefunktion ausübt sowie das Eindringen von Darmbakterien und Endotoxinen in die Gewebe und systemischen Organe verhindert (DEITCH 1990). Die Integrität der intestinalen Schleimhaut ist eine wichtige Barriere gegen bakterielle Translokationen (AVŞAR et al. 2001). Bakterielle Translokation definiert den Übertritt lebensfähiger Bakterien aus dem Gastrointestinaltrakt durch die Darmschleimhaut in die Lamina propria und in die mesenteralen Lymphknoten, aber auch möglicherweise in andere Organe (BERG u. OWENS 1979).

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WELLS et al. (1986) sehen Abszesse und tiefe Wunden als Quellen bakterieller Translokationen. Permanente Übertritte der autochthonen Flora aus dem Intestinal-trakt nach Infektionen sind auch beschrieben worden (TALAFANTOVA et al. 1989). Klinische und experimentelle Untersuchungen haben gezeigt, dass die vorbeugende Funktion der intestinalen Schleimhaut gegen die Translokationen aus dem Darmtrakt von der anatomischen Integrität der Schleimhaut, vom immunologischen Status des Wirts und von der normalen intestinalen Flora abhängt (DEITCH 1990). ERBIL et al. (1999) untersuchten die Effekte von Glutamin, Lactulose und Na–deoxycholate auf die Prophylaxe der bakteriellen Translokationen bei Wistar–Albino–Ratten und stellten fest, dass alle drei Substanzen die Translokationsraten in den mesenteriellen Lymphknoten signifikant (p<0,001) reduzierten. Für Lactulose stand dieser positive Effekt mit der Reduzierung der intraluminaren Keimzahlen im Darm in Zusammenhang. Ähnliche Untersuchungen führten auch ÖZÇELIK et al. (1997) durch. Ratten mit chirurgischem Trauma wurden mit Lactulose behandelt und eine signifikante Abnahme von bakteriellen Translokationen in den mesenterialen Lymphknoten und im venösen Blut im Vergleich zur Kontrolle festgestellt. Ebenso sank in der Behandlungsgruppe die Keimzahl aerober Gram–negativer und fakultativ anaerober Bakterien im Darminhalt, während die Keimzahl an Lactobazillen signifikant zunahm. Die intestinale Mucosa und die normale Darmflora sind effektive Barrieren gegen Translokationen. Eine Schädigung oder Beeinträchtigung dieser Barrierefunktionen führen nach DEITCH (1989) zu Translokationen aus dem Intestinaltrakt. Gallengangsverstopfungen, Ischämien, physisch–psychischer Stress, Traumen und Chemotherapien/Bestrahlungen stellen weitere Ursachen dar (ÖZÇELIK et al. 1997, FINK 1991, DEITCH et al. 1989). Infolge der Immunsuppressionen kann im Darm eine Überwucherung durch potentiell pathogene Erreger stattfinden. Diese Überwucherungen führen meist zu bakteriellen Translokationen aus dem MDT in die mezenterielle Lymphknoten, in die Leber und in andere systemische Organe. AVŞAR et al. (2001) haben den Einfluss von L–Glutamin, Insulin und Laxativen auf bakterielle Translokationen bei Ratten mit akuter Pankreatitis untersucht. Die Autoren stellten neben einer signifikanten Zunahme des Amylasespiegels im Plasma einen signifikanten Rückgang der aeroben Keimzahlen im Darm fest.

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Nach der Simulation extremer klimatischer Bedingungen aber auch physischer Belastungen konnte SEIDLER (1998) bei Schweinen einen signifikant gesteigerten Endotoxinspiegel ermitteln, während auch eine signifikant erhöhte Besiedlungs-häufigkeit beobachtet wurde. Langzeittransporte hatten ebenfalls erhöhte Endotoxinwerte und höhere Besiedlungshäufigkeiten zur Folge, wobei eine Korrelation zwischen beiden Parametern festzustellen war. Nach Untersuchungen am Hochleistungsrind im peripartalen Zeitraum vertritt FRITSCHE (1998) die Meinung, dass euterpathogene Gram–positive Kokken zur individuellen gastrointestinalen Flora gehören und möglicherweise in der peripartalen Periode durch Translokationen aus dem GIT in die systemische Zirkulation gelangen.

2.6 Puerperalstörungen bei den Sauen 2.6.1 Begriffsbestimmung In der Literatur begegnet man unterschiedlichen Bezeichnungen sowie verschiedenen Definitionen für Puerperalstörungen bei Sauen. BERTSCHINGER et al. (1990) verwenden den Begriff „Milchfieber“, während viele Autoren von puerperaler Septikämie sprechen (PLONAIT 1961, SCHULZ u. BRABANT 1968). Es hat sich die Bezeichnung „Metritis–Mastitis–Agalaktie Komplex“ durchgesetzt, da häufig gleichzeitig mehrere Symptome beobachtet werden können (AWAD–MASALMAH et al. 1990, MARTIN et al. 1967). EHRENTRAUT (1968) definiert die Krankheit als häufiges Vorkommen von Gesundheitsstörungen der Sau im Puerperium, wobei Sauen 12 bis 48 Stunden nach der Geburt unruhiges Verhalten, verminderte Fresslust oder absolute Futterverweigerung zeigen, Lochialfluss von seromuköser bis mukopurulenter Konsistenz aufweisen und auf dem Gesäuge liegen. Der MMA–Komplex ist eine multifaktorielle Krankheit der Muttersauen, die während der Geburt oder innerhalb von zwei bis drei Tagen danach auftritt. Kennzeichnend dafür sind partielles oder totales Versagen der Milchproduktion sowie vaginaler Ausfluss. Zwar scheint die Krankheit infektiös zu sein, trotzdem konnte sie durch künstliche Infektion nicht immer ausgelöst werden (BILKEI u. HORN 1991). Nach SCHULZ (1987) stellt die puerperale Septikämie eine Faktorenerkrankung dar, die fast immer mit einer Beeinträchtigung des Gesundheitszustandes der Ferkel verbunden ist.

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2.6 2 Ätiologie des MMA–Komplexes Über die Ätiologie von Puerperalstörungen bei Sauen existieren viele Meinungen. Zahlreiche ätiologische Faktoren wurden für den MMA–Komplex verantwortlich gemacht, wobei sich primäre von sekundären aber auch infektiöse von nicht– infektiösen Ursachen unterscheiden lassen. In der Abbildung 3 werden die Ursachen, die bei der Entstehung des MMA–Komplexes eine Rolle spielen, dargestellt. Abb. 3: Schematische Übersicht zur Etiologie, Pathogenese und Folgen des MMA–Komplexes (nach WENDT u. HEIDER 1994)

Mastitis

Puerperale Harnwegsinfektion Metritis Uterus- Obstipation atoni Hormonale Fieber Verhaltensstörung Agalaktie Stoffwechselstörung Dysregulation

Hemmung von Milchproduktion und Milchabgabe

2.6.2.1 Primäre Ursachen Nach BERTSCHINGER (1984) ist eine akute bakterielle Mastitis mit aszendierendem Infektionsweg verantwortlich für das Krankheitsgeschehen, wobei E. coli als ursächlicher Erreger in Betracht gezogen wird. AWAD–MASALMEH et al. (1990) isolierten aus 65,7% der erkrankten Tiere E. coli in höheren Keimzahlen. Sie konnten

Toxinämie

Bakteriämie

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aber die Virulenzfaktoren bei den meisten Isolaten nicht identifizieren, während sie die gleichen Stämme in der Milch sowie in Zervixtupfer– und Kotproben wiederfanden und hierfür eine enterogene Herkunft vermuten. Im Rahmen eines Beitrags zur Ätiologie hat KRÜGER (1984) Cervixtupferproben von Sauen im Puerperium genommen und darum eine semi–quantitative Keimzahl-bestimmung sowie eine Keimdifferenzierung durchgeführt. Nach dem Vergleich der bakteriologischen Befunde der Zervixtupferproben von mit Antibiotika behandelten und nicht behandelten Sauen schlussfolgerte die Autorin, dass sich das ermittelte Keimspektrum nicht signifikant unterschied, jedoch die Gesamtkeimzahl. WENDT und HAIDER (1994) sind der Meinung, dass sowohl die infektiöse akute Mastitis als auch die Infektion der Gebärmutter sowie auch die Dysbiose im Darm Bedingungen für eine Endotoxinproduktion schaffen, was zu Allgemeinstörungen führt. MOSSI (1995) konnte nach einer experimentellen Kolimastitis keine ein-heitlichen Symptome feststellen, während er in verschiedenem Ausmaß Anzeichen einer Agalaktie und signifikante Leukopenie festgestellt hat. Er vermutet, dass spontane Mastitiden auf galaktogenem Weg entstehen, obwohl er nur in zwei Fällen bei ins Gesäuge inokulierten E.coli–Keimen entweder im Uterus oder in der Harnblase diese nachweisen konnte. 2.6.2.2 Sekundäre Ursachen Einige Autoren (BUSSE et al. 1982, RINGARP 1960) sind der Meinung, dass Bewegungsmangel häufigeres Auftreten des MMA–Komplexes auslöst, während BERTSCHINGER et al. (1990) das für unwahrscheinlich halten. BERNER (1987) wies daraufhin, dass Harnweginfektionen (HWI) im Geschehen des MMA–Komplexes nicht außer Acht zu lassen sind. PETERSEN (1979) definiert die HWI als „Vorfeldsyndrom“ des MMA–Komplexes. Auf Grund seiner Untersuchung ist auch FINKENSIEP (1993) der Meinung, dass HWI als ein Risikofaktor für das Puerperal-syndrom der Sau zu betrachten sind. Nach Feststellungen von EIKMEIER (1965) spielen gastrointestinale Erkrankungen dabei auch eine Rolle, wobei die Tiere meist unter Obstipationen leiden. Die Atonie des Kolons und Uterus wurden von VANDEPLASSCHE et al. (1960) als prädisponierende Ursachen genannt. BERTSCHINGER et al. (1990) untersuchten die Bedeutung einer Gesäuge-verschmutzung für den MMA–Komplex und stellen fest, dass eine geringere Kot-

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verschmutzung der Liegeflächen und Zitzenkuppen die Häufigkeit von puerperaler Mastitis reduziert. Solche Faktoren wie die Minderung der unspezifischen Abwehrleistungen des Organismus gegen pathogene Krankheitserreger, hoher Keimdruck aus der Umwelt, die eingeschränkte neurohormonelle Regelkapazität oder rohfaserarme Fütterung kurz vor der Geburt werden von verschiedenen Autoren als weitere prädisponierende Ursachen genannt (KIELSTEIN 1987, SCHULZ 1987). Da in der Milch oder im Lochialausfluss nachgewiesene Erreger wie E. coli, ß–hämolysierende–Streptokokken, Staphylokokken, aber auch Korynebakterien ebenfalls in Proben gesunder Sauen des gleichen Bestandes nachgewiesen werden können, zählt KIELSTEIN (1987) diese Erreger nicht zu den primären Ursachen des MMA–Komplexes. Nach AWAD–MASALMEH et al. (1990) sind Faktoren wie Fütterung, Haltungsform, Klima, Jahreszeit, Alter, Tragezeit, Geburtsdauer und Rassendisposition verantwortlich für das Zustandekommen dieser Erkrankungen.

2.6.2.3 Infektiöse Ursachen Als infektiöse Ursachen werden meist an erster Stelle Enterobakterien, insbesondere E. coli genannt (AWAD–MASELMEH et al. 1990, BERTSCHINGER 1984). Weiterhin waren Klebsiellen und Pseudomonaden als Gram–negative Bakterien in Untersuchungen von RINGARP (1960) aus Milch und Uterussekret der erkrankten Tiere zu isolieren. AWAD–MASELMEH et al. (1990) konnten Staphylokokken und ß–hämolisierende Streptokokken in Proben erkrankter Tiere in hohen Keimzahlen nachweisen. BERNER (1986) wies darauf hin, dass Streptokokken bei Endometritis die hauptsächliche Ursache darstellen. KOBERA (2000) konnte einem Betrieb in Milch–und Zervixtupferproben an erster Stelle Vertreter aus der Familie Enterobacteriaceae, gefolgt von den Streptokokken isolieren, während er in einem anderen Betrieb in Milchproben hauptsächlich Staphylokokken und Streptokokken und mit geringer Beteiligung Enterobacteriaceae nachweisen konnte. Die Rolle der Endotoxine als Krankheitsauslöser beim MMA–Komplex wurden von verschiedenen Wissenschaftlern untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass post partal an Sauen injiziertes E. coli–LPS zu einem Körpertemperaturanstieg führte (NACHREINER et al. 1972).

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FRITSCHE (1998) konnte auch nachweisen, dass die Konzentration von freiem Endotoxin im Blut in der Zeit zwei bis fünf Tage vor dem Abkalben signifikant mit der bakteriellen Besiedlungshäufigkeit des Kolostrums korreliert. Ähnliche Korrelationen wurden von MORKOÇ et al. (1983) ermittelt. Die Autoren konnten im Blut erkrankter Sauen höhere Endotoxinspiegel feststellen, welche mit den Befunden Gram–negativer Bakterien aus Darm und Milch korrelierten. Dagegen war kein Zusammen-hang zwischen bakteriologischen Befunden des Uterussekretes und der Endotoxin-ämie festzustellen.

