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Aus dem Institut für Versuchstierkunde der Medizinischen Hochschule Hannover

Genetische Charakterisierung der LEW/Ztm-ci2 (circling2)

und der BH.7A/Ztm-ci3 (circling3) Ratte als Modelle

für Taubblindheit des Menschen (USH1)

bzw. Lateralisierung von Hirnfunktionen und Hyperlokomotion

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades eines

Doktors der Veterinärmedizin

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Wojciech Chwalisz

aus Kattowitz

Hannover 2003

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. H. J. Hedrich

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H. J. Hedrich

2. Gutacher: Univ.-Prof. Dr. O. Distl

Tag der mündlichen Prüfung: 24.11.2003

Gefördert durch ein Promotionsstipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft

(Graduiertenkolleg GK705)

Teile der vorliegenden Dissertation wurden bereits in folgender Originalarbeit

veröffentlicht:

Chwalisz, W. T., Koelsch, B. U., Kindler-Röhrborn, A., Hedrich, H. J. und Wedekind,

D. (2003):

The circling behavior of the deafblind LEW-ci2 rat is linked to a segment of RNO10

containing Myo15 and Kcnj12.

Mamm Genome 14, 620-627

Meiner Familie

Inhaltsverzeichnis

Seite

1. Einleitung 15

2. Literaturübersicht 18

2.1 Die LEW/Ztm-ci2 Rattenmutante 18

2.2 Die BH.7A/Ztm-ci3 Rattenmutante 22

2.2.1 Komplementationstest (cis-trans-Test) 24

2.3 Weitere Mutanten mit Rotationsverhalten und/oder 25

Innenohrdegeneration

2.3.1 Rattenmutanten 25

2.3.1.1 Die spinner-Rattenmutanten (spn) 25

2.3.1.2 Die jerker-Rattenmutante (je); 25

Synonym: stargazer-Rattenmutante (stg)

2.3.1.3 Die waltzing-Rattenmutante (2001) 26

2.3.2 Mausmutanten 27

2.3.2.1 Die shaker1-Mausmutanten (Myo7ash1) 27

2.3.2.2 Die shaker2-Mausmutanten (Myo15sh2) 28

2.3.2.3 Die Snell´s waltzer-Mausmutante (Myo6sv) 28

2.4 Potentielle Kandidatengene für den ci2- und ci3-Phänotypen 29

und damit verbundene Erkrankungen

2.4.1 Unkonventionelle Myosine: Funktionen und Mutationen 29

2.4.1.1 Das „Usher Syndrom“ 33

2.4.2 Kaliumeinzelkanäle und ihre Bedeutung für die Funktion des 34

Innenohres und der Netzhaut

2.4.3 Rezeptoren des dopaminergen Systems 36

2.5 Literatur zur Methodik 37

2.5.1 Mikrosatelliten 37

2.5.1.1 Kopplungskarten und Kopplungsanalyse 38

2.5.2 Neurophysilogische Verhaltensuntersuchung 39

3. Material und Methoden 40

3.1 Versuchstiere und Organentnahme 40

3.1.1 Versuchstiere 40

3.1.2 Organentnahme 42

3.2 Neurophysiologische Verhaltensuntersuchungen 42

3.2.1 Untersuchung des Rotationsverhaltens 43

3.2.2 Untersuchung des auditiven und vestibulären Systems der 44

(LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2 Ratten

3.2.2.1 Akustischer Stimulus 44

3.2.2.2 „Air-Righting”-Test 44

3.2.2.3 „Balance“-Test 45

3.2.2.4 Schwimmtest 45

3.2.3 Überprüfung der Sehfähigkeit der (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x 46

LEW/Ztm-ci2 Ratten

3.2.3.1 Verhalten der Tiere an einer sichtbaren Kante 46

(modifizierter „Visual-Cliff“-Test)

3.2.3.2 Hell-Dunkel-Transfer-Test 47

3.3 Molekularbiologische Untersuchungen 48

3.3.1 Isolierung von Desoxyribonukleinsäure (DNA) 48

3.3.2 Einstellen der DNA-Konzentration 49

3.3.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 50

3.3.4 Agarosegel-Elektrophorese 51

3.4 Mikrosatellitenmarker-gestützte Kopplungsanalyse 52

3.4.1 Auswahl geeigneter anonymer Mikrosatellitenmarker 53

3.4.2 Untersuchung der Mikrosatellitenmarker auf Polymorphismen 54

3.5 Computer- und Datenbank-gestützte genetische Analysen 55

3.5.1 Identifikation geeigneter funktioneller Kandidatengene 55

3.5.2 Identifikation geeigneter gengekoppelter Mikrosatelliten 56

3.5.3 Amplifikation der gengekoppelten Mikrosatelliten, Untersuchung 57

auf SSLPs und Genotypisierung der N2-Individuen

3.5.4 Virtueller Aufbau einer physikalischen Karte der nicht 58

rekombinanten Region (LEW-ci2)

3.5.5 Nachweis einzelner Exone eines Kanidatengens 59

im Genom der BH.7A/Ztm-ci3 Ratte

3.6 Statistische Auswertung 61

3.6.1 Statistische Auswertung der genetischen Befunde 61

3.6.2 Statistische Auswertung der Verhaltensuntersuchungen 62

3.7 Lösungen und Reagenzien 63

3.7.1 DNA Aufarbeitung 63

3.7.2 PCR 63

3.7.3 Elektrophorese 64

3.8 Geräte und Verbrauchsmaterialien 65

3.8.1 Geräte 65

3.8.2 Verbrauchsmaterialen 66

3.9 Statistik- und Genetik-Programme 66

3.10 World-Wide-Web Adressen 67

4. Ergebnisse 68

4.1 Neurophysiologische Verhaltensuntersuchungen 68

4.1.1 Untersuchung des Rotationsverhaltens 68

4.1.2 Untersuchung des auditiven und vestibulären Systems 69

der (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2 Ratten

4.1.2.1 Akustischer Stimulus 69

4.1.2.2 „Air-Righting”-Test 69

4.1.2.3 „Balance“-Test 69

4.1.2.4 Schwimmtest 70

4.1.3 Überprüfung der Sehfähigkeit der (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1x 71

LEW/Ztm-ci2 Ratten

4.1.3.1 Verhalten der Tiere an einer sichtbaren Kante 71


4.1.3.2 Hell-Dunkel-Transfer-Test 76

4.2 Mikrosatellitenmarker-gestützte Kopplungsanalyse 79

4.2.1 Anonyme Mikrosatellitenmarker und Assoziation 79

mit den Phänotypen

4.3 Computer- und Datenbank-gestützte genetische Analysen 82

4.3.1 Identifikation geeigneter funktioneller Kandidatengene 82

4.3.2 Identifikation geeigneter gengekoppelter Mikrosatelliten 83

4.3.3 Amplifikation der genassozierten Mikrosatelliten, Untersuchung 85

auf SSLPs und Genotypisierung der N2-Ratten

4.3.4 Virtueller Aufbau einer physikalischen Karte der nicht 91


4.3.5 Nachweis einzelner Exone eines Kanidatengens 93


5. Diskussion 97

5.1 Untersuchungen zum Phänotypen und zur Genetik 97

der LEW/Ztm-ci2 Rattenmutante

5.1.1 Neurophysiologische Verhaltensuntersuchungen 97

5.1.1.1 Untersuchungen des Rotationsverhaltens sowie des auditiven 98

und vestibulären Systems

5.1.1.2 Überprüfung der Sehfähigkeit der (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x 99

LEW/Ztm-ci2 Ratten

5.1.1.2.1 Verhalten der Tiere an einer sichtbaren Kante 100


5.1.1.2.2 Hell-Dunkel-Transfer-Test 101

5.1.1.2.3 Abschliessende Betrachtung der Tests zur Überprüfung der 102

Sehfähigkeit der (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x

LEW/Ztm-ci2 Ratten

5.1.2 Genetische Analysen zur LEW/Ztm-ci2 Rattenmutante 104

5.1.2.1 Mikrosatellitenmarker-gestützte Kopplungsanalyse 104

5.1.2.1.1 Anonyme Mikrosatellitenmarker und ihre Assoziation mit dem 104

ci2-Phänotypen

5.1.2.2 Computer- und Datenbank-gestützte genetische Analysen 106

5.1.2.2.1 Gengekoppelte Marker und ihre Assoziation mit 106

dem ci2-Phänotypen

5.1.2.2.2 Physikalische Karte der nicht rekombinanten Region 108

auf RNO10 (LEW-ci2)

5.2 Untersuchungen zum Phänotypen und zur Genetik 111

der BH.7A/Ztm-ci3 Ratte

5.2.1 Neurophysiologische Verhaltensuntersuchungen 111

5.2.1.1 Untersuchungen des Rotationsverhaltens 111

5.2.2 Genetische Analysen zur BH.7A/Ztm-ci3 Rattenmutante 112

5.2.2.1 Vorläufige Mikrosatellitenmarker-gestützte Kopplungsanalyse 112

5.2.2.1.1 Anonyme Marker und ihre Assoziation mit dem ci3-Phänotypen 112

5.2.2.2 Computer- und Datenbank-gestützte genetische Analysen 113

5.2.2.2.1 Gengekoppelte Marker und ihre Assoziation mit 113

dem ci3-Phänotypen

5.2.2.2.2 Nachweis einzelner Exone des Kandidatengens Drd3 115


5.3 Vergleich der LEW/Ztm-ci2 bzw. BH.7A/Ztm-ci3 Ratte mit 116

genetisch bedingten Erkrankungen des Menschen und

die Bedeutung beider Rattenmutanten als mögliche Tiermodelle

5.4 Abschließende vergleichende Betrachtung der LEW/Ztm-ci2 122

und BH.7A/Ztm-ci3 Ratte

5.5 Ausblick 123

6. Zusammenfassung – Summary 127

7. Literaturverzeichnis 133

8. Anhang 161

Abkürzungsverzeichnis

A Adenin

Abb. Abbildung

ALMS „Alstrom Syndrom”

ATP Adenosintriphosphat

Aqua dest. aqua destillata

BAC bacterial artificial chromosome

BBS „Bardet-Biedl Syndrom”

BH Black-hooded (Rattenstamm)

BLAST basic local alignment search tool

BN Brown Norway (Rattenstamm)

bp Basenpaare

bzw. beziehungsweise

C Cytosin

ca. circa

cd/m2 Candela pro Quadratmeter

cds/m2 Candelasekunden pro Quadratmeter

CH230 CHORI-230 (Rattenklone)

ci circling (Rattenmutanten)

cm Centimeter

cM centi-Morgan

CO2 Kohlendioxid

D Dopamin

DFG Deutsche Forschungsgemeinschaft

DNA deoxyribonucleic acid

dNTP 2`-Deoxynukleosidtriphosphat

DRD Dopamin-Rezeptor

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EEG Elektroencephalogramm

EP endocochleäres Potential

ERG Elektroretinogramm

et al. et alii (und andere)

f forward

FERM Four-point-one (4.1), Ezrin, Radixin, Moesin

G Guanin

HSA Bezeichnung für Chromosomen von Homo sapiens

je jerker (Maus- bzw. Rattenmutante)

K+ Kaliumionen

kb Kilobasenpaare

Kir Inwardly rectifying K+-channel

LEW Lewis (Rattenstamm)

LOD logarithm of the odds

mA Milliampere

Mb Megabasenpaare

min Minuten

mg Milligramm

ml Milliliter

mm Millimeter

mM millimolar

MMU Bezeichnung für Chromosomen von Mus musculus

MRT Magnetresonanztomograpie

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

µM mikromolar

N2 1. Rückkreuzungsgeneration

ng Nanogramm

nm Nanometer

p p(petit)-Arm eines Chromosoms = kurzer Arm eines

Chromosoms

PAC P1-bacteriophage artificial chromosome

PAR Paris (Rattenstamm)

PCR polymerase chain reaction

PET Positronemissionstomographie

q q-Arm eines Chromosoms = langer Arm eines

Chromosoms.

r reverse

RNO Bezeichnung für Chromosomen von Rattus

norvegicus

RPE Pigmentepithel der Netzhaut

s Sekunden

sh shaker (Mausmutante)

spn spinner (Rattenmutante)

SRS subretinaler Raum

SSLP simple sequence length polymorphism

SSR simple sequence repeats

stg stargazer (Rattenmutante); Synonym: je (jerker)

STR simple tandem repeats

sv Snell´s waltzer (Mausmutante)

T Thymin

U unit (internationale Einheit)

u. A. unter Anderem

USH „Usher Syndrom“

UV ultraviolett

vs. versus

w waltzing (Rattenmutante)

z.B. zum Beispiel

Ztm Haltersymbol des Zentralen Tierlaboratoriums der

Medizinischen Hochschule Hannover

15

1. Einleitung

Bei den LEW/Ztm-ci2 (circling2) und BH.7A/Ztm-ci3 (circling3) Ratten handelt es

sich um zwei Spontanmutanten, deren gemeinsames phänotypisches

Chrakteristikum ihr spontanes und lateralisiertes Rotationsverhalten ist.

Als Rotationsverhalten (synonym: Drehverhalten; „circling“) bezeichnet man eine

aktive, stereotype Bewegung um die eigene Körperachse (PYCOCK, 1980), wobei

diese Drehungen sowohl als enge Rotationen, als auch in Form von Rotationen auf

weiten Kreisen gezeigt werden können (KOSHIKAWA, 1994).

Die Phänotypen beider Rattenmutanten wurden bereits in mehreren Untersuchungen

gut charakterisiert (LÖSCHER et al., 1996; RICHTER et al., 1999; FEDROWITZ,

1999; FEDROWITZ et al., 2000; KAISER et al., 2001; LESSENICH et al., 2001;

LINDEMANN et al., 2001; LESSENICH, 2002). Festgestellt wurde, dass beide

Mutationen neben dem Drehverhalten auch Hyperaktivität verursachen. Zusätzlich

zeichnet sich die LEW/Ztm-ci2 Ratte durch Ataxie und einen Opisthotonus aus.

Untersuchungen zu den Basalganglien zeigten, dass sowohl bei der LEW/Ztm-ci2 als

auch bei der BH.7A/Ztm-ci3 Ratte eine neurochemische Lateralität im dopaminergen

System vorliegt, wobei die ci3-Mutation auch eine morphologische Lateralität

hinsichtlich dopaminerger Neurone verursacht. Darüber hinaus wurde nur bei der

LEW/Ztm-ci2 Mutante auch eine Innenohrdegeneration vom neurosensorischen Typ

festgestellt, die sowohl das cochleäre, als auch das vestibuläre System betrifft. Folge

dieser Degeneration ist eine profunde Taubheit und vestibuläre Fehlfunktion

betroffener Tiere. Rotationsverhalten als Folge solcher Veränderungen ist sowohl für

die Ratte als auch für die Maus beschrieben. Als Beispiele seien an dieser Stelle die

jerker-Rattenmutante (TRUETT et al., 1994) sowie die unter dem Sammelbegriff

shaker zusammengefassten Mausmutanten (DOBROVOLSKAIA-ZAVASDKAIA,

1928; LORD und GATES, 1929; ANDERSON et al., 2000) genannt.

Entsprechend den bisher festgestellten Befunden gilt die LEW/Ztm-ci2 Ratte

insbesondere als mögliches Modell für neurosensorische Taubheitsformen des

Menschen (KAISER et al., 2001), während die BH.7A/Ztm-ci3 Ratte bei der

16

Untersuchung von funktioneller Lateralität bestimmter Hirnfunktionen und der

Untersuchung hyperkinetischer Bewegungsstörungen hilfreich sein könnte

(LESSENICH et al., 2001).

Die Genetik beider Rattenmutanten wurde bisher mit Hilfe von klassischen

Kreuzungsanalysen untersucht. Festgestellt wurde, dass beide Mutationen

autosomal rezessiv vererbt werden (LÖSCHER et al., 1996; LESSENICH et al.,

2001).

Die bei der Verpaarung einer LEW/Ztm-ci2 mit einer BH.7A/Ztm-ci3 Ratte

(Komplementationstest) hervorgegangene Nachkommenschaft wies keinerlei

phänotypische Auffälligkeiten auf, woraus geschlossen wurde, dass die

verantwortlichen Mutationen unterschiedliche Gene betreffen müssen (LESSENICH

et al., 2001).

Hauptziel dieser Arbeit sollte eine genauere genetische Charakterisierung beider

Mutanten sein, um so weitere Aspekte der Tiere aufzudecken, die möglicherweise

auf Parallelitäten zu genetisch bedingten Erkrankungen des Menschen hinweisen.

Mit Hilfe einer genomweiten Kopplungsanalyse unter Einsatz anonymer

Mikrosatellitenmarker sollten die chromosomalen Lokalisationen beider Mutationen

identifiziert und anschließend die Suszeptibilitätsregionen feinkartiert werden. Als

Grundlage hierfür sollten zwei Rückkreuzungspopulationen (N2) dienen, die bereits

vor Beginn dieser Arbeit am Zentralen Tierlaboratorium der Medizinischen

Hochschule Hannover gezüchtet und phänotypisiert worden sind. Diese beiden

Populationen sollten zudem durch die Zucht neuer N2-Individuen erweitert werden.

Neugezüchtete N2-Individuen sollten mittels neurophysiologischer

Verhaltensuntersuchungen eindeutig phänotypisiert werden, um sie auf diese Weise

- als Vorraussetzung für die Kopplungsanalyse - in homozygote und heterozygote

Merkmalsträger einteilen zu können. Des Weiteren sollten neurophysiologische

Verhaltensuntersuchung auch eingesetzt werden, falls die Ergebnisse der

17

genetischen Untersuchungen Hinweise auf Veränderungen in weiteren

Organsystemen der beiden Mutanten liefern sollten, die bisher noch nicht untersucht

wurden.

Neben der Bestimmung der Lokalisation beider Mutationen sollten auch mögliche

funktionelle Kandidatengene für beide Phänotypen vorgestellt werden. Hierzu sollten

Vergleiche der zu ermittelnden Suszeptibilitätsregionen mit dem Genom des

Menschen und der Maus vorgenommen werden („comparative mapping“).

Gene, die aufgrund ihrer Funktion oder bereits beschriebener Mutationen als

Kandidaten in Frage kamen, sollten auf ihre Assoziation mit dem ci2- bzw. ci3-

Phänotypen geprüft werden. Hierzu sollten unter anderem Mikrosatelliten identifiziert

werden, die an solche Gene gekoppelt sind.

18

2. Literaturübersicht

2.1 Die LEW/Ztm-ci2 Rattenmutante

Die ci2-Mutation trat 1991 spontan in der 96. Filialgeneration des LEW/Han-

Inzuchtstamms des Zentralinstituts für Versuchstierzucht der DFG in Hannover auf.

Als auffälligstes Charakteristikum betroffener Tiere wurde eine Bewegungsstörung in

Form eines Rotationsverhaltens festgestellt. Entsprechend wurde diese Mutation mit

dem Symbol „ci“ für „circling“ (Rotationsverhalten) belegt. Der Zusatz „2“ war nötig,

weil bereits 1986 in demselben Inzuchtstamm eine drehende Rattenmutante

aufgetreten war (DEERBERG et al., 1989), die als „ci1“ benannt, aber nicht näher

charakterisiert wurde. Ein Vergleich zwischen beiden Mutanten war nicht mehr

möglich, da es nicht gelang kryokonservierte Embryonen, die homozygote Träger der

ci1-Mutation waren, zu revitalisieren.

Es konnte ein als LEW-ci2 bezeichneter coisogener Stamm etabliert werden, der seit

1993 am Zentralen Tierlaboratorium der Medizinischen Hochschule Hannover (Ztm)

weitergezüchtet wird, indem homozygote mit heterozygoten Merkmalsträgern

verpaart werden (segregierende Inzucht).

Die Vererbung der Mutation erfolgt autosomal rezessiv. Neben dem Drehverhalten

sind bereits im Absatzalter weitere motorische Anomalien, wie ein Opisthotonus (ab

dem 18. bis 20. Lebenstag), also ein Überstrecken des Kopfes nach caudo-dorsal,

welches auch als „stargazing“ bezeichnet wird, Ataxie und Hyperaktivität zu

beobachten. Das intensive spontane Drehverhalten, das in Form von engen „nose-

to-tail“ Rotationen salvenartig ausgeführt wird, ist ab der 3. bis 4. Lebenswoche zu

beobachten und wird durch Stressfaktoren, wie das Verbringen der Tiere in eine

neue Umgebung (z.B. Fremdkäfig), noch verstärkt (LÖSCHER et al., 1996).

Heterozygote Merkmalsträger zeigen kein Rotationsverhalten oder sonstige

Verhaltensauffälligkeiten. Aufgrund des Rotationsverhaltens und der insgesamt

gesteigerten Bewegungsaktivität zeichnen sich betroffene Ratten durch geringere

Gewichtszunahmen im Vergleich zu heterozygoten Geschwistertieren aus, wobei

ihre Vitalität jedoch nicht beeinträchtigt ist (LÖSCHER et al., 1996;

19

FEDROWITZ, 1999).

Untersuchungen zum Drehverhalten haben gezeigt, dass ein Großteil der

betroffenen Ratten eine eindeutige Richtungspräferenz aufweist und es sich somit

um ein lateralisiertes Rotationsverhalten handelt. Ebenso wurde die Motorik der

Vorderextremitäten überprüft, wobei sich eine ausgeprägte einseitige Defizienz der

Vorderextremität contralateral zur spontanen Drehpräferenz feststellen ließ

(LÖSCHER et al., 1996).

Weiterhin weist die LEW-ci2 Ratte Ähnlichkeiten im Phänotyp zum induzierten

Ungerstedt-Modell auf. Dieses wird häufig als geeignetes Tiermodell für den Morbus

Parkinson, der häufigsten Basalganglienerkrankung des Menschen, angesehen. Die

Basalganglien stellen eine Gruppe komplex untereinander verschalteter

Gehirnregionen dar, denen eine wichtige Bedeutung bei der Kontrolle der Motorik

zukommt (GRAYBIEL, 1990). Im Ungerstedt-Modell zeigten nach unilateraler

Injektion des Neurotoxins 6-Hydroxydopamin, welches eine selektive Zerstörung

dopaminerger und noradrenerger Neurone bewirkt (UNGERSTEDT, 1968), in

Strukturen der Basalganglien (Substantia nigra, pars compacta) entsprechend

behandelte Ratten spontane Rotationen zur Seite mit der geringeren dopaminergen

Aktivität (HASHITANI et al., 1998). Die Gabe von Amphetamin (Freisetzung von

Dopamin aus den präsynaptischen Nervenendigungen; GLICK und COX, 1976)

verstärkte das Rotationsverhalten (CLAUSING et al., 1996), während eine Injektion

von Apomorphin (Dopamin-Rezeptor Agonist) eine Umkehrung der Drehpräferenz

bewirkte (HUDSON et al., 1993).

Entsprechend wurden in pharmakologischen Testreihen den LEW-ci2 Ratten

Amphetamin und Apomorphin in verschiedenen Dosen appliziert. Nachdem eine

Injektion von Amphetamin eine signifikante Erhöhung der Rotationsrate bei den

Tieren bewirkte, wurde dieses Ergebnis auf eine Imbalanz des dopaminergen

Systems zurückgeführt (LÖSCHER et al., 1996), da durch die Wirkung des

Amphetamins eine bestehende Ungleichheit im Dopamingehalt verstärkt würde.

Apomorphin wurde sowohl in einer Dosierung, welche nur die präsynaptischen

Dopamin D2-Rezeptoren erregt, als auch in einer höheren Dosis, die auf prä- und auf

postsynaptische Rezeptoren stimulierend wirkt, injiziert. In beiden Fällen kam es zu

20

einer Abnahme spontaner Rotationen bei den LEW-ci2 Ratten. Diese Ergebnisse

wurde dahingehend interpretiert, dass bei reiner Erregung der präsynaptischen

Dopamin D2-Rezeptoren, welche einen Überschuss an freiem Dopamin im

synaptischen Spalt signalisiert, die Freisetzung dieses Transmitters reduziert wurde

und somit auch die Rotationszahl abnahm. Aus der Tatsache, dass die Erregung der

postsynaptischen Dopamin-Rezeptoren die Rotationsrate ebenfalls verminderte,

wurde gefolgert, dass keine einseitige Hypersensitivität von Dopamin-Rezeptoren

vorliegt (LÖSCHER et al., 1996).

Neurochemische Untersuchungen, bei denen Homogenate von Bereichen der

Basalganglien (u. A. Striatum) hergestellt und der Dopamingehalt bestimmt wurde,

zeigten, dass LEW-ci2 Ratten mit ausgeprägter Seitenpräferenz im

Rotationsverhalten im Striatum der Hemisphärenseite, zu der ihre Rotationspräferenz

ausgebildet war, eine signifikant geringere Konzentrationen an Dopamin und seinen

Metaboliten aufwiesen (LÖSCHER et al., 1996).

Trotz dieser pharmakologischen und neurochemischen Gemeinsamkeiten mit dem

Ungerstedt-Modell, konnte die Annahme, dass die LEW-ci2 Ratte das erste

genetische Tiermodell für Morbus Parkinson darstellt, nicht bestätigt werden.

Immunhistochemische Studien zeigten, dass im Gegensatz zu der Parkinsonschen

Erkrankung die Anzahl dopaminerger Neurone und die Dichte der dopaminergen

Terminalen im Bereich der Basalganglien keine bilaterale Asymmetrie aufwiesen.

Auch der Vergleich zu LEW/Ztm Kontrollratten erbrachte keine signifikanten

Unterschiede (RICHTER et al., 1999). Des Weiteren wiesen die Rattenmutanten eine

Hyperlokomotion und stereotype Kopfbewegungen auf, so dass daraus die

Schlussfolgerung getroffen wurde, dass sie als Modell für hyperkinetische

Bewegungsstörungen geeignet sein könnten (RICHTER et al., 1999; FEDROWITZ et

al., 2000), während der Morbus Parkinson, eine hypokinetische Bewegungsstörung

darstellt.

Es ist bekannt, dass neben Innnenohrinfektionen auch hereditäre Erkrankungen des

Innnenohres häufig Rotationsverhalten bei Ratten und Mäusen durch

Beeinträchtigung des vestibulären Apparats auslösen können (Kapitel 2.3). Nachdem

eine Infektion des Innenohres bei betroffenen LEW-ci2 Ratten ausgeschlossen

21

werden konnte, wurden das vestibuläre und auch das cochleäre System der Tiere

funktionell und histologisch auf pathologische Abweichungen untersucht.

Die Ableitung auditorisch evozierter Potentiale zeigte einen signifikanten Unterschied

zu Kontrolltieren, der für eine vollständige Taubheit der Mutante spricht. Bei

histologischen Untersuchungen der Cochlea konnte ein nahezu vollständiger Verlust

des sensorischen Epithels (Haarzellen) festgestellt werden. Ebenso wurden

Degenerationen der Zellen der cochleären Kerngebiete im Hirnstamm nachgewiesen

(KAISER et al., 2001).

Die Funktionsfähigkeit des vestibulären Systems wurde anhand eines Schwimmtests

(PORSOLT et al. , 1978) sowie weiterer neurophysiologischer

Verhaltensuntersuchungen („Air-Righting“-Test: OSSENKOPP et al., 1990;

RABBATH et al., 2001; „Tail-Hanging“-Test: HUNT et al., 1987; RABBATH et al.,

2001) analysiert. Auch hier wurden Fehlfunktionen bei der LEW-ci2 Ratte festgestellt,

die sich in der Unfähigkeit zu schwimmen (korkenzieherförmiges Abtauchen) sowie

Defiziten beim „Air-Righting“- und „Tail-Hanging“-Test ausdrückten (KAISER et al.,

2001; LESSENICH, 2002). Diese Befunde deckten sich mit den Ergebnissen der

histologischen Untersuchungen des vestibulären Apparates und seiner Kerngebiete.

Es zeigte sich zwar bei adulten LEW-ci2 Ratten kein Verlust der vestibulären

Haarzellen, jedoch wiesen diese kleine Protrusionen des Cytoplasmas in den

endolymphatischen Raum auf, aus denen auf Veränderungen des Cytoskelettes der

Haarzellen geschlossen wurde. Da bei jungen LEW-ci2 Ratten (ca. vier Wochen alt)

jedoch auch ein Verlust vestibulärer Haarzellen zu beobachten war, wurde eine

Regeneration der vestibulären Haarzellen während der späteren Entwicklung

angenommen. Die vestibulären Kerngebiete wiesen ebenfalls signifikante

Abweichungen hinsichtlich Volumen und Neuronendichte auf (KAISER et al., 2001).

Die LEW-ci2 Ratten wurde darüber hinaus auf die Möglichkeit untersucht, ob ihr

Rotationsverhalten im Zusammenhang mit epileptischen Anfällen stehen könnte, da

beim Menschen eine Form der Epilepsie beschrieben ist, die mit Rotationen um die

eigene Körperlängsachse einher geht (GASTAUT et al., 1986). Im Vergleich zu

nachweislich epileptischen WAG/Rij Ratten („petit Mal“-Anfälle) konnten bei den

LEW-ci2 Ratten keine epileptiformen Anomalien während der durchgeführten

22

Elektroencephalogramm (EEG)-Untersuchungen festgestellt werden (LINDEMANN

et al., 2001).

Aufgrund der bisher festgestellten Befunde gilt folglich die LEW/Ztm-ci2 Ratte somit

als potentielles Modell für neurosensorische Taubheitsformen des Menschen

(KAISER et al., 2001).

2.2 Die BH.7A/Ztm-ci3 Rattenmutante

Die ci3-Mutation trat im Jahre 1997 spontan am Zentralen Tierlaboratorium der

Medizinischen Hochschule Hannover (Ztm) in dem Inzuchtstamm BH.7A(LEW)/Won

auf. Der BH.7A-Stamm ist ein zum BH-Stamm congener Rattenstamm, der das a-

Allel des Gens Ptprc (Protein Tyrosin Phosphatase Rezeptor Typ c; Synonym: Cd45,

Lca, RT7) exprimiert. Das von dem LEW/Ztm-Inzuchtstamm stammende Allel wurde

durch Verdrängungskreuzung innerhalb von 12 Rückkreuzungsgenerationen auf

BH/Ztm-Ratten übertragen (HEDRICH, 1990). Die Mutation, die autosomal rezessiv

vererbt wird (LESSENICH et al., 2001) wurde mit dem Symbol „ci3“ belegt, da sich

auch hier betroffene Tiere durch Rotationsverhalten auszeichnen.

Es konnte ein als BH.7A-ci3 bezeichneter coisogener Stamm etabliert werden, der

am Zentralen Tierlaboratorium der Medizinischen Hochschule Hannover

weitergezüchtet wird, indem homozygote Merkmalsträger miteinander verpaart

werden.

Neben dem Rotationsverhalten konnte eine deutliche Hyperaktivität der Tiere

festgestellt werden (LESSENICH et al., 2001). Zu erkennen sind diese Auffälligkeiten

bei betroffenen Tieren bereits im Absatzalter.

Untersucht wurde bei diesem Stamm durch LESSENICH et al. (2001) insbesondere

das Rotationsverhalten, die Basalganglien sowie die Funktionsfähigkeit des

Innenohres und die histologische Struktur der dazugehörigen Kerngebiete im

Hirnstamm.

Festgestellt wurde, dass das Rotationsverhalten, welches wie bei der LEW-ci2 Ratte

in Form von engen „nose-to-tail“ Rotationen salvenartig ausgeführt wird, sowohl

23

spontan, als auch unter Stress (Fremdkäfig; „Open Field“-Apparatur) auftritt. Ein

überwiegender Teil der untersuchten Tiere zeigte eine Richtungspräferenz

(lateralisiertes Rotationsverhalten).

Durch Applikation von Amphetamin konnte die Hyperaktivität jedoch nicht das

Rotationsverhalten verstärkt werden.

Die Basalganglien wurden neurochemischen Untersuchungen - bei denen

Homogenate von Bereichen der Basalganglien (u. A. Striatum) hergestellt und der

Dopamingehalt bestimmt wurde - und histologischen Studien unterzogen. Die

neurochemischen Untersuchungen zeigten, dass BH.7A-ci3 Ratten mit ausgeprägter

Seitenpräferenz im Rotationsverhalten im Striatum der Hemisphärenseite, zu der ihre

Rotationspräferenz ausgebildet war, eine signifikant höhere Konzentrationen an

Dopamin und seinen Metaboliten aufwiesen. Durch histologische Untersuchungen

der Basalganglien konnte nachgewiesen werden, dass in einem fokussierten Bereich

dieser Strukturen eine signifikante Lateralität in der Dichte dopaminerger Neurone

vorlag. Die Zelldichte war auf der Hemisphärenseite erhöht, zu der die BH.7A/Ztm-

ci3 Ratten ihre Rotationspräferenz zeigten (LESSENICH et al., 2001).

Bei histologischen Untersuchungen der cochleären und vestibulären Kerngebiete im

Hirnstamm konnten keine Veränderungen festgestellt werden. Die Ableitung

auditorisch evozierter Potentiale zeigte keinen Unterschied zu Kontrolltieren des

Hintergrundstamms, was für eine physiologische Funktionsfähigkeit des auditiven

Systems bei den BH.7A-ci3 Ratten spricht. Zur Überprüfung des vestibulären

Systems wurde zunächst ein Schwimmtest (PORSOLT et al., 1978) durchgeführt.

Hierbei zeigte sich, wie bei den Kontrolltieren des Hintergrundstamms die bei Ratten

natürlich ausgeprägte Fähigkeit zu schwimmen. Auch die durchgeführten „Air-

Righting“- (OSSENKOPP et al., 1990; RABBATH et al., 2001) und „Tail-Hanging“-

(HUNT et al., 1987; RABBATH et al., 2001) Tests wiesen nicht auf Fehlfunktionen

des vestibulären Systems hin.

LESSENICH et al. (2001) schlossen aus den Ergebnissen dieser Untersuchungen,

dass es sich bei der BH.7A-ci3 um die ihres Wissens nach erste beschriebene

Rattenmutante mit Rotationsverhalten, aber funktionsfähigem cochleärem und

vestibulärem System handelt und führten die festgestellten phänotypischen

24

Abweichungen auf die lateralisierten Abnormitäten im Bereich der Basalganglien

zurück.

2.2.1 Komplementationstest (cis-trans-Test)

Aufgrund der phänotypischen Gemeinsamkeiten der LEW-ci2 und der BH.7A-ci3

Ratte wurden homozygote Merkmalsträger beider Stämme miteinander verpaart.

Hierbei konnten bei keinem der Individuen der Nachkommenschaft phänotypische

Auffälligkeiten beobachtet werden (LESSENICH et al., 2001). Daraus wurde

geschlossen, dass die verantwortlichen Mutationen unterschiedliche Gene betreffen

müssen.

2.3 Weitere Mutanten mit Rotationsverhalten und/oder

Innenohrdegenerationen

Beschreibungen von Ratten- und Mausmutanten mit Rotatationsverhalten bzw.

Bewegungsstörungen reichen bis in die erste Hälfte des 20. Jahrhunderts zurück,

wobei in den meisten Fällen Veränderungen im Bereich des Innenohres beschrieben

werden. Entsprechend werden diese Mutanten als Tiermodelle für hereditäre

Erkrankungen des Innenohres des Menschen gehandelt. Nachfolgend ist eine

Auswahl an Mutanten mit Rotationsverhalten und/oder Innenohrdegenerationen

aufgeführt.

25

2.3.1 Rattenmutanten

2.3.1.1 Die spinner-Rattenmutanten (spn)

Bereits im Jahr 1973 wurden zwei Rattenmutanten mit Rotationsverhalten

beschrieben.

Die spinner-1 (spn-1)-Mutante trat im B/1N-Stamm spontan auf und weist einen

autosomal rezessiven Erbgang auf. Homozygote Tiere haben den Hang, in

Uhrzeigerrichtung zu drehen. Zudem wird ein leichter Hydrocephalus beobachtet

(HANSEN, 1973; HEDRICH, 1990).

Auch die spinner-2 (spn-2)-Mutante trat spontan auf, und zwar im N:SDN

Auszuchtstamm. Phänotypisch ist diese Mutante der spn-1-Mutante ähnlich. Ein

Komplementationstest wies allerdings auf zwei unabhängige Mutationen hin

(HANSEN, 1973; HEDRICH, 1990).

2.3.1.2 Die jerker-Rattenmutante (je);

Synonym: stargazer-Rattenmutante (stg)

Die 1994 von TRUETT et al. beschriebene und ursprünglich als stargazer (stg)

bezeichnete Mutation wurde in einer Kolonie von Zucker-Ratten (Crl:ZUC-Leprfa)

entdeckt und wird autosomal rezessiv vererbt. Betroffene Tiere zeichnen sich ab der

3. Lebenswoche unter anderem durch einen Opisthotonus („stargazing“),

Hyperaktivität, Rückwärtsbewegungen und Rotationsverhalten aus und weisen somit

einen der LEW-ci2 Ratte sehr ähnlichen Phänotypen auf. Mit Hilfe der Ableitung

auditorisch evozierter Potentiale und eines Schwimmtests wurde eine vestibuläre

Fehlfunktion und profunde Taubheit nachgewiesen. Histologische Untersuchungen

zeigten eine progressive Degeneration der Zellen des akustischen Ganglions und der

Haarzellen (TRUETT et al., 1994). Das Reaktionsmuster der Mutante sowie

gesunder Kontrollen auf Stimulation und Inhibition der Dopamin D2-/D3-Rezeptoren

mittels der Applikation von Quinpirol und Haloperidol wies auf eine verringerte

26

Sensitivität dieser Rezeptoren hin, so dass weiterhin auf eine Fehlfunktion des

zentralen dopaminergen Systems geschlossen wurde (BROCK und ASHBY, 1996).

