Aus dem Institut für Neuroendokrinologie der Universität ... · cytotoxischen T-Lymphozyten...

Aus dem Institut für Neuroendokrinologie der Universität zu Lübeck Direktor: Prof. Dr. J. Born

Die regulatorische Rolle von Cortisol und Wachstumshormon auf die Zytokinproduktion humaner T-Lymphozyten und die Th1/Th2-Balance

Inauguraldissertation

zur Erlangung des akademischen Grades

Doktor der Medizin

(Dr. med.)

der Medizinischen Fakultät

der Universität zu Lübeck

Vorgelegt von: Melanie Wolf

aus Neubrandenburg

Lübeck, 2012

2

1. Berichterstatter: Professor Dr. med. J. Born

2. Berichterstatter: Priv. - Doz. Dr. med. Kai Mortensen

Tag der mündlichen Prüfung: 01.11.2012

Zum Druck genehmigt. Lübeck, den 01.11.2012 -Promotionskommission der Sektion Medizin-

3

Diese Arbeit widme ich meiner Familie

Inhaltsverzeichnis

4

Inhaltsverzeichnis Seite

Abkürzungsverzeichnis 6

1 Einleitung 8

1.1 Das Immunsystem 8

1.1.1 Zellen des Immunsystems 8

1.1.2 Th1/Th2-Immunbalance 12

1.2 Endokrinum und das Immunsystem 14

1.2.1 Das Glukokortikoid Cortisol 16

1.2.2 Einfluss von Cortisol auf das Immunsystem und die Th1/Th2-Balance 17

1.2.3 Das humane Wachstumshormon GH 18

1.2.4 Einfluss von GH auf das Immunsystem und die Th1/Th2-Balance 19

1.3 Schlaf, Endokrinum und das Immunsystem 19

1.4 Fragestellung und Ziel der Arbeit 24

2 Material und Methoden 25

2.1 Probanden 25

2.2 Reagenzien 25

2.3 Versuchsablauf 26

2.3.1 Zellstimulation und Aktivierung 26

2.3.2 Durchflusszytometrische Analyse 27

2.3.3 Hormonbestimmung 28

2.3.4 Statistische Auswertung der Ergebnisse 29

3 Ergebnisse 30

3.1 Plasma - Hormon - Konzentration innerhalb der Kontrollgruppe 30

Inhaltsverzeichnis

5

3.2 Auswirkungen auf IFN-γ-produzierende CD4-positive T-Helferzellen 31

3.3 Auswirkungen auf IL-4-produzierende CD4-positive T-Helferzellen 33

3.4 Auswirkungen auf das IFN-γ-/ IL-4-Gleichgewicht (Th1/Th2-Balance) 35

4 Diskussion 37

5 Zusammenfassung 54

6 Literaturverzeichnis 56

7 Anhang 82

8 Danksagung 84

9 Lebenslauf 85

10 Veröffentlichung der Arbeitsergebnisse 86

Abkürzungsverzeichnis

6


ACTH: Adrenocorticotropes Hormon (Adrenocorticotropin)

APC: Allophycocyanin

APZ: Antigenpräsentierende Zellen

BFA: Brefeldin A

CD: Cluster of Differentiation

CRH: Corticoliberin (corticotropin-releasing hormone)

CTL: Cytotoxische T-Lymphozyten (cytotoxic T-cells)

DC: Dendritische Zellen (dendritic cells)

DEX: Dexamethason

DFG: Deutsche Forschungsgemeinschaft

DMSO: Dimethylsulfoxid

FACS: Durchflusszytometer (Fluorescence Activated Cell Sorter)

FITC: Fluorescein-Iso-Thio-Cyanat (Fluorochrom)

FSC: Vorwärtsstreuung (Frontscatter)

GK: Glukokortikoid

hGh: Wachstumshormon, somatotrophes Hormon (human growth hormone)

HHN – Achse: Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden-Achse

HVL: Hypophysenvorderlappen

IFN: Interferon

Ig: Immunglobulin

IGF: Insulinähnlicher Wachstumsfaktor (Insuline-like growth factor)

IL: Interleukin

MHC: Haupthistokompatibilitätskomplex (Major Histocompatibility Complex)

MK: Mineralokortikoid

NK-Zellen: Natürliche Killerzellen

NNR: Nebennierenrinde

nTreg: natürliche regulatorische T-Zellen (natural regulatory T cells)


7

SEM: Standard Error of the Mean

SSC: Seitwärtsstreuung (Sidescatter)

SWS: langsamwellige Schlafphase (Slow Wave Sleep)

PE: Phycoerythrin

PerCP: Peridin Chlorophyll Protein

PBMC: mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (peripher blood mononuclear

cells)

PBS: Phosphatgepufferte Salzlösung (phosphate buffered saline)

PMA: Phorbol 12-myristate 13-acetate

R-A-A-S: Renin-Aldosteron-Angiotensin-System

REM: Rapid eye movement

Rpm: Umdrehungen pro Minute (revolutions per minute)

Th-Zellen: T-Helferzellen

TCR: T-Zell Rezeptor (t-cell receptor)

TSH: Thyreotropin, thyreotropes Hormon (thyroid stimulating hormone)

Einleitung

8

1. Einleitung

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem Einfluss des Wachstumshormons

(GH) und des Cortisols auf das Immunsystem. Insbesondere wird dabei das

Verhältnis der Th1- und Th2-Zytokine unter in vitro Bedingungen untersucht. Es

galt die Hypothese zu überprüfen, ob niedrige Cortisol- und / oder hohe GH-

Konzentrationen zu einer Dominanz des Th1-Zytokinprofils führen. Um einen

Überblick über die klinische Relevanz des Versuchsvorhabens zu geben, wird im

Folgenden auf das Immunsystem und dessen Bestandteile eingegangen.

1.1 Das Immunsystem

Der Mensch benötigt ein gut funktionierendes Immunsystem, um in einer Umwelt

verschiedenster gesundheitlicher Herausforderungen überleben zu können. In den

Organismus eingedrungene körperfremde Strukturen müssen aufgesucht und

bekämpft werden. Ebenfalls müssen fehlerhaft veränderte, mutierte (z. B. maligne

entartete) körpereigene Zellen gefunden und, bevor Schäden im Organismus

auftreten, eliminiert werden. Man unterscheidet eine unspezifische, bereits bei

wirbellosen Lebewesen vorhandene, angeborene Immunabwehr von einer

adaptiven Immunabwehr. Letztere bietet einen spezifischen Schutz gegen Erreger

und ist in der Lage, ein immunologisches Gedächtnis gegen wiederkehrende

Pathogene auszubilden. Auf dieses immunologische Gedächtnis stützt sich das

Prinzip der Impfung (Janeway et al., 2009; Müller et al., 2008).

1.1.1 Zellen des Immunsystems

Die „erste“ Linie der Verteidigung gegen Pathogene wird durch das angeborene

Immunsystem realisiert. Hierfür stehen Makrophagen, natürliche Killerzellen (NK-

Zellen), dendritische Zellen (DC), neutrophile, basophile und eosinophile

Granulozyten zur Verfügung (Figdor et al., 2002; Houssaint und Sai 1988; Svedmyr und Jondal 1975). Durch Makrophagen werden Pathogene anhand der

auf ihrer Oberfläche befindlichen Proteine erkannt, durch Phagozytose zersetzt

Einleitung

9

und die so entstandenen Antigene auf der Oberfläche der Makrophagen

präsentiert (Aderem und Underhill 1999). Diese Antigenpräsentation führt zur

Aktivierung von Zellen der erworbenen Immunabwehr. Die aktivierten

Makrophagen leiten durch Freisetzung verschiedener chemischer Botenstoffe, den

Zytokinen, lokale Entzündungsreaktionen ein (Kayser et al., 2005).

Die 1973 von Ralf Steinmann entdeckten dendritischen Zellen (DC) gehören

analog den Makrophagen zu den antigenpräsentierenden Zellen (APZ). Sie

vermitteln über aktivierte B- und T-Lymphozyten zwischen angeborener und

erworbener Immunabwehr (Banchereau et al., 2000; Steinman und Hemmi 2006; Villadangos und Schnorrer 2007). Natürliche Killerzellen (NK) sind Bestandteil der

angeborenen Immunabwehr. Sie sind in der Lage virus-infizierte und entartete

Zellen zu erkennen. NK werden über ein komplexes Rezeptorsystem aktiviert und

lösen durch Ausschüttung verschiedener Zytotoxine die Apoptose der Zielzelle

aus (Bukowski et al., 1985; Janeway et al., 2009; Kayser et al., 2005).

Ein weiterer Bestandteil der angeborenen Immunabwehr ist das

Komplementsystem, welches aus Plasmaproteinen und proteolyischen Enzymen

besteht. Durch Lyse, Opsonierung und Einleitung von lokalen

Entzündungsreaktionen können Bakterien und Viren inaktiviert und zerstört

werden (Frank und Fries 1991; Rambach et al., 2008; Ricklin et al., 2010; Tosi 2005). Diese Art der Immunantwort erfolgt zeitnah und liegt somit vor den

spezifischen Immunreaktionen (Fearon und Locksley 1996).

Sollten die Erreger diese Front des angeborenen Immunsystems überwinden oder

umgehen, ist eine spezifische, erworbene (adaptive) Immunantwort notwendig,

wobei im Verlauf antigenspezifische Effektorzellen und Gedächtniszellen

entstehen. Durch diese Eigenschaft des Immunsystems können Erreger, mit

denen sich der Körper bereits zu einem früheren Zeitpunkt auseinandergesetzt

hat, schnell erkannt und anschließend eliminiert werden. Dies steigert die

Effektivität der immunologischen Prozesse und verhindert unnötige

Begleitschäden. Das adaptive Immunsystem wird durch B- und T-Lymphozyten

repräsentiert.

Einleitung

10

Die B-Lymphozyten entwickeln sich aus den hämatopoetischen Stammzellen des

Knochenmarks (B = bone marrow). Sie differenzieren sich zu Gedächtniszellen

oder zu antikörpersezernierenden Plasmazellen. Sie sind in der Lage, mit oder

ohne Kontakt zu T-Zellen (T-Helferzellen, Th-Zellen), antigenspezifische

Antikörper (Ig, Immunglobuline) zu bilden, wodurch sie zur humoralen

Immunantwort gezählt werden (Janeway et al., 2009; Neumann 2008). Neuere

Studien zeigen jedoch auch einen negativen Effekt der B-Zellen auf das

Immunsystem. Regulatorische B-Zellen sollen im Tiermodell das Immunsystem

sogar unterdrücken und an der Entstehung einiger Krankheiten wie chronischer

Colitis, Arthritis und autoimmuner Encephalitis beteiligt sein (Bouaziz et al., 2008; Matsushita et al., 2008; Mauri und Bosma 2012; Mauri und Ehrenstein 2008; Mizoguchi und Bhan 2006; Noh und Lee 2011; Yanaba 2009; Yang et al., 2009).

T-Lymphozyten werden in der fetalen Leber und dem Knochenmark gebildet und

gelangen über das Blutsystem in den Thymus (T-Lymphozyten), wo sie

heranwachsen und ausreifen (Graf 2008). Durch Rekombination von

Gensegmenten werden spezifische Rezeptoren für bestimmte Antigene gebildet.

Je nach Differenzierungsgrad und Aktivierungszustand exprimieren die

Lymphozyten auf ihrer Oberfläche zelluläre Glykoproteine, die „clusters of

differentiation“ (CD) genannt werden (Geenen et al., 2001). So differenzieren T-

Lymphozyten zu verschiedenen Populationen wie T-Helferzellen (Th-Zellen), die

den Oberflächenmarker CD4 tragen, oder zu den CD8-positiven (CD8+)

cytotoxischen T-Lymphozyten (CTL). Nach Heranreifung werden diese Zellen in

das sekundäre lymphatische Gewebe ausgeschwemmt, wo sie auf ihre jeweiligen

Antigene treffen sollen. Diese Antigene müssen den T-Zellen durch B-

Lymphozyten, dendritische Zellen oder Makrophagen, die als

antigenpräsentierende Zellen (APZ) bezeichnet werden, präsentiert werden. In

den APZ lysierte Peptidfragmente der Antigene werden an bestimmte

Oberflächenproteine, wie z. B. dem Haupthistokompatibilitätskomplex II (MHC =

Major Histocompatibility Complex) gekoppelt, von den T-Zell Rezeptoren (TCR = t-

cell receptor) erkannt und gebunden (Fraser et al., 1998). Es werden zwei Klassen

von Proteinen des MHC unterschieden.

MHC I kommt auf der Oberfläche der meisten Zellen des Organismus vor und wird

von den CD8- Rezeptoren der CTL’s gebunden. Die an MHC I gebundenen

Antigene werden durch die CTL’s erkannt und vernichtet (Berke 1994; Kirchner et

Einleitung

11

al., 1998). Darüber hinaus werden durch Aktivierung der CTL’s verschiedene

Zytokine wie z. B. Interferone (IFN) freigesetzt, die unter anderem die

antigenpräsentierenden Eigenschaften der APZ verstärken und eine Inflammation

einleiten (Kirchner et al., 1998). Der von B-Lymphozyten und Makrophagen

exprimierte MHC II wird von CD4-positiven (CD4+) T-Lymphozyten gebunden

(Long 1992), wodurch eine Aktivierung mit anschließender Ausschüttung von

Zytokinen resultiert. Anhand der Zytokinmuster werden die T-Helferzellen in Th1

und Th2 unterteilt (Delves und Roitt 2000a; Delves und Roitt 2000b; Janeway et al., 2009).

Der Umstand, dass CD4+ T-Lymphozyten nur von MHC II präsentierte Antigene

und CD8+ T-Lymphozyten ausschließlich an MHC I gebundene Antigene

erkennen, wird als MHC-Restriktion der T-Lymphozyten bezeichnet (Stevanovic 2002; Zinkernagel und Doherty 1974a; Zinkernagel und Doherty 1974b).

Eine weitere Lymphozytensubpopulation, die erstmalig 1995 von Sakaguchi

beschrieben wurde, stellen die natürlichen regulatorischen T-Zellen (nTreg) dar

(Sakaguchi 2005). Sie machen bis zu 10% der peripheren CD4-positiven T-

Lymphozyten aus und sind in der Lage CD25 zu exprimieren (Sakaguchi 2005; Sakaguchi 2011; Stephens et al., 2001). Bei ihnen wurden ausgeprägte

immunmodulierende Eigenschaften in vitro und in vivo nachgewiesen. Sie spielen

eine wichtige Rolle für die Aufrechterhaltung der Selbsttolleranz (Murakami et al., 2002; Sakaguchi 2004; Shevach 2000) und werden mit unterschiedlichen Th1-

und Th2-bedingten Autoimmunerkrankungen in Verbindung gebracht (Bollinger et al., 2010; Corthay 2009; Tang und Bluestone 2008). Ferner sollen nTreg-Zellen in

der Entstehung von Immunantworten gegen Tumore (Onizuka et al., 1999), Infektionen (Belkaid et al., 2002) und bei Reaktionen nach allogenen

Organtransplantationen beteiligt sein (Cohen et al., 2002). Zusätzlich verhindern

sie die Reifung der DCs und unterdrücken die Funktion der natürlichen Killerzellen

(Cederbom et al., 2000; Miyara und Sakaguchi 2007). Sie inhibieren die

Proliferation, Aktivierung und Zytokinproduktion von CD4+- sowie CD8+-Zellen

(Sakaguchi 2004; Thornton und Shevach 1998) und von B-Lymphozyten (Miyara und Sakaguchi 2007).