2.6.2.4 Nicht–infektiöse Ursachen Fütterungsfehler kurz vor der Geburt wie rohfaserarme Fütterung oder abrupter Futterwechsel wurden von verschiedenen Autoren (GLAWISCHNIG 1964, PLONAIT u. BICKHARDT 1997, EHRENTRAUT 1968) verantwortlich für das Krankheitsgeschehen gemacht. Rohfaserarme Fütterung führt unter anderem zu Verstopfungen, deren unmittelbare Folge eine Fäulnis im Darm ist. PLONAIT (1988) konnte durch eine restriktive Fütterung die Erkrankungshäufigkeit signifikant reduzieren, wobei die restriktiv gefütterten Sauen a.p. Laxantien verabreicht bekamen. Mangel an Vitaminen, insbesondere Vitamin–E oder an Mineralstoffen wie Selen während der letzten Trächtigkeitsmonate werden von NACHREINER und GINTHER (1969) als krankheitsauslösende Ursachen angegeben. Auch soll ein Mangel an Calcium, Eisen und Phosphor verantwortlich für das Krankheitsgeschehen sein (STEIN 1994). WAGNER (1985) untersucht den Verlauf des Prolaktinspiegels während einer Endotoxämie, da Prolaktin für eine ausreichende Laktation wichtig ist. Er injizierte laktierenden Sauen zwei Tage post partum E.coli–Endotoxin und erreichte damit eine signifikante Reduzierung des Prolaktinspiegels. Weiterhin wurde vermehrte Östrogensekretion als mögliche Ursache für das Auftreten einer Agalaktie genannt (BÖMER 1960).

2.6.3 Pathogenese des MMA–Komplexes Obwohl E. coli und Endotoxine als auslösende Faktoren des MMA–Komplexes in der Fachliteratur eine weitgehende Akzeptanz gefunden haben, dauern die Diskussionen über die Pathogenese weiter an.

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Nach Beobachtungen von BERTSCHINGER (1984) spielt die Mastitis bei der Entstehung des MMA–Komplexes eine zentrale Rolle, wobei die Mastitis durch eine aszendierende Infektion mit Keimen aus der Familie Enterobacteriaceae hervorgerufen wird. Er hielt es auch für möglich, dass die Endotoxine aus dem Uterus in die Zirkulation übertreten können. PEDERSEN et al. (1998) haben bei an Kolimastitis erkrankten Sauen 69 E. coli–Stämme isoliert und serologisch untersucht. Während davon 34 Stämme zu 18 verschiedenen O–Serotypen zugeordnet werden konnten, waren 35 Stämme serologisch nicht zu typisieren. 42 von 44 untersuchten Stämmen waren gegenüber Serum von Schweinen resistent. Die Mehrzahl der untersuchten Stämme waren in der Lage, in vitro humanes Fibronektin zu binden, während einige Stämme an fötale Rinderfibroblastenzellen adhärierten. Anhand der Serum–Resistenz und der unterschiedlichen Serotypen sind die gleichen Autoren der Meinung, dass ein galaktogener Weg für die Pathogenese verantwortlich ist. BERNER (1971) untersuchte Urinproben in verschiedenen Zuchtbeständen mit Puerperalstörungen in den letzten Trächtigkeitsmonaten und stellte fest, dass die Tiere mit Bakteriurie meist gleichzeitig eine fieberhafte Puerperalstörung zeigten. Anhand seiner Ergebnisse geht er davon aus, dass die Gebärmutter aszendierend von den Harnwegen aus infiziert werden kann, da die Besiedlungsgrenze im Bereich des Hymenaalringes zwischen Vestibulum vaginae und Vagina mit der Geburt verwischt. Nach Auffassung von SCHULZ (1987) hat die Resorption von Bakterientoxinen über die Gebärmutterschleimhaut eine zentrale Bedeutung für Puerperalstörungen. Dieser Vorgang wird dann besonders begünstigt, wenn einerseits der Uterus infiziert ist und andererseits postpartale Uterusatonien und Geburtsverzögerungen vorliegen. Eine Überlastung des MDT begünstigt ebenfalls den Prozess. AWAD–MASALMEH et al. (1990) konnten feststellen, dass die aus Milch– und Zervixtupferproben identifizierten O–Serotypen von E. coli mehr oder weniger auch in den Kotproben nachzuweisen waren. Diese Keime können erst nach Schädigung der Darmschranke in verschiedene Organe wie die Milchdrüse gelangen, da die nachgewiesenen Keime kein invasives Verhalten zeigten. Damit ist die enterogene Herkunft für die Pathogenese des MMA–Komplexes sehr wahrscheinlich. Beweise dafür, dass Endotoxine aus Darm– und Urogenitaltrakt resorbiert werden und mit dem Blut in die Milchdrüse gelangen können, lieferten MORKOÇ et al. (1983) und ELMORE et al. (1982). Diese Endotoxine verursachen nicht nur eine toxische Wirkung auf die Epithelzellen der Milchdrüsen, sondern bewirken auch über den

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Hypothalamus eine Senkung des Prolaktinspiegels, wodurch eine Hemmung der Laktation eintritt ( SMITH u. WAGNER 1995). Weiterhin verlangsamen rohfaserarme Fütterung und Bewegungsarmut die Darmpassage, deren Folge meist eine Obstipation ist. Nach PLONAIT (1961) begünstigt diese Obstipation die vermehrte Resorption des Darminhaltes, wobei eine Infektion und Intoxikation auf hämatogenem Weg aus dem Darm entstehen soll.

2.6.4 Symptomatik und Diagnose Der MMA–Komplex manifestiert sich während der Geburt oder innerhalb von zwei bis drei Tagen danach (BILKEI und HORN 1991, KIELSTEIN 1987). Als Hauptsymptome werden die Hypogalaktie bzw. Agalaktie beschrieben, welche die Ferkel infolge von Mangelernährung zum Schreien bringt, sie schwächt und sogar deren Tod bedeuten kann (PLONAIT 1961). Eine erhöhte Körpertemperatur von über 39,3 oC (KIELSTEIN 1987) ist ein wichtiges Anzeichen für einen beginnenden MMA–Komplex. Die lokalen Symptome äußern sich am Gesäuge in Form von Rötung der Haut, schmerzhafter Schwellung, entzündlichem Gesäugeödem und erhöhter Hauttemperatur (SCHULZ 1987, PLONAIT 1961). Nach den Untersuchungen von STELZER et al. (1997) erkrankten die Sauen mit präpartalem Scheidenausfluss signifikant häufiger postpartal als Sauen ohne einen solchen. Damit wird der vaginale Ausfluss der Symptomatik des MMA–Komplexes hinzugefügt. Neben einer erhöhten Zellzahl in der Milch erkrankter Sauen (WEGMAN 1985) sind HWI (Harnwegsinfektionen) mit einer Bakteriurie ≥ 106 Keime/ml wichtige Parameter für die Diagnose (BERNER 1971). Dementsprechend konnte FINKENSIEB (1993) in MMA–Komplex–Problembeständen signifikant höhere Bakteriurie feststellen. 2.6.5 Prophylaxe und Metaphylaxe des MMA–Komplexes Bei infektiösen und nicht–infektiösen Ursachen des MMA–Komplexes stehen prophylaktische und metaphylaktische Maßnahmen sowie eine Frühdiagnose an erster Stelle. Mit der Entwicklung und Verbesserung des Wissensstandes nehmen prophylaktische und metaphylaktische Maßnahmen an Bedeutung zu.

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Nach Auffassung von BILKEI et al. (1995) kann der puerperale Krankheitskomplex der Sauen vorzugsweise durch prophylaktische Maßnahmen beeinflusst werden. BILKEI und BIRO (2000) haben Sauen zweimal ante partum und einmal post partum gegen E. coli geimpft und die Verlustrate mit disem modifizierten Impfprogramm im Bestand um 64% verringert. WAWRON (1997) ist auch der Meinung, dass ein Schutz der Tiere vor ungünstigen Umweltbedingungen durch immunstimulierende Medikamente erreicht werden kann. In diesem Zusammenhang hat er Sauen im letzten Monat der Trächtigkeit mit Levamisol oder Nitrogranulogen behandelt und eine Senkung der Ferkel–Morbidität und eine Verbesserung des Gesundheitsstatus der Sauen festgestellt. Es ist KARG und BILKEI (2000) gelungen, durch Immunisierung gegen E. coli im letzten Trächtigkeitsdrittel die Produktionszahlen in den Beständen zu verbessern. Die Autoren erzielten bessere Ergebnisse, wenn die Tiere am ersten Tag nach der Geburt wiederholt geimpft wurden. NACHREINER und GINTER (1969) konnten in verschiedenen Fällen durch eine Ergänzung des Futters mit Vitamin E oder Vitamin E und Selen eine Senkung der Häufigkeit der Tiere mit MMA–Komplex erreichen. STAHLY et al. (1979) empfehlen eine restriktive Fütterung von 2-3 kg einer rohfaserreichen Diät bis zur Geburt. BERTSCHINGER et al. (1990) konnten durch die Verbesserung der Haltungshygiene wie geringerer Kotverschmutzung der Liegeflächen eine Verminderung des MMA–Komplexes erzielen. Was zu Stress führt, ist prädisponierend für das Krankheitsgeschehen. Deswegen empfehlen NACHREINER und GINTHER (1969) eine Vermeidung von Stressfaktoren besonders in der Spätträchtigkeit. HEßLING (1997) untersuchte die Wirksamkeit einer Baytril®–Prämix (Enrofloxacin) als orale Metaphlaxe auf den MMA–Komplex und stellte keine signifikanten Unterschiede in der Erkrankungshäufigkeit fest. Dagegen konnten SCHÖNING und PLONAIT (1990) durch Futtermedikation mit Furazolidon und Sulfadimidin eine Senkung der Erkrankungshäufigkeit auf 30% erzielen.

2.6.6 Therapiemöglichkeiten Eine antibiotische Behandlung ist erst dann angezeigt, wenn die Prävention des MMA–Komplexes versagt (BILKEI et al. 1995), wobei die kausale von der symptomatischen Therapie zu unterscheiden ist (SCHÖNING u. PLONAIT 1990).

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Die Förderung der Milchleistung steht bei der symptomatischen Behandlung im Vordergrund. Schon GLAWISCHNIG (1967) hielt den Oxytocineinsatz in Kombination mit Prednisolon oder Dexamethason für ratsam, während GLOCK (1983) die alleinige Oxytozinverabreichung als kausale Therapie empfiehlt, wenn endokrine Dysregulationen Hauptursache des Milchmangels darstellen. Weiterhin ist eine antiphlogistische Behandlung angeraten, wenn ein Körpertemperaturanstieg und Schmerzen am Euter vorliegen. Eine Unterdrückung der Entzündung und Analgesie kann durch Injektion von Kortikosteroiden und deren Kombination mit Pyrazolonderivaten erreicht werden (OSSKA u. WALSER 1979). SCHÖNING und PLONAIT (1990) haben eine Vergleichsuntersuchung bei Sauen mit Enrofloxacin und Trimethoprim–Sulfadimidin durchgeführt und signifikante Unterschiede in der therapeutischen Wirkung zugunsten von Enrofloxacin festgestellt. Im Falle von Hypokalzämie und Wehenschwäche ist die parenterale Gabe von Calciumglukonat angezeigt, um die Wehenfunktion wiederherstellen zu können. Das ist besonders dann vorteilhaft, wenn eine Uterusatonie vorliegt und diese durch Oxytocinapplikation nicht behandelt werden kann (PLONAIT u. BICKHARDT 1997). Nach einer Vergleichsuntersuchung mit Cefquinom und Enrofloxacin konnte KOBERA (2000) einen hochsignifikanten Abfall der Körpertemperatur in beiden Versuchsgruppen erreichen, wobei eine Heilungsrate von ca. 85% bei der Cefquinomgruppe und ca. 71% bei der Enrofloxacingruppe nach dem dritten Tag der Behandlung ermittelt wurde.

2.7 Auswirkungen des MMA–Komplexes auf die Ferkel Der wirtschaftliche Schaden des MMA–Komplexes betrifft in erster Linie die Ferkel der erkrankten Sauen, wobei die Ferkelverluste bis zu 80% erreichen können. Diese Ferkelverluste kommen auch durch Erdrücken durch die Muttersau zustande (EHRENTRAUT 1968). Die betroffenen Ferkel entwickeln sich wegen Energie-mangels sehr langsam. Die Neugeborenen nehmen erst durch das Kolostrum maternale Antikörper auf, was bei Hypogalaktie oder Agalaktie nicht der Fall sein kann. Im Laufe der Laktation wird die IgA–Produktion an der Schleimhautoberfläche vermindert und die Saugferkel werden anfällig gegen enterale Koliinfektionen (KARG u. BILKEI 2000), da die lokale

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IgA–Produktion der Schleimhautoberfläche die Entstehung der Kolibazillose bei den Neugeborenen verhindert (LYCZYNSKI u. MICHALAK 1996). Da die Ferkel in den ersten Lebenstagen nicht in der Lage sind, durch Glukoneogenese ihren Energiebedarf zu decken, (SCHNURRBUSCH u. HÜHN 1994) wird die Hypoglykämie noch verschlechtert. Die Ferkel müssen unbedingt in die Behandlung der Sauen einbezogen werden, da letztendlich nicht das Befinden der Sau, sondern die verlustlose Aufzucht der Ferkel über die Wirtschaftlichkeit entscheidet. In erster Linie ist die Sicherung der Energie– und Flüssigkeitszufuhr zur Überbrückung der verminderten Milchaufnahme unentbehrlich. Vitale Ferkel können durch kräftige Eutermassage die Sauen, die die Allgemeinstörungen überwunden haben, wieder zur vollen Laktationsleistung bringen (SCHULZ 1987). PLONAIT und BICKHARDT (1997) empfehlen in großen Beständen das Umsetzen der Ferkel an Ammensauen, wenn die Erkrankungsrate niedrig bleibt. Durch dreimalige Fütterung mit speziellem Milchaustauscher können mutterlose Ferkel am Leben erhalten werden.