Durch genetische Untersuchungen mittels Mikrosatellitenmarkern konnte die

Mutation im distalen Bereich von Chromosom 5 der Ratte (RNO5) kartiert werden.

Dieser Bereich weist große Homologien zu einem Segment von Chromosom 4 der

Maus (MMU4) auf, auf dem das verantwortliche Gen für die jerker-Mausmutante (je)

(DEOL, 1954; STEEL und BOCK, 1983) lokalisert ist. Es wurde vermutet, dass eine

Mutation in dem homologen Gen der Ratte für den Phänotyp der stargazer-Mutante

verantwortlich ist und vorgeschlagen die Mutation von stargazer (stg) in jerker (je)

umzubenennen (TRUETT et al., 1996).

2.3.1.3 Die walzing-Rattenmutante (2001)

Im Jahre 2001 wurde von RABBATH et al. in einem nicht näher definierten

Rattenstamm der Universität Pavia eine neue waltzing-Mutante beschrieben. Diese

Mutante steht aller Wahrscheinlichkeit nach in keinem Zusammenhang mit der

ursprünglich von KING (1936) beschriebenen waltzing-Rattenmutante (w). Die neue

Mutante zeichnet sich durch Rotationsverhalten, sowie vestibuläre Fehlfunktionen in

der Haltung (Kopfhaltung nach abwärts) und Blick (Defizit des horizontalen vestibulo-

oculären Reflexes) aus. Da bei histologischen Untersuchungen das vestibuläre

Epithel (Haarzellen) keine Veränderungen aufwies, wurde in diesem Fall

angenommen, dass das Rotationsverhalten in Verbindung zu einer Fehlfunktion in

der Transduktion oder der Prozessierung von Signalen im vestibulären System

stehen könnte.

27

2.3.2 Mausmutanten

2.3.2.1 Die shaker1 – Mausmutanten (Myo7ash1)

Die shaker1-Mausmutanten zeichnen sich durch Hyperaktivität, stereotype

Kopfbewegungen und Rotationsverhalten vestibulären Ursprungs aus.

Histopathologisch zeigen sich typische cochleäre und vestibuläre Defekte vom

neuroepithelialen Typ (LORD und GATES, 1929; DEOL, 1956; KIKUCHI und

HILDING, 1965; STEEL und BOCK, 1983; RICHARDSON et al., 1997; SELF et al.,

1998; RICHARDSON et al., 1999). Die ursprüngliche sh1-Mutation entstand auf dem

genetischen Hintergrund des Mäuseinzuchtstamms BALB/c (LORD und GATES,

1929). Bei der Myo7ash1-6J-Mutation handelt es sich um eine spontane Remutation in

dem Stamm C57BLKS/J-m Leprdb (LETTS et al., 1994). In beiden Fällen geht man

von einer Punktmutation in Myo7a (MMU7) aus, die zu einer Veränderung in der

Motordomäne von Myosin VIIa führt (Kapitel 2.4.1).

Myo7as h 1 - 8 J (genetischer Hintergrund: B6;SJL-TgN(c177-lacZ)226Bri) und

Myo7ash1-9J (genetischer Hintergrund: C3.MRL-Tnfrsf6lpr) stellen zwei weitere

spontane Remutationen dar (Jackson Laboratories Mouse Genome Informatics

(MGI), www.informatics.jax.org).

Daneben existiert eine Reihe von chemisch induzierten shaker1-Mausmutanten

(Myo7a26SB, Myo7a3336SB, Myo7a4494SB, Myo7a4626SB, Myo7a816SB, Myo7ash1-1R)

basierend auf dem Stamm BALB/cR1 (Ausnahme: Myo7ash1-1R; nicht näher

charakterisierter genetischer Hintergrund) (RINCHIK et al., 1990; MGI,

www.informatics.jax.org). Betroffen sollen wiederum die Motordomäne (Myo7a4494SB,

Myo7a4626SB, Myo7a816SB) bzw. die Schwanzregion (Kapitel 2.4.1) sein (MGI,

www.informatics.jax.org).

Die Mutationen im Myo7a Gen führen vor allem zu Veränderungen des sensorischen

Neuroepithels des Innenohres (Desorganisation der Stereozilienbündel der

Haarzellen) (GIBSON et al., 1995; SELF et al., 1998).

Ebenso zeigten Untersuchungen zur Netzhaut der shaker1-Mäuse Abweichungen.

Bei Elektroretinographie-(ERG)-Messungen wurde eine verminderte

28

Photorezeptorantwort festgestellt (LIBBY und STEEL, 2001). GIBBS et al.

beschreiben (2003) eine Störung in der Phagozytose der von den Photorezeptoren

abgegebenen äußeren Segmente durch die Zellen des retinalen Pigmentepithels und

schlossen daraus auf eine verminderte Lebensfähigkeit der Photorezeptoren.

2.3.2.2 Die shaker2 – Mausmutanten (Myo15sh2)

Den shaker2-Mausmutanten sind ebenfalls profunde Taubheit und vestibuläre

Fehlfunktion, die zu Rotationsverhalten führt, eigen (PROBST et al., 1998; WANG et

al., 1998; ANDERSON et al., 2000).

Shaker2-(Myo15sh2) wurde bereits 1928 in der Nachkommenschaft einer mit

Röntgenstrahlung behandelten Maus entdeckt (DOBROVOLSKAIA-ZAVASDKAIA,

1928). Bei dieser Mausmutante konnte eine Punktmutation in Exon 18 des Myo15

Gens, welches auf MMU11 lokalisiert ist, nachgewiesen werden. Dieses Exon kodiert

für einen Bereich der Motordomäne des Proteins (Kapitel 2.4.1). Bei histologischen

Untersuchungen des Innenohres wurde vor allem eine starke Verkürzung der

Stereozilien der Haarzellen festgestellt (PROBST et al., 1998).

Auch Myo15sh2J resultiert aus einer Spontanmutation in Myo15. Sie entstand auf dem

genetischen Hintergrund des spontan diabetischen Stamms C57BLKS/J-m Leprdb

(MGI, www.informatics.jax.org). In diesem Fall wurde eine Deletion in den Exonen

nachgewiesen, die für die FERM (Four-point-one (4.1), Ezrin, Radixin, Moesin)-

Domäne (Kapitel 2.4.1) kodieren. Wiederum sind die Haarzellen des Innenohres

durch stark verkürzte Stereozilien gekennzeichnet (ANDERSON, et al., 2000).

2.3.2.3 Die Snell´s waltzer – Mausmutante (Myo6sv)

Die Snell´s waltzer-(Myo6sv)-Spontanmutation wurde erstmals von DEOL und

GREEN (1966) beschrieben. Die Mutation betrifft das Myo6 Gen, das auf MMU9

lokalisiert ist. Homozygote Individuen weisen Rotationsverhalten, stereotype

29

Kopfbewegungen und Hyperaktivität auf.

Nahezu das gesamte Neuroepithel des Innenohres ist bei dieser Mausmutante

betroffen. Ab dem dritten Lebenstag erscheinen die Haarzellen desorganisiert, wobei

es zu einer Fusionierung ihrer Stereozilien kommt. Funktionelle Untersuchungen

weisen auf eine Taubheit dieser Tiere ab dem 20. bis 30. Lebenstag hin (AVRAHAM

et al., 1997; SELF et al., 1999; MELCHIONDA et al., 2001).

2.4 Potentielle Kandidatengene für den ci2- und ci3-Phänotypen und

damit verbundene Erkrankungen

Im Verlauf der Untersuchungen der vorliegenden Arbeit zur Genetik der LEW-ci2 und

BH.7A-ci3 Rattenmutante verdichteten sich die Hinweise auf eine mögliche

Beteiligung der Gene Myo15 (Myosin XV) und Kcnj12 (Kir2.2) am ci2-Phänotypen

bzw. Drd3 (Dopamin D3-Rezeptor) am ci3-Phänotypen. Entsprechend soll

nachfolgend auf diese Gene bzw. Genfamilien sowie auf das „Usher Syndrom“, eine

Erkrankung des Menschen, welche unter Anderem durch eine Mutation in MYO7A

(Myosin VIIa) hervorgerufen wird, eingegangen werden.

2.4.1 Unkonventionelle Myosine: Funktionen und Mutationen

Zu den über 40 bislang identifizierten Genen, die in Zusammenhang mit

syndromartiger und nicht syndromartiger Taubheit beim Menschen stehen (CALL

und MORTON, 2002), gehört auch eine Reihe von Genen, die für unkonventionelle

Myosine kodieren.

Die Familie der unkonventionellen Myosine besteht aus über einem Dutzend

strukturell unterschiedlicher Klassen. Sie wurden in verschiedenen Geweben und

Zelltypen nachgewiesen, darunter Neurone und sensorische Zellen (HASSON und

MOOSEKER, 1997). Unkonventionellen Myosine sind funktionell an

Endozytosevorgängen, Zellmigration und sensorischer Transduktion beteiligt (WU et

30

al., 2000). Myosine stellen im Zusammenspiel mit Aktinfilamenten unter Verbrauch

von Adenosintriphosphat (ATP) molekulare Motoren dar, die verschiedene Prozesse

regulieren, wie die dynamische Neuanordnung des Aktinzytoskeletts, die Spannung

der Aktinfilamente und den Transport von Organellen (MERMALL et al., 1998).

Sämtliche Myosine besitzen eine identische Grundstruktur. Die Motordomäne bindet

ATP und Aktinfilamente. An sie schließt sich eine flexible Nackenregion an, gefolgt

von einer schwanzförmigen Struktur, die bei den einzelnen Klassen unterschiedlich

aufgebaut ist (MOOSEKER und CHENEY, 1995).

Im Bereich des Innenohres sind verschiedene unkonventionelle Myosine

nachgewiesen worden. Sie sind dort unter anderem Bestandteil der Stereozilien, die

aktinreiche Strukturen repräsentieren. Diese Strukturen werden von dem

sensorischen Epithel des Innenohres, den Haarzellen, benutzt, um akustische

Signale und Bewegungen im Raum zu erfassen (HASSON et al., 1997; FRIEDMAN

et al., 1999; REDOWICZ, 1999). Myosin VIIa wurde auch in aktinreichen Strukturen

der Netzhaut des Menschen und der Maus nachgewiesen (HASSON et al., 1995; LIU

et al., 1997).

Mutationen in vier Genen, die für die unkonventionellen Myosine VI, VIIa, IX und XV

kodieren, führen beim Menschen und/oder der Maus zu Taubheit und vestibulärer

Funktionsstörung. Zusätzlich verursacht eine Mutation in MYO7A des Menschen eine

progressive Degeneration der Netzhaut.

Bei der Snell’s waltzer-Maus liegt eine Mutation im Myo6 Gen vor, die zu einer

Fusion der Stereozilien führt (AVRAHAM et al., 1995). Die propagierte Funktion von

Myosin VI ist die Aufrechterhaltung der Spannung innerhalb der Aktinbündel der

Stereozilien, um so deren Integrität aufrecht zu erhalten (CRAMER, 2000), was die

Veränderungen bei dieser Mausmutante erklären würde. Des weiteren soll dieses

Protein die Zellmembran mit dem Aktinzytoskelett verbinden (SELF et al., 1999).

Beim Menschen ist eine Mutation in MYO6 verantwortlich für eine nicht

syndromartige, dominant vererbte Taubheitsform (DFNA22) (MELCHIONDA et al.,

2001). Das Gen ist auf Chromosom 6 des Menschen (HSA6q14.1) lokalisiert.

Myosin VIIa wird auf Grund seiner FERM-Domäne eine vermittelnde Rolle bei der

Interaktion von Membranen mit Zelloberflächenrezeptoren zugesprochen (CHISHTI

31

et al., 1998). Ebenso werden eine regulative Rolle des Proteins bei mechanisch

gesteuerten Ionenkanälen (RICHARDSON et al., 1999) und die Beteiligung an

intrazellulären Transportprozessen (LIBBY und STEEL, 2001) diskutiert. Bei den

shaker1-Mäusen resultieren Mutationen in Myo7a in einer Desorganisation der

Stereozilienbündel (GIBSON et al., 1995; HASSON et al., 1997; SELF et al., 1998).

Beim Menschen können Mutationen in dem homologen Gen (MYO7A; HSA11q13.5)

zu drei verschiedenen Formen genetisch bedingter Taubheit führen. Zum einen ist

eine nicht syndromartige, rezessiv vererbte Taubheitsform (DFNB2) und eine nicht

syndromartige, dominant vererbte Taubheitsform (DFNA11 ) beschrieben

(FRIEDMAN et al., 1999). Weiterhin wird eine Mutation in diesem Gen für das „Usher

Syndrom“ Typ 1B (Kapitel 2.4.1.1) verantwortlich gemacht (WEIL et al., 1995).

Hierbei zeigen betroffene Patienten neben einem Innenohrdefekt eine tapetoretinale

Degeneration. Tatsächlich wurde Myosin VIIa durch genetische Studien als essentiell

für die Sehfähigkeit des Menschen eingestuft (HASSON und MOOSEKER, 1997). Es

wird vermutet, dass es an Transportprozessen im Bereich des Pigmentepithels der

Netzhaut (RPE) beteiligt ist (LIBBY und STEEL, 2001). Die von den sich in ständiger

Erneuerung befindlichen Photorezeptoren abgegebenen äußeren Segmente werden

von den Zellen des RPE phagozytiert und somit abgebaut. Die Aufnahme und der

Transport der phagozytierten Substanzen ist ein Prozess, der durch aktinreiche

Strukturen der Zellen des RPE durchgeführt wird und deren Bestandteil Myosin VIIa

ist (HASSON, 1999). Ursprünglich wurde davon ausgegangen, dass die Expression

dieses Myosins bei Nagetieren auf dieses Pigmentepithel beschränkt ist (HASSON,

et al., 1995), während beim Menschen dagegen das Protein auch in den

Photorezeptoren selbst nachgewiesen werden konnte (EL-AMRAOUI et al., 1996).

Die shaker1-Mausmutanten weisen auch keine Degeneration der Netzhaut auf

(HASSON et al., 1997; LIU et al., 1998; TITUS, 1999). Daraus wurde geschlossen,

dass die Ausbildung der progressiven Retinopathie bei dem Typ 1B des „Usher

Syndroms“ auf Veränderungen in den Photorezeptoren (Stäbchen und Zapfen) und

nicht in den Zellen des Pigmentepithels zurückzuführen ist (HASSON und

MOOSEKER, 1997). Tatsächlich wurde aber Myosin VIIa in den Zilien der Stäbchen

und Zapfen, die den Zellkörper der Photorezeptoren mit ihren inneren und äußeren

32

Segmenten verbinden sowohl beim Menschen, als auch bei der Maus nachgewiesen

(LIU, et al., 1997). LIBBY und STEEL (2001) diskutieren die Möglichkeit, dass es bei

den shaker1-Mausmutanten nicht zur Ausbildung einer retinalen Degeneration

kommt, weil die Mäuse nicht das entsprechende Alter erreichen und/oder nicht der

Lichtmenge ausgesetzt sind wie ein durchschnittlicher „Usher Syndrom“ Typ 1B-

Patient.

Eine Mutation im MYH9 Gen (HSA22q12.3), welches für Myosin IX kodiert ist für eine

nicht syndromartige, dominant vererbte Taubheitsform (DFNA17) des Menschen

verantwortlich. Die Expression des homologen Gens (Myh9) wurde auch in der

Cochlea der Ratte nachgewiesen (LALWANI et al., 2000). Dieses Gen kartiert auf

RNO7.

Wie Myosin VIIa besitzt auch Myosin XV eine FERM-Domäne, die dazu dient mit den

zytoplasmatischen Domänen integraler Zellmembranproteine, wie CD44, CD43 und

ICAM-2 zu interagieren. Dadurch könnte das Protein als Verbindung zwischen der

Zellmembran und dem Aktinzytoskelett fungieren (YONEMURA et al., 1998).

Bezüglich der Ausstattung mit weiteren Domänen und deren struktureller Anordnung

weisen Myosin VIIa und XV ebenfalls große Ähnlichkeit auf. Die Gesamtlänge des

Myo15 Gens beträgt bei der Maus ca. 60 Kilobasenpaare (kb), wobei 66 Exone

nachgewiesen wurden (LIANG et al., 1999).

Sowohl eine Punktmutation in der Motordomäne von Myo15, als auch eine Deletion

in den Exonen, die für die FERM-Domäne kodieren, führen bei den shaker2-Mäusen

zu einer autosomal rezessiv vererbten Taubheit und vestibulärer Fehlfunktion

(PROBST, et al., 1998; LIANG, et al., 1999; ANDERSON, et al., 2000). Auch beim

Menschen sind verschiedene Mutationen in MYO15 (HSA17p11.2) beschrieben, die

als Folge eine nicht syndromartige, rezessiv vererbte Taubheitsform (DFNB3) haben

(WANG, et al., 1998).

33

2.4.1.1 Das „Usher Syndrom“

Das „Usher Syndrom“ zählt zu den über 40 beschriebenen Syndromen des

Menschen, die mit Taubheit und Beeinträchtigung des optischen Apparates

einhergehen (PETIT, 2001). Tatsächlich handelt es sich bei mehr als 50 % dieser

Fälle um eine Form dieses Syndroms (VERNON, 1969). Seine Prävalenz beträgt

basierend auf Studien der skandinavischen (NUUTILA, 1970; GRONDAHL, 1987;

ROSENBERG et al., 1997) kolumbianischen (TAMAYO et al., 1991), britischen

(HOPE et al., 1997) und nordamerikanischen Bevölkerung (BOUGHMAN et al.,

1983) zwischen 1 zu 16.000 und 1 zu 50.000.

Das „Usher Syndrom“ (USH) zeichnet sich durch neurosensorische Taubheit mit und

ohne Beeinträchtigung des vestibulären Systems sowie eingeschränktes

Sehvermögen auf Grund einer Retinitis pigmentosa (tapetoretinale Degeneration)

aus (PETIT, 2001). Es werden drei klinische Subtypen, Usher Typ 1 (USH1), Typ 2

(USH2) und Typ 3 (USH3), unterschieden (DAVENPORT und OMENN, 1977). USH1

repräsentiert dabei die klinisch schwerwiegendste Form. Patienten, die am Typ 1

leiden zeigen eine angeborene schwere neurosensorische Taubheit, konstante

vestibuläre Funktionsstörung und einen vorpubertären Beginn der Retinitis

pigmentosa (PETIT, 2001). Betroffene Kinder können ohne Hilfe in einem Alter von

sechs Monaten nicht sitzen und häufig nicht laufen, bevor sie ein Alter von 18

Monaten erreichen (MOLLER et al., 1989; SMITH et al., 1994). Dabei sind zum Teil

Ataxien vestibulären Ursprungs zu beobachten. USH2 unterscheidet sich vom Typ 1

durch eine moderatere Form der Taubheit (moderater Hörverlust bei niedrigen

Frequenzen; schwerer Hörverlust bei hohen Frequenzen), ein Fehlen der

vestibulären Funktionsstörung sowie eine höhere Variabilität im Fortschreiten der

Sehstörung (Beginn einer Nachtblindheit meist während der Pubertät) (PETIT, 2001).

USH3 unterscheidet sich wiederum von den Typen 1 und 2 durch eine progressive

Form der Taubheit, die zum Teil mit vestibulären Funktionsstörungen verbunden ist

(KARJALAINEN et al., 1989).

Der genetische Ursprung des Syndroms weist eine noch größere Heterogenität als

die klinische Ausprägung auf. Mindestens 12 Loci sollen an den drei Subtypen der

34

Erkrankung beteiligt sein. Zu den bereits identifizierten Genen gehören MYO7A

(USH1B; Protein: Myosin VIIa; Kapitel 2.4.1), USH1C (USH1C; Protein Harmonin),

CDH23 (USH1D; Protein: Cadherin 23), PCDH15 (USH1F; Protein: Protocadherin

15), USH1G (USH1G; Protein SANS), USH2A (USH2A; Protein Usherin) sowie

USH3A (USH3A; Protein Clarin 1) (AHMED et al., 2003).

2.4.2 Kaliumeinzelkanäle und ihre Bedeutung für die Funktion des

Innenohres und der Netzhaut

Zelleinwärts gerichtete K+-Einzelkanäle (Kir: „Inwardly rectifying K+-channel“)

repräsentieren eine im Körper weit verbreitete Klasse von Membranproteinen. Zu

den Zellfunktionen, an denen sie beteiligt sind, gehören die Generierung von

Membranpotenialen, die Regulation der Aktionspotenialdauer und der Erregbarkeit

von Membranen sowie die Sekretion und Absorption von Kaliumionen (LAGRUTTA

et al., 1996; ISOMOTO et al., 1997; REIMANN und ASHCROFT, 1999).

Als gemeinsames Charakteristikum dieser Gen- bzw. Protein-Familie ist

erwähnenswert, dass sie Kaliumionen bevorzugt in die Zelle einschleusen. Ihnen

wird auch eine Schlüsselrolle beim Transport von Kaliumionen in der Netzhaut des

Auges und in der Cochlea zugesprochen (MARCUS et al., 2002; YUAN et al., 2003).

Untersuchungen zu Veränderungen der Kaliumkonzentration im subretinalen Raum

(SRS) sind von OAKLEY und GREEN (1976) sowie STEINBERG et al. (1980)

beschrieben. Der SRS befindet sich zwischen den äußeren Segmenten der

Photorezeptoren und dem Pigmentepithel der Netzhaut (RPE), das die

Photorezeptoren von der Aderhaut trennt. Eine Illumination der dunkeladaptierten

Retina verursacht einen rapiden Abfall der Kaliumkonzentration in dem SRS durch

eine Veränderung der Aktivität der Photorezeptoren. Dieser Abfall wird dann zum Teil

kompensiert durch einen Efflux von K+ aus dem RPE und den Müller-Zellen

(KARWOSKI et al., 1989). An der Regulation des Kaliumhaushalts im SRS soll auch

der Kaliumeinzelkanal Kir7.1 (Kcnj13) beteiligt sein (SHIMURA et al., 2001). Es gibt

auch Hinweise auf die Existenz dieses Kanals (Kcnj13; RNO9) sowie der

35

Kaliumeinzelkanäle Kir4.1 (Kcnj10; RNO13) und Kir6.2/SUR1 (Kcnj11; RNO1) im

RPE der Ratte (KUSAKA et al., 1999; ETTAICHE et al., 2001; KUSAKA et al., 2001).

Die Expression des Kaliumeinzelkanals Kir4.1 wurde bei der Ratte auch für die

Intermediärzellen der Stria vascularis der Cochlea bestätigt (ANDO und TAKEUCHI,

1999). Bei der Stria vascularis handelt es sich um ein stark vaskularisiertes

mehrschichtiges Epithel, das in der Lateralwand der Cochlea dem Ligamentum

spirale angelagert ist und aus Marginal-, Intermediär- und Basalzellen besteht

(JAHNKE, 1975). Die Marginalzellen sezernieren Kaliumionen in die Endolymphe der

Cochlea, während die Basalzellen zum einen mit den zwischen Marginal- und

Basalzellen lokalisierten Intermediärzellen und zum anderen mit dem Ligamentum

spirale in Verbindung stehen (MARCUS, et al., 2002).

Die Stria vascularis ist als Ursprung des endocochleären Potentials (EP) bekannt,

welches zusammen mit der hohen Kaliumkonzentration in der Endolymphe der

Cochlea für die sensorische Transduktion in den Haarzellen sorgt. Man geht davon

aus, dass Kaliumeinzelkanäle vom Typ Kir4.1, die für einen Kaliumeinstrom in die

Intermediärzellen sorgen, für die Generierung des endocochleären Potentials

verantwortlich sind (MARCUS, et al., 2002). Gestützt wird diese Hypothese durch die

Tatsache, dass in Mausmutanten, denen die Intermediärzellen fehlten, kein EP

gemessen werden konnte (CARLISLE et al., 1990) und man das EP durch Einsatz

von Kaliumeinzelkanalblockern beeinflussen konnte (MARCUS et al., 1985; HIBINO

et al., 1997; TAKEUCHI et al., 2000). Ebenso ist eine Mausmutante (Kcnj10tm1Pkj) mit

einem genetisch inaktivierten Kir4.1 Kaliumeinzelkanal (Kcnj10; MMU1) beschrieben.

Dieses Tier weist eine Innenohrdegeneration in Verbindung mit Hörverlust auf

(KOFUJI et al., 2000; MARCUS, et al., 2002; ROZENGURT et al., 2003).

Bei der Kcnj12tm1Swz-Mausmutante wurde der Kir2.2 Kaliumeinzelkanal (Kcnj12;

MMU11) durch gerichtete Mutation inaktiviert (ZARITSKY et al., 2000). Sie wurde

zusammen mit der Kcnj2tm1Swz-Mausmutante (genetisch inaktivierter Kir2.1

Kaliumeinzelkanal; Kcnj2; MMU11) für Untersuchungen zu Kaliumionen abhängigen

Dilatationen von cerebralen Arterien herangezogen. Aus ihren Untersuchungen

schlossen ZARITSKY et al. (2000), dass die Expression von Kir2.1, nicht aber von

Kir2.2 in den glatten Muskelzellen der Arterien für die durch Kaliumionen gesteuerte

36

Dilatation notwendig ist. Untersuchungen zur Expression und Funktion von Kcnj12

für das Innenohr und die Netzhaut sind noch nicht beschrieben.

2.4.3 Rezeptoren des dopaminergen Systems

Als Zielstrukturen des Neurotransmitters Dopamin dienen G-Protein gekoppelte

Rezeptoren (DRD), die in 5 Typen (DRD1 – DRD5) aufgeteilt werden. Die zuerst

identifizierten Dopamin D1- und D2-Rezeptoren übertreffen zahlenmäßig bei weitem

die später gefundenen Dopamin D3- bis D5-Rezeptoren. Entsprechend werden die

Rezeptoren heute in zwei Unterfamilien gegliedert. DRD1 und DRD5 werden als D1-

ähnliche während DRD2, DRD3 und DRD4 als D2-ähnliche Rezeptoren bezeichnet

(Strange, 1996).

Zwischen den Rezeptoren bestehen Unterschiede hinsichtlich Lokalisation,

physiologischer Funktion und biochemischer Reaktion. In den Basalganglien

(Striatum) findet man hauptsächlich D1- und D2-Rezeptoren während im Cortex und

im limbischen System alle Subtypen vorkommen. In der Hypophyse gibt es fast

ausschließlich D2-Rezeptoren und im Gefäßsystem herrschen D1-, D2- und D4-

Rezeptoren vor. Die D1-Rezeptoren sind somit für die Bewegungsmodulation, für

kognitive und kardiovaskuläre Funktionen wichtig. D2-Rezeptoren vermitteln

Bewegungsmodulation und Verhalten, sowie die Prolaktinsekretion in der

Hypophyse. D3- und D4-Rezeptoren sind wahrscheinlich an kognitiven und

emotionalen Vorgängen und Verhalten beteiligt, während die Bedeutung der

D5-Rezeptoren noch weitgehend unklar ist (JABER et al., 1996).

Die D3-Rezeptoren repräsentieren in etwa nur 1 % der D2-ähnlichen Rezeptoren

(SOKOLOFF und SCHWARTZ, 1995). Sie wurden längere Zeit auch auf eine

Beteiligung an der Ausprägung von Schizophrenie beim Menschen untersucht, wobei

neuere Untersuchungen Veränderungen in D R D 3 (HSA3q13.31) eine

prädispositionierende Rolle aberkennen (ANNEY et al., 2002; CHONG et al., 2003).

Interessanterweise beschrieben ACCILI et al. (1996) eine Mausmutante (Drd3tm1Dac)

mit einem genetisch inaktivierten D3-Rezeptor, die sich vor allem durch eine starke

37

Hyperaktivität - wie sie auch bei der BH.7A-ci3 Rattenmutante vorliegt (LESSENICH

et al., 2001) - auszeichnet, und schlossen daraus, dass dieser Rezeptor-Typ eine

inhibitorische Rolle in der Beeinflußung bestimmter Verhaltensabläufe spielen

könnte. Das für diesen Rezeptor kodierene Gen (Drd3) ist bei der Maus auf

Chromosom 16 lokalisiert.

2.5 Literatur zur Methodik

2.5.1 Mikrosatelliten

Mikrosatelliten, auch „simple tandem repeats“ (STRs) oder „simple sequence

repeats“ (SSRs), sind definiert als kurze 1-6 Basenpaare (bp) lange DNA

Sequenzen, die sich unterschiedlich oft hintereinander wiederholen (BECKMANN

und WEBER, 1992). Die Anzahl dieser Wiederholungen ist dabei der Gesamtlänge

des Mikrosatelliten proportional. Daraus resultierende Fragmentlängenunterschiede,

wie sie z.B. beim Vergleich zweier Ratteninzuchtstämme auftreten können, werden

auch als „simple sequence length polymorphism“ (SSLPs) bezeichnet (COPELAND

et al., 1993; DIETRICH et al., 1994). Solche Polymorphismen lassen sich einfach

mittels PCR-Amplifikation darstellen (WEBER und MAY, 1989).

Man unterscheidet zwischen anonymen und gengekoppelten Mikrosatelliten. Bei den

anonymen Markern ist zwar die chromosomale Lokalisation aufgrund von

genetischen Kopplungskarten beschrieben, deren physikalischer Abstand zu

benachbarten Genen ist jedoch unbekannt. Gengekoppelte Mikrosatellitenmarker

dagegen liegen meist in Introns und 3´- und 5´- „untranslated regions“ von Genen.

Bei der Ratte wurden Mikrosatelliten erstmals 1992 beschrieben (SERIKAWA et al.).

Seitdem wurde eine stetig ansteigende Anzahl von Mikrosatelliten, die über das

gesamte Genom der Ratte verteilt sind, identifiziert und für genetische

Untersuchungen (Kopplungsanalysen) herangezogen (KURAMOTO et al., 1993;

PROKOP et al., 1993; YEUNG et al., 1993). Angaben zu ihrer Lokalisation und den

38

benötigten Primersequenzen findet man bei Datenbanken wie z.B. der „Rat Genome

Database“ (www.rgd.mcw.edu).

2.5.1.1 Kopplungskarten und Kopplungsanalyse

Biologische Grundlage für eine Kopplungsanalyse sind Crossover-Vorgänge

zwischen zwei Nicht-Schwester-Chromatiden. Hierbei kann es zu reziprokem

Austausch von homologen Chromosomen-Abschnitten und somit zur Entkopplung

benachbarter Gene bzw. Loci kommen. Die Austauschhäufigkeit zwischen zwei Loci

ist abhängig von ihrer gegenseitigen Entfernung und ist somit ein Maß für ihre

relative Entfernung. Maßeinheit ist das centi-Morgan (cM), wobei ein cM einer

Austauschhäufigkeit von 1 % entspricht (STRICKBERGER 1988).

Die Austauschhäufigkeit zwischen zwei Loci wird mit Hilfe von

Kreuzungspopulationen bestimmt. Hierzu kann beispielsweise eine

Rückkreuzungspopulation dienen (KURAMOTO et al., 1993; PROKOP et al., 1993;

YEUNG et al., 1993). Durch Genotypisierung der Individuen der

Kreuzungspopulation mittels polymorpher Marker (beispielsweise Mikrosatelliten)

bestimmt man die Austauschhäufigkeit zwischen zwei Loci/Markern, die sich aus

dem prozentualen Anteil der Austauschkombinationen an den Gesamtkombinationen

ergibt. Durch solch eine Kopplungsanalyse können Kopplungsgruppen und darauf

basierend Kopplungskarten ermittelt werden. Ist die chromosomale Position eines

Locus einer Kopplungsgruppe bekannt, kann diese als Ganzes dem entsprechenden

Chromosom zugeordnet werden (SERIKAWA et al., 1992).

Parallel zu der Ermittlung der chromosomalen Position einzelner Marker

(beispielsweise SSLPs) kann auch deren Assoziation zu einem bestimmten

phänotypischen Merkmal untersucht werden. Hierbei wird die Austauschhäufigkeit

(Rekombinationsfrequenz) zwischen einem Marker und dem Gen, welches für das

entsprechende Merkmal verantwortlich ist, überprüft.

39

2.5.2 Neurophysiologische Verhaltensuntersuchungen

Für die vielfältigen neurologischen Störungen des Menschen stehen noch nicht

genügend brauchbare Tiermodelle zur Verfügung. Gentechnologische Modifikationen

(klassische und konditionale „Knockout“-Mausmutanten) haben zwar zu guten neuen

Modellen geführt, setzten aber die Kenntnis des ursächlichen Defektgens voraus und

erfordern eine vollständige Phänotypisierung. Bestandteil einer vollständigen

Phänotypisierung sollten neben immunologischen, endokrinologischen,

histologischen und genetischen Analysen auch verhaltensbiologische

Beobachtungen sein. Entsprechend haben Untersuchungen zum Verhalten von

Versuchstieren in der jüngsten Vergangenheit zunehmende Bedeutung erhalten

(CRAWLEY, 1999).

Neben diesen genetisch veränderten Tieren bedarf es natürlich auch bei

Spontanmutanten einer genauen Abklärung sämtlicher Züge des Phänotypen.

Im Rahmen eines vollständigen „Screening“-Verfahrens ist es von essentieller

Bedeutung, vorab die Physis der Untersuchungstiere zu prüfen. Hierbei sollten auch

die sensorischen Fähigkeiten untersucht werden. Diese Voruntersuchungen schaffen

die Voraussetzung, um daran anschließend entsprechend untersuchte Tiere komplex

aufgebauten Verhaltenstests zu unterziehen (CRAWLEY und PAYLOR, 1997).

Auf Grund individueller Unterschiede in den Verhaltensreaktionen der Tiere ist es

unabdingbar ihre neurophysiologischen und sensorischen Funktionen durch

unterschiedliche Versuchsaufbauten zu prüfen, um falsch positive Ergebnisse

ausschliessen zu können (KARL et al., 2003).

40

3. Material und Methoden

3.1 Versuchstiere und Organentnahme

3.1.1 Versuchstiere

Die Haltung und Zucht sämtlicher Tiere erfolgte am Zentralen Tierlaboratorium der

Medizinischen Hochschule Hannover (Haltersymbol: Ztm).

Sämtliche Ratten wurden in Gruppen (2-3 Tiere) in Makrolonkäfigen Typ III gehalten

und wöchentlich in saubere Käfige umgesetzt. Als Futter wurde handelsübliches

Haltungsfutter (Altromin 1324) bzw. Zuchtfutter (Altromin 1310) ad libitum eingesetzt

und Wasser in Makrolonflaschen ebenfalls ad libitum zur Verfügung gestellt. Die

Einstreu bestand aus staubfreiem Weichholzgranulat. Die relative Luftfeuchtigkeit lag

bei 55 ± 5%, die Temperatur bei 22 ± 2°C. Das Lichtprogramm war auf einen 12/12

Stunden Licht-/Dunkel-Zyklus eingestellt (Lichtphase begann ab 6.00 Uhr

mitteleuropäischer Zeit).

Für die Verhaltensuntersuchungen (Kapitel 3.2) sowie für die genetischen Analysen

(Kapitel 3.4) wurden zwei Rückkreuzungspopulationen ((LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x

LEW/Ztm-ci2 und (BN/Ztm x BH.7A/Ztm-ci3)F1 x BH.7A/Ztm-ci3) angelegt. Ein Teil

der Individuen dieser Rückkreuzungspopulationen (N2) war zum Zeitpunkt des

Dissertationsbeginns bereits im Zentralen Tierlaboratorium phänotypisiert

(Rotationsverhalten; Funktionsfähigkeit des vestibulären Systems (Schwimmtest,

Kapitel 3.2.2.4)) und euthanasiert worden, so dass die bei -20 °C gelagerten

Organproben (Schwanz; Milz, Ohren) dieser Tiere nach einer Aufreinigung der DNA

für die Genotypisierung zum Einsatz kamen.

Im Verlauf der vorliegenden Arbeit wurden 55 weitere (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x

LEW/Ztm-ci2 Individuen gezüchtet und phänotypisiert (Kapitel 3.2), so dass

insgesamt 208 N2-Individuen für die genetischen Analysen (Kapitel 3.4) zur

Verfügung standen.

41

Die bereits vorhandene (BN/Ztm x BH.7A/Ztm-ci3)F1 x BH.7A/Ztm-c i 3

Rückkreuzungspopulation (n=125) wurde im Verlauf dieser Dissertation durch 154

neue N2-Individuen ergänzt, die entsprechend phänotypisiert (Kapitel 3.2) wurden.

Insgesamt entstand somit bis Juni 2003 eine 279 Individuen starke Population.

(LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2:

Es wurden weibliche LEW-ci2 Ratten mit männlichen Ratten des Inzuchtstammes

BN/Ztm verpaart. Die weiblichen Tiere der resultierenden F1 (LEW-ci2 x BN)

Generation wurden mit männlichen LEW/Ztm-ci2 Ratten verpaart, so dass eine

segregierende Rückkreuzungspopulation ((LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-

ci2) entstand.

(BN/Ztm x BH.7A/Ztm-ci3)F1 x BH.7A/Ztm-ci3:

Es wurden Rückkreuzungstiere basierend auf dem Inzuchtstamm BN/Ztm und dem

Inzuchtstamm BH.7A/Ztm-ci3 gezüchtet. Hierzu wurden männliche BH.7A/Ztm-ci3

Ratten mit weiblichen BN/Ztm Tieren verpaart. Die weiblichen Tiere der

resultierenden F1 (BN/Ztm x BH.7A/Ztm-ci3) Generation wurden mit den männlichen

Elterntieren verpaart, so dass eine segregierende Rückkreuzungspopulation

((BN/Ztm x BH.7A/Ztm-ci3)F1 x BH.7A/Ztm-ci3) entstand.

