Aus der Klinik für Geflügel der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Experimentelle Studie über die Verträglichkeit und Wirksamkeit

eines inaktivierten Mycoplasma gallisepticum - MG -

Öl-Adjuvans-Impfstoffes bei Legehennen

I N A U G U R A L - D I S S E R T A T I O N

Zur Erlangung des Grades Eines Doktors der Veterinärmedizin

(Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von Hanns-Dietrich Graack

aus Itzehoe

Hannover 2001

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. K.-H. Hinz 1. Gutachter Univ.-Prof. Dr. K.-H. Hinz

2. Gutachter Apl. Prof. Dr. med. vet. Dr. med. vet. habil. K. Pohlmeyer

Tag der mündlichen Prüfung: 19. November 2001

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Inhaltsverzeichnis Seite

1. Einleitung 11

2. Schrifttum 13

2.1. Historisches über die ersten Vakzinationsversuche gegen

Mycoplasma gallisepticum (MG) 13

2.2. Wirksamkeit von Mycoplasma gallisepticum - Totimpfstoffen 20

2.3. Mycoplasma gallisepticum - bedingte immunologische Reaktionen 42

2.4. Aerogene Inokulation mittels Aerosol 62

3. Material und Methoden 66

3.1. Allgemeiner Versuchsaufbau 66

3.2. Voruntersuchungen 66

3.3. Hauptuntersuchungen 67

3.3.1 Verträglichkeitsprüfung 67

3.3.2. Wirksamkeitsprüfung 68

3.4. Herkunft und Haltung der Versuchstiere 68

3.5. Mycoplasma gallisepticum - Stämme 68

3.5.1. Herkunft 69

3.5.2. Anzüchtung und Vermehrung 70

3.6. Vakzination 72

3.7. Experimentelle Belastungsinfizierung (EBI) 74

3.7.1. Infizierungskammer nach W. HOLLÄNDER (1995) 74

3.7.2. Pariboy - Ultraschallvernebler 75

3.7.3. Präparation und Applikation des Inokulums als Aerosol 75

3.8. Klinische Untersuchungen 77

3.8.1. Allgemeinbefinden 77

3.8.2. Lokale Impfstoffreaktion 78

3.8.3. Legeleistung 78

3.9. Serologisch nachweisbare Reaktionen 78

3.9.1. Serum-Schnellagglutinationstest (SSA) 79

3.9.2. Hämagglutinationshemmungstest (HAHT) 79

3.9.3. Enzymgebundener Immunadsorptionstest zum Nachweis von

Antikörpern ( ELISA) 81

3.10. Pathologisch-anatomische Untersuchungen 81

3.11. Kulturell-bakteriologische Untersuchungen 83

3.12. Statistische Auswertung 83

4. Ergebnisse 85

4.1. Voruntersuchungen 85

4.1.1. Zum Zeitpunkt der Einstallung 85

4.1.2. Nach der Vakzination 85

4.1.2.1. Versuch A 85

4.1.2.2. Versuche B und C 86

4.1.2.3. Versuch D 86

4.1.2.4. Versuch E 87

4.2. Hauptuntersuchungen 87

4.2.1. Verträglichkeitsprüfungen 87

4.2.2. Wirksamkeitsprüfungen 89

4.2.2.1. Legeleistung im Versuch1 89

4.2.2.2. Legeleistung im Versuch 2 90

4.2.2.3. Legeleistung im Versuch 3 91

4.3. Ergebnisse der serologischen Untersuchungen 93

4.3.1. Serumschnellagglutination (SSA) 93

4.3.2. Hämagglutinationshemmungstest (HAHT) 95

4.3.3. Enzymgebundener Immunadsorptionstest zum Nachweis von

Antikörpern (ELISA) 97

4.4. Ergebnisse der pathologisch-anatomischen Untersuchungen 98

4.5. Ergebnisse der kulturell-bakteriologischen Untersuchungen 102

5. Diskussion 104

6. Zusammenfassung 111

7. Summary 112

8. Literaturübersicht 113

9. Anhang 128

9.1. Verwendete Nährmedien und Lösungen 128

Abkürzungsverzeichnis µm Mikrometer Abb. Abbildung AE Aviäre Enzephalomyelitis AIB / AIBV Aviäre Infektiöse Bronchitis / Aviäres Infektiöses Bronchitis-Virus AID50 Dosis eines infektiösen Agens, welche bei 50 % der Versuchs-

tiere im Luftsack (airsac) eine pathologische Veränderungen herbeiführt

AK Antikörper bzw. beziehungsweise °C Grad Celsius cm2 Quadratzentimeter CCU Colour changing unit / Stoffwechseltiter CD Cluster of differentiation / charakteristische Oberflächenantigene

auf T-Lymphozyten CRD Chronic respiratory disease d. h. dass heißt DNA / DNS Desoxyribonukleinsäure EBI experimentelle Belastungsinfizierung E. coli Escherichia coli EID Dosis eines infektiösen Agens, welche ausreicht, um Eier

zu infizieren ELISA Enzyme-linked immunosorbant assay / enzymgebundener

Immunadsorptionstest zum Nachweis von Antikörpern g Gramm x g durch Zentrifugalbeschleunigung erzeugtes Vielfaches der Erd- beschleunigung (g= 9,81 m/sec) GMT Geometrischer Mittelwert H. Haemophilus HA Hämadsorption HAH / HAHT Hämagglutinationshemmungstest IBD Gumboro-Krankheit / Infectious Bursal Disease IB / IBV Infektiöse Bronchitis / Infektiöses Bronchitis-Virus ID50 Dosis einen infektiösen Agens, welche bei 50 % der Versuchs-

tiere zu einer Infektion führt I.E. Internationale Einheiten iCGN Iota carrageenan i.c. intrazoelomal IgA Immunglobulin der Klasse A IgG Immunglobulin der Klasse G IgM Immunglobulin der Klasse M IIPA Indirect immunoperoxidase assay i.n. intranasal i.t. intratracheal i.v. intravenös KBE Kolonie-bildende Einheit

kDA Kilodalton l Liter LAH Lohmann Animal Health (Pharmazeutisches Unternehmen) LMI Leukozytenmigrationshemmungstest LP Lipoprotein LSE Luftsackentzündung Lw. Lebenswoche M. Mycoplasma mm Millimeter Mab monoclonal antibody / monoklonaler Antikörper MID Minimale Infektiöse Dosis MG Mycoplasma gallisepticum MGn Mycoplasma gallinarum mg Milligramm ml Milliliter MS Mycoplasma synoviae m/s Meter pro Sekunde m2 Quadratmeter N. Nervus Nn. Nervi n Anzahl der Meßwerte ND / NDV Newcastle Disease / Newcastle Disease Virus p Irrtumswahrscheinlichkeit PAGE Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese PCR Polymerase chain reaction pH negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionen-

konzentration p.i. post infectionem p.m. post mortem PPLO pleuropneumonia-like organisms eingetragenes Warenzeichen RDE receptor-destroying-enzyme RIA radio-immune-assay RVI reduced virulence isolate / Isolat mit reduzierter Virulenz s.c. subkutan SDS Sodium-dodecyl-sulfat / Natrium-dodecyl-sulfat s.o. siehe oben SPF specific pathogen free / frei von bestimmten pathogen Erregern STP Salmonella typhimurium-Zellwandprotein SSA Serum-Schnellagglutination TA tube agglutination / Röhrchenagglutination TCR t-cell-receptor / T-Zell-Rezeptor ts temperatursensibel Vlp variable lipoprotein / variables lipophiles Protein Vsp variable surface protein / variables Oberflächenprotein

11

1. Einleitung

Mycoplasma gallisepticum (MG) ist als Erreger der Mykoplasmose des Huhnes

weltweit verbreitet. Latente Infektionen mit MG können eine erhöhte Embryonal-

sterblichkeit, Entwicklungsstörungen der Jungtiere und Legeleistungsminderungen

bis zu 10 % zur Folge haben. Nach klinischen Erkrankungen können erhöhte

Abgangsraten und Legeleistungsminderungen bis zu 20 % auftreten. Hierdurch

entstehen der Geflügelwirtschaft bedeutende Verluste (JOHNSON 1983, MALLISON

1983 a, b, LEVISOHN und KLEVEN 2000), die allein in den USA mit jährlich 118

Millionen Dollar beziffert wurden (MALLISON und CARPENTER 1981).

Die effektivste Bekämpfung ist die Schaffung von MG-freien Herden. Zuchtherden

sind weitgehend MG-frei (STIPKOVITIS 1985, HINZ 1988), in Deutschland konnte

aber seit 1985 wieder eine Zunahme von MG-Neuinfektionen in Ablegebetrieben

festgestellt werden (HINZ und RYLL 1996). Die Eradikation des Erregers ist vor

allem in solchen Ablegebetrieben schwierig, in denen die Infektketten durch das

permanente Nebeneinander von Legehennen verschiedener Altersgruppen (multiple-

age) nicht unterbrochen wird; dies hat zur Folge, dass neu eingestallte MG-freie

Junghennen sich von den vorhandenen MG-infizierten Althennen anstecken. Auch

die regionale Zunahme von „single-age“-Betrieben und die nachlassende Sorgfalt im

Rahmen der Sicherung des Gesundheitszustandes der Herden (Biosecurity) bieten

dem Erreger die Möglichkeit (KALETA u. SIEGMANN 1993), in der Population zu

persistieren (HILL 1995, HINZ und RYLL 1996, KLEVEN 1994).

Eine Minderung wirtschaftlicher Verluste durch eine MG-assozierte

Legeleistungsminderung und schlechtere Futterverwertung ist durch Vakzination der

Junghennen vor der Umstallung in infizierte Ablegebetriebe möglich. Hierzu stehen

sowohl Lebend- als auch Totimpfstoffe zur Verfügung (KLEVEN 1994). Die Impfung

induziert eine spezifische Partialimmunität, die zwar eine klinisch manifeste

Mykoplasmose unterbindet, jedoch reicht der induzierte Impfschutz nicht aus, um bei

den vakzinierten Tieren eine Infektion mit einem MG-Feldstamm zu verhindern.

Vakzinierte Legehennen sind jedoch in signifikantem Maße besser vor einer MG-

bedingten Leistungsminderung geschützt als nicht vakzinierte Tiere.

12

In den USA ist die Impfung mit dem MG-Stamm F als Lebendimpfstoff möglich

(LEVISOHN und KLEVEN 1981, GLISSON 1987). Der Einsatz dieser Lebendvakzine

ist jedoch auf Grund der Pathogenität des Impfstammes für Puten, Broiler und auch

im geringeren Maße für Legehennen (CARPENTER et al. 1981) problematisch, und

daher ist sie in Deutschland nicht zugelassen (Hinz 1988). In der Bundesrepublik ist

jedoch die Vakzination mit inaktiviertem Impfstoff möglich. Zur Zeit sind in

Deutschland zwei Impfstoffe zugelassen.

Ziel dieser experimentellen Arbeit war es, die neuentwickelte inaktivierte Öl-

Adjuvans-Vakzine „Talovac 104 MG“ der Firma LAH (Lohmann Animal Health) auf

ihre Verträglichkeit und Wirksamkeit bei Legehennen zu prüfen.

13

2. Schrifttum

Schwerpunktmäßig soll hier auf die Entwicklung von Totimpfstoffen gegen

Mycoplasma gallisepticum eingegangen werden, da eine Literaturübersicht über die

Entwicklung von Lebendimpfstoffen bereits von ODENTHAL (1996) im Rahmen einer

Dissertation vorgelegt wurde.

2.1. Historisches zu ersten Vakzinationsversuchen gegen MG

J. B. NELSON untersuchte in den dreißiger Jahren dieses Jahrhunderts die

Ursachen von Atemwegserkrankungen bei Hühnern, Laborratten und Mäusen. Von

1933 bis 1938 veröffentlichte er ca. 10 Arbeiten, die sich mit der ursächlichen

Klärung respiratorischer Erkrankungen des Geflügels befassen (LANCASTER und

FABRICANT 1988). 1935 beschrieb NELSON erstmalig den Erreger von Schnupfen

beim Huhn, welcher sich durch seinen Krankheitsverlauf von dem durch H.

paragallinarum ausgelösten Geflügelschnupfen unterschied. Er konnte von diesen

Hühnern nasales Exsudat gewinnen und durch eine experimentelle Verabreichung

des erregerhaltigen Inokulums diese Erkrankung reproduzieren. Bei dieser

Schnupfenform traten erst nach einer bis vier Wochen bei einzelnen Versuchstieren

die ersten Krankheitssymptome auf. Diese hielten über einen Zeitraum von zwei

Monaten oder länger an. In dem von den Tieren ausgeschiedenen Exsudat konnte H.

paragallinarum nicht nachgewiesen werden. Das isolierte Exsudat der erkrankten

Hühner enthielt jedoch stets andere Bakterien, welche von NELSON (1935) jedoch

als sekundäre Erreger gewertet wurden. Es gelang ihm, mit einem nach Filtration

bakterienfreien Exsudat bei Hühnern den typisch protrahierten Krankheitsverlauf zu

reproduzieren. Mikroskopisch ließen sich in diesem Exsudat sehr kleine,

gramnegative, kokkoide Körperchen, welche gewöhnlich extrazellulär lagen,

nachweisen. Die Größe der Körperchen gab der Autor mit 0,1 – 0,5 µm an.

Im gleichen Jahr schlug KLIENEBERGER (zitiert nach: LANCASTER und

FABRICANT 1988) den Begriff „pleuropneumonia-like organisms“ (PPLO) für diese

Organismen vor. 1939 gelang es NELSON, das Wachstum der „coccobacilliform

14

bodies“ in „inaktiviertem“ Überstand von sedimentiertem Embryonalgewebe

nachzuweisen.

DELAPLANE und STUART (1943) beschrieben die Erkrankung einer Legeherde von

5000 Hennen, deren Legeleistung nach einer Infektion mit einem unbekannten

Erreger auf 30 % abfiel und die klinische, respiratorische Erscheinungen aufwiesen.

Sie verwandten erstmals den Begriff „chronic respiratory disease“ (CRD) für diese

ERkrankung, ohne dass sie einen Zusammenhang zu den PPLO herstellen konnten.

VAN HERICK und EATON gelang 1945 die Isolierung von PPLO aus embryonierten

Hühnereiern und die Anzüchtung in einer Bouillon mit Pferdeserum und Glukose. Sie

beobachteten, dass nach einer viertägigen Bebrütung (37 °C) in der Bouillon keine

lebenden Organismen mehr nachzuweisen waren. Dies führten sie auf die Metabo-

lisierung der Glukose und das damit verbundene Absinken des pH-Wertes zurück.

Mit der erregerhaltigen Bouillon konnten sie eine Agglutination von Hühner-

erythrozyten auslösen. Die Zugabe von Serum eines zuvor hyperimmunisierten

Kaninchens verhinderte diese Agglutinationsreaktion.

Erst 1952 konnten MARKHAM und WONG jedoch den Zusammenhang zwischen

diesem Erreger (PPLO) und der „chronic respiratory disease“ (CRD) der Hühner und

der „Infektiösen Sinusitis“ der Puten nachweisen, indem sie verschiedene Isolate von

erkrankten Tieren kulturell, morphologisch und in klinischen Versuchen verglichen.

DOMERMUTH (1957) beschrieb die PPLO als Ursache des chronischen

Geflügelschnupfens bei Hühnern. Er untersuchte, ob durch eine Impfung eine

Schutzwirkung gegen Luftsackentzündungen induziert werden kann. Nach einer

intramuskulären bzw. subkutanen Applikation von 0,1 bis 0,2 ml Suspension

lebender PPLO des Winchester-Stammes bei jungen Hühnern wurden diese in

einem Zeitabstand von vier bis neun Wochen nach dieser Impfung mit dem

homologen Stamm experimentell infiziert. Die Applikation des Inokulums erfolgte in

den Brustluftsack. Eine Woche nach dieser experimentellen Belastungsinfizierung

(EBI) wurden die Tiere getötet und pathologisch-anatomisch untersucht. Die

Luftsackveränderungen bewertete DOMERMUTH (1957) mit Hilfe einer vierstufigen

Skala und stellte fest, dass bei den geimpften Hühnern die Luftsackentzündungen

„weniger stark“ ausgeprägt waren.

15

ADLER (1958) impfte Puten mit einem inaktivierten bzw. attenuierten (90. Passage)

PPLO-Stamm S6. Vier Wochen nach der intramuskulären Injektion konnte er keine

spezifischen Titer agglutinierender Antikörper feststellen. Zu diesem Zeitpunkt

infizierte er die Puten durch eine intraperitoneale Injektion mit dem homologen

PPLO-Stamm. 21 Tage später wurden die Puten getötet und pathologisch-

anatomisch sowie serologisch untersucht. Er stellte bei allen Tieren ausgedehnte

Luftsackentzündungen fest. Diese Luftsackentzündungen erschienen ADLER (1958)

bei den Puten, die mit dem attenuierten Impfstoff intraperitoneal vakziniert worden

waren, „weniger stark“ ausgebildet. Bei serologischen Untersuchungen wurden nach

experimenteller Infizierung in allen untersuchten Blutproben spezifische Antikörper

gegen den PPLO-Stamm nachgewiesen.

EDWARD und KANAREK (1960) führten für die „pleuropneumonia-like organisms“

(PPLO), welche die „Infektiöse Sinusitis“ der Puten und die „chronic respiratory

disease“ (CRD) der Hühner auslösten, den Namen Mycoplasma gallisepticum (MG)

ein.

ADLER et al. (1960) suchten nach einer Möglichkeit, CRD-freie Hühner und Puten

durch Impfung mit Lebend- oder Totimpfstoffen vor einer Infektion durch

Mykoplasmen zu schützen. Zur Impfstoffherstellung und Infizierung verwandten sie

verschiedene Verdünnungen von Suspensionen des MG-Stammes S6. Die von

ihnen verwandten Lebendimpfstoffe enthielten 109 KBE/ml. Die Inaktivierung erfolgte

durch eine 30-minütige Ultraschallbehandlung. Die EBI der Versuchstiere erfolgte

durch Inokulation in den linken abdominalen Luftsack, die pathologisch-

anatomischen Veränderungen bewerteten sie mittels einer vierstufigen

Bewertungsskala auf Grundlage eines numerischen Punktesystems, dessen

gemittelte Werte sie als Luftsackentzündungs-Wert (LSE-Wert) angaben. ADLER et

al.(1960) stellten in ihren Experimenten fest, dass 106,5 KBE einer

Mykoplasmensuspension der 5. in vitro-Passage des S6-Stammes nötig sind, um 50

% der sieben Wochen alten Hühnerküken zu infizieren. Zehn Legehennen im Alter

von fünf Monaten infizierten ADLER et al. (1960) über die Eierstöcke mit dem MG-

Stamm S6. Daraufhin sank die Legeleistung dieser Hennen um 16 %. Vier Monate

später wurde eine EBI mit dem MG-Stamm F durchgeführt; nun fiel die Legeleistung

16

der Kontrollgruppe um 12 % ab, während die der bereits infizierten Gruppe konstant

blieb. Nach intravenöser Applikation von inaktiviertem Impfstoff konnten ADLER et al.

(1960) zwar bei diesen Tieren die höchsten Titer spezifischer Antikörper gegen MG

ermitteln, jedoch traten in dieser Versuchsgruppe nach experimenteller Infizierung

die ausgedehntesten Luftsackentzündungen auf, deren LSE-Wert sie für diese

Gruppe mit ≥ 2 angaben. Hühner, die i.m. geimpft worden waren, erkrankten in

einem geringeren Ausmaß (LSE-Wert: ≤ 1,5).

Mc MARTIN und ADLER (1961) arbeiteten in ihren Experimenten mit bei

Versuchsbeginn vier Wochen alten, SPF-freien Hühnerküken. Mit Hilfe von

logarithmisch verdünnten Mykoplasmensuspensionen, die zwischen 101 bis 107 KBE

enthielten, ermittelten sie die Dosis, die bei einer direkten Inokulation in den linken

abdominalen Luftsack, respektive einer intranasalen Applikation, bei 50 % der

Versuchstiere im Luftsack eine pathologische Veränderung herbeiführt (AID50). Zwei

Wochen nach Verabreichung des Inokulums wurden die Tiere getötet und

pathologisch-anatomisch untersucht. Sie ermittelten für die direkte Inokulation in den

Luftsack eine AID50 von 101,8 und für die intranasale Applikation eine AID50 von 102,9

Mykoplasmen. In weiteren Experimenten stellten sie fest, dass die intranasale

Applikation von 103 lebenden Mykoplasmen des S6-Stammes einen Schutz vor einer

Erkrankung nach einer erneuten experimentellen Infizierung mit dem homologen

Stamm bewirkte. In einem anderen Versuch impften sie Hühner durch die intranasale

Gabe von 108 Mykoplasmen und infizierten sie 21 Tage nach der Impfung durch

Inokulation des homologen Stammes in den linken abdominalen Luftsack. Bei den

Impflingen waren auch nach einer Infizierungsdosis von 300 x AID50 keine

Luftsackentzündungen festzustellen.

WARREN et al. (1968) vakzinierten mehrere Gruppen MG-freier Hühnerküken im

Alter von einem bis 14 Tagen mit einem inaktivierten MG-Impfstoff (MG-Stamm

293C-5261). Die Applikation des Impfstoffes erfolgte entweder subkutan oder

intranasal, einmalig oder zweimalig in einem Abstand von zwei Wochen. Die EBI mit

dem homologen Stamm erfolgte im Alter von 14 bis 28 Tagen mit 0,25 bzw. 0,5 ml

einer Suspension mit je 105,5 KBE/ml zwei Wochen post vaccinationem. Bei 89% der

nicht geimpften Kontrolltiere konnten post mortem Luftsackentzündungen festgestellt

17

werden. Der Schutz vor entzündlichen Veränderungen betrug in den geimpften

Gruppen zwischen 10 und 70%. Dieser Schutz vor einer Erkrankung zeigte sich nicht

nur in der Abnahme der Morbidität, sondern auch in einer Verminderung entzündlich

veränderter Lungen bei den Küken der Impfgruppe.

ADLER und LAMAS DA SILVA (1970) untersuchten die Wirksamkeit inaktivierter

MG-Impfstoffe in Abhängigkeit von der Applikationsroute. Für diese Versuche

verwendeten sie MG-freie Hühner. Sie stellten nach ein- bzw. zweimaliger

intravenöser Gabe des inaktivierten Impfstoffes einen Schutz vor

Luftsackentzündungen nach Belastungsinfizierung mit 109 Mykoplasmen des S6-

Stammes je Tier fest. Die durchschnittlichen LSE-Werte lagen mit 0,9 bzw. 1,0

deutlich unter denen der Kontrollgruppe (≥ 2). Die intranasale Gabe des inaktivierten

Impfstoffes erzeugte keinen Schutz. Bei Versuchen mit lebenden Mykoplasmen,

konnte eine Schutzwirkung, unabhängig von der Applikationsart, feststellt werden,

jedoch war die Belastbarkeit dieser Vakzination abhängig von der Anzahl der

verimpften Mykoplasmen. Aufgrund dieser Ergebnisse gelangten ADLER und

LAMAS DA SILVA (1970) zu der Auffassung, dass durch eine i.v. Impfung mit

inaktivierten Mykoplasmen ein Schutz gegen Luftsackentzündungen erzielt werden

kann, wenn die Belastungsinfizierung nicht später als 25 Tage nach der Impfung

erfolgt. Die Wirksamkeit der lokalen Applikation von inaktivierten MG-Adjuvans-

Impfstoffen untersuchten HAYATSU et al. (1974) bei MG-freien Mastküken. Sie

verwendeten für die Impfstoffherstellung und die EBI den virulenten MG-Stamm S6-

K. In verschiedenen Versuchsanordnungen untersuchten sie die Wirksamkeit von

Impfstoffen mit oder ohne Zusatz verschiedener Adjuvantien in Abhängigkeit von der

Applikationsweise, der Menge des verwendeten Impfstoffes bzw. der Menge der bei

der EBI verwendeten Mykoplasmen sowie die Dauer einer eventuell erzielten

Wirkung. Als Parameter für die Effizienz der Impfung wurden die post mortem

festgestellten Organveränderungen, die histologischen Befunde sowie die

Reisolationsrate von MG herangezogen. Hierzu wurden die Organveränderungen in

einer Skala (siehe ADLER 1960) bewertet. Die dreimalige, intramuskuläre Gabe

verschiedener Impfstoffarten erzeugte keinen Schutz vor einer Infektion der

Atemwege mit MG. Die intranasale und aerogene Applikation des Impfstoffes

18

hingegen führte zu einer Verminderung des Ausmaßes der Luftsackentzündungen

und/oder der Besiedlung des Tieres durch MG (HAYATSU et al. 1974). Nach der

Inokulation von 5,0 x 109 inaktivierten Mykoplasmen mittels Aerosol konnten sie

einen vollständigen Schutz vor einer Infektion und Luftsackentzündungen nach einer

EBI mit 7,4 x 103 KBE feststellen. Diesen Schutz beobachteten sie auch bei

geimpften Hühnern, die sie vier Wochen lang mit artifiziell infizierten Hühnern

zusammenhielten. In einem weiteren Experiment testeten sie die Dauer des

Impfschutzes in Abhängigkeit von ihrem verwendeten Impfkonzept, das eine

dreimalige Vakzination im Abstand von jeweils zehn Tagen mit 5,0 x 109 inaktivierten

Mykoplasmen vorsah. HAYATSU et al. (1974) konnten bei drei von neun Hühnern

auch sechs Monate nach der Impfung noch einen Schutz vor Luftsackentzündungen

nach einer EBI mit MG feststellen.

Diese Ergebnisse konnten HAYATSU et al. (1975) in einem kontrollierten

Feldversuch bestätigen. Sie impften via Aerosol 1760 Küken im Alter von drei, 14

und 25 Tagen mit 2,0 x 1010 inaktivierten Mykoplasmen des S6-K Stammes. 7170

Küken wurden als Kontrollgruppe unter identischen Bedingungen gehalten. Bei den

geimpften Küken war keine erhöhte Abgangsrate zu verzeichnen, die

Gewichtsentwicklung entsprach am 95. Tag der Zunahme der Kontrollgruppe. Bis

zum 74. Lebenstag konnten keine Mykoplasmen reisoliert werden. Dies war jedoch

in der Kontrollgruppe am 84. und 134. Lebenstag möglich. In den Luftsäcken konnten

bei der pathologisch-anatomischen Untersuchung am 84. und 134. Versuchstag

keine signifikanten Unterschiede im Ausmaß der Luftsackentzündung festgestellt

werden. Jedoch konnten HAYATSU et al. (1975) am 84. Versuchstag bei sechs von

zehn Hühnern der Kontrollgruppe Mykoplasmen reisolieren. Dies war bei keinem der

zehn untersuchten Küken der Impfgruppe der Fall. Nach einer aerogenen

Verabreichung von NDV am 45. Versuchstag zeigten sich in der Kontrollgruppe

deutlichere respiratorische Krankheitserscheinungen als in der geimpften Gruppe. Es

konnte nicht geklärt werden, ob diese Erkrankung Folge einer natürlichen Infektion

mit MG, der Applikation von NDV oder einer Kombination von beidem war. Im

Ergebnis wurde die Impfung mittels eines Aerosols als Möglichkeit bewertet, Hühner

vor einer natürlichen Infektion durch MG zu schützen.