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3 Material und Methoden

3.1 Tiermaterial, Gruppenaufteilung und –kennzeichnung Der Fütterungsversuch wurde als sogenanntes „Mutter–Kind–Konzept“ angelegt und in einer Schweineanlage von Mai 2000 bis September 2000 durchgeführt. Die Versuchsplanung und Versuchsdurchführung erfolgte durch die Zusammenarbeit des Institutes für Bakteriologie und Mykologie der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig und der Landesanstalt für Landwirtschaft, Dezernat Schwein–Kleintiere–Tierhaltung–Ruhlsdorf.

3.1.1 Sauen Alle Sauen einer Wurfgruppe, die spätestens 11 Tage vor dem errechneten Geburts-termin keine das Reproduktionsgeschehen absehbar beeinträchtigenden Gesundheitsschäden aufwiesen, galten grundsätzlich als Probanden. Jede Sau hatte eine individuelle Tätowiernummer. Danach wurden alle Probanden einer Wurfgruppe per Losentscheid zufällig auf die Kontroll (K) oder die Versuchsgruppe (V) verteilt. Die Gruppenzugehörigkeit wurde auf der Sauenskarte farblich fixiert. Der Versuchsablauf und die Dokumentation der Daten von Sauen wurden in der Tabelle 6 zusammengestellt. Die Versuchsgruppe bestand aus 71 Sauen, denen ab 10 Tage ante partum bis 10 Tage post partum 45 ml Lactulosesirup (L.) je Tier und Tag als „top dressing“ gefüttert wurden. Die Kontrollgruppe bestand aus 68 Sauen. Hier lag das gleiche Fütterungsregime zugrunde, jedoch ohne Lactuloseapplikation. 3.1.2 Ferkel Spätestens am ersten Tag nach der Geburt wurden alle Ferkel mit einer fortlaufend nummerierten, farbigen Ohrmarke eindeutig gekennzeichnet. Während die männlichen Ferkel der Versuchsgruppe (V) blau, weibliche grün markiert wurden, erhielten die männlichen der Kontrollgruppe (K) eine rote, die weiblichen eine gelbe Markierung. Der Versuchsablauf und die Dokumentation der Daten der Ferkel zeigt Tabelle sieben. Das Starterfutter der V–Ferkel enthielt ebenfalls Lactulose (15 ml Sirup/kg Futter). Über die dreiwöchige Säugezeit hinaus wurden den V–Ferkeln noch 10 Tage lang im Flatdeck zusätzlich 15 ml Lactulosesirup/kg Futter angeboten. Danach blieb die Behandlung für alle Ferkel gleich.

40

Tab. 6: Versuchsablauf und Dokumentation der Daten von Sauen

Sauen Kontrolle (K) Versuch (V) Behandlung im Abferkel- bzw. noch im Wartestall:

Parameter:

gleiche Behandlung wie V, jedoch ohne Lactulosegabe

ab 10 d a.p bis 10 d p.p. 45 ml Lactulosesirup (L.) je Tier und Tag als „top-dressing“ zur Fütterung

Lebendmasse (V / K) Ws1 = Einstallung in Abferkelbereich Ws2 = Absetzen

Futterverzehr (V / K)

täglich je Sau ab 10 d a.p bis zum Absetzen mit Einstellung des Volumendosierens

Kotproben (V / K)

K1 = 10 d ante partum

K2 = Tag der Geburt K3 = 10. Tag post partum ( letzte Lactulosegabe ) K4 = 1 Tag vor dem Absetzen

Milchproben (V / K)

M1 = Tag der Geburt M2 = 10. Tag post partum M3 = 1 Tag vor dem Absetzen

Tägliche Kotbonitur (V / K)

A = fest; B = weich, formbar; C = Durchfall; E = sonstiges

Vet – med. Behandlung/ Tierverlust (V / K)

Jede/r vet.-med. Behandlung/Tierverlust aller in den Versuch einbezogenen Sauen wird vom 10. d a.p. bis zum Absetzen des Wurfes auf der individuellen Sauenkarte dokumentiert und begründet.

3.1.3 Lactulose Lactulosesirup wurde von „Solvay Pharmaceuticals“ zur Verfügung gestellt. Seit dem 08.06.1999 ist die Lactulose als Aromazusatz und appetitanregender Stoff nach Anlage 3 Nr. 3 FMV im Handel erhältlich (HAGEMANN 2001). Die Lactulose war Hauptbestandteil ( ≈ 82%) des leicht süßlichen, autosterilen Sirups (Dichte: 1 Liter = 1,34 kg). Dieser Mischung ließ sich problemlos im 200 l-Fass mit Auslaufhahn vor Ort deponieren.

41

Tab. 7: Versuchsablauf und Dokumentation der Daten von Ferkeln

Ferkel Kontrolle Versuch Behandlung im Abferkelabteil und im Flatdeck

Fa*) I ohne L., keine Abweichung von der üblichen Praxis

Fa I mit 15 ml L./kg Futter sonst keine Abweichung von der üblichen Praxis

Parameter: Lebendmasse einzeln (V / K) Abferkelabteil/Flatdeck

WF1 = Geburt (auch die totgeborenen Ferkel/ mit Kommentar nach betriebsüblichem Schlüssel WF2 = beim Absetzen WF3 = 10 d nach dem Absetzen WF4 = gruppenweise beim Verkauf zur Verifizierung des Zielparameters‚ “c“ - fakultativ

Futterverzehr (V / K) Abferkelabteil/Flatdeck

Tägliche Futtergabe je Wurf bzw. Aufzuchtgruppe (zu Beginn der Beifütterung auch verbal möglich, z.B. „zwei Hände voll“)

Tägliche Durchfallbonitur Je Wurf oder Aufzuchtgruppe (V / K) Abferkelabteil/ Flatdeck

1 = ohne besonderen Befund 2 = leichter Durchfall 3 = starker Durchfall 4 = starker Durchfall mit Verlusten 5 = Ödemkrankheit, kein Durchfall 6 = nicht erfasst ( Ursachenangabe)

Vet.–med. Behandlung/ Tierverlust (V / K)

Jede/r vet.–med. Behandlung/ Tierverlust aller in den Versuch einbezogenen Ferkel wird bis zum 10. Aufzuchttag im Flatdeck individuell erfasst und begründet.

Stalltemperatur Abferkelabteil/ Flatdeck

2 x täglich zur gleichen Zeit am selben Ort

*) Ferkelaufzuchtsstall

42

3.2 Probengewinnung Es wurden insgesamt viermal Kotproben und dreimal Milchproben gewonnen. In der Tabelle acht wird der Beprobungsplan schematisch dargestellt. 3.2.1 Kotproben Beginnend 10 d a.p wurden viermal Kotproben (K) im Abstand von 10 d gewonnen. Die vier Kotproben je Sau wurden entweder rektal oder von dem frisch abgesetzten Kot genommen, in dafür vorgesehene, gekennzeichnete Röhrchen (GREINER) gegeben, bei –18°C aufbewahrt, gesammelt und zum Untersuchungslabor transportiert.

Tab. 8: Beprobungsplan

10.Tag a.p

Tag der Geburt

10.Tag p.p.

20. Tag p.p.

K1 / V1

K2 / V2

K3 / V3

K4 / V4

M1

M2

M3

K = Kotproben in der Kontrollgruppe; V = Kotproben in der Versuchsgruppe; M = Milchproben in Kontroll- und Versuchsgruppe Abb. 4: Darstellung der ausgewählten Zitzen auf der Gesäugeleiste der Sauen

für die Milchprobenentnahme

oben Gesäugeleiste→ unten

O O O O O O O O O O O O

43

3.2.2 Milchproben Beginnend am Tag der Geburt wurden dreimal Milchproben (M) im Abstand von 10 Tagen genommen. Möglichst jeder laktierenden Sau wurde an insgesamt drei definierten Tagen Milch als Sammelprobe, insgesamt ca. 5 ml aus drei Zitzen steril entnommen. Die Proben wurden in entsprechende Röhrchen (GREINER) gegeben, je Wurfgruppe bei –18°C aufbewahrt und nach Abschluss einer Wurfgruppe zum Untersuchungslabor transportiert. Die Auswahl der Zitzen wurde wie in Abbildung 4 dargestellt vorgenommen. 3.2.3 Futterproben Jede im Versuch eingesetzte Charge Ferkel– und Sauenfutter (K u. V) wurde durch die LfL (Landesanstalt für Landwirtschaft) einzeln beprobt und chemisch analysiert. Vollanalyse von Mischfutter für Lysin, Methionin, Cystin, Threonin, Triptophan, P, Ca, Na, Mg wurden durchgeführt. Bei Ferkelfutter wurden zusätzlich Säurebindungs-kapazität und pH–Wert analysiert. Die Rückstellproben sind für 12 Monate im TG–Depot (–18 oC) der LfL aufbewahrt worden. Die Charakteristika der eingesetzten Futtermittel für Sauen und Ferkel sind in den Tabellen 9 a und b zusammengestellt. Tab. 9 a: Charakteristika der eingesetzten Futterfuttermittel –Ferkel

Inhaltsstoffe „Frühstart“ / „Frühstart+“

ME *) [MJ] Rohprotein [%] Lysin [%] Rohfett [%] Rohfaser [%] Rohasche [%] Calcium [%] Phosphor [%] Natrium [%]

Kupfer [mg]

14,20 19,50 1,40 6,00 3,80 6,50 0,70 0,65 0,25 170,00

Vit. A [IE] Vit. E [mg]

Vit. D3 [IE]

26667 100 2000

Zugabe je kg Trockenfutter: 500 FTU 3-Phytase; 250 FXU Endo-1,4-Beta-Xylanase (ZY 68); 40 mg Avilamycin; 1280 Mio KBE “Bioplus 2B“

„Frühstart+“ = „Frühstart“ + 15 ml Lactulosesirup auf 1kg Futter

44

Tab. 9 b : Charakteristika der eingesetzten Futterfuttermittel –Sauen

Inhaltsstoffe

“AT Pig Sau NT” Alleinfutter für

tragende Sauen

„AT Pig Sauen Extra“Alleinfutter für

säugende Sauen

ME *) [MJ] Rohprotein [%] Lysin [%] Rohfett [%] Rohfaser [%] Rohasche [%] Calcium [%] Phosphor [%] Natrium [%] Kupfer [mg]

11,80 14,00 0,60 3,50 7,00 7,00 0,90 0,70 0,20 25,00

13,00 18,00 0,95 5,50 6,00 7,00 0,90 0,70 0,20 25,00

Vit. A [IE] Vit. E [mg] Vit. D3 [IE]

23000 60 2000

23000 60 2000

Hersteller: Arp, Thordsen und Rautenberg GmbH&Co.KG 23909 Ratzeburg Werk Golzern

*) Umsetzbare Energie 3.3 Auswertungsmethodik der Leistungsparameter In der Auswertung werden die Einflusse der Lactuloseapplikation auf die Reproduktionsleistung der Sauen und die Aufzuchtleistung ihrer Ferkel unter Berücksichtigung des Wurfgruppeneffektes geschätzt. Die Auswertung der Leistungsparameter erfolgte von HAGEMANN (2001). Die erfassten Leistungsparameter sind in der Tabelle 10 zusammengestellt.

3.4 Mikrobiologische Untersuchung und Auswertung Zusammensetzung des Hepes–Puffers mit Mg2+ (HM–Puffer) Die Herstellung des HM–Puffers wurde durch Zusatz von 1 mM CaCl2 x 2 H2O und 0,1 mM MgCl2 x 7H2O zum Hepes–Puffer (N-2-hydrooxyethyl piperazin-N-2-ethano-sulfonic acid) der Firma Sigma als 5 mM Lösung hergestellt. Der pH–Wert des HM–Puffers wurde auf 7,5 eingestellt. HEPES (C8H18N2O4S) + 100 mg/l CaCl2 + 80 mg/l MgCl2 = HM–Puffer

45

Tab. 10: Leistungsparameter

Sauen

Ferkel

Lebendmasse (LM) 10 d a.p Lebendmasse zur Geburt (einzeltierbezogen)

LM zum Absetzen

LM zum Absetzen

LM – Verlust während der Laktation

LM 10 d nach dem Absetzen

∑ Futterverzehr 10 d a.p

LM zum Verkauf

Ø tägl. Futterverzehr bis zum Absetzen

Tägl. Futterverzehr (gruppenweise)

Wurfmasse zur Geburt (incl. Totgeb.)