Sämtliche Individuen beider N2-Populationen wurden zur Organentnahme (Schwanz,

Milz, Ohren) nach vorheriger CO2 Betäubung durch cervikale Dislokation getötet.

Ebenso wurden jeweils ein männliches adultes Tier der beiden coisogenen Stämme

LEW/Ztm-ci2 bzw. BH.7A/Ztm-ci3 sowie jeweils ein männliches adultes Tier der

Hintergrundstämme LEW/Ztm und BH.7A/Ztm bzw. BH/Ztm zur Organentnahme

(Schwanz, Milz, Ohren) wie oben beschrieben getötet. Die DNA dieser Tiere diente

als Kontrolle bei der Auswahl geeigneter Mikrosatelliten (Kapitel 3.4.1 und 3.5.3)

sowie zum Nachweis einzelner Exone eines Kandidatengens (Kapitel 3.5.5).

42

3.1.2 Organentnahme

Die Milz, die Ohren und die Schwanzspitze wurden nach Tötung eines Tieres unter

aspetischen Bedingungen entnommen, in ein steriles 2 ml Reaktionsgefäß verbracht

und sofort in flüssigen Stickstoff überführt. Dabei wurde strengstens darauf geachtet,

dass keine Probenkontamination von Tier zu Tier entstand (Reinigung des

Operationsbesteckes zwischen zwei Organentnahmen). Die Lagerung der Organe

erfolgte bei -80 °C.

3.2 Neurophysiologische Verhaltensuntersuchungen

Die durchgeführten neurophysiologischen Verhaltensuntersuchungen wurden der

Bezirksregierung Hannover angezeigt und sind von dieser zur Kenntnis genommen

worden (Aktenzeichen: 509c-42502-02A139).

Die im Verlauf dieser Dissertation gezüchteten N2-Tiere beider Rückkreuzungen

wurden, wie es bei den vorab gezüchteten N2-Individuen bereits geschehen war, auf

das Vorhandensein der charakteristischen Merkmale des ci2- bzw. ci3-Phänotyps

getestet, um so die jeweiligen Individuen in homozygote und heterozygote

Merkmalsträger aufteilen zu können. Diese eindeutige phänotypische

Charakterisierung ist als Grundvorrausetzung anzusehen, um die bei der

Kopplungsanalyse (Kapitel 3.4) ermittelten Genotypen mit den Phänotypen der

Rückkreuzungsindividuen abgleichen zu können und somit einen Hinweis auf

Kopplung des untersuchten Markers zur jeweiligen Mutation zu erlangen.

Hierbei handelte es sich in beiden Fällen um das für die Parentalstämme

beschriebene Rotationsverhalten (LINDEMANN et al., 2001; LESSENICH et al.,

2001). Zusätzlich sollten die (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2 Individuen

auf die von der LEW-ci2 Ratte bekannten Fehlfunktionen des auditiven und

vestibulären Systems geprüft werden (KAISER et al., 2001).

43

Wie bei den bereits phänotypisierten und euthanasierten N2-Individuen sollte das

Rotationsverhalten im Heimatkäfig und in einer „Open Field“-Apparatur und die

vestibuläre Funktion mit Hilfe eines Schwimmtests bei den neu gezüchteten Tieren

untersucht werden. Zusätzlich sollte das vestibuläre System, wie bereits bei den

Parentalstämmen (KAISER et al., 2001; LESSENICH et al., 2001), mit Hilfe des

„Balance“- und „Air-Righting”-Tests geprüft werden.

Des Weiteren sollte die Sehfähigkeit der (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2

Individuen überprüft werden. Der Grund für diese Untersuchungen war der auf den

Ergebnissen der genetischen Untersuchungen dieser Arbeit basierende Hinweis auf

Parallelität des ci2-Phänotypen zu dem „Usher Syndrom“ Typ 1B des Menschen, das

mit einer progressiven Retinopathie einhergeht (Kapitel 5.3.1). Hierbei war das Ziel

neurophysiologische Verhaltentests zu etablieren, mit denen eine große Anzahl von

Individuen vergleichsweise einfach auf ihre Sehfähigkeit geprüft werden konnte.

3.2.1 Untersuchung des Rotationsverhaltens

Die im Verlauf dieser Dissertation gezüchteten Individuen der (LEW/Ztm-ci2 x

BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2 Rückkreuzung (n=55; Alter zum Zeitpunkt dieser

Untersuchung: zwischen 6 und 10 Wochen) sowie der (BN/Ztm x BH.7A/Ztm-ci3)F1 x

BH.7A/Ztm-ci3 Rückkreuzung (n=154; Alter zum Zeitpunkt dieser Untersuchung:

zwischen 4 und 8 Wochen) wurden hinsichtlich ihres Rotationsverhalten untersucht.

Hierzu erfolgte zunächst eine Beobachtung der Tiere in der ihnen gewohnten

Umgebung des Heimatkäfigs (Makrolonkäfig Typ III; Gruppenhaltung (2-3 Tiere) –

„Homecage Behavior“). Danach wurden die Tiere einzeln in eine runde „Open Field“-

Apparatur verbracht (Durchmesser 105 cm; Höhe 40 cm) und ihr Verhalten in dieser

für sie neuen Umgebung, die bei den Tieren Stress erzeugen sollte, beobachtet.

Das für den ci2 -Phänotypen bzw. c i 3-Phänotypen charakteristische

Rotationsverhalten lag vor, wenn die Tiere sowohl im Heimatkäfig als auch in der

„Open Field“-Apparatur wiederholt schnelle Drehbewegungen um die eigene Achse

zeigten.

44

3.2.2 Untersuchung des auditiven und vestibulären Systems der


Die 55 N2-Individuen waren zum Zeitpunkt der folgenden Untersuchungen (Kapitel

3.2.2.1 bis 3.2.2.4) zwischen 6 und 10 Wochen alt.

3.2.2.1 Akustischer Stimulus

Zur Überprüfung ihres Hörvermögens wurden die N2-Individuen mit einem

definierten akustischen Stimulus (Blechfeder mit Resonanzkörper: „Knackfrosch“;

VON HÖRSTEN et al., 1993) konfrontiert und eine etwaige Schreckreaktion

(Zusammenzucken des Flankenbereichs; heftiges Zucken der Kopfregion)

aufgezeichnet.

3.2.2.2 „Air-Righting”-Test

Der „Air-Righting“-Test überprüft bestimmte Funktionen (Stellreflexe) des

vestibulären Systems (OSSENKOPP et al., 1990; RABBATH et al., 2001). Die Tiere

wurden auf den Rücken gedreht und aus einer Höhe von ca. 50 cm auf eine

gepolsterte Unterlage fallengelassen. Die Fähigkeit der Tiere, sich auf dieser kurzen

Strecke so zu drehen, dass sie auf den Gliedmaßen landen, wurde beurteilt. Dieser

Test wurde dreimal hintereinander durchgeführt. Nur bei Ratten, die in allen drei

Tests ein Defizit zeigten (auf der Seite oder auf dem Rücken landeten), wurde dieses

auf einen Defekt des vestibulären Systems zurückgeführt.

45

3.2.2.3 „Balance“-Test

Beim „Balance“-Test wird ebenfalls die Funktionsfähigkeit des Gleichgewichtorgans

der Tiere überprüft (CRAWLEY, 1999). Die N2-Ratten wurden in einen Makrolonkäfig

Typ III plaziert und dieser jeweils zehnmal in seiner Längs- und Querachse gekippt.

Zusätzlich wurde der Käfig durch schnelle Bewegungen in seiner Vertikalachse

verschoben. Die Fähigkeit der Tiere diese Bewegungen des Käfigs durch gespreizte

Stellung ihrer Pfoten und durch Ruderbewegungen mit dem Schwanz auszugleichen,

um eine aufrechte Position zu erhalten, wurde beobachtet und diejenigen Tiere, die

solch ein Verhalten zeigten als positiv bewertet.

3.2.2.4 Schwimmtest

Ebenso wurde ein Schwimmtest (modifiziert nach PORSOLT et al., 1978)

durchgeführt, um Aussagen über die Funktion des vestibulären Systems zu erhalten.

Die Ratten wurden hierzu in ein quadratisches Wasserbecken (Breite x Höhe x Tiefe:

50 x 42 x 50 cm) verbracht, aus welchem sie nicht entrinnen konnten. Die

Wassertemperatur betrug 32 – 36°C. Die Ratten wurden für 5 Minuten in diesem

Becken beobachtet und ihr Schwimmvermögen beurteilt. Nach Ablauf der 5 Minuten

wurden die Tiere aus dem Becken entnommen. Tauchten die Tiere ab, weil sie nicht

in der Lage waren, zu schwimmen, so erfolgte eine sofortige Entnahme aus dem

Wasserbecken.

46

3.2.3 Überprüfung der Sehfähigkeit der (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x

LEW/Ztm-ci2 Ratten

Die in der Literatur beschriebenen Verhaltensuntersuchung, aus denen man

Rückschlüsse auf die Sehfähigkeit von Ratten und Mäusen ziehen kann („Foreign

Stimulus“-Test: CRAWLEY, 1999; „Ringtest“: KARL et al., 2003), konnten auf Grund

des Rotationsverhaltens und der Defizite in der Funktion des vestibulären Systems

der den ci2-Phänotypen aufweisenden N2-Individuen nicht durchgeführt werden.

Es kamen zwei Testaufbauten zum Einsatz, die trotz dieses spezifischen

Verhaltensmusters Rückschlüsse auf das Sehvermögen der den ci2-Phänotypen

tragenden N2-Tiere zuließen. Sämtliche Tiere wurden wie oben beschrieben (Kapitel

3.2.1 und 3.2.2) vor der Durchführung beider Untersuchungen auf das

Vorhandensein der charakteristischen Merkmale der ci2-Mutation geprüft und in zwei

Gruppen (homozygote Merkmalsträger: Rotationsverhalten, Defizite in der Funktion

des vestibulären Systems vs. heterozygote Merkmalsträger: kein Rotationsverhalten,

physiologische Funktion des vestibulären Systems) unterteilt. Die N2-Individuen

waren zum Zeitpunkt der folgenden Untersuchungen (Kapitel 3.2.3.1 und 3.2.3.2)

zwischen 3 und 5 Monate alt.

3.2.3.1 Verhalten der Tiere an einer sichtbaren Kante (modifizierter

„Visual-Cliff“-Test)

Es wurde das Verhalten der 55 im Verlauf dieser Arbeit gezüchteten N2-Individuen

bei der Positionierung auf einem Rundhocker (Höhe: 50 cm; Durchmesser der

Sitzfläche: 30 cm), welcher von einer Schaumstoffunterlage umgeben war,

untersucht. Die Tiere wurden somit einer exponierten Situation ausgesetzt, um zu

überprüfen, ob sie in der Lage sind, die optische Begrenzung dieser Fläche (Kante

der Sitzfläche) zu registrieren. Hierzu wurden die N2-Ratten zentral plaziert und für 3

Minuten ihr Verhalten beobachtet. Es wurde die Latenzzeit bis zu dem Zeitpunkt

gemessen, an dem die Tiere erstmalig über die Kante der Sitzfläche des Hockers

47

hinabblickten („Head Dipping“). Ebenso wurde die Häufigkeit dieses „Head Dipping“-

Verhaltens gezählt. Des Weiteren wurde die Anzahl der Stürze auf den gepolsterten

Boden protokolliert. Nach einem Sturz wurde der Test unterbrochen, die Tiere wieder

zentral auf der Sitzfläche des Hockers positioniert und anschließend die

Untersuchung wieder fortgesetzt. Bei einem absehbaren Sturz wurde dieser als

solcher gewertet, die Tiere aber rechtzeitig von der Kante entfernt und ebenfalls

wieder zentral plaziert, um jegliche Verletzungen zu vermeiden. Stürze, die sich auf

Grund des Rotationsverhaltens ergaben, wurden nicht aufgezeichnet. Die Anzahl der

während der Beobachtungsdauer abgesetzten Kot-Boli wurde als Indikator für die

Emotionalität und die Stressreaktion der Tiere (Hall, 1934) ebenfalls protokolliert.

3.2.3.2 Hell-Dunkel-Transfer-Test

Diese Untersuchung wurde lediglich mit jeweils 10 N2-Individuen, die den ci2-

Phänotypen aufwiesen und 10 nicht betroffenen N2-Individuen durchgeführt, um

mögliche Hinweise aus dem vorherigen Test (Kapitel 3.2.3.1) zu prüfen.

Zur Feststellung einer eventuell verminderten Sehfähigkeit der N2-Individuen wurde

als zweite Verhaltensuntersuchung ein Hell-Dunkel-Transfer-Test in einer „Shuttle-

Box“ (Hell-Dunkel-Kammer) durchgeführt (CRAWLEY, 1985). Die Shuttle-Box (Abb.

13) bestand aus einem hell ausgeleuchteten (575 Lux) und einem durch eine Wand

abgetrennten abgedunkelten Kompartiment (0.5 Lux). Die Tiere wurden in das helle

Kompartiment gesetzt. Nagetiere meiden natürlicherweise helle, offene Bereiche; so

dass das Einsetzen der Tiere in einen derartigen Bereich Ängstlichkeit induzieren

sollte. Nach einer Gewöhnungsphase von 10 Sekunden wurde eine in der

Trennwand plazierte Schubtür geöffnet, um den Zugang zum dunklen Kompartiment

zu ermöglichen und somit eine Ausweichmöglichkeit zu schaffen. Gemessen wurde

die Latenzzeit zwischen der Öffnung der Tür und dem Übergang der Tiere ins dunkle

Kompartiment („Light Dark Transversion Time“). Ebenso wurde gezählt, wie oft die

Ratten mit dem Kopf durch die Öffnung in den dunklen Bereich eintauchten, ohne

diesen zu betreten. Gezählt wurde auch die Anzahl der abgesetzten Kot-Boli

48

(Indikator für Emotionalität und Stressreaktion). Der Test wurde nach Übergang der

Ratten in das dunkle Kompartiment bzw. nach einer Zeitspanne von fünf Minuten

abgebrochen.

3.3 Molekularbiologische Untersuchungen

3.3.1 Isolierung von Desoxyribonukleinsäure (DNA)

Die DNA der N2-Ratten sowie Kontroll-DNA der Parentalstämme und der

Hintergrundstämme wurde unter Verwendung eines Aufarbeitungskits

(„NucleoSpinTM Tissue kit“; Firma Macherey-Nagel) isoliert.

Für die DNA-Gewinnung wurden ca. 25 mg des tiefgefrorenen Ohrmuschel- oder

Schwanzgewebes in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß mit 180 µl Pre-Lysispuffer

versetzt und mit einer sterilen Schere grob zerkleinert. Nach Zugabe von 25 µl

Proteinase K-Lösung wurde der Ansatz etwa 15 Sekunden gut durchmischt (Vortex)

und 2 bis 4 Stunden in einem Thermomixer bei 56 °C inkubiert. Anschließend wurden

200 µl eines Lysispuffers hinzugefügt, die Proben etwa 15 Sekunden gut durchmischt

und bei 70 °C für 10 Minuten inkubiert. Die ungelösten Gewebe- und Zellreste

wurden durch fünfminütige Zentrifugation (Biofuge) bei 12.000 Umdrehungen/min

abgetrennt und der Probenüberstand in ein neues 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt.

Nach Zugabe von Ethanol (96 %) und erneutem durchmischen wurde die Lösung auf

eine Silicium-Gelmembran-Säule, die sich in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß befand,

aufgetragen. Nach einminütiger Zentrifugation bei 12.000 Umdrehungen/min erfolgte

ein zweimaliger Waschvorgang der in der Säule enthaltenen DNA mit 500 µl bzw.

600 µl Waschpuffer und anschließender jeweils einminütiger Zentrifugation bei

12.000 Umdrehungen/min, um restliche Verunreinigungen zu entfernen.

Abschließend wurde die DNA mit 100 µl eines auf 70 °C erwärmten Elutionspuffers

und nach einminütiger Zentrifugation bei 12.000 Umdrehungen/min gewonnen.

49

3.3.2 Einstellen der DNA-Konzentration

Nachdem jede DNA-Probe 1:10 mit sterilem Aqua dest. verdünnt war, folgte eine

photometrische Bestimmung des DNA-Gehaltes bei 260 nm in einer 1 ml

Quarzküvette.

Zur Berechnung der DNA-Menge pro µl Probe galt folgende Formel:

OD260 x 50/ 1000 = µg DNA/ml

Im Anschluss an die Ermittlung der DNA-Konzentration erfolgte deren Einstellung auf

50 ng/ml mit sterilem Aqua dest. Die eingestellten DNA-Proben wurden bis zur

Weiterverwendung bei 4°C, zur längeren Aufbewahrung bei -18°C gelagert.

50

3.3.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Zum Nachweis sämtlicher in dieser Arbeit untersuchten genomischen DNA-

Sequenzen wurde das in Tabelle 1 beschriebene Protokoll benutzt.

Tabelle 1: PCR-Ansatz pro DNA-Probe

MgCl2: Magnesiumchlorid; 10 x Reaktionspuffer Y: 200 mM Tris-HCl (pH 8,55), 160

mM (NH4)2SO4, 20 mM MgCl2 ; dNTP: 2`-Desoxynukleosidtriphosphat;

Taq-DNA-Polymerase: SAWDAY Taq-DNA-PolymeraseTM

Volumen Endkonzentration

DNA-Lösung (50ng/ml) 2µl 100 ng

Mastermix:

Aqua dest. (steril) 4,6 µl

dNTP-Mix

(pro dNTP 2,5 mM)

1,2 µl pro dNTP 0,3 mM

10x Reaktionspuffer Y

(Tris-HCl)

((NH4)2SO4)

( MgCl2)

1 µl

(20 mM)

(16 mM)

( 2 mM)

25 mM MgCl2 0,6 µl 1,5 mM

6,7 µM Forward-Primer 0,25 µl 0,17 µM

6,7 µM Reverse-Primer 0,25 µl 0,17 µM

5U/µl Taq-DNA-

Polymerase

0,1 µl 0,5 U

Gesamt 10 µl

51

Alle Pipettierarbeiten wurden auf Kühlplatten durchgeführt, um vorzeitige Reaktionen

zu minimieren. Zunächst wurden 2 µl DNA-Lösung in 96er-Mikrotiterplatten, die als

PCR-Reaktionsgefäße dienten, vorgelegt und dann eine der Probenzahl

entsprechende Menge (8 µl pro DNA-Probe) des in Tabelle 1 beschriebenen

Mastermixes in ein 2 ml Reaktionsgefäß gegeben und durchmischt. Anschließend

wurden je 8 µl des Mastermixes in die vorgelegte DNA-Lösung gegeben. Die

Mikrotiterplatten wurden mit Silikonmatten verschlossen, das Gemisch wurde kurz

zentrifugiert und in einen Thermocycler verbracht. Das Temperaturprofil der PCR

begann mit einem Denaturierungsschritt von 4 min bei 95 °C. Es folgten 35 Zyklen je

15 s bei 94 °C (Denaturierung), 1 min bei 55 °C bis 60 °C (Anlagerung) und 2 min

bei 72 °C (Elongation). Nach dem letzten Zyklus folgte für 7 min ein abschließender

Schritt bei einer Temperatur von 72 °C. Bis zu ihrer Entnahme hielt der Thermocycler

die Proben auf 8 °C gekühlt.

3.3.4 Agarosegel-Elektrophorese

Zum Nachweis sämtlicher PCR-Produkte wurden 3 %ige Agarose-Gele verwendet.

Die Agarose wurde in 1 x TBE-Puffer (10 x TBE : Aqua dest = 1 : 10) durch

fünfminütiges Erhitzen in einer Mikrowelle und durch anschließendes Rühren

aufgelöst.

Unter ständigem Rühren mittels eines Magnetrührers wurde die Agaroselösung bis

auf etwa 50 °C abgekühlt. Es wurde 5 ml Ethidiumbromidlösung oder 5 ml „Gel Star“

pro 100 ml Gellösung zugesetzt. Die Gellösung wurde in eine 18 cm x 15 cm große

Kunststoffkammer gegossen. Zuvor wurde die Kunststoffkammer an den Enden mit

Klebeband abgedichtet und mit jeweils vier Kunstoffkämmen (2 mm stark mit 25

Zähnen) versehen. Die Gelstärke betrug 0,5 bis 0,7 cm.

Nachdem das Gel polymerisiert war (ca. 15 bis 20 min) wurden die Kunststoffkämme

und die Klebestreifen entfernt. Die Gelkammer wurde samt Gel in eine horizontal

ausnivellierte, mit 1x TBE-Puffer gefüllte und an ein Netzgerät angeschlossene

Elektrophoresekammer verbracht.

52

Die PCR-Proben wurden mit je 4 ml Ladepuffer (0,05 %iges Orange G) versetzt. Von

diesem Gemisch wurden je 12 ml in die einzelnen Geltaschen pipettiert. In die erste

Tasche jeder Probenreihe wurde ein 100 bp DNA-Standardgrößenmarker zur

Überprüfung der Länge der PCR-Produkte pipettiert. Die Elektrophorese erfolgte mit

einer Spannung von 60 bis 100 Volt und bei einer Stromstärke von 90 mA für eine

Dauer von 90 bis zu 240 Minuten.

Die Ergebnisse wurden auf einem UV-Transilluminator bei 312 nm Wellenlänge

ausgewertet und mit einer Digitalkamera dokumentiert.

3.4 Mikrosatellitenmarker-gestützte Kopplungsanalyse

Es wurde in beiden Fällen eine genomweite Kopplungsanalyse durchgeführt, um die

Lokalisation der mutierten Gene im Genom der LEW-ci2 bzw. BH.7A-ci3 Ratten bzw.

die mit den jeweiligen Phänotypen assozierten genomischen Regionen ausfindig zu

machen. Hierzu wurde die DNA der Individuen beider Rückkreuzungspopulationen

zunächst mit anonymen Mikrosatellitenmarkern untersucht. Es erfolgte bei jedem N2-

Individuum am jeweiligen Mikrosatellitenlocus eine Zuordnung der Allele zum LEW-

ci2- bzw. BH.7A-ci3- oder BN-Stamm. Somit wurde eine Kopplung des jeweiligen

Locus zu den mutierten Genen bzw. eine Assoziation des jeweiligen Mikrosatelliten

zu dem ci2- bzw. ci3-Phänotypen untersucht (Kapitel 2.5.1).

Für die Kopplungsanalyse standen aufgereinigte Gewebeproben sämtlicher 208

Individuen der (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2 Rückkreuzung zur

Verfügung.

Für die vorläufige grobe Untersuchung des Genoms der BH.7A-ci3 Rattenmutante

wurden die aufgereinigten Gewebeproben der vorab gezüchteten 125 Individuen der

(BN/Ztm x BH.7A/Ztm-ci3)F1 x BH.7A/Ztm-ci3 Rückkreuzungspopulation benutzt. Die

Gewebeproben der neu gezüchteten 154 N2-Individuen standen erst in einem

Zeitraum zur Verfügung (Oktober 2002 bis Juni 2003), als die vorläufige

Untersuchung bereits abgeschlossen war. Aufgrund der Problematik eine

ausreichende Anzahl polymorpher Marker für diese Rückkreuzung zu finden, die für

53

eine Feinkartierung unabdingbar sind (Kapitel 3.4.1), wurden diese Gewebeproben

zunächst einmal für mögliche Nachfolgeuntersuchungen (Kapitel 5.5) zurückgestellt.

3.4.1 Auswahl geeigneter anonymer Mikrosatellitenmarker

Herangezogen wurden Mikrosatellitenmarker, die in der Internet-Datenbank „Rat

Genome Database“ (www.rgd.mcw.edu) samt der für die PCR-Amplifikation

benötigten entsprechenden Primer-Sequenzen für die 20 Autosomen der Ratte

beschrieben sind.

Im Falle der (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2 Rückkreuzung wurden

Mikrosatelliten mit einem durchschnittlichen Markerabstand von 25 cM ausgewählt.

Als Orientierung dienten hierbei beschriebene Polymorphismen von mindestens 5 bp

für die Stämme LEW/Pit und BN/Cup, die am Ztm mit Hilfe der DNA einer LEW/Ztm-

ci2 und einer BN/Ztm Ratte überprüft wurden (Kapitel 3.4.2).

Bei der Auswahl von Mikrosatelliten für die Untersuchung der (BN/Ztm x BH.7A/Ztm-

ci3)F1 x BH.7A/Ztm-ci3 Rückkreuzung konnte nicht auf durch „Rat Genome

Database“ beschriebene Polymorphismen zwischen den Stämmen BN und BH

zurückgegriffen werden, da der Stamm BH nicht in dem Untersuchungspanel der

Datenbank enthalten ist. Entsprechend mussten sämtliche eingesetzten Marker am

Ztm auf Polymorphismen zwischen den Stämmen BH.7A/Ztm-ci3 und BN/Ztm

untersucht werden (Kapitel 3.4.2), wobei sich ein Großteil (über 70 %) als nicht

polymorph erwies.

Folglich wurde bei der Untersuchung der (BN/Ztm x BH.7A/Ztm-ci3)F1 x BH.7A/Ztm-

ci3 Rückkreuzung für jedes Autosom zunächst ein möglichst zentral lokalisierter

Mikrosatellitenmarker herangezogen. Mit Hilfe dieser im Vergleich zu der

Untersuchung der (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2 Rückkreuzung weniger

detaillierten Analyse, sollte im Sinne eines vorläufigen und groben Übersichts- bzw.

„Screening“-Verfahrens das Chromosom identifiziert werden, auf welchem die ci3-

Mutation lokalisiert ist.

54

Nach Bestimmung der entsprechenden Chromosomen wurde in beiden Fällen zur

Eingrenzung der Kandidatenregion (ci3-Mutation) bzw. Feinkartierung der Mutation

(ci2-Mutation) die Anzahl der anonymen Mikrosatelliten erhöht.

Die zur Amplifikation der Mikrosatelliten benötigten Primer wurden als Lyophilisat von

der Firma Roth bezogen und nach Herstellerangaben mit sterilem Aqua dest.

rekonstituiert. Es wurden 100 µl Aliquots 6,7 mM Primerlösungen hergestellt und bei

4 °C gelagert.

3.4.2 Untersuchung der Mikrosatellitenmarker auf Polymorphismen

Alle für die Kopplungsanalysen in Frage kommenden Marker wurden mit Hilfe der

beschriebenen Polymerase-Kettenreaktion- (Kapitel 3.3.3) und Elektrophorese-

Protokolle (Kapitel 3.3.4) und unter Verwendung der DNA der Parentalstämme

LEW/Ztm-ci2 und BN/Ztm bzw. BH.7A/Ztm-ci3 und BN/Ztm sowie der Individuen

beider N2-Populationen auf Polymorphismen getestet.

Ein Marker war für die Analyse geeignet, wenn ein Polymorphismus sowohl zwischen

den jeweiligen Parentalstämmen, als auch bei den N2-Individuen deutlich

differenzierbar war.

55

3.5 Computer- und Datenbank-gestützte genetische Analysen

3.5.1 Identifikation geeigneter funktioneller Kandidatengene

Auf der Suche nach Genen, die ausgelöst durch Veränderungen in der DNA-

Sequenz für die Phänotypen der LEW-ci2 und BH.7A-ci3 Tiere verantwortlich sein

könnten, wurden Informationen aus Genom-Datenbanken der Ratte, des Menschen

und der Maus herangezogen. Nach Ermittlung der zentralen Assoziationsbereiche,

also der genomischen Regionen, die die ci2- bzw. ci3-Muation tragen

(Suszeptibilitätsregionen), wurden diese Regionen des Rattengenoms bzw. die zu

diesen Regionen homologen Bereiche des Menschen- und Mausgenoms auf

geeignete funktionelle Kandidaten untersucht („Comparative Mapping“). Die im

Internet zu Verfügung stehenden und das Genom des Menschen und der Maus

beschreibenden Datenbanken waren insofern hilfreich, als sie deutlich umfangreicher

und vollständiger sind, als die des Rattengenoms (Stand: Mai 2003). Insbesondere

wurde nach Genen gesucht, für die Mutationen beschrieben sind, die zu

Rotationsverhalten (Ratte, Maus), Innenohrdegeneration und Retinopathien führen

können. Ebenso wurde jenen Genen besonderes Augenmerk gewidmet, die für

Faktoren des dopaminergen Systems (z.B. Rezeptoren) kodieren.

Zum Einsatz kam zum einen die Internet Datenbank der „Jackson Laboraties“ (MGI,

www.informatics.jax.org), die genetische Kopplungskarten der Maus und Homologien

zur Ratte beschreibt. Des weiteren standen genetische Kopplungskarten aus den

Datenbanken „Ratmap“ (www.ratmap.gen.gu.se) und „Rat Genome Database“

(www.rgd.mcw.edu) zur Verfügung. Ebenso wurden für die Suche nach

Kandidatengenen die physikalischen und cytogenetischen Karten der Datenbank

„UCSC Genome Bioinformatics“ (genome.ucsc.edu) herangezogen, die das Genom

der Ratte, des Menschen und der Maus beschreiben.

56

3.5.2 Identifikation geeigneter gengekoppelter Mikrosatelliten

Es wurden Mikrosatelliten innerhalb bzw. in direkter Nachbarschaft möglicher

Kandidatengene identifiziert, um die genomische Position dieser Gene und somit ihre

Assoziation mit dem ci2- bzw. ci3-Phänotypen zu ermitteln. Hierzu wurden zunächst

die DNA-Sequenzen der in Frage kommenden Gene über die Internet Datenbank

des „National Center for Biotechnology Information“ (NCBI) (www.ncbi.nlm.nih.gov/)

abgefragt. Anschliessend wurden mittels BLAST (=basic local alignment search tool;

ALTSCHUL et al., 1990) die DNA-Sequenzen von Rattenklonen identifiziert die

Sequenzübereinstimmungen mit diesen Genen aufwiesen.

Bei BLAST handelt es sich um ein Programm, welches in der Lage ist,

Übereinstimmungen zwischen zwei DNA-Sequenzen ausfindig zu machen. Der

Gebrauch sämtlicher nachfolgend erwähnter BLAST-Programme (siehe auch Kapitel

3.5.4 und 3.5.5) erfolgte unter den von NCBI vorgegebenen Standardbedingungen

hinsichtlich der Signifikanz von Sequenzübereinstimmungen (BLAST Search main

parameters; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/newoptions.html). Benutzt wurde

hier das von der NCBI Datenbank angebotene „Blast the Rat Genome“-Programm

(www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/RnBlast.html).

Die Klon-Sequenzen entstammen von Ratten-BAC (= bacterial artificial

chromosome)-Klonen aus dem „CHORI-230 Rat BAC library sequencing” Projekt

(www.chori.org/bacpac/). Sie basieren auf der DNA einer drei Monate alten

weiblichen BN (BN/SsNHsd/MCW) Ratte. Diese Klone repräsentieren in Bakterien

amplifizierte und im Schnitt 250 kb lange Fragmente des Rattengenoms.

Klone, bei denen mittels BLAST Sequenzübereinstimmungen zu den fraglichen

Genen gezeigt werden konnten, entsprechen den Bereichen des Rattengenoms, auf

denen diese Gene lokalisiert sind. Die Sequenz solcher Klone wurde anschließend

auf Mikrosatelliten untersucht, die innerhalb der genomischen Sequenz oder wenige

kb von entsprechenden Genen entfernt auf dem Klon lokalisiert sind. Benutzt wurde

hierbei das Programm „Tandem Repeats Finder“ („Mount Sinai / The Department of

Biomathematical Science“; c3.biomath.mssm.edu/trf.basic.submit.html). Somit

57

konnten Mikrosatelliten mit eindeutiger Kopplung zu den in Frage stehenden

Kandidatengenen ermittelt werden.

3.5.3 Amplifikation der gengekoppelten Mikrosatelliten, Untersuchung

auf SSLPs und Genotypisierung der N2-Individuen

Mit Hilfe des Programms OligoTM4.0 wurden die für die PCR Amplifikation der

gengekoppelten Mikrosatelliten benötigten Primer-Sequenzen identifiziert. Basierend

auf der DNA-Sequenz des entsprechenden Ratten Klons wurden 19-25 bp lange den

gengekoppelten Mikrosatelliten flankierende Primer ermittelt und ihre

Anlagerungstemperatur berechnet. Durch Variation des Abstandes zwischen den

Primern sollte eine Anlagerungstemperatur von 55 bis 60 °C erreicht werden, um

eine ausreichend starke Amplifikation zu erhalten. Mit Hilfe des „Blast the Rat

Genome“-Programms wurde dann untersucht, ob mögliche Kreuzreaktionen mit

anderen Loci im Genom der Ratte zu erwarten waren.

Die entsprechenden Primer wurden als Lyophilisat von der Firma Roth bezogen und

nach Herstellerangaben mit sterilem Aqua dest. rekonstituiert. Es wurden 100 µl

Aliquots 6,7 µM Primerlösungen hergestellt und bei 4 °C gelagert.

Eine Untersuchung der neu identifizierten gengekoppelten Mikrosatelliten auf

Polymorphismen wurde mit Hilfe der oben beschriebenen Polymerase-

Kettenreaktion- (Kapitel 3.3.3) und Elektrophoreseprotokolle (Kapitel 3.3.4) und unter

Verwendung der DNA der Parentalstämme LEW/Ztm-ci2 und BN/Ztm bzw.

BH.7A/Ztm-ci3 und BN/Ztm sowie der N2-Populationen durchgeführt. Zum Einsatz

kamen diejenigen Marker, bei denen ein deutlich sichtbarer SSLP sowohl zwischen

den Parentalstämmen als auch bei den N2-Individuen vorlag.

Anschließend erfolgte bei jedem N2-Individuum für den jeweiligen gengekoppelten

Mikrosatellitenlocus eine Zuordnung der Allele zum LEW-ci2- bzw. BH.7A-ci3- oder

BN-Stamm. Ziel war es, die Assoziation der Mikrosatelliten bzw. der Gene mit den

beiden Phänotypen festzustellen. Ebenso wurde die Kopplung dieser Mikrosatelliten

zu den bereits untersuchten anonymen Mikrosatellitenmarkern untersucht, um eine

58

genetische Kopplungskarte des jeweiligen Chromosoms erstellen und die Position

der einzelnen Marker bzw. Gene ermitteln zu können (Kapitel 3.6.1).

3.5.4 Virtueller Aufbau einer physikalischen Karte der nicht


Nachdem mittels genomweiter Kopplungsanalyse und Feinkartierung die zentrale

Assoziationsregion für den ci2-Phänotypen identifiziert worden war, erfolgte die

Generierung einer physikalischen Karte dieser Region, um die Position weiterer

möglicher Kandidatengene aufzeigen zu können. Ausgehend von den Genen bzw.

ihren genassozierten Mikrosatelliten, die keine Rekombination zum ci2-Phänotypen

mehr zeigten, wurde ein Fragment des Mausgenoms, das die Homologe zu diesen

Rattengenen trägt, von der Datenbank „Ensembl Mouse Genome Server“

(www.ensembl.org/Mus_musculus/exportview) ü b e r n o m m e n . D i e s e 1

Megabasenpaar (Mb) lange DNA-Sequenz des homologen Maus Chromosoms

diente als Gerüst für die physikalische Karte. Zunächst wurden mittels BLAST

(„BLAST the Rat Genome“, NCBI) überlappende Ratten-BAC-Klone („CHORI-230

Rat BAC library sequencing project”) identifiziert, die Sequenzübereinstimmung zu

dem 1 Mb langen Maus Fragment aufwiesen und somit dem zu diesen Fragment

homologen Bereich des Rattengenoms entsprachen. Solch ein aus überlappenden

Klonen entstandener Strang wird als „Contig“ bezeichnet. Zusätzlich erfolgte eine

Verankerung der Rattenklone untereinander durch Sequenzvergleiche ihrer

überlappenden Enden mittels des Programms „BLAST 2 Sequences“ (NCBI

Datenbank; www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html).

Im zweiten Schritt erfolgte ebenfalls mit Hilfe des „BLAST the Rat Genome“

Programms die Identifikation von exprimierten Gensequenzen der Ratte, die sowohl

zu dem Mausgenomfragment, als auch zu den entsprechenden Rattenklonen

Sequenzübereinstimmung aufwiesen. Auf diese Weise sollte die Position dieser

Gene innerhalb der Klone und somit innerhalb des Rattengenoms ermittelt werden.

59

Absch l ießend er fo lg te unter E insatz der NCBI-Programme

„BLAST the Mouse Genome“ (www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/MmBlast.html) und

„BLAST the Human Genome“ (www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq

/page.cgi?F=HsBlast.html&&ORG=Hs) die Identifikation von exprimierten

Gensequenzen des Menschen und der Maus, die ebensfal ls

Sequenzübereinstimmungen zu den untereinander verankerten Ratten-Klonen

aufwiesen. Somit sollten Homologien zwischen den Genomen von Ratte, Mensch

und Maus aufgezeigt werden. Zudem war die Sequenzierung des Rattengenoms

zum Zeitpunkt dieser Untersuchung (Oktober/November 2002) noch nicht

abgeschlossen. Durch den Vergleich mit dem Menschen und der Maus sollten somit

zusätzliche Gensequenzen innerhalb der Klone identifiziert werden, die zwar noch

nicht für die Ratte, wohl aber für den Menschen und/oder die Maus bereits

beschrieben sind.