Einleitung

12

1.1.2 Th1/Th2-Immunbalance

An der Steuerung des Immunsystems sind unter anderem Zytokine beteiligt.

Hierbei handelt es sich um Mediatoren, kurzlebige Botenstoffe, die für die

Kommunikation der Zellen untereinander unerlässlich sind. Zu ihnen gehören

Tumornekrosefaktoren (TNF), Interleukine (IL), Interferone (INF),

Wachstumsfaktoren und koloniestimulierende Faktoren (CSF). Diese werden in

unterschiedlichen Konzentrationen vorwiegend von Leukozyten exprimiert und

bewirken unterschiedliche Reaktionen des Organismus (Ibelgaufts 2012; Janeway et al., 2009). Je nach ihrer Funktion kann man sie in proinflammatorische

Zytokine, wie z. B. IL-1, IL-6, TNF-α (Cavaillon 1994; Kirchner et al., 1998) und

antiinflammatorische Zytokine, wie z. B. IL-4, IL-5, IL-10 einteilen (Fiorentino et al., 1991a; Fiorentino et al., 1991b).

Mosmann und Mitarbeiter entdeckten, dass naive T-Lymphozyten nach ihrer

Aktivierung zwei funktionell verschiedene Zytokinmuster exprimieren. Anhand der

freigesetzten Zytokine klassifiziert man die T-Helferzellen als Th1- und Th2-

Zellen. Th1 Leitzytokine sind IL-2, IL-12, IFN-γ und TNF-α. Th2-Zellen sind vor

allem durch Ausschüttung von IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 und IL-13 charakterisiert (Han et al., 2012; Kasakura 1998; Mosmann 1991; Mosmann und Coffman 1989; Ramos et al., 2011; Romagnani 1991; Szczypka et al., 2012; Takato-Kaji et al., 2005). Th1-Zytokine wirken proinflammatorisch. Sie führen zur Freisetzung von

Makrophagen, aktivieren zytotoxische T-Zellen und sind besonders wichtig bei der

Abwehr intrazellulärer Erreger (Viren, Chlamydien, Mykobakterien, Pilze). Th2-

Zytokine wirken antiinflammatorisch. Sie hemmen die Makrophagenaktivität,

aktivieren Mastzellen und eosinophile Granulozyten. Außerdem stimulieren sie

antikörperproduzierende B-Lymphozyten, was die humorale Immunantwort

unterstützt. Dieser Abwehrmechanismus reguliert unter anderem allergische

Reaktionen des Organismus sowie die Bekämpfung extrazellulärer Parasiten

(Kidd 2003; Mosmann 1991; Mosmann und Coffman 1989; Romagnani 1991).

Für einen optimalen Ablauf der Immunantwort ist die Balance der Th1- und Th2-

Zytokine von entscheidender Bedeutung (Kidd 2003). Beim gesunden Menschen

sollte sie ausgeglichen sein und sich nach Ablauf einer Immunreaktion erneut

einstellen. Überschießende Th1-Antworten können zu einer übermäßigen

Einleitung

13

Entzündungsreaktion bis hin zum septischen Schock führen. Ein Überwiegen der

Th2-Zytokine begünstigt hingegen eine Immunschwäche. Eine physiologische

Th2-Dominanz sorgt jedoch für eine erfolgreiche Schwangerschaft und lässt sich

auch in den ersten Lebensjahren eines Kindes nachweisen (Herberth et al., 2010; Kasakura 1998). Zudem wird in der Literatur eine rhythmische Schwankung der

Th1/Th2-Balance mit einem Maximum in der ersten Nachthälfte beschrieben

(Besedovsky et al., 2012; Dimitrov et al., 2004b; Lange et al., 2006a). Der

Zusammenhang zwischen einer Immundysbalance und diversen chronischen

Leiden wird durch eine Vielzahl von Studien belegt. So sind sowohl Erkrankungen

wie rheumatoide Arthritis, Diabetes mellitus Typ I, als auch Multiple Sklerose oder

Morbus Crohn mit einer Dominanz der Th1-Zytokine assoziiert. Bei Überlegenheit

der Th2-Zytokine werden vor allem allergische Reaktionen, Infektionen mit dem

humanen Immundefizienz-Virus (HIV) und das erworbene Immundefektsyndrom

(AIDS) beobachtet (Herberth et al., 2010; Janeway et al., 2009; Kayser et al., 2005; Neumann 2008; Romagnani 1991).

Zur Regelung und Aufrechterhaltung dieser Immunbalance sind die Zytokine

ausgefeilten Regelmechanismen durch das Endokrinum und durch das

Nervensystem unterworfen, wobei der Psyche und dem Schlaf ebenfalls eine

große Rolle zugeschrieben wird (Ader et al., 1995; Besedovsky et al., 2012;

Dhabhar 2009; Forsythe 2012; Ricklin et al., 2010; Whitesman und Booth 2004). Dabei hemmen sich die Zytokine der Th1- und Th2-Reihe gegenseitig (McEwen et al., 1997; Romagnani 1991). IFN-γ inhibiert beispielsweise selektiv die Proliferation

und Funktion von Th2-Zytokinen, hat aber keinen direkten Einfluss auf die Th1-

Zellen. Die Th2-Zytokine IL-4 und IL-10 wirken ihrerseits supprimierend auf die

Produktion der Th1-Zytokine (Gajewski und Fitch 1988; Gajewski et al., 1989).

Neuere Studien zeigen auf, dass natürliche regulatorische T-Zellen (nTreg)

ebenfalls an der Regulierung der Zytokinbalance beteiligt sind. NTreg

unterdrücken die Sekretion von IFN-γ, IL-2 und TNF-α, aber nicht die von IL-4, IL-6

und IL-10 (Bollinger et al., 2010; Stroopinsky et al., 2009). Um ihre suppressive

Wirkung entfalten zu können, sind sie wiederum wesentlich auf die Präsenz und

Unterstützung von IL-6 und IL-2 angewiesen (Doganci et al., 2005; Pandiyan et al., 2007; Pasare und Medzhitov 2003). Bollinger und Mitarbeiter demonstrierten,

Einleitung

14

dass Hormone, insbesondere Cortisol und Prolaktin in Zusammenarbeit mit nTreg

die zirkadiane Steuerung der T-Zell-Aktivität modulieren (Bollinger et al., 2010).

1.2 Endokrinum und das Immunsystem

Die Wechselwirkung zwischen dem Endokrinum und dem Immunsystem ist ein

wichtiges Forschungsgebiet der Medizin. Die genauen Zusammenhänge und

Wirkmechanismen sind bis dato nicht vollständig geklärt. Bereits in den späten

vierziger Jahren des letzten Jahrhunderts stand fest, dass einige Hormone starke

Auswirkungen auf das Immunsystem haben. So wurden z. B. dem Steroidhormon

Cortisol immunsuppressive Eigenschaften zugewiesen. Es wurde zur Behandlung

der rheumatoiden Arthritis verwandt, wofür Hench und Kollegen im Jahr 1950 den

Nobelpreis verliehen bekamen (Kendall 1950; Lloyd 2002; Schubert und Schussler 2009).

Das Endokrinum zählt neben dem Nervensystem zum wichtigsten Steuerelement

des Organismus. Als „Kommunikationsmittel“ dienen Botenstoffe, unter anderem

Hormone, die von Zellen des Endokrinums sezerniert werden und am Zielort ihre

Wirkung über bestimmte Rezeptoren entfalten. Die „oberste Kontrollinstanz“ ist der

Hypothalamus, der über komplexe Regulationsmechanismen als

Verbindungselement zwischen Endokrinum und Nervensystem fungiert. Seine

Verbindung mit dem Hypophysenvorderlappen (HVL) und der Nebennierenrinde

(NNR) nennt man Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden-Achse (HHN-

Achse) (Abb. 1). Über die Ausschüttung des Corticoliberins (Corticotropin-

releasing Hormone = CRH) im Hypothalamus wird die Freisetzung vom

Adrenocorticotropin (adrenocorticotropes Hormons = ACTH) im

Hypophysenvorderlappen (HVL) gefördert. ACTH regt die Nebennierenrinde unter

anderem zur Produktion von Mineralokortikoiden (MK), Glukokortikoiden (GK) und

Sexualhormonen an. Sie regulieren über negative Feedback-Mechanismen die

Freisetzung von ACTH und CRH (Hermus et al., 1984; Suda et al., 1985; Suda et al., 1987; Suda et al., 1986) und wirken auch auf Vorgänge innerhalb des

Immunsystems (Arlt und Hewison 2004; Bornstein et al., 2004; Forsythe 2012; Janeway et al., 2009; Kelley et al., 2007; Kidd 2003).

Einleitung

15

Abbildung 1: Schematische Darstellung der HHN-Achse. Regelmechanismen zur Freisetzung von Cortisol. HT = Hypothalamus, CRH = Corticotropin Releasing Hormone, HVL = Hypophysenvorderlappen, NNR = Nebennierenrinde, IS = Immunsystem, Rote Pfeile = Inhibition, Grüne Pfeile = Induktion

Zwei weitere Hormone, die einen wichtigen Einfluss auf das Immunsystem haben

und deren Freisetzung aus dem HVL über sogenannte Releasing - Hormone des

Hypothalamus stimuliert wird, sind das Prolaktin und das humane

Wachstumshormon (GH = human growth hormone). Deren Produktion und

Freisetzung wird ebenfalls durch negative Rückkopplungsmechanismen reguliert

(Dimitrov et al., 2004a; Jara et al., 2006; Kelley 1988; Kelley et al., 2007).

Nachfolgende Abbildung schematisiert die Regulationsmechanismen der GH-

Sekretion.

Abbildung 2: Schematische Darstellung der Regelmechanismen zur Freisetzung von GH. HT = Hypothalamus, GHIH = Growth Hormone Inhibiting Hormone, GHRH = Growth Hormone Releasing Hormone, GIT = Gastrointestinaltrakt, HVL = Hypophysenvorderlappen, GH = Growth Hormone, IGF = Insulin-Like Growth Factor, IS = Immunsystem, Rote Pfeile = Inhibition, Grüne Pfeile = Induktion

Im Folgenden wird auf die zwei, in dieser Studie untersuchten Hormone Cortisol

und GH eingegangen.

Einleitung

16

1.2.1 Das Glukokortikoid Cortisol

Kortikoide sind eine Gruppe von Hormonen, die in den Zellen der

Nebennierenrinde gebildet werden. Anhand ihrer Hauptwirkung werden sie in

Glukokortikoide (GK) und Mineralokortikoide (MK) eingeteilt. GK fördern die

Glukoneogenese der Leber durch Induktion verschiedener Enzyme und stellen

dadurch die Energieversorgung des Organismus in Bedarfssituationen sicher,

wohingegen MK an der Aufrechterhaltung des Salz- und Wasserhaushaltes

beteiligt sind. Über das Renin-Aldosteron-Angiotensin-System (R-A-A-S)

regulieren sie das Blutvolumen. Ihre Wirkung entfalten beide Steroide über zwei

Rezeptortypen: die Glukokortikoid- (GR) und Mineralokortikoidrezeptoren (MR) (de Kloet et al., 1993; Funder 1986; Funder 2000; Joels und de Kloet 1994). Die

wichtigsten Liganden für GR und MR sind Cortisol und Aldosteron, wobei Cortisol

seine Wirkung über beide Rezeptoren vermitteln kann. Als Antagonisten dienen

unter anderem der GR-Antagonist RU-486 und der MR-Antagonist Spironolacton

(Castinetti et al., 2012; de Kloet et al., 1999), womit in dieser Studie die

Rezeptorbindung komplett unterbunden wurde.

Das Glukokortikoid Cortisol wird in der Zona fasciculata der Nebennierenrinde

über verschiedene Zwischenschritte aus Cholesterin gebildet. Wie bereits

beschrieben, unterliegt die Cortisolsekretion der hypothalamischen und

hypophysären Regulation durch CRH und ACTH. Aber auch andere Hormone

(Fehm et al., 1984), wie z. B. GH (Castro-Magana et al., 1983) und Katecholamine

(Rivier und Vale 1983) können seine Freisetzung beeinflussen. Zudem ist Cortisol

selbst in der Lage, seine Synthese auf jeder Ebene der Bildungskaskade zu

regulieren (Abb. 1).

Die Plasmahalbwertszeit des Cortisols beträgt ca. 90 - 120 Minuten. Nach Abbau

durch die Leber werden die entstandenen Metabolite über die Niere

ausgeschieden (Köhrle und Petrides 2007a). Die Cortisolfreisetzung unterliegt

einem strengen zirkadianen Rhythmus mit einem Höchstwert in den frühen

Morgenstunden und sinkenden Werten in den späten Abendstunden,

beziehungsweise während des Schlafes (Ball et al., 2006; Dimitrov et al., 2009;

Einleitung

17

Esteban et al., 1991; Gallagher et al., 1973; Migeon et al., 1956; Nichols und Tyler 1967; Perkoff et al., 1959; Rimmele et al., 2010). Der Nadir der Cortisolfreisetzung

wird zwischen Mitternacht und zwei Uhr morgens erreicht.

Die wichtigste Funktion des Cortisols besteht in der Einleitung der

Glukoneogenese zur kurzfristigen Bereitstellung von Energie bei der Bewältigung

von Stresssituationen (Köhrle und Petrides 2007a; Munck et al., 1984). Diese

Situationen können unter anderem körperliche Anstrengung (Brandenberger und Follenius 1975; Brandenberger et al., 1982), psychischer Stress (Holl et al., 1984) oder geistige Anspannung sein (Kamezaki et al., 2012). Ein Cortisolanstieg kann

sogar nach einer Mahlzeit erfolgen (Follenius et al., 1982). Um die Wirksamkeit zu

verbessern und die Nebenwirkungen zu verringern, wurden im letzten Jahrhundert

synthetische Cortisolderivate entwickelt. Einige wichtige Vertreter sind das

kurzwirksame Prednisolon und die langwirksamen Kortikoide Bethametason und

Dexamethason (DEX) (Kaiser und Kley 2002; Mutschler et al., 2008).