Wurfmasse zum Absetzen

Tageszunahme (einzeltierbezogen) für Saugferkel

Ø Kotbonitur von 10 d a.p bis 10 d p.p

Anzahl lebend geb. Ferkel / Wurf

Tageszunahme (einzeltierbezogen) für Aufzuchtsferkel

Ø LM / leb. geb. Ferkel / Wurf Aufzuchtverluste je Gruppe (codiert)

Anz. abgesetzter Ferkel / Wurf Beifutterverzehr je Ferkel im Wurf Anzahl tot geb. Ferkel Ø Masse / tot geb. Ferkel Alter der Ferkel / Wurf beim Absetzen Anzahl Ferkelverluste / Wurf (codiert) bis zum Absetzen

46

3.4.1 Aerobe Gesamtkeimzahl (GKZ) Von den Kotproben wurde zunächst 1 g abgewogen und in Röhrchen mit 9 ml HM–Puffer (pH 7,4 steril) suspendiert und gut homogenisiert. Danach wurden die Proben in Mikrotiterplatten in 10er Schritten bis 10–7 verdünnt. Die Petrischalen mit Nähragar wurden mittels eines Metallstempels 10 kreisrunde Flächen mit einem Durchmesser von 18 mm markiert und ausschließlich beschriftet.

Abb. 5: Aerobe Gesamtkeimzahl auf Einfachagar

Auf gestempelte und beschriftete Petrischalen mit Nähragar (SIFIN Berlin, vgl. Abb. 5) wurden 10 µl von jeder Verdünnung als Doppelansatz getropft und die Platten anschließend aerob im Brutschrank bei 37°C über 24 Stunden lang bebrütet. Unter einer Lichtquelle wurden alle sichtbaren Kolonien gezählt. 3.4.2 Aerobe Keimzahl Gram–negativer Bakterien (KZg–) Die vorverdünnten Proben (Kapitel 3.4.1) fanden auch für die Keimzahlbestimmung Gram–negativer Bakterien Verwendung. Wie die GKZ wurden 10 µl von jeder Verdünnung als Doppeltropfansatz auf die gestempelten und beschrifteten MacConkey–Platten (SIFIN Berlin, vgl. Abb. 6) getropft. Sie wurden ebenfalls aerob

47

im Brutschrank bei 37°C über 24 Stunden bebrütet und danach unter einer Lichtquelle alle sichtbaren Kolonien gezählt.

Abb. 6: Aerobe Keimzahl Gram–negativer Bakterien auf MacConkey–Agar

3.4.3 Keimzahl an Clostridium perfringens Für die Keimzahlbestimmung von Clostridium perfringens wurden 5% Schafblutagar mit 200 µg Neomycin/ml und 100 µg Polymyxin/ml verwendet (vgl. Abb. 7). Von den Verdünnungen, die für die GKZ und KZg– vorbereitet waren, wurden 10 µl Proben entnommen, auf die beschriftete sowie geviertelten Platten getropft und diese mit einem Glasstab ausplattiert. Die Platten wurden mit Anaero–Cult (MERCK) im Anaeorobier–Topf über 48 h bei 37°C aneorob bebrütet. Nach 48 Stunden wurden die Platten ebenfalls unter einer Lichtquelle gezählt.

48

Abb. 7: Schafblutagar mit Neomycin– und Polymyxinzusatz zur Keimzahlbestimmung von C. perfringens

3.4.4 Keimzahl an Bdellovibrionen Die Bdellovibrionen wurden nach der Doppelschichtagarmethode untersucht (STOLP u. PETZOLD 1962). Ein Gramm der Kotprobe wurde abgewogen und in 9 ml HM–Puffer (steril) suspendiert. Wirtszellagar (EDKRÜ) In 1000 ml destilliertes Wasser wurden 20 g Inulin, 20 g Hefe–Extrakt, 20 g CaCO3 und 15 g Agar (Bacto) gemischt und der pH–Wert auf 7,6 eingestellt. Diese Suspension wurde gut homogenisiert, bei 121 oC für 15 min autoklaviert und danach in Petrischalen gegossen sowie in der Kühlzelle aufbewahrt. Wirtszellvorbereitung Zunächst wurde der als Wirtszelle verwendete E. coli–K12 Stamm auf EDKRÜ–Nährboden (EDAO 2001) ausplattiert und 24 Stunden bei 37°C in Brutschrank aerob bebrütet. Danach wurden die Wirtszellen mit HM–Puffer (5 ml pro Platte) abgeschwemmt, in Zentrifugenröhrchen verbracht und 15 min bei 4000 U/min

49

zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand verworfen, das Zellsediment mit 5 ml HM–Puffer aufgefüllt und homogenisiert. Gießmethode In Röhrchen wurde Bdellovibrio–Oberschichtagar (BdO, 5 ml 0,6% Bactoagar) abgefüllt, im Wasserkocher aufgekocht und im Wasserbad, das auf 45°C temperiert war, ca. 15 min aufbewahrt. In den Oberschichtagar wurde 1 ml Wirtszellsuspension, die in einer Konzentration von 108 bis 109 KbE/ml Wirtszellen enthielt, je Röhrchen zugegeben und 30 min inkubiert. Von den verdünnten Kotproben wurden 500 µl entnommen und in den BdO gegeben. Unmittelbar danach wurde der BdO mit einem Schüttler 2000 U/min kurz homogenisiert und auf den Bdellovibrio–Unterschichtagar (BdU) gegossen. Nach Verfestigung der Platten wurden sie bei 37°C im Brutschrank aerob bebrütet und nach 2–5 Tagen abgelesen. Tropfmethode Die Wirtszellsuspension (E. coli K–12) wurde in einer Konzentration von 108–109

KbE/ml in HM–Puffer vorbereitet. Der BdO wurde im Wasserbad bei 45°C 15 min temperiert. Von den vorbereiteten Wirtszellen wurden 500 µl entnommen und in BdO

Abb. 8: Lyseaktivität der Bdellovibrio–Isolate auf Bdellovibrio–

Unterschichtagarplatten nach der Tropfmethode

50

gegeben und gut homogenisiert. Danach wurde diese Wirtszellsuspension mit BdO auf den Bdellovibrio–Unterschichtagar (BdU, vgl. Abb. 8) gegeben und die Platten bis zur Verfestigung bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Zum Schluss werden von untersuchten Proben 20 µl entnommen und auf die Platten getropft. Die Platten werden 2–5 Tage aerob bebrütet und die Plaquebildungen bewertet.

3.5 Enzymologische Untersuchungen

3.5.1 Alkalische Phosphathase Zunächst wurden die Kotproben im Verhältnis von 1:10 verdünnt. Dafür wurden 0,1 g Kot in Eppendorf–Röhrchen (Greiner) abgewogen und jeweils 900 µl AP–Puffer hinzu pipettiert. Nach Homogenisieren wurden Eppendorf–Röhrchen bei 10000 U/min für 10 min zentrifugiert und pro Probe 100 µl Überstand in die Mikrotiterplatte pipettiert. Auf jede Platte wurde der AP–Standard (bovine Schleimhaut, Sigma, Taufenkirchen) mit einer Ausgangskonzentration von 40 U/l mitgeführt. Nach diesem Vorgang wurde AP–Puffer mit einer 10 millimolaren pNPP–Lösung (para-Nitro–Phenyl–Phosphathase) in Röhrchen 50:1 verdünnt. Damit hatte man AP–Substrat zur Verfügung. Alle Vertiefungen, sowohl der Proben als auch des Standards, wurden mit 100 µl AP–Substrat aufgefüllt und schnellstmöglich die Nullwertmessung im Fotometer bei 405/620 nm durchgeführt. Weitere Messungen erfolgten nach 2,5 und 5 min. Zur Erfassung der Extinktionszunahme (≅OD) ist der Nullwert zu subtrahieren. Die Extinktionszunahme der Proben entspricht in Relation zum Standard einem Wert in U/l. 3.6 Immunologische Untersuchungen Die Milch der Sauen wurde auf ihre immunologische Eigenschaften untersucht. Die Methoden wurden von Dr. W. SCHRÖDEL erarbeitet (KRÜGER et al. 2002). Dazu wurden die folgenden immunologischen Parameter zur Untersuchung herangezogen:

• CRP (C–reaktives Protein), • IgG–anti–Phospholipase C (C.perfringens)–Antikörper, • IgM–anti–Phospholipase C (C.perfringens)–Antikörper und • IgG–anti–LPS (E. coli, Rc–Mutante)–Antikörper.

51

3.7 Statistische Analysen Sigma Stat (SPSS Science, Erkrath, Deutschland) ist als Software für die statistischen Analysen verwendet worden. Um eine Normalverteilung zu bekommen, wurden die aerobe GKZ, die aerobe Gesamtkeimzahl Gram–negativer Bakterien, die Keimzahl von Bdellovibrionen und die von C. perfringens logarithmiert. Die Untersuchungen der Normalwerte wurden mittels des Shapiro–Wilk–Testes durchgeführt. Die Signifikanzuntersuchungen erfolgten mit ANOVA (Varianzanalyse) und DUNCAN–Test.

52

4 Ergebnisse

4.1 Ergebnisse der bakteriologischen Untersuchungen 4.1.1 Ergebnisse der aeroben Gesamtkeimzahl Die Ergebnisse der Untersuchungen von Kotproben zur Gesamtkeimzahldynamik sind in der Abbildung 9 dargestellt. Bei den mikrobiologischen Untersuchungen wurde festgestellt, dass die Gesamtkeimzahl (GKZ) von V4 (Versuchsgruppe, letzter Probenentnahmepunkt) hoch signifikant (p=0,002) niedriger lag als bei K4 (Kontrollgruppe, letzter Probenentnahmepunkt), während die Werte V1 (Versuchsgruppe, erster Probenentnahmezeitpunkt) zu K1 (Kontrollgruppe, erster Probenentnahmepunkt) sich nicht signifikant ( p=0,063) unterschieden. Bei beiden Gruppen erreichten die Gesamtkeimzahlen am 2. Entnahmezeitpunkt (V/K2) ihren höchsten Wert. Danach sanken die Werte ab.

Abb. 9: Vergleich der Dynamik der GKZ der Kontroll– und Versuchs–

gruppe (Lactuloseapplikation) bei Sauen im Puerperalzeitraum

6,6

6,8

7

7,2

7,4

7,6

7,8

V/K 1 V/K 2 V/K 3 V/K 4

Proben im Abstand von 10 Tagen (beginnend 10 d a.p.)

log GKZ/g

Versuchsgruppe

Kontrollgruppe

53

4.1.2 Ergebnisse der aeroben Keimzahl Gram–negativer Bakterien Die Ergebnisse der Untersuchungen von Kotproben zur Keimzahldynamik der Gram–negativen Bakterien sind der Abbildung. 10 zu entnehmen. Beim Vergleich der Keimzahl Gram–negativer Bakterien (KZg–) waren die Werte zwischen V2 und K2 im Unterschied zu K4 und V4 tendenziell unterschiedlich (p=0,077 zu p=0,359). Die Werte der KZg– bei beiden Gruppen waren zum ersten Probenentnahmezeitpunkt fast gleich. Bei beiden Gruppen erreichten die Keimzahlen Gram–negativer Bakterien wie die Gesamtkeimzahlen am zweiten Entnahmezeitpunkt (V/K2) ihren höchsten Wert. Bei beiden Gruppen nahm generell die Keimzahl Gram–negativer Bakterien ab dem zweiten Probenentnahmezeitpunkt im Verlauf der Untersuchung ab.

Abb. 10: Vergleich der Dynamik von KZg– von Kontroll– und Versuchsgruppe (Lactuloseapplikation) im Puerperalzeitraum bei Sauen

4.1.3 Ergebnisse der Keimzahl an Clostridium perfringens Die Ergebnisse der Untersuchungen von Kotproben zur Keimzahldynamik von Clostridium perfringens sind in der Abbildung 11 dargestellt.

4 , 5

5

5 , 5

6

6 , 5

V / K 1 V / K 2 V / K 3 V / K 4

P r o b e n i m A b s t a n d v o n 1 0 T a g e n ( b e g i n n e n d 1 0 d a . p . )

l o g K Z g - / g

V e r s u c h s g r u p p e

K o n t r o l l g r u p p e

54

Anlässlich der letzten Probenentnahme in der Kontrollgruppe (K4) war die Keimzahl von Clostridium perfringens höher im Vergleich zu K1, während sie bei der Versuchsgruppe V4 niedriger als V1 lag. Die beiden Gruppen erreichten ihren niedrigsten Wert zum zweiten Probenentnahmezeitpunkt. Danach war ein tendenzieller Anstieg bei beiden Gruppen festzustellen. Während die Keimzahldynamik in der Kontrollgruppe ab dem dritten Entnahmezeitpunkt sich scheinbar stabilisierte, war ein tendenzieller Abfall bei der Versuchsgruppe festzustellen. Ein signifikanter Unterschied zwischen beiden Gruppen war nach 20 Tagen p.p. (p<0,05) festzustellen.

Abb. 11: Vergleich der Dynamik von C. perfringens der Kontroll– und Versuchsgruppe (Lactuloseapplikation) im Puerperalzeitraum bei Sauen

4.1.4 Ergebnisse der Keimzahl an Bdellovibrionen Die Untersuchungsergebnisse von Kotproben auf Bdellovibrionen sind in der Abbildung 12 dargestellt. Es ist festzustellen, dass Lactulose keinen negativen Einfluss auf Bdellovibrionen hat. Die Werte von Kontroll– und Versuchsgruppen wiesen keine signifikanten Unterschiede auf. Eine tendenzielle Entwicklung in den Gruppen im Laufe der Untersuchungen war nicht festzustellen.

3,7

3,9

4,1

4,3

4,5

4,7

4,9

V/K 1 V/K 2 V/K 3 V/K 4

Proben im Abstand von 10 Tagen (beginnend 10 d a.p.)

log C. perfr.