19

Rimmler et al. (1978) untersuchten die Schutzwirkung von inaktivierten Vakzinen

gegen „Geflügelschnupfen“, welcher durch Haemophilus paragallinarum (HG)

und/oder MG hervorgerufen wurde. Es wurden in mehreren Versuchsanordnungen

verschiedene Kombinationen von MG- und HG-Impfstoffen untersucht. Zur

Herstellung der MG-Vakzine wurde der R-Stamm verwendet; die für die Versuche

verwendeten Hühner waren bei Versuchsbeginn 16 Wochen alt. Die Impfung erfolgte

im Alter von 16 bzw. 19 Wochen ein- bzw. zweimalig subkutan im Nacken. Maßstab

für die Schutzwirkung war die Häufigkeit von klinischen manifesten Erkrankungen im

Bereich der oberen Atemwege und der Luftsäcke. In ihren Versuchen konnten sie die

von NELSON (1933, 1938) als Typ I und Typ III klassifizierten Schnupfenformen bei

den Versuchshühnern reproduzieren. Eine zweimalige Impfung mit der kombinierten

MG/HG-Vakzine schützte die Tiere am besten vor einer Erkrankung nach der EBI mit

dem MG-Stamm R (3,1 x 108 KBE/ml) und dem HG-Stamm W. In der Impfgruppe

stellten sie nur bei drei von zehn Hühnern nicht genau definierte respiratorische

Erscheinungen fest, hingegen traten solche bei sieben von zehn Tieren der

Kontrollgruppe auf. Bei der pathologisch-anatomischen Untersuchung fanden

RIMMLER et al. (1978) lediglich bei zwei Hühnern der Impf- aber bei sieben Hühnern

der Kontrollgruppe eine Luftsackentzündung.

20

2.2. Wirksamkeit von MG-Totimpfstoffen

1979 untersuchte YODER, ob eine einmalige Impfung von MG-freien Legehennen im

Alter von 18 Wochen mit inaktivierten Vakzinen unterschiedlicher

Herstellungsverfahren einen Schutz vor einer klinischen Erkrankung oder einer

Legeleistungsminderung nach einer artifiziellen Infizierung bewirkte. Nach

intranasaler EBI in der 28. Lebenswoche mit 0,2 ml einer 24-Stunden-Bouillonkultur

des R-Stammes konnte er weder in der Impf- noch in der Kontrollgruppe Anzeichen

einer klinischen Erkrankung oder einer Minderung der Legeleistung feststellen. Den

Anstieg der Antikörpertiter nach der Infizierung mit MG wertete YODER (1979) nicht

als Zeichen für einen Schutz gegen eine Legeleistungsminderung durch Mycoplasma

gallisepticum.

PANIGRAHEY et al. (1981) testeten die Wirksamkeit von drei inaktivierten MG-

Impfstoffen unterschiedlicher Zusammensetzung an Hand klinischer Erkrankungen

nach der Belastungsinfizierung mit dem MG-Stamm R via „eye drop“. 150 MG-freie

Eintagsküken wurden in drei Impf- und eine Kontrollgruppe geteilt. Im Alter von fünf

Wochen erfolgte die erste Vakzination. Die Hälfte jeder Impfgruppe wurde sechs

Wochen später ein zweites Mal vakziniert. Zwei Wochen nach der Zweitimpfung

erfolgte die EBI. Bei den Hühnern, die zweimal mit einer Wasser in Öl-Vakzine

geimpft worden waren, wurden keine sichtbaren Anzeichen einer klinisch manifesten

Erkrankung festgestellt. Die signifikant höheren Titer spezifischer Antikörper in der

Gruppe, die zweimal mit einer Öl-Emulsions-Vakzine geimpft worden war, und der

fehlende weitere Titeranstieg nach der Infizierung der Küken bewerteten sie als

Impfschutz gegen MG.

Im Rahmen des AAAP Mycoplasmosis Symposiums berichtete YODER (1983) über

Untersuchungen, in denen die Schutzwirkung inaktivierter MG-Öl-Adjuvansimpfstoffe

vor Legeleistungsminderungen bei Hennen nach Impfung in der 18. Lebenswoche

(Lw) geprüft wurden. In der 28. bis 30. Lebenswoche wurden die Hennen zunächst

mit IBV und zwei bis drei Tage später mit MG infiziert. In zwei von vier

Versuchsdurchgängen war die Legeleistung der nicht geimpften Kontrollgruppen in

der zweiten Woche nach der experimentellen Infizierung „ein wenig geringer“.

21

YODER (1983) beschrieb, dass die Zusatzbelastung durch IBV notwendig war, um

„gute“ Auswertungen, d.h. statistisch verwertbare Unterschiede in der Legeleistung

zu erzielen. Lokale Impfreaktionen traten nach der subkutanen Injektion im

Nackenbereich nicht auf.

HILDEBRAND et al. (1983) untersuchten die Wirksamkeit einer inaktivierten Öl-

Adjuvans-Vakzine, „MG-Bac®“ (Salsbury Lab. Charles City, Iowa USA), hinsichtlich

ihres Schutzes gegen die Mykoplasmose bei Küken und vor

Legeleistungsminderungen bei Hennen. Sie verwendeten für die Laborstudien SPF-

Küken, welche im Alter von drei Wochen geimpft und vier Wochen später in den

rechten Infraorbitalsinus mit verschiedenen MG-Stämmen (R, S-6, PG-31 und 1150)

infiziert wurden. Sieben bis 14 Tage p. i. erfolgte die Untersuchung. Als Kriterium für

eine klinische Erkrankung wurde das Austreten mukösen Exsudates aus den

Nasenöffnungen gewertet. Bei den geimpften Küken stellte man einen 90 bis 95-

prozentigen Schutz vor einer klinischen Erkrankung fest. In den ungeimpften

Kontrollgruppen fanden sie bei 44% der Küken Luftsackentzündungen, in der

Impfgruppe hingegen nur bei 10 % der Versuchstiere. HILDEBRAND et al. (1983)

gelang die Reisolation von MG aus der Trachea bei allen Tieren der Kontrollgruppen.

Bei den Probanden der Impfgruppen war die Reisolation von MG auch nach einer

Subkultivierung nur bei 76 % der Tiere möglich. Für die Feldversuche wurden

110000 MG-freie Legehennen zweier Zuchtlinien verwendet. Den Tieren der

Impfgruppen wurde jeweils 0,5 ml der MG-Öl-Adjuvans-Vakzine subkutan im

Nackenbereich appliziert. 50 % der Hennen erhielten nur eine einmalige Impfung im

Alter von 14 Wochen, die andere Hälfte wurde im Alter von 18 Wochen erneut

vakziniert. Die Autoren empfahlen die Vakzination im unteren Drittel des Halses, da

sie Ödeme im Augenbereich infolge Impfstoffapplikation im oberen Halsabschnitt

beobachtet hatten. Eine Herde von ca. 165000 Hennen wurde in der zehnten

Lebenswoche mit lebenden Mykoplasmen des F-Stammes geimpft, um zwischen

Lebend- und Totimpfstoffen vergleichen zu können. Sie verglichen ihre Ergebnisse

mit der Legeleistung, die jährlich als Stall- bzw. Zuchtlinienstandards errechnet

wurde. 72 Hennen stallten sie als ungeimpfte Kontrollgruppe mit auf. Die einmal

geimpften Legehennen zeigten einen Schutz von 50 % bis 89 % vor einer klinisch

22

manifesten Mykoplasmose nach einer MG-Feldinfektion. Bei den Hühnern, die

zweimal geimpft worden waren, betrug der „Schutz“ zwischen 70 % und 100 %,

während 90 % bis 100 % der Kontrolltiere im Verlaufe des 64 Wochen währenden

Versuches erkrankten. Die Legeleistung der zweimalig mit MG-Bac® geimpften

Hennen lag mit 233,5 Eiern pro aufgestallter Henne über der Legeleistung der Herde,

die mit einer Dosis des F-Stammes (220,7 Eier/Henne) geimpft worden war. Den

Herdenstandard gaben sie mit 222 Eiern je aufgestallter Henne an. Auch die

Futterverwertung der mit MG-Bac® vakzinierten Herden lag über der mit dem F-

Stamm vakzinierten. HILDEBRAND et al. (1983) schätzten die untersuchte Vakzine

als sicher und wirksam ein.

Grundlage für die Effizienz einer Impfung mit einer inaktivierten Öl-Adjuvans-Vakzine

gegen MG stellte für YODER et al. (1984) der Schutz von Broilerküken vor

Luftsackentzündungen dar. Verschiedene Gruppen SPF-freie Küken wurden am

ersten, siebten oder 14. Lebenstag mit je 0,5 ml bzw. 0,1 ml der Öl-Adjuvans-

Vakzine subkutan im Nacken geimpft. Im Alter von sechs Wochen erfolgte die EBI

der Impf- und Kontrollgruppen. Zunächst wurden die Küken intratracheal mit IBV und

zwei Tage später mittels eines erregerhaltigen Aerosols mit dem MG-Stamm R

infiziert. Gleichzeitig wurden die Küken in eine kalte Umgebung gebracht. 21 Tage

nach dem Challenge wurden die Tiere getötet und pathologisch-anatomisch

untersucht. Die Schwere der Luftsackveränderungen wurden in einer Skala von 0

(keine Veränderungen) bis 4 (schwere Luftsackentzündungen mit viel Exsudat im

Bereich aller Luftsäcke) erfaßt und der LSE-Wert als arithmetischer Mittelwert

angegeben (siehe ADLER 1960). In dem ersten ihrer Experimente stellten YODER et

al. (1984) fest, dass Küken, die im Alter von einer bzw. zwei Wochen geimpft worden

waren, im Vergleich mit den Kontrollgruppen, einen signifikant höheren Schutz vor

Luftsackentzündungen aufwiesen. Ebenso erkrankten von 60 Küken, welche sie im

Alter von 15 Tagen geimpft hatten, nur 4 (6,6, %) Tiere, während in der

Kontrollgruppe bei 17 von 60 Küken (28,3 %) eine Luftsackentzündung festgestellt

wurde. Nach einer Impfung mit 0,1 ml der Vakzine erkrankten nur 8,3 %, in der

Kontrollgruppe hatten 35 % der Küken Luftsackentzündungen. Im selben Versuch

23

konnte in einer Gruppe, die mit 0,5 ml geimpft worden war, ein Schutz von 98,3 %

vor Luftsackentzündungen erzielt werden.

ZOLLI (1984) berichtete über Feldversuche mit einer inaktivierten Öl-Adjuvans-

Vakzine. Im Zusammenhang mit den Angaben zum verwendeten Impfstoff, der

Impfweise und dem Zeitpunkt der Infizierung verwies er auf die Publikation von

HILDEBRAND et al. (1983). Zwei Herden mit je 40000 Hühnern wurden im Alter von

16 Wochen einmalig geimpft. Es konnte ein Schutz vor einer

Legeleistungsminderung nach intrasinuidaler Belastungsinfizierung mit dem MG-

Stamm R festgestellt werden. Eine geimpfte Legehennenherde (n= 20000) wies im

Vergleich mit einer ungeimpften Kontrollherde (n= 20000) bis zum Alter von 47

Wochen eine um zwei Eier höhere Legeleistung auf. Dies stimmte mit dem Ergebnis

einer anderen Studie überein, in welcher zwei Herden mit je 75000 Hennen

verglichen wurden. Eine dieser Herden wurde einmal geimpft, in der ungeimpften

Herde kam es zu einem Ausbruch einer durch MG-bedingten CRD, so daß dieser

Herde von der 33. bis zur 60. Lebenswoche mit Tylosin medikamentiertes Futter

verabreicht wurde. Die geimpfte Herde erreichte einen um 4,6 % höheren

Legeleistungspeak und legte bis zur 60. Lebenswoche im Durchschnitt sieben Eier

mehr. Im Vergleich der Legeleistung von insgesamt 600000 Legehennen wurden

fünf Herden mit jeweils 60000 Hennen mit einer inaktivierten Öl-Adjuvans-Vakzine

und fünf Herden derselben Größe mit dem F-Stamm von MG geimpft. In vier von fünf

dieser Studien legten die Herden, die mit der inaktivierten Öl-Adjuvans-Vakzine

geimpft worden waren, mehr Eier als die jeweiligen Vergleichsgruppen.

GLISSON und KLEVEN (1984) untersuchten die Wirksamkeit unterschiedlicher MG-

Impfungen im Hinblick auf eine transovarielle Übertragung von Mykoplasmen und

eine Minderung der Legeleistung nach einer artifiziellen Infizierung mit dem MG-

Stamm R. 150 MG-freie Legehennen teilten sie in fünf Gruppen auf und verglichen

eine Kontrollgruppe mit vier Impfgruppen, die unterschiedlich geimpft wurden:

1. Vakzination im Alter von 16 Wochen mit dem F-Stamm (3x106 KBE/Tier) via

eye-drop.

2. kombinierte Vakzination mit dem F-Stamm (3x106 KBE/Tier) in der 16. Woche

und mit der inaktivierten Vakzine „MG-bac®“ im Alter von 20 Wochen.

24

3. zweimalige Vakzination mit „MG-bac®“ in der 16. und 20. Lebenswoche

4. einmalige Impfung mit „MG-bac®“ in der 20. Lebenswoche.

Die Applikation des inaktivierten Impfstoffes erfolgte jeweils subkutan. Zum Zeitpunkt

des Produktionsmaximums in der 28. Lebenswoche wurden alle Tiere durch ein

erregerhaltiges Aerosol und durch Gabe von 1,5 x 107 Mykoplasmen je Henne in den

linken Infraorbitalsinus infiziert. In allen vier Impfgruppen konnten GLISSON und

KLEVEN (1984) feststellen, dass im Vergleich mit der Kontrollgruppe die

Übertragung von MG erst zu einem späteren Zeitpunkt nach der EBI begann. In der

Gruppe, die zweimal mit dem inaktivierten Impfstoff geimpft worden war, konnten sie

diese Übertragung erst nach 82 Tagen nachweisen. Warum gerade diese

Impfgruppe gegen Ende des Versuches in der 15. bis 25. Woche p.i. den höchsten

prozentualen Anteil infizierter Eier aufwies (3,7 % - 12,6 %), konnten GLISSON und

KLEVEN (1984) nicht erklären. Die Legeleistung der vakzinierten Gruppen lag im

Versuchszeitraum von der 19. - 54. Lebenswoche 5 bis 15 Eier über der der

Kontrollgruppe. Gründe, warum die Impfgruppe, welche sie mit der Kombination F-

Stamm und MG-bac® vakziniert hatten, über den gesamten Versuchszeitraum in der

Legeleistung zurückblieb, konnten nicht gefunden werden. Alle Impfgruppen waren

jedoch vor einer Legeleistungsminderung nach experimenteller Infizierung mit dem

MG-Stamm R geschützt. Allein in der Kontrollgruppe kam es bis zur 30.

Lebenswoche zu einen Abfall der Legeleistung von 90 % auf 20 %.

GLISSON und KLEVEN versuchten 1985, diese Ergebnisse in entsprechend

gestalteten Studien zu bestätigen. Sie verglichen eine ungeimpfte Kontrollgruppe mit

drei unterschiedlich vakzinierten Gruppen von jeweils 30 MG-freien Legehennen: Die

erste wurde zweimalig in der 17. und 21. Lebenswoche mit MG-Bac® (Salsbury Lab.

Charles City, Iowa, USA) geimpft, in der zweiten Impfgruppe wurde diese Impfung in

der 30., 41. und 52. Lebenswoche wiederholt. Die dritte Gruppe wurde erst zwei

Wochen nach der Belastungsinfektion geimpft. Diese Belastungsinfektion via Aerosol

und Injektion von 2,3 x 107 KBE/Henne in den rechten Infraorbitalsinus erfolgte in der

28. Lebenswoche zum Zeitpunkt des Legeleistungsmaximums. Die zweimalige

Impfung mit MG-Bac® (Salsbury Lab. Charles City, Iowa, USA) schützte fast

vollständig gegen die transovarielle Übertragung nach der Infizierung mit MG. Nur in

25

einem von 4725 Eiern konnten GLISSON und KLEVEN (1985) den MG-Stamm R

nachweisen. Die Boosterung der Impfung verhinderte diese Übertragung von MG

vollständig. Im Vergleich mit der Kontrollgruppe war dieser Schutz signifikant. Im

Unterschied zu den Ergebnissen ihrer Studien aus dem Jahr 1984 erfolgte auch im

weiteren Verlauf ihres Versuches bis zur 60. Lebenswoche keine transovarielle

Übertragung von MG. Nach der Belastungsinfektion fiel die Legeleistung in den

beiden zu diesem Zeitpunkt ungeimpften Gruppen von 85 % auf 30 % ab. Diese

Legeleistungsminderung betrug in den beiden, zum Zeitpunkt der Infizierung bereits

geimpften Gruppen nur 15 % bzw. 30 %. Eine einmalige Impfung von zuvor natürlich

infizierten Hennen mit MG-Bac® (Salsbury Lab. Charles City, Iowa, USA) verminderte

die transovarielle Übertragung von Mycoplasma gallisepticum, verhinderte sie aber

nicht vollständig. GLISSON und KLEVEN (1985) fanden in diesem Versuch in 4,1 %

der Eier der Kontrollgruppe Mykoplasmen. Durch die Impfung p.i. verringerte sich der

Anteil der infizierten Eier auf 1,2 %.

YODER und HOPKINS (1985) prüften einen inaktivierten Öl-Emulsions-Impfstoff in

Bezug auf seine Schutzwirkung vor einer MG-bedingten Minderung der Legeleistung

bei Legehennen, die sie aus kommerziell gehaltenden Herden und einem

Versuchslabor erhielten. Die Ergebnisse ihrer Versuche zeigten ein unterschiedliches

Bild. In ihrem ersten Experiment hatten sie 32 Hühner in der elften und 19.

Lebenswoche mit 0,5 ml des Impfstoffes subkutan im Nacken geimpft. Impf- und

Kontrollgruppe wurden in der 29. Lebenswoche mit 0,2 ml einer MG-Bouillon (Stamm

R) infiziert. YODER und HOPKINS (1985) konnten im Laufe dieses Versuches keine

Unterschiede in der Legeleistung feststellen. Dies war auch bei einem Vergleich von

in der 20. Lebenswoche geimpften 48 Hennen mit ihren unter identischen

Bedingungen gehaltenden Kontrolltieren der Fall. Beide Gruppen wurden in der 28.

Lebenswoche zunächst mit IBV infiziert. Zwei Tage danach wurde den Hühnern 0,4

ml einer MG-Kultur des R-Stammes verabreicht. Die Infizierung mit MG erfolgt

intrakonjunktival, intranasal und intratracheal. Vor dieser Infizierung wiesen beide

Gruppen eine Legeleistung von ca. 92 % auf, diese fiel zunächst auf 85 % ab, um

dann in der Legeleistung wieder auf 87 % anzusteigen. Die 48 Legehennen, die

YODER und HOPKINS (1985) im Anschluß an ein Experiment mit IBV in der 33.

26

Lebenswoche gegen MG geimpft hatten, zeigten nach einer kombinierten Infizierung

mit IBV und MG in der 38. Lebenswoche keinen Abfall in der Legeleistung. In der

entsprechenden Kontrollgruppe verminderte sich die Legeleistung von ca. 90 % auf

76 %. Nach einer Impfung gegen MG in der 20. Lebenswoche kam es bei Hennen

nach einer kombinierten Infizierung mit IBV und MG zum Zeitpunkt des

Legeleistungsmaximums in der 29. Lebenswoche nur zu einer Verringerung der

Legeleistung von 93 % auf 91 %. In einem weiteren Versuch wurden Hennen durch

ein erregerhaltiges Aerosol infiziert. Die Legeleistung der vakzinierten Gruppe betrug

vor der experimentellen Infizierung 85 %, die der Kontrollgruppe 82 %. Eine dritte

Gruppe, welche weder geimpft noch infiziert worden war, zeigte im Verlaufe des

Versuches eine Legeleistung von 78 % bis 80 %. Im Zeitraum von zwei Wochen

nach der EBI mit MG fiel die Legeleistung der Kontrollgruppe auf 66 % ab. Die

vakzinierte Gruppe zeigte nur einen leichten Legeleistungsrückgang auf 80 %,

erholte sich aber binnen drei Wochen auf 83 % bis 85 %. Die Legeleistung der

Kontrollgruppe stieg lediglich wieder auf 76 % bis 79 % an. Anzeichen einer

klinischen Erkrankung zeigten sich nur bei den Hennen der ungeimpften

Kontrollgruppe, ebenso konnten in dieser Gruppe eine Zunahme von Abweichungen

in der Größe, Form und Schalenqualität der Eier festgestellt werden. YODER und

HOPKINS (1985) konnten keine Unterschiede bei der Reisolation von MG feststellen.

KLEVEN (1985) untersuchte, ob nach einer Impfung mit der kommerziell erhältlichen

Vakzine MG-Bac® (Salsbury Lab. Charles City, Iowa, USA) sich die Anzahl von

Mykoplasmen in der Trachealschleimhaut nach einer experimentellen

Belastungsinfizierung mit MG vermindert. Hierzu bildete er drei Gruppen mit je 75

SPF-Küken, die aus normalen Feldherden stammten. Die erste Gruppe wurde in der

15. und 19. Lebenswoche, die zweite Gruppe nur einmalig in der 19. Lebenswoche

geimpft. Die Impfdosis betrug jeweils 0,5 ml und wurde subkutan verabreicht. Eine

Gruppe von 75 Hühnern blieb als Kontrollgruppe ungeimpft. In der 23. Lebenswoche

wurden alle Hühner mit je 1,5 x 105 KBE/Tier des MG-Stammes R intratracheal

infiziert. Von jeweils 20 Tieren jeder Gruppe wurden in der 15., 19. und 23. Woche

Blut entnommen und mittels SSA und HAH auf MG-Antikörper untersucht. Zufällig

ausgewählte Tiere wurden im Verlauf des Versuches seziert. Bei den vakzinierten

27

Hühnern konnte bis zur achten Woche p.i. eine quantitativ geringere Kolonisation der

Trachea mit Mykoplasmen festgestellt werden, jedoch waren die Unterschiede im

Verhältnis zur Kontrollgruppe nicht signifikant. Ab der achten Woche p.i. bis zum

Versuchsende 28 Wochen p.i. konnte KLEVEN (1985) keine Unterschiede mehr

feststellen.

In Fortführung seiner Arbeiten aus dem Jahre 1983 überprüfte HILDEBRAND (1985)

den Schutz vor einer Mykoplasmose bei Küken und Legehennen nach einer Impfung

mit der inaktivierten Öl-Adjuvans-Vakzine MG-Bac® (Salsbury Lab. Charles City,

Iowa, USA). Für seine Laborstudien verwendete er sowohl SPF-Küken als auch

kommerziell erhältliche Broilerküken. Diese wurden in den Versuchen

unterschiedlichen Vakzinations- und Infektionsprozeduren unterzogen. Die EBI

erfolgte in den rechten Infraorbitalsinus mit dem MG-Stamm R, die Infektionsdosis

lag zwischen 2 x 104 und 1 x 105 KBE/Tier. Jeweils sieben Tage nach der Inokulation

des Agens wurden die Hühner auf klinische Erkrankung, d. h. auf die

Nachweisbarkeit eines nasalen Exsudates untersucht. In diesen Versuchen zeigte

sich, daß die SPF-Küken, welche in der ersten Lebenswoche geimpft worden waren,

vor einer MG-bedingten Erkrankung geschützt waren. Dieser Schutz war bei Gabe

der vollen Impfstoffdosis von 0,5 ml mit 95 % Schutz vier Wochen nach der

Infizierung besser ausgeprägt als bei der Gabe von nur 0,2 ml (80 %). Die Impfung

von zuvor mit MG-Feldstamm infizierten Hühnern bewirkte einen vollständigen

Schutz vor einer vier Wochen später stattfindenden EBI mit 1 x 105 Mykoplasmen.

Die Dokumentation der Feldversuche erscheinen identisch mit denen, die ZOLLI

(1984) veröffentlichte. Bei dem Vergleich der mit MG-Bac® (Salsbury Lab. Charles

City, Iowa, USA) geimpften Herden mit den Herden, die mit der Lebendvakzine

(Conn. F-Stamm) geimpft wurden, unterließ HILDEBRAND (1985) allerdings die

Darstellung des Feldversuches, in dem die mit dem MG-Stamm F geimpfte Herde in

dem Zeitraum von 60 Wochen eine um sieben Eier höhere Legeleistung aufwies.

Die vertikale Übertragung von Mykoplasmen stellte für SASIPREEYAJAN et al.

(1985) das Arbeitsfeld dar. Zur Herstellung des inaktivierten Öl-Adjuvans-Impfstoffes

verwendete er den MG-Stamm R. In einem vierwöchigem Abstand erfolgte eine

zweimalige Vakzination von seropositiven Elterntiere im Alter von 12 bis 20 Wochen.

28

Die Dosis betrug 0,5 ml und wurde subkutan verabreicht. Diese Vakzination erfolgte

in zwei aufeinander folgenden Generationen. Die Hühner der dritten Generation

wurden nicht vakziniert. Von den Legehennen der zweiten Generation wurden in der

33. Lebenswoche 36 Eier kulturell auf MG untersucht. In keinem der untersuchten

Eier fanden SASIPREEYAJAN et al. (1985) Mykoplasmen. Von den Hühnern der

dritten Generation wurden am ersten Lebenstag, in der sechsten, elften, und 31.

Lebenswoche stichprobenartig Blutproben für die serologische Untersuchung

entnommen. In der 16. Lebenswoche entnahmen SASIPREEYAJAN et al. (1985)

von allen 700 Hühnern dieser Studie Blutproben. In keinem der untersuchten Seren

konnten sie spezifische Antikörper gegen MG nachweisen. SASIPREEYAJAN et al.

(1985) hielten es für möglich, durch dieses Impfverfahren MG aus Kleinbeständen

und Ziervogelzuchten zu eliminieren.

Der Schutz vor einer Kolonisation der Trachea mit Mykoplasmen des R-Stammes

beschäftigte TALKINGTON und KLEVEN (1985). Hierzu untersuchten sie 164

kommerziell erhältliche MG-freie Legehennen. Für ihre Experimente teilten sie die

Hennen in drei Gruppen auf. Die erste Gruppe wurde im Alter von 16 und 20 Wochen

mit 0,5 ml MG-Bac® (Salsbury Lab. Charles City, Iowa, USA) intramuskulär geimpft.