1.2.2 Einfluss von Cortisol auf das Immunsystem und die Th1/Th2-Balance

Neben seiner katabolen Hauptwirkung hat Cortisol auch immunmodulierende

Eigenschaften, die bereits in den vierziger Jahren des letzten Jahrhunderts zur

Behandlung immunologischer Erkrankungen, wie z. B. der rheumatoiden Arthritis

ausgenutzt wurden (Hench et al., 1949; Kendall 1950). Die immunsuppressive

Wirkung des Cortisols wurde in den letzten Jahren gründlich untersucht

(Besedovsky et al., 2012; Pinto et al., 2006; Skjolaas et al., 2002; Yeager et al., 2008).

Cortisol hemmt unter anderem die Entwicklung von Monozyten sowie die

Proliferation und Expression von Rezeptoren auf Makrophagen. Durch GK wird die

Anzahl der zirkulierenden Lymphozyten verändert, die Lymphozytenakkumulation,

besonders im entzündeten Gewebe gehemmt und eine Lymphozyten-Apoptose

induziert (Dimitrov et al., 2009; Dobbs et al., 1996; McEwen et al., 1997). Studien

zeigen, dass durch erhöhte GK-Konzentrationen die Produktion der Th1-Zytokine

IL-2, INF-γ und TNF-α gehemmt wird. Zudem kommt es zu einem leichten

Sekretionsanstieg der Th2-Zytokine IL-10 und IL-4 (Agarwal und Marshall Jr.

Einleitung

18

2001; Gleeson und Bishop 2005; Visser et al., 1998; Yeager et al., 2008). Der

endgültige Umschwung des Zytokinmusters zugunsten von Th2 soll eher durch die

Inhibition der Th1-Zytokine, als durch Aktivierung der Th2-Zytokine zustande

kommen. Analog dazu führt eine erniedrigte GK-Konzentration, die z. B. durch

Blockade der GK-Wirkung hervorgerufen wurde, zur stärkeren Entwicklung Th1-

spezifischer Zytokine (Agarwal und Marshall Jr. 2001; Bollinger et al., 2010; Brinkmann und Kristofic 1995; Daynes und Araneo 1989; Dhabhar 2009; Franchimont et al., 2000; Franchimont et al., 1998; Pinto et al., 2006; Schreiber 2011).

1.2.3 Das humane Wachstumshormon (GH)

GH ist ein Peptidhormon und wird im Hypophysenvorderlappen gebildet. Seine

Sekretion wird unter anderem vom Hypothalamus über Growth Hormone

Releasing Hormone (GHRH) und Somatostatin gesteuert. Ein weiterer Stimulus

für seine Freisetzung ist das Hormon Ghrelin, welches größtenteils von der

Magenmukosa produziert und ins Blut sezerniert wird (Köhrle und Petrides

2007b). GH wird pulsativ abgegeben und unterliegt einem ausgeprägten

zirkadianen Rhythmus, wobei seine höchste Konzentration im Tiefschlaf

gemessen werden kann. Daneben ist die Sekretion geschlechts- und

altersabhängig (Antonijevic et al., 1999; Baeza et al., 2008; Veldhuis et al., 1997). Sie nimmt mit zunehmendem Lebensalter ab. GH löst in der Leber, aber auch in

der Muskulatur und im Fettgewebe die Freisetzung von Insulin-ähnlichen

Wachstumsfaktoren (IGF = Insuline like growth factors) aus, die zusammen mit

Somatostatin die wichtigsten Inhibitoren der GHRH- und GH-Sekretion darstellen

(Krueger und Obal 1993; Nyberg 2000) (Abb. 2). Die Hauptwirkung des GH wird

durch IGF vermittelt und besteht in der Regulierung des Wachstums. Aus einem

Hyposomatotropismus im Kindesalter kann ein Zwergwuchs resultieren. Eine

Überproduktion dagegen führt entweder zu Gigantismus oder im

Erwachsenenalter zu Akromegalie (de Boer et al., 1996; Köhrle und Petrides 2007b; Schiebler 2005).

Einleitung

19

1.2.4 Einfluss von GH auf das Immunsystem und die Th1/Th2-Balance

Wie auch Cortisol besitzt GH immunmodulatorische Eigenschaften. Ihm werden

Interaktionen mit T- und B-Zellen zugeschrieben. So soll GH immunstimulierende

Fähigkeiten wie Förderung des Thymuswachstums oder Antikörperbildung

besitzen. Ebenso sollen Makrophagen aktiviert, die Sekretion von Antikörpern

durch B-Zellen stimuliert und über direkte Wirkung auf Monozyten die Freisetzung

von proinflammatorischen Zytokinen (IL-12, IFN-γ und TNF-α) gefördert werden

(Chappel 1999; Kelley et al., 2007; Postel-Vinay et al., 1997; Tripathi und Sodhi 2009). Ferner soll GH die Aktivität der CTL und NK sowie die Expression von

Rezeptoren auf immunkompetente Zellen begünstigen (Auernhammer und Strasburger 1995; Berczi 1994; Chappel 1999; Davila et al., 1987).

Mehrere Studien belegen, dass durch GH die Anzahl der Th1-Zytokine gesteigert

und die Th2-Aktivität sogar erniedrigt wird (Barbano et al., 2001; Liu et al., 2008; Mustafa et al., 1997; Takagi et al., 1998), wodurch die Th1/Th2-Balance

zugunsten der proinflammatorischen Th1-Antwort verschoben wird. Eine neue

Studie von Borrione und Mitarbeitern beschreibt jedoch einen unerwarteten Shift

zur Th2-Dominanz nach Gabe hoher Dosen des Wachstumshormons bei

gesunden Sportlern (Borrione et al., 2012).

1.3 Schlaf, Endokrinum und das Immunsystem

Ein weiterer Schwerpunkt der heutigen immunologischen Forschung ist die

Wechselwirkung zwischen Immunsystem, Endokrinum und Schlaf. In

vorangegangenen Studien wurde der regulatorische Einfluss des Schlafes auf

immunologische Prozesse belegt. Schlaf gilt nunmehr als essenziell zur

Aufrechterhaltung aller homöostatischer Prozesse, indem er auf den Stoffwechsel,

das Endokrinum und das Immunsystem wirkt (Besedovsky et al., 2012; Horne 1988).

In der Polysomnographie werden 5 Schlafstadien unterschieden. Das erste

Stadium (S1) schließt sich direkt an die Einschlafphase an. Darauf folgt eine

weitere Phase des leichten Schlafes (S2), indem der Körper noch ohne Weiteres

Einleitung

20

erweckbar ist. Als Tiefschlaf oder slow wave sleep (SWS) werden die Stadien 3

und 4 bezeichnet, die sich durch langsamere Wellen mit hoher Amplitude

auszeichnen. Diese Tiefschlafphasen findet man vor allem in der ersten

Nachthälfte. Im zweiten Abschnitt der Nacht werden sie durch vermehrt

auftretende und länger andauernde rapid-eye-movement Phasen (REM) abgelöst.

Die Übergänge dieser Schlafphasen sind fließend und werden mehrmals pro

Nacht durchlaufen (Rechtschaffen und Kahles 1968).

Die im Rahmen dieser Studie untersuchten Hormone Cortisol und GH unterliegen

einem schlafassoziierten Sekretionsmuster. Somit beeinflusst Schlaf deren

Plasmakonzentration und deren Wirkung auf die Zytokinproduktion der T-Zellen.

SWS-reiche Schlafphasen der ersten Nachthälfte inhibieren die

Cortisolfreisetzung, was in einem Nadir zwischen 24:00 und 2:00 Uhr resultiert. Mit

Abnahme der Tiefschlafphasen in der zweiten Nachthälfte steigen die Cortisol-

Plasmaspiegel kontinuierlich an und erreichen ihr Maximum in den frühen

Morgenstunden (Born und Fehm 1998; Gallagher et al., 1973; Weitzman 1976a; Weitzman 1976b). Auch bei GH wurde eine schlafassoziierte Abhängigkeit des

Sekretionsmusters beobachtet. Im Gegensatz zu Cortisol wurde jedoch der

Sekretionsgipfel in den ersten SWS-Phasen nach dem Einschlafen beschrieben.

Im Verlauf der folgenden 24 Stunden lassen sich nur noch länger andauernde

Phasen einer verminderten Freisetzung verzeichnen (Davidson et al., 1991; Lange et al., 2006a; Van Cauter und Copinschi 2000; Weitzman et al., 1981). Die

Zusammenhänge zwischen Schlafstadien, Hormonfreisetzung und Zytokinbalance

sind in der folgenden Abbildung dargestellt (Abb. 3).

Einleitung

21

Abbildung 3: Schematische Darstellung eines Hypnogramms mit Cortisol- und GH- Plasmakonzentrationen sowie dazugehörigem Zytokinprofil: W = Wachphase, REM = Rapid Eye Movement, S1 bis S4 = Non REM Schlafphasen, S3 und S4 = SWS = Tiefschlafphasen, GH = Wachstumshormon, Blaue Linie = Konzentrationverlauf GH, Rote Linie = Konzentrationsverlauf Cortisol, Grüne Fläche = Th1-Zytokinprofil, Gelbe Fläche = Th2-Zytokinprofil, GG = Th1/Th2-Gleichgewicht (Balance)

Wie in der obigen Skizze verdeutlicht, unterliegt die Zytokinsekretion diurnalen

Schwankungen. Unter erniedrigtem Cortisolspiegel und hohen Konzentrationen

von GH, wie sie in der ersten Nachthälfte (SWS-Phasen) bestehen, werden

proinflammatorische Zytokine freigesetzt. Es kommt zur Sekretion von IL-1, IL-12,

TNF-α und IFN-γ. Das Verhältnis der IFN-γ zu IL-4 produzierenden T-Zellen

verschiebt sich zugunsten des Th1-Zytokins IFN-γ (Besedovsky et al., 2012;

Dimitrov et al., 2004b; Esquifino et al., 2004; Hattori 2009; Haus 2007; Kelley et al., 2007). In der zweiten Nachthälfte und den frühen Morgenstunden, die durch

erniedrigte GH- und erhöhte Cortisolspiegel bei vermehrt auftretenden REM-

Phasen gekennzeichnet sind, ist ein Umschwung der Th1/Th2-Balance zugunsten

von Th2 zu verzeichnen (Besedovsky et al., 2012; Dimitrov et al., 2004b). Diese

Zusammenhänge verdeutlichen die Interaktionen zwischen Endokrinum,

Immunsystem und Schlaf, wobei der Hypothalamus als zentrales

Regulationsorgan anzusehen ist. Er moduliert über den Ncl. suprachiasmaticus

die zirkadiane Rhythmik, über Releasing- und Inhibiting-Hormone das

Endokrinum, über den Locus coeruleus und Raphe Kerne den Schlaf sowie über

Ausschüttung bestimmter Neurotransmitter das vegetative Nervensystem (Abb. 4).

Einleitung

22

Abbildung 4: Schematische Darstellung der Immunmodulation: Wechselwirkungen und Rückkopplungsmechanismen zwischen Hypothalamus als Vermittler und zentraler Instanz zwischen Nervensystem, Endokrinum, zirkadianem Schrittmacher und Immunsystem (Guillemin 2005). HT = Hypothalamus, HVL = Hypophysenvorderlappen, EP = Epiphyse, CRH = Corticotropin Releasing Hormone (Corticoliberin), ACTH = Adrenocorticotropes Hormon, GHRH = Growth Hormon Releasing Hormon, GHIH = Growth Hormon Inhibiting Hormon SWS = Slow Wave Sleep = Tiefschlaf, REM = Rapid Eye Movement, NNR = Nebennierenrinde, GH = Growth Hormon, Th1/Th2 = Zytokine der Th1- und Th2-Helferzellen, Rote Pfeile = Inhibition, Grüne Pfeile = Induktion, Schwarze Pfeile = gegenseitige Beeinflussung

Dem Wachstumshormon schreibt man proinflammatorische Effekte zu, während

Cortisol konzentrationsabhängig eher antiinflammatorische Reaktionen hervorruft

(Elenkov 2004; Kelley et al., 2007). Weitere schlafassoziierte Hormone sind

Melatonin und Prolaktin. Auch sie sollen synergistische Effekte auf die

Regulierung einer Immunantwort haben. Mit Anstieg ihrer Sekretion während des

Einleitung

23

Schlafes sollen sie eine proinflammatorische Reaktion begünstigen (Besedovsky et al., 2012; Dimitrov et al., 2004b).

Zusammenfassend besitzen der Schlaf, ebenso wie die zirkadiane Rhythmik,

einen starken Einfluss auf das Immunsystem. Ein geregelter Schlaf-Wach-

Rhythmus ist essenziell für eine suffiziente Immunabwehr. Insomnie führt zu einer

herabgesetzten Immunantwort und früher oder später zur Beeinträchtigung der

Gesundheit (Besedovsky et al., 2012; Cohen et al., 2009; Dhabhar 2009; Everson 1993; Everson 2005; McEwen 2006; Meerlo et al., 2008).

Einleitung

24

1.4 Fragestellung und Ziel der Arbeit

Diese in vitro Studie beschäftigt sich mit den Auswirkungen physiologischer

Konzentrationen des humanen Wachstumshormons (GH) und des Cortisols auf

das Immunsystem, insbesondere auf die Balance der Th1/Th2-Zytokine.

Als Parameter für die Funktion des Immunsystems dienten IFN-γ- und IL-4-

produzierende CD4+ T-Helferzellen, wobei IFN-γ als Leitzytokin für Th1 und IL-4

für Immunreaktionen der Th2-Zellreihe dienten.

Unter standardisierten Bedingungen wurden T-Lymphozyten aus Vollblutproben

von 15 gesunden jungen Männern auf ihre intrazelluläre Konzentration an den o.g.

Zytokinen am Durchflusszytometer untersucht.

Im Einzelnen sollten folgende Fragen beantwortet werden.

1. Welchen Einfluss besitzen die Hormone GH und Cortisol auf IFN-γ-

produzierende CD4-positive T-Helferzellen?

2. Welchen Einfluss besitzen die Hormone GH und Cortisol auf IL-4-produzierende

CD4-positive T-Helferzellen?

3. Welche Auswirkungen haben veränderte GH- und Cortisolkonzentrationen auf

die Th1/Th2-Balance?

Material und Methoden

25

2. Material und Methoden

2.1 Probanden

An dieser Studie nahmen 15 physisch und psychisch gesunde männliche

Probanden im Alter zwischen 20 und 35 Jahren teil. Voraussetzung für die

Teilnahme war ein gesunder und regelmäßiger Schlaf-Wach-Rhythmus, der einen

Nachtschlaf von sieben bis neun Stunden ermöglichte und Schichtarbeit in den der

Untersuchung vorausgegangenen sechs Wochen ausschloss. Innerhalb der

letzten drei Monate durften die Probanden unter keinerlei Medikamenteneinfluss

gestanden haben. Weitere Ausschlusskriterien waren Nikotinabusus und

allergische Erkrankungen. Akute und / oder chronische Krankheiten wurden

mittels eines Anamnesebogens (s. Anhang), klinischer Untersuchung sowie einer

Routine-Laborkontrolle ausgeschlossen. Die Laborparameter schlossen ein

großes Blutbild (Leukozyten < 9/µl, C-reaktives Protein (CRP) < 6mg/l), Elektrolyt-

und Plasmametabolitbestimmungen und Bestimmung des TSH- (Thyroid

Stimulating Hormon) Wertes ein.