3.5.5 Nachweis einzelner Exone eines Kanidatengens im Genom der

BH.7A/Ztm-ci3 Ratte

Es sollte geprüft werden, ob ein mögliches Kandidatengen für den ci3-Phänotypen im

Genom der BH.7A-ci3 Ratte nachweisbar ist. Hierzu erfolgte eine Amplifikation

einzelner Exone dieses Gens mittels PCR unter Verwendung der DNA von

BH.7A-ci3 Ratten. Es wurden zunächst Ratten-BAC-Klone („CHORI-230 Rat BAC

library sequencing project”) identifiziert („BLAST the Rat Genome“), welche sowohl

die flankierende Sequenz des Gens als auch dessen Intronregionen und die

exprimierten genomischen Bereiche beinhalteten. Basierend auf der Sequenz

solcher Klone wurden anschließend mit Hilfe des Programms OligoTM4.0 die zur

Amplifikation benötigten Primersequenzen, die jeweils direkt vor bzw. hinter einem

Exon in den dazwischen liegenden Intronbereichen binden ermittelt. Bei der

Ermittlung der optimalen Anlagerungstemperatur und Überprüfung auf

Kreuzreaktionen wurde die in Kapitel 3.5.3 beschriebene Strategie übernommen.

60

Die entsprechenden Primer wurden als Lyophilisat von der Firma Roth bezogen und

wie in Kapitel 3.5.3 beschreiben rekonstituiert und gelagert.

Die PCR-Amplifkation und der anschließende Nachweis der PCR Produkte im

Agarosegel erfolgte gemäß den oben beschriebenen Protokollen (Kapitel 3.3.3 und

3.3.4).

Zusätzlich wurden die Exone auch unter Verwendung von DNA des congenen

Hintergrundstammes BH.7A/Ztm bzw. auch des Inzuchtstammes BH/Ztm mittels

PCR amplifiziert. Diese PCR Produkte dienten als Kontrollen. Aus dem Vergleich der

im 3 %igen Agarosegel zu detektierenden Produktlängen identischer Exone, die

jeweils unter Verwendung von DNA des mutierten Rattenstammes und des

entsprechenden Hintergrundstammes amplifiziert wurden, sollten Rückschlüsse auf

mögliche Deletionen beim mutierten Stamm innerhalb der einzelnen Exone gezogen

werden können.

61

3.6 Statistische Auswertung

3.6.1 Statistische Auswertung der genetischen Analysen

Mit Hilfe des Programms StatViewTM5.0 wurden die bei der Mikrosatellitenmarker-

gestützten Kopplungsanalyse erhobenen Daten ausgewertet. Sämtliche verwendeten

Marker wurden bei den Individuen beider Rückkreuzungspopulationen unter

Verwendung des c2-Tests auf Kopplung zur ci2- bzw. ci3-Mutation untersucht. Dabei

wurden die N2-Individuen in zwei Gruppen, bestehend aus homozygoten und

heterozygoten Merkmalsträgern, aufgeteilt. Da es sich in beiden Fällen um

Rückkreuzungspopulationen handelte, waren pro Markerlocus innerhalb der beiden

Gruppen homozygote LEW-ci2- bzw. BH.7A-ci3- und heterozygote LEW-ci2/BN-

bzw. BH.7A-ci3/BN-Genotypen im Verhältnis 1:1 zu erwarten. Mittels des c2-Tests

wurden die beobachteten Werte auf Abweichungen von dem erwarteten

Verteilungsverhältnis überprüft. Ein Wert von p £ 0,05 galt dabei als ein Hinweis auf

Abweichung vom zu erwarteten Verhältnis. Ein Überwiegen an homozygoten LEW-

ci2- bzw. BH.7A-ci3-Genotypen in der Gruppe der betroffenen N2-Individuen galt

wiederum als Hinweis auf eine Kopplung des Markers zur ci2- bzw. ci3-Mutation.

Diejenigen Mikrosatelliten, die eine Kopplung zur jeweiligen Mutation und somit eine

Assoziation mit dem jeweiligen Phänotyp zeigten, wurden unter Verwendung des

Programms JoinMapTM2.0 zu Kopplungsgruppen zusammen gefaßt. Ziel war es

hierbei eine genetische Kopplungskarte des Merkmal-tragenden Rattenchromosoms

zu erstellen. Berechnet wurde basierend auf der Rekombinationsfrequenz die relative

Entfernung zwischen den einzelnen Mikrosatelliten in cM.

Die graphische Darstellung der Kopplungskarten erfolgte mit Hilfe des Programms

MapChartTM2.0. Die c2-Werte der Mikrosatelliten, die Bestandteil dieser

Kopplungskarten sind, wurden für die graphische Darstellung in „logarithm of the

odds“ (LOD)-Score-Werte umgerechnet (c2-Wert/4,6052; LIU, 1998).

62

3.6.2 Statistische Auswertung der Verhaltensuntersuchungen

Die bei beiden Verhaltensuntersuchungen zur Überprüfung der Sehfähigkeit (Kapitel

3.2.2) ermittelten Daten wurden ebenfalls mit Hilfe des Programms StatViewTM5.0

ausgewertet. Diese Daten wurden einer einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) mit

dem Faktor „Genotyp“ unterzogen, um signifikante Unterschiede im Verhalten der

nicht betroffenen und der den ci2-Phänotypen aufweisenden N2-Tiere festzustellen.

Ein Wert von p £ 0,05 galt dabei als signifikant.

Bei Feststellung signifikanter Unterschiede wurden die entsprechenden Daten

zusätzlich durch einen posthoc-Test ausgewertet. Dabei handelte es sich um den

Fisher´s PLSD Test. Die mit diesem Test ermittelten möglichen signifikanten

Unterschiede der Gruppe der Ratten mit ci2-Phänotyp gegenüber der Gruppe der

nicht betroffenen Ratten wurden nach folgendem Schlüssel in den Abbildungen in

Kapitel 4.1.3 dargestellt: * = p £ 0,05; ** = p £ 0,01; *** = p £ 0,001.

Alle Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler dargestellt.

63

3.7 Lösungen und Reagenzien

3.7.1 DNA Aufarbeitung

„NucleoSpinTM Tissue kit“ Firma Macherey-Nagel, Düren, Deutschland

bestehend aus:

Pre-Lysispuffer T1

Proteinase K

Lysispuffer B3

1. Waschpuffer BW

2. Waschpuffer B5

Elutionspuffers BE

Ethanol (96%) Firma Merck, Darmstadt, Deutschland

3.7.2 PCR

MgCl2-Lösung, Reaktionspuffer Y, Firma Peqlab Biotechnologie, Erlangen,

dNTP-Gemisch, Deutschland

SAWDAY Taq-DNA-PolymeraseTM

Primer Firma Roth, Karlsruhe, Deutschland

DNA-Standardgrößenmarker Firma Roche, Basel, Schweiz

„DNA Molecular Weight Marker

XIV, 100 base pair lader“

64

3.7.3 Elektrophorese

Agarose „NuSieveTM 3:1" Firma Bio Whittaker Molecular Applications,

Rockland (Me), USA

10 x TBE (pH-Wert 8,3)

bestehend aus:

Tris(hydroxymethyl)- Firma Roth, Karlsruhe, Deutschland

aminomethan (89 mM)

Borsäure (89 mM) Firma Roth, Karlsruhe, Deutschland

EDTA (2 mM) Firma Roth, Karlsruhe, Deutschland

Ethidiumbromidlösung (10 mg/ml) Firma Serva, Heidelberg, Deutschland

„Gel Star“ (10.000fach konzentriert) Firma Biozym, Hessisch Oldendorf,

Deutschland

Ladepuffer Orange G

Bestehend aus:

Glycerin (99 %) Firma Serva, Heidelberg, Deutschland

Orange G Firma Sigma, St.Louis (Mo), USA

Aqua dest. (steril) Eigenproduktion

65

3.8 Geräte und Verbrauchsmaterialien

3.8.1 Geräte

Biofuge „fresco“ Firma Heraeus Instruments, Osterode, Deutschland

Digitalkamera „DC 120 Zoom“ Firma Kodak, Rochester (N.Y.), USA

Elektrophoresekammer Forschungswerkstätten, Medizinische Hochschule

Hannover, Deutschland

Magnetrührer „MR 2002“ Firma Heildolph, Schwabach, Deutschland

Mikrowelle „R-2V16“ Firma Sharp (Europe), Hamburg, Deutschland

Netzgerät „PP2200“ Firma Biometra, Göttingen, Deutschland

Netzgerät „Desatronic“ Firma, Desaga, Heidelberg, Deutschland

Open Field 105 x 40 cm Forschungswerkstätten, Medizinische Hochschule

Hannover, Deutschland

Photometer „GeneQuant II“ Firma Pharmacia Biotech, Cambridge, England

Shuttle-Box „Passive Firma TSE-Systems, Bad Homburg, Deutschland

Avoidence System“

Thermocycler „PTC-200“ Firma MJ Research, Watertown (Ma), USA

Thermomixer „5436“ Firma Eppendorf-Nethler-Hinz, Hamburg,

Deutschland

UV-Transilluminator 312 nm Firma Bachofer, Reutlingen, Deutschland

Vortex „Vibrofix VF1“ Firma Janke & Kunkel, Staufen, Deutschland

66

3.8.2 Verbrauchsmaterialien

Pipetten Firma Eppendorf, Köln, Deutschland

Firma Gilson, Middelton (Wi), USA

Pipetenspitzen Firma Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland

Firma Roth, Karlsruhe, Deutschland

Reaktionsgefäße Firma Eppendorf, Köln, Deutschland

Silicium-Gelmembran-Säulen Firma Macherey-Nagel, Düren, Deutschland

Silikonmatten „Thermosprint" Firma Bilatec, Mannheim, Deutschland

96er-Mikrotiterplatten Firma Roth, Karlsruhe, Deutschland

„Multi-Rigid Ultra Plates“

3.9 Statistik- und Genetik-Programme

JoinMapTM2.0 Anbieter: Centre for Plant Breeding and

Reproduction Research (CPRO-DLO),

Wageningen, Holland

MapChartTM2.0 Anbieter: CPRO-DLO, Wageningen, Holland

OligoTM4.0 Anbieter: Molecular Biology Insights, Cascade (Co),

USA

StatViewTM5.0 Anbieter: SAS Institute, Cary (NC), USA

67

3.10 World-Wide-Web Adressen

http://www.rgd.mcw.edu (Rat Genome Database)

http://www.informatics.jax.org (Jackson Laboratories Mouse Genome Informatics)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ (National Center for Biotechnology Information)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html (NCBI Blast 2 Sequences)

http://www.ratmap.gen.gu.se (Ratmap)

http://c3.biomath.mssm.edu/trf.basic.submit.html (Tandem Repeats Finder)

http://www.ensembl.org/Mus_musculus/exportview(Ensembl Mouse Genome Server)

http://genome.ucsc.edu/ (UCSC Genome Bioinformatics)

http:// www.chori.org/bacpac/ (BACPAC Resources)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/RnBlast.html (NCBI Rat Genome Blast)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/MmBlast.html (NCBI Mouse Genome Blast)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/page.cgi?F=HsBlast.html&&ORG=Hs

(NCBI Human Genome Blast)

http://www.well.ox.ac.uk/~bihoreau/ (Genetic Linkage Maps of the Rat Genome

(1997))

68

4. Ergebnisse

4.1 Neurophysiologische Verhaltensuntersuchungen

4.1.1 Untersuchung des Rotationsverhaltens

Es wurden sämtliche im Verlauf dieser Arbeit gezüchteten Individuen der (LEW/Ztm-

ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2 Rückkreuzung (n=55) untersucht. Die Tiere waren

zum Zeitpunkt der Untersuchung zwischen 6 und 10 Wochen alt.

Bei der Untersuchung sowohl im gewohnten Heimatkäfig, als auch in der „Open

Field“-Apparatur zeigten 26 der N2-Tiere das für die ci2-Mutation charakteristische

Rotationsmuster (anfallsartige, wiederholte, enge Rotationen). Bei den restlichen 29

N2-Ratten konnte solch ein Verhalten weder im Heimatkäfig, noch im „Open Field“

registriert werden (Anhang Tabelle 9).

Ebenso wurden sämtliche im Verlauf dieser Arbeit gezüchteten Individuen der

(BN/Ztm x BH.7A/Ztm-ci3)F1 x BH.7A/Ztm-ci3 Rückkreuzung (n=154) untersucht. Die

Tiere waren zum Zeitpunkt der Untersuchung zwischen 4 und 8 Wochen alt.

Bei der Untersuchung sowohl im gewohnten Heimatkäfig als auch in der „Open Field“

Apparatur zeigten 73 der N2-Tiere das für die ci3-Mutation charakteristische

Rotationsmuster (anfallsartige, wiederholte, enge Rotationen). Bei den restlichen 81

N2-Ratten konnte solch ein Verhalten weder im Käfig noch im „Open Field“ registriert

werden (Anhang Tabelle 10).

69

4.1.2 Untersuchung des auditiven und vestibulären Systems der


Die 55 N2-Individuen waren zum Zeitpunkt der folgenden Untersuchungen (Kapitel

4.1.2.1 bis 4.1.2.4) zwischen 6 und 10 Wochen alt.

4.1.2.1 Akustischer Stimulus

Die 29 Tiere ohne Rotationsverhalten zeigten alle eine Schreckreaktion auf einen

akustischen Stimulus hin, während solch eine Reaktion bei den übrigen 26 Tieren

auch bei wiederholtem Stimulus nicht auszulösen war (Anhang Tabelle 9).

4.1.2.2 „Air-Righting”-Test

Beim „Air-Righting“-Test landeten alle 29 Tiere, die kein Rotationsverhalten

aufwiesen, bei mindestens zwei von drei Versuchen auf ihren Gliedmaßen. Die

übrigen 26 Ratten besaßen bei allen drei Versuchen nicht die Fähigkeit, sich auf der

kurzen Fallstrecke so zu drehen, dass sie auf den Gliedmaßen landeten (Anhang

Tabelle 9).

4.1.2.3 „Balance“-Test

Ein ähnliches Bild ergab sich beim „Balance“-Test. Alle 29 Ratten, die kein

Rotationsverhalten zeigten, besaßen die Fähigkeit, mit ausgestreckten Gliedmaßen

die Bewegungen des Käfigs auszugleichen. Die Tiere, die Rotationsverhalten

aufwiesen, waren dazu nicht in der Lage (Anhang Tabelle 9).

70

4.1.2.4 Schwimmtest

Auch beim Schwimmtest konnte bei den N2-Tieren ohne Rotationsverhalten keine

Beeinträchtigung festgestellt werden. Alle 29 Ratten waren in der Lage, sich durch

Schwimmbewegungen während des Untersuchungszeitraums von fünf Minuten über

Wasser zu halten. Die übrigen 26 Tiere zeigten deutliche Einschränkungen in ihrer

Schwimmfähigkeit. Fünfundzwanzig dieser Ratten begannen direkt, nachdem sie ins

Wasser verbracht worden waren mit Rotationsbewegungen um die eigene

Längsachse und tauchten korkenzieherförmig ab, so dass eine sofortige Entnahme

aus dem Wasserbecken zwingend erforderlich war. Bei einem N2-Tier mit

Rotationsverhalten war eine Abweichung feststellbar. Diese Ratte begann zwar auch

mit Rotationen um die Längsachse unmittelbar nach Verbringung in das

Wasserbecken. Nachdem sie jedoch einmal abgetaucht war, kam sie wieder an die

Wasseroberfläche und war in der Lage, sich mühsam und kurzfristig mit kreiselnden

und rotierenden Schwimmbewegungen an der Wasseroberfläche zu halten. Da das

Tier jedoch immer wieder zwischendurch abtauchte, wurde die Beobachtung nach 30

Sekunden abgebrochen.

Daraufhin wurden die N2-Tiere mit Rotationsverhalten nach ca. sechs Wochen

wiederholt diesem Schwimmtest unterzogen. Hierbei zeigten fünf weitere Ratten

diese zuvor nur bei einem Tier beobachtete Form der partiellen Schwimmfähigkeit

(Anhang Tabelle 9).

71

4.1.3 Überprüfung der Sehfähigkeit der (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1x

LEW/Ztm-ci2 Ratten

Die N2-Individuen waren zum Zeitpunkt der folgenden Untersuchungen (Kapitel

4.1.3.1 und 4.1.3.2) zwischen 3 und 5 Monate alt.

4.1.3.1 Verhalten der Tiere an einer sichtbaren Kante (modifizierter


Es wurde das Verhalten der 55 im Verlauf dieser Arbeit gezüchteten N2-Individuen

bei der Positionierung auf einem Rundhocker untersucht. Dabei handelte es sich um

26 Tiere, die den ci2-Phänotypen (Rotationsverhalten; Defizite in der Funktion des

vestibulären Systems) aufwiesen, und 29 Tiere, die bei den vorherigen

Untersuchungen (Kapitel 4.1.1 und 4.1.2) keine Verhaltensaufälligkeiten besaßen.

Bei allen vier ausgewerteten Parametern ließen sich signifikante Unterschiede im

Verhalten beider Gruppen feststellen.

Zunächst wurde die Latenzzeit für die Verhaltensweise „Head Dipping“ protokolliert.

Hierbei zeigten die 29 N2-Individuen ohne Rotationsverhalten eine signifikant kürzere

Latenzzeit.

Zwanzig der insgesamt 26 N2-Individuen, die den ci2-Phänotypen aufwiesen,

stürzten zwischen ein- und fünfmal an der Hockerkante. Nur eines der 29 nicht

betroffenen Tiere stürzte einmalig.

Des Weiteren blickten die 29 nicht betroffenen N2-Tiere signifikant häufiger an der

Kante des Hockers stehend von dieser auf den Boden und die Umgebung herab

(„Head Dipping“-Verhalten).

Die Anzahl abgesetzter Kot-Boli war bei den 26 N2-Individuen, die den ci2-

Phänotypen aufwiesen, größer, als bei den 29 nicht betroffenen Individuen.

72

Die einfaktorielle Varianazanalyse ergab eine signifikant längere Latenzzeit der

Ratten, die den ci2-Phänotypen aufwiesen bis zum Verhalten „Head Dipping“ (F(1,

53)=11,28; p=0,002; Abb.1).

Abb1: Latenzzeit bis zum Erreichen der sichtbaren Kante im modifizierten

„Visual-Cliff“-Test

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Sekunden

nicht betroffen ci2-Phänotyp

**

73

Zwanzig der 26 betroffenen N2-Ratten stürzten zwischen ein- und fünfmal. Diese

Stürze ergaben sich zum einen daraus, dass die Tiere von der Mitte der Sitzfläche

aus auf die Kante des Hockers zu liefen und ohne abzubremsen über diese

hinwegtraten. Zum anderen zeigten sie ein besonders tiefes Eintauchen des Kopfes

über die Kante hinweg („Head Dipping“), welches anschließend zum Sturz führte.

Nur ein Tier aus der Gruppe der nicht betroffenen N2-Ratten stürzte einmalig bei

dem Versuch sich direkt an der Kante umzudrehen, wobei es den Halt mit den

hinteren Extremitäten verlor. Die einfaktorielle Varianzanalyse ergab für diesen

Parameter einen signifikanten Unterschied zwischen den Tieren mit ci2-Phänotyp

und den nicht betroffenen Ratten (F(1, 53)=35,76; p<0,0001; Abb.2).

Abb.2: Anzahl der Stürze im modifizierten „Visual-Cliff“-Test

0

0,25

0,5

0,75

1

1,25

1,5

1,75

2

2,25

Stürze


***

74

Die einfaktorielle Varianzanalyse ergab eine signifikant höhere Frequenz der

Verhaltensweise „Head Dipping“ bei den nicht betroffenen N2-Tieren (F(1, 53)=15,3;

p=0,0003; Abb.3).

Abb.3: Häufigkeit des „Head Dipping“-Verhaltens im modifizierten „Visual-Cliff“-

Test

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Head D

ippingnicht betroffen ci2-Phänotyp

***

75

Die einfaktorielle Varianzanalyse ergab für den Parameter „Kot-Boli“ einen

signifikanten Unterschied zwischen den Tieren mit ci2-Phänotyp und den nicht

betroffenen Ratten (F(1, 53)=6,47; p=0,01; Abb.4).

Abb.4: Anzahl der abgesetzten Kot-Boli im modifizierten „Visual-Cliff“-Test

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8 Kot -B

olinicht betroffen ci2-Phänotyp

*

76

4.1.3.2 Hell-Dunkel-Transfer-Test

Diese Untersuchung wurde lediglich mit jeweils 10 N2-Individuen, die den ci2-

Phänotypen aufwiesen und 10 nicht betroffenen N2-Individuen durchgeführt, um die

Hinweise aus dem vorherigen Test (Kapitel 4.1.3.1) zu prüfen. Hierbei wurden

signifikante Unterschiede hinsichtlich der Latenzzeit bis zum Übergang in das dunkle

Kompartiment und dem Parameter „Eintauchen des Kopfes in das dunkle

Kompartiment“ festgestellt.

Die einfaktorielle Varianzanalyse ergab eine signifikant längere Latenzzeit der 10

Ratten, die den ci2-Phänotypen aufwiesen, bis zum Übergang in das dunkle

Kompartiment (F(1, 8)=7,23; p=0,015; Abb.5).

Abb.5: Latenzzeit während des Hell-Dunkel-Transfer-Tests

0

20

40

60

80

100

120

140 S

ekunden


*160

77

Nur die N2-Tiere, die den ci2-Phänotypen aufwiesen, zeigten ein Eintauchen des

Kopfes in das dunkle Kompartiment, ohne dieses im Anschluss zu betreten. Die

einfaktorielle Varianzanalyse ergab für diesen Parameter einen signifikanten

Unterschied zwischen den Tieren mit ci2-Phänotyp und den nicht betroffenen Ratten

(F(1, 8)=9,85: p=0,006; Abb.6).

Abb.6: Anzahl der Eintauchvorgänge in das dunkle Kompartiment während des

Hell-Dunkel-Transfer-Tests

0

0,25

0,5

0,75

1

1,25

1,5

1,75

2

2,25

2,5

Eintauchen


**

78

Die einfaktorielle Varianzanalyse ergab für den Parameter „Kot-Boli“ keinen

signifikanten Unterschied zwischen den Tieren mit ci2-Phänotyp und den nicht

betroffenen Ratten (F(1, 8)=2,67; 0,1198; Abb.7).

Abb.7: Anzahl der abgesetzten Kot-Boli während des Hell-Dunkel-Transfer-

Tests

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

Kot-B

oli


79

4.2 Mikrosatellitenmarker-gestützte Kopplungsanalyse

Von den 208 Ratten der (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2 Rückkreuzung,

die für die Kopplungsanalyse zur Verfügung standen, zeigten 94 die phänotypischen

Charakteristika der ci2-Mutation.

Neunundfünfzig der vorab gezüchteten 125 Ratten der (BN/Ztm x BH.7A/Ztm-ci3)F1

x BH.7A/Ztm-ci3 Rückkreuzung, die für die Kopplungsanalyse eingesetzt wurden,

wiesen den ci3-Phänotypen auf.

Somit lag die Inzidenz bezüglich des ci2-Phänotypen bei 45,2 % und bezüglich des

ci3-Phänotypen bei 46,8 %.

4.2.1 Anonyme Mikrosatellitenmarker und Assoziation mit den

Phänotypen

Die DNA der (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2 Tiere wurde insgesamt mit

86 anonymen und für diese Kreuzung polymorphen Mikrosatellitenmarkern

untersucht (Tabelle 2 und Anhang Tabelle 11). Im Falle der (BN/Ztm x BH.7A/Ztm-

ci3)F1 x BH.7A/Ztm-ci3 Rückkreuzung kamen 32 anonyme und für diese Population

polymorphe Marker zum Einsatz (Tabelle 3 und Anhang Tabelle 12).

(LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2:

Die Auswertung der erhobenen Daten mit dem c2-Tests ergab insgesamt keine

signifikanten p-Werte für die auf den Rattenchromosomen (RNO) 1 bis 9 und 11 bis

20 lokalisierten Marker mit Ausnahme der Marker D1Mit2, D4Mgh3, D8Mit7,

D19Mgh2 und D19Rat17. Für diese Marker wurde ein signifikanter p-Wert (p£0,05)

ermittelt (Anhang Tabelle 11).

Im Gegensatz zu D1Mit2, D4Mgh3 und D8Mit7 zeigten sämtliche übrigen Marker auf

den Chromosomen 1, 4 und 8 keine signifikanten Abweichungen von dem zu

erwarteten Genotypenverhältnis (1:1).

80

Die bei den Markern D19Mgh2 und D19Rat17 festgestellte signifikante Abweichung

ergab sich daraus, dass bei diesen Markern eine größere Anzahl an heterozygoten

LEW-ci2/BN-Genotypen in der Gruppe der den ci2-Phänotypen aufweisenden

Individuen vorlag.

Für sämtliche 18 auf RNO10 lokalisierten Mikrosatellitenmarker konnte eine

signifikante Abweichung (p<0,0001; Ausnahme: D10Rat218; p=0.0144) vom zu

erwarteten Genotypenverhältnis mittels c2-Tests errechnet werden. Es zeigte sich ein

stetiger Anstieg der c2-Werte bzw. LOD-Score-Werte zum zentralen Bereich des

Chromosoms hin. Der Marker D10Rat164 zeigte dabei die stärkste Assoziation mit

dem ci2-Phänotypen („Peak Marker“). An diesem Locus rekombinierten vier der 94

den ci2-Phänotypen aufweisenden N2-Individuen (Tabelle 2 und Anhang Tabelle 14).

Die in Tabelle 2 beschriebenen Lokalisationen der RNO10 Mikrosatellitenmarker sind

mit Hilfe des Programms JoinMapTM2.0 errechnet worden.

Tabelle 2: Untersuchte Mikrosatellitenmarker auf dem Rattenchromosom 10

SSLP-Marker c2-Wert p-Wert Chromosom Lokalisation in cM

D10Rat218 5,988 0,0144 RNO10 0D10Rat47 18,294 < 0,0001 RNO10 5,1D10Rat45 24,092 < 0,0001 RNO10 13,3D10Mgh10 96,702 < 0,0001 RNO10 32,5D10Rat168 90,906 < 0,0001 RNO10 35,2D10Rat171 106,502 < 0,0001 RNO10 38,7D10Rat164 121,149 < 0,0001 RNO10 41,2D10Rat166 116,041 < 0,0001 RNO10 42,1D10Rat126 119,605 < 0,0001 RNO10 42,1D10Rat32 116,044 < 0,0001 RNO10 47,8

D10Rat116 113,266 < 0,0001 RNO10 48,8D10Rat31 104,292 < 0,0001 RNO10 50,1D10Mgh6 111,768 < 0,0001 RNO10 53,5D10Mit2 93,264 < 0,0001 RNO10 55,7

D10Rat26 85,076 < 0,0001 RNO10 59D10Ppy 46,133 < 0,0001 RNO10 75,2

D10Mgh4 23,768 < 0,0001 RNO10 85,1

81

(BN/Ztm x BH.7A/Ztm-ci3)F1 x BH.7A/Ztm-ci3:

Die Auswertung der erhobenen Daten mit dem c2-Test ergab insgesamt keine

Hinweise auf Kopplung zu der ci3-Mutation für die auf den Chromosomen 1 bis 10

und 12 bis 20 lokalisierten Marker. Sämtliche auf diesen Chromosomen untersuchten

Marker zeigten keine signifikanten Abweichungen von dem zu erwarteten

Genotypenverhältnis (1:1) (Anhang Tabelle 12).

Von 21 untersuchten RNO11-Markern erwiesen sich 12 als polymorph für die

eingesetzte Rückkreuzung. Für sämtliche dieser 12 Mikrosatellitenmarker konnte

eine signifikante Abweichung (p<0,0001; Ausnahme: D11Wox6, p=0.0019) von dem

zu erwarteten Genotypenverhältnis mittels c2-Tests errechnet werden. Der Marker

D11Rat67 zeigte dabei die stärkste Assoziation mit dem ci3-Phänotypen („Peak

Marker“). An diesem Locus rekombinierten fünf der 59 den ci3-Phänotypen

aufweisenden N2-Individuen (Tabelle 3 und Anhang Tabelle 15).

Die in Tabelle 3 beschriebenen Lokalisationen der RNO11 Mikrosatellitenmarker sind

mit Hilfe des Programms JoinMapTM2.0 errechnet worden.

Tabelle 3: Untersuchte Mikrosatellitenmarker auf dem Rattenchromosom 11


D11Rat28 35,967 < 0,0001 RNO11 0D11Rat27 38,272 < 0,0001 RNO11 2,4D11Mit4 52,705 < 0,0001 RNO11 10,2

D11Rat24 47,53 < 0,0001 RNO11 14,1D11Rat67 57,234 < 0,0001 RNO11 18,8D11Rat10 54,075 < 0,0001 RNO11 20,1D11Rat65 37,078 < 0,0001 RNO11 27,7D11Mgh4 44,661 < 0,0001 RNO11 29,8D11Rat93 34,718 < 0,0001 RNO11 33,1D11Mgh3 31,582 < 0,0001 RNO11 33,9D11Rat56 19,796 < 0,0001 RNO11 42,7D11Wox6 9,598 0,0019 RNO11 53,9

82

4.3 Computer- und Datenbank-gestützte genetische Analysen

4.3.1 Identifikation geeigneter funktioneller Kandidatengene

Eine vergleichende Betrachtung des Ratten-, Menschen- und Mausgenoms

(„Comparative Mapping“) wurde anhand der Datenbank der „Jackson Laboratories“

(MGI) und der „UCSC Genome Bioinformatics“ Datenbank vorgenommen.

Kandidatengene für die LEW-ci2 Ratte:

Die zentrale Assoziationsregion mit dem ci2-Phänotypen auf RNO10, markiert durch

D10Rat164, weist homologe Regionen auf dem Chromosom 17 des Menschen

(HSA17) und dem Chromosom 11 der Maus (MMU11) auf (MGI). Als

Kandidatengene für die taubblinde LEW-ci2 Ratte kam aufgrund seiner Funktion und

der beschriebenen Mutationen (Kapitel 2.4.1) insbesondere Myo15 sowie ein

weiteres für ein unkonventionelles Myosin kodierendes Gen (Myo1c; Synonym:

Myr4) in Betracht. Laut MGI sind diese beiden Gene bei 33,9 cM (Myo15) und 44,13

cM (Myo1c) auf MMU11 lokalisiert. Die homologen Gene des Menschen kartieren

gemäß der „UCSC Genome Bioinformatics“ Datenbank bei 17p11.2 (MYO15A) und

17p13.3 (MYO1C) auf HSA17.

Kandidatengene für die BH.7A-ci3 Ratte:

Die zentrale Assoziationsregion mit dem ci3-Phänotypen auf RNO11, markiert durch

D11Rat67, besitzt ihre homologen Regionen auf HSA3 und MMU16 (MGI). Aufgrund

seiner Lokalisation auf MMU16 (von bp 45 833 129 bis bp 45 846 531; „UCSC

Genome Bioinformatics“) und Funktion (Kapitel 5.2.2.1.1) kam das Gen Tagln3,

welches für das Neuroprotein Transgelin 3 kodiert, als Kandidatengen für den ci3-

Phänotypen in Betracht.

83

Nach Angaben „UCSC Genome Bioinformatics“ Datenbank ist das Drd3 Gen auf

RNO11 mit einem Abstand von ca. 5 Mb zu D11Rat67 lokalisiert. Dieses Gen kodiert

für den Dopamin D3-Rezeptor (Kapitel 2.4.3) und ist somit ein mögliches

Kandidatengen für die BH.7A-ci3 Ratte, bei der Abnormitäten im dopaminergen

Systems nachgewiesen worden waren (Kapitel 2.2).

4.3.2 Identifikation geeigneter gengekoppelter Mikrosatelliten

Mikrosatelliten für die Kandidatengene der LEW-ci2 Ratte:

Es wurde nach gengekoppelten Mikrosatelliten für die Kandidatengene Myo1c und

Myo15 gesucht. Des Weiteren sollten gengekoppelte Mikrosatelliten für die in

direkter Nachbarschaft zu Myo15 lokalisierten Gene Znf179 und Aldh3a1 identifiziert

werden (Zfp179: 34,35 cM; Aldh3a1 34,25 cM; Genetische Kopplungskarte von

MMU11; MGI). Diese sollten zur Absicherung der Position von Myo15 mitkartiert

werden.

Die von der Maus bekannte cDNA-Sequenz von Myo15 (NM_010862; PROBST et

al., 1998; LIANG et al., 1999) wurde für die Untersuchung benutzt, da die Sequenz

der Ratte noch nicht beschrieben ist (Stand Mai 2003). Mittels BLAST wurden

ca. 90 % dieser cDNA-Sequenz auf den Ratten Klonen CH230-5O22/AC129460 und

CH230-38B5/AC120677 wiedergefunden. Die Sequenz beider Klone beinhaltet einen

(AC)20-Mikrosatelliten, der basierend auf dem Vergleich mit dem humanen MYO15A

(UCSC Genome Bioinformatics Datenbank) zwischen Exon 36 und 37 lokalisiert ist.

Der Klon CH230-10J14/AC095925 enthält die für die Ratte beschriebene cDNA-

Sequenz von Znf179 (NM_138613; MATSUDA et al., 1996; INOUE et al., 1997).

Etwa sechs kb stromabwärts dieser cDNA Sequenz konnte ein (AC)170-Mikrosatellit

identifiziert werden.

Die Ratten cDNA-Sequenz von Aldh3a1 (NM_0311972; JONES et al., 1988; ASMAN

et al., 1993) sowie ein (AG)29-Mikrosatellit sind innerhalb der Sequenz des Klons

CH230-6D21/AC094934 vorzufinden. Ein Vergleich mit dem humanen ALDH3A1

84

(„UCSC Genome Bioinformatics“) erbrachte, dass dieser Mikrosatellit zwischen Exon

sechs und sieben des Gens lokalisiert ist. Mit einem physikalischen Abstand von ca.

29 kb zu Aldh3a1 konnte auch die Ratten-Sequenz von Aldh3a2 (NM_031731;

MIYAUCHI et al., 1991) auf diesem Klon identifiziert werden.

Die Sequenz des Klons CH230-256G19/AC111613 beinhaltet die Ratten cDNA-

Sequenz von Myo1c (Synonym: Myr4; NM_012983; BAHLER et al., 1994). Ebenso

sind zwei hintereinander lokalisierte Mikrosatelliten ((CT)30, (CA)20) auf diesem Klon

detektierbar. Der physikalische Abstand zwischen diesen Mikrosatelliten und der

Sequenz des Gens beträgt ca. 7 kb.

Mikrosatelliten für die Kandidatengene der BH.7A-ci3 Ratte:

Mikrosatelliten innerhalb der Sequenz der beiden möglichen Kandidatengene Tagln3

und Drd3 sollten identifiziert werden. Des Weiteren wurde nach einem Mikrosatelliten

innerhalb der Sequenz von Morc (33,7 cM; Genetische Kopplungskarte von MMU16;

MGI), einem Nachbargen von Tagln3, gesucht. Dieses sollte zur Absicherung der

Position von Tagln3 mitkartiert werden.

Die cDNA-Sequenz von Tagln3 (NM_031676; FAN et al., 2001) wurde innerhalb der

Sequenz des BAC-Klons CH230-225H18/AC109930 wiedergefunden. Zwischen dem

ersten und zweiten Exon dieses Gens wurde ein (AC)25-Mikrosatellit identifiziert.

Bei dem Gen Morc (XM_221483) handelt es sich um eine aus dem NCBI „Contig“

NW_042731 vorhergesagte Modell-cDNA-Sequenz die als „Similar to Morc Mus

musculus“ bezeichnet wird. Diese Sequenz wurde auf dem Ratten-Klon CH230-

230P11/AC106331 wiedergefunden. Zwischen dem 17. und 18. Exon dieses Gens

ist ein (GT)41-Mikrosatellit auf dem Klon lokalisiert.

Insgesamt wurden 13 Mikrosatelliten identifiziert, welche auf 4 verschiedenen

Ratten-Klonen (Anhang Tabelle 11) lokalisiert sind, die gemäß der „UCSC Genome

Bioinformatics“ Datenbank entweder die Sequenz von Drd3 (NM_017140; SNYDER

et al., 1991) beinhalten oder die unmittelbar benachbarte genomische Sequenz von

RNO11 zu diesem Gen repräsentieren.

85

4.3.3 Amplifikation der genassozierten Mikrosatelliten, Untersuchung

auf SSLPs und Genotypisierung der N2-Ratten

LEW-ci2:

Für alle vier identifizierten gengekoppelten Mikrosatelliten wurden entsprechende

Primerpaare mit einer Anlagerungstemperatur von 56 bis 58 °C ermittelt (Tabelle 4).