Die zweite Gruppe erhielt lediglich eine Impfung in der 20. Lebenswoche, die dritte

Gruppe diente als ungeimpfte Kontrolle. In der 24. Lebenswoche wurden die Hühner

mit 0,1 ml verschiedener Verdünnungen einer Kultur des R-Stammes von MG

intratracheal infiziert. Die Anzahl der Mykoplasmen betrug in der 10-4 Verdünnung

15000 KBE/Tier und in der 10-9 Verdünnung 0,15 KBE/Tier. Drei Tage nach der

erfolgten Infizierung wurden die Tiere getötet und kulturell untersucht. Im Vergleich

der einzelnen Gruppen konnte festgestellt werden, dass bereits 15 KBE als

„Minimale Infektiöse Dosis“ (MID) ausreichten, um die Hühner der Kontrollgruppe mit

MG zu infizieren. Die MID lag für die einmalig geimpften Hühner bei 150 KBE bzw.

bei 1500 KBE nach der zweifachen Vakzination. Ebenso betrug die ID50 für die

einzelnen Gruppen 794, 2512 und 5012 KBE.

Im Gegensatz zu HILDEBRAND (1985) konnten KHAN et al. (1986) nicht feststellen,

daß eine einmalige Impfung mit dem Impfstoff MG-Bac® (Salsbury Lab., Charles City,

Iowa, USA) bei den geimpften Hennen zu einem signifikanten Schutz vor einer

29

Legeleistungsminderung durch eine Infektion mit Mycoplasma gallisepticum führte. In

einen Betrieb, in welchem Legehennen in fünf verschiedenen, latent mit MG

infizierten Altersgruppen gehalten wurden, wurden einen Monat nach der Ausstallung

der ältesten Gruppe 7700 neue Legehennen eingestallt. Die benachbarten Gruppen

waren vor der Einstallung der neuen Legehennen mit MG infiziert. 3400 Hennen

wurden zum Zeitpunkt der Aufstallung in der 19. Lebenswoche mit Impfstoff MG-

Bac® (Salsbury Lab., Charles City, Iowa, USA) vakziniert. 4300 Hühner dienten als

ungeimpfte Kontrollgruppe. Durch den Nachweis spezifischer Antikörper gegen MG

im Serum der ungeimpften Kontrolltiere in der 26. Lebenswoche stellen KHAN et al.

(1986) fest, dass die Legehennen sich auf natürlichem Weg infiziert hatten. Der

kulturelle Nachweis von MG gelang ihnen jedoch erst in der 48. Lebenswoche in

beiden Gruppen. Zeitgleich stellten sie in beiden Gruppen Anzeichen einer

respiratorischen Erkrankung fest, ohne diese genauer zu beschreiben. Signifikante

Unterschiede in der Legeleistung waren im Verlaufe des Versuches nicht zu

erkennen.

KARACA und LAM (1986) verglichen die Auswirkung einer Vakzination mit dem

temperatursensitiven MG-Stamm TS 100 in seiner lebenden Form mit der

inaktivierten Variante des Impfstoffes in Bezug auf einen Schutz vor

Luftsackentzündungen. Für diese Versuche verwendeten sie kommerziell erhältliche,

MG-freie Küken. Im Alter von einer Woche wurden auf unterschiedliche Weise

geimpft: intranasal mit 0,1 ml TS 100 lebend (3x107 KBE/0,1ml), subkutan mit 0,1 ml

TS 100 lebend (3x107 KBE/0,1ml), intranasal mit 0,2 ml TS 100 inaktiviert (2,25x109

KBE/0,1 ml) und subkutan mit 0,5 ml TS 100 inaktiviert (2,25x109 KBE/0,1 ml). Zwei

Gruppen blieben zur Kontrolle der Versuchsergebnisse ungeimpft. Drei Wochen

nach der Impfung wurden die Küken durch die Applikation von 1x104 KBE des MG-

Stammes S6 in die Luftsäcke infiziert. Eine Woche später wurden die Probanden

getötet und pathologisch-anatomisch untersucht. KARACA und LAM (1986) fanden

deutliche Unterschiede in der Schutzwirkung der einzelnen Impfverfahren. So wies

nur eines von 54 Küken, welches intranasal mit der Lebendvariante des Impfstoffes

TS 100 geimpft worden war, Luftsackentzündungen auf. Durch die subkutane

Applikation der Lebendvariante erzielten sie eine Schutzwirkung von 81 %,

30

respektive 85 % bei Verwendung des inaktivierten Impfstoffes. Die intranasale

Verabreichung der inaktivierten Impfstoffvariante schützte dagegen nur

unzureichend (44 %) gegen Luftsackentzündungen. In den ungeimpften

Kontrollgruppen wiesen 93 % bzw. 70 % der Küken eine Woche nach der EBI eine

Luftsackentzündung auf. Die Bemühungen von KARACA und LAM (1986), aus

unveränderten Luftsäcken von Küken, die intranasal mit der Lebendvariante von TS

100 geimpft worden waren, Mykoplasmen des S6-Stammes zu isolieren, schlugen

fehl.

Mit demselben Versuchsaufbau testeten KARACA und LAM (1987) in zwei

Versuchsdurchgängen auch die Schutzwirkung des Impfstoffes MG-Bac® (Salsbury

Lab. Charles City, Iowa, USA). Sie verabreichten eine Impfstoffmenge von 0,5 ml

subkutan im Nacken. Drei Wochen nach der Impfung wurden die Küken mit 1x104

Mykoplasmen des S6-Stammes experimentell infiziert. Eine Woche später wurden

die Küken getötet und pathologisch-anatomisch untersucht. In den Impfgruppen

stellten KARACA und LAM (1987) lediglich bei 10 % bzw. 9 % der Küken

Luftsackentzündungen fest. Für die Kontrollgruppe gaben sie den Anteil der Küken

mit Luftsackentzündungen mit 63 % und 83 % an, diese Unterschiede sind in beiden

Versuchen statistisch hochsignifikant.

YAGIHASHI et al. (1987) untersuchten die Schutzwirkung einer inaktivierten

Aluminiumhydroxid-Vakzine. Für den Versuch wurden 96 SPF-Hühner der Rasse

„White Leghorn“ aus der eigenen Versuchsaufzucht verwendet, welche bei

Versuchsbeginn fünf Wochen alt waren. Die Impfgruppen wurden zweimalig geimpft,

eine Gruppe zweimal im Abstand von 14 Tagen intramuskulär, die andere

intramuskulär und intratracheal. Die Kontrollgruppe wurde nicht vakziniert. Zur

Herstellung der Vakzine und zur Infizierung wurde der SAS-Stamm verwendet, die

Konzentration der Mykoplasmen vor der Inaktivierung mit 0,1 % Formalin betrug

annähernd 109 KBE/ml. Eine Woche nach der letzten Impfung wurden alle Tiere mit

0,5 ml Mykoplasmensuspension (107 KBE/Tier) intratracheal infiziert. Vier, sieben

und 14 Tage nach der Infizierung wurden Hühner aus den Versuchsgruppen getötet,

die Tracheen in Formalin fixiert und mikroskopisch untersucht. Die Veränderungen in

der Trachealschleimhaut wurden in einer Skala von 0 bis 3 bewertet. Bei beiden

31

Impfgruppen konnten deutlich weniger entzündliche Läsionen in der Trachea durch

Mycoplasma gallisepticum festgestellt werden. Sieben Tage p.i. lag der

durchschnittliche Wert für die festgestellten Trachealläsionen für die zweimal

intramuskulär geimpfte Gruppe bei 1,0 und für die intramuskulär und intratracheal

geimpfte Gruppe bei 0,3. Im Vergleich mit der Kontrollgruppe (2,0) ergab sich für die

kombiniert geimpfte Gruppe ein signifikanter Schutz gegen entzündliche Läsionen in

der Trachealschleimhaut. Gleichzeitig wurden in den Trachealspülproben auch

signifikant weniger Mykoplasmen reisoliert.

Die Schutzwirkung von liposomalen Vakzinen vor einer Infektion der Trachea nach

einer experimentellen Infizierung mit Mycoplasma gallisepticum untersuchten

BARBOUR et al. (1987). In dem Versuch wurden Hühnergruppen, die mit sechs

unterschiedlichen liposomalen Impfstoffpräparationen und zwei Öl-Emulsions-

Vakzinen geimpft worden waren, mit den Hühnern einer ungeimpften Kontrollgruppe

verglichen. Jeweils eine von zwei identischen Impfstoffpräparationen wurde mit

Ultraschall behandelt. Bei diesem Versuch wurden 56 MG-freie Küken aus

kommerzieller Aufzucht verwendet. Zur Herstellung der Vakzine wurde der R-Stamm

benutzt. Die Impfung der Hühner erfolgte im Alter von 13 und 17 Wochen mit jeweils

einer Impfstoffmenge von 0,5 ml/Tier. Die Belastungsinfizierung erfolgte mit dem

homologen Stamm, intratracheal mit 17800 KBE/Tier. 72 Stunden nach der EBI

wurden die Hühner getötet und seziert. BARBOUR et al. (1987) fertigten

histologische Schnitte der Trachea zwischen dem ersten und fünften Trachealring

an, machten aber keine Angaben zur Beurteilung dieser histo-pathologischen

Untersuchungen. Die Schutzwirkung der einzelnen Impfstoffpräparationen war sehr

unterschiedlich, drei Gruppen zeigten einen guten Schutz gegen die Infektion der

Trachealschleimhaut. Hierzu gehörten zwei Gruppen (Gruppen 2 und 3), die mit

liposomalen Impfstoffen geimpft worden waren. 14 Tage nach der Infizierung

konnten nur bei jeweils einem von sechs Hühnern (16,67 %) MG aus der Trachea

isoliert werden. Auch in der Gruppe 8, die mit der nicht mit Ultraschall behandelten

Öl-Emulsions-Vakzine geimpft worden war, fand sich nur bei drei von acht Hühnern

(37,5 %) MG. Die Gruppe 3 war die einzige, in welcher bei keinem Huhn

Veränderungen in der Trachealschleimhaut festgestellt werden konnte. Ebenso wies

32

diese Gruppe die im Verhältnis zur Kontrollgruppe signifikant höchsten

Antikörpertiter im Respirationstrakt gegen MG auf.

SASIPREEYAJAN et al. (1987) prüften, ob durch eine inaktivierte MG-Vakzine ein

Schutz vor Legeleistungsminderung und transovarieller Übertragung nach einer EBI

mit MG erzielt werden kann. Für diese Untersuchungen verwendeten sie 49 MS- und

MG-freie Legehennen unbekannter Herkunft. Eine Impfgruppe wurde in der 19. und

23., die andere nur in der 23. Lebenswoche im Bereich der Schädelbasis subkutan

mit 0,5 ml geimpft. Zur Herstellung der Vakzine und für die Infizierung wurde der MG-

Stamm R verwendet. In der 27. Lebenswoche wurden beide Impfgruppen und die

Kontrollgruppe infiziert. Es wurden jeweils 0,1 ml Inokulum in den linken kaudalen

thorakalen Luftsack und 0,1 ml in den linken Infraorbitalsinus verabreicht. Die

Konzentration der Mykoplasmen in der Suspension betrug 1,3 x 107 KBE/ml. Zum

Zeitpunkt der Infizierung lag die Legeleistung bei allen drei Gruppen bei 90 %.

Binnen zweier Wochen fiel die Legeleistung der Kontrollgruppe auf 40 % ab und

stieg bis zum Versuchsende, sieben Wochen nach der EBI, nur auf 69 % an. In

beiden Impfgruppen war nur eine Legeleistungsminderung um ca. 5 % festzustellen.

Die Impfgruppen zeigten nach der experimentellen Infizierung eine signifikant höhere

Legeleistung. Im Zeitraum von sieben Wochen p.i. lag die Legeleistung der einmal

vakzinierten Gruppe mit 84,63 % über der jeweiligen der nur zweimal geimpften

Gruppe (79,97 %) und der Kontrollgruppe (60,33 %). In der Kontrollgruppe stellten

vier Hennen ihre Legetätigkeit ein, in den Impfgruppen war dies nur bei einem Tier

der Fall. Auch bei der Übertragung von Mykoplasmen auf die Eier zeigten sich

signifikante Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen. So konnten

SASIPREEYAJAN et al. (1987) bei 45,9 % der Eier der Kontrollgruppe MG von der

Dottermembran isolieren. Dieser kulturelle Nachweis war nur bei 38,55 % der Eier

der einmal vakzinierten Gruppe bzw. bei 17,65 % der zweimal vakzinierten Gruppe

möglich. Sieben Wochen nach der Infizierung fanden SASIPREEYAJAN et al. (1987)

nur in einem von zehn untersuchten Eileitern der zweimal geimpften Hennen MG. In

der einmal geimpften Gruppe war dies bei zwei, in der Kontrollgruppe bei acht von

zehn Eileitern der Fall. Auch BARBOUR und NEWMAN (1990) untersuchten die

Wirksamkeit verschiedener Präparationen von MG-Impfstoffen anhand der

33

Legeleistung und Eiübertragung von MG nach einer Belastungsinfizierung mit dem

homologen Stamm. Sie verglichen die Wirkung von zwei Öl-Emulsions-Vakzinen und

zwei liposomalen, positiv geladenen Vakzinen. Jeweils eine dieser Präparationen

erhielt einen Zusatz von Salmonella typhimurium - Zellwandprotein (STP). Die

Vakzination der 32 MG-freien Legehennen erfolgte in der 13. und 17. Lebenswoche.

Zwei Kontrollgruppen wurden nicht geimpft und wiederum eine von diesen auch nicht

infiziert. Die EBI mit dem R-Stamm wurde in der 21. Lebenswoche durch die Injektion

von jeweils 1,3 x 105 KBE/Tier in den rechten und linken Brustluftsack durchgeführt.

Die Legeleistung der einzelnen Gruppen wurde für den Zeitraum von zwei Monaten

p.i. dokumentiert. Die Vittelinische Membran der Eier, die jeweils an den beiden

letzten Tagen einer Woche gelegt wurden, wurde kulturell auf MG untersucht.

Angaben zur Legeleistung der Hennen vor der EBI machten sie nicht. Im ersten

Monat nach der Infizierung lag die Legeleistung der mit der liposomalen Vakzine

ohne STP geimpften Hennen bei 87,1 % und die der mit der Öl-Emulsions-Vakzine

ohne STP bei 82,1 %. Dieser Abfall war nicht signifikant gegenüber der Legeleistung

der ungeimpften und nicht infizierten Kontrollgruppe (88,0 %). Im Vergleich mit einer

infizierten Kontrollgruppe war dies ein signifikanter besserer Schutz vor einer

Legeleistungsminderung. Die Legeleistung der beiden Gruppen, bei denen das

Salmonella typhimurium - Zellwandprotein zum Impfstoff hinzugefügt worden war, fiel

im ersten Monat nach der Infektion auf ca. 65 % ab. Diese Unterschiede

verringerten sich im zweiten Monat p.i.. Die transovarielle Übertragung von MG war

in allen geimpften Gruppen im zweiten Monat signifikant geringer als in der

Kontrollgruppe. BARBOUR und NEWMAN (1990) werteten dies als Anzeichen dafür,

dass durch Impfung der Hennen eine Reduktion der transovariellen Übertragung von

MG erzielt worden ist.

REFAI et al. (1990) untersuchten die Schutzwirkung einer inaktivierten MG-

Adjuvans-Vakzine (Aluminium-Kalium-Sulfat) in Abhängigkeit von der

Applikationsroute. Als Maßstab für die Bewertung gaben sie klinische Symptome und

post mortem festgestellte Veränderungen an, die sie jedoch nicht genauer

beschrieben. Für die Experimente verwendeten sie 540 kommerziell erhältliche

Mycoplasma spp.-freie Hühner. Sie verglichen die Schutzwirkung des Impfstoffes bei

34

Tieren, die zum Zeitpunkt der Impfung unterschiedlich alt waren: einen Tag (n=160),

eine Woche (n=120), zwei Wochen (n=100), vier Wochen (n=80) und sechs Wochen

(n=42). Jede dieser Altersstufen wurde wiederum in Subgruppen unterteilt, die sich

durch die Applikationsart (i.m.,s.c.,i.n.) unterschieden. Ein Teil der Hühner blieb als

Kontrollgruppe ungeimpft. Die Hühner wurden mit 0,2 ml des Impfstoffes geimpft und

zwei Wochen danach mit dem homologen MG-Stamm S6 infiziert. Angaben darüber,

welches Volumen der Suspension mit 2x108 KBE/ml für die Infizierung verwandt

wurde, machten REFAI et al. (1990) nicht. Sie stellten fest, daß der „beste Schutz“

durch die intramuskuläre Applikation des Impfstoffes bei Hühnern im Alter von einer

Woche zu erzielen war. Bei 93,3 % der Hühner fanden sie p.m. keine Läsionen.

REDMANN und GÖBEL (1991) berichteten von unterschiedlichen Erfolgen bei der

Impfung mit einer inaktivierten Vakzine, um Legeleistungsminderungen durch MG zu

reduzieren. In vier von ihnen ausgewählten Betrieben (Betriebe A, B, C, D), in denen

Hennen unterschiedlichen Alters gehalten wurden, lag die Legeleistung deutlich

unter der Norm, die von den Zuchtgesellschaften angegeben wurden. MG-

Infektionen waren in diesen Herden mittels SSA mehrfach nachgewiesen worden. In

Betrieb „D“ stellten sie überdies in der 34. und 35. Lebenswoche einer Legegruppe

eine klinisch manifeste Mykoplasmose fest. Die Verluste durch die latente Infektion

mit MG wurden für den Betrieb „A“ mit ca. DM 22500.- im Zeitraum der letzten fünf

Jahre angegeben. Der Geflügelgesundheitsdienst Gießen empfahl den

Betriebsleitern, nur noch Junghennen in ihre Betriebe einzustallen, die drei bis vier

Wochen vor der Ankunft in ihrem Betrieb einmal mit einer inaktivierten MG-Vakzine

geimpft worden waren. Maßstab für den Erfolg der Impfung war die Legeleistung. Die

Ergebnisse wurden nur anhand der Legeleistungsstandards der Zuchtgesellschaften

bewertet. Im Betrieb „A“ verlief die Legeleistungskurve der geimpften Herde trotz

eines geringen Einbruchs (ca. 4 %) in der 28. Lebenswoche entsprechend der

vorgegebenen Standardkurve. Insgesamt lag die Legeleistung der geimpften Herden

im Zeitraum von 52 Wochen 14 % über den Legeleistungen der zuvor in diesem

Betrieb gehaltenen nicht vakzinierten Gruppen. Auch im Betrieb „B“ entsprach die

Legeleistung zweier neu eingestallter geimpfter Gruppen den erwarteten

Normwerten. Durch die Einstallung geimpfter Junghennen in den Betrieb „C“

35

verbesserte sich die Situation, jedoch ohne dass diese Herden die Normwerte

erreichten. Ein Grund hierfür war möglicherweise der Ausbruch der tumorösen Form

der Marek´schen Krankheit, die erhebliche Verluste verursachte. Im Betrieb „D“

hingegen hatte die Impfung nicht den gewünschten Effekt. Auch bei den beiden neu

eingestallten geimpften Herden kam es in der 30. Lebenswoche zu einem Rückgang

der Legeleistung um 5 bis 10 %. REDMANN und GÖBEL (1991) vermuteten, dass

die unterschiedliche Virulenz der MG-Stämme für den Mißerfolg in Betrieb „D“

verantwortlich gewesen ist.

BEHR et al. (1991) berichteten über Feldversuche, in denen Legehennen durch die

Impfung mit der inaktivierten Öl-Adjuvans-Vakzine „Talovac 104 MG“ (TAD

Pharmazeutisches Werk GmbH, Cuxhaven) vor Legeleistungsminderungen infolge

einer natürlichen Infizierung durch MG geschützt werden sollten. Die Versuche

wurden in Betrieben durchgeführt, in denen eine MG- und MS-Infektion serologisch

zuvor nachgewiesen worden waren. In den drei Ablegebetrieben (H, B, L) wurden

jeweils zeitgleich braune und weiße Hennen in zwei (L) respektive drei (H, B)

Altersgruppen gehalten. Die Junghennen stammten aus MG-freien

Aufzuchtbetrieben. In den Betrieb H wurden für die Versuche 340, in den Bestand B

1404 und in den Bestand L 400 Hennen eingestallt. Die Hälfte von ihnen wurde in

der 16. und 20. Lebenswoche (Betrieb H) bzw. 12./13. und 17./18. Lebenswoche

(Betriebe B, L) mit 0,5 ml des Impfstoffes subkutan im Nacken geimpft. Die andere

Hälfte der einzustallenden Hennen verblieb jeweils als Kontrollgruppe ungeimpft. Die

Legeleistung sowie die Tierverluste wurden in allen drei Beständen täglich

protokolliert. Zusätzlich wurden in den Beständen zunächst in drei-, später in

sechswöchigem Abstand Blutproben entnommen, um den Zeitpunkt einer MG-

Feldinfektion bei den ungeimpften Kontrolltieren feststellen zu können. Im Betrieb H

verzögerte sich der Legebeginn bei den geimpften Hennen. Die Legeleistungskurven

der Gruppen glichen sich aber an, so daß zwischen der 26. und 46. Lebenswoche

keine Unterschiede mehr im Verlauf der Legeleistungskurven zu erkennen waren.

Eine Infizierung mit MG konnten BEHR et al. (1991) bei den braunen Legehennen ab

der 26. und bei den weißen Legehennen ab der 32. Lebenswoche serologisch

nachweisen (HINZ et al. 1991). In der 47. Woche beginnend kam es - bei den

36

weißen Hennen deutlicher als bei den braunen - zu einer Legeleistungsminderung in

den ungeimpften Kontrollgruppen. BEHR et al. (1991) vermuteten, dass die bei der

Ausstallung einer älteren Hennengruppe verbundene Belastung der Tiere

disponierend eine Rolle gespielt hat. Bis zur Ausstallung der Versuchsgruppe in

Betrieb H in der 68. Lebenswoche legten die geimpften weißen Hennen mit 252

Eiern 22 Eier mehr als die Kontrollgruppe. Der Unterschied bei den braunen Hennen

betrug 254 zu 256 Eier. Auch im Betrieb B zeigten sich Unterschiede in der

Legeleistung nur zwischen der Impf- und der Kontrollgruppe bei den weißen Hennen.

Auch in diesem Betrieb kam es zu einem Einbruch der Legeleistung der ungeimpften

weißen Hennen ab der 43. Lebenswoche. In den 65 Legewochen legten die

geimpften weißen Hennen 337 Eier und damit 22 mehr als die Hennen der

ungeimpften Kontrollgruppe. Auch in diesem Betrieb gab es bei den braunen

Legehennen kaum Unterschiede in der Legeleistung zwischen geimpften (301) und

ungeimpften Hennen (297). Im Betrieb L kam es dagegen zu einer langanhaltenden

Legeleistungsminderung der ungeimpften braunen Hennen. Ab der 35. Lebenswoche

konnten in allen entnommenen Blutproben spezifische Antikörper gegen MG

nachgewiesen werden. Nach der Einstallung neuer Junghennen in den Betrieb kam

es in allen Versuchsgruppen zu einem Rückgang der Legeleistung, von welchem

sich die braunen ungeimpften Hennen nicht wieder erholten. So legten die geimpften

braunen Hennen in 66 Legewochen 27 Eier mehr (355 zu 328) als die ungeimpften

Kontrolltiere. Bei den weißen Hennen war in diesem Betrieb kein Unterschied

zwischen geimpften (366) und ungeimpften (365) Tieren zu erkennen. Diese

Ergebnisse sprechen nach Ansicht von BEHR et al. (1991) dafür, dass die Impfung

vor einer Legeleistungsminderung durch MG geschützt hat. Die Unterschiede

zwischen den Legeleistungskurven der braunen und weißen Legehennen ließen sich

durch die bekannte, unterschiedliche Sensibilität von braunen und weißen

Legehennen gegenüber definierten Stressoren infektiöser (NDV, AIBV, E. coli) und

nicht infektiöser Art (Temperatur, Staub, Schadgase) erklären.

YAGIHASHI et al. (1992) verglichen Hühner zweier verschiedener Zuchtlinien, die

„high responder line“ GSP mit der „low responder line“ BM-C, deren schwächere

Antikörperbildung auf eine Infizierung mit MG bekannt ist. Die MG-freien Küken

37

bezogen sie im Alter von sechs Wochen aus einer speziellen Laboratoriumsaufzucht.

Zunächst wurden die Hühner mit inaktivierter Adjuvans-Vakzine intramuskulär

geimpft. 14 Tage später erfolgte eine Boosterung durch eine intratracheale Gabe des

Impfstoffes ohne Adjuvans. Wiederum eine Woche nach der zweiten Impfung wurden

die geimpften Hühner und ungeimpfte Kontrolltiere gleichermaßen durch die

intratracheale Gabe von 0,5 ml Suspension mit 1x106 Mykoplasmen des SAS-

Stammes infiziert. Die histo-pathologischen Veränderungen in den Tracheen und die

Veränderungen der Luftsäcke wurden post mortem in einer vierstufigen

Bewertungsskala auf Grundlage eines numerischen Punktesystems klassifiziert. Zum

Vergleich der Impf- und Kontrollgruppen wurde das arithmetische Mittel der

einzelnen Werte gebildet. Die von YAGIHASHI et al. (1992) vorgenommene Art der

Vakzination schützte die geimpften Hühner beider Linien weitgehend vor einer

Infektion der Luftsäcke durch MG. So konnten bei allen Hühnern der Kontrollgruppe

vier Tage nach der Inokulation in allen untersuchten Luftsäcken Mykoplasmen

reisoliert werden. Dies gelang YAGIHASHI et al. (1992) jedoch nur bei zwei Hühnern

der GSP- und bei vier Hühnern der BM-C-Linie (n=6). Auch Luftsackentzündungen

stellten sie sieben Tage nach der Infizierung bei den geimpften Hühnern seltener

fest. Von sechs untersuchten Hühnern der GSP-Impfgruppe wies nur eines

Anzeichen einer Luftsackentzündung auf. In der Kontrollgruppe traten bei allen sechs

Hühnern Luftsackentzündungen auf. Allgemein war der Impferfolg in der GSP-Linie

„deutlicher“ ausgebildet als in der BM-C-Linie. Dies deckte sich auch mit den

Ergebnissen der serologischen Untersuchungen. YAGIHASHI et al. (1992) vertraten

die Auffassung, dass lokale Antikörper eine wichtige Rolle bei der Immunabwehr vor

einer respiratorischen Erkrankung infolge einer EBI mit MG spielen.