Bei der vorliegenden Studie handelt es sich um ein DFG-gefördertes Projekt

(FOR457). Das Studienprotokoll wurde im Vorfeld von der Ethikkommission der

Universität zu Lübeck vorgelegt und genehmigt. Jeder Proband wurde ausführlich

aufgeklärt. Von jedem Teilnehmer lag eine schriftliche Einverständniserklärung vor

Beginn der Studie vor.

2.2 Reagenzien

Das humane Wachstumshormon (GH), der GR-Antagonist RU-486 sowie der MR-

Antagonist Spironolacton wurden über Sigma-Aldrich (St. Louis, Minnesota, USA)

erworben.

Die monoklonalen GH-Antikörper (5801) wurden von Oy Medix Biochemica

Antibody (Kaunianinen, Finnland) hergestellt.


26

2.3 Versuchsablauf

Um eine Aussage über die immunologischen Effekte physiologischer

Konzentrationen von GH und Cortisol treffen zu können, wurden Vollblutproben

gesunder Männer analysiert. Nach in vitro-Stimulation mit Ionomycin und PMA, in

An- und Abwesenheit von GH und dem Cortisol-Rezeptor-Antagonisten RU-486

und Spironolacton wurde mittels Durchflusszytometers die Zytokinproduktion CD4-

positiver T-Helferzellen untersucht. Als Kontrollgruppe diente eine nicht stimulierte

Vollblutprobe eines jeden Probanden.

2.3.1 Zellstimulation und Zellaktivierung

Jedem Probanden wurde durch eine Venenpunktion 0,5 ml venöses Vollblut in

heparinisierte Monovetten (Firma Becton Dickinson, San Jose, Kalifornien, USA)

entnommen. Die Blutentnahme erfolgte, gemäß Studienprotokoll, immer morgens

gegen 8:00 Uhr durch die gleiche Person. Die Probanden waren zum

Abnahmezeitpunkt nüchtern und befanden sich in sitzender Position. Das Blut

wurde unverzüglich im Verhältnis 1:1 mit dem Kulturmedium RPMI-1640 unter

Zusatz von Penicillin, Streptomycin, Glutamin, nicht essentiellen Aminosäuren und

Natriumpyruvat in Falcon-Röhrchen (Becton Dickinson, San Jose, Kalifornien,

USA) versetzt. Danach folgte eine sechsstündige Inkubation der Proben in einem

Brutschrank bei 37°C und 5 %-igem CO2-Zusatz in An- bzw. Abwesenheit von 20

ng/ml GH, 8,3 µM RU-486, einer Kombination aus GH und RU-486, und 8,3 µM

Spironolacton. Durch den Zusatz von RU-486 und Spironolacton wurde eine

komplette Blockade der Cortisolwirkung erreicht, da Cortisol seine Wirkung

bekanntermaßen über beide Rezeptortypen (GR und MR) entfalten kann. So

wurde der physiologische Nadir der Cortisol-Plasmakonzentration, wie er in der

ersten Nachthälfte vorliegt, simuliert. Eine weitere Kultur, ohne jeglichen Zusatz,

diente als unbehandelte Kontrolle. Diese Vollblutprobe enthielt die physiologisch

hohe Cortisolkonzentration, die üblicherweise in den frühen Morgenstunden

vorherrscht. Für die letzten vier Stunden der insgesamt sechsstündigen Inkubation

wurden die Proben mit jeweils 1µg/ml Ionomycin und 8 ng/ml PMA (Phorbol-12-

myristat-13-acetat) stimuliert. Eine Proteinausschüttung wurde durch Zugabe des


27

Golgi-Inhibitors Brefeldin A in einer Konzentration von 10 µg/ml verhindert. Alle

hier verwandten Reagenzien wurden von Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Minnesota,

USA hergestellt.

2.3.2 Durchflusszytometrische Analyse

Nach abgeschlossener Stimulation der Zellen, wie unter 2.3.1 erklärt, erfolgte

deren Markierung für die durchflusszytometrische Analyse. Dazu wurden direkt

konjugierte Antikörper gegen die Oberflächenmarker CD3 mit dem Fluorochrom

Allophycocyanin (APC) (CD3-APC) und die Oberflächenmarker CD8 mit dem

Farbstoff Peridin-Chlorophyll (PerCP) (CD8-PerCP) verwandt (Becton Dickinson,

San Jose, Kalifornien, USA). Die Markierung wurde unter Lichtschutz bei

Raumtemperatur für 20 Minuten durchgeführt. Anschließend erfolgte die

zehnminütige Lyse der Erythrozyten mit 2 ml einer FACS-Lyse-Lösung (BD

FACS™ lysing solution, Becton Dickinson, San Jose, Kalifornien, USA). Nach

Zentrifugation für 5 Minuten bei 500g wurde der Überstand entfernt. Um ein

Eindringen der zytokin-spezifischen Antikörper in die Zellen zu ermöglichen,

erfolgte eine zehnminütige Permeabilisierung mittels FACS-

Permeabilisierungslösung (BD FACS™ permeabilizing solution, Becton

Dickinson). Nach der Zellwaschung mit CellWash + 0,5% FCS (fetales

Kälberserum, fetal calf serum) erfolgte die Inkubation mit den intrazellulären

Antikörpern gegen die Zytokine IFN-γ mit dem Fluorochrom

Fluoresceinisothiocyanat (FITC) (IFN-γ-FITC) und gegen die Zytokine IL-4 mit dem

Farbstoff Phycoerythrin (PE) (IL4-PE). Um eine Differenzierung zwischen positiven

und negativen Zellen zu ermöglichen, wurden Isotyp-Kontroll-Antikörper benutzt

(Machura et al., 2007; Pala et al., 2000; Prussin 1997).

Nach einer erneuten Wäsche wurden die Zellen mit einer phosphatgepufferten

Salzlösung (Phosphate buffered saline, PBS) versetzt und umgehend im

Durchflusszytometer (BD FACSCalibur flow cytometer, Becton Dickinson) anhand

der Software BD CellQuest Pro (ebenfalls Becton Dickinson) analysiert.

Bei der Durchführung der Durchflusszytometrie wurde strikt nach der Anleitung

des Geräteherstellers vorgegangen. Bei jeder Analyse wurden mindestens 10.000


28

Zellen innerhalb der CD3+-Region, die den T-Lymphozyten entspricht, gezählt.

Die Schwelle für Zytokin-positive Zellen wurde anhand von Isotyp-Kontroll-

Antikörpern ermittelt. Um eine Kontamination durch andere Zellpopulationen

auszuschließen, wurde die Vorwärts- und Seitwärts-Streuung für Lymphozyten

zusammen mit den CD3-positiven Zellen (CD3+) entsprechend eingestellt.

Die für diese Untersuchung relevanten IFN-γ- und IL-4-positiven Zellen wurden als

prozentualer Anteil der CD3+CD8- T-Helferzellen ausgedrückt. Da der sonst

übliche Marker CD4 durch Stimulation durch PMA herunterreguliert werden kann

(Petersen et al., 1992; Suzuki et al., 1991), wurde im Rahmen dieser Studie der

Marker CD8 zur Bestimmung der T-Helferzellen ausgewählt.

2.3.3 Hormonbestimmung

Für die Hormonbestimmung wurde das durch eine morgendliche Venenpunktion

gewonnene Blut in Serum-Monovetten (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) gefüllt.

Nach sofortiger Zentrifugation wurde der Überstand gewonnen und bis zur

Hormonbestimmung bei -20 °C aufbewahrt.

Die Messung des humanen Wachstumhormons (GH) erfolgte durch einen

Radioimmunoassay (RIA, Diagnostic Products Corporation, Los Angeles,

Kalifornien). Die Sensitivität der Untersuchung betrug 0,9 ng/ml. Der Intra- und

Interassay-Variationskoeffizient (CV) lag unter 5,9 bzw. 8,3%.

Für die Cortisol-Bestimmung wurde ein enzymgekoppelter Immunadsorptionstest

(EIA) der Firma Diagnostic Systems Laboratories, Sinsheim, Deutschland mit der

Sensitivität 0,1 µg/dl herangezogen. Der Intra- und Interassay-Variationskoeffizient

(CV) lag unter 5,0 bzw. 12%.


29

2.3.4 Statistische Auswertung der Ergebnisse

Folgende Parameter wurden statistisch ausgewertet:

- Anzahl der IFN-γ-produzierenden CD4+ T-Helferzellen und IL-4-

produzierenden CD4+ T-Helferzellen als Leitzytokine der Th1- bzw. Th2-

Immunantwort

- absolute Änderung IFN-γ-produzierenden CD4+ T-Helferzellen und IL-4-

produzierenden CD4+ T-Helferzellen nach Zusatz von GH, RU-486, GH und

RU-486 sowie Spironolacton.

Um starke interindividuelle Schwankungen der Absolutwerte auszugleichen und

eine genauere Aussage über die Konzentrationsänderung der Zytokine treffen zu

können, wurden diese Absolutwerte zusätzlich ins Verhältnis zur unbehandelten

Kontrollgruppe gesetzt und anschließend statistisch ausgewertet. Hierdurch

wurden nicht die Absolutwerte, sondern die tatsächliche Änderung der

Zytokinproduktion erfasst.

Darüber hinaus wurde das Verhältnis der Th1- zu Th2-Helferzellen (Th1/Th2-

Balance) nach Zusatz der o.g. Substanzen verglichen zur Kontrollgruppe

ausgewertet.

Nach Prüfung der Normalverteilung mit Hilfe des parameterfreien Kolmogoroff-

Smirnov-Testes erfolgte die Evaluation der Änderung der Th1- und Th2-Zellen

nach Zugabe der o.g. Substrate im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe.

Hierfür wurde der zweiseitige t-Test nach Student für abhängige Proben verwandt.

Alle Daten wurden als Mittelwerte ± SEM (Standard Error of Mean) angegeben.

Die Auswertung erfolgte mit der Software IBM SPSS Statistics 18 für Mac OS/X

(SPSS Incorporated, an IBM Company, Chicago, Illinois USA). Die Unterschiede

wurden als signifikant betrachtet, wenn die Irrtumswahrscheinlichkeit p < 0,05 war.

Ergebnisse

30

3. Ergebnisse

Im Rahmen dieser Studie wurden Vollblutproben von 15 gesunden Männern im

Alter von 20 bis 35 Jahren auf die Veränderungen von IL-4- bzw. IFN-γ-

Konzentrationen nach in vitro-Stimulation untersucht. Als Kontrolle diente

stimuliertes Blut ohne Zusatz von GH oder Rezeptorantagonisten. In diesen

Proben lagen physiologische morgendliche Hormonkonzentrationen vor. IFN-γ

repräsentierte die Zytokinproduktion des Th1-Profils, IL-4 wurde als Marker für die

Th2-Zytokingruppe herangezogen. Die für diese Untersuchung relevanten IFN-γ-

und IL-4-positiven Zellen wurden, wie unter Material und Methoden beschrieben,

als prozentueller Anteil der CD3+CD8- T-Helferzellen ausgedrückt.

3.1 Plasma-Hormon-Konzentration innerhalb der Kontrollgruppe

Der Schwellenwert für eine mögliche Bestimmung der GH-Konzentration im Blut

liegt bei 0,9 ng/ml. Bei keinem der Probanden (n=15) konnte dieser Wert erreicht

werden.

Der Schwellenwert für die Cortisol-bestimmung (durch EIA) ist 0,1 µg/dl. Die

Cortisol-Konzentration im Blut der Probanden schwankte zwischen 10,3 und 29,6

µg/dl (20,19 ± 1,53) (Mittelwert ± SEM) (Abb. 5)

Ergebnisse

31

Abbildung 5: Schematische Darstellung der Cortisol - Plasmaspiegel der Probanden in µg/dl

3.2 Auswirkungen auf IFN-γ-produzierende CD4+ T-Helferzellen

Die gemessenen Werte (Absolutwerte) der Kontrollgruppe, der IFN-γ-

produzierenden CD4+ T-Helferzellen bewegten sich zwischen 11,4 und 35,4

(22,1 ± 1,8%). Nach Zugabe von humanem Wachstumshormon (growth hormone,

GH) konnte ein Anstieg der Zellen auf 23,1 ± 1,7% gemessen werden. Den

größten Einfluss auf die Produktion der IFN-γ-produzierenden CD4+ Zellen hatte

die Zugabe des Spironolactons, wodurch sich die Zellzahl auf 25,6 ± 2,1% erhöhte

(p=0,007) (Tab. 1; Abb. 6).

Kontrolle RU-486 GH + RU-486 GH Spironolacton

22,1 ± 1,8 24,5 ± 2,1 24,4 ± 2,0 23,1 ± 1,7 25,6 ± 2,1

p-Wert 0,002 * 0,0007 * 0,04 * 0,007 *

Tabelle 1: Absolutwerte (gemessene Werte) der IFN-γ-produzierenden CD4+ T-Helferzellen (in %) nach Zugabe von RU-486, GH+RU-486, GH und Spironolacton nach Inkubation mit Ionomycin und PMA (MW ± SEM), * = signifikant (p < 0,05)

Ergebnisse

32

Abbildung 6: Schematische Darstellung der Absolutwerte (Mittelwerte ± SEM) der IFN-γ- produzierenden CD4+ T-Helferzellen nach Zugabe von RU-486, GH+RU-486, GH und Spironolacton (Spiro) im Vergleich zur Kontrolle, * = signifikant (p < 0,05)

Nach Zugabe von GH (p=0,04), von RU-486 (p=0,002), Spironolacton (p=0,007)

und der Kombination aus GH und RU-486 (p=0,0007) war ein signifikanter Anstieg

der IFN-γ-produzierenden CD4+ T-Helferzellen zu verzeichnen (Abb. 6; Tab. 1).

Betrachtet man die relative Änderung der Zellzahlen im Verhältnis zur Kontrolle,

so war hier ebenfalls eine signifikante Zunahme der IFN-γ-produzierenden CD4+

T-Helferzellen nach Zusatz von GH, RU-486, Spironolacton und der Kombination

von GH und RU-486 erkennbar. Der größte Anstieg der IFN-γ-produzierenden

CD4+ T-Lymphozyten wurde auch hier nach Zugabe von Spironolacton gemessen

(Tab. 2; Abb. 7).