Tabelle 4: PCR- und Gelelektrophoresedaten der gengekoppelten Mikrosatelliten

auf RNO10

Locus Primer sequenzen Repetitive Errechnete OptimaleSymbol (5/ fi 3/) Sequenz Produkt- Anlagerungs-

größe temperatur

D10Ztm1 f:GCC TGG GAA TAG AC 135 bp 58 °C(Myo15) GTG ACC ATG GTG

r:CCT TCA TCC ACAGGC AGG CTG TTT

D10Ztm2 f:TGG ATT TGC TGG AC 471 bp 57 °C(Znf179) CCT GCC AGT CTA T

r:CTT CAT GGC CTCAGG ATC ACT TGC C

D10Ztm3 f:CCA GAA TTT GGT CT; CA 284 bp 56 °C(Myo1c) AGG TGG AGG CAG

GAr:GAG CCG GGA GCCTCT GCC TGC TAGGC

D10Ztm4 f:AAA GTG TTT ATC AC; AG 315 bp 56 °C(Aldh3a1) TGG GGG AAG GGC C

r:AGG GAC CTA GCA ACA CCT TAA GTC A

86

Die als D10Ztm1 (Myo15), D10Ztm2 (Znf179), D10Ztm3 (Myo1c) und D10Ztm4

(Aldh3a1) bezeichneten Mikrosatelliten wiesen deutlich detektierbare SSLPs sowohl

zwischen den Parentalstämmen, als auch bei den N2-Tieren auf.

Nach anschließender Genotypisierung der N2-Tiere konnte für diese vier Marker eine

signifikante Abweichung (p<0,0001) von dem zu erwarteten Genotypenverhältnis

mittels c2-Test errechnet und somit ein signifikanter Hinweis auf Kopplung zu der ci2-

Mutation bestimmt werden. D10Ztm1 (Myo15), D10Ztm2 (Znf179) und D10Ztm4

(Aldh3a1) wiesen dabei eine stärkere Assoziation mit dem ci2-Phänotypen als der

anonyme „Peak Marker“ D10Rat164 auf. An diesen Loci rekombinierte keines der 94

den ci2-Phänotypen aufweisenden N2-Individuen. D10Ztm3 (Myo1c) zeigte dagegen

eine deutlich schwächere Assoziation als die drei übrigen Loci. An diesem Locus

rekombinierten 15 der 94 den ci2-Phänotypen aufweisenden N2-Individuen (Tabelle

5 und Anhang Tabelle 14).

Tabelle 5: Untersuchte gengekoppelte Marker auf RNO10


D10Ztm1 (Myo15) 130,812 < 0,0001 RNO10 43,5D10Ztm4 (Aldh3a1) 132,457 < 0,0001 RNO10 43,5D10Ztm2 (Znf179) 133,396 < 0,0001 RNO10 43,5D10Ztm3 (Myo1c) 70,88 < 0,0001 RNO10 64,1

Es erfolgte eine Bestimmung der Rekombinationsfrequenzen zwischen den 17

anonymen auf RNO10 untersuchten Mikrosatelliten (Tabelle 2) und den vier

gengekoppelten Markern (Tabelle 5). Basierend hierauf wurde eine genetische

Kopplungskarte des Rattenchromosoms 10 erstellt und somit die Position der vier

gengekoppelten Mikrosatelliten bestimmt. Diese Karte beschreibt die Position von

D10Ztm1 (Myo15), D10Ztm2 (Znf179) und D10Ztm4 (Aldh3a1) bei 43,5 cM.

D10Ztm3 (Myo1c) kartiert bei 64,1 cM (Abb. 8). Für die Darstellung der Assoziation

des jeweiligen Mikrosatelliten Markers zu dem ci2-Phänotypen in Abb. 8 wurden die

einzelnen c2-Werte in LOD-Score-Werte umgerechnet.

87

Abb. 8: Genetische Kopplungskarte von RNO10 einschließlich der Assoziation

der Mikrosatelliten mit dem ci2-Phänotypen in LOD-Score-Werten

Grauer Balken = nicht rekombinante Region

LOD-Score

cM 0.0

5.1

13.3

32.535.238.741.242.142.143.543.543.547.848.850.153.555.759.064.1

75.2

85.1

D10Rat218 10 20

D10Rat47

D10Rat45

D10Mgh10D10Rat168D10Rat171D10Rat164D10Rat166D10Rat126D10Ztm1(Myo15)D10Ztm4(Aldh3a1)D10Ztm2(Znf179)D10Rat32D10Rat116D10Rat31D10Mgh6D10Mit2D10Rat26D10Ztm3(Myo1c)

D10Ppy

D10Mgh4

88

BH.7A-ci3:

Für alle 15 identifizierten gengekoppelten Mikrosatelliten wurden entsprechende

Primerpaare mit einer Anlagerungstemperatur von 53 bis 62 °C ermittelt (Tabelle 6

und Anhang Tabelle 13).

Tabelle 6: PCR- und Gelelektrophoresedaten der gengekoppelten Mikrosatelliten

für Morc und Tagln3

Locus Primer sequenzen Repetitive Errechnete OptimaleSymbol (5/ fi 3/) Sequenz Produkt- Anlagerungs-

größe temperatur

D11Ztm1 f:TGC CGC CCT CCC GC 345 bp 54 °C(Morc) CCC ATA GAC TAG T

r:GGA ACG TCA GCATCA CAC CCT CGA T

D11Ztm2 f:TCA GTG GTC CTG AC 337 bp 59 °C(Tagln3) ACG CCA TAG ACC TC

r:TCC GGT TGC AAGATA GCT GTG GTC A

Bei sämtlichen 13 mit Drd3 assoziierten Mikrosatelliten (Anhang Tabelle 13) konnten

weder zwischen den Parentalstämmen noch bei den N2-Tieren deutlich detektierbare

SSLPs identifiziert werden.

Die als D11Ztm1 (Morc) und D11Ztm2 (Tagln3) bezeichneten Mikrosatelliten wiesen

deutlich sichtbare SSLPs sowohl zwischen den Parentalstämmen, als auch bei den

N2-Tieren auf.

Nach anschließender Genotypisierung der N2-Tiere konnte für diese zwei Marker

eine signifikante Abweichung (p<0,0001) von dem zu erwarteten

Genotypenverhältnis mittels c2-Tests errechnet und somit ein signifikanter Hinweis

89

auf Kopplung zu der ci3-Mutation bestimmt werden. D11Ztm1 (Morc) und D11Ztm2

(Tagln3) wiese dabei eine schwächere Assoziation mit dem ci3-Phänotypen als der

anonyme „Peak Marker“ D11Rat67 auf. An diesen Loci rekombinierten jeweils fünf

N2-Individuen, die den ci3-Phänotypen aufwiesen (Tabelle 7 und Anhang Tabelle

15).

Tabelle 7: Untersuchte gengekoppelte Marker auf RNO11


D11Ztm1 (Morc) 53,232 < 0,0001 RNO11 24,7D11Ztm2 (Tagln3) 47,981 < 0,0001 RNO11 28,8

Es erfolgte eine Bestimmung der Rekombinationsfrequenzen zwischen den 12

anonymen auf RNO11 untersuchten Mikrosatelliten (Tabelle 3) und den zwei

gengekoppelten Markern (Tabelle 7). Basierend hierauf wurde eine genetische

Kopplungskarte des Rattenchromosoms 11 erstellt und somit die Position der beiden

gengekoppelten Mikrosatelliten bestimmt. Diese Karte beschreibt die Position von

D11Ztm1 (Morc) bei 24,7 cM. D11Ztm2 (Tagln3) kartiert bei 28,8 cM (Abb. 9). Für die

Darstellung der Assoziation des jeweiligen Mikrosatellitenmarkers mit dem ci3-

Phänotypen in Abb. 9 wurden die einzelnen c2-Werte in LOD-Score-Werte

umgerechnet.

90

Abb. 9: Genetische Kopplungskarte von RNO11 einschließlich der Assoziation

der Mikrosatelliten mit dem ci3-Phänotypen in LOD-Score-Werte

LOD-Score

D11Rat28 cM 0.0

D11Rat272.4

D11Mit410.2

D11Rat2414.1

D11Rat6718.8D11Rat1020.1

D11Ztm1 (Morc)24.7

D11Rat6527.7D11Ztm2 (Tagln3)28.8D11Mgh429.8

D11Rat9333.1D11Mgh333.9

D11Rat5642.7

D11Wox653.9

5 10 15

91

4.3.4 Virtueller Aufbau einer physikalischen Karte der nicht


Mit Hilfe der Sequenzen von Ratten-BAC-Klonen wurde eine physikalische Karte der

nicht rekombinanten Region auf RNO10 (D10Ztm1 – D10Ztm2) erzeugt.

Als Grundgerüst für diese Karte diente ein 106 bp großer Bereich (61. Mb bis 62. Mb;

„Ensembl Mouse Genome Server“) des Mauschromosoms 11 der die Sequenzen der

homologen Gene zu Myo15, Znf179 und Aldh3a1 beinhaltet (Abb. 10 E). Mittels

BLAST wurden 11 überlappende Rattenklone („Contig“) identifiziert, die diesem

Bereich des Mausgenoms entsprechen (Abb. 10 D). Die überlappenden Enden

benachbarter Klone wurden auf Sequenzübereinstimmung überprüft und somit diese

untereinander verankert.

Die cDNA-Sequenzen von neun Rattengenen, darunter Myo15, Znf179 und Aldh3a1,

wurden auf diesen Rattenklonen wiedergefunden. Gensequenzen, die in den

überlappenden Bereichen zweier Klone lagen, wurden auf beiden jeweils

benachbarten Klonen nachgewiesen.

Somit konnte die Position der Gene auf der durch die verankerten Klone gebildeten

physikalischen Karte bestimmt werden (Abb. 10 B). Der so ermittelte physikalische

Abstand, der bei 43,5 cM der genetischen Kopplungskarte lokalisierten Gene Myo15,

Znf179 und Aldh3a1 betrug in etwa 800 kb. Unter den sechs weiteren lokalisierten

Rattengenen befindet sich das Gen Kcnj12 (NM_053981; KOYAMA et al., 1994),

welches für den Kaliumeinzelkanal Kir2.2 kodiert (Kapitel 2.4.2).

Auch die für Mensch und Maus beschriebenen Sequenzen, der zu diesen neun

Rattengenen homologen Gene zeigten signifikante Sequenzübereinstimmungen zu

den 11 Rattenklonen (Abb. 10 A und B). Darüber hinaus wurden bei weiteren vier

Genen des Menschen und 12 Genen der Maus Sequenzübereinstimmungen zu

diesen Rattenklonen gefunden. Hierbei handelt es sich um Gene deren Sequenzen

für die Ratte noch nicht beschrieben sind (Stand Mai 2003).

92

Abb. 10: Physikalische Karte der nicht rekombinanten Region auf RNO10

basierend auf überlappenden Rattenklonen der „CHORI-230 Rat BAC

library sequencing project” Datenbank

61. Mb

61,5. Mb

62. Mb

CH230-38B5 CH230-5O22

CH230-68E7

CH230-13K13

CH230-30B23

CH230-103A8

CH230-6D21

CH230-311A11

CH230-1E4

CH230-10J14

CH230-255K6

Drg2

Myo15

LglhFliih

LOC194946,(SMCR7)Top3a

LOC237782,(SMCR8)

Shmt1

Gtlf3b

Gtlf3a

Map2k3

Kcnj12

Tnfrsf13b

Aldh3a1

Aldh3a2

Zfp179

Mapk7

Eppb9

Epn2

UbcUba52Lglh

Kcnj12

D10Ztm4(Aldh3a1)

Aldh3a2

D10Ztm2/Znf179

Epn2

MYO15A

KCNJN12

MAPK7

ALDH3A2

EPN2

ZNF179

DRG2

ALDH3A1

SMCR8

SMCR7

A) cDNA-Sequenzen B) cDNA-Sequenzen C) cDNA-Sequenzen D) BAC-Klone E) MMU11 Homo sapiens Rattus norvegicus Mus musculus Rattus norvegicus Mus

musculus

D10Ztm1(Myo15)

93

4.3.5 Nachweis einzelner Exone eines Kanidatengens im Genom der

BH.7A/Ztm-ci3 Ratte

Das Ziel war es, die laut der „UCSC Genome Bioinformatics“ Datenbank sieben

vorhandenen Exone des Kandidatengens Drd3 im Genom der BH.7A/Ztm-ci3 und,

als Kontrolle, der BH.7A/Ztm bzw. BH/Ztm Ratte mittels PCR-Amplifikation

nachzuweisen.

Wie von der Datenbank beschrieben findet man die für die Ratte beschriebene

cDNA-Sequenz von Drd3 (NM_017140; SNYDER et al., 1991) als sieben

voneinander getrennte Fragmente auf dem Rattenklon CH230-3C10/AC094353

wieder. Die Sequenz dieses Klons wurde benutzt, um Primer zu identifizieren, die in

den flankierenden Regionen der sieben Exone des Gens binden (Tabelle 8).

94

Tabelle 8: PCR- und Gelelektrophoresedaten der sieben nachgewiesenen Exone

von Drd3 (NM_017140)

Drd3 Primer sequenzen Errechnete OptimaleExone (5/ fi 3/) Produkt- Anlagerungs-

größe temperatur

Exon 1 f: AGA GCC TGA TTT 426 bp 60 °CAGC CCA CAT TGr: TCC CCA GTC CTCTGA GCA CTA AC

Exon 2 f: GAT GAA CAG CTC 308 bp 55 °CAGG GGA GGC Ar: GGC AAG TTC CCTTGG AAG TGA CC

Exon 3 f: AAC CAC TGC TCC 247 bp 58 °CCAT CAT GCC Tr: CCA CCC GGG AATGAT GTG GA

Exon 4 f: CCA TAC CAT GCC 328 bp 56 °CATA TGG ACT TAr: GGA GAC TGA GGGCTG CTA TGT

Exon 5 f: GGT TCA AGT TTG 186 bp 54 °CTAG AGC TTA TCC Cr: GGG AAA GAC ATCTCA CTC TTC CC

Exon 6 f: CAC TTC CCA GGG 488 bp 61 °CTCC CAC CGr: GCC CCC ATG GTACTC GCT TCA

Exon 7 f: GAC TTG TGA GTT 386 bp 57 °CGCT TTT CGT GTT Cr: ACA TTA CCA GAGCCC AGT GCA G

95

Mit Hilfe dieser Primer konnten die sieben Fragmente sowohl im Genom der BH.7A-

ci3 Ratte, als auch des Hintergrundstamms BH.7A bzw. BH nachgewiesen werden.

Die im 3 %igen Agarosegel detektierten Banden zeigten dabei die vorher berechnete

Fragmentlänge. Unterschiede zwischen den beiden Stämmen in der Fragmentlänge

der sieben Exone konnten dabei nicht beobachtet werden (Abb. 11 bis 14).

Abb. 11: PCR-Produkte des Exon 1 von Drd3 basierend auf der DNA von Ratten

der Stämme BH (A), BH.7A (B) und BH.7A-ci3 (C)

Abb. 12: PCR-Produkte des Exon 2 von Drd3 basierend auf der DNA von Ratten

der Stämme BH (A), BH.7A (B) und BH.7A-ci3 (C)

A B C

A B C

96

Abb. 13: PCR-Produkte der Exone 3, 4 und 5 von Drd3 basierend auf der DNA

von Ratten der Stämme BH (A), BH.7A (B) und BH.7A-ci3 (C)

Abb. 14: PCR-Produkte der Exone 6 und 7 von Drd3 basierend auf der DNA von

Ratten der Stämme BH (A), BH.7A (B) und BH.7A-ci3 (C)

97

5. Diskussion

5.1 Untersuchungen zum Phänotypen und zur Genetik der LEW/Ztm-

ci2 Rattenmutante


Ziel der Verhaltensuntersuchungen war zum einen eine Bestimmung der Phänotypen

der 55 im Laufe dieser Arbeit gezüchteten Individuen der (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1

x LEW/Ztm-ci2 Rückkreuzungspopulation (N2). Hierdurch sollten die N2-Individuen

ermittelt werden, die homozygote Träger der ci2-Mutation waren und den

entsprechenden Phänotypen (Rota t ionsverha l ten ; ves t ibu lä re

Ausfallserscheinungen) aufwiesen. Diese eindeutige phänotypische

Charakterisierung diente als Grundvorrausetzung, um die bei der Kopplungsanalyse

(Kapitel 4.2) ermittelten Genotypen mit den Phänotypen der

Rückkreuzungsindividuen abgleichen zu können und somit einen Hinweis auf

Kopplung des untersuchten Markers zur ci2-Mutation zu erlangen.

Der zweite Teil der Verhaltensuntersuchungen beschäftigte sich mit dem

Sehvermögen der (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2 Individuen. Festgestellt

werden sollte, ob eine Beeinträchtigung des Sehvermögens, wie es für den

Parentalstamm LEW/Ztm-ci2 beschrieben wurde (GOCKELN et al., 2003), bei den

Tieren vorlag. Hierzu wurden Verhaltensuntertests durchgeführt, mit deren Hilfe man

vergleichsweise unkompliziert die Sehfähigkeit bei einer großen Anzahl von Tieren

überprüfen kann.

98

5.1.1.1 Untersuchungen des Rotationsverhaltens sowie des auditiven und

vestibulären Systems

Mit Hilfe der angewendeten Verhaltensuntersuchungen konnte bei 26 der 55

untersuchten N2-Individuen das für den Parentalstamm (LEW/Ztm-ci2) beschriebene

Rotationsverhalten (LINDEMANN et al., 2001) und die Taubheit (KAISER et al.,

2001) nachgewiesen werden.

Beim Schwimmtest traten Abweichungen innerhalb der Gruppe der N2-Individuen mit

Rotationsverhalten auf. Sechs Tiere aus dieser Gruppe waren, im Gegensatz zu dem

Parentalstamm LEW/Ztm-ci2 (KAISER et al., 2001; LESSENICH 2002), in der Lage

sich mühsam und kurzfristig an der Wasseroberfläche zu halten.

Als mögliche Erklärung für diese Abweichung ist der Einfluss von modulierenden

Genen des zweiten für die Rückkreuzung eingesetzten Parentalstammes BN/Ztm zu

diskutieren.

Als zweite Möglichkeit ist die Entkopplung von zwei für den ci2-Phänotypen

verantwortlichen Genen bei den N2-Individuen in Betracht zu ziehen. Hierbei müsste

es sich jedoch gemäß den Ergebnissen der Kopplungsanalyse (Kapitel 4.2) um zwei

eng benachbarte Gene handeln. Sechs von 26 N2-Individuen mit Rotationsverhalten

zeigten jedoch dieses beim Schwimmtest festgestellte Phänomen. Dies entspräche

einer Rekombinationsfrequenz von 23 % und somit einem Abstand von 23 cM

zwischen zwei für den ci2-Phänotypen möglicherweise verantwortlichen Genen und

widerspricht somit den Ergebnissen der Kopplungsanalyse. Somit ist diese zweite

Möglichkeit eher auszuschließen.

Bei den beiden weiteren Untersuchungen zur vestibulären Funktion („Air-Righting“-

Test; „Balance“-Test) konnten solche Varianzen innerhalb der beiden Gruppen (N2-

Individuen mit Rotationsverhalten vs. N2-Individuen ohne Rotationsverhalten)

allerdings nicht festgestellt bzw. bestätigt werden.

Somit lässt sich zusammenfassend festhalten, dass - mit Ausnahme der Varianz im

Phänotypen hinsicht l ich des Schwimmverhaltens - durch die

Verhaltensuntersuchungen 26 der 55 gezüchteten Rückkreuzungstiere eindeutig der

99

ci2-Phänotyp zugewiesen werden konnte, während die übrigen 29 Tiere

phänotypisch unauffällig waren.

5.1.1.2 Überprüfung der Sehfähigkeit der (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x

LEW/Ztm-ci2 Ratten

Parallel zu den phänotypischen und genetischen Untersuchungen zur LEW-ci2

Ratte, die Bestandteil dieser Arbeit waren, wurden adulte LEW-ci2 Ratten von Dr.

Roland Gockeln aus der Augenklinik der Medizinischen Hochschule Hannover auf ihr

Sehvermögen untersucht. Der Grund für diese Untersuchungen war der auf den

Ergebnissen der genetischen Untersuchungen dieser Arbeit basierende Hinweis auf

Parallelität des ci2-Phänotypen zu dem „Usher Syndrom“ Typ 1B des Menschen.

Hierbei handelt es sich um eine Erkrankung, die mit progressiver Retinopathie

einhergeht (Kapitel 5.3.1 und 5.4).

Bei der durchgeführten extrazellulären Elektroretinographie (ERG) zeigte sich eine

generalisierte Funktionsstörung der Photorezeptoren, und zwar unter skotopischen

(Stäbchensystem) und photopischen (Zapfensystem) Bedingungen (Anhang Abb.

12). Dieser retinale Funktionsverlust wurde durch histologische Untersuchungen, bei

denen ein Verlust der Photorezeptorzellen nachgewiesen werden konnte, bestätigt.

Unter Berücksichtigung dieser Befundsituation ist der visuelle Funktionsverlust bei

den LEW-ci2 Ratten durch progressive Netzhautdystrophie zu erklären (Gockeln et

al., 2003). Erste Anzeichen einer Netzhautdegeneration sind bereits bei vier Monate

alten Tieren festzustellen (ERG-Messungen). Der Zeitpunkt der Manifestation der

progressive Netzhautdystrophie scheint bei sechs Monaten zu liegen (GOCKELN,

persönliche Mitteilung).

Um diesen beim Parentalstamm festgestellten Verlust der Sehfähigkeit bei den N2-

Individuen zu überprüfen, kamen ein modifizierter „Visual-Cliff“-Test und – zur

Absicherung der Ergebnisse – ein Hell-Dunkel-Transfer-Test zum Einsatz.

100

5.1.1.2.1 Verhalten der Tiere an einer sichtbaren Kante (modifizierter


Die signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Gruppen (N2-Individuen mit

Rotationsverhalten und vestibulären Fehlfunktionen = ci2-Phänotyp vs. nicht

betroffene N2-Individuen) deuten auf Unterschiede in der Sehfähigkeit der N2-Tiere

hin.

Aus der längeren Latenzzeit bis zur Verhaltensweise „Head Dipping“ und der

größeren Anzahl an Stürzen bei den 26 N2-Individuen, die den ci2-Phänotypen

aufwiesen, lässt sich ableiten, dass diese N2-Tiere die Hockerkante als Begrenzung

der exponierten Fläche (Sitzfläche des Hockers) optisch nicht wahrnahmen. Erste

Kantenkontakte könnten sich bei diesen Tieren eher als Zufallsprodukt einer

vorsichtigen Exploration der neuen Umgebung oder als Folge einer ungezielten

Fluchtreaktion, die allerdings meist mit einem Sturz an der Hockerkante (Tiere traten

ohne abzubremsen über diese hinweg) verbunden war, ergeben haben, während die

nicht betroffenen N2-Individuen sofort nachdem sie die für sie unbehagliche Situation

erfasst hatten, zur Hockerkante eilten und von dieser herabblickten, um so

möglicherweise Fluchtwege aus dieser Situation zu erkunden. Neben dem

Übertreten der Hockerkante spricht auch das zweite Verhaltensmuster, aus dem sich

Stürze ergaben (tiefes Eintauchen des Kopfes von der Kante aus in den Abgrund),

für ein eingeschränktes Sehvermögen der N2-Tiere mit Rotationsverhalten. Es kann

angenommen werden, dass diese N2-Individuen optisch den Boden des

Untersuchungsraumes nicht erfassen konnten und somit versuchten über taktile

Reize den Abgrund zu explorieren.

Die Tatsache, daß die 29 nicht betroffenen N2-Tiere signifikant häufiger von der

Kante aus auf den Boden und die Umgebung herabblickten („Head Dipping“-

Verhalten), untermauert die Vermutung, dass sie diese optisch wahrnahmen und,

nachdem sie beim ersten Versuch keinen Fluchtweg erkannten, gezielt weitere

Positionen an der Hockerkante auf Fluchtmöglichkeiten untersuchten. Bei den 26 N2-

Individuen, die den ci2-Phänotypen aufwiesen, können neue Kontakte mit der

Hockerkante wiederum als Zufallsprodukte vorsichtiger Exploration gewertet werden,

101

die dann ausgenutzt wurden, um durch tiefes Eintauchen den Abgrund

möglicherweise zu ertasten.

Die größere Anzahl abgesetzter Kot-Boli bei den 26 N2-Individuen mit ci2-

Phänotypen ist ein klarer Hinweis dafür, dass sie einem größeren Stress ausgesetzt

waren als die 29 nicht betroffenen Individuen, was möglicherweise durch die

eingeschränkte Fähigkeit des Erfassens der neuen Umgebung (fehlende optischen

Wahrnehmung) und somit der Einschätzung der unbehaglichen Situation erklärbar

ist.

5.1.1.2.2 Hell-Dunkel-Transfer-Test

Die signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Parameter „Latenzzeit“ und

„Exploration des Eingangsbereiches zum dunklen Kompartiment, ohne dieses zu

betreten“, die sich bei diesem Test ergeben haben, stützen die Hinweise aus dem

vorherigen Test (Kapitel 5.1.1.2.1), dass bei den N2-Individuen mit

Rotationsverhalten eine eingeschränkte Sehfähigkeit vorliegt.

Die im Mittel vierfach längere Latenzzeit zwischen Öffnung der Schiebetür und

Übergang in das dunkle Kompartiment der N2-Tiere, die den ci2-Phänotypen

aufwiesen, lässt den Schluss zu, dass diese Individuen das helle Kompartiment nicht

als in dem Maße unbehaglich registrierten bzw. das dunkle Kompartiment nicht als

geschützten Bereich erkannten. Eine mögliche Erklärung hierfür wäre, dass sie den

Unterschied in der Beleuchtungsstärke beider Kompartimente nicht ausmachen

konnten. Aus der Tatsache, dass alle nicht betroffenen Ratten das dunkle

Kompartiment im Mittel nach 30 Sekunden betraten, kann gefolgert werden, dass sie

diesen Bereich als dunkel und somit geschützt erkannten.

Zudem zeigten lediglich N2-Individuen, die den ci2-Phänotypen aufwiesen, eine

vorsichtige Exploration des Eingangsbereiches zum dunklen Kompartiment, ohne

dieses zu betreten. Dieses Verhalten ist ein weiterer Hinweis dafür, dass sie diesen

Bereich nicht als dunkel und geschützt erkannten und zunächst eine Erkundung

dieses Teils der „Shuttle-Box“ mit ihrem Tast- und Geruchsinn vornahmen. Alle

102

phänotypisch unauffälligen Individuen betraten den dunklen Bereich dagegen, ohne

ein solches Verhalten zu zeigen, so dass man wiederum davon ausgehen kann, dass

sie das Kompartiment auch als Dunkles erkannten.

Der Unterschied zwischen beiden Gruppen in der Anzahl der während der

Untersuchungszeit abgegebenen Kot-Boli war nicht signifikant. Es ließ sich jedoch

der Trend erkennen, dass N2-Tiere mit ci2-Phänotyp mehr defäkieren als nicht

betroffene Tiere, was darauf schließen lässt, dass ihnen die neue unbekannte

Umgebung aufgrund der möglicherweise fehlenden optischen Informationen

größeren Stress bereitet. Da es sich bei der Messung der abgesetzten Kot-Boli

während einer Untersuchung um einen sehr groben Parameter für Stressempfinden

handelt (HALL, 1934; HUNT und OTIS, 1953), ist auch ein solcher nicht signifikanter

Trend im Zusammenhang mit den anderen Befunden zumindest als Faktor zu

werten, der als unterstützender Parameter für eine unterschiedliche Stressantwort

der Tiere gelten kann.

5.1.1.2.3 Abschliessende Betrachtung der Tests zur Überprüfung der

Sehfähigkeit der (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2 Ratten

Abschließend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse beider Untersuchungen auf eine

eingeschränkte Sehfähigkeit der Rückkreuzungsindividuen mit ci2-Phänotyp

(homozygote Merkmalsträger) im Vergleich zu phänotypisch unauffälligen N2-Ratten

(heterozygote Merkmalsträger) schließen lassen. Eine Validierung der Ergebnisse

sollte anhand von ERG-Untersuchungen vorgenommen werden, zumal bei

heterozygoten LEW-ci2 Ratten durch GOCKELN et al. (2003) sehr wohl eine

eingeschränkte Sehfähigkeit festgesellt wurde (Anhang Abb. 12).

Zum Zeitpunkt dieser neurophysiologischen Untersuchungen war allerdings das

Lebensalter, in dem das Einsetzen der progressiven Retinopathie bei der LEW-ci2

Ratte beginnt, noch nicht bekannt. Die in dieser Arbeit untersuchten N2-Tiere waren

in einem Alter (3 bis 5 Monate) in dem sich zwar erste Anzeichen einer Retinopathie

bei LEW-ci2 Ratten beobachten lassen, eine vollständige Manifestation der

103

Erkrankung (6. Lebensmonat; Gocklen, persönliche Mitteilung) aber aller

Wahrscheinlichkeit nach noch nicht statt gefunden hat. Möglicherweise bestehen

Unterschiede bei den N2-Individuen zwischen homozygoten und heterozygoten

Merkmalsträgern in der Entwicklung der progressiven Retinopathie durch den Einfluß

modulierender Gene des Kreuzungspartners BN/Ztm.

104

5.1.2 Genetische Analysen zur LEW/Ztm-ci2 Rattenmutante

5.1.2.1 Mikrosatellitenmarker-gestützte Kopplungsanalyse

Die mittels anonymer Mikrosatellitenmarker untersuchte (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x

LEW/Ztm-ci2 Rückkreuzungspopulation bestand aus einer Gruppe von Tieren mit

abnormen Phänotyp und einer Gruppe von phänotypisch unauffälligen Tieren. Dabei

zeigte sich eine Inzidenz bezüglich des ci2-Phänotypen von nahezu 50 %. Dies kann

als deutlicher Hinweis gewertet werden, dass es sich hierbei um ein monogenetisch

verursachten Phänotypen handelt.

Ziel der Kopplungsanalyse war die Identifikation und Eingrenzung der Regionen,

welche die ci2-Mutation trägt.

5.1.2.1.1 Anonyme Mikrosatellitenmarker und ihre Assoziation mit dem ci2-

Phänotypen

Von den auf den Chromosomen 1 bis 9 und 11 bis 20 untersuchten Markern wiesen

lediglich fünf (D1Mit2, D4Mgh3, D8Mit7, D19Mgh2, D19Rat17) einen signifikanten p-

Wert auf. Die Möglichkeit, dass es sich hierbei um fälschlicherweise für die

Chromosomen 1, 4, 8 und 19 beschriebene Marker handelt ist mit Ausnahme von

D8Mit7 auszuschließen. D1Mit2, D4Mgh3, D19Mgh2 und D19Rat17 sind in den

physikalischen Karten der Datenbank „UCSC Genome Bioinformatics“

(genome.ucsc.edu/) auf den entsprechenden Chromosomen wiederzufinden. Bei

D8Mit7 besteht die Möglichkeit, dass dieser Marker nicht korrekt kartiert wurde.

Da aber für sämtliche übrigen untersuchten Mikrosatellitenmarker auf den

Chromosomen 1, 4 und 8 keine signifikante Abweichung vom zu erwarteten

Genotypenverhältnis ermittelt werden konnten, ist davon auszugehen, dass es sich

bei diesen isoliert vorliegenden Abweichungen (D1Mit2, D4Mgh3, D8Mit7) eher um

Zufallsbefunde handelt, und sie nicht als Hinweis auf Kopplung zur ci2-Mutation

einzustufen sind.

105

Interessanterweise ergaben sich die bei den beiden auf Chromosom 19 lokalisierten

Mikrosatelliten festgestellten signifikanten p-Werte aus einem Überwiegen an

heterozygoten LEW-ci2/BN-Genotypen in der Gruppe der den ci2-Phänotypen

aufweisenden Individuen. Tatsächlich muss aber ein Überwiegen an homozygoten

LEW-ci2-Genotypen in dieser Gruppe als Hinweis auf Kopplung zur ci2-Mutation

gewertet werden, da diese Tiere aufgrund des rezessiven Erbgangs ebenfalls

homozygot für diese Mutation sein müssen. Da aber zwei benachbarte Marker diese

Form der signifikanten Abweichung aufweisen, ist dieses Ergebnis nicht als

Zufallsbefund einzustufen. Zu diskutieren ist hier dagegen die Möglichkeit, dass die

festgestellte Abweichung ein Hinweis auf den Einfluss von auf Chromosom 19

lokalisierten, modulierenden Genen des Kreuzungspartners BN/Ztm ist.

Für sämtliche 18 auf Chromosom 10 lokalisierten Mikrosatellitenmarker konnte eine

signifikante Abweichung vom zu erwarteten Genotypenverhältnis mittels c2-Tests

errechnet werden. Bei diesen Markern überwog jeweils die Anzahl an homozygoten

LEW-ci2-Genotypen in der Gruppe, der den ci2-Phänotypen aufweisenden

Individuen, womit ein signifikanter Hinweis auf Kopplung zu der Mutation gegeben

war. Tatsächlich wiesen 90 der 94 phänotypisch betroffenen Tiere bei dem Marker

mit der stärksten Assoziation mit dem ci2-Phänotypen (D10Rat164; „Peak Marker“)

einen homozygoten LEW-ci2-Genotypen auf. Diese Anzahl entspricht einer

Rekombinationsfrequenz von 4,3 % (4 / 94), was einer wahrscheinlichen Entfernung

dieses Markers zur ci2-Mutation von 4,3 cM entspricht.

Folglich konnte die ci2-Mutation mit Hilfe der Kopplungsanalyse eindeutig auf

Chromosom 10 kartiert werden. Die Region, die diese Mutation trägt, ist gemäß

diesen Daten im zentralen Bereich des Chromosoms lokalisiert und wird von den

Markern D10Rat164 (41,2 cM) und D10Rat32 (47,8 cM) flankiert.

106

5.1.2.2 Computer- und Datenbank-gestützte genetische Analysen

5.1.2.2.1 Gengekoppelte Marker und ihre Assoziation mit dem ci2-

Phänotypen

Die vergleichende Betrachtung des Rattengenoms mit denen des Menschen und der

Maus („comparative mapping“) brachte zwei Gene (Myo15, Myo1c) die für

unkonventionelle Myosine kodieren, als mögliche Kandidaten für die taubblinde

LEW-ci2 Ratte hervor. Diese beiden Gene sowie zwei benachbarte Gene (Aldh3a1,

Znf179) von Myo15 wurden mit Hilfe gengekoppelter Mikrosatelliten Marker

untersucht, um festzustellen, ob sie innerhalb der zentralen Assoziationsregion auf

RNO10 kartieren.

Myo15 kodiert für das unkonventionelle Myosin XV, dem eine essentielle Bedeutung

für die Struktur und Funktion des Sinnesepithels des Innenohres (Haarzellen)

zugesprochen wird (ANDERSON et al., 2000). Mutationen in diesem Gen sind

sowohl für den Menschen, als auch für die Maus beschrieben worden.

Bei den shaker2-Mäusen (Myo15sh2, Myo15sh2J) resultieren zum einen eine

Punktmutation und zum anderen eine Deletion in Myo15 in einer autosomal rezessiv

vererbten Taubheit und einer Schädigung des vestibulären Systems, die zu

Rotationsverhalten führt. In beiden Fällen findet man pathologisch verkürzte

Stereozilien der Haarzellen in der Cochlea und im vestibulären Apparat (LIANG et

al., 1998; PROBST et al., 1998; ANDERSON et al., 2000). Im Gegensatz hierzu

äußern sich allerdings die histologischen Veränderungen im Innenohr der LEW-ci2

Ratte in einem nahezu vollständigen Verlust der Haarzellen der Cochlea. Ein Teil der

vestibulären Haarzellen zeigt dagegen Protrusionen in den endolymphatischen

Raum, die für einen cytoskeletalen Schaden dieser Zellen sprechen (KAISER et al.,

2001). Diese Veränderungen sind wiederum ein Indiz für eine Beteiligung eines

Strukturproteins an dem ci2-Phänotypen, wie es z.B. Myosin XV darstellt.

Auch beim Menschen führen Punktmutationen in MYO15 zu einer rezessiv

vererbten, nicht syndromartigen Taubheit (DFNB3). Diese Punktmutationen wurden

107

bei drei nicht miteinander verwandten DFNB3 Familien durch Sequenzanalysen

nachgewiesen (Wang et al., 1998). Des weiteren sind Mutationen in MYO7A,

welches für ein zu Myosin XV strukturell eng verwandtes Protein kodiert (CHEN et

al., 1996; MBURU et al., 1997; LIANG, et al., 1999), beschrieben, die zum „Usher

Syndrom“ Typ 1B führen. Patienten, die an diesem Syndrom leiden, zeigen

angeborene Taubheit mit Beeinträchtigung des vestibulären Systems sowie eine

tapetoretinale Degeneration, die sich meist im vorpubertären Alter manifestiert. Auch

Ataxien vestibulären Ursprungs sind bisweilen zu beobachten (PETIT, 2001).

Tatsächlich entspricht damit dieser Typ des „Usher Syndroms“ dem Phänotypen der

taubblinden LEW-ci2 Ratte (Kapitel 5.4) und liefert somit einen weiteren Hinweis auf

eine mögliche Beteiligung eines unkonventionellen Myosins an der Entstehung des

ci2-Phänotypen.

Mit Hilfe eines innerhalb der genomischen Sequenz von Myo15 lokalisierten und

polymorphen Mikrosatellitenmarkers (D10Ztm1) konnte erstmalig die Lokalisation

dieses Gens innerhalb des Genoms der Ratte (RNO10; 43,5 cM) und gleichzeitig die

Assoziation des Markers und folglich von Myo15 mit dem ci2-Phänotypen bestimmt

werden. Tatsächlich zeigten sämtliche N2-Individuen, die den betroffenen

Phänotypen aufwiesen, bei den Markern D10Ztm1 (Myo15), D10Ztm2 (Znf179) und

D10Ztm4 (Aldh3a1), die alle drei bei 43,5 cM auf RNO10 lokalisiert sind, einen

homozygoten LEW-ci2-Genotypen. Entsprechend lässt die fehlende Rekombination

zwischen diesem Locus und der ci2-Mutation den Schluss zu, dass diese Region an

der Entstehung des ci2-Phänotypen beteiligt ist. Unter den in diesen Bereich

kartierenden Genen ist Myo15 aufgrund seiner Funktion und den beschriebenen

Mutationen als Kandidatengen besonders hervorzuheben.