ELFAKI et al. (1992) untersuchten die Wirksamkeit einer inaktivierten MG-Vakzine

mit und ohne Iota carrageenan (iCGN) als Adjuvans in verschiedenen

Konzentrationen im Vergleich mit der kommerziell erhältlichen Vakzine MG-bac®

(Salsbury Lab., Charles City, Iowa, USA) und einer Kontrollgruppe. Darüber hinaus

prüften sie den Einfluß der Applikationsart auf den Impferfolg. Für die Versuche

verwendeten sie Mycoplasma spp.-freie männliche Eintagsküken, die sie aus einer

örtlichen Zucht erhielten. Die Impfungen erfolgten in der dritten und fünften

38

Lebenswoche. Die MG-Vakzine mit iCGN wurde bei der ersten Impfung intrazölomal

(i.c.) und bei der zweiten Vakzination intrabursal (i.b.) verabreicht. In allen drei

Versuchen wurden die Küken in der siebten Lebenswoche via Aerosol mit dem MG-

Stamm R belastet. Für die serologischen Untersuchungen wurden jeweils zwei

Wochen nach den Impfungen bzw. zwei Wochen nach der Belastungsinfizierung

Blutproben und Trachealspülproben entnommen. Für die kulturelle Untersuchung auf

MG nach der Infizierung wurde ein Trachealabstrich von den Hühnern gemacht. 14

Tage nach der EBI wurden die Küken getötet und die Luftsackveränderungen im

Rahmen einer pathologisch-anatomischen Untersuchung protokolliert sowie in einer

Skala von 0 bis 4 bewertet. Für jede Gruppe wurde ein Mittelwert gebildet und dieser

durch den theoretisch zu erzielenden LSE-Maximalwert dividiert. Dabei entspricht der

LSE-Wert von 1,0 den maximal möglichen pathologisch-anatomischen

Veränderungen. Die intrazölomale Impfung mit dem inaktivierten MG-Impfstoff mit

0,2 % iCGN und der anschließenden intrabursalen Boosterung schützte die Küken

am besten vor der Belastungsinfizierung. Der LSE-Wert betrug für die geimpfte

Gruppe nur 0,15. Bei 75 % dieser Küken konnten ELFAKI et al. (1992) keine

Luftsackentzündung feststellen. Dieser Wert war im Vergleich mit der Kontrollgruppe

signifikant besser. Die Impfung mit MG-bac® (Salsbury Lab., Charles City, Iowa,

USA) schützte 50 % der Küken vor Luftsackentzündungen; den LSE dieser Gruppen

gaben sie mit 0,40 an.

Die Auswirkung von Vakzination und EBI mit Mycoplasma gallisepticum bei MG-

freien Legehennen untersuchten EVANS et al. (1992 a). Sie verglichen in drei

Experimenten mit verschiedenen inaktivierten Vakzinen oder mit Lebendvakzinen

geimpfte Gruppen mit einer Kontrollgruppe. Hierzu wurden die Impfgruppen einmalig

in der zehnten Lebenswoche bzw. zum Teil zweimalig in der 10. und 16.

Lebenswoche vakziniert. Die Tiere wurden in der 29. bzw. 30. Lebenswoche mit dem

MG-Stamm R in form eines erregerhaltigen Aerosols infiziert; die hierzu verwendete

Mykoplasmensuspension enthielt 107 KBE je Huhn. Die Hühner aller Gruppen

zeigten nach dieser Belastungsinfizierung einen Einbruch in der Legeleistung binnen

drei bis sieben Tagen. Die Legeleistung der drei Kontrollgruppen betrug im

Durchschnitt vor der Infizierung 88,7 % und fiel infolge der EBI mit MG auf 26 % ab.

39

Der Unterschied in der Legeleistungsminderung war im ersten Versuch zwischen

Kontroll- und Impfgruppe nicht signifikant. Im Vergleich der Wirksamkeit zwischen

einem inaktivierten Impfstoff, der aus einem „Isolat reduzierter Virulenz (RVI)“

hergestellt worden war, der kommerziell erhältlichen Vakzine MG-bac® (Salsbury

Lab., Charles City, Iowa, USA) und einer Kontrollgruppe fiel die Legeleistung der

Kontrollgruppe am stärksten (von 85,14 % auf 39,8 %) ab. In der Gruppe, die mit

dem inaktivierten RVI-Impfstoff vakziniert worden war, verzeichneten EVANS et al.

(1992 a) eine Legeleistungsminderung von 81,5 % auf 50,6 %. Die dritte Gruppe

(MG-bac®) wies vor der Infizierung die höchste Legeleistung (90,07 %) auf. Sie fiel in

der Legeleistung auf 61,9 % ab. Diese Gruppe erholte sich am schnellsten von der

Legeleistungsminderung nach der EBI und erreichte wieder einen Wert von 84,23 %.

Dieser Schutz vor Legeleistungsminderung nach EBI durch MG war im Vergleich mit

der Kontrollgruppe signifikant.

ELFAKI et al. (1993) verglichen die Wirksamkeit von Mykoplasmenimpfstoffen in

Abhängigkeit von der Art der Applikation. Sie verwendeten MG-freie männliche

Küken aus kommerzieller Aufzucht. In einzelnen Gruppen wurden Kombinationen

von intrazölomaler (i.c.), intratrachealer (i.t.), intranasaler (i.n.), intravenöser (i.v.),

subkutaner (s.c.) und oraler Vakzination mit MG-Impfstoffen mit und ohne Iota

carrageenan (iCGN) als Adjuvans im Vergleich mit einer kommerziell erhältlichen

Vakzine und einer ungeimpften Kontrollgruppe geprüft. Die Erstimpfung der Küken

erfolgte in der dritten, die zweite Vakzination in der fünften Lebenswoche. Die

Versuchstiere wurden in der siebten Lebenswoche aerogen infiziert. In der zur

Infizierung verwendeten Mykoplasmensuspension (MG-Stamm R) befanden sich

mindestens 2,9x108 KBE/ml-1. Die Menge, die je Küken zur Infizierung verwandt

wurde, gaben ELFAKI et al. (1993) nicht an. Zwei Wochen nach der

Belastungsinfektion wurden die Küken getötet und pathologisch-anatomisch

untersucht. Die Veränderungen der Luftsäcke wurden auf einer Skala von 0 bis 4

bewertet und der LSE-Wert für jede Gruppe berechnet (ELFAKI et al. 1992). Im

Verlaufe des Versuches wurden von den Küken Blut- und Trachealspülproben

gewonnen und Abstriche aus der Trachea entnommen. Die Vakzination der Tiere

bewirkte eine deutlichen Schutz vor Luftsackentzündungen nach einer EBI mit dem

40

MG-Stamm R. Der LSE-Wert der Kontrollgruppe betrug 1,00 und erreichte damit den

maximal möglichen Wert. Für die Gruppen, die s.c. mit der kommerziell erhältliche

Vakzine geimpft worden waren, gaben ELFAKI et al. (1993) den LSE-Wert mit 0,05

an. Die Impferfolge mit dem Impfstoff, der iCGN als Adjuvans enthielt, waren

abhängig von der Applikationsart: So betrug der LSE nach i.c./i.n. Impfung 0,00,

nach i.c. Impfung 0,15 und nach i.c./i.t. Impfung 0,14. Der Impfschutz dieser vier

Gruppen war im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant höher. Die Anzahl der

reisolierten Mykoplasmen war in der Kontrollgruppe signifikant höher als in den

geimpften Gruppen. Dieser Unterschied fiel zwischen der Kontrollgruppe (7,41 log10

KBE/ml-1) und der mit der kommerziell erhältlichen Vakzine geimpften Gruppe (5,71

log10 KBE/ml-1) am deutlichsten aus.

ABD-EL-MOTELIB und KLEVEN (1993) untersuchten den induzierbaren Schutz

durch verschiedene Impfstoffe vor Luftsackentzündungen nach einer EBI mit dem

MG-Stamm R. Als Versuchstiere nutzten sie insgesamt 349 MG-freie Hühner der

Rasse „White Leghorn“. Sie verglichen die Effizienz dreier Lebendvakzinen der MG-

Stämme F, ts 11 und 6/85 und eines inaktivierten Impfstoffs (Intervet America) im

Vergleich mit einer ungeimpften Kontrollgruppe. Es wurden in dieser Studie - nicht

näher beschriebene - respiratorische Erscheinungen nach der Vakzination, die

serologische Immunantwort, die Persistenz der Impfstämme und das Ausmaß von

Luftsackentzündungen nach einer EBI bewertet. Die Küken wurden im Alter von 10

Tagen geimpft. Dies geschah bei den drei Lebendvakzinen via eye-drop und bei der

inaktivierten Vakzine durch eine subkutane Injektion. 30, 60 und 90 Tage nach der

Impfung wurden Hühner aus jeder Gruppe via Aerosol infiziert. Die für diese EBI

genutzte Suspension des R-Stammes enthielt 3,62x108 CCU/ml. 10 Tage p.i. wurden

die Hühner getötet und seziert. Die festgestellten pathologisch-anatomischen

Veränderungen der Luftsäcke wurden mit Hilfe einer Skala von 0 (keine Läsionen)

bis 4 (schwere Läsionen) klassifiziert. Nach der Vakzination mit dem F-Stamm kam

es bei den Hühnern dieser Gruppe zu „leichten respiratorischen Erscheinungen“.

Ähnliche Symptome stellten ABD-EL-MOTELIB und KLEVEN (1993) auch in der ts

11-, 6/85- und Kontrollgruppe nach der EBI fest. Die Reisolierung von Mykoplasmen

des F-Stammes gelang auch 90 Tage nach der Impfung aus den Tracheen aller

41

untersuchten Hühner. Mykoplasmen des ts-11-Stammes waren zu diesem Zeitpunkt

nur noch bei zwei von fünf Tieren und bei Mykoplasmen des 6/85-Stammes bei

keinem Tier nachzuweisen. Die Vakzination mit dem F-Stamm schützte die Hühner

„am besten“ vor Luftsackentzündungen. Die LSE-Werte dieser Gruppe waren in allen

drei Fällen mit 0,2, 0,2 und 0,1 am niedrigsten. Die Werte für die mit der inaktivierten

Vakzine geimpften Hühner lagen mit 1,2, 1,7 und 3,0 zum Teil sogar über denen der

Kontrollgruppe (1,5, 1,7 und 2,3). Die LSE-Werte der ts-11- bzw. 6/85-Gruppe lagen

bei 0,6, 1,9 und 1,3 bzw. 0,9, 1,2 und 2,0. In der Addition aller drei

Versuchsabschnitte ergab sich ein signifikant besserer Schutz vor

Luftsackentzündungen durch die Vakzination mit dem F-Stamm. ABD-EL-MOTELIB

und KLEVEN (1993) vertraten die Ansicht, dass die höhere Virulenz des

verwendeten F-Stammes mit der besseren Schutzwirkung vor Luftsackentzündungen

korreliert. Einen Schutz vor einer Infektion konnten sie nicht nachweisen. Die durch

die Impfung mit der inaktivierten Vakzine induzierten hohen Antikörpertiter im Serum

korrelierten nicht mit dem Schutz vor Luftsackentzündungen.

NAKAMURA et al. (1995) untersuchten den Einfluß der Applikationsart des

Impfstoffes auf die serologische Reaktion und den Schutz vor Trachealläsionen nach

einer Infizierung mit dem homologen MG-Stamm. Hierzu wurden SPF-Küken im Alter

von vier und sechs Wochen mit einer inaktivierten Vakzine, hergestellt mit dem SAS-

Stamm, intramuskulär, intratracheal, per os (in drei verschiedenen Konzentrationen)

und in den Kropf geimpft. Nach zwei Wochen wurden die Küken mit 1,0 ml

Phosphatpufferlösung, in welcher 106,6 KBE des MG-Stammes SAS suspendiert

waren, intratracheal infiziert und weitere zwei Wochen später getötet. Die

Schleimhautveränderungen der Tracheen wurden patho-histologisch untersucht, die

festgestellten Veränderungen wurden in einer Skala von 0 bis 3 klassifiziert und

Ergebnisse > 2 als positiv bewertet. Die intratracheale und intramuskuläre Impfung

der Küken ergab den besten Schutz (100%). Auch die orale Impfung mit 1011

inaktivierten Mykoplasmen schützte die Küken zu 100%, doch konnten NAKAMURA

et al. (1995) nicht ausschließen, dass ein Teil des verimpften Volumens (5 ml) bei

der Atmung in den Respirationstrakt gelangt war und dieses Impfverfahren somit

einer intratrachealen Vakzination entsprach. Diese Vermutung entsprach auch dem

42

Ergebnis, welches sie durch die direkte Applikation der Vakzine in den Kropf erzielt

hatten. Bei vier von sechs Küken, die sie auf diese Weise geimpft hatten, bildeten

sich Trachealläsionen aus. Dies entsprach den Werten, die bei der ungeimpften

Kontrollgruppe festgestellt worden waren.

2.3. MG-bedingte immunologische Reaktionen

Im folgenden Kapitel werden die Reaktionen des Immunsystems von Hühnern auf

eine Infektion mit Mycoplasma gallisepticum sowie die Befähigung von MG, sich

diesen Reaktionen zu entziehen, dargestellt.

ROBERTS et al. (1967) verglichen verschiedene Methoden (SSA, HAH und

Röhrchenagglutination (TA)) zum Nachweis spezifischer Antikörper gegen MG.

Hierzu infizierten sie MG- und MS-freie Hühner mit dem MG-Stamm Hy. Sie konnten

in der SSA, im HAH und der TA bis zur 28. Woche p.i. spezifische Antikörper gegen

MG nachweisen. Gleichzeitig stellen sie in den Untersuchungen der Seren der nicht

infizierten Kontrolltiere ihnen unerklärliche positive Reaktionen in der SSA und TA

fest. Ähnliche unspezifische Reaktionen im HAH ließen sich durch die Behandlung

der Blutserumprobe mit einem „receptor-destroying enzyme“ (RDE) von Vibrio

cholerae verhindern. Als Ursache für die von ihnen gefundenen unspezifischen

Reaktionen vermuteten ROBERTS et al. (1967) Kontaminationen des Serums oder

Kreuzreaktionen mit anderen Bakterien.

Bis zu vier Wochen nach einer Impfung von zehn Wochen alten, MG-freien Küken

gegen Erysipelothrix rhusiopathiae konnten auch VARDAMAN und YODER (1971)

unspezifische Agglutinationsreaktionen in der SSA gegen MG feststellen. Bei der

Überprüfung dieser Ergebnisse im HAHT wies jedoch keines der Seren spezifische

Antikörper gegen MG auf.

CULLEN und TIMMS (1972) berichteten von ähnlichen falsch positiven Ergebnissen.

Sie hatten MG-freie Hühner aus einer Laboraufzucht im Alter von drei, neun und 16

Wochen intramuskulär mit verschiedenen Vakzinen (ND, ND+IB, ND+IB+AE, AE)

geimpft oder ihnen reines Adjuvans bzw. eine Kombination von Adjuvans und Protein

43

injiziert. In der elften Lebenswoche stellten sie beispielsweise in der Gruppe, die mit

ND-Impfstoff vakziniert worden war, in neun von zwölf untersuchten

Blutserumproben eine positive Reaktion mit dem MG-Antigen fest. Auch in den

Serumproben von Hühnern, denen lediglich reines Adjuvans bzw. ein Gemisch von

Adjuvans und Protein injiziert worden war, fanden sie im Alter von 18 Wochen bei

jeweils drei Hühnern agglutinierende Antikörper, die in der SSA mit dem MG-Antigen

reagierten. In keinem der zur Kontrolle dieser Ergebnisse im HAH untersuchten

Seren konnten CULLEN und TIMMS (1972) spezifische Antikörper gegen MG

nachweisen.

Auch YODER (1989) untersuchte das Auftreten von unspezifischen Agglutinations-

reaktionen in der SSA für MG und MS nach Impfungen mit acht verschiedenen

Vakzinen. Für seine Versuche verwendete er acht Wochen alte SPF-freie Hühner

(Mycoplasma spp., NDV, IBV, AE und Marek). Die Agglutinationsreaktionen in der

SSA wurden in einer Skala von 0 bis 4 bewertet. Nach einer Vakzination mit

verschiedenen Kombinationsimpfstoffen (NDV+IBV+IBD+Reo-Virus, IBD+NDV) und

monovalenten Vakzinen gegen IBD, beispielsweise Coryza-vac® (Salsbury Lab.

Charles City, Iowa, USA), kam es bei der Untersuchung der Seren in der SSA mit

MG-Antigen zu „starken“ unspezifischen Reaktionen. Versuche zur Eliminination

dieser Reaktivität schlugen fehl, jedoch war das Auftreten nur vorübergehend

nachzuweisen. Sechs Wochen nach der Impfung mit Coryza-vac® (Salsbury Lab.

Charles City, Iowa, USA) war der Titer der unspezifischen Reaktionen wieder von 3,2

auf 0,2 abgefallen. Zu keinem Zeitpunkt seiner Versuche konnte YODER (1989) im

HAH spezifische Antikörpertiter gegen MG feststellen.

Bei weiteren Arbeiten über die serologischen Reaktionen nach einer MG-Infektion

verglich ROBERTS (1969) die Antikörperreaktion der MG-Stämme S 6, F und WS7

in der SSA und im HAH. Hierzu verwendete er sechs Wochen alte, MG- und MS-freie

Hühner. In drei Gruppen mit jeweils 14 Tieren aufgeteilt, wurden sie mit 0,5 x 107

Mykoplasmen der drei genannten Stämme intranasal infiziert. Im wöchentlichem

Abstand wurden je Gruppe zwei Hühner getötet und das Blut serologisch untersucht.

In den beiden ersten Wochen p.i. stellte ROBERTS (1969) überwiegend positive

Reaktionen in der SSA fest. Diese Antigen-Antikörperreaktion war abhängig von den

44

hochmolekularen Immunglobulinen des Typs IgM. Er fand in der SSA Reaktionen

sowohl mit den homologen als auch mit den heterologen Antigenen. Der HAH-Test

reagierte dagegen stammspezifischer. Diese Reaktion ist abhängig von den

niedermolekularen Immunglobulinen des Typs IgG. So reagierte das Serum der mit

dem F-Stamm infizierten Hühner zu keinem Zeitpunkt des Versuches mit dem

Antigen des WS7-Stammes.

Ähnliche Kreuzreaktionen bei hochvirulenten Stämmen beobachten LIN und

KLEVEN (1982 b) im HAHT. Nach einer Impfung bzw. einer aerogenen Infizierung

mit den MG-Stämmen R, F und S6 stellten sie fest, daß Agglutinationsreaktionen

auch bei heterologen Antigenpräparationen mit den MG-Stämmen S6, A 5969, 730

und 503 auftraten. Dagegen reagierten die Seren von Hühnern, die mit den MG-

Stämmen 730 und 503 geimpft worden waren, nur mit dem entsprechenden

homologen Antigen.

KLEVEN (1975) und HINZ (1977, 1978) empfahlen den Einsatz der SSA als

Suchtest für Infektionen in Legehennenherden mit MG. Zur Verifizierung positiver

Ergebnisse sollten solche Proben mit dem HAH überprüft werden. HINZ (1977)

beschrieb, dass positive HA-Hemmtiter immer mit einer positiven Reaktion in der

SSA verbunden sind, dies aber im umgekehrten Fall nicht gilt. In der SSA waren bei

der Verwendung von heterologen Antigenen verzögerte oder schwach positive

Reaktionen festzustellen. In keinem Fall konnte HINZ (1977) im HAH bei Seren, die

er mit RDE behandelt hatte, Reaktionen mit heterologen Antigenen erkennen.

Bereits eine Woche nach einer EBI via eye-drop mit dem R-Stamm von MG konnten

AVAKIAN und LEY (1993) bei allen Versuchshühnern agglutinierende Antikörper in

der SSA nachweisen. Nach einer intrakonjunktivalen Applikation der inaktivierten

MG-Vakzine (MG-bac®, Salsbury Lab.) konnten ABD-EL-MOTELIB und KLEVEN

(1993) zwei Wochen nach der Impfung spezifische Antikörpertiter (IgM, IgG) im SSA,

HAH und ELISA nachweisen. Im Vergleich zu drei Lebendvakzinen (F, ts-11, 6/85)

erfolgte der Nachweis der spezifischen Antikörper zwei Wochen früher und war

länger möglich, in ihrem Versuch bis zur zwölften Woche. Einen Zusammenhang

zwischen den Antikörpertitern und einem Schutz gegen die Adhäsion der

Mykoplasmen im Respirationstrakt nach einer EBI mit dem R-Stamm konnten sie

45

jedoch nicht feststellen. KHAN et al. (1986) fanden in einer von ihnen geimpften

Hennengruppe (n = 3400) drei Wochen nach der Impfung mit der Vakzine MG-bac®,

Salsbury Lab. die ersten Antikörper in der SSA. Im Verlaufe ihrer Untersuchungen

(50 Wochen) wies die geimpfte Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant

höhere Antikörpertiter im SSA-Verdünnungstest auf.

Mit der Frage, wie lange nach einer Impfung mit einer inaktivierten MG-Vakzine

humorale Antikörper gegen MG nachzuweisen sind, beschäftigten sich HINZ et al.

(1991). Vier Wochen nach der ersten Impfung wiesen sie das erste Auftreten von

agglutinierenden Antikörpern in der SSA nach. In einer Gruppe reagierten zu diesem

Zeitpunkt 77 % und in zwei anderen Gruppen 100 % der untersuchten Seren positiv.

Erste negative Reaktionen stellten sie ein Jahr nach der Zweitvakzination fest, wobei

über 90 % der untersuchten Seren auch 78 respektive 85 Wochen nach der zweiten

Impfung in der SSA positiv reagierten. In diesen Seren konnten sie auch mit Hilfe des

ELISA spezifische Antikörper gegen MG nachweisen. Der Nachweis spezifisch HA-

hemmender Antikörper schwankte vier Wochen nach der Erstimpfung zwischen 0%

und 66 %. Zwar konnten sie vier Wochen nach der Zweitvakzination in allen

Versuchsgruppen positive Reaktionen nachweisen, doch lag die Nachweishäufigkeit

zwischen 20 % und 100%. Im Gegensatz zu den agglutinierenden Antikörpern

konnten HINZ et al. (1991) HA-hemmende Antikörper nur bis maximal 27 Wochen

nach der Zweitimpfung nachweisen.

Diesen Zeitraum für den Nachweis HA-hemmender Antikörper gegen MG gaben

auch GLISSON und KLEVEN (1984) an. Sie konnten nach Impfungen in der 16. und

20. Lebenswoche sowie einer experimentellen Infektion in der 28. Lebenswoche bis

zur 55. Lebenswoche spezifische Antikörpertiter im HAH nachweisen.

BENCINA und DORRER (1983) überprüften die Sicherheit serologischer

Nachweismethoden bei lang zurückliegenden Infektionen mit MG. Sie untersuchten

Hühner, die aus einer latent infizierten Herde stammten. Diese Tiere hatten von der

fünften bis zur 13. Lebenswoche deutliche respiratorische Erscheinungen und

Nasenausfluß gezeigt. Zum Zeitpunkt der Erkrankung konnte MG aus der Trachea

isoliert werden. Im Alter von 57 Wochen wurden bei den Hühnern Abstriche aus der

Trachea entnommen. Bei 12 Hühnern konnten mittels indirektem

46

Fluoreszenzantiglobulintest MG Serotyp A nachgewiesen werden. Bei den

serologischen Kontrolluntersuchungen stellten sie fest, daß z. B. in der SSA in

Abhängigkeit von dem verwendeten Antigen bei neun von zwölf getesteten Seren

kein Nachweis für die latente MG-Infektion erbracht werden konnte. Im HAHT stellten

sie nur Antikörpertiter zwischen 1:32 und 1:128 fest, wobei das arithmetische Mittel

bei 1:72 lag. Eine MG-Infektion war bei ihrem Versuchsaufbau jedoch erst ab einem

Titer von ≥ 1:80 sicher zu erkennen.

Auch die Untersuchungen von KLEVEN et al. (1988) zeigten, daß in der Diagnostik

von MG Lücken auftreten können. Blutserumproben von Hühnern, die mit 16

verschiedenen MG-Stämmen infiziert worden waren, wurden von ihnen im HAH mit

insgesamt 19 unterschiedlichen Antigenpräparationen untersucht. Prinzipiell stellten

sie fest, dass im HAHT mit den homologen Antigenen die höchsten Titer zu erreichen

waren. Sie waren überrascht, dass gerade der in vielen Labors zur

Antigenherstellung verwandte Stamm A5969 derjenige war, bei welchem sie die

geringsten Antikörpertiter fanden. Bei anderen verwendeten Antigenen waren alle

untersuchten Seren negativ, so dass diese Proben bei der Untersuchung eines MG-

Ausbruches als negativ gewertet worden wären. Mit keinem der von ihnen

verwendeten Antigene konnten alle MG-Stämme nachgewiesen werden.

Die Untersuchungen von BENICINA et al. (1991) zeigten diagnostische Lücken bei

latenten Infektionen mit mehreren Mycoplasma spp. auf. Bei einer kulturellen

Untersuchung von acht einjährigen Hühnern konnten sie MS, MG und MGn

nachweisen. Die Blutserumproben der Hühner zeigten in der SSA für M. synoviae

deutliche Agglutinationsreaktionen. Die spezifischen Titer für MS im HAHT

schwankten zwischen 1:40 und 1:160. Auch mit dem IIPA konnten sie spezifische

Antikörpertiter (IgG, IgM) für MS bis zu einer Höhe von 1:2560 nachweisen. Mit dem

MGn-Antigen konnten sie jedoch nur in einem der getesteten Seren eine schwache

Agglutinationsreaktion erkennen. Ein Nachweis spezifischer Antikörper im Serum

gegen MG gelang ihnen weder in der SSA noch im HAH oder der IIPA. Aus allen

acht Milzen und drei Harder´schen Drüsen war jedoch mittels IIPA ein Nachweis

spezifischer Antikörper möglich. Die Autoren fanden, dass eine vorangehende

47

Infektion mit MS die Schwere einer nachfolgenden klinischen Erkrankung durch MG

und die Höhe der Antikörpertiter mindert.

RODRIGUEZ und KLEVEN (1980 a) verglichen die Höhe spezifischer Antikörpertiter

im HAH nach einer EBI mittels eines erregerhaltigen Aerosols mit unterschiedlich

pathogenen MG-Stämmen. Die im Alter von 30 Tagen mit dem R-Stamm infizierten

Küken wiesen signifikant höhere Antikörpertiter im HAH auf als die Vergleichsgruppe,

die mit dem F-Stamm infiziert worden war. Auch nach einer weiteren EBI, die 14

Tage später erfolgte, lagen die Titer HA-hemmender Antikörper in der mit dem R-

Stamm infizierten Gruppe höher (GMT 212,5) als in der Gruppe (GMT 127), die

erneut mit dem F-Stamm von MG infiziert worden war (RODRIGUEZ und KLEVEN

1980 b).

SOERIPTO et al. (1989 b) untersuchten die Wirksamkeit einer Impfung von sieben

Wochen alten SPF-Küken mit dem MG-Stamm 80083, bzw. der 50. (80083M) und

der 100. (80083H) Passage dieses Stammes. Die Hühner, die über Trinkwasser(tw)

oder eye drop(ed) mit dem MG-Stamm 80083 vakziniert worden waren, zeigten eine

serologische Reaktion im HAHT (GMT 1:15(tw,ed) und im ELISA (GMT 105(tw) bzw.