Ergebnisse

33

RU-486 GH + RU-486 GH Spironolacton

11,3 ± 2,9 11,0 ± 2,6 5,5 ± 2,9 12,9 ± 3,8

p = 0,002 * p = 0,0004 * p = 0,048 * p = 0,005 *

Tabelle 2: Relativ zur Kontrolle stattgefundene Änderung der IFN-γ-produzierenden CD4+ T-Helferzellen (in %) nach Zugabe von RU-486, GH+RU-486, GH und Spironolacton nach Inkubation mit Ionomycin und PMA (MW ± SEM) und die dazugehörigen p-Werte, * = signifikant (p < 0,05)

Abbildung 7: Schematische Darstellung der Auswirkungen (Mittelwerte ± SEM) von RU-486, GH+ RU-486, GH sowie Spironolacton (Spiro) auf IFN-γ-produziernde CD4+ T-Helferzellen verglichen mit der Kontrolle, * = signifikant

3.3 Auswirkungen auf IL-4-produzierende CD4+ T-Helferzellen

Die Ergebnisse der Kontrollgruppe bewegten sich zwischen 0,21 und 2,56 % (1,08

± 0,15 %). In Tab. 3 und Abb. 8 sind die gemessenen Absolutwerte und die

dazugehörigen p- Werte nach Zugabe der einzelnen Substanzen ersichtlich. Nach

Zugabe der jeweiligen Substanzen kam es in dieser Gruppe zu keiner

signifikanten Veränderung der Anzahl der IL-4-produzierenden CD4+ T-

Helferzellen.

Ergebnisse

34

Kontrolle RU-486 GH + RU-486 GH Spironolacton

1,08 ± 0,15 1,10 ± 0,16 0,99 ± 0,14 1,06 ± 0,17 1,05 ± 0,16

p - Wert 0,6 0,1 0,8 0,2

Tabelle 3: Absolutwerte der IL-4-produzierenden CD4+ T-Helferzellen (in %) nach Zugabe von RU-486, GH+RU-486, GH, und Spironolacton nach Inkubation mit Ionomycin und PMA (MW ± SEM) und die dazugehörigen p- Werte

Abbildung 8: Schematische Darstellung der Absolutwerte (Mittelwerte ± SEM) der IL-4-produzierenden CD4+ T-Helferzellen nach Zugabe von RU-486, GH+RU-486, GH und Spironolacton im Vergleich zur Kontrolle

Betrachtet man die relativ zur Kontrollgruppe stattgefundene Änderung der Anzahl

IL-4-produzierender CD4+ T-Helferzellen, sieht man ebenfalls keine signifikanten

Unterschiede (Tab. 4; Abb. 9).


4,8 ± 6,4 -6,9 ± 3,5 9,0 ± 13,0 -5,7 ± 4,9

p = 0,4 p = 0,06 p = 0,6 p = 0,2

Tabelle 4: Relativ zur Kontrollgruppe stattgefundene Änderung der IL-4 produzierenden CD4+ T-Helferzellen (in %) nach Zugabe von RU-486, GH+RU-486, GH und Spironolacton nach Inkubation mit Ionomycin und PMA (MW ± SEM) und die dazugehörigen p-Werte

Ergebnisse

35

Abbildung 9: Schematische Darstellung der Auswirkungen (Mittelwerte ± SEM) von RU-486, GH+ RU-486, GH sowie Spironolacton (Spiro) auf IL-4-produzierende CD4+ T-Helferzellen verglichen mit der Kontrolle

3.4 Auswirkungen auf das IFN-γ-/ IL-4-Gleichgewicht (Th1/Th2-Balance)

Da in vivo die Th1/Th2-Balance eine bessere Aussage über die Immunkompetenz

des Organismus zulässt, als die isolierten Absolutwerte der Zytokine, wurde im

Rahmen dieser Studie das Verhältnis der IFN-γ- zu IL-4-produzierenden CD4+ T-

zellen bestimmt. Betrachtet man die Relation der IFN-γ- zu IL-4-produzierenden

CD4+ Zellen (Th1/Th2-Balance), so hatten alle Substanzen einen Anstieg der IFN-

γ Produktion zur Folge, wobei durch Zugabe von GH+RU-486 und Spironolacton

signifikante Werte erreicht wurden (p=0,0008 bzw. p= 0,002) (Abb. 10; Tab. 5).


10,3 ± 5,9 21,6 ± 5,0 8,24 ± 8,7 23,1 ± 6,3

p = 0,1 p = 0,0008 * p = 0,3 p = 0,002 *

Tabelle 5: Relativ zur Kontrollgruppe erfolgte Änderung des Verhältnisses der IFN-γ- zu IL-4-produzierenden CD4+ T-Helferzellen (in %) nach Zugabe von RU-486, GH+RU-486, GH und Spironolacton nach Inkubation mit Ionomycin und PMA (MW ± SEM) und die dazugehörigen p-Werte, * = signifikant (p < 0,05)

Ergebnisse

36

Abbildung 10: Schematische Darstellung der relativen Änderung (Mittelwerte ± SEM) des Verhältnisses IFN-γ- zu IL-4-produzierenden CD4+ T-Helferzellen zur Kontrolle in % nach Zugabe von RU-486, GH+RU-486, GH und Spironolacton, * = signifikant (p < 0.05)

Diskussion

37

4. Diskussion

Die Modulation einer Immunantwort stellt einen wichtigen klinischen Aspekt bei

der Behandlung und Prävention unterschiedlichster Erkrankungen dar. Sie

unterliegt komplexen Steuermechanismen, welche weiterer Erforschung bedürfen.

Zytokine fungieren als wichtige Akteure immunologischer Reaktionen und sind

daher Gegenstand klinischer Untersuchungen. Besondere Aufmerksamkeit wird in

diesem Zusammenhang dem Th1/Th2-Verteilungsmuster, der so genannten

Th1/Th2-Balance geschenkt. Inzwischen ist bekannt, dass Schlaf über

weitreichende Einflüsse auf die Modulation des Zytokinprofils und somit auf die Art

der Immunantwort verfügt. Hier werden bestimmte Hormonkonstellationen

ausgenutzt, die sich begünstigend auf proinflammatorische Reaktionen auswirken

(Besedovsky et al., 2012; Born et al., 1997; Dimitrov et al., 2004b; Lange et al., 2010). In diesem Zusammenhang gehören Cortisol und GH zu den immunologisch

aktiven, schlafassoziierten Hormonen.

In der vorliegenden Arbeit sollte die Auswirkung physiologischer Konzentrationen

von Cortisol und GH auf das menschliche Immunsystem, insbesondere auf das

Gleichgewicht der Th1/Th2-Zytokine analysiert werden. Dabei sollten

Hormonzustände simuliert werden, die üblicherweise während der ersten

Nachthälfte (SWS - Phasen) in vivo existieren. Mittels Durchflusszytometers

wurden die Vollblutproben von gesunden männlichen Probanden auf Alterrationen

bezüglich der Zytokinproduktion CD4+ T-Zellen untersucht. Als repräsentative

Parameter der Th1- und Th2-Zellreihen dienten die Zytokine IFN-γ und IL-4. Die

Wirkung des GH wurde direkt durch dessen Zugabe und die des Cortisols indirekt

durch Blockade der Glukokortikoid- und Mineralokortikoidrezeptoren gemessen.

IFN-γ wurde als repräsentatives Zytokin für das Th1-Profil gewählt. Es unterstützt

als Hauptzytokin der proinflammatorischen, Th1-vermittelten Immunantwort die

Proliferation von T-Helferzellen der unspezifischen zellulären Immunabwehr

(Fearon und Locksley 1996; Gajewski und Fitch 1988; Gajewski et al., 1989; Maggi et al., 1992; Mosmann und Coffman 1989; Sad und Mosmann 1994). IFN-γ

wurde in früheren Untersuchungen mehrfach als reproduzierbarer Parameter zur

Evaluation der Th1-Funktionen herangezogen (Kidd 2003; Petrovsky und Harrison

Diskussion

38

1998; Skjolaas und Minton 2002; Szczypka et al., 2012). Analog dazu liegen

Studien vor, die IL-4 als Leitzytokin für die Beurteilung einer Th2-Immunantwort

postulieren (Agarwal und Marshall Jr. 2001; Holland et al., 2008; Romagnani 1991; Szczypka et al., 2012) und zudem bestätigen, dass dieses Zytokin für eine

Th2-vermittelte Immunantwort unerlässlich ist (Chen et al., 2004; Liew 2002; Paul und Seder 1994; Swain et al., 1990). Diese Erkenntnisse führten zur

entsprechenden Zytokinauswahl im Rahmen dieser Studie. Aber auch andere

Zytokine können als repräsentative Parameter für eine Th1- oder Th2-gerichtete

Immunantwort herangezogen werden. Dazu gehören unter anderem IL-2, IL-4, IL-

7, IL-10, TNF-α und IL-12 (Benedict et al., 2007; Besedovsky et al., 2012; Bollinger et al., 2009; Dimitrov et al., 2006; Dimitrov et al., 2007; Lange et al., 2010; Lange et al., 2006a; Lange et al., 2006b).

In der vorliegenden Arbeit wurden ausschließlich gesunde, allergiefreie, männliche

Nichtraucher einbezogen. Entsprechend den Protokollvorgaben wurden mittels

eines Fragebogens (s. Anhang, Kapitel 7) und nach Bestimmung entsprechender

Laborwerte, akute, chronische, psychische und medikamentös therapierte

Erkrankungen ausgeschlossen. Probanden mit labordiagnostisch nachgewiesenen

Infektionen (CRP über 6 mg/l und / oder erhöhter Leukozytenzahl > 9000/µl)

wurden aus der Studie ausgeschlossen. Jede Infektion stellt eine relevante

Stressbelastung für den Organismus dar (Dhabhar 2009; Dobbs et al., 1996; Kidd 2003) und führt unter anderem zu erhöhten Cortisolspiegeln und somit zu

Veränderungen der Zytokinaktivität (Black 1994; Dhabhar 2009; Lucey et al., 1996; Pinto et al., 2006; Tosi 2005). Schlafstörungen oder regelmäßiger Konsum

von Drogen und Alkohol haben gleichermaßen Auswirkungen auf die

immunologische Situation des Probanden. Um verfälschten Ergebnissen entgegen

zu wirken, wurden betroffene Probanden von der Teilnahme ausgeschlossen

(Besedovsky et al., 2012; Born et al., 1997; Dimitrov et al., 2004b; Jerrells 1991; Lange et al., 2010; Redwine et al., 2003). Bei psychischen Leiden sind ebenso

Alterationen in der Th1/Th2-Balance beschrieben. So wurden bei Untersuchungen

schizophrener Patienten diskrepante Veränderungen der IFN-γ-Spiegel

beobachtet (Schwarz et al., 2001). Auch bei depressiven Patienten fielen

supprimierte IFN-γ-Spiegel bei parallel gesteigerter IL-4-Synthese auf (Myint et al.,

Diskussion

39

2005; Song et al., 2009), so dass auch diese Patientengruppe aus der Studie

ausgeschlossen wurde. Durch eine Begrenzung des Alters der Teilnehmer auf

maximal 35 Jahre wurden altersbedingte Schwankungen der Immunsituation

berücksichtigt. So wurde zum einen eine Vergleichbarkeit der Probanden

untereinander sowie zu Ergebnissen anderer Studien ermöglicht. Diverse Autoren

beschrieben eine Dysbalance des Immunprofils zugunsten von Th2 mit

zunehmendem Alter (Castle et al., 1997; Rink et al., 1998; Schwab et al., 1992;

Van Cauter et al., 2000). Aufgrund erhöhter hormoneller Schwankungen wurden

Frauen aus der Studie ausgeschlossen (Kalu et al., 2008; Kruse et al., 2000; Piccinni und Romagnani 1996; Piccinni et al., 2000). Zudem stellten

Autoimmunerkrankungen, z. B. der Schilddrüse, ein Ausschlusskriterium dar.

Pathologisch veränderte Hormonwerte, z. B. TSH beeinflussen nachweislich die

Immunkompetenz (Kelley et al., 2007; Kidd 2003; Klecha et al., 2008) und könnten

dadurch zu nicht repräsentativen Ergebnissen führen. Die oben aufgeführten

Kriterien bekräftigen die Wahl der Probandengruppe, um möglichst unverfälschte

Voraussetzungen für diese Studie zu schaffen.

Die im Blut der Probanden gemessenen Cortisolspiegel lagen innerhalb der

üblichen Referenzbereiche. Die interindividuellen Schwankungen könnten durch

geringe stressbedingte Konzentrationsänderungen bedingt sein. Beispielsweise

könnte eine Trypanophobie zu einer vermehrten Sekretion des Stresshormons

Cortisol führen (Kamezaki et al., 2012; Petrovsky und Harrison 1998; Schubert und Schussler 2009). Die GH-Konzentration in den morgendlichen Blutproben lag,

wie erwartet, unterhalb der Detektionsgrenze (Dimitrov et al., 2004b; Lange et al., 2010; Lange et al., 2006a)(Kapitel 3.1).

Ein Teil der immunologischen Forschung beschäftigte sich mit Zytokinen und ihren

Auswirkungen auf das Immunsystem. Es gibt mehrere in Studien erprobte

Methoden zur Untersuchung und Bestimmung von Zytokinen. Hierzu zählen unter

anderem der Enzyme linked immuno-sorbant-assay (ELISA), Enzyme linked

immuno-spot-assay (Elispot), Radio immuno-assay (RIA), Reverse-transcription-

polymerase chain reaction (RT-PCR), die Westernblot-Technik und Verfahren zur

Detektion einer messenger (m)RNA Expression (Arora 2002; Ford 2010; Pala et

Diskussion

40

al., 2000; Skapenko und Schulze-Koops 2007).

Im vorliegenden Studiendesign wurde die Untersuchung von stimulierten und

aktivierten Vollblutproben am Durchflusszytometer gewählt. Der Nachweis reaktiv

gebildeter Zytokine nach Antigenstimulation ist jedoch auch durch die Verwendung

mononukleärer Zellen des peripheren Blutes (Peripheral Blood Mononuclear Cell,

PBMC) möglich. In beiden Varianten werden die Zellen stimuliert, fixiert,

permeabilisiert und die dann exprimierten Zytokine mittels monoklonaler

fluoreszierender Antikörper markiert und anschließend am Durchflusszytometer

dargestellt. Studien belegen, dass beide Verfahren vergleichbare

Analysemethoden zur Zytokinmessung per Durchflusszytometer darstellen (De Groote et al., 1992; Jason und Larned 1997; McNerlan et al., 2002; Yaqoob et al., 1999), auch wenn in Untersuchungen von Waldrop und Mitarbeitern die Frequenz

der Zytokinexpression bei Vollblutstimulationen im Vergleich zu PBMC höher war

(Waldrop et al. 1997).