VersuchsgruppeKontrollgruppe

55

Abb. 12: Vergleich der Bdellovibrionen der Kontroll– und Versuchsgruppe (Lactuloseapplikation) im Puerperalzeitraum bei Sauen

Die Beziehungen zwischen Bdellovibrionen und C. perfringens der Versuchs– und Kontrollgruppe im Untersuchungszeitraum sind in den Abbildungen 13 und 14 dargestellt. Dazu kam das Statistikprogramm SAS zur Anwendung. Während der Korrelationskoeffizient zwischen Bdellovibrionen und C. perfringens in der Versuchsgruppe 10 Tage a.p bei –0,166 (p<0,177), am Tag der Geburt bei –0,02 (p<0,829), 10 Tage p.p bei –0,215 (p<0,868) und 20 Tage p.p bei –0,071 (p<0,570) lag, befand sich dieser in der Kontrollgruppe 10 Tage a.p bei –0,03 (p<0,808), zur Zeit der Geburt bei –0,062 (p<0,633), 10 Tage p.p bei –0,186 (p<0,139) und 20 Tage p.p bei 0,09 (p<0,471). Demnach konnten in beiden Gruppen zu keinem Zeitpunkt korrelative Zusammenhänge festgestellt werden. Im Laufe der gesamten Untersuchung konnte keine signifikante Korrelation zwischen Bdellovibrionen und C. perfringens festgestellt werden, da durchgängig zu geringe Konzentrationen an Bdellovibrionen im Kot der Sauen nachzuweisen waren.

Dynam ik von Bdellovibrionenkonzentration

1

1,5

2

V/K1 V/K2 V/K3 V/K4

Proben im Abstand von 10 Tagen (beginnend 10 d a.p.)

lo

g B

dello

vibr

ione

n/g

Kontrollgruppe

Versuchsgruppe

56

Abb. 13: Beziehung zwischen Bdellovibrionen (Bdello.) und C. perfringens bei Sauen der Versuchsgruppe

1,6 1,45 1,4 1,36

4,89

3,91

4,954,59

0

1

2

3

4

5

6

V1 V2 V3 V4

Probenentnahmezeitpunkte im Abstand von 10 Tagen, beginnend 10 Tage a.p.

log

C. p

erf./

Bde

llo.

BdellovibrionenC. perfringens

Abb. 14: Beziehung zwischen Bdellovibrionen (Bdello) und C. perfringens bei Sauen der Kontrollgruppe

1,5 1,52 1,37 1,38

4,07 3,87

4,84 4,96

0

1

2

3

4

5

6

K1 K2 K3 K4

Probenentnahmezeitpunkte im Abstand von 10 Tagen, beginnend 10 Tage a.p.

log

C. p

erf./

Bde

llo.

BdellovibrionenC. perfringens

57

4.2 Ergebnisse der enzymologischen Untersuchungen

4.2.1 Ergebnisse der Alkalischen Phosphathase–Bestimmung Die Ergebnisse der Untersuchungen der Kotproben zur Bestimmung der Alkalischen Phosphathase–Aktivität sind in der Abbildung 15 dargestellt. Zu keinem Zeitpunkt der Probenentnahme war zwischen der Kontroll– und Versuchsgruppe ein deutlicher Unterschied und damit ein Einfluss der Lactulose-applikation (Versuchsgruppe) auf den Parameter Alkalische Phosphathase–Aktivität (AP–A) im Kot erkennbar. Die Werte von AP–A erreichten ihren höchsten Stand zum zweiten Probenentnahmezeitpunkt. Danach fielen die Werte bei beiden Gruppen tendenziell ab. Nach dem dritten Probenentnahmezeitpunkt war ein leichter Anstieg festzustellen.

Abb. 15: Alkalische Phosphathase–Aktivität in den Kotproben der Kontroll–

und Versuchsgruppe nach Lactuloseapplikation

0

0 ,1

0 ,2

0 ,3

0 ,4

0 ,5

0 ,6

V /K 1 V /K 2 V /K 3 V /K 4

P r o b e n im A b s ta n d v o n 1 0 T a g e n (b e g in n e n d 1 0 d a .p .)

alk.

Pho

spha

tase

(U/g

)

K o n tr o l lg r u p p e

V e r s u c h s g r u p p e

58

4.3 Ergebnisse der immunologischen Untersuchengen

4.3.1 C–reaktives Protein (CRP) Die Untersuchungsergebnisse von Milchproben auf C–reaktives Protein (CRP) sind in der Abbildung 16 dargestellt. Beide Gruppen besaßen zum Zeitpunkt M1 der Milchprobenentnahme die höchsten CRP–Werte. Danach sanken diese deutlich bis M2 ab. Zu keinem Messzeitpunkt bestanden signifikante Abweichungen zwischen Kontroll– und Versuchsgruppe (p= 0,295).

Abb. 16: Gehalt an CRP in der Milch von Sauen nach Lactulose- applikation im Puerperalzeitraum

0

2

4

6

8

10

12

14

16

M1 M2 M3Probenentnahmezeitpunkt, beginnend mit der Geburt im

Abstand von 10 Tagen

CR

P (µ

g/m

l)

KontrollgruppeVersuchsgruppe

59

4.3.2 Anti–Phospholipase C–Antikörper von C. perfringens Die Ergebnisse der Untersuchungen von Milchproben zur Bestimmung der Gehalte an IgG und IgM–Anti–Phospholipase C–Antikörpern von C. perfringens sind in den Abbildungen 17 und 18 dargestellt. Auf der Basis des relativen Gehaltes an IgG–anti–Phospholipase C (C. perfringens) waren keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Gruppen festzustellen, während bei den IgM–anti–Phospholipase C–Antikörpern zum zweiten Proben-entnahmezeitpunkt ein leichter Abfall bei der Versuchsgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe ermittelt werden konnte. Allerdings bestand zwischen beiden Gruppen zu diesem Zeitpunkt (M2) kein signifikanter Unterschied (p=0,970). Sowohl die Kontroll– als auch die Versuchsgruppe hatten zum ersten Entnahmezeitpunkt ihren höchsten IgG–anti–PLC–Antikörper-Gehalt, wobei ein höherer Wert (p=0,577) zugunsten der Versuchsgruppe festzustellen war.

Abb. 17: Gehalt an IgG–anti–Phospholipase C–Antikörpern (C. perfringens) in

Sauenmilch nach Applikation von Lactulose

Gehalt an IgG-anti-Phospholipase C-Antikörpern (C. perfringens)

0

500

1000

1500

2000

M1 M2 M3

Probenentnahmezeitpunkt, beginnend mit der Geburt, im Abstand von 10 Tagen

IgG

-ant

i-PLC

-Ant

ikör

per (

rE/m

l) KontrollgruppeVersuchsgruppe

60

Abb. 18: Gehalt an IgM–anti–Phospholipase C–Antikörper (C. perfringens) in Sauenmilch nach Applikation von Lactulose

Gehalt an IgM-anti-PLC-Antikörper (C. perfringens)

0

25

50

75

100

M1 M2 M3Probenentnahmezeitpunkt, beginnend mit der Geburt, im

Abstand von 10 Tagen

IgM

-ant

i-PLC

-Ant

ikör

per (

rE/m

l)

KontrollgruppeVersuchsgruppe

4.3.3 Anti–LPS–Antikörper Die Ergebnisse der Untersuchungen von Milchproben zur Bestimmung des Gehaltes an Anti–LPS–Antikörpern sind in der Abbildung 19 dargestellt. Im Gehalt an IgG–anti–LPS unterschied sich die Versuchsgruppe bei M2 signifikant (p<0,05) von der Kontrollgruppe, während bei M1 und M3 keine signifikanten Unterschiede festzustellen waren. Ihren höchsten Stand erreichten beide Gruppen im Bezug auf den Gehalt an IgG–anti–LPS–Antikörpern zum ersten Probenentnahme-zeitpunkt. Danach sanken die Werte bei beiden Gruppen bis M2. Es ist festzustellen, dass die Werte ab M2 sich stabilisiert haben.

61

Abb. 19: Gehalt an IgG–anti–LPS (E. coli, Rc–Mutante) in Sauenmilch nach Lactuloseapplikation

4.4 Leistungsparameter 4.4.1 Reproduktions– und Aufzuchtleistungen der Sauen Die Reproduktions– und Aufzuchtleistungen der Sauen werden in der Tabelle 11 dargestellt. Im Alter bzw. Nutzungsstatus waren die Sauen der Versuchs– und Kontrollgruppe vergleichbar. Interessant war die signifikant kürzere Trächtigkeits-dauer bei Versuchssauen gegenüber Kontrollsauen. Der Masseverlust der Sauen während der Laktation war in der Lactulosegruppe wegen des höheren Futterverzehrs um 2,6 kg geringer als bei der Kontrollgruppe.

10

100

1000

M1 M2 M3Probenentnahmezeitpunkt, beginnend mit der Geburt im Abstand von 10

Tagen

IgG-anti-LPSrE/ml

Versuchsgruppe

Kontrollgruppe

p<0,05

62

Tab. 11: Die Reproduktions– und Aufzuchtleistung der Sauen

Parameter Kontrolle Versuch Diff. zu Kon.

Anzahl Sauen 67 71

Wurfnummer1) 4,6 [3,4] 4,4 [3,1]

Trächtigkeitstage 115,6a 115,1b -0,5

Lebendmasse (LM) der Sauen:

LM ≈ 10 Tage a.p.2) (kg) Anzahl gewogener Sauen

275,7 n=63

278,5 n=69

+ 2,8

Zum Absetzzeitpunkt (kg) 249,4 254,8 + 5,4

LM-Verlust in der Laktation (kg) 26,3 23,7 - 2,6

Ferkel je Sau:

Insgesamt geb. Ferkel -IGF- (Stck.)

10,32 10,43 + 0,11

Lebend geb. Ferkel –LGF (Stck.)

8,93 8,84 - 0,09

Totgeborene Ferkel -TGF- (Stck.)

1,40 1,59 + 0,19

Abgesetzte -AGF- (Stck.)

7,65 7,87 + 0,19

Wurfmasse:

IGF (kg) 15,85 15,97 + 0,12

LGF (kg) 13,90 13,80 - 0,10

TGF (kg) 1,95 2,17 + 0,22

AGF (kg) 37,55 38,71 + 1,16

1) arithmetisches Mittel und Standardabweichung (in [ ]) 2) Wägung: erster errechneter Abferkeltermin minus 10 Tage für alle Sauen einer Wurfgruppe a, b unterschiedliche Hochbuchstaben bezeichnen eine signifikante Merkmals-

differenz (SNK–Test)

63

Tab.12: Ferkelleistung

Parameter Kontrolle Versuch Diff. zu K

Lebendmasse je Ferkel (kg):

Bei Geburt (je LGF) 1,56 (n=662)

1,57 (n=714)

+0,01

Beim Absetzen 5,01 (n=517)

5,05 (n=572)

+0,04

10–11 Tage nach Absetzen im Flatdeck 6,37 (n=502)

6,53 (n=563)

+0,16

Nach 35 Aufzuchttagen im Flatdeck 19,32 (n=493)

19,89 (n=555)

+0,57

Tägliche Lebendmassezunahme im Haltungsabschnitt (in g)

Saugferkel 165 163 -2

Aufzuchtferkel (10 bis 11 Tage im Flatdeck)

130a 147b +17+

Aufzuchtferkel (35 Tage im Flatdeck) 375a 390b +15+

Tägliche Lebendmassezunahme (g) (kumulativ)

Geburt bis 10 Tage nach Absetzen 155 158 +3

Geburt bis 35 Tag nach Absetzen 302 309 +7

Futterverbrauch im Haltungsabschnitt

Gesamtfutter je Saugferkel*) (g) 214 212 -2

Gesamtfutter je Aufzuchtsferkel*) (1 bis 12 Tage im Flatdeck) (kg)

2,95 3,09 +0,14

Tierverluste im Abschnitt**) (%)

Saugferkel 21,9 19,9 -2,0

Aufzucht (bis 35. Tag im Flatdeck) 4,6 3,0 -1,6

Insgesamt 25,5 22,3 -3,2

a, b: Unterschiedliche Hochbuchstaben bezeichnen eine signifikante Merkmals-

differenz (SNK–Test) *): Beifuttergabe kumulativ je Abferkelung bzw. je Aufzuchtbucht erfasst **): Berechnung prozentual aus Gesamtferkelpool

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4.4.2 Ferkelleistungen Die erfassten Ferkelleistungen wurden in der Tabelle 12 dargestellt. Die mit Lactulose versorgten Ferkel nahmen in den ersten 10 Tagen nach dem Absetzen signifikant 13% mehr zu als die Kontrollgruppe. Insgesamt verringerten sich die Ferkelverluste mit der definierten Lactulose–Applikation um etwa 3%. Dieser Erfolg betraf sowohl die Saug– als auch die Aufsuchtferkel. Anhand der diesbezüglich erzielten Ergebbnisse ist festzustellen, dass Lactulose den mit dem Verzicht auf Muttermilch verbundenen Stress für die Ferkel der Versuchsgruppe reduzierte.

65

5 Diskussion

5.1 Untersuchte Substrate 5.1.1 Kot Der Verdauungskanal stellt sich innerhalb seiner einzelnen Abschnitte in seinen verschiedenartigen anatomischen und physiologischen Gegebenheiten dar. Diese Gegebenheiten bestimmen mehr oder weniger die qualitative und quantitative Zusammensetzung der Darmflora mit. Die bakterielle Besiedlung unterscheidet sich auch innerhalb eines Darmabschnittes, z.B. zwischen dem Darmlumen und der Darmwand (AMTSBERG 1984). Zwischen Kot und Darminhaltbeschaffenheit existieren große Unterschiede. Trotzdem wird Kot als Substrat verwendet, da es sich um einen Feldversuch handelte und die Tiere im Produktionsprozess standen.