Bei dem zweiten ebenfalls für ein unkonventionelles Myosin kodierenden Gen

handelt es sich um Myo1c (Synonym: Myr4). Die mRNA dieses Gens wurde aus der

Cochlea von Mäusen isoliert und das Gen auf Chromosom 11 der Maus und

Chromosom 17 des Menschen, welche die homologen Chromosome zu RNO10

darstellen, kartiert (CROZET et al., 1997). Durch gerichtete Inaktivierung des Gens

108

konnte seine Beteiligung an der Mechanotransduktion im Bereich der sensorischen

Haarzellen des Innenohres gezeigt werden (ZUO, 2002).

Aufgrund seiner Funktion und Lokalisation auf den homologen Chromosomen von

Mensch und Maus wurde auch Myo1c als mögliches Kandidatengen für den ci2-

Phänotypen in Betracht gezogen. Mit Hilfe eines gengekoppelten

Mikrosatellitenmarkers konnte die Lokalisation des Gens auf RNO10 bei 64,1 cM

bestimmt und eine signifikante Kopplung zur ci2-Mutation nachgewiesen werden.

Allerdings rekombinierten an diesem Locus 15 der 94 N2-Individuen, die einen

betroffenen Phänotypen aufwiesen. Aufgrund dieser Tatsache kann eine Beteiligung

des Gens am ci2-Phänotypen ausgeschlossen werden.

5.1.2.2.2 Physikalische Karte der nicht rekombinanten Region auf RNO10

(LEW-ci2)

Myo15 und seine beiden benachbarten Gene Aldh3a1 und Znf179 wurden mit Hilfe

ihrer gekoppelten Marker bei 43,5 cM auf RNO10 kartiert. Um den tatsächlichen

physikalischen Abstand zwischen den Genen zu bestimmen und weitere,

möglicherweise dazwischen lokalisierte Gene aufzudecken, wurde eine physikalische

Karte dieser Region von RNO10 generiert.

Basierend auf der homologen chromosomalen Region der Maus (MMU11) konnten

überlappende Ratten-BAC-Klone zu einem „Contig“ zusammengefügt und auf

Sequenzübereinstimmung zu Referenz-cDNA-Sequenzen von Genen der Ratte

geprüft werden. Hierbei wurden das Intervall, in dem die drei Gene lokalisiert sind

(ca. 800 kb), bestimmt und weitere sechs in diesem Bereich lokalisierte Gene der

Ratte identifiziert. Auch die entsprechenden homologen Gene des Menschen und der

Maus zeigten Sequenzübereinstimmungen zu den Ratten-Klonen. Daraus lässt sich

ableiten, dass diese Region eine deutliche Homologie unter den drei Spezies,

bezüglich Gehalt und Anordnung der Gene, aufweist. Darüber hinaus wiesen weitere

Referenzsequenzen von Genen des Menschen und der Maus Übereinstimmungen

zu den Ratten-Klonen auf. Hieraus ist zu schließen, dass weitere Gene der Ratte in

109

dieser Region lokalisiert sein müssen, deren entsprechende Sequenzen noch nicht

beschrieben worden sind.

Unter den mit dieser Methode kartierten Genen der Ratte befindet sich auch Kcnj12

(RNO10: 47182207 bp bis 47228820 bp; „UCSC Genome Bioinformatics“) , welches

für die Kaliumeinzelkanal-Alphauntereinheit Kir2.2 kodiert.

Zelleinwärts gerichtete K+-Kanäle spielen eine Schlüsselrolle in dem Transport von

Kaliumionen in und aus dem subretinalen Raum (YUAN, et al., 2003). Die

Untereinheiten Kir 1.1 (Kcnj1; unbekannte Lokalisation), 2.1 (Kcnj2; RNO10:

100589355 bp bis 100590638 bp), 2.3 (Kcnj4; RNO7), 3.1 (Kcnj3; RNO3), 3.2 (Kcnj6;

RNO11), 3.3 (Kcnj9; RNO13) und 4.2 (Kcnj15; RNO11) konnten bereits in

verschiedenen Bereichen der Netzhaut der Ratte immunhistochemisch

nachgewiesen werden (TIAN et al., 2003).

Darüber hinaus sind verschiedene Mutationen in einem Kaliumkanal nachgewiesen

worden, die zur dominant vererbten nicht syndromartigen Taubheit (DFNA2) beim

Menschen führen (VAN CAMP et al., 2002). Ebenso ist eine Maus (Kcnj10tm1Pkj) mit

einem genetisch inaktivierten Kir4.1 Kaliumeinzelkanal (Kcnj10; MMU1) beschrieben.

Dieses Tier weist eine Innenohrdegeneration in Verbindung mit Hörverlust auf

(KOFUJI et al., 2000; MARCUS et al., 2001; ROZENGURT et al., 2003).

Aufgrund der Bedeutung von Kaliumeinzelkanälen für die Funktion der Zellen im

Innenohr und der Netzhaut (Kapitel 2.4.3) sowie seiner Lokalisation innerhalb eines

Intervalls von RNO10, das keine Rekombination zu der ci2-Mutation zeigt, muss

Kcnj12 als weiteres potentielles Kandidatengen für die taubblinde LEW-ci2 Ratte

betrachtet werden. Einschränkend ist aber zu erwähnen, dass zur Zeit ein Nachweis

dieser speziellen Untereinheit im Innenohr und/oder der Retina noch nicht erbracht

bzw. publiziert worden ist (Stand Juni 2003). Bisher sind Untersuchung mit einer

Kcnj12tm1Swz-Mausmutante zur Kaliumionen abhängigen Dilatation von cerebralen

Arterien vorgenommen worden (ZARITSKY et al., 2000). Zudem besteht noch kein

Hinweis auf Beteiligung von Kaliumeinzelkanälen an syndromalen

Taubblindheitsformen.

110

Basierend auf dem geringen physikalischen Abstand von ungefähr 500 kb zwischen

Myo15 und Kcnj12 (Kapitel 4.3.4, Abb. 10) ist auch durchaus die Möglichkeit zu

diskutieren, dass eine Mutation, die beide Gene betrifft (Deletion), für den ci2-

Phänotypen verantwortlich sein könnte (siehe auch Kapitel 5.5). Dies würde auch

nicht dem Inzidenzwert von nahezu 50 % bezüglich des betroffenen Phänotypen bei

der untersuchten N2-Population widersprechen, der auf einen monogenetischen

Erbgang hinweist. Aufgrund des geringen Abstands zwischen den beiden

Kandidatengenen ist davon auszugehen, dass die beiden eng gekoppelten Gene

miteinander vererbt werden und Rekombinationsereignisse zwischen beiden Loci

äußerst selten auftreten. Dies spiegelt auch die Tatsache wieder, dass die gesamte

chromosomale Region, auf der beide Gene lokalisiert sind, keine Rekombination bei

den Untersuchten N2-Individuen mit der ci2-Mutation gezeigt hat. Entsprechend

würde ein Phänotyp, der durch Mutationen in zwei so eng gekoppelten Genen

verursacht wird, bei einer Kreuzungspopulation die entsprechende Inzidenz eines

monogenetischen Erbgangs aufweisen.

Myo15 ist sicherlich aufgrund seiner bereits für den Menschen und die Maus

beschriebenen Mutationen sowie der Bedeutung unkonventioneller Myosine im

Zusammenhang mit Taubheitsformen bzw. syndromaler Taublindheit (Kapitel 2.4.1

und 5.3.1) gegenüber Kcnj12 als Kandidatengen vorzuziehen ist.

Letztendlich können aber sowohl mit Myo15 als auch mit Kcnj12 zwei sehr

interessante Kandidatengene für die LEW-ci2 Rattenmutante in der vorliegenden

Arbeit vorgestellt werden. Die Identifikation des Gens, das für den ci2-Phänotypen

verantwortlich ist, erfordert eine positionelle Klonierung, die in Folgeuntersuchungen

(Kapitel 5.5) vorgenommen werden muss.

111

5.2 Untersuchungen zum Phänotypen und zur Genetik der BH.7A/Ztm-

ci3 Ratte


Ziel der Verhaltensuntersuchungen war wiederum eine Bestimmung der Phänotypen

der Individuen der (BN/Ztm x BH.7A/Ztm-c i3 )F1 x BH.7A/Ztm-c i 3

Rückkreuzungspopulation (N2). Wie zuvor beschrieben (Kapitel 5.1.1) sollten die N2-

Individuen, die homozygote Träger der ci3-Mutation (Rotationsverhalten) waren,

ermittelt werden, um die bei der Kopplungsanalyse (Kapitel 4.2) festgestellten

Genotypen mit den Phänotypen der Rückkreuzungsindividuen abgleichen zu können

und somit einen Hinweis auf Kopplung des untersuchten Markers zur ci3-Mutation zu

erlangen.

5.2.1.1 Untersuchungen des Rotationsverhaltens

Bei 73 der 154 untersuchten N2-Individuen konnte Rotationsverhalten nachgewiesen

werden. Dabei wurde dieses Verhalten, wie es für den Parentalstamm BH.7A/Ztm-ci3

beschrieben ist (LESSENICH et al., 2001), sowohl unter Stress, als auch spontan

auftretend beobachtet. Mögliche Varianzen im Phänotyp – ausgelöst durch

modulierende Gene des Kreuzungspartner BN/Ztm – traten bei betroffenen N2-

Tieren nicht auf.

112

5.2.2 Genetische Analysen zur BH.7A/Ztm-ci3 Rattenmutante

5.2.2.1 Vorläufige Mikrosatellitenmarker-gestützte Kopplungsanalyse

Die mittels anonymer Mikrosatellitenmarker untersuchte Rückkreuzungspopulation

bestanden jeweils aus einer Gruppe von Tieren mit abnormen Phänotypen und einer

Gruppe von phänotypisch unauffälligen Tieren. Dabei zeigte sich eine Inzidenz

bezüglich des ci3-Phänotypen (Rotationsverhalten) von nahezu 50 %. Dies kann als

deutlicher Hinweis gewertet werden, dass es sich hier um einen monogenetisch

verursachten Phänotypen handelt.

Ziel der Kopplungsanalyse war die Identifikation und Eingrenzung der Region,

welche die ci3-Mutation trägt.

5.2.2.1.1 Anonyme Marker und ihre Assoziation mit dem ci3-Phänotypen

Sämtliche auf den Chromosomen 1 bis 10 und 12 bis 20 untersuchten Marker wiesen

keine signifikanten Abweichungen von dem zu erwarteten Genotypenverhältnis (1:1)

innerhalb beider N2 Gruppen auf und lieferten somit kein Hinweis auf Kopplung zu

der ci3-Mutation. Hierdurch kann allerdings nicht ausgeschlossen werden, dass auf

diesen Autosomen möglicherweise Gene lokalisiert sind, die einen modulierenden

Einfluß auf den ci3-Phänotypen haben, da hier nur ein Marker pro Chromosom

untersucht wurde. Nach Identifikation einer ausreichend großen Anzahl polymorpher

Mikrosatelliten sollte in Folgeuntersuchungen (Kapitel 5.5) dieser Möglichkeit durch

eine vollständige Kopplungsanalyse (Intermarker-Abstand von ca. 25 cM)

nachgegangen werden.

Lediglich 12 von 21 untersuchten RNO11-Markern erwiesen sich als polymorph für

die eingesetzte Rückkreuzung. Bei den 12 auf Chromosom 11 untersuchten Markern

konnte ein signifikanter Hinweis auf Kopplung zu der ci3-Mutation festgestellt

werden. Bei dem „Peak-Marker“ D11Rat67 wurde eine Rekombinationsfrequenz von

8,5 % innerhalb der Gruppe, der den ci3-Phänotypen aufweisenden N2-Individuen,

113

festgestellt. Dies entspricht einem wahrscheinlichen Abstand dieses Markers zu der

ci3-Mutation von 8,5 cM.

Somit konnte die Lokalisation der ci3-Mutation eindeutig auf Chromosom 11

bestimmt werden. Für eine Feinkartierung dieser Mutation sollten in Folgearbeiten

(Kapitel 5.5) weitere polymorphe RNO11-Marker eingesetzt werden, die bis dahin zur

Verfügung stehen könnten. Sollte dies nicht der Fall sein bestünde als Alternative die

Möglichkeit einen Kreuzungspartner mit ausgeprägter genetischer Divergenz zum

BH.7A/Ztm-ci3 Stamm (z.B. PAR/Ztm) für die Zucht einer neuen Rückkreuzung

einzusetzen.

5.2.2.2 Computer- und Datenbank-gestützte genetische Analysen

5.2.2.2.1 Gengekoppelte Marker und ihre Assoziation mit dem ci3-

Phänotypen

Der Vergleich mit dem Genom der Maus („UCSC Genome Bioinformatics“) brachte

das Gen Tagln3, welches für ein neuronales Protein kodiert, als mögliches

Kandidatengen hervor. Es wurde - zusammen mit dem Nachbargen Morc, welches

zur Absicherung der Lokalisation von Tagln3 mitkartiert wurde - mittels eines

gengekoppelten Markers kartiert und auf Assoziation mit dem ci3-Phänotypen

geprüft. Des Weiteren sollte das Gen Drd3, welches laut der „UCSC Genome

Bioinformatics“ Datenbank auf RNO11 lokalisiert ist, mit Hilfe eines gengekoppelten

Markers untersucht werden.

Tagln3 (Synonym: NP25) kodiert für das Protein Transgelin 3 (Synonym: NP25). Das

Gen wurde als cDNA-Klon aus dem Gehirn der Ratte isoliert. Es ist spezifisch für das

Gehirn und wird dort ubiquitär exprimiert. Aufgrund dieser Verbreitung wird

Transgelin 3 eine bedeutende Rolle in der Funktion neuronaler Systeme

zugesprochen (REN et al., 1994).

114

Eine mögliche Beteiligung dieses Gens an dem ci3-Phänotypen wurde mittels eines

in der genomischen Sequenz von Tagln3 lokalisierten Markers (D11Ztm2) geprüft.

Die Lokalisation des Gens konnte mit dieser Methode auf RNO11 bei 28,8 cM

bestimmt werden, wobei eine signifikante Kopplung zu der ci3-Mutation vorlag.

Allerdings rekombinierten an diesem Locus fünf der 59 N2 Individuen, die einen

betroffenen Phänotypen aufwiesen. Aufgrund dieser Tatsache kann Tagln3 als

Kandidatengen für den ci3-Phänotypen ausgeschlossen werden.

Drd3 kodiert für den Dopamin-D3-Rezeptor (DRD3). Dieser Rezeptor wurde längere

Zeit auf eine Beteiligung an der Ausprägung von Schizophrenie beim Menschen

untersucht, wobei neuere Untersuchung Veränderungen in DRD3 eine

prädispositionierende Rolle aberkennen (ANNEY, et al., 2002; CHONG, et al., 2003).

Interessanterweise ist aber eine gezielte Mutation in der Drd3tm1Dac-Mausmutante

beschrieben, bei der die Funktion des Rezeptors eliminiert wurde. Homozygote

Individuen wiesen gesteigerte lokomotorische Aktivität und ein gehäuftes Aufrichten

(„rearing behavior“) auf. Dieses Verhalten lässt den Schluss zu, dass dieser

Rezeptor eine inhibitorische Rolle in der Beeinflussung bestimmter

Verhaltensabläufe spielt (ACCILI et al., 1996). Tatsächlich ist eine deutlich

gesteigerte motorische Aktivität neben dem Rotationsverhalten das prägende

Charakteristikum des ci3-Phänotypen. Des Weiteren repräsentieren die

morphologische und neurochemische Asymmetrie bezüglich des dopaminergen

Systems die einzigen festgestellten pathologischen Abweichungen der BH.7A-ci3

Ratte (LESSENICH et al., 2001). Aufgrund dieser Befunde und seiner Lokalisation

auf RNO11 muss Drd3 als funktionelles Kandidatengen für den ci3-Phänotypen

betrachtet werden.

Eine Überprüfung der Assoziation dieses Gens mit dem ci3-Phänotyp mit Hilfe eines

gekoppelten Mikrosatelliten war nicht möglich, da sich sämtliche 13 untersuchten

Marker als nicht polymorph für die N2 Individuen erwiesen. An dieser Stelle sei

jedoch darauf hingewiesen, dass sich die Lokalisation von Drd3 auf RNO11

beginnend ab dem 30270000. bp („UCSC Genome Bioinformatics“) in einem Intervall

befindet, welches von den Markern D11Rat24 (beginnend ab 25718102. bp; „UCSC

115

Genome Bioinformatics“) und D11Rat67 (beginnend ab 45325473. bp; „UCSC

Genome Bioinformatics“) flankiert wird. Da es sich bei D11Rat67 um den Marker mit

der stärksten Assoziation mit dem ci3-Phänotypen handelt, kann davon

ausgegangen werden, dass Drd3 in der zentralen Assoziationsregion lokalisiert sein

müsste. Entsprechend wurden weitere Untersuchungen (PCR-Nachweis der Exone;

Kapitel 5.2.2.2.2) dieses Gens vorgenommen.

Allerdings ist die zentrale Assoziationsregion auf RNO11 noch nicht ausreichend

feinkartiert worden, um sich auf Drd3 als einziges Kandidatengen festzulegen. Eine

weitere Untersuchung dieser Region mit Hilfe von Mikrosatellitenmarkern (Kapitel

5.5) ist daher unabdingbar, um mögliche weitere Kandidatengene zu identifizieren.

5.2.2.2.2 Nachweis einzelner Exone des Kandidatengens Drd3 im Genom

der BH.7A/Ztm-ci3 Ratte

Aufgrund seiner wahrscheinlichen Lokalisation innerhalb des zentralen

Assoziationsbereiches auf RNO11 und seiner Bedeutung als potentielles

Kandidatengen für den ci3-Phänotypen (Kapitel 5.3.1) wurde Drd3 weiter untersucht.

Mit Hilfe von Computer-generierten Primern konnten die sieben Exone dieses Gens

im Genom der BH.7A/Ztm-ci3 Ratte nachgewiesen werden. Mit Hilfe dieser Primer

wurde auch genomische DNA des Hintergrundstammes BH.7A/Ztm bzw. BH/Ztm

analysiert. Aus dem Vergleich der PCR-Produkte lässt sich ableiten, dass keine

größeren Deletionen innerhalb der exprimierten Sequenz dieses Gens bei der

BH.7A-ci3 Ratte vorliegen können. Damit können jedoch Veränderungen innerhalb

dieses Gens, die zu einer Fehlfunktion des Dopamin D3-Rezeptors führen können,

nicht ausgeschlossen werden. Denkbar wären Punktmutationen oder im Agarosegel

nicht erfassbare, kleinere Deletionen. Solche Veränderungen in der Erbsubstanz sind

nur durch Sequenzanalysen der einzelnen PCR-Produkte nachzuweisen bzw.

auszuschließen. Diese Untersuchungen sollten als weiterführende Analysen dieser

Mutante durchgeführt werden (Kapitel 5.5).

116

5.3 Vergleich der LEW/Ztm-ci2 bzw. BH.7A/Ztm-ci3 Ratte mit genetisch

bedingten Erkrankungen des Menschen und die Bedeutung beider

Rattenmutanten als mögliche Tiermodelle

LEW/Ztm-ci2:

Aufgrund der bisherigen funktionellen Befunde wurde die LEW/Ztm-ci2 Ratte als

mögliches Tiermodell für hereditäre Taubheitsformen vom neurosensorischen Typ

beim Menschen eingestuft (KAISER et al., 2001). Mit der stargazer (stg)- bzw. jerker

(je)-Ratte (TRUETT et al., 1994) existiert bereits eine Rattenmutante, die ebenfalls

Innenohrdegenerationen aufweist und auch in weiteren Aspekten ihres Phänotypen

der LEW-ci2 Ratte ähnelt, so dass anfangs Überlegungen bestanden, beide

Mutanten einem cis-trans-Test (Komplementationstest) zu unterziehen. Für je

(Synonym: stg) konnte jedoch eine Kopplung mit dem Pigmentierungslocus B (black)

sowie weiteren anonymen Markern auf RNO5 (TRUETT et al., 1996) und somit ein

Unterschied zur LEW-ci2 Rattenmutante gezeigt werden.

Aus den jüngsten Befunden zur Retina (Netzhautdegeneration in Form einer Retinitis

pigmentosa) von homo- und heterozygoten LEW-ci2 Ratten (Gockeln et al., 2003),

die erst durch den Hinweis auf Myo15 als mögliches Kandidatengen durchgeführt

wurden, kann die LEW/Ztm-ci2 Ratte jetzt eindeutig als Modell für syndromale

Taubblindheit angesehen werden.

Über 40 dieser Syndrome sind beim Menschen beschrieben (PETIT, 2001). Zu

diesen Erkrankungen gehört das „Kearns-Sayre Syndrom“ (KSS). Neben einer

Netzhaut-Aderhautdystrophie, Hörstörungen und vestibulärer Fehlfunktion ist hierbei

aber auch eine Muskeldystrophie zu beobachten (KEARNS, 1965), welche bei der

LEW-ci2 Ratte nicht vorliegt. Zudem wird dieses Syndrom mitochondrial vererbt

(LESTIENNE und PONSOT, 1988).

Beim „Bardet-Biedl Syndrom“ (BBS) kann die Netzhaut-Aderhautdystrophie mit einer

Polydaktylie, einer congenitalen Fettsucht, neurosensorischer Taubheit, geistiger

117

Retardierung und Hypogonadismus vergesellschaftet sein (AMMANN, 1970). Von

den bisher sieben identifizierten BBS-Loci (KATSANIS et al., 2001) kartiert keiner auf

Chromosom 17 des Menschen, welches das Homolog zu RNO10 darstellt, dem

Chromosom auf dem die ci2-Mutation lokalisiert ist.

Das „Alstrom Syndrom“ (ALMS) wird autosomal rezessiv vererbt und ist dem

Phänotypen des BBS bis auf die Polydaktylie, der geistigen Retardierung und dem

Hypogonadismus sehr ähnlich (ALSTORM et al., 1959). Verantwortlich für das ALMS

sind Mutationen im ALMS1 Gen, welches auf Chromosom 2 des Menschen lokalisiert

ist (COLLIN et al., 1997; COLLIN et al., 2002).

Patienten mit „Refsum Syndrom“ entwickeln ebenfalls der Retinitis pigmentosa

ähnliche Symptome, die sich oft durch Nachtblindheit ankündigen und

Schwerhörigkeit (ASHENHURST et al., 1958). Weitere Symptome des „Refsum

Syndroms“ sind periphere Neuropathien und Ataxien. Als Ursache werden

Mutationen im PHYH (HSA10p-11.2) oder dem PEX7 Gen (HSA6q22-q24) vermutet

(NADAL et al., 1995; JANSEN et al., 1997; MIHALIK et al., 1997).

Eine Bedeutung der LEW-ci2 Ratte als mögliches Tiermodell für eine dieser oben

genannten Erkrankungen muss folglich aufgrund der die Taubblindheit begleitenden

Symptome bei diesen Syndromen sowie den bisherigen Erkenntnissen zu deren

genetischem Ursprung eher ausgeschlossen werden.

Weitreichende Homologien weist der ci2-Phänotyp dagegen zu dem „Usher

Syndrom“ Typ1 des Menschen (Kapitel 2.4.1.1) auf. Das „Usher Syndrom“ macht

über 50 % der hereditären syndromalen Taubblindheitsformen des Menschen aus

(VERNON, 1969). Von den drei klinischen Erscheinungsformen [Usher Typ 1

(USH1), Typ 2 (USH2) und Typ 3 (USH3); DAVENPORT und OMENN, 1977]

repräsentiert USH1 den schwerwiegendsten Subtypen. Tatsächlich ist die gesamte

Symptomatik des USH1 bei der LEW-ci2 Ratte wiederzufinden. Wie betroffene

Patienten zeichnen sich homozygote Merkmalsträger der ci2-Mutation durch

angeborene Taubheit und vestibuläre Fehlfunktion neurosensorischen Ursprungs

aus (KAISER et al., 2001). Auch die teilweise beim Menschen auftretenden Ataxien

(PETIT, 2001) sind bei diesen Ratten zu beobachten (LÖSCHER et al., 1996).

118

Entscheidend ist, dass ein visueller Funktionsverlust bei den LEW-ci2 Ratten vorliegt,

der wie beim Menschen durch eine progressive Netzhautdystrophie rückzuführen ist

(Gockeln et al., 2003).

Die bisher als mögliches Tiermodell für das „Usher Syndrom“ Typ 1B (USH1B)

gehandelten shaker1-Mausmutanten zeigen zwar cochleäre und vestibuläre Defekte

vom neuroepithelialen Typ und eine bei ERG-Messungen festgestellte reduzierte

Photorezeptorantwort, die allerdings keinesfalls auf völligen visuellen

Funktionsverlust schließen lässt (LORD und GATES, 1929; DEOL, 1956; KIKUCHI

und HILDING, 1965; STEEL und BOCK, 1983; RICHARDSON et al., 1997; SELF et

al., 1998; RICHARDSON et al., 1999; LIBBY und STEEL, 2001). Jedoch fehlen

diesen Mausmutanten Degenerationen der Netzhaut (HASSON, et al., 1997; LIU, et

al., 1998; LIU et al., 1999; TITUS, 1999).

Der in dieser Arbeit mit Hilfe eines gengekoppelten Mikrosatellitenmarkers erbrachte

Hinweis auf ein unkonventionelles Myosin-Gen (Myo15), als eines von zwei

möglichen funktionellen Kandidatengenen für den ci2-Phänotypen (Kapitel 5.3.1) fügt

sich nahtlos in das Bild der LEW-ci2 Ratte als hereditäres Modell für USH1 ein. Auch

wenn für USH1B eine Mutation im MYO7A Gen verantwortlich ist, welches wie

Myo15 für ein unkonventionelles Myosin kodiert, handelt es sich doch bei Myosin XV

und Myosin VIIa um strukturell eng verwandte Proteine innerhalb der Familie der

unkonventionellen Myosine (CHEN et al., 1996; MBURU et al., 1997; LIANG et al.,

1999). Es ist vorstellbar, dass Unterschiede hinsichtlich Expression und Aufgaben

beider Myosine im Bereich der Netzhaut zwischen Mensch und Ratte (sowie Maus)

vorliegen könnten. So wurde zwar Myosin VIIa beim Menschen und der Maus sowohl

in den Photorezeptoren, als auch im Pigmentblatt, aber nur beim Menschen auch in

den Synapsen der Photorezeptoren nachgewiesen (El-Amraoui et al., 1996; Liu et

al., 1997). Möglicherweise ist ein Unterschied zwischen Mensch und Ratte wie auch

Maus in der funktionellen Aufgabe beider Myosine im Bereich der Netzhaut eine

Erklärung dafür, dass bisher beschriebene Mutationen in MYO15 nur in einer nicht

syndromartigen Taubheitsform (DFNB3) des Menschen resultieren (WANG et al.,

119

1998), während die shaker1-Mausmutanten, die verschiedene Mutationen in Myo7a

aufweisen, keine progressive Netzhautdystrophie ausbilden.

Obwohl eine progressive Netzhautdystrophie auch bei Mäusen nicht zu finden ist, die

Mutationen in Myo15 aufweisen (shaker2: LIANG et al., 1998; PROBST et al., 1998;

ANDERSON et al., 2000), muss doch festgehalten werden, dass auch beim

Menschen Mutationen in MYO7A nicht zwangsläufig zum „Usher Syndrom“ Typ 1B

führen müssen. Sie können vielmehr auch in einer nicht syndromartigen, rezessiv

vererbten Taubheitsform (DFNB2) und einer nicht syndromartigen, dominant

vererbten Taubheitsform (DFNA11) resultieren (FRIEDMAN et al., 1999).

Untersuchungen zur Funktion und Morphologie der Netzhaut der LEW-ci2 Ratte

zeigten, dass auch heterozygote Träger der ci2-Mutation von der progressiven

Netzhautdystrophie betroffen sind (Anhang Abb. 12; GOCKELN et al., 2003), jedoch

keine Veränderungen des Innenohres aufweisen. Dies entspricht der Befundsituation

beim Menschen. Hier wird davon ausgegangen, dass knapp ein Viertel aller Retinitis

pigmentosa Patienten auch taub bzw. an einer Form des „Usher Syndroms“ erkrankt

sind (BOUGHMAN et al., 1983).

In jüngster Vergangenheit (Juni 2003) wurde ein neues Mausmodell für das „Usher

Syndrom“ vorgestellt. Bei der C57BL/6;129S5/SvEvBrd-Slc4a7tm1-Mausmutante

wurde das Slc4a7 Gen (MMU14), welches für einen Natriumbicarbonat-Kotransporter

(NBC3) kodiert, durch gerichtete Mutation inaktiviert. Homozygote Träger dieser

Mutation zeichnen sich durch Beeinträchtigungen des retinalen und cochleären

Systems aus. Histologische Veränderungen im vestibulären System und damit

verbundene Funktionsausfälle sind - im Gegensatz zu der LEW-ci2 Mutante und

USH1 Patienten - nicht zu beobachten (BOK et al., 2003). Entsprechend wird diese

Mutante als Modell für USH2 gehandelt (BOK et al., 2003), zumal SLC4A7

(HSA3p22) ein Kandidatengen für USH2B darstellt (HMANI et al., 1999).

Basierend auf den aktuellen Erkenntnissen zur Genetik und aufgrund des in

sämtlichen Zügen USH1 entsprechenden Phänotypen kann somit die LEW/Ztm-ci2

Ratte als hereditäres Tiermodell für das „Usher Syndrom“ Typ1 des Menschen

120

eingestuft werden. Dennoch sind weitere funktionelle Studien, insbesondere zu den

Veränderungen an der Netzhaut, und genetische Analysen (Positionsklonierung und

Sequenzierung der Defektgene) zwingend notwendig (Kapitel 5.5).

BH.7A/Ztm-ci3:

Die in dieser Arbeit vorgenommenen Untersuchungen zur Genetik der BH.7A-ci3

Ratte weisen bisher auf Drd3 als funktionelles Kandidatengen hin, welches für den

Dopamin D3-Rezeptor kodiert. Dies passt zur Hypothese, dass die phänotypischen

Abweichungen (Rotationsverhalten, Hyperaktivität) mit den festgestellten

lateralisierten Abnormitäten im Bereich des dopaminergen Systems der

Basalganglien zusammenhängen (LESSENICH et al., 2001).

Sollte sich in weitergehenden genetischen Untersuchungen (Kapitel 5.5) tatsächlich

eine Mutation in diesem Gen als verantwortlich für den ci3-Phänotypen erweisen, so

würde es doch schwierig bleiben auf eine spezifische Erkrankung des Menschen

hinzuweisen. Dies liegt in der Tatsache begründet, dass die Bedeutung des D3-

Rezeptors für Erkrankungen des Menschen nicht geklärt ist.

Hervorzuheben sind hier noch die Untersuchungen zur Assoziation von DRD3 mit

der Ausbildung von Schizophrenie beim Menschen. Insgesamt wird aber über eine

solche Beteiligung kontrovers diskutiert (ANNEY et al. 2002; CHONG et al., 2003).

Nachgewiesen wurde die Assoziation einer Mutation in D R D 3 mit der

Empfänglichkeit für die Dyskinesia tarda, die durch den Einsatz von

antipsychotischen Medikamenten ausgelöst wird (LERER et al., 2002).

Der Zusammenhang von Polymorphismen in D R D 3 und dem

Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitäts-Syndrom (ADHS) des Menschen wurde

ebenfalls untersucht. Dies erscheint insofern interessant, als sowohl die BH.7A-ci3

Ratte, als auch eine Maus mit Modifikationen in Drd3 (Drd3tm1Dac) sich durch

Hyperaktivität auszeichnen (ACCILI et al., 1996; LESSENICH et al., 2001). Ein

Zusammenhang von Mutationen in DRD3 und der Ausbildung des ADHS konnte

jedoch noch nicht nachgewiesen werden (MUGLIA et al., 2002).

121

Somit könnte die Bedeutung der BH.7A-ci3 Ratte in der weiteren Erforschung des

dopaminergen Systems liegen. Falls sich in nachfolgenden Studien (Kapitel 5.5) eine

Mutation in Drd3 als ursächlich für den ci3-Phänotypen nachweisen ließe, könnten

mit dieser Mutante insbesondere Abläufe untersucht werden, die durch den D3-

Rezeptor vermittelt werden.

Des Weiteren ist die BH.7A-ci3 Ratte gegenüber anderen Mutanten mit

Rotationsverhalten, wie z.B. der jerker (je)- bzw. stargazer (stg)-Rattenmutante

(TRUETT et al., 1994), hervorzuheben, da sie ein funktionsfähiges cochleäres und

vestibuläres System aufweist (LESSENICH et al., 2001). Entsprechend muss nach

dem bisherigen Erkenntnisstand tatsächlich davon ausgegangen werden, dass der

ci3-Phänotyp auf die Veränderungen im dopaminergen System zurückzuführen ist,

während die jerker-Mutante und die LEW-ci2 Ratte zwar auch Veränderungen in

diesem System aufweisen (BROCK und ASHBY, 1996; LÖSCHER et al., 1996), aber

gleichzeitig durch Innenohrdegenerationen charakterisiert sind.

122

5.4 Abschließende vergleichende Betrachtung der LEW/Ztm-ci2 und

BH.7A/Ztm-ci3 Ratte

Mit der LEW/Ztm-ci2 und BH.7A/Ztm-ci3 Ratte wurden in der vorliegenden Arbeit

zwei Mutanten untersucht, die sich beide durch spontanes und lateralisiertes

Rotationsverhalten sowie Hyperaktivität auszeichnen. Trotz dieser starken

Ähnlichkeiten im Phänotyp konnte durch die genetischen Untersuchungen der

vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass es sich hierbei um zwei vollkommen

unterschiedliche Tiermodelle handelt.

Bei der BH.7A/Ztm-ci3 Ratte verdichteten sich durch den Hinweis auf Drd3 (RNO11)

als potentielles Kandidatengen die Anzeichen, dass die Veränderungen im

dopaminergen System der Basalganglien als ursächlich für den ci3-Phänotyp

eingestuft werden können. Somit ist die BH.7A/Ztm-ci3 Mutante weiterhin als

mögliches Modell zur Untersuchung dieses Systems einzustufen.

Die Befunde aus den Untersuchungen zur Genetik der LEW/Ztm-ci2 Mutante

(Kandidatengene auf RNO10: Myo15, Kcnj12) weisen dagegen klar auf die schon

zuvor festgestellten Veränderungen im akustischen und vestibulären System

(KAISER et al., 2001) hin. Darüber hinaus konnte neben der neurosensorischen

Degeneration des Innnenohres eine progressive Retinopathie als weiterer

Bestandteil des ci2-Phänotypen durch GOCKELN et al. (2003) festgestellt werden.

Folglich repräsentiert die LEW/Ztm-ci2 Rattenmutante ein hereditäres Modell für das

„Usher Syndrom“ Typ1 des Menschen.

Somit bietet sich für mögliche Folgeuntersuchungen (Kapitel 5.5) nicht ein weiterer

Vergleich beider in dieser Arbeit beschriebenen Mutanten, sondern viel mehr eine

vergleichende Betrachtung der LEW/Ztm-ci2 mit der PAR/Ztm-ci4 Ratte an. Die

PAR/Ztm-ci4 Ratte stellt eine neue Mutante dar, die spontan im Jahre 2002 am Ztm

auftratt, ebenfalls Rotationsverhalten aufweist und ersten Erkenntnissen nach taub

und blind ist (GLAGE et al., 2003). Aufgrund dieser vorläufigen Befunde könnte es

sich bei dieser Rattenmutante möglicherweise um ein Tiermodell für das „Usher

Syndrom“ Typ3 (USH3) handeln, womit ein Vergleich mit der LEW/Ztm-ci2 Mutante

äußerst interessant wäre.

123

5.5 Ausblick

Bei den im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten genetischen Untersuchungen zur

LEW/Ztm-ci2 und BH.7A/Ztm-ci3 Rattenmutante konnte klar gezeigt werden, dass

die Mutationen auf Chromosom 10 (ci2) bzw. Chromosom 11 (ci3) des

Rattengenoms lokalisiert sind. Innerhalb der zentralen Assoziationsbereiche

(Suszeptibilitätsregionen) konnten Myo15 und Kcnj12 für den ci2-Phänotypen und

Drd3 für den ci3-Phänotypen als Kandidatengene ausgemacht werden.

Zur Abklärung einer möglichen Beteiligung dieser Gene (Myo15, Kcnj12, Drd3) an

der Ausprägung des ci2- bzw. ci3-Phänotypen sind weitere Analysen angebracht. Es

würde sich zunächst anbieten, wie es bereits in dieser Arbeit für das Drd3 Gen

durchgeführt wurde, die Exone der beiden anderen Kandidaten mittels PCR-

Amplifikation im Genom der LEW/Ztm-ci2 Ratte nachzuweisen. Es sollte sich dann

eine Klonierung sämtlicher PCR-Produkte von Myo15 und Kcnj12 sowie auch Drd3 in

Bakterien anschließen, um diese Sequenzanalysen unterziehen zu können, die

mögliche Mutationen innerhalb dieser drei Gene aufdecken könnten. Des Weiteren

sollte eine positionelle Klonierung der Kandidatengene-tragenden Regionen unter

Verwendung von BAC- und PAC (= P1-bacteriophage artificial chromosome)-Klonen

durchgeführt werden.