In der vorliegenden Arbeit wurde die Vollblutanalyse verwandt, um ungewollte

Zellaktivierungen, die eventuell durch konventionelle Separationsvorgänge

verursacht werden könnten, zu umgehen. Eine Zell-Separation könnte eine

Abtrennung der T-Zellen von ihrem umgebenden hormonellen Milieu bedeuten,

welches jedoch gerade im Rahmen dieser Untersuchung von Interesse war

(Schultz et al., 2002). Zudem wird durch Nutzung von Vollblutproben eine

Reproduzierbarkeit sowie die Vergleichbarkeit mit bereits vorausgegangenen

Studien unserer und anderer Arbeitsgruppen zu dieser Thematik ermöglicht

(Dimitrov et al., 2009; Duramad et al., 2004; Lange et al., 2006a; Matalka und Ali 2005; Visser et al., 1998).

Die im Rahmen dieser Arbeit verwandte Zytokinbestimmung mittels

Durchflusszytometer ist eine anerkannte Methode zur Erfassung der Th1/Th2-

Immunaktivität und ermöglicht detaillierte Aussagen über das Zytokinmuster

(Arora 2002; Brown und Wittwer 2000; Longobardi-Givani 1992; Pala et al., 2000).

Die FACS setzt jedoch eine Stimulation der Zellen vor der Messung voraus,

wodurch eine spontane Zytokinmessung nicht möglich ist. Ein weiterer Nachteil

dieser Methode ist, dass zur intrazellulären Akkumulation der Zytokine Brefeldin A

eingesetzt wird, welches zugleich verhindert, dass die stimulierten Zellen

Rezeptoren exprimieren oder autokrine bzw. parakrine Mediatoren freisetzen.

Diskussion

41

Andererseits erlaubt sie eine individuelle Analyse großer Zellpopulationen auf

Einzelzellbasis (Jung et al., 1993; Pala et al., 2000) und mittels FACS-Analyse

stellt sie die einzige Methode zur Identifizierung der gewünschten Zellreihen in

heterogenen Suspensionen wie Vollblut dar (Kwak et al., 2000; Martin et al., 1992). Zudem ist die Durchflusszytometrie objektivierbar, d. h. vom Untersucher

unabhängig und läßt die Vergleichbarkeit der Daten verschiedener Arbeitsgruppen

zu (Brown und Wittwer 2000; Sack et al., 2000). Außerdem siedelt sich die

Erfassungsgrenze für Zytokine unterhalb der für Serum-Testverfahren an (Lange et al., 2006a). Aus den oben aufgeführten Gründen wurde sich in dieser Studie für

die FACS-Analyse als Mittel der Wahl zur Zytokinbestimmung und deren

Quantifizierung entschieden.

Die Interpretation durchflusszytometrisch ermittelter Daten ist von diversen

Einflussfaktoren, wie Lagerung und Transport der Proben sowie Tageszeit und

Körperlage zum Zeitpunkt der Blutabnahme, abhängig. Lange Transport- und /

oder Lagerungszeiten können zu verfälschten Ergebnissen, gerade in der

Bestimmung von Lymphozytenpopulationen, führen (Schultz et al., 2002; Tayebi et al., 1999). Für die korpuskulären Bestandteile im Vollblut ergeben sich niedrigere

Werte in liegender Position der Probanden zum Zeitpunkt der Abnahme (Sack et al., 2000). Zudem sind für die in der vorliegenden Studie untersuchten Substanzen

zirkadiane Rhythmen charakteristisch (Besedovsky et al., 2012; Born et al., 1997; Dimitrov et al., 2009; Lange et al., 2010; Levi et al., 1985; Levi et al., 1988). Um

diesen Schwankungen entgegen zu wirken und vergleichbare Ergebnisse zu

erzielen, wurde das Blut unter standardisierten Bedingungen entnommen und

unverzüglich verarbeitet.

Für die Stimulation der Zellen zur Zytokinproduktion wurden Ionomycin und PMA

verwendet. Ionomycin und PMA sind unspezifische, unphysiologische Stimulantien

des T-Zellrezeptor-Komplexes. Sie beeinflussen die intrazelluläre Bildung von

Zytokinen wie IFN, IL-2 und IL-4 (Andersson et al., 1990; Rostaing et al., 1999; Yssel et al., 1992). In vivo hingegen benötigen T-Zellen ein spezifisches Antigen,

welches nach Präsentation durch die APZ an den entsprechenden T-Zell-Rezeptor

bindet und so zur Zytokinfreisetzung führt. Studien belegen aber, dass die

Ergebnisse einer Zytokinstimulation in vivo durchaus mit denen einer Stimulation

Diskussion

42

in vitro vergleichbar sind, auch wenn die letztgenannte APZ unabhängig durch

unphysiologische Stimuli wie PMA / Ionomycin erfolgt (Jung et al., 1993;

Schuerwegh et al., 2003). Somit stellt die in vitro-Stimulation von T-Zellen eine

anerkannte, reproduzierbare und gut erforschte Methode dar (Lange et al., 2006a; Picker et al., 1995; Prussin 1997; Tayebi et al., 1999).

Die PMA-Konzentration wurde mit 8 ng/ml relativ gering gehalten. Diese

Dosierung entspricht jedoch der üblichen Standarddosierung zur Induktion einer

Zytokinaktivität (McNerlan et al., 2002; Picker et al., 1995). Eine weitere

Steigerung der PMA-Konzentration (25 ng/ml) führte in einer Pilotstudie und in

einer parallelen Versuchsreihe unter analogen Bedingungen zu keiner

signifikanten Änderung der Th1/Th2-Balance, was die Wahl der PMA-Dosierung

bekräftigte (Dimitrov et al., 2004a; Lange et al., 2006a).

Für die Blockade des Sekretionsapparates der Zellen und Freisetzung von

Mediatoren wurde Brefeldin A (BFA) verwandt. Es führt zur intrazellulären

Akkumulation der Zytokine und macht ihre intrazelluläre Messung mittels

Durchflusszytometer erst möglich. Im Gegensatz zu Monensin, welches in einigen

Studien zum gleichen Zweck herangezogen wurde, blockiert BFA den

Proteintransport zwischen endoplasmatischem Retikulum und dem Golgi-Apparat.

Nachweislich ist BFA der potentere Inhibitor der Exozytose bei geringerer Toxizität

(Nylander und Kalies 1999; Schuerwegh et al., 2001). In der Literatur werden

BFA-Konzentrationen von 0,1 bis 10 µg/ml beschrieben, wobei bereits bei einer

Dosierung von 0,1 µg/ml eine suffiziente Inhibition des Golgiapparates

nachgewiesen werden konnte (Lippincott-Schwartz et al., 1991). Um eine

maximale Inhibition und eine Vergleichbarkeit mit der Literatur sowie

vorangegangener und nachfolgender Studien unserer Arbeitsgruppe zu erreichen,

wurde in diesem Versuch mit einer Endkonzentration von 10 µg/ml gearbeitet

(Dimitrov et al., 2004a; Dimitrov et al., 2004b; Waldrop et al., 1997).

In der vorliegenden Arbeit wurde die Auswirkung von Cortisol und GH auf die

Produktion von CD4+ T-Zellen mit besonderem Augenmerk auf die Th1/Th2-

Zytokinbalance untersucht. Cortisol und andere Glukokortikoide sind für ihre

immunsuppressiven und antiinflammatorischen Wirkungen bekannt und werden

als Standardtherapeutika zur Behandlung immun- und entzündungsbedingter

Diskussion

43

Erkrankungen eingesetzt (Belvisi und Hele 2003; Hench et al., 1950; Kendall 1950; Miner et al., 2005; Schreiber 2011). Heute mehren sich die Belege dafür,

dass systemisch wirkende GK, darunter Cortisol, eher immunmodulierend agieren.

Sie sollen selektiv die Th1-Antwort hemmen und eine humorale Immunreaktion

fördern, wobei unter anderem vermutlich deren Dosierung eine erhebliche Rolle

spielt. Während pharmakologisch eingesetzte, unphysiologische Konzentrationen

die Immunreaktionen unterdrücken, sollen physiologische Dosen

immunmodulierend wirken (Ashwell et al., 2000; Daynes und Araneo 1989; Elenkov 2004; Elenkov und Chrousos 1999; Franchimont et al., 2000; Sternberg 2001).

Im Rahmen dieser Studie wurde die Wirkung des Cortisols auf die

Zytokinproduktion und die Th1/Th2-Balance untersucht. Durch Blockade der GR

durch RU-486 und MR durch Spironolacton wurden die Effekte des Cortisols

unterbunden, wodurch ein Cortisol-Nadir, wie er während des Tiefschlafes

besteht, simuliert wurde. Es ist bekannt, dass Cortisol seine Wirkung über

Stimulation beider Rezeptoren entfaltet (De Kloet et al., 1998; Lange et al., 2006a; White et al., 1997). Die gewählte Dosis von 8,3 ηM RU-486 und 8,3 ηM

Spironolacton zeigten in einer Pilotstudie eine komplette Blockade beider

Rezeptoren.

Wie man es aus den Ergebnissen entnehmen kann, fand durch die Blockade der

MR durch Spironolacton eine signifikante Verschiebung der Th1/Th2-Balance in

Richtung Th1 statt (Tab. 5; Abb. 10), was auf einen signifikanten Anstieg des Th1-

Zytokins IFN-γ durch IFN-γ-produzierende CD4+ T-Zellen zurückzuführen ist (Abb.

6, 7; Tab. 1, 2). Es erfolgte keine signifikante Änderung der IL-4-produzierenden

CD4+ Th-Zellen durch die Blockade des MR (Tab. 3, 4; Abb. 8, 9). Im Gegensatz

dazu wurde durch die Blockade des GR durch RU-486 weder die Th1/Th2-

Balance (Tab. 5; Abb. 10), noch die Anzahl IL-4-produzierender CD4+ Zellen

signifikant verändert (Tab. 3, 4; Abb. 8, 9). Es kam jedoch zu einer signifikanten

Zunahme der IFN-γ-produzierenden CD4+ Zellen (Abb. 6, 7; Tab.1, 2).

Die Kombination von Wachstumshormon und dem Cortisolrezeptor-Antagonisten

RU-486 führte zu einem signifikanten Shift in Richtung des Th1-Zytokinmusters

(Tab. 5; Abb. 10), der auch in diesem Fall nicht auf einer Veränderung der IL-4-

produzierenden Th-Zellen (Tab. 3, 4; Abb. 8, 9), sondern durch den signifikanten

Diskussion

44

Anstieg der IFN-γ-produzierenden CD4+ Zellen bedingt ist (Abb. 6, 7; Tab.1, 2).

Zusammenfassend ist festzustellen, dass die Dysbalance zugunsten der Th1-

Zytokine unter vollständiger Inhibition der Cortisolwirkung auf einer signifikanten

Zunahme der IFN-γ-produzierenden CD4+ Zellen beruht. Diese Ergebnisse

werden von vielen in vitro-Studien indirekt bestätigt, in denen Cortisol einen

Umschwung vom Th1- zum Th2-Profil vornehmlich durch Inhibition der Th1-

Zytokine bewirkt (Agarwal und Marshall Jr. 2001; Franchimont et al., 2000; Petrovsky und Harrison 1997; Petrovsky und Harrison 1998; Visser et al., 1998).

Eine Zunahme des Th1-Profils unter abfallenden Cortisolwerten stellt eine

Voraussetzung für inflammatorische Reaktionen dar, die im Rahmen einer

suffizienten Abwehrreaktion notwendig sind. Diese Konstellation ist

charakteristisch für die SWS-Phasen der ersten Nachthälfte und unterstreicht die

Relevanz des Schlafes im Rahmen der Immunabwehr (Besedovsky et al., 2012; Born et al., 1997; Lange et al., 2010).

Bei der Durchsicht der Literatur findet man kontroverse Aussagen über den

Einfluss von Glukokortikoiden auf die Th2-Zytokine. Die Produktion dieser

Zytokinreihe soll nach GK-Zusatz gesenkt, gesteigert oder unverändert bleiben.

Nach Cortisoladministration fanden Lange und Mitarbeiter eine Reduktion der IL-4-

produzierenden CD4+ Zellen um 30% (Lange et al., 2006a), wobei andere

Arbeitsgruppen eine dosisabhängige Reduktion von bis zu 90% beschrieben

(Byron et al., 1992; Wu et al., 1991). Nach erneuter Stimulation einiger, bereits mit

Glukokortikoiden anbehandelter Zellen fand eine signifikante Zunahme der IL-4-

Synthese statt (Agarwal und Marshall Jr. 1998; Agarwal und Marshall Jr. 2001; Brinkmann und Kristofic 1995; Daynes und Araneo 1989; Elenkov 2004; Ramirez 1998; Ramirez et al., 1996). Dies könnte entweder durch einen indirekten Effekt

der GK, eine lange andauernde Stimulation oder die Anwesenheit von

akzessorischen Zellen bedingt sein. Beispielsweise hemmen GK die Produktion

von IL-12 durch Herabregulierung seiner Rezeptoren. IL-12, welches unter

anderem von DC gebildet wird, induziert als potenter Inhibitor der IL-4-Zytokine

und durch Steigerung der Synthese IFN-γ-produzierender CD4+ T-Zellen eine

Th1-Dominanz. Eine Senkung des IL-12-Spiegels durch Cortisol führt demnach zu

Diskussion

45

einem Anstieg der IL-4- und Reduktion der IFN-γ-produzierenden CD4+ Zellen,

was in einer Verschiebung der Th1/Th2-Balance in Richtung Th2 resultiert

(Besedovsky et al., 2012; Blotta et al., 1997; Dimitrov et al., 2007; Franchimont et al., 2000; Langenkamp et al., 2000; Moser und Murphy 2000).

In der vorliegenden Studie konnte kein signifikanter Einfluss von GK auf IL-4

gezeigt werden, was durch die hier verwandten körpereigenen, physiologischen

Konzentrationen für Cortisol bedingt sein könnte. Ein Großteil der Studien, in

denen eine Änderung der IL-4-Produktion beschrieben wurde, benutzte zur

Evaluierung der GK-Wirkung das potente, synthetische Glukokortikoid

Dexamethason (DEX) in eher unphysiologischen Konzentrationen (Agarwal und Marshall Jr. 2001; Daynes und Araneo 1989; Franchimont et al., 2000; Franchimont et al., 1998; Ramirez 1998; Ramirez et al., 1996; Skjolaas et al., 2002; Visser et al., 1998). Unter Verwendung synthetischer GK in

unphysiologischen Konzentrationen wurde überwiegend eine generelle

Immunsuppression und Inhibition der Zytokinproduktion, sowohl der Th1- als auch

der Th2-Zytokinreihe beobachtet (Braun et al., 1997; Kunicka et al., 1993; Snijdewint et al., 1995).