139(ed)), wobei die Titer deutlich über denen der beiden anderen Gruppen lagen.

Keines der mit dem Ausgangsstamm geimpften Hühner erkrankte an einer

Luftsackentzündung nach einer EBI mit dem virulenten Stamm Ap3AS. Serologisch

konnten SOERIPTO et al. (1989 b) nach der EBI einen deutlichen Anstieg der

Antikörpertiter feststellen. Die Hühner, die mit 80083M vakziniert wurden, wiesen vor

der EBI nur niedrige serologische Titer auf, waren aber vor Luftsackentzündungen

geschützt. Bei den Tieren, welche mit dem Stamm 80083H geimpft worden waren,

konnten sie vor der EBI keine Antikörper nachweisen. Diese Hühner erkrankten nach

der Belastungsinfizierung an einer Mykoplasmose. Aus denen im Rahmen der

pathologisch-anatomischen Untersuchungen festgestellten, auf einer Skala von 0 bis

4 bewerteten Luftsackveränderungen, ergaben sich Mittelwerte von ≥ 3,5.

SOERIPTO et al. (1989 b) vermuteten einen Zusammenhang zwischen der Höhe der

Antikörpertiter und dem Schutz vor Luftsackentzündungen, wobei die Ausbildung der

Antikörpertiter von der Virulenz des Impfstammes abhängig sein soll. So konnten sie

bei 37 Wochen alten Hühnern 13 Wochen nach der Impfung hohe Antikörpertiter

48

gegen den Impfstamm MG-Stamm 80083 nachweisen. Ein Schutz vor

Luftsackentzündungen durch eine EBI war zu diesem Zeitpunkt nur gegen den

homologen Stamm vollständig ausgebildet.

Einen Schutz vor pathologisch-anatomischen Veränderungen der Tracheal-

schleimhaut stellten NAKAMURA et al. (1995) grundsätzlich nur bei den Hühnern

fest, bei denen sie in der serologischen Untersuchung auch agglutinierende

Antikörper in der SSA fanden. In den Blutserumproben von neun Hühnern, die sie im

Alter von vier und sechs Wochen intratracheal mit einem inaktiviertem Impfstoff (MG-

Stamm SAS) vakziniert hatten, stellten sie vier Wochen nach der zweiten Gabe

agglutinierende Antikörper fest. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Hühner mit 106,6

Mykoplasmen des homologen Stammes infiziert. Bei keinem dieser Hühner konnten

sie bei der pathologisch-anatomischen Untersuchung zwei Wochen p.i.

Trachealläsionen diagnostizieren.

Der von YODER et al. (1984) festgestellte signifikante Schutz gegen

Luftsackentzündungen bei Broilern deckte sich mit den Ergebnissen ihrer

serologischen Untersuchungen. So ermittelten sie in einem Versuch bei geimpften

Hühnern vor der EBI spezifische Antikörper gegen MG. Der geometrische Mittelwert

der im HAH untersuchten Seren lag bei 1:25, während in der Kontrollgruppe nur ein

unspezifischer Titer von ≤ 1:10 gemessen wurde. Auch in einem zweiten Versuch

stellten sie bei geimpften Tieren vor der Infizierung spezifische HAH-Titer (GMT 1:40)

fest. Nach der EBI lagen die Titer der Tiere von Impf- und Kontrollgruppe bei 1:320,

jedoch wiesen die Hühner der Kontrollgruppe signifikant häufiger

Luftsackentzündungen auf.

Auch TALKINGTON und KLEVEN (1985) fanden bei zwölf Wochen alten,

kommerziell erworbenen Hühnern nach einer einmaligen Impfung mit inaktiviertem

MG-Impfstoff humorale Antikörpertiter im HAHT (GMT 1:68). Nach einer Boosterung

stieg der GMT auf 1:112 an. Alle zweimal geimpften Hühner wiesen mindestens

einen spezifischen Antikörpertiter von ≥ 1:40 auf. Alle untersuchten Seren zeigten in

der SSA Agglutinationsreaktionen. Für die erfolgreiche Infizierung der geimpften

Hühner waren im Durchschnitt eine größere Anzahl von lebenden Mykoplasmen

notwendig. So mußten Tiere, die zweimal vakziniert worden waren, mit 1500

49

KBE/Tier infiziert werden, damit drei Tage p.i. MG aus der Trachea zu reisolieren

war. Bei den einmal geimpften Tieren bzw. der Kontrollgruppe waren für eine

Infektion nur 150 respektive 15 KBE/Tier notwendig. TALKINGTON und KLEVEN

(1985) konnten jedoch bei der Reisolation keinen Zusammenhang zwischen der

Höhe der serologischen Titer und der Anzahl der gefundenen Mykoplasmen

feststellen. Die Anzahl der Mykoplasmen stieg nach ihren Angaben auch bei

geimpften Hühnern nach einer Infektion zunächst stark an, um dann langsam

abzufallen.

Auch BARBOUR et al. (1987) stellten einen Zusammenhang zwischen einer zuvor

erfolgten Immunisierung (s. o.), lokal sezernierten Antikörpern und einem Schutz vor

einer Infektion der Trachea nach experimenteller Infizierung mit dem R-Stamm von

MG fest. Beim Vergleich verschiedener Impfstoffpräparationen wies allein die Gruppe

mit dem signifikant höchsten lokalen Antikörpertiter keine mikroskopisch

nachweisbaren Läsionen der Trachealschleimhaut auf. Bei der Untersuchung der

Überempfindlichkeitsreaktion vom Typ IV zeigten drei zuvor mit liposomaler

Adjuvans-Vakzine grundimmunisierte Gruppen 24 Stunden nach einer intradermalen

Applikation von 0,9 mg MG-Äquivalent einen im Vergleich mit der Kontrollgruppe

signifikant stärker verdickten Kehllappen auf.

YODER und HOPKINS (1985) beschrieben bei geimpften Legehennen, die entweder

aus einer Versuchstierhaltung oder aus kommerziellen Beständen stammten, einen

Schutz vor einer Legeleistungsminderung (s.o.). Die geimpften Hennen (Experiment

6) wiesen nach der EBI mit dem MG-Stamm R im Durchschnitt einen deutlich

höheren Titer (GMT: 557) im HAH auf als die der Kontrollgruppe (GMT: 320). Im

Vergleich der subkutanen*1 Impfung mit der intratrachealen*2 stellten sie jeweils vier

Wochen nach der ersten bzw. zweiten Impfung bei subkutaner Verabreichung

höhere Antikörpertiter im HAH fest (GMT*1: 1:155 und 1:150; GMT*2: 1:32 und 1:45).

In diesem Versuch lagen sechs Wochen nach der Infizierung die HAH-Titer beider

Impf- und der Kontrollgruppe bei etwa 1:300.

Eine Korrelation zwischen der Anzahl der nach experimenteller Infizierung

(105 KBE/Tier) reisolierten Mykoplasmen (SAS-Stamm) und der Schwere der

Trachealläsionen stellten YAGIHASHI und TAJIMA (1986) fest. Gleichzeitig wiesen

50

sie nach der Infektion einen Anstieg lokaler (IgG, IgA, IgM) Antikörper nach, die bei

IgA (log102,6 ±0,4) und IgM (log102,0 ±0) zwei Wochen p.i. und bei IgG (log103,1 ±0,3)

drei Wochen p.i. ihre höchsten Werte erreichten. Die Titer der im Blutserum

nachgewiesenen Antikörper erreichten ebenfalls nach ca. drei Wochen ihre höchsten

Werte (IgG log103,8, IgA log103,7), die dann bis zur zwölften Woche auf hohem

Niveau konstant blieben. Drei bzw. 14 Tage nach einer zweiten EBI konnten sie aus

den Tracheen der Tiere signifikant weniger Mykoplasmen reisolieren als nach der

ersten. Diese Hühner zeigten geringere entzündliche Veränderungen der Trachea

und eine schnellere Elimination der Mykoplasmen. YAGIHASHI und TAJIMA (1986)

bewerteten dies als Indiz dafür, dass lokale Antikörper eine Rolle bei der

Infektionsabwehr gegen MG spielen.

Dagegen beobachtete KLEVEN (1985) direkt nach Belastungsinfektion geimpfter

Hühner einen starken Abfall der Serumantikörpertiter im HAHT. So fiel der im

geometrischen Mittel errechnete HAH-Titer bei den Tieren, die zweimal geimpft

worden waren, von 1:149,3 zum Zeitpunkt der Infizierung mit MG auf 1:22,0 zwei

Wochen p.i. ab. Zurückgeführt wurde dies auf die Neutralisation der bereits

vorhandenen Antikörper durch die in den Organismus eindringenden Mykoplasmen.

Die Frage, welche Bedeutung maternale Antikörper gegen MG und MS für Küken

haben, beschäftigte SNELL und CULLEN (1977). Sie konnten in Blutserumproben

der Küken bis zum 18. Tag maternale Antikörper in der SSA und dem HAHT

nachweisen. Jedoch nahm die Anzahl der Küken, die über maternale Antikörper

verfügten, sehr schnell ab. So konnten sie am vierten Tag nach dem Schlupf bei 35%

der Küken keine maternalen Antikörper in der SSA mehr finden. LIN und KLEVEN

(1984) verglichen Küken MG-positiver und MG-freier Abstammung in Bezug auf die

Bedeutung maternaler Antikörper. Nach experimenteller Infizierung mit dem MG-

Stamm R am dritten und 14. Lebenstag konnten sie keine signifikanten Unterschiede

im Ausmaß der Luftsackentzündungen feststellen. Von den Probanden, die im Alter

von sieben Tagen infiziert worden waren, wiesen die Küken der MG-positiven

Hennen signifikant niedrigere LSE-Werte auf als die der MG-freien Hennen. Das

Vorhandensein maternaler Antikörper beeinflußte die Entwicklung der Antikörpertiter

nach einer Impfung mit dem MG-Stamm F am ersten Lebenstag nicht.

51

Die Art und den Umfang von zellulärer, humoraler und lokaler Immunantwort nach

Infizierung mit MG (S 6) untersuchten CHHABRA und GOEL (1980) bei SPF-

Hühnern, die bei Versuchsbeginn sieben Wochen alt waren. Bereits eine Woche

nach einer EBI konnten sie eine zelluläre Immunantwort mit dem

Leukozytenmigrationshemmungstest (LMI) nachweisen, wobei sie die höchsten

Werte (36,4%) der Migrationshemmung sieben Wochen p. i. feststellten. Ebenfalls

als Anzeichen einer zellulären Immunantwort werteten sie eine lokale

Hypersensibilitätsreaktion in der 17. Lebenswoche. Hierzu injizierten sie sieben

Hühnern der bereits MG-positiven Gruppe und fünf Hühner der Kontrollgruppe durch

eine intradermale Injektion von 0,1 ml Antigen (MG-Stamm S6) in den rechten

Kehllappen. Die Dickenzunahme der Haut binnen 48 Stunden war in der zuvor

infizierten Gruppe signifikant größer als in der Kontrollgruppe. Die humorale

Antikörperreaktion untersuchten sie per HAHT. Sie stellten schon eine Woche nach

der Infizierung Antikörper fest. Der Titer erreichte seinen Maximalwert ebenfalls in

der siebten Woche p. i.. CHHABRA und GOEL (1980) stellten eine hochsignifikante

Korrelation zwischen LMI und HAHT fest. Die Antikörperreaktion im Serum war

geprägt durch einen signifikant höheren Titer von Immunglobulinen des Typs IgG im

Vergleich zu den Kontrolltieren. Mit Trachealspülproben ermittelten sie die Titer lokal

sezernierter Antikörper vom Typ IgG und IgA. Hierbei stellten sie einen Anstieg der

Titer fest, wobei das Maximum in der sechsten Woche p.i. lag. Der Beginn der

Genesung der Hühner von der experimentell erzeugten Mykoplasmose erfolgte

zeitgleich mit der Abnahme der Anzahl der aus der Trachea zu reisolierenden

Mykoplasmen, der Abnahme der Trachealläsionen und den höchsten Antikörpertitern

in den serologischen Untersuchungen.

BENCINA und DORRER (1989) untersuchten Seren und Schleim aus dem oberen

Respirationstrakt von natürlich und experimentell infizierten Hühnern auf Antikörper

(IgG) gegen MG und MS mittels indirektem Immunoperoxidase-Test (IIPA). In 90 %

der Fälle stimmten die Ergebnisse des Antikörpernachweises im IIPA für Serum und

Schleim überein. Jedoch fanden BENICINA und DORRER (1989) bei drei Hühnern

lediglich Antikörper im Schleim aus dem oberen Respirationstrakt. Auch die generelle

Übereinstimmung des Nachweises von Immunglobulinen (IgG) in der Harder´schen

52

Drüse und dem Schleim aus der Choanenspalte ließen sie eine partielle lokale

Antikörperproduktion vermuten. Den Ursprung der von ihnen in der Bursa cloacalis

gefundenen MG-Antikörper vermochten sie nicht zu klären.

Anzeichen für die Bedeutung der Bursa cloacalis bei der Immunantwort von Hühnern

auf Mykoplasmen belegen die Untersuchungsergebnisse von VARDAMAN et al.

(1973). Hühner, denen die Bursa cloacalis chirurgisch entfernt worden war, wiesen

nach einer Infektion mit M. synoviae signifikant niedrigere Antikörpertiter im HAH auf.

Zudem stellten sie bei diesen Tieren nach einer aerogenen Belastungsinfektion bei

21 von 32 Hühnern Luftsackentzündungen mit fibrinösem Exsudat fest, während

entsprechende Veränderungen nur bei drei Tieren der Kontrollgruppe gefunden

wurden.

Auch LAM und LIN (1984) entfernten bei Eintagsküken die Bursa cloacalis bzw. den

Thymus. Am zweiten Lebenstag wurden die Küken mit 1x1010 Mykoplasmen (TS

100) je Tier geimpft. Nach drei Wochen erfolgte eine EBI mit dem MG-Stamm S6 in

die Luftsäcke. Nach einer Woche wurden die Küken getötet, das Blut zur

serologischen Untersuchung gewonnen und die Tiere pathologisch-anatomisch

untersucht. Im Vergleich zu einer nicht bursektomierten und geimpften

Kontrollgruppe (15%) wiesen ungeimpfte (47 %) und geimpfte aber bursektomierte

Küken (50%) signifikant häufiger Luftsackentzündungen auf. Durch die Entfernung

des Thymus ergaben sich keine signifikanten Unterschiede in der Häufigkeit von

Luftsackentzündungen. Beim Antikörpernachweis per serologischer Untersuchung in

der SSA konnten LAM und LIN (1984) keine signifikanten Unterschiede zwischen

burs- bzw. thymektomierten Tieren und ihren jeweiligen Kontrollgruppen feststellen.

Sie vertraten die Ansicht, dass die Ergebnisse ihrer Untersuchungen auf einen B-

Zell-vermittelten Schutzmechanismus vor Luftsackentzündungen hinwiesen.

LAM et al. (1986) stellten bei SPF-Küken nach einer EBI mit dem MG-Stamm TS-100

eine „milde“ zelluläre Reaktion im oberen Atemtrakt fest. Küken, die sie mit dem MG-

Stamm S6 infiziert hatten, zeigten „deutlichere“ Reaktionen. Serologisch konnten sie

keine Unterschiede der Titer in der SSA, im HAHT und Radioimmunassay feststellen.

Nur bei 50 % der Küken, die sie zuvor bursektomiert und experimentell infiziert

hatten, fanden sie in Trachealspülproben im Radioimmunassay (RIA) spezifische

53

Antikörpertiter (IgG) gegen MG. Dagegen konnten sie bei allen nicht

bursektomierten, aber infizierten Küken der Kontrollgruppe spezifische Antikörper

(IgG) im RIA nachweisen. Die Tatsache, daß bei den bursektomierten Tieren zwar

humorale Antikörper nachzuweisen waren, sie jedoch lokal in der Trachea keine

spezifischen Antikörper fanden, deuteten LAM et al. (1986) als einen Hinweis auf

eine B-Zell-vermittelte lokale Antikörperproduktion in der Trachealschleimhaut.

ELFAKI et al. (1992, 1993) beschrieben die Immunreaktionen von kommerziell

erworbenen Küken, die sie im Alter von drei und sieben Wochen mit einer

inaktivierten Vakzine, die mit iota carrageenan (iCGN) als Adjuvans hergestellt

worden war, impften. Sie verglichen verschiedene Applikationsrouten bei der

Impfstoffgabe (s. o.). Küken, die nach der Impfung einen signifikanten Schutz vor

Luftsackentzündungen aufwiesen, hatten zeitgleich auch signifikant höhere Titer

spezifischer Immunglobuline (IgG, IgA) im Serum. Nach der EBI stiegen die

Antikörpertiter (IgG, IgA) in den Trachealspülproben deutlich von <1,0 log10 auf 3,03

± 0,058 log10 respektive < 1,0 log10 auf 3,03 ±0,130 log10 an. Dieser Anstieg der

Antikörpertiter war signifikant höher als der Anstieg der Antikörpertiter

Kontrollgruppe. Zwei Wochen nach der Infizierung konnten aus den Tracheen der

geimpften Hühner signifikant weniger Mykoplasmen reisoliert werden.

Nach einer EBI von 15 MG-freien Hühnern im Alter von 35 Tagen mit dem MG-

Stamm R konnten AVAKIAN und LEY (1993) in Spülproben der oberen und unteren

Atemwege Immunglobuline der Klassen IgG, IgM, und IgA nachweisen. In einer von

ihnen angelegten Trachealringkultur konnten sie eine signifikant höhere

Beweglichkeit der Zilien feststellen, wenn sie diese Kultur mit der Spülflüssigkeit aus

den oberen Atemwegen zuvor infizierter Hühner behandelt hatten. Desweiteren

hemmten die Spülflüssigkeiten aus den oberen und unteren Atemwegen die

Anheftung von Mykoplasmen in vitro, in Abhängigkeit von der in der Spülflüssigkeit

mittels ELISA nachgewiesen Antikörpermenge. Dies könnte auf einen

Abwehrmechanismus hinweisen, der in vivo die Adhäsion der Mykoplasmen im

Respirationstrakt beeinflußt. Den Ursprung der von ihnen nachgewiesenen

Antikörper konnten die Autoren nicht belegen.

54

YAGIHASHI et al. (1987) untersuchten die Wirksamkeit einer inaktivierten Öl-

Adjuvansvakzine bei SPF-Hühnern. Hierbei testeten sie unterschiedliche

Applikationswege. Eine Gruppe wurde zweimal intramuskulär geimpft, bei der

zweiten Gruppe folgte auf die intramuskuläre eine intratracheale Impfung. Beide

Gruppen wiesen zum Zeitpunkt der Infektion mit dem MG-Stamm SAS ähnliche Titer

(ELISA (IgG, IgA)) in den Trachealspülproben und im Serum auf, jedoch war die

Schutzwirkung bei den intratracheal nachgeimpften Tieren höher. Sieben Tage nach

der Infizierung konnten sie bei den i.m. und i.t. geimpften Tieren signifikant weniger

Mykoplasmen reisolieren und stellten signifikant weniger Läsionen in der Trachea

fest. Der bessere Schutz der intratracheal geimpften Tiere deutete ihrer Meinung

nach darauf hin, dass bei den Hühnern auch eine lokale zellvermittelte Abwehr eine

Rolle beim Schutz gegen eine MG-Infektion spielt. Sie vermuteten hierbei eine lokale

Antigenproduktion. Letztendlich konnten sie in dieser Studie keinen Nachweis über

die Herkunft der Antikörper führen, nahmen aber an, dass es sich sowohl um lokal

sezernierte Antikörper als auch um transsudierte Immunglobuline handeln könnte.

Die Abhängigkeit des Impfschutzes von der Höhe bestehender Antikörpertiter und

der immunologischen Fähigkeit der Hühner, auf eine Impfung zu reagieren,

untersuchten YAGIHASHI et al. (1992). Zwei verschiedene Hühnerlinien wurden als

Versuchstiere ausgewählt. Hennen der GSP-Linie sind als „high responder“ bekannt.

Als weitere Versuchstiere wurden Hennen einer Linie gewählt, die als „low-responder

line“ (BM-C) bekannt ist. Die Hühner beider Linien wurden mit inaktivierter

Aluminium-Hydroxid-Vakzine zunächst intramuskulär, dann intratracheal geimpft. Die

EBI erfolgte mit dem MG-Stamm SAS. Die GSP-Hühner zeigten deutlich höhere

Antikörpertiter (IgG und IgA) im ELISA. So zeigten diese Tiere 14 Tage nach der

ersten Impfung einen Wert von 2,7 ± 0,3 log10 Antikörper des Typs IgG im Serum.

Die Hühner der BM-C Linie hatten zur gleichen Zeit einen signifikant niedrigeren Titer

von 0,3 ± 0,6 log10. Vier Tage nach der EBI wurden in den Trachealspülproben der

GSP-Hühner signifikant höhere Antikörpertiter des Typs IgG gefunden. Bei diesen

Probanden konnten sie auch in Tränenflüssigkeit bzw. im Speichel signifikant

häufiger Immunglobuline vom Typ IgG und IgA feststellen. Beide Linien zeigten nach

der EBI einen Schutz vor einer Infektion der Trachea mit MG. Der „Grad der

55

Schutzwirkung“ ist jedoch bei der GSP-Linie ausgeprägter. Die Ergebnisse dieser

Untersuchungen deuten darauf hin, dass die Qualität der Immunabwehr mit der

Menge der lokal vorhandenen Antikörper korreliert ist. BRANTON et al. (1997)

berichteten über die Veränderungen des weißen Blutbildes nach einer EBI von MG-

freien Hühnern im Alter von sechs Wochen mit 0,4 ml einer Mykoplasmensuspension

(F-Stamm). In der akuten Phase innerhalb der ersten vier Wochen nach der

Inokulation der Mykoplasmen via eye-drop, stellten sie bei der infizierten Gruppe

Heterophilie, von ihnen als Verschiebung des Verhältnisses zwischen

Gesamtleukozytenzahl und Lymphozytenzahl definiert, sowie Lymphopenie,

Monozytose, Eosinopenie, und Basopenie fest. Im Vergleich mit einer nicht infizierten

Kontrollgruppe waren diese Unterschiede signifikant. Histopathologisch konnten sie

bei den infizierten Hühnern eine Hyperplasie der Lymphzentren in Milz und

Knochenmark feststellen.

GAUNSON et al. (2000) untersuchten erstmals die Anzahl und Verteilung von T-

Lymphozytzen in der Trachea von Hühnern nach einer EBI mit dem virulenten MG-

Stamm R. Signifikante Unterschiede in der Häufigkeit von zytotoxischen T-

Lymphozyten (CD 8) im oberen, mittleren und unteren Bereich der Trachea konnten

sie nicht feststellen. Während die T-Helferzellen (CD 4) gleichmäßig in der

Trachealschleimhaut verteilt waren, lagen die zytotoxischen T-Lymphozyten in

„follikelähnlichen“ Haufen zusammen. Im gesamten Verlauf des Experiments konnten

sie hohe Konzentrationen von T- Helferzellen und zytotoxischen T-Lymphozyten in

der Trachealschleimhaut feststellen, die sich jedoch in der Häufigkeit ihrer

spezifischen T-Zell-��������������� +�������+������������������������

Anzahl der Mykoplasmen in der Trachealschleimhaut nahm in der zweiten Woche p.i.

ab, währenddessen die Zahl der T-Lymphozyten gleichzeitig noch anstieg.

GAUNSON et al. (2000) bewerteten die spezifische Aktivierung der zytotoxischen T-

Lymphozyten als wichtigen Abwehrmechanismus des Wirtes gegen eine Infektion

durch MG.

Die Fähigkeit von MG in nicht phagozytierenden Zellen einzudringen und sich so der

Immunabwehr des Wirtes zu entziehen, stellt eine weitere Überlebensstrategie von

MG dar. WINNER et al. (2000) konnten diese Fähigkeit von MG in vitro bei

56

menschlichen Epithelzellen und Fibroblasten aus Hühnerembryonen nachweisen.

Binnen 20 Minuten gelangten Mykoplasmen aus dem interzellularen Bereich in die

Zellen hinein und konnten hier auch durch eine antibiotische Behandlung mit

Gentamycin nicht abgetötet werden. Da sie gleichzeitig ihre Fähigkeit, diese Zellen

wieder zu verlassen, nicht einbüßten, sahen WINNER et al. (2000) dies als eine der

Ursachen chronischer und generalisierter Infektionen an.

KHAN et al. (1986) stellten bei der Untersuchung der Proteinzusammensetzung

verschiedener MG-Stämme (S6, F, A5969) in der Natrium-dodecyl-sulfat - Polyacryl-

amid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) fest, dass sich die einzelnen MG-Stämme in

ihrem Bandenmuster unterschieden. Anhand geringer Abweichungen in den

Bandenmustern konnten sie auch Subpopulationen eines Stammes unterschiedlicher

Herkunft von einander abgrenzen. KHAN et al. (1986) hoben die Bedeutung der

SDS-PAGE für epidemiologische Studien hervor.

Auch YOGEV et al. (1988) konnten mit Hilfe von RNA-Gensonden unterschiedliche

Genotypen innerhalb eines MG-Stammes nachweisen. Ihre Untersuchungen

deuteten darauf hin, daß einige Genomabschnitte bei allen Stämmen von MG

identisch sind und andere stammspezifisch und somit verantwortlich für die Spezifität

des „genetischen Fingerabdrucks“ eines Stammes zeichnen. Aber auch bei

Subpopulationen eines Stammes waren unterschiedliche Bandenmuster zu

erkennen, so dass beispielsweise eine Abgrenzung von Feldisolaten des F-Stammes

gegenüber dem Impfstamm möglich war.

BARBOUR und NEWMAN (1990) untersuchten die Bildung spezifischer Antikörper

nach Impfung von Mycoplasma-spp.-freien Hühnern mit MG-„sub-unit-Vakzinen“.

Nach Impfung mit einer „sub-unit-Vakzine“ im Alter von 13 und 17 Wochen, die das

Adhäsinprotein von MG enthielt, konnten sie die Bildung spezifischer Antikörper

nachweisen. Diese Antikörper konnten sie im Western-Blot als Proteinbande im

Molekulargewichtsbereich von 75 kDA darstellen. Gleichzeitig fanden sie in ihren

Untersuchungen auch Kreuzreaktionen drei Wochen nach der ersten bzw. zweiten

Impfung im Bereich von 85 kDA respektive 56 kDA. Auch nach Impfung mit MG-

Vakzinen, die aus dem ganzen Erreger hergestellt waren, konnten Antikörper mit

einem Molekulargewicht von 75 kDA nachgewiesen werden. Sie werteten dies als

57

Hinweis auf die immunologische Bedeutung des Adhäsins für die Antikörper-

entwicklung und die damit verbundene Wirksamkeit einer Vakzine gegen die

Anheftung und Infektion mit MG.