Zusätzlich sollten Expressionsanalysen der drei Kandidatengene in für beide

Phänotypen kritischen Geweben (Gehirn, Innenohr, Netzhaut) vorgenommen

werden. Hier würden sich insbesondere „Northern Blot“- und „Real Time“-PCR-

Untersuchungen anbieten. Ebenso könnten mit Positronemissionstomographie

(PET)-Geräten der neuesten Generation, die sich durch eine auch für Mäuse und

Rat ten notwend ige Auf lösung ausze ichnen, n ich t invas ive

Longitudinaluntersuchungen zu den Expressionsmustern der Kandidatengene

durchgeführt werden.

Ein Vergleich der Ergebnisse aus Sequenz- und Expressions-Analysen würde auch

Schlüsse darauf zu lassen, ob möglicherweise nicht die eigentliche Sequenz der

Gene, sondern stromaufwärts lokalisierte Promoter-Regionen von den Mutationen

betroffen sind.

124

Aus den Untersuchungen von GOCKELN et al. (2003) geht hervor, dass auch

heterozygote Träger der ci2-Mutation eine Retinitis pigmentosa aufweisen, während

sie aber keine Degeneration des sensorischen Epithels des Innenohres und auch

kein Rotationsverhalten zeigen. Es sollte folglich geprüft werden, ob möglicherweise

ein weiteres Gen an der Ausbildung des ci2-Phänotypen beteiligt ist, oder ob es sich

hierbei um einen dominant-negativen Effekt einer Mutation in den bereits

identifizierten Kandidatengenen (Myo15, Kcnj12) handelt. Denkbar wäre auch die

Möglichkeit, dass beide Kandidatengene für den ci2-Phänotypen mutiert sind, wobei

eine Mutation sowohl für das Rotationsverhalten als auch für die neurosensorische

Degeneration des Innenohrs und die andere für die progressive Retinopathie

verantwortlich sein könnte. Neben den bereits oben erwähnten Expressions- und

Sequenz-Analysen sollte zur Prüfung dieser Möglichkeiten eine

Rückkreuzungspopulation angelegt werden, bei der - aufgrund des aller

Wahrscheinlichkeit nach dominanten Vererbungsmusters der progressiven

Retinopathie - die Individuen der Filialgeneration mit demjenigen Elternteil verpaart

werden, der keine Veränderungen der Netzhaut aufweist (z.B. BN). Anschliessend

sollten die N2-Individuen systematisch auf Retinitis pigmentosa untersucht werden.

(ERG-Messungen). Unter Zuhilfenahme einer so phänotypisierten N2-Population

könnte geprüft werden (Kopplungsanalyse) ob möglicherweise weitere Loci im

Genom der LEW-ci2 Ratte eine Assoziation mit der progressiven Retinopathie

zeigen.

Bei der Untersuchung zur Genetik der BH.7A/Ztm-ci3 Ratte sollte die in der

vorliegenden Arbeit in Form eines Übersichtsverfahrens (ein Marker pro

Chromosom) begonnene Kopplungsanalyse, nach Identifikation einer ausreichenden

Anzahl polymorpher Mikrosatelliten, fortgesetzt werden. Zum einen könnte so die

modulierende Beteiligung weiterer Loci (außerhalb von RNO11) im Genom der

BH.7A/Ztm-ci3 Ratte an der Entstehung des ci3-Phänotypen untersucht werden.

Zum anderen könnte durch eine Erhöhung der Mikrosatellitenmarkerdichte auf

RNO11 eine weitere Eingrenzung der zentralen Assoziationsregion auf einen nicht

rekombinanten Bereich erreicht werden, um so mögliche weitere Kandidatengene für

125

die BH.7A/Ztm-ci3 Mutante zu identifizieren, falls eine Mutation innerhalb des

Kandidatengens Drd3 nicht als ursächlich für die Entsehung des ci3-Phänotypen

belegt werden könnte. Durch eine Einbeziehung der im Verlauf dieser Arbeit

gezüchteten und phänotypisierten N2-Individuen in die Kopplungsanalyse, die eine

sehr genaue Identifikation von Rekombinationsereignissen zuließe, könnte dieser

nicht rekombinante Bereich sehr exakt bestimmt werden. Im Zusammenhang mit der

Identifikation neuer Kandidatengene für die BH.7A/Ztm-ci3 Mutante würde sich auch

die Generierung einer physikalischen Karte der nicht rekombinanten Region, wie es

in dieser Arbeit bereits für RNO10 durchgeführt wurde, anbieten. Sollte es weiterhin

nicht möglich sein eine ausreichende Anzahl polymorpher Mikrosatellitenmarker zu

identifizieren, um die genetischen Analysen fortzusetzen, bestünde als Alternative

die Möglichkeit einen Kreuzungspartner mit ausgeprägter genetischer Divergenz zum

BH.7A/Ztm-ci3 Stamm (z.B. PAR/Ztm) für die Zucht einer neuen Rückkreuzung

einzusetzen.

Die Untersuchung von modulierenden Einflüssen des genetischen Hintergrundes

sowohl des LEW/Ztm- als auch des BH.7A/Ztm-Stammes könnte durch die

Entwicklung congener Stämme, also einer Übertragung der ci2- bzw. ci3-Mutation

auf einen anderen Rattenstamm, vorgenommen werden.

Neben genetischen Analysen sollten auch weitere funktionelle Untersuchungen der

LEW-ci2 und BH.7A-ci3 Rattenmutanten folgen. Insbesondere bietet sich der Einsatz

moderner nicht invasiver bildgebender Vefahren an. Neben den bereits erwähnten

PET-Geräten kann mittlerweile auch die Magnetresonanztomograpie (MRT) bei

Ratten und Mäusen angewandt werden. Mit Hilfe der PET-Technologie könnten nicht

nur die Expressionsmuster der Kandidatengene (Myo15, Kcnj12, Drd3) sondern auch

Unterschiede zwischen den beiden Mutanten und den Hintergrundstämmen

(LEW/Ztm, BH.7A/Ztm) bezüglich der entsprechenden Produkte (Myosin XV, Kir2.2,

DRD3) untersucht werden.

MRT würde einen Vergleich der Funktionen bestimmter Gehirnareale (BH.7A-ci3,

LEW-ci2) sowie des visuellen und akustischen bzw. vestibulären Systems (LEW-ci2)

126

zwischen den beiden Mutanten und den entsprechenden Hintergrundstämmen

erlauben. Hierdurch könnte den bisherigen Erkenntnissen zum visuellen, akustischen

und vestibulären (ci2-Mutation) bzw. dopaminergen System (ci3-Mutation) weiter

nachgegangen werden. Bei der LEW/Ztm-ci2 Rattenmutante könnte geprüft werden,

ob z.B. jene Gehirnareale, welche die Impulse des visuellen Systems und des

Innenohres verarbeiten, Funktionsunterschiede im Vergleich zum LEW/Ztm

Hintergrundstamm aufweisen. Darüber hinaus könnten so bei der BH.7A-ci3

Rattenmutante weitere Gehirnregionen untersucht werden, um festzustellen, ob

neben dem dopaminergen System der Basalganglien auch andere Areale von der

ci3-Mutation betroffen sind.

Es sind auch weitere funktionelle Untersuchung zu der progressiven Retinopathie der

LEW/Ztm-ci2 Ratte notwendig. Insbesondere der Zeitpunkt der Manifestation der

Retinitis pigmentosa, der bisher grob bestimmt wurde (zwischen dem 4. und dem 6.

Lebensmonat), sollte anhand von Longitudinalstudien genau analysiert werden.

Ausserdem sollte die Phagozytosefunktion und Apoptoseaktivität der Zellen des RPE

geprüft werden.

Abschliessend sei nochmals darauf hingewiesen, dass in die weiteren

Untersuchungen der LEW/Ztm-ci2 Ratte die neue PAR/Ztm-ci4 Mutante

eingebunden werden sollte, die möglicherweise ein Tiermodell für USH3 darstellt.

127

6. Zusammenfassung

Wojciech Chwalisz

Genetische Charakterisierung der LEW/Ztm-ci2 (circling2) und der BH.7A/Ztm-ci3

(circling3) Ratte als Modelle für Taubblindheit des Menschen (USH1) bzw.

Lateralisierung von Hirnfunktionen und Hyperlokomotion

Die LEW/Ztm-ci2 und BH.7A/Ztm-ci3 Ratten repräsentieren zwei Mutanten, die sich

durch spontanes und lateralisiertes Rotationsverhalten sowie Hyperaktivität und, im

Falle der LEW/Ztm-ci2, durch Ataxie und einen Opisthotonus auszeichnen.

Durch langjährige Untersuchungen zu den Phänotypen beider Mutanten konnte eine

neurochemische Lateralität des dopaminergen Systems der Basalganglien

festgestellt werden, wobei BH.7A/Ztm-c i3 Ratten zusätzlich auch eine

morphologische Lateralität hinsichtlich dopaminerger Neurone in diesen Strukturen

des Gehirns aufweisen.

Analysen zur Funktion und Morphologie des Innenohres zeigten, dass bei der

LEW/Ztm-ci2 Ratte Degenerationen vom neurosensorischen Typ vorliegen, die

sowohl die Haarzellen der Cochlea, als auch des vestibulären Systems betreffen und

mit entsprechenden Funktionsausfällen verbunden sind.

Die beiden Rattenmutanten zu Grunde liegende Genetik wurde mit Hilfe klassischer

Kreuzungsmethoden untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass beide Mutationen

autosomal rezessiv vererbt werden und es sich um Mutationen handeln muss, die

unterschiedliche Gene betreffen (Komplementationsanalyse).

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der Frage nachgegangen, in welchen

chromosomalen Bereichen beide Mutationen lokalisiert sind und welche Gene sie

betreffen könnten. Hierzu dienten zwei segregierende Rückkreuzungspopulationen

((LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2; (BN/Ztm x BH.7A/Ztm-ci3)F1 x

B H . 7 A / Z t m - c i 3 ), deren Individuen mit Hilfe neurophysiologischer

Verhaltensuntersuchungen phänotypisch charakterisiert wurden, um sie in

homozygote und heterozygote Merkmalsträger differenzieren zu können. Untersucht

128

wurde das Rotationsverhalten der Individuen beider Rückkreuzungen sowie die

Funktion des auditiven und vestibulären Systems der Individuen der (LEW/Ztm-ci2 x

BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2 Rückkreuzungspopulation. Aufgrund dieser Parameter

(Rotationsverhalten bzw. Rotationsverhalten und Ausfälle des akustischen und

vestibulären Systems) konnte für den ci2- und den ci3-Phänotypen eine Inzidenz von

nahezu 50 % in der jeweiligen N2-Populationen festgestellt werden.

Beide Populationen wurden einer Kopplungsanalyse unter Verwendung anonymer

Mikrosatellitenmarker unterzogen, um die Assoziation beider Phänotypen mit

bestimmten chromosomalen Bereichen zu ermitteln. Hierbei zeigte sich, dass

sämtliche untersuchte Marker auf Chromosom 10 der Ratte (RNO10) eine

signifikante Kopplung zur ci2-Mutation aufwiesen, während sämtliche untersuchten

RNO11-Marker eine signifikante Kopplung zur ci3-Mutation zeigten.

Mit Hilfe eines im Rahmen dieser Arbeit entwickelten, gengekoppelten

Mikrosatellitenmarkers konnte erstmalig die Position des Gens Myo15 im Genom der

Ratte innerhalb der nicht rekombinanten Suszeptibilitätsregion auf RNO10 bestimmt

werden. Myo15 , welches für ein unkonventionelles Myosin kodiert, wird als

mögliches Kandidatengen für die LEW-ci2 Mutante betrachtet. Dies ergibt sich

daraus, dass bereits Mutationen in diesem Gen beschrieben sind, die zum einen bei

betroffenen Menschen und zum anderen bei Mäusen zu neurosensorischen

Innenohrdegenerationen und entsprechenden Funktionsausfällen führen. Basierend

auf Befunden zu MYO7A (Myosin VIIa) bei Mensch und Maus (Myo7a) erfolgten

durch GOCKELN et al. (2003) Untersuchungen zur Funktion und Morphologie der

Netzhaut von LEW/Ztm-ci2 Ratten. Hierbei wurde festgestellt, dass bei den LEW-ci2

Ratten, wie beim „Usher Syndrom“ des Menschen, eine retinale Degeneration in

Form einer Retinitis pigmentosa vorliegt. Durch neurophysiologische

Verhaltensuntersuchungen konnten Hinweise erlangt werden, dass entsprechende

Rückkreuzungsindividuen auch eine Störung des visuellen Systems aufweisen.

Mit Hilfe einer physikalischen Karte der nicht rekombinanten RNO10-Region konnte

ebenfalls die Position des Kcnj12 Gens bestimmt werden. Dieses Gen kodiert für

einen Kaliumeinzelkanal. Es wird auch als Kandidatengen für den ci2-Phänotypen

129

betrachtet, da Kaliumeinzelkanäle sowohl für die Funktion der Netzhaut, als auch des

Innenohres essentiell sind.

Innerhalb der zentralen Assoziationsregion mit dem ci3-Phänotypen auf RNO11 ist

laut der Datenbank „UCSC Genome Bioinformatics“ das Gen Drd3 lokalisiert, das für

den Dopamin D3-Rezeptor kodiert. Somit ist Drd3 ein potentielles Kandidatengen für

den ci3-Phänotypen, dem nach bisherigen Erkenntnisstand eine morphologische und

neurochemische Lateralität des dopaminergen Systems zu Grunde liegt. Im Rahmen

der vorliegenden Arbeit wurden die sieben Exone dieses Gens unter Verwendung

genomischer DNA einer BH.7A/Ztm-ci3 Ratte sowie jeweils einer Ratte des

congenen Stamms BH.7A/Ztm-ci3 und des originären Hintergrundes BH/Ztm mittels

PCR amplifiziert. Hierbei wurden aber keine Längenunterschiede der PCR-Produkte

festgestellt, die auf mögliche größere Deletionen innerhalb dieses Gens hinweisen

würden. Allerdings konnten bisher Punktmutationen in Drd3, die für den ci3-Phänotyp

verantwortlich sind, nicht ausgeschlossen werden.

130

Summary

Wojciech Chwalisz

Genetical characterization of the LEW/Ztm-ci2 (circling2) and the BH.7A/Ztm-ci3

(circling3) rats as animal models for syndromic deafness (USH1) respectively

lateralization of brain function and hyperlocomotion

Both, the LEW/Ztm-ci2 and the BH.7A/Ztm-ci3 rat, carry spontaneous mutations,

which cause lateralized circling behavior and locomotor hyperactivity. The ci2

phenotype is also characterized by ataxia and opisthotonus.

Previous studies have shown a neurochemical lateralization within the dopaminergic

system of the basal ganglia in both rats and a morphological lateralization of

dopaminergic neurons in the BH.7A/Ztm-ci3 rat. In addition, functional and

histological analyses of the inner ear of the LEW/Ztm-ci2 rat revealed degenerations

concerning the hair cells of the cochlea and the vestibular apparatus leading to

profound deafness and vestibular dysfunction.

Using breeding experiments it was shown that both mutations are gentically

transmitted as autosomal recessive traits. Furthermore, a classical complementation

analysis (cis-trans test) clearly indicated that both circling mutations affect different

loci.

In this study genetic analyses were performed in order to identify the chromosomal

localization bearing the ci2 and the ci3 mutation and to present functional candidate

genes. Using anonymous microsatellite markers two backcross populations

((LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2; (BN/Ztm x BH.7A/Ztm-ci3)F1 x

BH.7A/Ztm-ci3)) were analyzed, which were previously phenotyped by behavioral

testing. The incidence of circling behavior in both populations was nearly 50 %,

indicating that the ci2 as well as the ci3 phenotype are caused by a defect in a single

locus. These linkage analyses mapped the ci2 mutation to rat chromosome 10

(RNO10) and the ci3 mutation to RNO11.

131

A gene-linked marker for Myo15 was designed and the position of this gene in the rat

genome described for the first time within the non-recombinant interval of the core

region of association on RNO10. Thus Myo15, which codes for an unconventional

myosin (Myosin XV) that is expressed in the hair cells of the inner ear, can be

regarded as a candidate gene for the ci2 phenotype. This is based on the fact, that

mutations in the homologue genes of human and mouse are known to cause

profound deafness and vestibular dysfunction due to sensorineural degenerations of

the inner ear. Further on, mutations in human MYO7A, a gene that encodes for a

myosin with significant structural similarities to Myosin XV, are known to cause

“Usher Syndrome” 1B, which is characterized by sensorineural hearing loss,

vestibular dysfunction and a progressive retinal degeneration.

Because of the hind, that a mutation in a gene encoding for an unconventional

myosin might be responsible for the ci2 phenotype, GOCKELN et al. (2003)

performed functional and histological analysis of the retina of LEW/Ztm-ci2 rats. This

analysis revealed that LEW-ci2 rats display a progressive retinopathy as described

for the “Usher Syndrome” in Human. In this study behavioral testing of the (LEW/Ztm-

ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2 backcross population indicated that affected

individuals of this backcross also display a loss of retinal function.

A physical map of the non-recombinant interval on RNO10 was generated, which

describes the position of Kcnj12 to this part of the rat genome. This gene, which

codes for an inwardly rectifying potassium channel, can also be regarded as a

candidate gene for the deafblind LEW/Ztm-ci2 rat as these types of channels are

known to play an important role for the physiology of both the retina and the inner

ear.

The „UCSC Genome Bioinformatics“ database describes the chromosomal position

of Drd3 within the core region of association with the ci3 phenotype on RNO11. This

gene codes for the dopamine D3 receptor and can be regarded as a functional

candidate for the phenotype of the BH.7A/Ztm-ci3 rat, which seems to be related to a

lateralization of the dopaminergic system of the basal ganglia. PCR-amplification of

the seven exons of Drd3 was performed in this study using genomic DNA of a

BH.7A/Ztm-ci3 rat and a rat from the backround strain. No differences in the length of

132

the PCR-products could be detected indicating that this gene is not affected by

deletions. This result does not exclude that a single point mutation within the

sequence of Drd3 might be responsible for the phenotype of the BH.7A/Ztm-ci3 rat.

133

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161

8. Anhang

Tabelle 9: Ergebnisse der neurophysiologischen Verhaltensuntersuchungen zur

Prüfung des Rotationsverhaltens und der Funktion des Innenohrs der

(LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2) Individuen

Tiernummer Rotations-VerhaltenAkustischer

Stimulus "Air-Rightning"-Test "Balance"-Test Schwimmtest

1 + - - - s.E.

2 - + + + 5 Min.

3 + - - - s.E.

4 - + + + 5 Min.

5 - + + + 5 Min.

6 + - - - s.E.

7 + - - - s.E.

8 - + + + 5 Min.

9 - + + + 5 Min.

10 - + + + 5 Min.

11 + - - - s.E.

12 - + + + 5 Min.

13 - + + + 5 Min.

14 - + + + 5 Min.

15 - + + + 5 Min.

16 + - - - s.E.

17 - + + + 5 Min.

18 - + + + 5 Min.

19 - + + + 5 Min.

20 + - - - s.E.

21 - + + + 5 Min.

22 + - - - s.E.

23 + - - - 30 Sek.

24 + - - - s.E.

25 + - - - 30 Sek.

26 - + + + 5 Min.

27 - + + + 5 Min.

28 + - - - s.E.

29 - + + + 5 Min.

30 + - - - s.E.

31 + - - - s.E.

162

Fortsetzung von Tabelle 9:

Tiernummer Rotations-VerhaltenAkustischer

Stimulus "Air-Rightning"-Test "Balance"-Test Schwimmtest

32 - + + + 5 Min.

33 + - - - s.E.

34 + - - - s.E.

35 - + + + 5 Min.

36 + - - - 30 Sek.

37 - + + + 5 Min.

38 + - - - s.E.

39 + - - - s.E.

40 + - - - s.E.

41 + - - - s.E.

42 - + + + 5 Min.

43 + - - - s.E.

44 - + + + 5 Min.

45 - + + + 5 Min.

46 + - - - 30 Sek.

47 - + + + 5 Min.

48 - + + + 5 Min.

49 - + + + 5 Min.

50 - + + + 5 Min.

51 - + + + 5 Min.

52 + - - - 30 Sek.

53 + - - - s.E.

54 - + + + 5 Min.

55 + - - - 30 Sek.

Legende zu Tabelle 9:

Die mit dem Symbol „+“ ausgezeichneten N2 Individuen zeigten ein positives

Ergebnis gemäß den in Kapitel 3.2.1 und 3.2.2 beschriebenen Bedingungen.

Die mit dem Symbol „-“ ausgezeichneten N2 Individuen zeigten ein negatives

Ergebnis gemäß den in Kapitel 3.2.1 und 3.2.2 beschriebenen Bedingungen.

Bei den Tieren, die mit der Bezeichnung „s.E.“ in der Rubrik „Schwimmtest“

ausgewiesenen sind erfolgte unmittelbar nach ihrer Verbringung in das

Schwimmbecken eine sofortige Entnahme, da sie nicht in der Lage waren zu

schwimmen.

163

Tabelle 10: Ergebnisse der neurophysiologischen Verhaltensuntersuchungen zur

Prüfung des Rotationsverhaltens der (BN/Ztm x BH.7A/Ztm-ci3)F1 x

BH.7A/Ztm-ci3 Individuen

Tiernummer Rotationsverhalten Tiernummer Rotationsverhalten1 - 35 +2 - 36 -3 - 37 -4 + 38 -5 + 39 -6 + 40 -7 - 41 -8 - 42 +9 + 43 +

10 + 44 +11 - 45 +12 - 46 +13 - 47 -14 - 48 -15 + 49 +16 + 50 -17 - 51 +18 + 52 +19 - 53 -20 - 54 +21 + 55 -22 + 56 +23 + 57 -24 - 58 -25 - 59 +26 + 60 +27 - 61 +28 + 62 +29 + 63 -30 - 64 -31 - 65 -32 - 66 -33 + 67 -34 + 68 +

164


Tiernummer Rotationsverhalten Tiernummer Rotationsverhalten69 + 107 +70 - 108 -71 - 109 +72 + 110 +73 - 111 -74 + 112 +75 - 113 -76 - 114 -77 + 115 +78 + 116 -79 - 117 -80 - 118 -81 + 119 -82 - 120 -83 + 121 -84 + 122 +85 - 123 -86 - 124 -87 + 125 -88 + 126 +89 - 127 -90 + 128 +91 + 129 -92 + 130 +93 - 131 -94 + 132 +95 - 133 -96 + 134 +97 - 135 +98 + 136 -99 - 137 +

100 - 138 +101 + 139 -102 - 140 -103 + 141 -104 + 142 -105 + 143 -106 + 144 -

165


Tiernummer Rotationsverhalten145 -146 +147 -148 +149 +150 -151 +152 +153 +154 -

Legende zu Tabelle 10:

Die mit dem Symbol „+“ ausgezeichneten N2 Individuen zeigten ein positives

Ergebnis gemäß den in Kapitel 3.2.1 beschriebenen Bedingungen.

Die mit dem Symbol „-“ ausgezeichneten N2 Individuen zeigten ein negatives

Ergebnis gemäß den in Kapitel 3.2.1 beschriebenen Bedingungen.

166

Tabelle 11: Untersuchte Mikrosatellitenmarker auf den Rattenchromosomen 1 bis 9

und 11 bis 20 ((LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2)

SSLP-Marker c2-Wert p-Wert ChromosomLokalisation in

cM

D1Mgh12 2,413 0,1203 RNO1 17,3D1Mit4 3,005 0,083 RNO1 63,7D1Mit2 3,864 0,0493 RNO1 76,9D1Mit1 0,708 0,4 RNO1 121,5

D2Wox36 1,408 0,2353 RNO2 47,7D2Mgh9 0,158 0,6909 RNO2 77D2Mit17 1,322 0,2502 RNO2 99,2

D3Mgh1 0,313 0,5757 RNO3 10,2D3Mit4 3,26 0,71 RNO3 45,9

D3Mit12 1,845 0,1744 RNO3 58,4D3Mgh8 3,173 0,749 RNO3 145,4

D4Wox32 0,223 0,6368 RNO4 20D4Mgh3 4,579 0,0324 RNO4 39,4D4Mit17 0,244 0,6215 RNO4 88,2

D4Mgh11 3,232 0,0722 RNO4 114,8D4Wox12 2,188 0,139 RNO4 134

D5Mgh1 2,714 0,2575 RNO5 0D5Mit10 2,114 0,146 RNO5 33,7D5Mit4 1,178 0,2778 RNO5 51,2

D5MCW 0,262 0,6089 RNO5 74,9

D6Mit10 0,357 0,5503 RNO6 9,4D6Mit8 0,666 0,4145 RNO6 30,1D6Pas1 0,407 0,5236 RNO6 78,5

D7Rat157 1,033 0,3096 RNO7 0D7Mgh9 2,637 0,1044 RNO7 22,9D7Wox1 0,947 0,3304 RNO7 29,2D7Mit7 0,488 0,4846 RNO7 44,9

D7Mit16 0,066 0,7969 RNO7 75,6D7Mgh1 0,024 0,8759 RNO7 90,2D7Arb7 0,003 0,9547 RNO7 98,8

167



cM

D8Mgh11 0,213 0,6444 RNO8 42,8D8Mit7 5,158 0,0231 RNO8 55,9

D8Mgh4 0,738 0,3903 RNO8 65,1D8Mgh1 0,009 0,9231 RNO8 93,8

D9Mit2 0,011 0,915 RNO9 38,5D9Mit6 0,807 0,369 RNO9 78,4

D9Mgh5 0,756 0,3845 RNO9 85,1

D11Mgh3 0,878 0,3487 RNO11 20,9D11Arb10 1,28 0,2579 RNO11 29,8D11Mit1 0,652 0,4194 RNO11 60,9

D12Wox8 0,007 0,9337 RNO12 5,7D12Wox5 0,026 0,8729 RNO12 44,7D12Wox6 0,207 0,649 RNO12 54,8

D13Mgh1 0,035 0,8523 RNO13 8,9

D14Mit4 3,192 0,074 RNO14 46,7D14Mit8 1,107 0,2927 RNO14 49,6

D14Mit2 0,148 0,7008 RNO14 71,7D14Mit1 0,047 0,8278 RNO14 77,6

D15Mgh7 0,261 0,6096 RNO15 22,4D15Mgh2 2,954 0,9863 RNO15 47,9D15Mgh6 1,13 0,2879 RNO15 92,8

D16Mgh4 0,117 0,7321 RNO16 6,8D16Mit2 0,15 0,6984 RNO16 45,8

D17Mit5 2,196 0,1384 RNO17 45,8D17Mgh5 0,744 0,3883 RNO17 68D17Mgh2 1,568 0,2105 RNO17 86,1D18Rat32 0,8 0,3711 RNO18 0,06D18Mit8 0,436 0,8041 RNO18 23,5D18Mit3 0,654 0,4186 RNO18 46

D19Rat17 6,353 0,0117 RNO19 6,75D19Mgh2 5,991 0,0144 RNO19 18D19Rat5 0,293 0,5881 RNO19 46,35

168



cM

D20Arb2 1,214 0,2705 RNO20 0D20Rat21 0,294 0,5784 RNO20 0D20Rat66 1,548 0,2135 RNO20 2,43D20Rat48 0,329 0,5662 RNO20 5,39D20Rat67 0,158 0,6909 RNO20 154,8D20Rat32 3,733 0,0534 RNO20 82,1 (cR)D20Mgh1 1,236 0,5318 RNO20 636 (cR)

169

Tabelle 12: Untersuchte Mikrosatellitenmarker auf den Rattenchromosomen 1 bis

10 und 12 bis 20 ((BN/Ztm x BH.7A/Ztm-ci3)F1 x BH.7A/Ztm-ci3)


cM

D1Wox6 2,4 0,1213 RNO1 70,1

D2Mit17 1,222 0,269 RNO2 37,4

D3Mgh11 0,133 0,715 RNO3 46,8

D4Rat153 0,6 0,4386 RNO4 32,5

D5Mgh6 0,144 0,7048 RNO5 47,1

D6Mit1 2,4 0,1213 RNO6 54,4

D7Mit4 0,536 0,4642 RNO7 31,7

D8Rat43 2,783 0,0953 RNO8 39

D9Mgh1 0,144 0,7048 RNO9 967(cR)

D10Mgh10 0,285 0,5936 RNO10 39,5

D12Rat107 1,222 0,269 RNO12 42,5

D13Rat30 1,222 0,269 RNO13 23,8

D14Mit4 5 0,253 RNO14 31,8

D15Rat126 0,136 0,7125 RNO15 49

D16Mit3 0,133 0,715 RNO16 16,4

D17Rat79 0,333 0,5637 RNO17 30,2

D18Mgh1 0,144 0,7048 RNO18 17,5

D19Rat58 0,136 0,7125 RNO19 44,9

D20Wox1 2,222 0,136 RNO20 47

Legende zu Tabelle 11 und 12:

Die in Tabelle 11 und Tabelle 12 beschriebenen Lokalisationen der

Mikrosatellitenmarker sind den genetischen Kopplungskarten der Datenbanken „Rat

Genome Database“ und „Genetic Linkage Maps of the Rat Genome (1997)”

entnommen. Die Position der Marker D20Rat32 und D20Mgh1 (Tabelle 11) sowie

D9Mgh1 (Tabelle 12) entstammen „Radiation Hybrid“-Karten der Datenbank „Rat

Genome Database“ und sind in centiRay (cR) angegeben.

170

Tabelle 13: PCR- und Gelelektrophoresedaten der untersuchten nicht polymorphen

Drd3-gekoppelten Mikrosatelliten sowie die Ratten-BAC-Klone auf

denen sie lokalisiert sind

Ratten- Primer sequenzen Errechnete OptimaleKlon (5/ fi 3/) Produkt- Anlagerungs-

größe temperatur

CH230-8A22 f: CCT CCA AAT TCT 307 bp 56 °CAAG AAA AGC AAC CCr: GTA AGC TTT CTCTCA AGC CTC CAA GG

CH230-8A22 f: CAG AGA GAG GGT 574 bp 56 °CGTG TAA GAA GCr: TCA GGG AGA ACTGTG AGA GTC TC

CH230-8A22 f: CAT TCA AAC CGC 287 bp 60 °CCAC CAC CAC CCr: TTT CCT CTG TGCCTG CGG AAG GG

CH230-43P17 f: GGG CCA GGC ATG 298 bp 62 °CGTG CCT CAC ACC TTr: GCC CAG ACG AGGGTG AGG GGT CCC TG

CH230-43P17 f: CCC AGG ACC CAC 260 bp 56 °CATG GTA GTT CTCr: GGG CTG CTT TGCCTT TTC CCA TTA T

CH230-43P17 f: GTG ATA ACC ACC 374 bp 57 °CCCT TCC AAT AGG Ar: CCA ATG TAA TAACCA GGT AGG CGT G

171


Ratten- Primer sequenzen Errechnete OptimaleKlon (5/ fi 3/) Produkt- Anlagerungs-

größe temperatur

CH230-7P17 f: AGA CAT GGG AGG 265 bp 56 °CAAT GGG ATG Cr: TTT GTG TAA TTCCTC CTT TCC TCC C

CH230-7P17 f: AAC TGC TGG GCC 343 bp 59 °CATC TCT CCA GCCr: CCA GCA GCT CACAGC TGC CTG TGA

CH230-7P17 f: CAA AAT TCC AGG 219 bp 58 °CAGG AAC GGC TGGr: CTC TGC CTC CCAAGT GCT GGG ATT

CH230-6K21 f: GCT AAG CAA CTA 473 bp 53 °CCTC TAC CAC TGG GCr: GGG AAG GAG CAGTGA GAC AGA CTT GG

CH230-6K21 f: GGA GGG TCC GTA 237 bp 54 °CGGA ACA AAA AGG AAr: GTT AGT AAA GGAGAC CAT TAT GGC CC

CH230-147H10 f: GGT CTA CTG TCT 453 bp 58 °CAGG ACA ATG AGG GCr: TTC TTG CCT AGCCAC TTG GGA C

CH230-147H10 f: ATT ATT TAG GAA 744 bp 54 °CGCT AAA TGA TAr: CTA TTT ACT TACTTA ATT TCA TTT C

172

Tabelle 14: Mit Hi l fe der RNO10-Mikrosatel l i tenmarker erhobene

Genotypisierungsdaten der Individuen der (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x

LEW/Ztm-ci2 Rückkreuzung

+ = ci2-Phänotyp L = LEW/Ztm-ci2-Genotyp

o = nicht betroffene Ratten B = BN/Ztm-Genotyp

Tiernummer PhänotypD10Ztm1(Myo15)

D10Ztm2(Znf179)

D10Ztm3(Myo1c)

D10Ztm4(Aldh3a1)

1 + L L L L2 + L L L L3 o L/B L/B L/B L/B4 o L/B L/B L/B L/B5 o L L L/B L6 o L/B L/B L/B L/B7 + L L L/B L8 o L/B L/B L/B L/B9 o L L L/B L10 + L L L L11 o L/B L/B L/B L/B12 o L/B L/B L/B L/B13 o L L L L14 o L/B L/B L/B L/B15 o L L L L16 o L/B L/B L L/B17 + L L L L18 o L/B L/B L/B L/B19 o L/B L/B L L/B20 o L L L L21 o L/B L/B L/B L/B22 + L L L L23 o L/B L/B L/B L/B24 o L/B L/B L/B L/B25 o L/B L/B L/B L/B26 o L/B L/B L/B L/B27 + L L L L28 o L/B L/B L/B L/B29 o L/B L/B L/B L/B30 o L/B L/B L/B L/B31 o L/B L/B L/B L/B32 + L L L L33 + L L L/B L34 o L/B L/B L/B L/B35 o L/B L/B L/B L/B

173



D10Ztm2(Znf179)

D10Ztm3(Myo1c)

D10Ztm4(Aldh3a1)

36 o L/B L/B L L/B37 + L L L L38 o L/B L/B L/B L/B39 o L L L L40 o L L L L41 + L L L L42 + L L L L43 o L/B L/B L/B L/B44 o L L L/B L45 o L L L/B L46 + L L L L47 o L/B L/B L/B L/B48 o L L L L49 + L L L L50 o L/B L/B L/B L/B51 o L L L/B L52 o L/B L/B L/B L/B53 + L L L L54 o L/B L/B L/B L/B55 + L L L L56 o L/B L/B L/B L/B57 + L L L L58 + L L L L59 + L L L L60 + L L L L61 + L L L L62 o L/B L/B L/B L/B63 + L L L L64 + L L L L65 + L L L/B L66 + L L L/B L67 + L L L L68 o L/B L/B L/B L/B69 o L/B L/B L/B L/B70 + L L L L71 o L/B L/B L/B L/B72 + L L L L73 o L L/B L/B L/B74 o L L L L75 + L L L L76 o L/B L/B L/B L/B77 o L/B L/B L/B L/B78 o L/B L/B L/B L/B79 o L/B L/B L L/B80 o L/B L/B L/B L/B

174



D10Ztm2(Znf179)

D10Ztm3(Myo1c)

D10Ztm4(Aldh3a1)

81 + L L L L82 + L L L L83 o L/B L/B L/B L/B84 o L/B L/B L/B L/B85 + L L L L86 + L L L L87 o L/B L/B L/B L/B88 o L/B L/B L/B L/B89 o L/B L/B L/B L/B90 o L/B L/B L/B L/B91 o L/B L/B L L/B92 o L/B L/B L L/B93 + L L L L94 o L/B L/B L/B L/B95 o L L L L96 o L L L L97 + L L L L98 + L L L L99 + L L L L100 + L L L L101 o L/B L/B L/B L/B102 o L/B L/B L/B L/B103 o L/B L/B L/B L/B104 o L/B L/B L/B L/B105 o L/B L/B L/B L/B106 + L L L L107 o L L L L108 o L/B L/B L/B L/B109 + L L L L110 + L L L L111 o L/B L/B L/B L/B112 o L L L L113 o L/B L/B L/B L/B114 + L L L/B L115 + L L L L116 + L L L L117 + L L L/B L118 o L/B L/B L L/B119 + L L L/B L120 o L/B L/B L/B L/B121 o L/B L/B L/B L/B122 o L/B L/B L/B L/B123 o L/B L/B L/B L/B124 o L/B L/B L/B L/B125 + L L L L

175



D10Ztm2(Znf179)

D10Ztm3(Myo1c)

D10Ztm4(Aldh3a1)

126 + L L L/B L127 o L L L/B L128 o L/B L/B L/B L/B129 o L L L L130 o L L L L131 o L L L/B L132 + L L L L133 o L/B L/B L/B L/B134 o L/B L/B L/B L/B135 o L/B L/B L/B L/B136 o L/B L/B L/B L/B137 + L L L L138 o L/B L/B L/B L/B139 o L/B L/B L/B L/B140 + L L L L141 o L/B L/B L/B L/B142 o L L L L143 o L/B L/B L/B L/B144 o L/B L/B L/B L/B145 + L L L L146 + L L L L147 + L L L L148 o L/B L/B L/B L/B149 o L/B L/B L/B L/B150 o L/B L/B L/B L/B151 o L/B L/B L/B L/B152 + L L L L153 o L/B L/B L L/B154 + L L L L155 o L/B L/B L L/B156 + L L L L157 + L L L L158 o L/B L/B L L/B159 o L/B L/B L/B L/B160 o L/B L/B L/B L/B161 + L L L/B L162 + L L L/B L163 + L L L L164 o L/B L/B L L/B165 o L L L L166 + L L L L167 + L L L L168 o L/B L/B L/B L/B169 o L/B L/B L/B L/B170 + L L L L