5.1.2 Milch Milch wurde als Substrat immunologischer Untersuchungen verwendet. Die Sauen sollten vor der Geburt nicht durch eine Blutentnahme belastet werden. Milchproben wurden bereits in Voruntersuchungen an zwei Versuchs– und zwei Kontrollsauen als Untersuchungssubstrat mit gutem Nachweisergebnis für CRP und Antikörper verwendet.

5.2 Auswahl der bakteriologischen Untersuchungsparameter Wie schon im Literaturteil erwähnt wurde, sind die Effekte der Lactulose auf die Magen–Darm–Flora aus der Humanmedizin bekannt. Einerseits dient die Lactulose den kohlenhydratspaltenden Bakterien des Dickdarms als ein spezieller Nährstoff, andererseits tragen durch seine Spaltung entstandene kurzkettige Fettsäuren zur Versorgung der Kolonozyten und zur Senkung des Kolon–pH–Wertes bei. Die Senkung des Kolon–pH–Wertes und die Produktion der kurzkettigen Fettsäuren schränken das Wachstum der Gram–negativen Bakterien wie Bacteroides und Koliforme–Keime ein (RUBIN et al. 1982). Aus der Humanmedizin und aus Tierversuchen bekannte Wirkungen der Lactulose auf die Magen–Darm–Flora veranlaßten uns, diese Eigenschaften auch bei Schweinen zu untersuchen, da zwischen Menschen und Schweinen im Hinblick auf den Magen–Darm–Trakt einige Ähnlichkeiten vorhanden sind.

66

Die bakteriologischen Parameter sollten kostengünstig und einfach zu erfassen sein. Aus Voruntersuchungen an Schweinen und anderen Tierarten war bekannt, dass quantitative Untersuchungen auf aerobe Gesamtbakterien, aerobe Gram–negative Bakterien und C. perfringens im Kot aussagefähig sind, deren engere Beziehung zum Gesundheitsstatus der Tiere aufzuzeigen. Bakteriologische Parameter werden in verschiedenen Publikationen zur Erfassung des Lactuloseeffekts verwendet. Zahlreiche Arbeiten aus der Humanmedizin und aus Tierexperimenten (HOFFMANN et al. 1964, BALLONGUE et al. 1997, VAGIANOS et al. 1995) belegen eindeutig, dass Veränderungen in bestimmten Keimgruppen, z.B. in der Bifidusflora durch Lactulose induziert werden. Aus Voruntersuchungen an Schweinen und Rindern ist bekannt, dass die aerobe Gesamtkeimzahl, die aerobe Gram–negative Keimzahl und die an C. perfringens gute Parameter zur Erfassung des Lactuloseeffekts bei Laktierenden sein können. Diese Parameter sind kostengünstig und einfach zu reproduzieren. Aus technischen Gründen konnten wir die Kotproben nicht frisch untersuchen. Wie im Kapitel Material und Methoden beschrieben, wurden die Proben gesammelt, im Gefrierschrank bei –20°C aufbewahrt und schließlich nach Beendigung einer Wurfgruppe zum Untersuchungslabor transportiert. Das Einfrieren der Proben kann die Keimzahlen negativ beeinflussen. Die vorgegebenen Bedingungen galten aber auch für die Kontrollgruppe. Daher kann die äußere Einflusse auf die Ergebnisse relativiert werden, weil die Kotproben beider Gruppen unter gleichen Bedingungen untersucht worden sind.

5.3 Auswahl der immunologischen Parameter Aus der Literatur ist zu entnehmen, dass Lactulose auch immunmodulierende Effekte besitzt. GREVE et al. (1990) und LIEHR und HEINE (1981) berichten über die inhibitorischen Effekte von Lactulose auf die TNFα–Produktion von Monozyten, die durch Endotoxin stimuliert wurden. Weiterhin sind für Lactulose antiinflammatorische Effekte beschrieben worden (GREVE et al. 1990). Daher war es bedeutsam, den unspezifischen Entzündungsparameter CRP in die Untersuchung einzubeziehen. SCHRÖDL et al. (1995) konnten zum ersten Mal nachweisen, dass das Vorkommen des CRP’s auch in der Rindermilch quantitativ durch EIA (Enzymimmunoassays) zu

67

erfassen war. Den genannten Autoren ist es gelungen, im Falle einer Mastitis mehr als die zehnfache Erhöhung der CRP–Konzentration in der Rohmilch festzustellen. In unseren Untersuchungen wurden der Gehalt an IgG–anti–LPS–Antikörpern und IgG– und IgM–anti–Phospholipase C (C. perfringens)–Antikörpern bei den Tieren in Verlaufsuntersuchungen bestimmt. Der Gehalt an IgG–anti–LPS–Antikörpern (E. coli J5) und anti–Phospholipase C (C. perfringens)–Antikörpern (IgG und IgM) als Parameter des spezifischen, adaptiven Immunsystems sowie das Akut–Phase–Protein (CRP) als Parameter des angeborenen unspezifischen humoralen Immunsystem haben ihre Eignung bereits bei anderen Untersuchungen (ELSAYED 2002, SCHRÖDL et al. 1995) bewiesen und können die Beziehung zwischen der qualitativen und quantitativen Zusammensetzung der Magen–Darm–Flora reflektieren.

5.4 MMA–Komplex und seine Regulierung Der MMA–Komplex ist nach wie vor die bedeutendste Erkrankung im Puerperium. Nach KIELSTEIN (1987) können 10 bis 30% der Sauen an klinischen Symptomen, bis zu 80% subklinisch erkranken. Die ökonomischen Schäden umfassen erhöhte Verluste und verminderte Tageszunahmen bei Saugferkeln. Verluste, Zuchtuntauglichkeit oder verminderte nachfolgende Fruchtbarkeitsleistungen bei Sauen kommen noch hinzu. Nicht nur der Kostenaufwand sondern auch die Probleme der frühzeitigen Erkennung und die Resistenzentwicklungen waren Ursachen dem MMA–Komplex vorzubeugen. Die Reproduktionsleistungen der Sau werden im entscheidenden Maße von der Fütterung der Sau beeinflusst. Bei der klassischen Geburtsvorbereitungsfütterung wird bereits in den letzten 3 bis 5 Tagen vor der Geburt eine restriktive Fütterung vorgenommen. Wenn man in Betracht zieht, dass gerade in den letzten Tagen vor der Geburt jeder Fötus ca. 100 g pro Tag zunimmt, erhöht sich der Energiebedarf der Sauen erheblich. Die Sau muss schon vor der Geburt sehr viel körpereigene Substanz abbauen. Die Anfütterung der Sauen in den nächsten Tagen nach der Geburt ist häufig erschwert, wodurch die Milchleistung und damit auch die Ferkelentwicklung nicht optimal sind. Die Trächtigkeit erfordert besondere Maßnahmen, da die Tiere um den Geburtszeitraum zusätzlich unter besonderem Stoffwechselstress und hohem Infektionsdruck stehen. Diese fördern MMA–Komplex–Erscheinungen und Harnblasenentzündungen bei den Sauen (KAMPMANN 2000).

68

FINKENSIEP (1993) konnte in eigenen Untersuchungen feststellen, dass die Sauen in der späten Trächtigkeit und nach der Abferkelung infolge der Inaktivität und Inappetenz weniger Wasser aufnehmen, wobei er keine erkennbare Einflüsse der Wasseraufnahme ante bzw. intra partum auf die Gesundheit des Harnapparates im Puerperium nachweisen konnte. Der verminderte Spüleffekt des Wassers und die verringerte Abwehrkraft sollen nach BERNER (1988) bei der Entstehung der HWI eine entscheidende Rolle spielen. Um Obstipationen um den Geburtszeitraum zu vermeiden, soll genügend Trinkwasser zur Verfügung stehen. Dadurch werden die Darmpassage beschleunigt und der Darminhalt schneller befördert. Potentiell pathogene Keime finden so keine Gelegenheit sich schnell zu vermehren und an die Epithelzellen anzuheften. Wasser wird auch unter anderem für die Milchbildung verbraucht. Um die Homöostase der Tiere zu gewährleisten, soll die Wasseraufnahme gefördert werden. Mit leicht süßlichem Geschmack stimuliert Lactulose die Wasseraufnahme. Lactulose erhöht im Darm den osmotischen Druck, was wiederum die Wasserabsorption erhöht. Die Verflüssigung des Darminhaltes erleichtert desen Verdauung und Absorbtion erheblich. Um den Geburtszeitraum erhöht sich der Energie– und Rohproteinbedarf der trächtigen Sauen. Die Integrität der Darm–Epithelzellen ist entscheidend, um den Translokationsdruck zu vermeiden. Der Abbau von Lactulose durch die saccharolytischen Bakterien führt zur Bildung der kurzkettigen Fettsäuren, die eine Energiequelle der Epithelzellen sind. Diese tragen zur Integrität der Epithelzellen bei. Um den Geburtszeitraum wird empfohlen ein spezielles Geburtsvorbereitungsfutter mit pH–Wert senkenden Mitteln einzusetzen. Die pH–Wert–Absenkung schränkt die Vermehrung potentiell pathogener Keime im Darmlumen, in der Blase, aber auch in den Harnwegen ein. Lactulose gelangt zum größten Teil unverdaut in den Dickdarm, wo sie durch Milchsäurebakterien aber auch durch Bifidobakterien abgebaut wird. Daraus entstandene kurzkettige Fettsäuren wie Propionsäure, Buttersäure aber auch Milchsäure säuern das Milieu an. Unabhängig davon, ob die Erreger aszendierend durch den Harnweg (BERNER 1971) oder durch die Zitzenzisterne (BERTSCHINGER 1984) oder deszendierend aus dem Darmkanal in den Uterus und die Gesäuge (AWAD–MASELMEH et al. 1990) gelangen, wird E. coli für die Auslösung des MMA–Komplexes von verschiedenen Autoren verantwortlich gemacht. FRITSCHE (1998) vertritt die Meinung, dass die Hochleistungsmilchkuh sich zumindest in der frühpuerperalen Periode nicht in der Homöostase befindet. Der genannte Autor konnte bei Tieren mit Fieber einen höheren Besiedlungsgrad des Uterus und des Euters vor allem mit Staphylokokken, Streptokokken und koliformen Keimen feststellen.

69

Nicht nur die Bakterien, sondern auch Endotoxine wurden als Krankheitsauslöser genannt (NACHREINER et al. 1972, MORKOÇ et al. 1983). Dabei besteht die Meinung, dass Endotoxine aus Darm– und Urogenitaltrakt resorbiert werden und mit dem Blut in die Milchdrüse gelangen können. Endotoxine schädigen nicht nur die Epithelzellen, sondern hemmen auch über den Hypothalamus die Sekretion des Prolaktins. Diese mangelhafte Sekretion an Prolaktin ist eine wesentliche Ursache der Agalaktie (SMITH u. WAGNER 1995).

5.5 Einfluss der Lactulose auf bakteriologische Parameter FULLER und GIBSON (1997) teilen die Bakterien des Intestinaltrakts in Gruppen, die einerseits gesundheitsfördernde Funktionen und die andererseits schädliche und pathogene Effekte besitzen. Zahlreiche Naturwissenschaftler untersuchten den gesundheitsfördernden Effekt von Präbiotika wie z.B. Fructooligosaccharide, Inulin und Lactulose (GIBSON et al. 1995, KLEESEN et al. 2001). Die positiven Effekte der Lactulose auf den Kolonmetabolismus sind gut bekannt. Die gesundheitsfördernden Effekte von Ballaststoffen wie Pektinen, Hemizellulosen und Pflanzengummis sind seit langem bekannt. Die Ballaststoffe unterscheiden sich von einem Präbiotikum durch ihre mangelnde Spezifität, so dass sie neben gesundheitsfördernden Bakterien unter Umständen auch Wachstum und Stoffwechselaktivitäten potentiell gesundheitsschädlicher Keime fördern (VRESE 1997). In vitro Untersuchungen von HOFFMANN et al. (1964) zeigen, dass B. bifidum, L. acidophilus und Streptokokken der Lancefield–Gruppe D regelmäßig Lactulose abbauen. E. coli und Staph. aureus bilden aus Lactulose dagegen keine bzw. nur sehr wenig Milchsäure. Im peripartalen Zeitraum unterliegen die Tiere dem Stress, einer hormonellen Umstellung, einem hohen Glukokortikoidspiegel und auch einem hohen Erregerdruck, welche wiederum für die Entstehung des MMA–Komplexes von Bedeutung sind (BERTSCHINGER et al. 1990). Darum sind Verfahren bzw. Maßnahmen wünschenswert, die zu einer Reduzierung von potentiell pathogenen Keimen im MDT führen. STUKE (2003) hat die möglichen infektionsprophylaktischen Effekte verschiedener Futterzusätze, u.a. Lactulose, unter den Bedingungen einer experimentellen oralen Belastung mit E. coli an Absetzferkeln bzw. mit S. Derby an Mastschweinen

70

untersucht, wobei er keinen Einfluss der Lactulose auf die Kot– und Chymusqualität sowie die Stoffwechselprodukte der Intestinalflora bei Absetzferkeln wie auch bei Mastschweinen feststellte. Er konnte aber einen Trend zur Verringerung von E. coli sowie zur Reduktion der NH3–Konzentration bei Absetzferkeln beobachten. Demgegenüber stellte er fest, dass Lactulosezulage keinen Einfluss auf das Auftreten der Ödemkrankheit sowie die Ausscheidung und Translokation von S. Derby bei Mastschweinen nach experimenteller Infektion hatte. Dabei wurden ca. 25 g reine Lactulose pro Kilogramm–Futter gegeben. Eine höhere Dosis der Lactulose könnte zu signifikanteren Ergebnissen führen, da die Verträglichkeitsgrenze der Lactulose sehr breit ist. Der Versuchsansatz von STUKE (2003) ist mit dem eigenen nicht vergleichbar, da er das Disaccarid Lactulose mit einem Antibiotikum direkt vergleicht. Dieser Vergleich ist unangemessen und bedarf einer Wiederholung, da auch die untersuchten Proben zu sehr unterschiedlichen Zeitpunkten entnommen worden sind.