Ein direkter Vergleich dieser Ergebnisse mit denen der vorliegenden Arbeit ist

aufgrund der unterschiedlichen Potenz und Pharmakokinetik der verwandten GK

nicht möglich. Beispielsweise liegt ein Großteil der körpereigenen GK in

gebundener Form vor und nur ein Bruchteil des frei im Blut zirkulierenden Anteils

ist biologisch aktiv (Tyrrell et al., 1986). Synthetische Steroide dagegen liegen

vermehrt in ungebundener Form vor, was sich in ihrer höheren Wirkpotenz

widerspiegelt (Fleshner et al., 2001; Pugeat et al., 1981; Skjolaas und Minton 2002; Spencer et al., 1990). Dies ist besonders bei in vivo-Studien zu bedenken.

Ferner müssen hier bei der Interpretation und Vergleich der Ergebnisse

synergistische oder antagonistische Effekte akzessorischer Zellen auf die

Zytokinproduktion beachtet werden, die unter in vitro-Bedingungen

ausgeschlossen werden können.

Bei der Auswertung der Ergebnisse muss man sich mit der Wirkungsweise der

Kortikosteroide und deren Rezeptoren auseinandersetzen. Kortikosteroide

Diskussion

46

entfalten ihre Wirkungen über 2 Rezeptortypen, den Glukokortikoid- und

Mineralokortikoid-Rezeptoren (Funder 1996; Funder 1997). Man ging davon aus,

dass MR von Aldosteron, einem Mineralokortikoid aktiviert wird, worüber es seine

Funktionen auf den Salz- und Wasserhaushalt des Körpers vermittelt. Analog

dazu sollte das Glukokortikoid Cortisol seine Wirkung über GR entfalten (Frey et al., 2004). Heute ist bekannt, dass Cortisol seine Effekte über beide Rezeptoren

vermittelt und sogar mit höherer Affinität an MR binden kann, als an GR (Funder 1997; Funder 2005; Mihailidou et al., 2009; Rupprecht et al., 1993). Abhängig von

der An- und Abwesenheit des Enzyms 11β-Hydroxysteroiddehydrogenase (11β-

HSD) im betroffenen Gewebe bindet Cortisol vermehrt an MR als an GR (De Kloet et al., 1998; Edwards et al., 1996; White et al., 1997). Beide Rezeptoren sollen

sogar als funktionelle Antagonisten fungieren (Funder 1993; Tanaka et al., 1997).

Bei der Untersuchung der Th1/Th2-Balance und deren Beeinflussung durch GK

wurde überwiegend auf DEX zurückgegriffen, welches selektiv an GR bindet. Bei

der Interpretation einiger Studien, bei denen die Wirkung des Cortisols auf das

Immunsystem eruiert wurde, ging man ebenfalls von seiner höheren Affinität zu

GR aus (Dobbs et al., 1996). Die in dieser Studie durch Spironolacton blockierten

MR bewirken einen signifikanten Umschwung des Gleichgewichts zugunsten der

Th1-Zytokine. Der spezifische GR-Antagonist RU-486 induzierte einen ähnlichen

Effekt, erreichte jedoch nur in Kombination mit GH-Signifikanz. Diese

Beobachtungen könnten wie folgt interpretiert werden:

1. GR und MR arbeiten bezüglich der cortisolinduzierten Suppression

proinflammatorischer Zytokine synergistisch, indem die Blockade beider

Rezeptoren zu einer Steigerung des proinflammatorischen Zytokins IFN-γ und

dadurch zu einer Verschiebung der Th1/Th2-Balance zugunsten von Th1 führte.

Dieses Resultat widerspricht der Annahme, dass MR und GR als funktionelle

Antagonisten fungieren (Funder 1993; Tanaka et al., 1997). Im Rahmen einer

Parallelstudie wurde die Synergie beider Steroidrezeptoren durch

Synthesesteigerung von TNF-α und IL-2 in CD4+ und CD8+ T-Zellen bei Blockade

von GR und MR erneut bestätigt (Dimitrov et al., 2004a).

2. Cortisol entfaltet den größeren Teil seiner immunologischen Wirkung nicht, wie

Diskussion

47

erwartet, über die GR, sondern über die MR. Auch Sauer und Mitarbeiter konnten

durch MR-Blockade mittels Spironolacton in humanen Monozyten eine Umkehr

der cortisolinduzierten Inhibition der IL-1-Sekretion, einem proinflammatorischen

Zytokin, belegen (Sauer et al., 1996). Analog dazu konnten Vedder und Mitarbeiter

einen Anstieg der TNF-α-Sekretion in menschlichen PBMC nach in vitro-Zusatz

von Spironolacton feststellen (Vedder et al., 2003), was für die

Wirkungsvermittlung der GK über MR spricht. In der oben genannten

Parallelstudie konnte dieser TNF-α Anstieg über MR ebenfalls bestätigt werden

(Dimitrov et al., 2004a).

Zu diskutieren wäre an dieser Stelle außerdem auch der Einfluss des

Mineralokortikoids Aldosteron auf das Immunsystem, denn dieses Hormon ist der

eigentliche Ligand der MR. Aldosteron hat ebenfalls immunologisch modulierende

Eigenschaften. Sie sollen unter anderem die Anzahl der zirkulierenden

Lymphozyten, der NK und der Monozyten senken (Miller et al., 1994). Der

periphere Plasmaspiegel von Cortisol liegt annähernd 1.000-fach über dem des

Aldosterons (Charloux et al., 2001). Ferner liegt die Plasmaverweildauer des

Aldosterons deutlich unter dem des Cortisols, da es kaum gebunden und bereits

nach einer Leberpassage vollständig eliminiert wird. Die Plasmahalbwertszeit

beträgt ca. 30 Minuten (Hubl et al., 1975).

Des Weiteren findet man im Rahmen eines Hyperaldosteronismus einen Anstieg

proinflammatorischer Zytokine wie z. B. TNF-α (Ahokas et al., 2003; Anker und Rauchhaus 1999; Carvajal et al., 2009). Trotz Blockade der MR durch

Spironolacton im Rahmen der vorliegenden Arbeit kam es dennoch zu einem

signifikanten Anstieg der proinflammatorischen Zytokine.

Diese Feststellung und die oben aufgeführten Eigenschaften des Aldosterons

sprechen gegen dieses Hormon als Auslöser der über MR-vermittelten Änderung

der Zytokinbalance. Diese Argumente lassen die Schlussfolgerung zu, dass

Cortisol seine Wirkung auf die Th1/Th2-Zytokinsynthese über MR ausübt.

Ein weiteres Hormon, welches an der Immunmodulation beteiligt ist, ist GH. Ihm

wird eine supportive Wirkung auf das Immunsystem zugeschrieben. Dieser Effekt

wird entweder direkt von GH oder durch Insulin-like growth factor-1 (IGF1), dessen

Diskussion

48

Bildung von GH stimuliert wird, ausgelöst (Auernhammer und Strasburger 1995; Clark 1997; Koo et al., 2001).

Im Rahmen dieser Studie wurde der Einfluss von GH auf die Zytokinproduktion

und die Th1/Th2-Balance untersucht. GH unterliegt einer starken,

schlafgebundenen zirkadianen Rhythmik, mit einer maximalen Ausschüttung direkt

nach dem Einschlafen und einem Nadir in der zweiten Nachthälfte und

Morgenstunden (Born et al., 1997; Lange et al., 2010; Mallmann et al., 1989; Van Cauter und Copinschi 2000). Dies wurde durch die Messung der

Hormonkonzentration im Rahmen dieser Studie bestätigt. Der GH-Spiegel im

untersuchten Blut lag, wie erwartet, unterhalb der Bestimmungsgrenze (0,9 ng/ml).

Um den Effekt einer GH Auswirkung auf das Immunsystem zu untersuchen, wurde

den morgendlichen Blutproben GH in einer Konzentration von 20 ng/ml zugesetzt.

Durch die Zufuhr des GH kam es zu einem signifikanten Anstieg des Th1-Zytokins

IFN-γ. Eine signifikante Auswirkung auf die Zytokine der Th2-Reihe konnte jedoch

nicht beobachtet werden. Ebenfalls konnte keine signifikante Änderung der

Th1/Th2-Balance durch GH gemessen werden. Lediglich die Kombination von GH

und RU-486 führte zu deren Verschiebung zugunsten von Th1 (Kapitel 3.1, 3.2,

3.3).

Eine durch GH bedingte Steigerung der Th1-Zytokinproduktion wird durch die

Ergebnisse mehrerer Arbeitsgruppen bestätigt (Lange et al., 2006a; Malarkey et al., 2002; Mellado et al., 1998; Mustafa et al., 1997; Sommese et al., 1996; Takagi et al., 1998).

Eine signifikante Änderung der IL-4-produzierenden CD4+ Zellen konnte in dieser

Studie nach GH-Applikation nicht festgestellt werden. Diese Resultate wurden

ebenfalls durch mehrere Studien belegt (Galdiero et al., 1995; Galdiero et al., 1997).

Im Widerspruch dazu lassen sich jedoch auch Berichte zu GH-bedingten

signifikanten Änderungen der Th2-Zytokine, unter anderem von IL-4 finden (Liu et al., 2008). Die Arbeitsgruppe um Mellado beschrieb einen Anstieg der IFN-γ- aber

einen Rückgang der IL-4-Produktion nach Zugabe von GH (Mellado et al., 1998). Takagi et al. haben einen signifikanten Rückgang von IL-4 durch GH an Mäusen,

Diskussion

49

die einem Verbrennungstrauma ausgesetzt waren, festgestellt. Dieses führte zu

einem Anstieg der Th2- und einem Abfall der Th1-Zytokinsynthese, repräsentiert

durch IL-4 bzw. IFN-γ. Nach Zugabe von rekombinantem GH gelang eine Umkehr

dieses Zytokinmusters erneut zugunsten von Th1, indem IFN-γ wieder anstieg und

IL-4 sank (Takagi et al., 1998). Im Gegensatz zur vorliegenden Arbeit waren diese

jedoch in vivo-Studien.

Schlussfolgernd ist zu sagen, dass GH eine Th1-vermittelte Immunantwort

induziert, welche in vivo, jedoch nicht in vitro, zu einer indirekten Suppression der

Th2-Zytokine führen kann. Eine generelle Suppression der Th2-Immunantwort

durch eine verstärkte IFN-γ-Aktivität wurde bereits mehrfach beschrieben

(Gajewski und Fitch 1988; Gajewski et al., 1989).

Ein weiterer Erklärungsversuch dieser Resultate könnte in der Verteilung der GH-

Rezeptoren liegen. Die Expression der Rezeptoren für das Wachstumshormon auf

T-Zellen ist gering, wobei fast alle (80-90%) B-Zellen und Makrophagen GH-

Rezeptor-positiv sind (Bresson et al., 1999; Dardenne et al., 1998; Postel-Vinay et al., 1997). Dies lässt vermuten, dass der direkte Effekt von GH auf die T-Zellen

geringer ausfallen muss, als seine indirekte Wirkung auf die T-Zellen, welche über

die APZ vermittelt wird. Derartige indirekte Effekte des GH können in der

vorliegenden Arbeit durch die APZ unabhängige Stimulation der Zellen mit PMA

maskiert werden (Lange et al., 2006a).

Im Gegensatz zu einem Abfall der Th2-Zytokine konnte Borrione einen

signifikanten Anstieg selbiger durch GH feststellen. Da Borrione jedoch die

Auswirkung unphysiologischer GH-Konzentrationen ab 200 ng/ml bis 600 ng/ml

untersucht hatte, können diese Ergebnisse mit denen der vorliegenden Arbeit, in

der physiologische Konzentrationen verwandt wurden, nicht verglichen werden

(Borrione et al., 2012). Ein Anstieg der Th2-Zytokine durch GH wurde auch durch

die Arbeitsgruppe um Ramos beobachtet. Hier wurde gezeigt, dass

- GH die IL-10-Sekretion der CD4+ T-Zellen in gesunden Probanden stimuliert

und

- IL-10 die Sekretion der Th1-Zytokine verhindert, wodurch die Th1/Th2-Balance

zugunsten von Th2 verschoben wurde (Ramos et al., 2011).

Diskussion

50

Ein Vergleich ist ebenfalls nicht möglich, da im Rahmen der vorliegenden Arbeit

die IL-10-Aktivität nicht untersucht wurde. Obwohl auch IL-10 zur Beantwortung

der Fragestellung dieser Arbeit hätte dienen können, wurde sich aufgrund der

Vergleichbarkeit mit vorangegangenen Studien unserer Arbeitsgruppe für IL-4

entschieden (Dimitrov et al., 2004a; Dimitrov et al., 2004b; Lange et al., 2006a).

Zudem wurde eine mögliche immunmodulierende Wirkung von IGF-1, welches

durch Stimulation von GH unter anderem von der Leber sezerniert wird, in dieser

Studie nicht untersucht. In vivo hat dieser Wachstumsfaktor ebenfalls

weitreichende Einflüsse auf die Immunkompetenz (Bernabei et al., 2003; Hattori 2009; Tu et al., 1999).

Bei der Betrachtung der Auswirkungen der hier untersuchten Hormone auf das

Immunsystem sollte auch die Rolle ihrer Releasing-Hormone diskutiert werden.

Wie bereits erwähnt, wird die Freisetzung des GH durch GHRH reguliert (Abb. 1).

GHRH selbst hat ebenfalls immunmodulierende Eigenschaften (Siejka et al., 2005a; Siejka et al., 2005b; Stepien et al., 2010; Valtorta et al., 1991), die zu

Verschiebung der Th1/Th2-Balance führen können. Siejka und Mitarbeiter zeigten

auf, dass GHRH unter in vitro-Bedingungen zu einem signifikanten Anstieg der

IFN-γ-Sekretion in PBMC führt (Siejka et al., 2004).

Die Freisetzung von Cortisol wird unter anderem über CRH reguliert. Auch dieses

Hormon beeinflusst inflammatorische Reaktionen. Im Rahmen seiner supportiven

Eigenschaften unterstützt es die Lymphozytenproliferation (Gay et al., 2008; Karalis et al., 1997; McGillis et al., 1989; Singh 1989). Über Aktivierung der HHN-

Achse durch die Zytokine TNF-α, IL-1 und IL-6 wirkt CRH über vermehrte

Ausschüttung des Cortisols letztlich immunsuppressiv (Besedovsky et al., 1986; Sapolsky et al., 1987).