Bereits 1988 berichteten WATSON et al. über die Heterogenität des Antigen-

Komplexes V-1 bei Mycoplasma pulmonis. Mit monoklonalen und monospezifischen

Antikörpern untersuchten sie 18 verschiedene Stämme von M. pulmonis. Alle

unterschieden sich in ihren Bandenmustern voneinander. Bei der Untersuchung von

subklonierten Populationen von vier Mycoplasma pulmonis-Stämmen konnten sie im

Immunblotting Unterschiede in der Struktur und im antigenetischen Charakter dieser

Subpopulationen nachweisen. Die Häufigkeit der Phasenvariation des Oberflächen-

antigen-Komplexes V-1 wurde mit 2 x 10-3 pro Zelle und Generation angegeben.

Diese Variationsmöglichkeit der Majorantigene der Zellmembran bewerteten die

Autoren als bedeutende Möglichkeit von M. pulmonis, sich der Wirtsabwehr zu

entziehen.

ROSENGARTEN und WISE (1990) stellten bei Mycoplasma hyorhinis, einer für das

Schwein pathogenen Mykoplasmenart, im Verlaufe von über 100 Kulturpassagen

Veränderungen im Erscheinungsbild der Kolonien fest. Hierbei konnten sie drei

unterschiedliche Kolonieformen identifizieren. Bei der Untersuchung von Sub-

populationen stellten sie fest, dass der Wechsel von einer in die andere Form

möglich ist. Sie konnten feststellen, dass die phänotypische Instabilität durch einen

hochfrequenten Wechsel von membranständigen Oberflächenproteinen bedingt ist.

Diesen Drift der Oberflächenstruktur konnte in einer Studie über das als „Variable

lipoprotein (Vlp) systems“ bezeichneten Komplexes bei M. hyorhinis bestätigt

werden. Die antigenetischen Variationsmöglichkeiten von drei membranständigen

Lipoproteinen (VlpA, VlpB, VlpC), von denen jedes unabhängig von den anderen

innerhalb einer isogenen Population hochfrequente Phasenvariationen aufwies,

wurden beschrieben.

ROSENGAREN und WISE (1991) fanden 12 bis 30 spontane Größenvariationen je

Vlp, die unabhängig voneinander auftraten. So konnten sie 104 verschiedene

strukturelle Unterschiede der Vlp´s dokumentieren. Den Nachweis von Antikörpern

gegen diese Vlp`s im Serum von Schweinen, welche sie zuvor experimentell mit M.

58

hyorhinis infiziert hatten, werteten sie als Hinweis darauf, daß das System der Vlp´s

auch in vivo auftritt.

Dagegen konnten EVANS et al. (1992 b) bei der Untersuchung der genetischen

Stabilität der MG-Stämme S6 und 6/85 (MGI; Intervet America Inc., Millsboro, Del.)

kaum Unterschiede im Verlauf von zehn in vivo Passagen feststellen. Sie verglichen

die mittels Restriktionsendonukleasen gelösten DNS-Banden in der Darstellung mit

der SDS-PAGE vor bzw. nach drei, sechs und zehn Passagen in Hühnern und

Puten. Bis auf eine deutlichere Ausprägung einer Proteinbande im Bereich von 86

kDa konnten sie keine Veränderungen der DNA-Bandenmuster im Bereich von 46,5

kDA, 50-54 kDA, 58-64 kDA und 105-140 kDA feststellen und werteten dies als

Anzeichen für eine genetische Stabilität der MG-Stämme S6 und 6/85.

PANANGALA et al. (1992) entwickelten monoklonale Antikörper (MAb) gegen den

Mycoplasma gallisepticum-Stamm PG 31. Mit diesen untersuchten sie die

antigenetischen Profile von fünf bekannten (PG 31, R, S6, F, A5969) Stämmen und

sechs Feldisolaten. Ein monoklonaler Antikörper (G12) reagierte mit allen Stämmen

und Isolaten und zeigte dabei in der SDS-PAGE ein einheitliches Bandenmuster. Mit

dem monoklonalen Antikörper G9 reagierten ebenfalls alle Stämme, jedoch

schwankte die Molekularmasse der nachgewiesenen Antigene zwischen 90 und 98

kDA. Die MAb´s G10 und G11 reagierten dagegen selektiv nur mit einigen MG-

Stämmen bzw. Isolaten. PANANGALA et al. (1992) konnten mit goldkonjugierten

Antigenen die Lokalisation der Antigene in der Zellmembran von MG nachweisen.

Der MAb G9 reagierte in ihrem Versuchsaufbau mit Oberflächenantigenen und war

an der Agglutinationsreaktion von MG beteiligt. Der Grad der Agglutinationsreaktion

war bei den einzelnen MG-Stämmen unterschiedlich stark. Es wurde vermutet, dass

die unterschiedliche Expression der Epitope für die antigenetischen Unterschiede der

einzelnen MG-Stämme verantwortlich ist.

Die Bedeutung des Hämagglutinins, einem lipophilen Oberflächenprotein von MG mit

einem Molekulargewicht von 64 kDA, für die Immunantwort untersuchten FORSYTH

et al. (1992). Durch Immunoelektronenmikroskopie konnten sie die Bindung dieses

Proteins an die Basis des terminalen Endes des Fab-Fragmentes feststellen. Obwohl

dieses Protein (LP 64) nur 1,7 % der Gesamtproteinmasse darstellt, trägt es zu 7,4

59

% zur Antigenbildung (IgG) vier Wochen p.i. bei. Sie konnten mittels Immunoblotting

das Hämagglutinin auf der Membran der MG-Stämme R, F, PG 31 und A 5969

nachweisen; dies gelang ihnen jedoch nicht bei M. synoviae. Anti-LP 64-Serum zuvor

infizierter Kaninchen verhinderte die Hämagglutination von Hühnererythrozyten bis

zu einer Verdünnung von 1:256. Durch eine 14C-Markierung von MG konnten

FORSYTH et al. (1992) nachweisen, daß Anti-LP 64-Serum von Kaninchen die

Anheftung von MG an die Epithelzellen der Trachea um 62 % vermindert. Sie werten

dies als Hinweis auf die Bedeutung des LP 64 als Adhäsionsfaktor.

MARKHAM et al. (1993) isolierten beim Mycoplasma gallisepticum-Stamm S6 mit

Hilfe eines monoklonalen Antikörpers (MAb) in der Affinitätschromatographie ein

Protein („pMGA“) mit einem Molekulargewicht von 67 kDA. Dieses Oberflächen-

protein wird mit den hämagglutinierenden Eigenschaften von MG in Verbindung

gebracht. Sie versuchten mit Hilfe der DNS-Restriktionsanalyse das Gen, welches

das pMGA kodiert, zu isolieren. Sie fanden jedoch nur zwei in ihrer Sequenz sehr

ähnliche Gene, die das von ihnen isolierte „pMGA“ jedoch nicht kodierten.

MARKHAM et al. (1992) vermuteten eine Genfamilie, die für die Exprimierung sehr

ähnlicher Oberflächenstrukturen verantwortlich ist.

ROSENGARTEN et al. (1994) untersuchten die Protein- und Antigenprofile von elf

M. bovis-Isolaten. In der SDS-PAGE stellten sie deutliche Unterschiede der

Bandenmuster zwischen den einzelnen Stämmen fest. Diese antigenetischen

Unterschiede traten unabhängig von der geographischen Herkunft, dem klinischen

Krankheitsbild oder der Art der Probenentnahme auf. ROSENGARTEN et al. (1994)

beobachteten diesen hochfrequenten Wechsel in der Ausbildung von Epitopen auch

bei von ihnen klonierten Subpopulationen des M. bovis-Stammes PG 45.

Auch BEHRENS et al. (1994) untersuchten subklonierte Nachkommen des M. bovis-

Stammes PG45 mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern (MAb´s). Hierbei

identifizierten sie eine „Familie“ von MAb´s und strukturell ähnlichen, variablen

Oberflächenproteinen (variable surface proteins; Vsps). Drei Mitglieder dieser

„Familie“ konnten sie identifizieren, sie bezeichneten sie als VspA, VspB und VspC.

Diese Oberflächenproteine veränderten unabhängig voneinander ihre Größe;

BEHRENS et al. (1994) vertreten die Ansicht, dass diese Fähigkeit zur

60

Oberflächenvariatiion eine Möglichkeit für M. bovis darstellt, sich der Wirtsabwehr zu

entziehen.

YOGEV et al. (1994) verwandten in ihrem Experiment denselben monoklonalen

Antikörper (1E5), den BEHRENS et al. (1994) zur Darstellung von variablen Epitopen

auf Oberflächenproteinen bei M. bovis genutzt hatten. Sie untersuchten 15

verschiedene MG-Stämme, u .a. F, R, S6, PG31, 6/85 und A5969. Bei diesen

Stämmen konnten sie auf dem Oberflächenprotein (PvpA) dieses Epitop erneut

nachweisen. Sie stellten fest, dass das PvpA ein integraler Bestandteil der

Zellmembran ist und das Epitop aus dieser Oberfläche herausragt. YOGEV et al.

(1994) konnten eine hochfrequente phänotypische Veränderung des Proteins

erkennen, für die sie eine reversible Veränderung des Genotyps in Form eines „Ein-

Aus-Ein-Mechanismus“ verantwortlich machten. Im Gegensatz zu den Versuchen

von BEHRENS et al. (1994), die mit dem MAb 1E5 lipophile Oberflächenproteine

nachgewiesen hatten, wies das Antigen bei den MG-Stämmen einen hydrophilen

Charakter auf.

GLEW et al. (2000) untersuchten die molekulare Struktur des Oberflächenproteins

(pMGA) in vivo. Hierzu infizierten sie Hühner mit dem MG-Stamm S 6. Zwei Tage p.i.

hatte sich bei 40 % der Mykoplasmen die phänotypische Struktur dieses Ober-

flächenproteins verändert. Sechs Tage p.i. konnten GLEW et al. (2000) diese

reversiblen Strukturveränderungen bei über 50 % der untersuchten Oberflächen-

proteine feststellen. Dieser Wechsel der Struktur der Oberflächenproteine fand auch

ohne das Vorhandensein spezifischer Antikörper statt und schien der spezifischen

Immunabwehr des Wirtes vorauszugehen. GLEW et al. (2000) sahen diese Fähigkeit

von MG als großen Vorteil für die Besiedlung von Wirtsorganismen an.

Auch BENICINA et al. (1994) verwendeten monoklonale Antikörper (n = 12) gegen

Epitope von MG-Stämmen (R, F, S6 (208) und PET2) zur Untersuchung der

Oberflächenantigene von insgesamt 22 MG-Stämmen. Zwei MAB´s reagierten mit

Epitopen einer Molekularmasse von 56 kDA bei allen untersuchten MG-Stämmen,

sechs MAB´s reagierten zwar mit fast allen Stämmen, jedoch nicht mit den MG-

Stämmen K 503 und K 703. Drei MAB´s erkannten drei unterschiedliche

Oberflächenantigene auf Proteinen von etwa 67 kDA, und ein MAb band an variable

61

Epitope auf Proteinen mit dem Molekulargewicht von 33 bzw. 80 kDA. Mittels

Darstellung durch zweidimensionale Immunoblots konnten sie Unterschiede in der

Ladung der Proteine nachweisen, die bei verschiedenen MG-Stämmen diese

variablen Oberflächen-antigene trugen. Einige subklonierte Kolonien wechseln die

mit den 67 kDA und 80 kDA assoziierten Epitope. Dieser phänotypische, reversible

Wechsel der Antigenstruktur trat bei einem bis fünf Prozent der Population der

nächsten Generation auf und führte zur Bildung von Subpopulationen; es wurde

vermutet, dass dieser Wechsel der Epitope wahrscheinlich auch in vivo vorkommt

und es MG so möglich wird, der Immunantwort des Wirts zu entgehen.

Die Ausprägung verschiedener Oberflächenepitope untersuchten GARCIA et al.

(1994) bei den Mycoplasma gallisepticum-Stämmen A5969, R, S6, F, 6/85, ts-11,

K503, K703 und K730 mit sieben verschiedenen monoklonalen Antikörpern (MAb).

Keiner der MAb´s reagierte in der IIPA mit den drei schwachvirulenten Stämmen

K503, K703 und K730. Im Western-Blot banden zwei MAb´s mit einem Protein (44

kDA) und ein MAb mit einem Protein (119 kDA) bei allen MG-Stämmen. Drei MAb´s,

die ihren Ursprung im S6-Stamm hatten, reagierten mit einem Protein, das ein

Molekulargewicht von 69 kDA aufwies. GARCIA et al. (1994) konnten an Hand

subklonierter Populationen in vitro einen Wechsel in der Ausprägung der Epitope

nachweisen.

LEVISOHN et al. (1995) untersuchten im Western-Blot die unterschiedlichen

antigenetischen Profile von MG-Isolaten (R-Stamm). Nach einer artifiziellen

aerogenen Infizierung reisolierten sie die Mykoplasmen mittels Abstrich drei und acht

Wochen p.i. aus den Tracheen der Versuchshühner. Die Bandenmuster der durch

die MAb´s identifizierten Oberflächenproteine veränderten sich im Verlaufe des

Versuches von der Inokulation beginnend bis acht Wochen p.i. deutlich. Die Autoren

sehen dies als Nachweis dafür, dass MG auch in vivo die Fähigkeit besitzt, seine

Oberflächenstruktur verändern und sich so der Wirtsabwehr entziehen zu können.

ELLAKANY et al. (1998) konnten in zwei Experimenten die Sensitivität eines

Immunoblottingverfahrens zum Nachweis von Antikörpern gegen MG in Tracheal-

spülproben und aus dem Blutserum belegen. Der Nachweis erfolgte mit Hilfe von

monoklonalen Antikörpern gegen IgG, IgM und IgA von Hühnern. Sie infizierten

62

Hühner im Alter von zehn Tagen mit dem MG-Stamm 1226. Zwei Wochen nach

dieser Belastungsinfektion untersuchten sie die Trachealspülproben und stellten fest,

daß die monoklonalen Antikörper gegen IgA mit acht Polypeptiden von MG

reagierten. Die Antikörper gegen IgG und IgM reagierten mit jeweils 3 Polypeptiden.

Im Serum konnten sie zu diesem Zeitpunkt keine IgA-Antikörper nachweisen, doch

reagierten die IgM-Antikörper mit acht Polypeptiden und die IgG-Antikörper mit 16

Polypeptiden von MG. In weiteren Untersuchungen stellten sie fest, daß nach einer

Infektion zunächst die Immunglobuline des Typs IgA in den Trachealspülproben

dominant waren und daß im Serum der Typ IgM vorherrschte. Ab der zweiten Woche

p.i. traten jedoch sowohl im Serum als auch in den Trachealspülproben die

Immunoglobuline des Typs IgG in den Vordergrund.

Die Möglichkeit einen Impfstoff gegen MG, auf Basis des Hühnerpockenvirus zu

entwickeln beschäftigte YOSHIDA et al. (2000). Hierzu isolierten sie den MAb 35A6

gegen den MG-Stamm R aus Mäusen. Dieser MAb bindet an ein Membranprotein

mit einen Molekulargewicht von 120 kDa und ist in der Lage sowohl das Wachstum

als auch den Stoffwechsel von MG in vitro zu unterbinden. Nach einer

Gensequenzierung und Genisolierung war es ihnen möglich, dass für das

Membranprotein entsprechende Gen (MGC 3) in das Genom von Hühnerpockenvirus

zu transferieren. Ein Hühnerpockenvirus war in der Lage das von dem MGC 3-Gen

terminierte Protein auf der Zelloberfläche zu exprimieren. YOSHIDA et al. (2000)

hielten es für möglich auf diese Weise einen Impfstoff gegen MG zu entwickeln.

2.4. Aerogene Infektion mittels Aerosol

Im Allgemeinen erfolgt eine Infizierung von Hühnern mit MG durch Inspiration die

anschließender Anheftung der Mykoplasmen an die Schleimhaut, vor allem der

oberen Atemwege (STIPKOVITS 1985). Bei der Beurteilung der Effizienz von

Impfstoffen im Experiment ist es notwendig, das natürliche Infektionsgeschehen

nachzuahmen (WHITHEAR 1996). JARNYCH (1976) faßte die Grundlagen der

Anwendung von Aerosolen in der Veterinärmedizin zusammen. Soll die

Verabreichung eines Aerosols zur Infektion eines Tieres über die Atemwege führen,

63

so ist die Schwebfähigkeit des Erregers und damit seine Fähigkeit, tief in die

Atmungsorgane einzudringen, entscheidend. Dies ist abhängig von der Größe der

Tröpfchen und der Konzentration des Aerosols. Bei einer zu hohen Anzahl von

Tröpfchen je Raumeinheit kommt es infolge der Brown´schen Bewegung durch

Kollision der Tröpfchen zu einer Größenzunahme der einzelnen Tropfen durch

„Koagulation“ (JARNYCH 1976). Ein konzentriertes Aerosol enthält daher,

unabhängig von seiner Ausganskonzentration, schon nach einigen Minuten nicht

mehr als 107 Tropfen / cm3.

Je kleiner die Tropfen sind, desto größer ist ihre Schwebfähigkeit. Aerosole, deren

Teilchen einen Durchmesser von 100 µm aufweisen, sind instabil und können daher

nicht in der Veterinärmedizin eingesetzt werden. Bei Teilchen mit einem

Durchmesser von weniger als 10-5 cm übertrifft die Brown´sche Molekularbewegung

die Schwerkraft. Diese Aerosole sedimentieren daher nur wenig. Sie werden als

hochdisperse Aerosole bezeichnet. Grobdisperse Aerosole besitzen einen

Teilchendurchmesser von 10-4 cm und weisen eine deutliche Sedimentationstendenz

auf. Aerosole mit der Teilchengröße von 10-4 bis 10-5 cm nehmen eine

Zwischenstellung ein. Besonders Teilchen mit einem Durchmesser von 0,2 µm

werden in Atmungsorganen und Filtern besonders schlecht zurückgehalten und

können daher auch tief in die Atmungsorgane eindringen.

Gleichzeitig weisen Stoffe, die als Aerosol vorliegen, eine stark vergrößerte

Oberfläche auf. Auf Grund dieser stark vergrößerten Oberfläche steigt die

Oberflächenaktivität an. Ein Beispiel hierfür ist die exponentielle Wirkungssteigerung

bei fein verteilten Desinfektionslösungen.

Die Anforderungen an Bauart und Betrieb einer Aerosol-Infektions-Box beschrieben

BEARD und EASTERDAY (1965). Es handelte sich hierbei um einen

Luftdruckvernebler mit zwei Kammern. Eine Kammer diente zur Vernebelung des

Agens, die andere zur zusätzlichen Versorgung der Tiere mit Luft. Die

Gesamtkapazität der Anlage betrug 8 l Luft/Minute. In das System war ein Filter

integriert, welcher einen Porendurchmesser von 0,8 +/- 0,05 µm aufwies. In der

Aerosolkammer herrschte negativer Luftdruck, um das Entweichen des Agens in die

Raumluft zu verhindern. Eine Vernebelungsdauer von 20 Minuten war bei diesem

64

Versuchsaufbau ausreichend, um eine Sättigung der Luft mit dem Agens zu

erreichen. Die Partikelgröße war nach ihrer Auffassung entscheidend für die

Eindringtiefe des Aerosols in den Respirationstrakt. Zur Infektion in den unteren

Abschnitten des Respirationstraktes verwendeten sie eine Partikelgröße von 4 - 5

µm. BEARD und EASTERDAY (1965) vermochten mit diesem Versuchsaufbau

erfolgreich Hühner mit Newcastle Disease Virus zu infizieren.

KLEVEN et al. (1972) beschrieben die erfolgreiche Infizierung von Eintagsküken

mittels Aerosol durch Mycoplasma synoviae, ohne genauer auf die technischen

Daten der Geräte einzugehen. Im ersten Versuch wurde ein „Sprayer“ für Impfungen

und in zwei weiteren Versuchen der „Vaponefrin standard nebulizer“ (Vaponefrin

Company, Edison, N.J.), verwendet. HAYATSU et al. (1974) nutzten eine 150 l große

Kammer zur aerogenen Impfung von Hühnern mit inaktiviertem MG-Impfstoff. Der

Vernebler (Toyoshima Co.) hatte eine Kapazität von 0,25 ml/min und arbeitete mit

einem Druck von 0,7 kg/cm². Sie gaben für diesen Versuch eine Impfdosis von 5 x

109 Zellen an. Für die Infizierung der Hühner verwendeten sie

Mykoplasmenkonzentrationen zwischen 7,4 x 103 bis 7,4 x 105 KBE/ml. Für die

Impfung von 1760 Broilern in einem Feldversuch verwendeten HAYATSU et al.

(1975) den „Sprayer“ MS-10 (Matsushita Electric Industrial Company, Ltd, Kadoma,

Japan). Der Sprayer hatte eine Durchflußrate von 10 ml/min, dies entsprach einer

Impfstoffmenge von 0,22 ml/Huhn in einem Zeitraum von 40 Minuten. Die

Konzentration des Impfstoffes gaben sie in diesem Versuch mit 2 x 1010 Zellen an.

Auf den Versuchsaufbau von KLEVEN (1972) bezogen sich LEVISOHN et al. (1986),

ABD-EL-MOTELIB und KLEVEN (1993) und ORTIZ et al. (1995). Zur Infektion der

Tiere verwendeten sie jeweils den MG-Stamm R, bzw. LEVISOHN et al. (1986) auch

die Stämme F, S-6, 227 und A 5969 in einem vergleichenden Experiment. Die

Konzentration der Mykoplasmen in der Suspension gaben ABD-EL-MOTELIB und

KLEVEN (1993) mit 5,0 x 108 KBE / ml und ORTIZ et al. (1995) mit 3,8 x 108 KBE /

ml an. RODRIGUEZ und KLEVEN (1980 a, b) verwendeten einen „Devilbiss No. 42

standard nebulizer“, um 14 Tage alte Küken mit dem F-Stamm (3 x 106 KBE / ml)

bzw. dem R-Stamm (4 x 108 oder 1,5 x 106 KBE / ml) zu infizieren.

65

CARPETER et al. (1981) benutzten in ihren Versuchen zur Vakzination von Hühnern

mit dem F-Stamm den Vernebler „HCS1-2AA“ der Firma Micro-Gen equipment, San

Antonio, Texas. Die Teilchengröße betrug 5 µm, für 1000 Hühner wurden 100 ml

einer Mykoplasmensuspension mit 109 KBE / ml versprüht.

LIN und KLEVEN (1982 a, b, 1984 a, b,) bezogen sich in ihrem Versuchsaufbau

wiederum auf RODRIGUEZ und KLEVEN (1980 a, b). Es gelang, mit dem Vernebler

„Devilbiss No. 42“ eine Infektion mit dem R-Stamm zu erzeugen und die

anschließende transovarielle Übertragung von MG auf Eier nachzuweisen. Auch

ELFAKI et al. (1992 und 1993) verwendeten diesen Vernebler, um Hühner mit dem

R-Stamm zu infizieren.

WHITHEAR et al. (1996) beschrieben ein Gerät zur aerogenen Infizierung mit MG,

um die Effizienz von MG-Vakzinen testen zu können. Grundlage für ihr

Infektionsmodell war die Arbeit von BEARD und EASTERDAY (1965). Die Kammer

faßte ein Volumen von 80 l bei einer Luftflußrate von 40 l/min, so dass in zwei

Minuten jeweils der Austausch der Luft erfolgte. Der Vernebler war eine Anfertigung

der Chemischen Werkstätten der Universität Melboure, Parkville und arbeitete mit

einer Luftrate von 15 l/min. Zur Infektion wurde die Luftrate der Frischluft auf 25 l/min

gesenkt. Die Teilchengröße betrug 1 bis 10 µm, wobei der Anteil der Teilchen < 5 µm

über 50 % lag. Für die Infektionsversuche verwendeten WHITHEAR et al. (1996) den

virulenten australischen Feldstamm Ap3AS. Hühner, die für 10 Minuten mit Aerosol

(40 l/min) infiziert wurden, welches 102 - 103 CCU/l enthielt, zeigten deutliche

Luftsackentzündungen und serologische Reaktionen. In der Trachea waren jedoch

keine pathologisch-anatomisch oder histologisch erkennbaren Läsionen

nachzuweisen.

66

3. Material und Methoden

3.1. Allgemeiner Versuchsaufbau

Zunächst wurde in Voruntersuchungen geprüft, ob die Hennen für die

Verträglichkeits- und Wirksamkeitsprüfung geeignet sind. Danach wurde die Hälfte

der aufgestallten Hennen in der 14. und 18. Lebenswoche mit der zu prüfenden MG-

Vakzine geimpft. Nachdem sowohl die Impfgruppe als auch die ungeimpfte

Kontrollgruppe eine Legeleistung von mindestens 70 % erreicht hatten, wurden beide

Gruppen mit dem Mycoplasma gallisepticum-Stamm R in Form eines erregerhaltigen

Aerosols inokuliert. Die Entwicklung der Legeleistung vor und nach der artifiziellen

Infizierung wurde dokumentiert und es wurden Blutproben zur serologischen

Untersuchung gewonnen. Nach einer Beobachtungszeit von mindestens vier

Wochen p.i. wurden die Tiere getötet. Es erfolgte eine pathologisch-anatomische

sowie eine kulturell-bakteriologische Untersuchung veränderter Organe. Zur

kulturellen Reisolation von MG wurden Proben aus Trachea, Lunge und Luftsäcken

gewonnen. Die zeitlichen Abläufe der einzelnen Versuchsdurchgänge sind in der

Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1: Zeitlicher Ablauf der Versuchsdurchgänge 1, 2 und 3

Versuch 1 Versuch 2 Versuch 3 1. Impfung*1 14. Lebenswoche 14. Lebenswoche 14. Lebenswoche 2. Impfung*2 18. Lebenswoche 18. Lebenswoche 18. Lebenswoche Infizierung*3 24. Lebenswoche 26. Lebenswoche 25. Lebenswoche

Versuchsende*4 28. Lebenswoche 30. Lebenswoche 29. Lebenswoche *1 Zeitpunkt der Aufstallung in die Klinik, 1. Impfung der Impfgruppe und Blutentnahme zur Überprüfung des serologischen Status *2 Zeitpunkt der 2. Impfung der Impfgruppe und Blutentnahme zur Überprüfung des serologischen Status *3 Zeitpunkt der experimentellen Infizierung beider Versuchsgruppen und Blutentnahme zur Überprüfung des serologischen Status *4 Versuchsende; Blutentnahme, Tötung und Sektion aller Versuchstiere

3.2. Voruntersuchungen

Zur Durchführung der Versuche wurden je Versuchsdurchgang 80 Legehennen im

Alter von 14 Wochen per Zufallsprinzip aus einer Herde kommerzieller Junghennen

entnommen und in die Klinik für Geflügel nach Hannover verbracht. 40 Hennen

67

bildeten die Impfgruppe, die anderen 40 die Kontrollgruppe. Die Aufteilung in diese

beiden Gruppen erfolgte nach dem Zufallsprinzip. Die Hennen wurden bei

Versuchsbeginn mit farbigen numerierten Flügelmarken gekennzeichnet. Hierbei

wurden die Hennen einer kurzen Allgemeinuntersuchung unterzogen. Je

Versuchsgruppe wurde bei jeweils 20 zufällig ausgewählten Hennen zum Zeitpunkt

der Aufstallung 10 ml je Tier Blut entnommen, um den MG- und MS-Status der Tiere

mittels Serumschnellagglutination feststellen zu können. In der 15. Lebenswoche

wurde je Gruppe eine gepoolte Kotprobe parasitologisch untersucht. Ziel der

Voruntersuchungen war es festzustellen, ob die Legehennen für den Hauptversuch

geeignet sind. Als Kriterien zur Beurteilung des Gesundheitszustandes wurden das

Allgemeinbefinden (Sensibilität [Aufmerksamkeit], Verhalten, Futter- und

Wasseraufnahme, Befiederung), die Ausbildung und Färbung des Kammes und die

Gewichtsentwicklung herangezogen. Zeigten Hennen eine Störung des

Allgemeinbefindens, erfolgte eine weitergehende Untersuchung des Tieres. Bei

einem Verdacht auf schwerwiegende Erkrankungen wurden diese Tiere getötet und

pathologisch-anatomisch untersucht. Die Voruntersuchung endete mit Beginn der

Legetätigkeit.