5.5.1 Aerobe Gesamtkeimzahl Mit unseren Ergebnissen konnten wir ebenfalls zeigen, dass Lactulose die Bakterien im Kot beeinflusste. Interessanterweise fanden wir signifikante Effekte (p<0,01) bei den aeroben Gesamtkeimzahlen 20 Tage post partum. Wenn man die Anfangssituation in Betracht zieht, merkt man, dass die Gesamtkeimzahl schon am Anfang des Versuches tendenziell unterschiedlich (nicht signifikant) war. Für die aerobe Gesamtkeimzahl ist Nähragar zum Einsatz gekommen. Die erzielte signifikant niedrigere aerobe Gesamtkeimzahl ist auf den Wechsel der quantitativen Zusammensetzung der Darmflora zurückzuführen. Die höchsten Gesamtkeimzahlen konnten erwartungsgemäß bei den Proben am Tag der Geburt festgestellt werden. Die Tiere stehen während der Geburt unter massivem physischen aber auch psychischen Stress. Dieser massive Stress kann unter anderem zur Immunschwäche führen, deren unmittelbare Folge eine Erhöhung der Gesamtkeimzahl im MDT sein kann. Es ist auch denkbar, dass die Bakterien direkt auf Stressfaktoren mit Vermehrung reagieren.

5.5.2 Aerobe Keimzahl Gram–negativer Bakterien (KZg–) Die Ergebnisse der KZg– waren tendenziell unterschiedlich, jedoch nicht signifikant. Die KZg– waren am Anfang der Untersuchung in Versuchs– und Kontrollgruppe gleich. Der höchste Wert der KZg– bei beiden Gruppen wurde wie schon für die GKZ

71

gefunden, am Tag der Geburt festgestellt. Danach fielen die Werte allmählich im Laufe der Untersuchung ab. Diese Ergebnisse kommen Literaturangaben nahe. HARJU (1986) konnte nachweisen, dass Lactulose durch die ß–Galaktosidase von E.coli und Bacteroides fragilis nicht oder sehr wenig hydrolisiert wurde. HOFFMANN et al. (1964) konnten in vitro ebenfalls zeigen, dass auch Bacteroides, Proteus, Salmonellen und Shigellen keine Ansäuerung des Lactulose–Nährbodens hervorgerufen haben. Dagegen konnte mit E.coli ein schwacher Indikatorumschlag zum Sauren festgestellt werden.

5.5.3 Clostridium perfringens Aus den Kotproben von Schweinen wurden verschiedene Klostridien–Spezies isoliert, von denen C. perfringens zur konstanten Darmflora des gesunden Schweines zählt (SCHULZE 1987). Aufgrund der Bildung verschiedener Major–Toxine werden innerhalb dieser Spezies 5 Toxovare (A, B, C, D, E) unterschieden. Während bei Läufer–, Mast– und Zuchtschweinen hauptsächlich als Enterotoxämieerreger die Toxovar–A in Frage kommt, führt bei Saugferkeln vorwiegend Toxovar–C zur nekrotischen Enteritis. Das Vorkommen von C. perfringens im Darmkanal von Schweinen wird wesentlich vom Alter der Tiere, der Futterzusammensetzung sowie den Fütterungs– und Haltungsbedingungen beeinflusst. Nach AMTSBERG et al. (1976) bestehen Zusammenhänge zwischen der Aufnahme von zu hohen Eiweißkonzentrationen und dem Auftreten von durch C. perfringens hervorgerufenen Enterotoxämien. Nach ALLISON und MACFARLANE (1989) bevorzugen Klostridien zum optimalen Wachstum ein leicht saures Milieu im Bereich zwischen pH 6–7. Wir konnten signifikante Unterschiede (p<0,05) zwischen den beiden Gruppen in der Keimzahl von C. perfringens 20 Tage nach der Geburt feststellen. Die Keimzahl von C. perfringens war nach der Geburt wegen drastischer Reduktion des Futters bei beiden Gruppen deutlich reduziert. Lactulose hat unter anderem eine leichte pH–senkende Wirkung im Darm (SCHUMANN 1992).

5.5.4 Bdellovibrionen Neuere Untersuchungen (EDAO 2001) geben Hinweise darauf, dass die Bdellovibrionen bei der Erhaltung des ökologischen Gleichgewichtes im Darm eine Rolle spielen können, da bei Tieren und Menschen, die gastrointestinale

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Entzündungsprozesse aufwiesen, Bdellovibrionen nicht oder nur vereinzelt nachgewiesen worden sind. Wir konnten auch in der Mehrzahl der untersuchten Proben Bdellovibrionen nachweisen. Lactulose hatte in den eigenen Untersuchungen keinen Einfluss auf die Anzahl an Bdellovibrionen. Die Keimzahldynamik beider Tiergruppen wiesen keine signifikanten Unterschiede auf und wichen im Laufe der Untersuchung nicht voneinander ab.

5.6 Enzymologische Parameter 5.6.1 Alkalische Phosphathase Die Alkalische Phosphathase (AP) ist ein membrangebundenes Enzym, das in vielen Organen, unter anderem im Darm vorkommt. POELSTRA et al. (1997) berichteten über Detoxifikation von bakteriellen Endotoxinen durch AP. Die Funktion der AP wird durch das Zerschneiden von Phosphatidylinositol durch Phospholipase C aufgehoben. In unseren Untersuchungen konnten wir keinen signifikanten Unterschied in der AP–Aktivität im Kot zwischen Kontrall– und Versuchsgruppe finden. Die beiden Gruppen erreichten ihre höchste AP–Aktivität am Tag der Geburt, was auch bei der Gesamtkeimzahl und der Keimzahl Gram–negativer Bakterien der Fall war, während C. perfringens um diesen Zeitpunkt am niedrigsten lag. Diese höhere AP–Konzentration um die Geburt ist als Resultat der Koprostase zu werten. Diese Erhöhung kann eine Antwort über die erhöhten Keimzahlen sein.

5.7 Einfluss der Lactulose auf immunologische Parameter 5.7.1 C–reaktive Protein (CRP) Das C–reaktive Protein gehört zu den Akute–Phase–Proteinen, das zuerst entdeckt wurde. Im normalen Serum ist die CRP–Konzentration sehr gering. In Folge von Entzündungsreaktionen kann sich die CRP–Konzentration in den ersten 24 Stunden bis auf das 1000 fache erhöhen (DIKER 1998). Das Vorkommen von CRP ist bei verschiedenen Tierarten beschrieben worden (SCHRÖDL et al. 1995). NEUMANN und KRÜGER (1999) konnten nachweisen, dass eine hohe Korrelation zwischen dem CRP–Gehalt und Sc. uberis in der Kuhmilch besteht. Nach ihren

73

Einschätzungen spiegelt die erhöhte CRP–Konzentration vor allem in den Proben mit Sc. uberis die infektionsbedingten Gewebsschädigungen und die daraus resultierenden unspezifischen Entzündungsreaktionen wider. SCHRÖDL et al. (2003) haben die Effekte von Kolostrumeinnahme und von additiver Lactulosegabe auf die CRP–Konzentration im Blut von Kälbern untersucht. Nach der Kolostrumeinnahme wurde ein signifikanter Anstieg der CRP–Konzentration festgestellt, während die Werte bei Lactulosezufuhr noch signifikanter ausfielen. Die gleichen Autoren haben in vitro die antibakteriellen Effekte des Plasmas derselben Tiere auf Morganella morganii getestet und eine höhere antibakterielle Aktivität im Plasma der Lactulosegruppe gegenüber anderen Gruppen festgestellt. Unsere Untersuchungsergebnisse stehen mit den von SCHRÖDL et al. (1995) ermittelten CRP–Befunden im Einklang. Die genannten Autoren haben bei mastitis-erkrankten Kühen im Vergleich zu nicht erkrankten Tieren 8 bis 34 fache höhere CRP–Konzentration gemessen. Wir konnten einen höheren CRP–Gehalt am Tag der Geburt feststellen. Da diese Erhöhung auch bei der Kontrollgruppe vorlag und kein Unterschied zwischen Versuchs– und Kontrollgruppe bestand, ist diese Erhöhung des CRP–Gehaltes in der Milch aus unserer Sicht als Antwort auf die veränderte Situation zu bewerten.Die Sauen waren gesund. Der hohe CRP–Gehalt nach der Geburt in der Milch ist physiologisch. Das CRPbesitzt Abwehrfunktionen und wird über die Milch vom Ferkel aufgenommen.

5.7.2 Gehalt an Anti–Phospholipase C–Antikörpern Einige Bakterienspezies wie C. perfringens sind in der Lage, Phospholipase C zu bilden. Phospholipase C hydrolysiert als Lecithinase Lecithin, aus dem dann enteral Phosphocholin entsteht. Klostridien vermehren sich und versporen im Darm, unter der Versporung wird das Enterotoxin frei (BISPING u. AMTSBERG 1988). Wir konnten auf der Basis des relativen Gehaltes an IgG und IgM–anti–Phospholipase C (C. perfringens) keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Gruppen feststellen. Die beiden Gruppen wiesen am Tag der Geburt den höchsten Gehalt an IgG und IgM–anti–phospholipase C (C. perfringens) auf. Phospholipasen gehören zum bakteriellen Adaptationssystem. Lactulose kann die Bakterien nach unseren Untersuchungen vor Umweltstress schützen. Da beide Gruppen keine Unterschiede in den Anti–PLC (C. perfringens)–Antikörper aufwiesen, kann davon ausgegangen werden, dass die Lactulosekonzentration nicht

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ausreichend groß war, in der IgG–Klasse einen Antikörperverbrauch durch gebildete PLC zu verhindern bzw. in der IgM–Klasse die Antikörperbildung. KRÜGER et al. (2002) konnten unter experimentellen Bedingungen den Anti–PLC–Antikörperverbrauch (IgG) durch Reduzierung der PLC–Bildung von C. perfringens nach Lactulosegabe reduzieren und die IgM–Antikörperproduktion dadurch ebenfalls verhindern. Dieses Ergebnis spiegelte sich auch im Blutplasma der Ferkel wider.

5.7.3 Gehalt an Anti–LPS–Antikörpern Endotoxine sind essentielle äußere Zellwandkomponenten von Gram–negativen Bakterien und werden zu den stärksten, die Immunabwehr stimulierenden biologischen Substanzen gezählt (KRÜGER et al. 2001). SEIDLER (1988) konnte nachweisen, dass unter Stress bei Schweinen gehäuft Bakterien aber auch Endotoxine aus dem MDT translozieren und in den Körper gelangen, wo sie abhängig vom Immunstatus des Wirtes Entzündungsreaktionen verursachen. ERBIL et al. (1999) haben den Effekt von Natrium–Deoxycholat, Lactulose und Glutamin auf bakterielle Translokationen bei Ratten, bei denen der Gallengang ligaturiert wurde, getestet. Die genannten Autoren haben festgestellt, dass Lactulose, Natrium–Deoxycholat und Glutamin bakterielle Translokationen in die mesenterialen Lymphknoten signifikant reduzierten. Lactulose und Natrium–Deoxycholat haben diesen Effekt durch die Reduktion von Keimzahlen im Darminhalt veranlasst. Obwohl beide Tiergruppen diesbezüglich in den ersten Milchproben keine signifikanten Unterschiede zeigten, haben wir einen signifikanten Unterschied (p <0,05) bei den IgG –anti – LPS (J5) Antikörpern in der Milch zehn Tage nach der Geburt festgestellt. Da keine signifikanten Differenzen zwischen den beiden Gruppen im unspezifischen Entzündungsparameter CRP bestanden, dürfte dieser höhere IgG–anti–LPS–Antikörperspiegel durch einen Minderverbrauch der Anti–LPS–Antikörper (IgG) induziert worden sein. Dieses spricht für eine geringere Anflutung von LPS in die systemische Zirkulation der Sauen. Bei Enterobakterien treten phänotypisch zwei Formen, S–(smooth) und R–(rough) LPS auf. Während S–Formen O–Antigen vollständig ausbilden, können R–Formen die O–Spezifischen Seitenketten entweder nicht oder nur teilweise ausbilden. Der Grund dafür sind Defekte an Genen, die speziell Phosphoryl– und Glykosyltransferasen kodieren (KLENA et al. 1992). Der Lactuloseeffekt scheint in einer Stabilisierung bzw. Verminderung der freien R–LPS–Konzentration im MDT zu liegen. Es ist auch