Der weit verbreitete Spruch „Schlaf Dich gesund“ fand durch zunehmende

Forschung auf den Gebieten der Neuroendokrinologie und Immunologie der

letzten Jahrzehnte immer wieder Bestätigung. Schlaf dient also nicht nur der

Erholung, sondern in gewissem Maße auch der zellulären Regeneration und

Diskussion

51

unterstützt das Abwehrsystem. Dabei werden die vegetativen und hormonellen

Gegebenheiten während des Schlafes ausgenutzt, um Pathogene suffizient zu

bekämpfen. Klinische Beobachtungen verdeutlichen den engen Zusammenhang

zwischen Schlaf und Immunsystem. Beispielsweise leiden Patienten mit Insomnie

oder chronischen Schlafstörungen, genauso wie ältere Menschen, unter einer

verstärkten Anfälligkeit für Infektionen mit protrahiertem Heilungsverlauf

(Besedovsky et al., 2012; Zikorsky et al., 2001). Demgegenüber zeigten Lange

und Mitarbeiter, dass gesunder Schlaf im Gegensatz zu Schlafentzug nach einer

Hepatitis A-Impfung zu einer deutlich höheren Aktivität der antigenspezifischen T-

Helferzellen führt. Diese Veränderung der Immunlage konnte ein Jahr nach

erfolgter Impfung noch nachvollzogen werden (Lange et al., 2011).

Um in diesem in vitro-Modell schlafassoziierte hormonelle Verhältnisse und ihre

Einflüsse auf die Zytokinproduktion zu simulieren, erfolgte die Stimulierung und

Aktivierung der morgendlichen Vollblutproben nach Studienprotokoll. Die für die

SWS-Phasen charakteristischen Konzentrationen an GH und Cortisol wurden

erreicht. Dennoch limitieren einige Faktoren die Interpretation der Ergebnisse.

In vivo wird das Zytokinmilieu und die Aktivität dieser Mediatoren durch

verschiedene Faktoren beeinflusst, welche jedoch unter experimentellen

Bedingungen nicht reproduzierbar sind (Born et al., 1997; Dhabhar 2002; Dhabhar et al., 1994; von Andrian und Mackay 2000).

Dennoch gehen die vorliegenden Ergebnisse mit denen anderer Arbeitsgruppen

konform. Für die SWS-Phasen und für die erste Nachthälfte sind

Sekretionssteigerungen der proinflammatorischen Zytokine charakteristisch. So

beschrieben Petrovsky et al. ein Maximum der IFN-γ-Sekretion gegen 23 Uhr

(Petrovsky und Harrison 1997). Dieses Ergebnis stimmt mit denen anderer

Arbeitsgruppen überein, die für dieses Zytokin einen Höchstwert in der ersten

Nachthälfte postulieren (Dimitrov et al., 2004b; Petrovsky und Harrison 1998;

Petrovsky et al., 1998). Bisherige Forschungsergebnisse über die

proinflammatorischen Zytokine IL-1, IL-6, TNF-α, IL-2 und IL-12 bestätigen das

Vorliegen einer Th1-dominierten Immunantwort während des nächtlichen Schlafes

(Born et al., 1997; Gudewill et al., 1992; Irwin et al., 2000; Palm et al., 1996; Petrovsky et al., 1998; Zabel et al., 1993). Dimitrov und Mitarbeiter beschrieben

Diskussion

52

sogar einen Shift der Balance zugunsten von Th1, gemessen anhand der Zytokine

IFN-γ und IL-4 (Dimitrov et al., 2004b). Dies bekräftigt sich erneut im Rahmen der

vorliegenden Studie, indem unter einer schlafähnlichen Hormonkonstellation eine

Th1-Dominanz, allein durch die isolierte Zunahme von IFN-γ-produzierenden

CD4+ T-Helferzellen zu verzeichnen war. Die IL-4-Synthese wurde in diesem

hormonellen Milieu nicht signifikant beeinflusst. Zum anderen zeigt es, dass

Cortisol eine deutlich höhere immunmodulierende Potenz besitzt, als sein

Gegenspieler GH. Dies wird deutlich, indem GH nur durch parallele Drosselung

der Cortisolwirkung signifikante Effekte auf die Th1/Th2-Balance aufwies.

Die Kernfragen der Studie konnten anhand der erzielten Ergebnisse wie folgt

beantwortet werden:

1. Die Zugabe von GH in einer physiologischen Konzentration von 20 ng/ml zu

den morgendlichen Blutproben der Probanden führte zu einem signifikanten

Anstieg der IFN-γ-produzierenden CD4+ T-Helferzellen. Die Wirkung des Cortisols

auf die IFN-γ-produzierenden CD4+ T-Helferzellen wurde durch Blockade der MR

und GR untersucht. Dies führte zu einem signifikanten Anstieg der IFN-γ-

produzierenden CD4+ T-Helferzellen. Im Umkehrschluss führt Cortisol zu einem

signifikanten Abfall der IFN-γ-produzierenden CD4+ T-Helferzellen.

2. Durch die Zugabe von GH in einer physiologischen Konzentration von 20 ng/ml

zu den morgendlichen Blutproben der Probanden konnte kein signifikanter Effekt

auf IL-4-produzierende CD4+ T-Helferzellen gezeigt werden. Ebenfalls konnte

dem Cortisol durch Blockade von MR und GR kein signifikanter Einfluss auf die IL-

4-produzierenden CD4+ T-Helferzellen nachgewiesen werden.

3. Durch die Zugabe von GH in einer physiologischen Konzentration von 20 ng/ml

zu den morgendlichen Blutproben der Probanden konnte kein signifikanter Effekt

auf die Th1/Th2-Balance beobachtet werden. Lediglich durch die Blockade von

MR durch Spironolacton wurde die Th1/Th2-Balance signifikant zugunsten von

Th1 verschoben. Die Blockade von GR führte nur in Kombination mit GH zu einer

Diskussion

53

signifikanten Änderung dieses Gleichgewichtes in Richtung Th1-Dominanz. Im

Umkehrschluss führt Cortisol zu einem Umschwung der Th1/Th2-Balance zur Th2-

Dominanz, vermittelt durch MR.

Unabhängig von den anfangs gestellten Fragen führte die Auswertung der

vorliegenden Arbeit zu weiteren Kenntnissen, die sich wie folgt zusammenfassen

lassen:

1. Die Verschiebung der Th1/Th2-Balance erfolgt durch die Auswirkung des

Cortisols durch Änderungen der Th1-und nicht der Th2-Zytokinaktivität.

2. Cortisol entfaltet seine immunmodulierende Wirkung über MR und nicht über

GR.

3. Erhöhte GH- sowie erniedrigte Cortisol-Konzentrationen bewirken eine

vermehrte Synthese des Th1-Zytokins IFN-γ, die in einer Th1 dominierten

Immunantwort resultiert.

Im Rahmen dieser in vitro Studie ist es gelungen, schlafähnliche

Hormonverhältnisse zu simulieren. Diese führten, wie erwartet, zu einer

Verschiebung der Th1/Th2-Balance zugunsten der Th1-Zytokine. Dieses

Zytokinprofil ist essenziell für die proinflammatorische Immunantwort im Rahmen

einer Abwehrreaktion und spiegelt die Bedeutung des Schlafes bezüglich seiner

immunmodulierenden Eigenschaften wider.

Um die Aussagen der vorliegenden Arbeit zu verifizieren, sollten weiterführende

Studien durchgeführt werden. Unter anderem wäre es sinnvoll, die Blutentnahme

während der SWS Phasen durchzuführen, um zu eruieren, ob eine

Reproduzierbarkeit der Ergebnisse möglich ist. Weiterhin könnten physiologische

Stimuli der Zytokinsynthese, wie z. B. Staphylokokkus Enterotoxin B verwendet

werden.

Zusammenfassung

54

5. Zusammenfassung

Eine suffiziente Immunabwehr ist essenziell für das Überleben eines Organismus

in einer Umwelt verschiedenster gesundheitlicher Herausforderungen. Ein

ausgewogenes Verhältnis zwischen Th1-und Th2-Zytokinen, welches auf den

immunologischen Reiz optimal abgestimmt sein sollte, ist hierbei von

herausragender Bedeutung. Die Steuerung einer Immunantwort unterliegt

komplexen Regulationsmechanismen, wobei das endokrine System eine wichtige

Instanz darstellt. Hierbei übernehmen Cortisol und GH als Immunmodulatoren

eine wichtige Rolle.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Auswirkung physiologischer

Konzentrationen des humanen Wachstumshormons (GH) und des Cortisols auf

das Immunsystem, insbesondere auf die Balance der Th1/Th2-Zytokine unter in

vitro-Bedingungen zu untersuchen. Als repräsentative Parameter dienten IFN-γ-

bzw. IL-4-produzierende CD4+ T-Helferzellen. Die Wirkung des GH wurde direkt

durch dessen Zugabe bestimmt, während die Messung der Cortisoleffekte indirekt

über Blockade der Glukokortikoid- und Mineralokortikoidrezeptoren erfolgte.

Vollblutproben von 15 gesunden jungen Männern wurden durch Ionomycin und

PMA in An- und Abwesenheit folgender Substanzen stimuliert: GH, RU-486 (GR-

Antagonist), Kombination aus GH und RU-486 sowie Spironolacton (MR-

Antagonist). Die intrazelluläre Zytokinproduktion wurde mittels eines

Durchflusszytometers gemessen.

Unter Administration von GH wurde lediglich eine signifikante Steigerung der IFN-

γ-produzierenden CD4+ T-Helferzellen beobachtet. Die IL-4-produzierenden CD4+

T-Helferzellen sowie die Th1/Th2-Balance blieben unbeeinflusst.

Die Kombination von GH und RU-486 führte zu einer signifikanten Zunahme der

IFN-γ-produzierenden CD4+ T-Helferzellen, durch Ausbleiben einer signifikanten

Änderung IL-4-produzierender CD4+ T-Helferzellen in einer signifikanten Th1-

Dominanz resultierte.

Nach Blockade von MR und GR durch die Zugabe von Spironolacton bzw. RU-486

Zusammenfassung

55

wurde eine signifikante Synthesesteigerung IFN-γ-produzierender CD4+ T-

Helferzellen protokolliert. Jedoch führte keine der zugesetzten Substanzen zu

einer signifikanten Änderung IL-4-produzierender CD4+ T-Zellen. In Bezug auf die

Th1/Th2-Balance zog ausschließlich Spironolacton eine signifikante Verschiebung

zugunsten der Th1-Dominanz nach sich.

Zudem konnte gezeigt werden, dass Cortisol seine immunmodulatorische Wirkung

hauptsächlich über MR und nicht über GR entfaltet.

Die Dysbalance zugunsten des Th1-Zytokinprofils resultiert primär durch Zunahme

des Th1-Zytokins IFN-γ- und nicht durch Veränderungen der IL-4-Synthese.

Die oben genannten Erkenntnisse wurden durch Simulation schlafähnlicher

Hormonkonstellationen gewonnen. Durch niedrige Cortisolspiegel und hohe GH-

Konzentrationen, die für die ersten Stunden des Schlafes charakteristisch sind,

entstand ein proinflammatorisches Zytokinprofil durch eine gesteigerte IFN-γ-

Synthese. Dies verdeutlicht die Notwendigkeit eines geregelten Schlaf-Wach-

Rhythmus für einen suffizienten und ungestörten Ablauf immunologischer

Prozesse.

Die Möglichkeit durch fundiertes Wissen auf dem Gebiet der Immunologie

Abwehrreaktionen von extern beeinflussen oder gar steuern zu können, ist

wichtiger Bestandteil der heutigen Forschung. Auch im Rahmen der Therapie von

Immunerkrankungen zeigt sie neue Möglichkeiten auf.

Bis dato sind jedoch nicht alle Zusammenhänge und Wirkmechanismen bekannt

und bedürfen weiterer klinischer Erforschung. Besonderes Augenmerk sollte dabei

den möglichen Therapieansätzen immunbedingter Erkrankungen gelten.

Literturverzeichnis

56

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Anhang

82

7. Anhang

Anhang

83

Danksagung

84

8. Danksagung

An erster Stelle möchte ich meinem Doktorvater, Herrn Professor Dr. med. J. Born

für die Überlassung des Promotionsthemas herzlich danken. Insbesondere

bedanke ich mich für das nochmals entgegenbrachte Vertrauen, mit dieser Arbeit

promovieren zu dürfen.

Zu tiefem Dank bin ich Frau Dr. med. T. Lange und Herrn Dr. Dipl.- Biol. S.

Dimitrov für die fürsorgliche Betreuung im Rahmen des experimentellen

Abschnittes verpflichtet. Ihre Geduld und das Engagement in der langen

Erstellungsphase dieser Promotionsarbeit möchte ich an dieser Stelle

hervorheben.

Mein besonderer Dank gilt Professor Dr. med. Dr. med. dent. P. Sieg, Direktor der

Klinik für Kiefer- und Gesichtschirurgie sowie meinen Kollegen, die mich in der Zeit

meines Zweitstudiums und während der Fertigstellung dieser Arbeit entlasteten.

Ferner bedanke ich mich bei Frau C. Zinke und A. Otterbein für die technische

Beratung während der Durchführung des labormedizinischen Teils der Arbeit.

Herrn Privatdozent Dr. Dipl.-Ing. P. D. Sindilariu bin ich für die kompetente

Beratung und Hilfe bei der statistischen Auswertung sehr verbunden.

Ich danke auch meiner Kondoktorandin und Freundin Frau W. Becker für die

wunderbare Zusammenarbeit im einsamen Labor.

Nicht zuletzt möchte ich Dir Attila für die konstruktive Kritik bei der Überarbeitung

des Manuskriptes, Deine liebevolle Unterstützung und dein Verständnis in den

vergangenen Jahren danken. Ohne Deine nahezu endlose Geduld hätte ich diese

Arbeit wohl nicht mehr fertig gestellt.

Lebenslauf

85

9. Lebenslauf

Persönliche Daten

Name: Wolf

Vorname: Melanie

Geburtsdatum: 26.09.1977

Geburtsort: Neubrandenburg

Staatsangehörigkeit: deutsch

Familienstand: ledig

Schulausbildung und beruflicher Werdegang

1984 -1989 Gesamtschule Polytechnische Oberschule Dessau

1989 -1997 Fürst Franz Gymnasium Dessau

1997 Abitur

10/1997-10/2005 Studium der Humanmedizin am Universitätsklinikum

Schleswig-Holstein, Campus Lübeck

10/2005 Approbation als Ärztin

seit 11/2005 Tätigkeit als wissenschaftliche Assistentin in der Klinik für

Kiefer- und Gesichtschirurgie am Universitätsklinikum

Schleswig-Holstein, Campus Lübeck

10/2006 -11/2011 Studium der Zahnmedizin an der Universität Hamburg und

an der CAU Kiel

11/2011 Approbation als Zahnärztin

Lübeck, den 28.06.2012

Veröffentlichung der Arbeitsergebnisse

86

10. Veröffentlichung der Arbeitsergebnisse

Dimitrov S, Lange T, Fehm HL, Born J: A regulatory role of prolactin, growth

hormone, and corticosteroids for human T-cell production of cytokines. Brain

Behav Immun 18(4), 368-74 (2004)

Aus dem Institut für Neuroendokrinologie der Universität ... · cytotoxischen T-Lymphozyten...

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