3.3. Hauptuntersuchungen

3.3.1. Verträglichkeitsprüfung

Als Kriterien für die Verträglichkeit des Impfstoffes wurde das Allgemeinbefinden

(Sensibilität, [Aufmerksamkeit], Verhalten, Futter- und Wasseraufnahme,

Befiederung, Gewichtsentwicklung) und die Legeleistung (nur bei adulten Hennen)

sowie die lokalen Reaktionen am Ort der Impfstoffapplikationen herangezogen. Die

Hennen wurden durch ein Kontrollfenster beobachtet sowie einige bei der täglichen

Stallkontrolle nach dem Zufallsprinzip einer kurzen Allgemeinuntersuchung

unterzogen und die Legeleistung dokumentiert. Da durch äußere Störungen, wie z.

B. klinische Untersuchungen, Gewichtsermittlung, Stallarbeiten oder Umstallungen

die Legeleistung von Hennen in erheblichem Maße negativ beeinflusst wird, wurde

nach Beginn der Legetätigkeit die klinische Untersuchung nur noch bei auffällig

gestörtem Allgemeinbefinden durchgeführt.

68

3.3.2. Wirksamkeitsprüfung

Die Überprüfung der Wirksamkeit wurde an der für den Impfstoff vorgesehenen

Zielart, Legehennen, vorgenommen. Daher war der Vergleich der Legeleistung

zwischen den geimpften Hennen und der ungeimpften Kontrollgruppe einziger

entscheidender Parameter. Ab der 18. Lebenswoche wurde die Legeleistung der

Hennen täglich dokumentiert. Bei Erreichen von mindestens 70 % Legeleistung

erfolgte die EBI beider Gruppen mit dem MG-Stamm R via Aerosol . Die Entwicklung

der Legeleistung wurde weiterhin dokumentiert und der Versuch nach einem

Beobachtungszeitraum von mindestens 28 Tagen p.i. beendet.

3.4. Herkunft und Haltung der Versuchstiere

Für die Voruntersuchungen und die Durchführung der Verträglichkeits- und

Legeleistungsprüfung wurden kommerziell erhältliche „Lohmann brown“-Legehennen

des Bodenhaltungstyps verwendet. Sie wurden von der Firma „Geflügelzuchtbetriebe

Gudendorf-Ankum GmbH & Co.“ als MG- und MS-freie Junghennen bezogen. Zum

Zeitpunkt der Aufstallung befanden sich die Hennen in der 14. Lebenswoche. Sie

entstammten den Legehennenaufzuchtbetrieben N. (Voruntersuchungsgruppe A),

G/S. (Voruntersuchungsgruppen B und C) W.-L. (Voruntersuchungsgruppe D) und N.

(Voruntersuchungsgruppe E). Die Tiere wurden in zwei identischen Versuchsställen

der Klinik für Geflügel in Bodenhaltung mit Sägespänen als Einstreu aufgestallt. Die

Grundfläche des Stalls betrug 9 m2. Weiterhin befand sich in dem Raum eine

Sitzstange von 2,5 Metern Länge und 10 cm Durchmesser. In der 18. Lebenswoche

wurden übereinander 2 x 5 Legenester Marke „Eierglück“ der Firma Siepmann,

Herdecke, aufgestellt.

Da die Ställe über keine Klimatisierung verfügten, war es in den Sommermonaten

nicht möglich, die Temperatur in den Ställen bei Außentemperaturen von über 18° C

auf diesem Niveau zu halten, so dass es im ersten Versuchsdurchgang zu

Temperaturschwankungen kam. Durch die Möglichkeit, die Zuluft zu erwärmen, war

es jedoch möglich, bei niedrigen Außentemperaturen die Raumtemperatur in den

Versuchsställen bei konstant 18° C zu halten.

69

Die Junghennen erhielten bis zur 18. Lebenswoche pelletiertes Junghennenaufzucht-

futter in einem Hennenfuttertrog mit einer Länge von einem Meter. Die Futtermenge

steigerte sich von 72 g je Henne in der 14. Lebenswoche auf 84 g in der 18.

Lebenswoche. Ab der 18. Lebenswoche erhielten die Hennen pelletiertes

Legehennenfutter, bis zur 22. Lebenswoche 100 g je Henne pro Tag, danach wurde

ad libitum gefüttert. Bei der täglichen Stallkontrolle wurde verbliebenes Futter aus

den Trögen entfernt. Wasser wurde durch eine automatische Standard-Hängetränke

stets ad libitum angeboten. Die Tränken und Tröge wurden täglich gereinigt.

Alleinfuttermittel für Legehennen: Inhaltsstoffe:

Rohprotein 16,50 % Methionin 0,36 % Rohfett 5,00 % Rohfaser 4,50 % Rohasche 12,50 % Calzium 3,40 % Phosphor 0,55 % Natrium 0,15 % MJ ME 11,00

Zusatzstoffe je kg Mischfutter:

Vitamin A 13500 I. E. Vitamin E 16 mg Vitamin D3 2700 I.E. Kupfer 28 mg Zinkbacitracin 50 mg Antioxydans (Buthylhydroxytoluol) Canthaxanthin

Die Beleuchtungsintensität in den Ställen betrug bis zur 16. Lebenswoche der

Hennen 5 Lux, in der 17. Woche 10 Lux und ab der 18. Lebenswoche bis zum

Versuchsende 15 Lux. Die Beleuchtungsdauer richtete sich nach dem

Beleuchtungsprogramm der Lohmann Tierzucht GmbH. Sie steigerte sich von acht

Stunden pro Tag in der 14. Lebenswoche auf schließlich 15 Stunden täglich ab der

23. Lebenswoche.

3.5. Mycoplasma gallisepticum - Stämme

3.5.1. Herkunft

R (K 781) 1990 S.H. KLEVEN, Poultry Research Center, Department of Avian

Medicine, University of Georgia, Athens, Georgia 30605, USA

70

A 5969 1990 S.H. KLEVEN, Poultry Research Center, Department of Avian

Medicine, University of Georgia, Athens, Georgia 30605, USA

3.5.2. Anzüchtung und Vermehrung

Herstellung der Mycoplasma-Nährmedien

Für die Anzüchtung von MG wurde das Flüssigmedium nach FREY et al. (1968)

verwendet. Die genaue Zusammensetzung des Mediums ist im Anhang mitgeteilt.

Für die Zubereitung von 500 ml Flüssigmedium wurden die einzelnen Substanzen

abgewogen und in 450 ml Ampuwa (Fresenius AG) mittels eines Magnetrührers

gelöst und mit 1N NaOH-Lösung der pH-Wert auf 7,8 eingestellt. Anschließend

wurde die Lösung mit Hilfe autoklavierter (121 °C, 15 min) Seitz-Filter (0,2 µm) der

Firma Schleicher & Schuell sterilfiltriert. Danach wurden 50 ml inaktiviertes (56 °C, 35

min) und sterilfiltriertes Schweineserum zugegeben und die Bouillon durchmischt.

Die Aufbewahrung der fertigen Nährmedien erfolgte in sterilen 10 ml

Polystyrolröhrchen mit Schraubverschluß (Firma Greiner), die mit je 5 ml Bouillon

beschickt wurden, oder in autoklavierten Erlenmeyerkolben (100 ml) mit

Schraubverschluß für maximal eine Woche bei 7 °C. Die Herstellung größerer MG-

Antigenmengen als Inokulum erfolgte in je 500 ml Mykoplasmenbouillon, abgefüllt in

sterilen Erlenmeyerkolben (1000 ml), die mit sterilen Zellulosestopfen verschlossen

wurden. Zur Herstellung des Festmediums nach FREY et al. (1968) wurde zunächst

15 g Noble-Agar (Difco) in 450 ml Ampuwa gelöst und eine Stunde stehengelassen,

bevor diese Suspension bei 121 °C für 15 Minuten autoklaviert wurde. Anschließend

wurde 450 ml flüssiger Agar mit 450 ml Flüssigmedium ohne Phenolrot (s. o.) bei 50°

C vermischt und sterilfiltriertes, inaktiviertes Schweineserum (100 ml) hinzugefügt. Je

10 ml wurden mit autoklavierten Cornwall-Spritzen in Petrischalen gefüllt, wobei die

Luftbläschen an der Oberfläche mit dem Bunsenbrenner entfernt wurden. Die

Mycoplasma-Agarplatten wurden in Plastiktüten eingeschweißt und maximal eine

Woche bei 7 °C gelagert. Zur Sterilitätskontrolle der Bouillon wurde je ein Tropfen mit

einer sterilen Pipette auf MG-Agarböden und Blutagar verbracht, und anschließend

bei 37° C aerob und mikroaerob bebrütet. Zur Kontrolle der MG-Agarplatten wurden

diese stichprobenartig wie oben beschrieben bebrütet.

71

Anzüchtung der MG-Stämme

Die verwendeten Stämme waren als Lyophilisat verfügbar. Der Inhalt der

lyophilisierten Röhrchen wurde mit 0,5 ml physiologischer NaCl-Lösung

resuspendiert. Die Anzüchtung erfolgte im Overlay-Medium in Polystyrolröhrchen

(Firma Greiner), die mit 1 ml MG-Agar beschickt und mit 5 ml MG-Flüssigmedium

überschichtet worden waren, bei 37°C ± 1 °C. Nach 24 Stunden erfolgte die erste

Kontrolle auf den Umschlag des Farbindikators. Bei einer Vermehrung der

Mykoplasmen kommt es durch die Metabolisierung von Glukose und der damit

verbundenen Freisetzung von H+-Ionen zu einem Absinken des pH-Wertes. Diese

Änderung des pH-Wertes bewirkt einen Farbumschlag des Indikators von rot nach

orange bis gelb. Die optische Kontrolle erfolgte unter standardisierten

Lichtverhältnissen vor demselben Hintergrund. Nach der kulturellen Anzüchtung

wurde die Einsaatkultur jeweils im Mengenverhältnis 1 : 10 verimpft. Subkulturen

wurden jeweils mit 0,05 ml der Flüssigkultur angelegt. Die Bebrütung erfolgte unter

mikroaeroben Bedingungen in einen Exsikkator bei 37 °C +/- 1 °C bis zu 72 Stunden.

Alle Arbeiten mit Mycoplasmen erfolgten in einem seperatem Sterillabor.

Herstellung des Inokulums

Zur Herstellung des zur Infizierung benötigten Inokulums wurde der Mycoplasma

gallisepticum-Stamm R verwendet und zunächst Wachstumsstudien mit

verschiedenen Beimpfungsmengen durchgeführt. So war es möglich, die

Wachstumsdynamik des Stammes zu verfolgen, um die für die artifizielle Infizierung

benötigte Menge des Inokulums zum gewünschten Zeitpunkt zur Verfügung zu

haben. Bei der Herstellung des Inokulums wurde pro Versuchsdurchgang schließlich

mit 6 x 50 ml Einsaatkultur 6 x 500 ml auf 37 °C vorgewärmtes MG-Flüssigmedium

beimpft und bei 37 °C bebrütet. Bei einem pH-Wert von 7,2 wurde die Kultur aus dem

Brutschrank genommen und in der Zentrifuge „Sorvall Superspeed RC-2-B“ mit dem

Rotor „GS-3“ bei 4 °C für 30 Minuten mit 10000 x g zentrifugiert. Der Überstand

wurde verworfen und die sedimentierten Mykoplasmen mit insgesamt 30 ml

Phosphatpufferlösung resuspendiert. Jeweils ein Milliliter wurde zur Bestimmung der

Anzahl der KBE/ml verwendet.

72

Herstellung des MG-HA-Antigens

Die Herstellung des Antigens für den HAH-Test erfolgte wie oben beschrieben unter

Verwendung des MG-Stammes A 5969. Nach sieben Passagen wurde 50 ml

Einsaatkultur auf 500 ml Flüssigmedium überimpft und bis zu einem pH-Wert von 7,0

bebrütet. Hierauf wurde die Kultur bei 4° C für 30 Minuten bei 10000 x g in der

Zentrifuge „Sorvall Superspeed RC-2-B“ mit dem Rotor „GS-3“ zentrifugiert. Der

Überstand wurde dekantiert und das Mykoplasmenpellet in 5 ml

Phosphatpufferlösung resuspendiert.

Bestimmung des vermehrungsfähigen Mykoplasmengehalts

Zur Bestimmung der Anzahl der koloniebildenden Einheiten (KBE) je Milliliter wurde

jeweils von der MG-Suspension, die zur experimentellen Infizierung der Hennen

vorgesehen war, ein Milliliter abgenommen und eine Verdünnungsreihe hergestellt.

Jeweils 0,05 ml mykoplasmenhaltige Suspension wurden in Zehnerstufen (log10)

jeweils im Verhältnis 1:10 in MG-Bouillon verdünnt und mit einem Schüttelautomaten

vermischt. Mit einer Eppendorf-Pipette wurden nun wiederum 0,05 ml Suspension

jeder Verdünnungsstufe in die Mitte der Agarplatten verbracht und ausgestrichen.

Die Agarplatten wurden dann unter mikroaeroben und humiden Klima im Exsikkator

bei 37° C +/- 1° C für zwei Tage bebrütet. Die Agarplatten, bei denen die Kolonien

weitgehend einzeln lagen ( 20 bis 100 Kolonien), wurden zur Auszählung

herangezogen. Die Auszählung erfolgte unter einem Stereomikroskop bei 20-facher

Vergrößerung.

3.6. Vakzination

In den drei Versuchsdurchgängen 1, 2 und 3 wurden die Chargen 5, 6 und 7 des

Impfstoffes „TALOVAC 104 MG“ der Firma Lohmann Animal Health GmbH & Co. KG

geprüft.

Nach drei Tagen Lagerung des Impfstoffes bei 6° C im Kühlschrank zeigte sich bei

den drei Chargen eine unterschiedliche Entmischung des Impfstoffes. In allen drei

Flaschen der Charge 5 bildete sich die von LAH beschriebene hellgelbliche, 2-3-mm

dünne, Schicht heraus, welche nach leichtem Schütteln wieder aufzulösen war. Der

73

Inhalt der Flaschen der Chargen 6 und 7 wies eine andere Schichtung auf. Zuoberst

befand sich ein hellweißlicher, 6-8 mm dicker Streifen einer Flüssigkeit, die im

Tröpfchentest im 4°C kalten Wasser den Charakter einer öligen Substanz aufwies.

Darunter folgte eine Emulsion, die adspektorisch ohne Anzeichen einer Entmischung

war. Am Boden der Flaschen befand sich ein ca. 2 mm dünner Film fast klarer

Flüssigkeit. Durch leichtes Schütteln ließen sich auch diese Bestandteile wieder

vermischen. Ursachen für die unterschiedliche Entmischung konnten von der Firma

LAH nicht angegeben werden.

Abweichend von dem von LAH empfohlenen Impfschema, 1. Impfung 6. - 8.

Lebenswoche und 2. Impfung 14. - 16. Lebenswoche, erfolgten die Vakzinationen in

dieser Versuchsanordnung in der 14. und 18. Lebenswoche.

Die Impfstoffmenge betrug 0,5 ml je Henne, die Impfung erfolgte mit einer

Revolverspritze mit Luer-Konus. Zur Impfung wurden Einmalkanülen 1,1 x 25 mm

verwendet, die nach jeder zehnten Henne erneuert wurden. Die Impfstoffapplikation

erfolgte subkutan, kaudal im Bereich der Halsbasis.

Nach den Vakzinationen wurden lokale Veränderungen an der Injektionsstelle nach

dem folgendem Beurteilungsschlüssel von Dr. Opitz, (1982) University of Maine,

Cooperative Extension, Orono Maine, USA, bewertet:

Grad 0 = keine Veränderungen

Grad 1 = Reste von Öl, keine Entzündungsreaktion

Grad 2 = einzelne Granulome, weniger als 2 cm Durchmesser

Grad 3 = einzelne oder multiple Granulome - im Durchmesser von 2 cm oder

mehr

Grad 4 = große Granulome, diffuse Schwellungen mit Nekrosebildungen; 4 bis

6 cm im Durchmesser, die das Allgemeinbefinden des Impflings durch

Druck auf Organe wie Nerven, Blutgefäße oder Schlund stören.

74

3.7. Experimentelle Belastungsinfizierung

3.7.1. Infizierungskammer nach W. Holländer (1995)1

Abb. 1: Schemazeichnung der Infektionskammer

(1) Infektionskiste

(2) Ablenkplatte

(3) Luftzuführung (Plastikregenrohr mit Ventilator)

(4) PARI LL – Vernebler

(5) Kompresssor 1 Dr. Werner Holländer, Fraunhofer Institut für Toxikologie und Aerosolforschung D-30625 Hannover

75

Für die Inokulation der Hühner mit dem erregerhaltigen Aerosol wurde aus 8 mm

starken Spanholzplatten eine Kiste (1) mit einer Grundfläche von 2 m x 1 m und

einer Höhe von 0,5 m gebaut. Der Kistendeckel war im Verhältnis ¼ zu ¾ geteilt. Um

die Hühner in die Kiste setzen zu können, war der größere Teil des Deckels

aufklappbar. In der Mitte befand sich ein Loch mit einem Durchmesser von 10 cm

und unterhalb davon, auf der Deckelunterseite, war parallel ein Brett (2) angebracht,

welches zur Luftablenkung und damit zur gleichmäßigen Verteilung des

erregerhaltigen Aerosols diente. Die Luftzufuhr (3) erfolgte über ein 1 m langes

Plastikregenrohr (Hagebaumarkt) mit einem Durchmesser von 10 cm, an dessen

unteren Ende sich ein 12-Volt Ventilator (Conrad Electronics) befand. Dieser wurde

mit einem Eisenbahntrafo (Märklin) auf minimale Drehzahl reduziert, so dass die

Luftaustrittsgeschwindigkeit am Ausgang des Rohres 2,2 m/s betrug. Am oberen

Rand des Rohres waren zwei Öffnungen gebohrt, welche die Mundstücke der beiden

„PARI LL - Vernebler“ (4) aufnahmen; über Schläuche wurde aus den Kompressoren

(5) die benötigte Druckluft zugeführt.

3.7.2 Pariboy-Ultraschallvernebler

Für die aerogene Inokulation mit den Mycoplasmen des R-Stammes wurden zwei

PARI LL - Vernebler , PARI GmbH, Moosstraße 9, D-82319 Starnberg, mit dem Pari

Boy als Kompressor gewählt. Der Pari Boy wird im Bereich der Humanmedizin zur

Behandlung von Atemwegserkrankungen eingesetzt.

Bei dem PARI LL - Vernebler handelt es sich um einen Ultraschallvernebler, der mit

Druckluft betrieben wird. Der mediane Massendurchmesser (MMD) beträgt 4,8 µm,

und die Auswurfleistung beträgt 0,42 g / min (0,9 % NaCl-Lösung). Der Pari Boy

Kompressor liefert einen Betriebsdruck von 0,75 bar.

3.7.3. Präparation und Applikation des Inokulums als Aerosol

Die Mykoplasmen (Durchmesser von 0,25-0,5 µm) liegen in Form einer Suspension

in einer Phosphatpufferlösung vor. Der Pari Boy vernebelt diese Suspension, wobei

52 % der Tröpfchen einen Durchmesser < 5 µm aufweisen. Dies hat zur Folge, dass

die einzelnen Mykoplasmen in einem Wassertropfen eingehüllt vorliegen. Die Größe

76

Abb. 2: PARI BOY - Pari GmbH D-82319 Starnberg - Technische Daten

77

dieser Teilchen reduziert die Schwebfähigkeit und die Eindringtiefe der Mykoplasmen

in die Bronchien, Lungen und Luftsäcke (siehe 2.4.). Durch den Luftsog, der durch

den Ventilator erzeugt wird, werden die Mykoplasmen, die aus den Pari-Boy

Ultraschallverneblern in das Rohr eintreten, in die Infektionskammer transportiert.

Während dieses Vorganges verdunstet die Wasserhülle der meisten Mykoplasmen.

Hierdurch erhöht sich wiederum die Schwebfähigkeit und Eindringtiefe der

Mykoplasmen. Eine Schädigung der Lebensfähigkeit der Mykoplasmen durch die

Ultraschallvernebelung ist durch die kurze Zeit der direkten Einwirkung nicht zu

befürchten.

Die Präparation des Inokulums erfolgte wie oben beschrieben. Die Hennen jeder

Gruppe wurden jeweils gemeinsam aus ihrem Stall in die Infektionskammer

verbracht und dort mit je 15 ml Mykoplasmensuspension inokuliert. Jeder der beiden

PARI - LL - Vernebler wurde mit 7,5 ml gefüllt. Nachdem diese Menge vernebelt war,

wurden beide PARI - LL - Vernebler noch einmal mit je 7,5 ml Phosphatpufferlösung

befüllt. Nach Abschluß der Vernebelung verblieben die Hühner für weitere 15

Minuten in der Infektionskammer, bevor sie wieder in die zwischenzeitlich gereinigten

Ställe verbracht wurden.

Für die zur Belastungsinfektion der Hennen gebrauchten Suspensionen wurden

durch Verdünnungsreihen folgende Titer ermittelt:

Tabelle 2: Infizierungsdosen für die experimentellen Belastunginfizierung

Versuchsdurchgang 1 - Charge 5 2 x 15 ml mit je 3,2 x 107 KBE / ml Versuchsdurchgang 2 - Charge 6 2 x 15 ml mit je 4,5 x 107 KBE / ml Versuchsdurchgang 3 - Charge 7 2 x 15 ml mit je 4,8 x 107 KBE / ml

3.8. Klinische Untersuchungen

3.8.1. Allgemeinbefinden

Die Legetätigkeit der Hennen ist ein sehr empfindlicher Indikator für Störungen der

Hömöostase. Daher wurde das Allgemeinbefinden (Sensibilität [Aufmerksamkeit],

Verhalten, Futter- und Wasseraufnahme, Befiederung) täglich nach einer mindestens

zehnminütige Beobachtung durch ein verdecktes Stallfenster beurteilt. Eine

78

weitergehende Untersuchung der einzelnen Tiere beschränkte sich auf die Hennen,

die bei den täglichen Stallarbeiten (Eier sammeln, Reinigung von Trog und Tränke

sowie Befüllung des Troges mit Futter) in die Hand genommen werden mussten. Bei

diesen Tieren wurden Augen, Nasenöffnungen und der Ernährungszustand

untersucht.

3.8.2. Lokale Impfstoffreaktion

Im Rahmen der Untersuchung des Allgemeinbefindens (3.7.1.) wurde bei den

Hennen der Impfgruppen, die bei der täglichen Stallkontrolle in die Hand genommen

wurden, das untere Halsdrittel im Bereich der Impfstoffapplikation durchgetastet.

3.8.3. Legeleistung

Die Eier wurden während der täglichen Stallkontrolle eingesammelt und die

Legeleistung einer jeden Gruppe notiert.

3.9. Serologisch nachweisbare Reaktionen

Zur serologischen Untersuchung wurde von den Hennen dreimal Blut gewonnen. Die

erste Blutentnahme erfolgte zum Zeitpunkt der zweiten Vakzination, die zweite zum

Zeitpunkt der Infizierung und die dritte zum Zeitpunkt der Tötung bei Versuchsende

(siehe Tabelle 1). Während des Versuchszeitraumes erfolgte die Blutentnahme aus

der Vena basilaris, bei Versuchsende aus der Vena jugularis. Der Blutkuchen wurde

anschließend mit einem Glasstab von der Wand der Auffanggefäße gelöst, bei 37 °C

für eine Stunde im Brutschrank inkubiert und dann für zehn Minuten zentrifugiert

(Megafuge 1,0; Heraeus 3000 U/min. entsprechend 3120 x g).

Unmittelbar nach der Serumgewinnung erfolgte die Untersuchung in der

Serumschnellagglutination. Anschließend wurden die Serumröhrchen mit sterilen

Zellulosestopfen verschlossen und für 24 Stunden bei - 18 °C eingefroren. Bis zur

Durchführung weiterer serologischer Untersuchungen (ELISA, HAH), die nach dem

Ende des dritten Versuchsdurchganges erfolgten, wurden die Seren bei - 70 °C

gelagert.

79

3.9.1. Serum-Schnellagglutinations-Test

Der Test wurde entsprechend der Gebrauchsinformation des Herstellers und nur mit

frisch gewonnenen Seren durchgeführt. Zunächst wurden Serum, Antigen sowie

Tüpfelplatte, Glasstäbe und Pipetten auf Raumtemperatur erwärmt. Ein Tropfen des

Serums wurde jeweils mit einer sterilen Glaspipette auf eine Tüpfelplatte verbracht,

mit Hilfe eines Glasstabes mit je einem Tropfen MG- bzw. MS-Antigen (Mycoplasma-

Gallisepticum- und Mycoplasma-Synnoviae-Antigen Vemie, Vemie Veterinär Chemie

GmbH, Kempen) vermischt. Die Tüpfelplatte wurde für 30 Sekunden stehengelassen

und dann für 90 Sekunden vorsichtig geschwenkt. Erfolgte innerhalb von 120

Sekunden eine Agglutinationsreaktion, so wurde dies als positives Ergebnis, d.h. als

Nachweis von spezifischen agglutinierenden Antikörpern gegen MG bzw. MS

gewertet. Zeitlich spätere oder schwache Agglutinationsreaktionen wurden als

zweifelhaftes Ergebnis angesehen. Je nach Menge der im Serum vorhandenen

Antikörper kam es zu einer unterschiedlichen Größe der Flocken, die aber nicht zur

quantitativen Bewertung herangezogen wurden.