75

denkbar, dass die Translokations– und/oder Resorptionsrate von LPS aus dem Darmtrakt reduziert war. Das kann dadurch erklärt werden, dass diese höhere IgG–anti–LPS–Antikörperkonzentration mangels LPS langsamer verbraucht wurde als in der Kontrollgruppe. 5.8 Leistungsparameter Mehrere Autoren haben eine verlängerte Geburtsdauer als prädisponierende Ursache des MMA–Komplexes erwähnt (AWAD–MASELMEH et al. 1990). Die Trächtigkeitsdauer der Versuchssauen waren signifikant um 1,5 Tage kürzer als bei den Kontrollsauen. Im Versuch wurde der Tag, an dem die Geburt abgeschlossen wurde, als der Geburtstag festgestellt. Die Geburtsdauer konnte aus technischen Gründen nicht erfasst werden. Ob diese signifikante Merkmalsdifferenz auf einen erwünscht schnelleren Geburtsverlauf oder auf eine eher auftretende Eröffnungsphase zurückzuführen ist, sollte in nachfolgenden Versuchen geklärt werden. Der Masseverlust der Sauen während der Laktation war nach der Lactuloseapplikation durch höheren Futterverzehr um 2,6 kg geringer als bei den Kontrollsauen. Da dieser Parameter stark variiert, war die Stichprobe jedoch für eine signifikante Aussage zu klein. Wir konnten feststellen, dass die abgesetzten Versuchsferkel eine höhere Wurfmasse als die Ferkel der Kontrollsauen hatten. Die Erwartung, durch die Lactuloseapplikation während ihres letzten intensiven, intrauterinen Wachstumsschubes schwerere Ferkel zu erzeugen, erfüllte sich nicht. Das Ziel, die Zahl der tot geborenen Ferkel zu reduzieren, wurde ebenso nicht erreicht. Die mit Lactulose versorgten Ferkel nahmen in den ersten 10 Tagen nach dem Absetzen signifikant (13%) mehr zu als die Kontrollgruppe. Die tägliche Lebendmassezunahme der Versuchsferkel im Flatdeck übertraf die Ferkel der Kontrolltiere am 35. Aufzuchtstag signifikant um 15 g (4%). Die Ferkelverluste waren vor Versuchsbeginn ein wesentliches Problem des Ferkelerzeugers und damit Hauptmotor, dieses umfangreiche Vorhaben bei laufendem Praxisbetrieb durchzuhalten. Insgesamt verringerten sich diese mit dem definierten Lactulose–Einsatz um etwa 3%-Punkte. Der Erfolg betraf sowohl die Saug– als auch die Aufzuchtferkel.

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6 Schlussfolgerungen Der peripartale Zeitraum stellt für die Sauen eine hohe Belastung dar. Dazu gehören Umstallungsstress, Futterumstellung sowie Veränderungen hormoneller Kenngrößen. Die Tiere sind dadurch anfälliger für Erkrankungen. Zur Vermeidung von Leistungsverlusten und Erkrankungshäufigkeiten ist es notwendig, im peripartalen Zeitraum nach einem Behandlungsschema zu arbeiten. Die von uns im peripartalen Zeitraum bei Sauen und Ferkeln eingesetzte Lactulose führte zu positiven Effekten in beiden Gruppen. Unsere Untersuchungsergebnisse, besonders die signifikante Reduzierung der Trächtigkeitsdauer in der Versuchsgruppe, die Reduzierung der Verluste bei den Versuchsferkeln und deren signifikant höhere tägliche Zunahmen zeigen, dass Lactulose im peripartalen Zeitraum bei Sauen und deren Nachkommen einen gesundheitsfördernden Effekt hat. Aus unserer Sicht sollte unter Praxisbedingungen eine höhere tägliche Dosis an Lactulose appliziert werden, um weitere signifikante Unterschiede wie z.B. bei Leistungsparametern zu erzielen.

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7 Zusammenfassung Untersuchungen zur präbiotischen Wirkung von Lactulose auf die Mikroflora des Magen–Darm–Traktes von Sauen im peripartalen Zeitraum

Kemal Işık

Institut für Bakteriologie und Mykologie, Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig Leipzig, Mai, 2004 (96 Seiten, 19 Abbildungen, 12 Tabellen und 167 Referenzen) Schlüsselwörter: Lactulose, Puerperalstörungen, Schwein, Magen–Darm–Flora, Immunsystem Die Wirkung von Lactulose wurde an 71 Sauen in einer Langzeit–Feldstudie im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen, bestehend aus 68 Sauen, überprüft. Der Fütterungsversuch wurde als sogenanntes „Mutter–Kind–Konzept“ angelegt und in einer Schweineanlage von Mai bis September 2000 durchgeführt. In den Versuch wurden nur Sauen aufgenommen, die spätestens 11 Tage vor dem errechneten Geburtstermin keine, das Reproduktionsgeschehen absehbar beeinträchtigende Gesundheitsschäden aufwiesen. Jede Sau der Versuchsgruppe erhielt täglich 45 ml Lactulosesirup. Das Starterfutter der Versuchsferkel enthielt 15 ml Lactulose pro Kilogramm Futter. Kotproben wurden im Abstand von 10 Tagen, beginnend 10 Tage vor dem errechneten Geburtstermin entnommen und bakteriologisch und enzymologisch untersucht. Die bakteriologischen Untersuchungen umfassten die aerobe Gesamtkeimzahl, die aerobe Keimzahl Gram–negativer Bakterien, die Keimzahl von C. perfringens sowie die Keimzahl an Bdellovibrionen. Die enzymologischen Untersuchungen schlossen die Alkalische Phosphathase ein. Sauenmilch wurde im Abstand von 10 Tagen beginnend mit der Geburt gewonnen und immunologisch untersucht. C–reaktives Protein (CRP), IgG–, IgM–Anti–Phospholipase C–Antikörper (Clostridium perfringens) und der Gehalt an Anti–LPS–Antikörpern wurde bestimmt. Zootechnische Parameter der Ferkel wie die Anzahl lebend geborener Ferkel, Geburtsgewicht und Gewichtszunahme während der Säugezeit wurden ebenfalls erfasst.

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Aus den Untersuchungen der Kotproben auf aerobe Gesamtkeimzahl konnten signifikante (p=0,002) Unterschiede zu den Kontrollgruppen 20 Tage p.p festgestellt werden. Die Ergebnisse der aeroben Keimzahl Gram–negativer Bakterien waren um den zweiten Probenentnahmezeitpunkt (Geburtstermin) tendenziell unterschiedlich (p=0,077), jedoch nicht signifikant verschieden. 20 Tage p.p konnte festgestellt werden, dass die Keimzahl von C. perfringens in den Kontrollgruppen höher als in den Versuchsgruppen lag. Beide Gruppen erreichten ihren niedrigsten Wert in Bezug auf C. perfringens zum Geburtszeitpunkt, während dieses bei den aeroben Keimen (GKZ und KZg–) umgekehrt war. Es wurde kein Einfluss der Lactuloseapplikation auf Bdellovibrionen festgestellt. Es war auch kein Einfluss der Lactuloseapplikation auf den Parameter Alkalische Phosphathase–Aktivität im Kot erkennbar. Zu keinem Zeitpunkt der Probenentnahme war zwischen Kontroll– und Versuchsgruppen ein Unterschied festzustellen. Aus den Ergebnissen der immunologischen Untersuchungen in der Milch war ersichtlich, dass die CRP–Konzentrationen zu keinem Zeitpunkt zwischen Kontroll– und Versuchsgruppen deutlich verschieden waren. Lactulose hatte keinen Effekt auf den relativen Gehalt an IgG–anti Phospholipase C (C. perfringens) in der Milch, während bei den IgM–anti Phospholipase C (C. perfringens) Antikörpern am 10. Tag p.p ein leichter Abfall (p=0,970) bei den Versuchsgruppen im Vergleich zu den Kontrollgruppen ermittelt werden konnte. Ein signifikanter Unterschied (p<0,05) zwischen Kontroll– und Versuchsgruppen konnte im Gehalt an IgG–anti–LPS–Antikörpern 10 Tage p.p festgestellt wurden, während zur Geburt und 20 Tage p.p keine signifikanten Unterschiede erkennbar waren. Im Bezug auf die Leistungsparameter der Sauen war festzustellen, dass die Versuchssauen eine signifikant kürzere Trächtigkeitsdauer aufwiesen. Auf der Basis der Ferkelleistung nahmen die mit Lactulose versorgten Saugferkel signifikant (13%) mehr an Gewicht zu als die Kontrollgruppen. Die Ferkelverluste wurden um 2% in der Versuchsgruppe reduziert. Die täglichen Zunahmen der Absetzer bis zum 35. Lebenstag waren zum Vorteil der Versuchsgruppe signifikant verschieden (387 g vs. 375 g). Die Verluste bei den Absetzern konnten gegenüber der Kontrollgruppe um 1,6% reduziert werden. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Lactuloseapplikation im peripartalen Zeitraum bei Sauen und deren Ferkel die Aufzuchtleistung und die Ferkelleistungen stabilisieren. Die in den Untersuchungen verwendete Lactulosedosis von 45 ml/d erwies sich aber unter den Belastungsbedingungen der Praxis als zu gering und sollte auf 80 ml erhöht werden.

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8 Summary Investigations to the prebiotic effect of Lactulose on the microflora of the gastrointestinal tract of sows in the peripartal period

Kemal Işık Institute of Bacteriology and Mycology, Veterinary Faculty, University of Leipzig Submitted in May 2004 (96 pages, 19 figures, 12 tables and 167 references) Key Words: Lactulose, periparturient disease complex, pig, intestinal flora, immune system. The effect of Lactulose was investigated with 71 sows in a long-term study under field conditions compared to untreated control groups of 68 sows. The feeding test was designed as a so called “mother-child concept”. It was carried out in a pig farm from May to September 2000. Only sows without any signs of illness or other health defects, what might spoil the reproduction processes and which had been at least 11 days ante partum were selected for these investigations. Each trial sow received 45 ml of Lactulose syrup daily. The starter food of the experimental piglets contained 15 ml of Lactulose per kg of food. The faeces of the sows were collected every 10 days, started 10 days before the expected birth and were tested for bacteriological and enzymological parameters. Bacteriological examinations included the aerobe total bacterial counts, aerobe Gram-negative counts, the C. perfringens counts and Bdellovibrio counts. Enzymological examinations contained the alkaline phosphatase. The milk of the sows was immunologically tested every 10 days, started at the day of birth. C–-reactive protein (CRP), IgG–, IgM–anti phospholipase C. (Clostridium perfringens) antibodies and the content of anti LPS antibodies were examined. Performance parameters of the piglets like the number of live born piglets, birth weight and weight gain were also taken during the sucking period. The examination of the faeces with regard to the aerobe total bacterial counts have shown significant differences (p= 0.002) in comparison with the control groups at 20 d p.p.. The results of the aerobe Gram-negative counts were different at the 2nd time of taking the specimens at birth (p=0.077), however not significantly. It could be

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stated that the counts of C. perfringens were higher in the control groups than in the trial groups 20 d p.p.. Both groups reached their lowest value of C. perfringens at the time of birth, whereas the total bacterial counts and Gram–negative counts showed the highest value. No influence of the Lactulose application on Bdellovibrio was stated. It also was not possible to see an influence of the Lactulose application on the alkaline phosphatase activity in the faeces. No difference was stated between the control and trial groups at any time of taking the specimens. It had to be noticed from the results of the immunological examinations of the milk that the CRP concentration between the control and trial groups had not been clearly different at any time. Lactulose did not have any effect on the relative content of IgG–anti Phospholipase C (C. perfringens) in the milk. The IgM–anti Phospholipase C (C. perfringens) antibodies showed a light decrease (p=0.970) within the trial groups in comparison with the control groups at the 10 d. p.p.. A significant difference (p<0.05) between the control and trial groups could be established in the content of IgG–anti LPS antibodies at 10 d. p.p, whereas no significant differences were seen at the time of birth and at 20 d. p.p With regard to the performance parameters of the sows it was seen that the trial sows had a significantly shorter gestation period. Compared to the control groups the piglets of the trial groups which received Lactulose gained more weight which was significantly increased by 13%. The losses of piglets were reduced on 2% in the trial groups. The daily increase in weight of the weaning piglets until the 35 d was significantly different in the trial groups (387 g vs. 375 g). The losses of weaning piglets could be reduced on 1,6% compared to the trial groups. Our results show that the Lactulose application to sows and their piglets stabilize the performance of the sows and of the piglets in the peripartal period. The used dose of 45 ml/d for the sows for the examinations proved too low under stress conditions in practice and should be increased to 80 ml/d.

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Danksagung Mein besonderer und herzlicher Dank gilt Frau Prof. Dr. habil. M. Krüger für die Überlassung des Themas der vorliegenden Dissertation, die allzeit gewährte Unterstützung, die fachliche Betreuung und die Anregung bei der Anfertigung dieser Dissertation. Mein besonderer Dank gilt Frau L. Hagemann aus der Landesanstalt für Landwirtschaft, Dez. Schweine – Kleintiere – Tierhaltung, für die Bereitstellung der zootechnischen Parameter. Zu großem Dank bin ich Herrn Dr. med. vet. Wieland Schrödl für die Durchführung der immunologischen Untersuchungen verpflichtet. Weiterhin bedanke ich mich bei allen Mitarbeitern des Institutes für Bakteriologie und Mykologie der Veterinärmedizinischen Fakultät für die labortechnische Zusammen-arbeit.