176



D10Ztm2(Znf179)

D10Ztm3(Myo1c)

D10Ztm4(Aldh3a1)

171 + L L L L172 + L L L/B L173 + L L L L174 + L L L/B L175 + L L L L176 o L/B L/B L L/B177 o L/B L/B L/B L/B178 + L L L L179 o L/B L/B L/B L/B180 o L/B L/B L L/B181 + L L L L182 o L/B L/B L/B L/B183 + L L L/B L184 + L L L/B L185 + L L L L186 + L L L L187 o L/B L/B L/B L/B188 o L/B L/B L/B L/B189 + L L L L190 + L L L L191 + L L L/B L192 o L L L L193 + L L L L194 + L L L L195 + L L L L196 + L L L L197 + L L L L198 + L L L L199 + L L L L200 + L L L L201 + L L L L202 + L L L L203 + L L L L204 + L L L L205 + L L L L206 + L L L L207 + L L L L208 + L L L L

177


Tiernummer Phänotyp D10Ppy D10Mgh6 D10Mgh10 D10Rat47 D10Rat45 D10Rat164

1 + L L L L L L2 + L L L L/B L L3 o L/B L/B L/B L L/B L/B4 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B5 o L/B L/B L L L L6 o L/B L/B L/B L L L/B7 + L/B L/B L L/B L L8 o L L/B L/B L/B L/B L/B9 o L L L L/B L/B L10 + L L L L/B L L11 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B12 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B13 o L/B L L L L L14 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B15 o L L L L/B L L16 o L L L/B L/B L/B L/B17 + L L L L L L18 o L/B L/B L L L L/B19 o L L/B L/B L L L/B20 o L L L L L L21 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B22 + L L L L L L23 o L L/B L/B L/B L/B L/B24 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B25 o L/B L/B L/B L L/B L/B26 o L/B L/B L/B - L L/B27 + L - - - L/B L28 o L/B L/B L L/B L/B L/B29 o L L/B L/B L L L/B30 o L L/B L/B L L/B L/B31 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B32 + L L L L L L33 + L L L L L L34 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B35 o L/B L/B L/B - L/B L/B36 o L L L/B L/B L/B L/B37 + L/B L L L/B L/B L38 o L/B L/B L/B L L L/B39 o L L L L/B L/B L/B40 o L L L L/B L L41 + L L L L L L/B42 + L L L L/B L/B L43 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B44 o L/B L/B L/B L L L/B

178



45 o L/B L/B L L L L46 + L L L L L L47 o L L/B L/B L L L/B48 o L L L L L L49 + L L L L/B L/B L50 o L/B L/B L/B L L L/B51 o L/B L/B L L L L52 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B53 + L L L L/B L/B L54 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B55 + L/B L L L/B L/B L56 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B57 + L L L L L L58 + L L L L L L59 + L/B L L L L L60 + L L L L L L61 + L L L L L L62 o L/B L/B L/B - L L/B63 + L L L - L L64 + L L L L L/B L65 + L/B L/B L L L L66 + L/B L/B L L L L67 + L L L L L L68 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B69 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B70 + L L L L L/B L71 o L L/B L/B L/B L/B L/B72 + L L L L L L73 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B74 o L L L L/B L L75 + L L L L L L76 o L L/B L L L L77 o L/B L/B L/B - L/B L/B78 o L/B L/B L/B - L/B L/B79 o L L L/B L/B L/B L/B80 o L L/B L/B L L L/B81 + L L L/B L/B L/B L82 + L/B L L L L L83 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B84 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B85 + L L L L L L86 + L L L/B L/B L/B L87 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B88 o L L/B L/B L/B L/B L/B

179



89 o L/B L/B L L L L/B90 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B91 o L/B L L/B L/B L/B L/B92 o L/B L/B - L/B L/B L/B93 + L L - L L L94 o L/B L/B L L/B - L/B95 o L/B L L/B L/B L/B L96 o L L L L L L97 + L L L L/B L L98 + L/B L L L/B L/B L99 + L L L L L L100 + L L L L/B L/B L101 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B102 o L L/B L/B L/B L/B L/B103 o L L/B L/B L/B L/B L/B104 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B105 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B106 + L L L L L L107 o L L L L L L108 o L L/B L/B L/B L/B L/B109 + L L L/B L/B L/B L/B110 + L/B L L L/B L/B L/B111 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B112 o L L L L L L113 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B114 + L/B L/B L L L L115 + L L L L L L116 + L L L L L L117 + L L L L L L118 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B119 + L L L L L L120 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B121 o L/B L/B L/B - L/B L/B122 o L/B L/B L/B L L/B L/B123 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B124 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B125 + L L L L/B L/B L126 + L L/B L L L L127 o L/B L/B L L L L128 o L/B L/B L/B L L L/B129 o L/B L L L L L130 o L/B L L L L L131 o L/B L/B L L L L132 + L/B L L L L L133 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B134 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B

180



135 o L/B L/B L/B L L L/B136 o L L/B L/B L L L/B137 + L L L L L L138 o L L/B L/B L/B L/B L/B139 o L/B L/B L/B L L L/B140 + L L L L/B L/B L141 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B142 o L L L/B L/B L/B L143 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B144 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B145 + L L L L L L146 + L L L L/B L L147 + L L L L/B L/B L148 o L L/B L/B L L/B L/B149 o L/B L/B L/B L/B L L/B150 o L/B L/B L L - L/B151 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B152 + L L L L L L153 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B154 + L/B L L L L L155 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B156 + L L L L L L157 + L L L L L L158 o L/B L/B L/B L L/B L/B159 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B160 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B161 + L L L L L L162 + L L L L L L163 + L L L L L L164 o L L/B L/B L/B L/B L/B165 o L L L/B L/B L L166 + L L L L L L167 + L/B L/B L L L L168 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B169 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B170 + L/B L/B L L L L171 + L L L L L L172 + L L L/B L/B L/B L173 + L/B L L L L L174 + L L L L L L175 + L L L L L L176 o L L/B L/B L L L/B177 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B178 + L L L L/B L/B L179 o L L/B L/B L L L/B180 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B

181



181 + L L L/B L/B L/B L182 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B183 + L L L L/B L L184 + L L L L/B L/B L185 + L L L L/B L L186 + L L L L L L187 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B188 o L L/B L/B - L L/B189 + L L L/B L/B L/B L/B190 + L L L L L L191 + L/B L/B L L L L192 o L/B L/B L/B - L L193 + L/B L L/B L/B L/B L194 + L/B L L L L L195 + L L L L/B L/B L196 + L L L/B L L/B L197 + L L L L/B L/B L198 + L L L L L L199 + L L L L L L200 + L L L L/B L/B L201 + L L L L L L202 + L L L L/B L/B L203 + L/B L L L L L204 + L L L L L L205 + L L L L L L206 + L/B L L L L L207 + L L L L L L208 + L L L/B L/B L/B L

182


Tiernummer Phänotyp D10Rat218 D10Rat26 D10Mgh4 D10Mit2 D10Rat126 D10Rat166

1 + L L L L L L2 + L/B L L L L L3 o L L/B L/B L/B L/B L/B4 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B5 o L L/B L/B L/B L L6 o L L/B L L/B L/B L/B7 + L L/B L/B L/B L L8 o L/B L/B L L/B L/B L/B9 o L/B L L L L L

10 + L/B L L L L L11 o - L/B - L/B L/B L/B12 o - L/B L/B L/B L/B L/B13 o L L L/B L L L14 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B15 o - L L L L L16 o L/B L L L L/B L/B17 + L L L L L L18 o L L/B L/B L/B L/B L/B19 o L L/B L L/B L/B L/B20 o L L L L L L21 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B22 + L L L L L L23 o L/B L/B L L/B L/B L/B24 o L/B L/B L L/B L/B L/B25 o L L/B L/B L L/B L/B26 o L L/B L/B L/B L/B L/B27 + - L L L L L28 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B29 o L L L L L/B L/B30 o L/B L L L L/B L/B31 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B32 + L L/B L/B L L L33 + - L/B L/B L L L34 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B35 o L L/B L/B L/B L/B L/B36 o L/B L L L L/B L/B37 + L/B L L/B L L L38 o L L/B L/B L/B L/B L/B39 o L/B L L L/B L L40 o L/B L L L L L41 + - L L L/B L L42 + L/B L L L L L43 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B44 o L L/B L/B L L L45 o L L/B L/B L/B L L

183



46 + L L L L L L47 o L L/B L L/B L/B L/B48 o L L L L L L49 + L/B L L/B L L L50 o L L/B L/B L/B L/B L/B51 o L L/B L/B L/B L L52 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B53 + L/B L L L L L54 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B55 + L/B L L/B L L L56 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B57 + L L L/B L L L58 + L L L L L L59 + L L/B L/B L L L60 + L L L L L L61 + L L L L L L62 o L L/B L/B L/B L/B L/B63 + L/B L L L L L64 + L/B L L L L L65 + L L/B L/B L/B L L66 + L L/B L/B L/B L L67 + L L L L L L68 o L L/B L/B L/B L/B L/B69 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B70 + L/B L L L L/B L71 o L/B L/B L L/B L/B L/B72 + L L L L L L73 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B74 o L L L/B L L L75 + L L L L L L76 o - L/B L L/B L L77 o L L/B L/B L/B L/B L/B78 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B79 o L/B L L L L/B L/B80 o L L/B L L/B L/B L/B81 + L/B L L L L L82 + L L L/B L L L83 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B84 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B85 + L L/B L L L L86 + L/B L L L L L87 o L/B L L/B L/B L/B L/B88 o L L/B L L/B L/B L/B89 o L L/B L/B L/B L/B L/B90 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B91 o L/B L L/B L/B L/B L/B

184



92 o L/B L L/B L L/B L/B93 + L L L L L L94 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B95 o L/B L/B L/B L L L96 o L L L L L L97 + L/B L L L L L98 + L/B L L/B L L L/B99 + L L L L L L100 + L/B L L L L L/B101 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B102 o L/B L/B L L/B L/B L/B103 o L/B L/B L L/B L/B L/B104 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B105 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B106 + L L L L L L107 o L L L L L L108 o L/B L L L/B L/B L/B109 + L/B L L L/B L/B L110 + L/B L L/B L L L111 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B112 o L L - L L L113 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B114 + L L/B - L/B L L115 + L L L L L L116 + L L L L L L117 + L L L L L L118 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B119 + L L L L L L120 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B121 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B122 o L L/B L/B L/B L/B L/B123 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B124 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B125 + L/B L L L L L126 + L L/B L/B L/B L L127 o L L/B L/B L/B L L128 o L L/B L/B L/B L/B L/B129 o L L L/B L L L130 o L L L L L L131 o L L/B L L/B L L132 + L L L L/B L L133 o L/B L/B L L/B L/B L/B134 o L/B L/B L L/B L/B L/B135 o L L/B L/B L/B L/B L/B136 o L L/B L/B L/B L/B L/B137 + L L L L L L/B

185



138 o L/B L/B L L/B L/B L/B139 o L L/B L L/B L/B L/B140 + L/B L L L L L141 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B142 o L L L L L L143 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B144 o L/B L/B L L/B L/B L/B145 + L L L L L L146 + L/B L L L L L147 + L/B L L L L L148 o L/B L/B L L/B L/B L/B149 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B150 o L L/B L/B L/B L/B L/B151 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B152 + L L L L L L153 o L/B L/B L L/B L/B L/B154 + L L L/B L L L155 o L/B L/B L L/B L/B L/B156 + L/B L L L L L157 + L L L L L L158 o L L/B L/B L/B L/B L/B159 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B160 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B161 + L L L L L L162 + L L L L L L163 + L L L/B L L L164 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B165 o L L L L L L166 + L L L L L L167 + L L/B L/B L/B L L168 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B169 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B170 + L L/B L/B L/B L L171 + L L L L L L172 + L/B L L L L L173 + L/B L L/B L L L174 + L L L/B L L L175 + L L L L L L176 o L L/B L L/B L/B L/B177 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B178 + L/B L L L L L179 o L L/B L L/B L/B L/B180 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B181 + L/B L L L L L182 o L/B L/B L L/B L/B L/B183 + L/B L L L L L

186



184 + L/B L L L L L185 + L/B L L L L L186 + L L L L L L187 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B188 o L L/B L L/B L/B L/B189 + L/B L - L L/B L/B190 + L L L L L L191 + L L/B L/B L/B L L192 o L L L/B L L L193 + L/B L L/B L L L194 + L L L/B L L L195 + L/B L L L L L196 + L/B L L L L L197 + L/B L L L L L198 + L L L L L L199 + L/B L L L L L200 + L/B L L L L L201 + L L L L L L202 + L/B L L L L L203 + L L/B L/B L L L204 + L L L/B L L L205 + L L L L L L206 + L L L/B L L L207 + L L L L L L208 + L/B L L L L L

187


Tiernummer Phänotyp D10Rat171 D10Rat 32 D10Rat31 D10Rat168 D10Rat116

1 + L L L L L2 + L L L L L3 o L/B L/B L/B L/B L/B4 o L/B L/B L/B L/B L/B5 o L L L L L6 o L/B L/B L/B L/B L/B7 + L L L L L8 o L/B L/B L/B L/B L/B9 o L L L L L

10 + L L L L L11 o L/B L/B L/B L/B L/B12 o L/B L/B L/B L/B L/B13 o L L/B L L L14 o L/B L L/B L/B L/B15 o L/B L/B L L L/B16 o L L/B L L L/B17 + L L L L L18 o L/B L/B L/B L L/B19 o L/B L/B L/B L/B L/B20 o L L L L L21 o L L/B L/B L/B L/B22 + L L L L L23 o L/B L/B L/B L/B L/B24 o L/B L/B L L/B L/B25 o L/B L/B L/B L/B L/B26 o L/B L/B L/B L/B L/B27 + L L L L/B L28 o L/B L/B L/B L/B L/B29 o L/B L/B L/B L/B L/B30 o L/B L/B L/B L/B L/B31 o L/B L/B L/B L/B L/B32 + L L L L L33 + L L L L L34 o L/B L/B L/B L/B L/B35 o L/B L/B L/B L/B L/B36 o L/B L/B L/B L/B L/B37 + L L L L L38 o L/B L/B L/B L/B L/B39 o L L L L L40 o L L L L L/B41 + L L L L L42 + L L L L L43 o L/B L/B L/B L/B L/B44 o L L/B L L L45 o L L L L L

188



46 + L L L L L47 o L/B L/B L/B L/B L/B48 o L L L L L49 + L L L L L50 o L L/B L/B L/B L/B51 o L L/B L/B L L/B52 o L/B L/B L/B L/B L/B53 + L L L L L54 o L/B L/B L/B L/B L/B55 + L L L L L56 o L/B L/B L/B L/B L/B57 + L L L L L58 + L L L L L59 + L L L L L60 + L L L L L61 + L L/B L L L62 o L/B L/B L/B L/B L/B63 + L L L L L64 + L L L L L65 + L L/B L/B L L/B66 + L L/B L/B L L/B67 + L L L L L68 o L/B L/B L/B L/B L/B69 o L/B L/B L/B L/B L/B70 + L L L L L71 o L L/B L/B L/B L/B72 + L L/B L L L73 o L/B L/B L/B L/B L/B74 o L L L L L75 + L L L L L76 o L L/B L/B L L/B77 o L L/B L/B L/B L/B78 o L/B L/B L/B L/B L/B79 o L/B L/B L/B L/B L/B80 o L/B L/B L/B L/B L/B81 + L L L L/B L82 + L L L L L83 o L L/B L/B L/B L/B84 o L/B L/B L/B L/B L/B85 + L L L L L86 + L L L L L87 o L/B L/B L/B L/B L/B88 o L/B L/B L/B L/B L/B89 o L/B L/B L/B L/B L/B90 o L/B L/B L/B L/B L/B91 o L/B L/B L/B L/B L

189



92 o L/B L/B L/B L/B L93 + L L L L L94 o L L/B L/B L/B L/B95 o L L L L L96 o L L L/B L L97 + L L L L L98 + L L L L L99 + L L L L L100 + L L L L L101 o L/B L/B L/B L/B L/B102 o L L/B L/B L/B L/B103 o L/B L/B L/B L/B L/B104 o L/B L/B L/B L/B L/B105 o L/B L/B L/B L/B L/B106 + L L L L L107 o L L L L/B L108 o L/B L/B L/B L/B L/B109 + L/B L L/B L/B L110 + L L L L -111 o L/B L/B L/B L/B L/B112 o L L L L L113 o L/B L/B L/B L/B L/B114 + L L L L L115 + L L L L L116 + L L L L L117 + L L L L L118 o L/B L/B L/B L/B L/B119 + L L L L L120 o L/B L/B L/B L/B L/B121 o L/B L/B L/B L/B L/B122 o L/B L/B L/B L/B L/B123 o L/B L/B L/B L/B L/B124 o L/B L/B L L/B L/B125 + L L L L L126 + L L/B L/B L L/B127 o L L L L L128 o L/B L/B L/B L/B L/B129 o L L L L L130 o L L L L L131 o L L/B L/B L L/B132 + L L L L L133 o L/B L/B L/B L/B L/B134 o L/B L L/B L/B L/B135 o L/B L/B L/B L/B L/B136 o L/B L/B L/B L/B L/B137 + L L L L L

190



138 o L/B L/B L/B L/B L/B139 o L/B L/B L/B L/B L/B140 + L L L L/B L141 o L/B L/B L L/B L/B142 o L L L L L143 o L/B L/B L/B L/B L/B144 o L/B L/B L/B L/B L/B145 + L L L L L146 + L L L L L147 + L L L L L148 o L/B L/B L/B L/B L/B149 o L/B L/B L L/B L/B150 o L/B L/B L/B L/B L/B151 o L/B L/B L/B L/B L/B152 + L L L L L153 o L/B L/B L/B L/B L/B154 + L L L L L155 o L/B L/B L/B L/B L156 + L L L L L/B157 + L L L L L158 o L/B L/B L/B L/B L/B159 o L/B L/B L/B L/B L/B160 o L/B L/B L/B L L/B161 + L L L L L162 + L L L L L163 + L L L L L164 o L/B L/B L/B L/B L/B165 o L L L L L166 + L L L L L167 + L L/B L/B L L/B168 o L/B L/B L/B L/B L/B169 o L/B L/B L/B L/B L/B170 + L L L L L171 + L L L L L172 + L L L L/B L173 + L L L L L174 + L L L L L175 + L L L L/B L176 o L/B L/B L/B L/B L/B177 o L/B L/B L/B L/B L/B178 + L L L L L179 o L/B L/B L L/B L/B180 o L/B L/B L/B L/B L/B181 + L L L L/B L182 o L/B L/B L/B L/B L/B183 + L L L L L

191



184 + L L L L L185 + L L L L L186 + L L L L L187 o L/B L/B L/B L/B L/B188 o L/B L/B L/B L/B L/B189 + L/B L L L/B L190 + L L L L L191 + L L/B L/B L L/B192 o L L L L/B L193 + L L L L/B L194 + L L L L L195 + L L L L L196 + L L L L/B L197 + L L L L L198 + L L L L L199 + L L L L L200 + L L L L L201 + L L L L L202 + L L L L L203 + L L L L L204 + L L L L L205 + L L L L L206 + L L L L L207 + L L L L L208 + L L L L/B L

192

Tabelle 15: Mit Hi l fe der RNO11-Mikrosatel l i tenmarker erhobene

Genotypisierungsdaten der Individuen der (BN/Ztm x BH.7A/Ztm-ci3)F1

x BH.7A/Ztm-ci3 Rückkreuzung

+ = ci3-Phänotyp BH = BH.7A/Ztm-ci3-Genotyp

o = nicht betroffene Ratten BN = BN/Ztm-Genotyp

Tiernummer Phänotyp D11Rat10 D11Rat24 D11Rat27 D11Rat28 D11Rat65

1 + BH BH BH/BN BH/BN BH2 + BH BH BH BH BH3 o BH/BN BH/BN BH BH BH/BN4 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN5 + BH BH BH BH BH6 + BH BH BH BH BH7 o BH BH BH/BN BH/BN BH8 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN9 + BH BH BH BH BH10 + BH BH BH/BN BH/BN BH11 + BH BH BH BH BH12 + BH BH BH/BN BH/BN BH13 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN14 + BH BH BH BH BH/BN15 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN16 o BH BH BH BH BH/BN17 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN18 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH19 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN20 + BH BH BH BH BH21 o BH BH/BN BH/BN BH/BN BH22 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN23 o BH/BN BH/BN BH/BN BH BH/BN24 + BH BH BH BH BH25 + BH BH BH BH BH26 + BH BH BH BH BH/BN27 + BH BH BH BH BH28 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN29 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN30 + BH BH BH/BN BH/BN BH/BN31 + BH BH BH BH BH32 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN33 o BH/BN BH/BN BH BH BH/BN34 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN35 + BH BH/BN BH/BN BH/BN BH

193



36 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN37 + BH BH BH BH BH38 + BH BH BH BH BH39 + BH BH BH BH BH40 o BH BH BH BH BH/BN41 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN42 + BH BH BH BH BH43 + BH BH BH BH BH/BN44 + BH BH BH BH BH45 o BH BH BH BH BH46 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN47 + BH/BN BH BH BH/BN BH48 + BH BH BH BH BH49 + BH BH BH BH BH50 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN51 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN52 + BH BH BH BH BH53 + BH BH BH BH BH54 + BH BH BH BH BH55 o BH BH BH BH BH56 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH57 + BH BH BH BH BH 58 o BH BH BH BH BH59 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN60 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN61 o BH BH BH/BN BH/BN BH62 + BH BH BH BH BH63 + BH BH BH BH BH64 + BH BH BH/BN BH/BN BH65 o BH BH BH BH BH66 o BH BH BH BH BH67 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN68 o BH BH BH BH/BN BH69 + BH BH BH BH BH70 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN71 + BH BH BH/BN BH/BN BH72 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN73 + BH BH BH BH BH/BN74 o BH BH BH BH BH75 + BH BH BH BH BH76 o BH BH BH BH BH77 o BH/BN BH BH BH BH/BN78 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN79 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN80 + BH BH BH BH BH81 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN

194



82 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH83 + BH BH BH BH BH84 + BH BH BH BH BH85 + BH BH BH BH -86 + BH BH BH BH BH/BN87 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN - 88 + BH BH BH BH -89 o BH/BN BH BH BH BH/BN90 + BH BH BH BH BH91 o BH/BN BH BH/BN BH/BN BH/BN92 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN93 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH94 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN95 + BH BH/BN BH/BN BH/BN BH96 + BH BH BH/BN BH/BN BH97 + BH BH BH BH BH98 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN99 + BH BH BH BH BH100 + BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH101 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN102 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN103 + BH BH BH BH BH104 o BH BH BH/BN BH/BN BH105 + BH/BN BH/BN BH BH BH/BN106 o BH BH BH/BN BH/BN BH107 + BH BH BH BH BH108 + BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN109 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN110 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN111 + BH BH BH BH BH112 + BH BH BH BH BH113 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN114 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN115 + BH BH BH BH BH116 + BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN117 o BH BH BH BH BH118 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN119 + BH BH BH BH BH120 o BH BH BH BH BH121 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN122 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN123 + BH BH BH BH BH124 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN125 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN

195


Tiernummer Phänotyp D11Rat67 D11Rat93 D11Arb7D11Ztm1

(Morc)D11Ztm2(Tagln3)

1 + BH BH BH BH BH2 + BH BH BH BH BH3 o BH/BN BH/BN BH BH/BN BH/BN4 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN5 + BH BH BH/BN BH BH6 + BH BH BH BH BH7 o BH BH BH/BN BH BH8 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN9 + BH BH BH BH BH10 + BH BH BH BH BH11 + BH BH/BN BH/BN BH BH12 + BH BH BH/BN BH BH13 o BH/BN BH/BN BH BH/BN BH/BN14 + BH BH BH/BN BH BH15 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN16 o BH/BN BH/BN BH BH/BN BH/BN17 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN18 o BH/BN BH BH BH/BN BH19 o BH/BN BH/BN BH BH/BN BH/BN20 + BH BH BH/BN BH BH21 o BH BH BH/BN BH BH22 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN23 o BH/BN BH/BN BH BH/BN BH/BN24 + BH BH/BN BH/BN BH BH25 + BH BH BH/BN BH BH26 + BH BH/BN BH/BN BH BH/BN27 + BH BH BH/BN BH BH28 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN29 o BH/BN BH/BN BH BH/BN BH/BN30 + BH BH BH/BN BH BH31 + BH BH BH BH BH32 o BH/BN BH/BN BH BH/BN BH/BN33 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN34 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN35 + BH - BH/BN BH BH36 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN37 + BH BH BH BH BH38 + BH - BH/BN BH BH39 + BH BH BH BH BH40 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN41 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN42 + BH BH BH/BN BH BH43 + BH BH BH/BN BH BH44 + BH BH BH BH BH

196




45 o BH BH BH/BN BH BH46 o BH/BN BH/BN BH BH/BN BH/BN47 + BH BH BH BH BH48 + BH BH BH BH BH49 + BH BH BH/BN BH BH50 o BH BH/BN BH BH/BN BH/BN51 o BH/BN BH/BN BH BH/BN BH/BN52 + BH/BN BH BH/BN BH BH53 + BH BH BH BH BH54 + BH BH BH/BN BH BH55 o BH BH BH/BN BH BH56 o BH BH BH/BN BH BH57 + BH BH BH/BN BH BH58 o BH/BN BH BH BH BH59 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN60 o BH BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN61 o BH BH BH BH BH62 + BH BH BH BH BH63 + BH BH BH/BN BH BH64 + BH/BN BH BH BH BH65 o BH BH BH/BN BH BH66 o BH BH BH BH BH67 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN68 o BH BH BH BH BH69 + BH BH BH/BN BH BH70 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN71 + BH BH BH/BN BH/BN BH72 o BH/BN BH/BN BH BH/BN BH/BN73 + BH BH BH BH BH74 o BH BH BH BH BH75 + BH BH BH BH BH76 o BH BH BH BH BH77 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN78 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN79 o BH/BN BH BH BH/BN BH/BN80 + BH BH BH BH BH81 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN82 o BH/BN BH BH BH/BN BH83 + BH BH BH BH BH84 + BH BH/BN BH BH BH85 + BH BH BH/BN BH BH86 + BH BH/BN BH BH/BN BH/BN87 o BH/BN BH BH BH/BN BH/BN88 + BH BH BH/BN BH BH89 o BH/BN BH/BN BH BH/BN BH/BN

197




90 + BH BH BH BH BH91 o BH/BN BH/BN BH BH/BN BH/BN92 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN93 o BH/BN BH BH BH BH94 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN95 + BH BH BH/BN BH BH96 + BH BH BH/BN BH BH97 + BH BH BH/BN BH BH98 o BH/BN BH BH BH/BN BH/BN99 + BH BH BH BH BH100 + BH BH BH/BN BH BH101 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN102 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN103 + BH BH BH BH BH104 o BH BH BH/BN BH BH105 + BH/BN BH/BN BH BH/BN BH/BN106 o BH BH BH/BN BH BH107 + BH BH BH BH BH108 + BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN109 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN110 o BH/BN BH/BN BH BH/BN BH/BN111 + BH BH BH BH BH112 + BH BH BH BH BH113 o BH/BN BH/BN BH BH/BN BH/BN114 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN115 + BH BH BH/BN BH BH116 + BH/BN BH/BN BH BH/BN BH/BN117 o BH/BN BH BH BH BH118 o BH/BN BH/BN BH BH/BN BH/BN119 + BH BH BH BH BH120 o BH BH BH BH BH121 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN122 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN123 + BH BH BH/BN BH BH124 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN125 o BH/BN BH/BN BH BH/BN BH/BN

198


Tiernummer Phänotyp D11Mgh4 D11Wox6 D11Rat56 D11Mgh3 D11Mit4

1 + BH BH/BN BH BH BH2 + BH BH BH BH BH3 o BH/BN BH BH/BN BH/BN BH4 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN5 + BH BH BH BH BH6 + BH BH/BN BH BH BH7 o BH BH BH BH BH/BN8 o BH/BN BH BH/BN BH/BN BH/BN9 + BH BH BH/BN BH BH10 + BH BH BH BH BH/BN11 + BH BH/BN BH/BN BH/BN BH12 + BH BH BH BH BH13 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN14 + BH BH BH BH BH15 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN16 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH17 o BH/BN BH BH BH/BN BH/BN18 o BH BH BH BH BH/BN19 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN20 + BH BH BH BH BH21 o BH BH BH BH BH/BN22 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN23 o BH/BN BH/BN BH/BN - BH/BN24 + BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH25 + BH BH BH BH BH26 + BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH27 + BH BH BH BH BH28 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN29 o BH/BN BH/BN BH/BN - BH/BN30 + BH BH BH - BH31 + BH BH/BN BH/BN BH BH32 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN33 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN34 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN35 + BH BH BH BH BH/BN36 o BH/BN BH BH/BN BH/BN BH/BN37 + BH BH BH BH BH38 + BH BH BH BH BH39 + BH BH/BN BH BH BH40 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH41 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN42 + BH BH BH BH BH43 + BH BH BH BH BH44 + BH BH BH BH BH45 o BH BH BH BH BH

199



46 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN47 + BH BH BH BH BH48 + BH BH BH BH BH49 + BH BH/BN BH BH BH50 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN51 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN52 + BH BH BH BH BH53 + BH BH/BN BH/BN BH BH54 + BH BH/BN BH BH BH55 o BH BH BH BH BH56 o BH BH/BN BH BH BH/BN57 + - - - BH BH58 o BH BH BH BH BH59 o BH/BN BH BH BH/BN BH/BN60 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN61 o BH BH BH BH BH/BN62 + BH BH BH BH BH63 + BH BH BH BH BH64 + BH BH BH BH BH65 o BH BH/BN BH/BN BH BH66 o BH BH BH BH BH67 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN68 o BH BH BH BH BH69 + BH BH BH BH BH70 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN71 + BH BH BH BH BH72 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN73 + BH BH BH BH BH74 o BH BH BH BH BH75 + BH BH BH BH BH76 o BH BH BH BH BH77 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH78 o BH/BN BH BH/BN BH/BN BH/BN79 o BH/BN BH BH BH BH/BN80 + BH BH BH BH BH81 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN82 o BH BH BH BH BH/BN83 + BH BH BH BH BH84 + BH BH/BN BH/BN BH/BN BH85 + BH BH BH BH BH86 + BH/BN BH/BN - BH/BN BH87 o BH BH BH BH BH/BN88 + BH BH BH BH/BN BH89 o BH/BN BH BH BH/BN - 90 + BH BH BH BH BH91 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN

200



92 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN93 o BH BH/BN BH BH BH/BN94 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN95 + BH BH BH BH BH/BN96 + BH BH BH BH BH97 + BH BH/BN BH BH BH98 o BH/BN BH BH BH BH/BN99 + BH BH/BN BH/BN BH BH100 + BH BH BH BH BH/BN101 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN102 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN103 + BH BH/BN BH/BN BH BH104 o BH BH/BN BH BH BH/BN105 + BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN106 o BH BH BH BH BH107 + BH BH BH BH BH108 + BH/BN BH/BN - BH/BN BH/BN109 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN110 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN111 + BH BH BH BH BH112 + BH BH/BN BH/BN BH BH113 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN114 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN115 + BH BH BH BH BH116 + BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN117 o BH BH BH BH BH118 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN119 + BH BH BH BH BH120 o BH BH BH - BH121 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN122 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN123 + BH BH - BH BH124 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN125 o BH/BN BH BH BH/BN BH/BN

201

Abb. 12: Elektroretinogramm (ERG) - Sequenzen von nicht affektierten LEW/Ztm

Ratten (Hintergrundstamm: wt) und affektierten homozygoten (ci2-/-)

und heterozygoten (ci2+/-) LEW/Ztm-ci2 Rattenmutanten (1) (GOCKELN

et al., 2003).

202

Legende zu Abb. 12:

Dargestellt sind ERG-Aufzeichnungen von 40 Wochen (PW40) alten Ratten unter

dunkeladaptierten (skotopischen) und helladaptierten (photopischen) Bedingungen.

In Anlehnung an den ISCEF-Standard (International Society for Clinical

Electrophysiology of Vision) wurde mit verschiedenen Stimulusintensitäten gereizt,

wobei als Standardblitz eine Stimulusintensität von 3.0 Candelasekunden pro

Quadratmeter (cds/m2) diente. Mit eingetragen ist die jeweilige Stimulusapplikation

(T). Als Hintergrundbeleuchtung für das photopische ERG diente eine

„Ganzfeldausleuchtung“ von 30 cd/m2.

Im Vergleich zu den LEW/Ztm-ci2 Rattenmutanten, welche im ERG lediglich

Restantworten aufwiesen, liess sich beim Hintergrundstamm (LEW/Ztm) ein im

Vergleich zu bekannten, nicht affektierten Ratten reguläres skotopisches und

photopisches ERG aufzeichnen. ERG-Aufzeichnungen von jungen LEW/Ztm-ci2

Rattenmutanten waren im Vergleich zum ERG des alterkorrelierten

Hintergrundstammes nicht verändert.

Dieser generalisierte Funktionsverlust der neurosensorischen Retina korrelierte gut

mit dem histopathologisch nachweisbaren Verlust der Photorezeptorzellen der

Mutantennetzhaut. Unter Berücksichtigung der funktionellen und strukturellen

Befundsituation liegt bei den homozygoten und heterozygoten LEW/Ztm-ci2

Rattenmutanten eine progressive Atrophie der Retina vor (GOCKELN et al., 2003).

203

Abb. 13: Shuttle-Box „Passive Avoidence System“ der Firma TSE-Systems, die

für den Hell-Dunkel-Transmissionstest benutzt wurde (Abb. ähnlich)

204

Danksagung

Herrn Prof. Dr. H.-J. Hedrich danke ich sehr für die Überlassung des Themas, die

Bereitstellung eines Arbeitsplatzes, sämtlicher untersuchten Tiere und aller

notwendigen Materialien sowie für die wissenschaftliche Anleitung bei der

Durchführung der Versuche und der Abfassung dieser Dissertation und insbesondere

für die stets gewährte und immer freundliche Unterstützung.

Weiterhin bedanke ich mich bei

Herrn Prof. Dr. W. Löscher, Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie

der Tierärztlichen Hochschule Hannover, für die Hilfe bei der Kontaktaufnahme zu

Herrn Prof. Dr. H.-J. Hedrich und die wissenschaftliche Mitbetreuung;

Herrn Dr. D. Wedekind für die geduldige Beantwortung zahlreicher Fragen sowie

freundliche Anleitung bei der praktischen Durchführung der Versuche und Gestaltung

dieser Arbeit;

Frau PD Dr. M.-L. Enß für die hervorragende organisatorische Betreuung des

Graduiertenkollegs GK 705 in dessen Rahmen diese Arbeit angefertigt wurde;

Herrn Prof. Dr. S. von Hörsten und Herrn T. Karl, Abteilung Funktionelle und

Angewandte Anatomie der Medizinischen Hochschule Hannover, für die

wissenschaftliche Anleitung bei der Durchführung der Verhaltensuntersuchungen

und ihrer Auswertung;

Frau PD. Dr. A. Kindler-Röhrborn und Herrn Dr. B. Kölsch, Institut für

Neuropathologie der Universität Bonn, für die wissenschaftliche Anleitung bei der

Durchführung der computergestützten genetischen Analysen;

205

Herrn Dr. R. Gockeln, Augenklinik der Medizinischen Hochschule Hannover, für die

freundliche Zusammenarbeit und die Bereitstellung der Ergebnisse seiner ERG-

Untersuchungen zur Netzhautfunktion der LEW/Ztm-ci2 Ratte für den Anhang dieser

Arbeit;

Frau U. Gänger, Frau S. Przyklenk und Frau I. Trotz für ihr hilfreiches Mitwirken bei

der Durchführung der genomweiten Kopplungsanalyse;

Herrn M. Meyer für sein tatkräftiges und immer freundliches Mitwirken bei der

Durchführung der Verhaltensuntersuchungen;

den Tierpflegern des Zentralen Tierlaboratoriums der Medizinischen Hochschule

Hannover für die sorgsame Betreuung der Tiere sowie allen weiteren Mitarbeitern

des Instituts für die freundliche Aufnahme, die erwiesene Hilfsbereitschaft und das

sehr gute Arbeitsklima;

Mein Dank gilt insbesondere meinen Eltern für die liebevolle moralische

Unterstützung bei der Abfassung dieser Arbeit.

206

Erklärung

Zur Anfertigung der Dissertation wurden die folgenden Hilfen und Hilfsmittel,

insbesondere die folgenden Hilfen Dritter, in Anspruch genommen:

Frau U. Gänger führte zu Beginn der genomweiten Kopplungsanalysen einen Teil

der molekularbiologischen Arbeiten durch, während Frau S. Przyklenk und Frau I.

Trotz einen Teil dieser Arbeiten zum Ende der Kopplungsanalyse vornahmen.

Herr M. Meyer war an den Verhaltensuntersuchungen zur Rotation und Funktion des

Innenohres der Rückkreuzungsindividuen beteiligt und nahm auch zusammen mit

Frau S. Przyklenk einen Teil der Organentnahmen vor.

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