Als Maßstab für die Bewertung der Agglutinationsreaktionen wurde folgende

Einteilung zu Grunde gelegt:

Keine Antigen-Antikörper (Flockung) Reaktion -

Schwache und/oder verzögerte Reaktion (Flockung nach mehr als 2 min.) (+)

Positive Reaktion (Flockung innerhalb von 2 min.) +

Bei jeder Untersuchung wurden Negativkontrollen durchgeführt. Reines Antigen

wurde auf die Tüpfelplatte getropft und auf Flockenbildung kontrolliert.

3.9.2. Hämagglutinationshemmungstest (HAHT)

Der Hämagglutinationshemmungstest wurde entsprechend der Beschreibung von

HINZ (1977) im Mikrotestverfahren durchgeführt. Zunächst wurde eine 0,75 %ige

Erythrozytensuspension hergestellt. Hierzu wurden 3 ml Alsever´sche Lösung und 7

ml Hühnerblut in einem Reagenzröhrchen gemischt. Anschließend wurde diese

Suspension bei 3000 U/min für zehn Minuten zentrifugiert und der Überstand

verworfen. Zweimal wurde der Bodensatz mit Phosphatpuffer aufgeschwemmt und

80

erneut zentrifugiert, so daß schließlich ein Erythrozytenkonzentrat vorlag. 0,75 ml

wurden mit 99,25 ml Phosphatpufferlösung zur Erythrozytensuspension gemischt.

Da bei der Verwendung von frisch hergestelltem HA-Antigen keine unspezifischen

Reaktionen auftreten, kann auch ohne eine Behandlung mit RDE (receptor

destroying enzyme) (ROBERTS u. OLESIUK 1967) bereits ein Hemmtiter von 1:5 als

spezifisch anzusehen ist (Hinz 1977).

Zunächst wurde durch eine Titrationsreihe der HA-Antigenendtiter bestimmt. Hierzu

wurde eine geometrische Verdünnungsreihe, beginnend mit 1:2, 1:4 usw. erstellt. Zu

jeder Stufe der Verdünnungsreihe (0,025 ml) wurden ein Tropfen physiologischer

NaCl-Lösung und zwei Tropfen (0,05 ml) einer 0,5 % Hühnererythrozytenlösung

gegeben und alles gut durchmischt. Nach 45-minütigem Stehenlassen bei

Zimmertemperatur wurde die Bewertung durchgeführt. Als HA-Antigenendtiter wurde

die Verdünnungsstufe gewertet, in der eine vollständige Hämagglutination bei

gleichzeitiger einwandfreier Erythrozytenkontrolle vorlag. Für die Antigensuspension

wurde ein HA-Antigenendtiter von 1:64 ermittelt. Im HAHT fand eine

Antigengebrauchsverdünnung von 1:16 Anwendung, entsprechend 4 HA-Einheiten in

0,025 ml.

Die Seren wurden nach der β-Methode beginnend mit 1:5, 1:10 usw. in

physiologischer Kochsalzlösung verdünnt. Nach Zugabe von Antigen und

Erythrozytensuspension wurde die Mikrotiterplatte (Nunc-Mikrotiterplatten aus

Polystyrol mit U-förmigen Vertiefungen) für eine Minute geschüttelt und für eine

Stunde bei Zimmertemperatur stehengelassen. Danach erfolgte die Ablesung der

Ergebnisse. Als Hemmtiter wurde die Serumverdünnung gewertet, bei der eine

vollständige Hemmung des HA vorlag und der knopfförmige Erythrozytenbodensatz

bei Schräghaltung der Titerplatten auslief.

Da bei der Berechnung des geometrischen Mittelwertes aufgrund der Einteilung nach

der β-Methode große Schwankungen entstehen, wurden die einzelnen

Verdünnungen mit Titerstufen gleichgesetzt. Hierbei entsprach die Verdünnung von

1:5 der Titerstufe 1, die Verdünnung von 1:10 der Stufe 2 usw.. Aus den Werten der

einzelnen Proben wurde dann der geometrische Mittelwert (GMT) der Gruppe

berechnet.

81

3.9.3. Enzymgebundener Immunadsorptionstest zum Nachweis von Antikörpern

(ELISA)

Für die Durchführung des ELISA wurde der ProFlok® „Mycoplasma gallisepticum

antibody test kit“ der Firma Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg

Maryland, USA, entsprechend der Gebrauchsanweisung verwendet. Die

Extinktionsbestimmung wurde mit einem Photometer bei einer Wellenlänge von 405

nm vorgenommen und mittels KPL-ELISA Programm am Computer ausgewertet.

Proben mit einem Titer von ≥ 744 sind als spezifisch positiv zu bewerten.

Bei fraglichen Ergebnissen in der SSA (MG/MS - Kreuzreaktionen) wurde zur

Klärung zusätzlich der entsprechende MS-ELISA durchgeführt.

3.10. Pathologisch-anatomische Untersuchungen

Traten im Verlauf der Vor- bzw. Hauptuntersuchungen gravierende Störungen des

Allgemeinbefindens einzelner Tiere oder Anzeichen einer Erkrankung mehrerer

Hennen einer Gruppe auf, wurden diese Tiere während des Versuchsdurchganges

getötet und seziert. Am Ende der Versuche wurden dann alle verbliebenen Hennen

getötet und seziert. Die Sektion erfolgte entsprechend des Sektionsganges nach

HINZ et al. (1993). Veränderungen an den Organen wurden protokolliert und nach

ihrem Schweregrad und dem Grad ihrer Ausbreitung mit Hilfe einer vierstufigen

Bewertungsskala numerisch kodiert. Zum Vergleich der Gruppen wurde jeweils das

arithmetische Mittel gebildet. Die Bewertung der entzündlichen Veränderungen der

Luftsäcke (LSE-Score-Werte) in den Kontroll- und Impfgruppen wurde in Anlehnung

an das System von YODER et al. (1984) vorgenommen.

Die folgende Bewertung der Organveränderungen wurden durchgeführt:

Herzbeutel:

geringgradig: grau-gelbliche Trübung und einfache Dickenzunahme des Peri-

kards, vor allem im Bereich der Verbindungsstelle zu den

thorakalen kranialen Luftsäcken.

82

Lunge:

geringgradig: Stauungslunge

mittelgradig: herdförmige Verdichtungsherde

Luftsäcke:

geringgradig: diffuse, grau-gelbe Trübung einer Luftsackwand, teilweise

verbunden mit herdförmigen Auflagerungen eines dünnen

Fibrinfilms.

mittelgradig: grau-gelbe Trübung und bis zweifache Verdickung der Luftsack-

wände mit großflächigen Auflagerungen von fibrino-purulentem

bis fibrinösem Exsudat bei einem oder zwei Luftsäcken.

hochgradig: entzündlich verdickte grau-gelbe Luftsäcke mit Ansammlungen

von fibrinösem Exsudat im Luftsacklumen bei zwei oder mehr

Luftsäcken

Leber, Milz:

geringgradig: Hyperämie

mittelgradig: Vergrößerung um 1/3 des Gewichts und Abflachung der

Leberränder.

hochgradig: Vergrößerung und Verdoppelung des Gewichtes bei Vorliegen

einer Stauungshyperämie.

Eierstock:

geringgradig: ein bis zwei Fibrinflocken zwischen den Follikeln eines aktiven

Eierstocks

mittelgradig: drei bis vier Fibrinflocken zwischen den Follikeln eines aktiven

Eierstocks

hochgradig: Mesosalpinx und die dem Eierstock benachbarten Luftsäcke

zeigen ausgeprägte fibrinöse entzündiche Veränderungen und

zahlreiche Fibrinflocken zwischen den Tertiärfollikeln des aktiven

Eierstocks; oder Vorhandensein von einem inaktiven,

degenerativ veränderten Eierstock.

83

3.11. Kulturell-bakteriologische Untersuchungen

Kulturell auf MG wurden ein ca. 5 cm langes Teilstück der Trachea aus dem Bereich

des kranialen Brusteinganges, ein Lungenflügel und ein Teil der thorakalen und

abdominalen Luftsäcke untersucht. Bei den Versuchsdurchgängen 1 und 3 wurde die

Schleimhaut der Tracheen mit einer jeweils zuvor ausgeglühten Platinöse

abgeschabt und anschließend auf MG-Agar ausgestrichen. Die Tracheaproben der

Hennen des zweiten Versuchsdurchganges wurden mit sterilen Wattetupfern

genommen. Bei diesen Proben erfolgte zusätzlich eine Untersuchung mittels PCR-

DNS-Sondentechnik auf MG-DNS. (SALISCH et al. 1998). Zum Nachweis von MG

aus Lunge und Luftsack wurden Proben von frisch entnommenen Organen auf MG-

Agar übertragen und ausgestrichen.

Im Rahmen der pathologisch-anatomischen Untersuchungen wurden Proben von

Herz, Leberlappen, Milz, Teilen der Lunge und Luftsäcke sowie veränderte und

unveränderte Ovarien mit sterilem Besteck entnommen und auf Blut - und

Drigalskiagar verimpft. Beim Herz, der Leber, der Milz und der Lunge wurden frisch

angelegte Schnittflächen auf den Nährböden ausgestrichen. Von den Luftsäcken

wurde mit einer ausgeglühten Platinöse eine Probe entnommen und verimpft. Die

Blutagarplatten wurden bei 37° C für 24 Stunden unter mikroaeroben Verhältnissen

angezüchtet. Die Bebrütung der Drigalskinährböden erfolgte ebenfalls bei 37° C

unter aeroben Bedingungen. Die weitere Differenzierung und Beurteilung erfolgte wie

bei BLOME (1994) beschrieben.

3.12. Statistische Auswertung

Die biostatistisch vergleichende Auswertung der Legeleistungen der Impf- mit der

Kontrollgruppe und die Untersuchungen auf die Signifikanz wurden mit Hilfe des

SAS® (Statistical Analysis Systems, Version 6.04 1989) Computerprogramms im Chi-

Quadrat-Test mit freundlicher Unterstützung des Institutes für Biometrie der

Tierärztlichen Hochschule Hannover, durchgeführt. Die biostatistische Auswertung

der ELISA-, HAH- und der LSE-Score-Werte erfolgte mit dem SPSS Programm

Version 9.0 (1999). Die Signifikanzprüfung der errechneten ELISA-Werte wurde im

84

T-Test, die der HAH- und der LSE-Score-Werte im Mann-Whitney-U-Test

durchgeführt.

85

4. Ergebnisse

4.1. Voruntersuchungen

4.1.1. Zum Zeitpunkt der Einstallung

Zum Zeitpunkt der Aufstallung in der Klinik konnte bei keiner der Hennen eine

Störung des Allgemeinbefindens festgestellt werden.

In den Kotproben, deren Untersuchung in der 15. Lebenswoche der Hennen erfolgte,

konnten mikroskopisch keine Parasiten bzw. deren Eier nachgewiesen werden.

Die Seren aller Hennen, die bei der Ankunft in der Klinik mittels SSA untersucht

worden waren, wiesen keine spezifischen agglutinierenden Antikörper gegen das

Mycoplasma gallisepticum-Antigen auf. Im Versuch A konnten jedoch bei 14 von 20

untersuchten Blutserumproben in der SSA bei der Verwendung von Mycoplasma

synoviae-Antigen eine positive Reaktion festgestellt werden. Auch die Junghennen

der Versuche B, C und D zeigten in der SSA für MS positive Reaktionen. Bei der

Voruntersuchungsgruppe D wurden bei zwölf von 20 Blutserumproben Antikörper

gegen Mycoplasma synoviae in der SSA festgestellt. Nur die

Voruntersuchungsgruppe E wies in der SSA keine agglutinierenden Antikörper gegen

MS-Antigen auf. Die Spezifität der positiven Reaktionen in der SSA konnten in allen

Fällen im enzymgebundenen Immunadsorptionstest zum Nachweis von Antikörpern

(ELISA) mit dem Pro-Flok® „Mycoplasma synoviae antibody test kit“ der Firma

Kirkegaard and Perry Laboratories verifiziert werden.

4.1.2. Nach der Vakzination

4.1.2.1. Versuch A

Die Junghennen der Impf- und Kontrollgruppe zeigten im Verlaufe der

Voruntersuchungen ein ungestörtes Allgemeinbefinden, keines der Tiere ließ eine

Entwicklungsstörung erkennen. Der Beginn der Legetätigkeit erfolgte in beiden

Gruppen zeitgleich.

Die Hennen des Versuchs A wurden daher im Rahmen der Hauptuntersuchungen

(Versuch 1) zur Prüfung der Verträglichkeit und Wirksamkeit der Impfstoffcharge 5

verwendet.

86

4.1.2.2. Versuche B und C

Die Junghennen beider Versuchsdurchgänge wurden zeitgleich aufgestallt. Hierbei

zeigten einige Hennen bereits kurz nach der Aufstallung in der Klinik für Geflügel

eine deutliche Störung des Allgemeinbefindens. In der Impfgruppe des Versuches B

verendeten fünf Hennen und in der Impfgruppe des Versuches C zwei Hennen. Bei

fünf von diesen Tieren wurden pathologisch-anatomische Veränderungen wie bei der

Marek´schen Krankheit gefunden. Histologisch konnte diese Befunde nicht bestätigt

werden. Da diese Hennen für die Verträglichkeits- und Wirksamkeitsprüfungen in den

Hauptuntersuchungen nicht zu verwenden waren, wurden die verbliebenen Hennen

der Voruntersuchungsgruppen B und C getötet. Eine Henne zeigte das klinische Bild

der Marek`schen Krankheit, bei insgesamt 20 Tieren der Impfgruppen (n = 80)

wurden im Rahmen der pathologisch-anatomischen Untersuchungen an den Nn.

ischiadici eine Verdickung und der Verlust der Querstreifung festgestellt wie sie für

die Marek´sche Lähme typisch ist. Hennen aus den Kontrollgruppen der Versuche B

und C waren von diesen Veränderungen nicht betroffen.

4.1.2.3. Versuch D

Bis zur zweiten Vakzination zeigten sowohl die Impf- als auch die Kontrollgruppe ein

ungestörtes Allgemeinbefinden. Die Entwicklung der Tiere in Bezug auf die

Gewichtszunahme und die Ausbildung der Kämme war gleichmäßig. Nach der

Wiederholungsimpfung fiel bei den Hennen der Impfgruppe eine leichte

Beeinträchtigung des Allgemeinbefindens auf. Sie bewegten sich weniger als die

Hennen der Kontrollgruppe, reagierten mit geringerer Intensität auf optische und

akustische Reize, wie z. B. Handbewegungen oder Fingerschnipsen und zeigten

einen geringgradigen Federverlust. Vier Hennen, die am deutlichsten in der

Entwicklung zurückblieben, wurden getötet. In der pathologisch-anatomischen

Untersuchung konnten Veränderungen, ins-besondere solche wie sie für die

Marek´sche Krankheit typisch sind, nicht festgestellt werden. Drei der sezierten

Hennen wiesen einen aktiven Legedarm auf. Der Beginn der Legetätigkeit verzögerte

sich in der Impfgruppe um zehn Tage.

87

Die Hennen des Versuchs D wurden im Rahmen der Hauptuntersuchungen

(Versuch 2) zur Prüfung der Verträglichkeit und Wirksamkeit der Impfstoffcharge 6

verwendet.

4.1.2.4. Versuch E

Die Hennen beider Gruppen zeigten ein ungestörtes Allgemeinbefinden und eine

gleichmäßige Entwicklung aller Tiere, jedoch trat bei Hennen der Impfgruppe

vereinzelt nach der zweiten Vakzination ein geringgradiger Federverlust auf.

Die Hennen des Versuchs E wurden im Rahmen der Hauptuntersuchungen (Versuch

3) zur Prüfung der Verträglichkeit und Wirksamkeit der Impfstoffcharge 7 verwendet.

4.2. Hauptuntersuchung

4.2.1. Verträglichkeitsprüfung

Nach der Impfstoffapplikation wurde bei den Hennen des Versuchs 1 keine Störung

des Allgemeinbefindens festgestellt. Die Hennen waren aufmerksam und zeigten ein

ungestörte Motilität. Eine Beeinträchtigung der Futter- bzw. Wasseraufnahme konnte

nicht beobachtet werden.

Bei den Hennen der Impfgruppe des Versuchs 2 kam es nach der

Wiederholungsimpfung bei einigen Hennen zu einem geringgradigem Federverlust.

Die Hennen dieser Gruppe zeigten, im Vergleich zu den Hennen der Kontrollgruppe,

eine verminderte Bewegungsaktivität. In dieser Gruppe verzögerte sich der

Legebeginn um zehn Tage. Die Hennen der Impfgruppe im Versuch 3 zeigten ein

ungestörtes Allgemeinbefinden. Nur bei einigen Tieren war ein leicht vermehrter

Federverlust zu beobachten. Die Gruppe war aufmerksam und bewegungsfreudig.

Bei der pathologisch-anatomischen Untersuchung am Versuchsende waren an den

Injektionsstellen der Legehennen in den drei Versuchsdurchgängen im

unterschiedlichen Ausmaß lokale Gewebsreaktionen feststellbar. In dem Versuch 1

waren die lokalen Reaktionen im Bereich der Injektionsstelle des Impfstoffes im

Vergleich mit den beiden anderen Versuchsdurchgängen, am geringsten ausgeprägt.

In den meisten Fällen (n = 32) waren nur noch Reste des Ölemulsions-Impfstoffes

festzustellen oder es konnten vereinzelte kleine Granulome gefunden werden. Bei

88

den Hennen des zweiten und dritten Versuchsdurchganges rief die Impfung stärkere

lokale Impfreaktionen hervor, so dass bei diesen Tieren (n = 9 bzw. n = 10) auch

entzündliche Veränderungen in der Unterhaut auftraten, welche eine Ausdehnung

von mehr als 6 cm aufwiesen.

Die Häufigkeit und Schwere der Veränderungen sind der Abbildung 1 zu entnehmen:

Abbildung 1: Lokale Impfstoffreaktionen in den Versuchen 1,2 und 3*

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

1+ 2+ 3+ 4+

Schweregrad

An

zah

l

Versuchsdurchgang 1

Versuchsdurchgang 2

Versuchsdurchgang 3

* Einteilung der Schweregrade nach Opitz 1982

In allen drei Versuchsdurchgängen wurde nach der Vakzination in den Impfgruppen

ein verzögerter Beginn des Legeleistungsanstiegs beobachtet. Die Legeleistung der

Hennen der Kontrollgruppen lag in dem Versuchszeitraum vor der EBI über denen

der Legeleistung der jeweiligen Impfgruppe.

Der Tabelle 2 ist die Anzahl der gelegten Eier der Kontroll- und Impfgruppen in allen

drei Versuchsdurchgängen zu entnehmen.

Tabelle 2: Legeleistung der Kontroll- und Impfgruppen vor der EBI

Untersuchungszeitraum Kontrollgruppe Impfgruppe Versuch 1 (36 Tage) 856* 775 Versuch 2 (52 Tage) 1246 888 Versuch 3 (46 Tage) 1225 1060

* Anzahl gelegter Eier

89

4.2.2. Wirksamkeitsprüfung

Die Wirksamkeit des Impfstoffes ließ sich biostatischtisch nur beurteilen, wenn die

vor der MG-Belastungsinfizierung vorhandenen Legeleistungsdifferenzen zwischen

Kontroll- und Impfgruppe mitberücksichtigt wurden. Dabei blieben die Zeiträume des

anfänglich starken Legeleistungsanstiegs bei der Berechnung der prozentualen

Legeleistung unberücksichtigt, da es als Folge der Belastung durch die Impfung in

den vakzinierten Gruppen zu einer Verzögerung des Legebeginns kam.

Zum Zeitpunkt der experimentellen Belastungsinfizierung mit dem MG-Stamm R

betrug die Legeleistung von Kontroll- und Impfgruppen jedoch mindestens 70 %.

4.2.2.1. Legeleistung im Versuch 1

Die Legeleistung beider Gruppen des ersten Versuchsdurchganges stiegen

zeitgleich von der 19. bis zur 21. Lebenswoche bis auf ca. 70 % der Legeleistung an.

Bis zur 24. Lebenswoche schwankte die Legeleistung beider Gruppen zwischen 70

und 90 %. Hierbei lag die Legeleistung der Kontrollgruppe im Durchschnitt um 7,61

% über der Leistung der Impfgruppe. Nach der EBI fiel die Legeleistung beider

Gruppen in einem Zeitraum von 14 Tagen zunächst auf ca. 60 % ab, um von diesem

Wert aus wieder auf eine Niveau von ca. 80 % anzusteigen. Die Legeleistung der

Impfgruppe übertraf nach der EBI die Legeleistung der Kontrollgruppe um 1,76 %.

In der Tabelle 3 ist die Entwicklung der Legeleistung vor und nach der EBI

dargestellt.

Tabelle 3: Prozentualer Legeleistungvergleich der Impf- und Kontrollgruppe

Versuch 1

Zeitraum Kontrollgruppe Impfgruppe Differenz vor der EBI (23 Tage) 80,45 % 72,84 % - 7,61 %

nach der EBI (29 Tage) 70,14 % 71,90 % + 1,76 % Differenz - 10,31 % - 0,94 % + 9,37 %

Die Entwicklung der Legeleistung im Vergleich vor und nach der

Belastungsinfizierung ist in der Abbildung 2 dargestellt.

Der Tabelle 3 und der Abbildung 2 ist zu entnehmen, dass die Legeleistung der

Kontrollgruppe nach der Belastungsinfektion um rund 10 % abfiel, während die

90

Legeleistung der Impfgruppe nahezu stabil blieb. Die biostatistische Auswertung

ergab für die Impfgruppe nach der EBI eine schwachsignifikant bessere Entwicklung

der Legeleistung (p ≤ 0.066).

Abb. 2: Legeleistungsveränderung im Versuch 1

Versuchsdurchgang 1

Prozentuale Legeleistungsveränderung im Vergleich der Zeiträume 23 Tage vor und 29 Tage nach der EBI

- 10,31%

- 0,94%

-12,00%

-10,00%

-8,00%

-6,00%

-4,00%

-2,00%

0,00% 1

Leg

elei

stun

gsv

erän

der

ung

Kontrollgruppe Impfgruppe

4.2.2.2. Legeleistung im Versuch 2

Beim Vergleich der Gruppenleistungen in diesem Versuch fällt der um zehn Tage

verzögerte Eintritt des Legebeginns in der Impfgruppe auf. Auch wenn der verzögerte

Legeleistungsbeginn nicht berücksichtigt wird, bleibt die Legeleistung der Impfgruppe

in den 29 Tagen vor der EBI um ca. 12 % unter der der Kontrollgruppe. In der

Tabelle 4 ist die Entwicklung der Legeleistung vor und nach der EBI dargestellt.

Mit der Belastungsinfizierung der Gruppen ändert sich dieses Bild. Während die

Legeleistung der Kontrollgruppe nach der EBI um gut 4 % abfällt, steigt die

Legeleistung der Impfgruppe weiter an.

91

Tabelle 4: Prozentuale Legeleistung der Impf- und Kontrollgruppe des zweiten Versuchsdurchganges

Zeitraum Kontrollgruppe Impfgruppe Differenz vor der Infektion (29 Tage) 84,67 % 72,58 % - 12,09 %

nach der Infektion (30 Tage) 80,58 % 82,96 % + 2,38 % Differenz - 4,09 % + 10,38 % + 14,47 %

Abb. 3: Legeleistungsveränderung im Versuch 2

Versuch 2

Prozentuale Legeleistungsveränderung im Zeitraum von 29 Tagen vor und 30 Tagen nach der EBI

- 4,09%

+ 10,38%

-6,00%

-4,00%

-2,00%

0,00%

2,00%

4,00%

6,00%

8,00%

10,00%

12,00%

1 Leg

elei

stun

gsv

erän

der

ung

Kontrollgruppe Impfgruppe

Trotz der Infektion nimmt die Legeleistung der geimpften Hennen, von einem

geringeren Niveau aus um über 10 % zu.

Die Legeleistung der geimpften Hennen zeigt im Vergleich mit der Kontrollgruppe

eine hochsignifikant bessere Entwicklung (p ≤ 0,001).

4.2.2.3. Legeleistung im Versuch 3

Im dritten Versuchsdurchgang beginnt die Kontrollgruppe vier Tage früher mit der

Legetätigkeit, und die Zunahme in der Gruppe erfolgt schneller als in der Impfgruppe.

92

In der 22. Lw. liegt die Legeleistung beider Gruppen über 80 %, wobei die

Legeleistung der Impfgruppe geringfügig über der der Kontrollgruppe liegt. Zum

Zeitpunkt der EBI beträgt die Legeleistung in beiden Gruppen 95 %, um nach der EBI

auf 80 % abzufallen. Die Legeleistung der Impfgruppe steigt binnen 14 Tagen wieder

auf ca. 90 % an und liegt damit im Durchschnitt um 4,03 % über der Legeleistung vor

der EBI. Die durchschnittliche Legeleistung der Kontrollgruppe fällt dagegen nach der

Infizierung um 7,47 % ab und erreicht 14 Tage nach der experimentellen Infizierung

eine Legeleistung von ca. 80 %. In der Tabelle 5 ist die Entwicklung der Legeleistung

vor und nach der EBI dargestellt.

Tabelle 5: Prozentuale Legeleistung der Impf- und Kontrollgruppe des dritten Versuchsdurchganges

Zeitraum Kontrollgruppe Impfgruppe Differenz vor der EBI (28 Tage) 86,55 % 83,88 % - 2,67 %

nach der EBI (30 Tage) 79,08 % 87,91 % + 8,83 % Differenz - 7,47 % + 4,03 % + 11,5 %

In der Abbildung 4 ist die Entwicklung der Legeleistung vor und nach der EBI grafisch

dargestellt.

Die Hennen der Kontrollgruppe zeigen eine größere und länger anhaltende

Depression der Legeleistung. Die Gruppe bleibt deutlich unter dem Niveau, welches

sie vor der Belastungsinfektion erreicht hatte.

Dieser Unterschied in der Entwicklung der Legeleistung der Kontroll- und Impfgruppe

ist hochsignifikant (p ≤ 0,001).

93

Abb. 4: Legeleistungsveränderung im dritten Versuchsdurchgang

Versuch 3Prozentuale Legeleistungsänderung im Zeitraum

28 Tage vor und 30 Tage nach der EBI

- 7,47%

+ 4,03%

-8,00%

-6,00%

-4,00%

-2,00%

0,00%

2,00%

4,00%

6,00%

1

Leg

elei

stu

ng

sän

der

un

g

Kontrollgruppe

Impfgruppe

4.3. Ergebnisse der serologischen Untersuchungen

4.3.1. Serumschnellagglutination (SSA)

Zum Zeitpunkt der Aufstallung der Versuchsgruppen in der Klinik für Geflügel

konnten in der SSA bei keiner Henne agglutinierende Antikörper gegen MG

festgestellt werden. Jedoch wurden bei Hennen des ersten und des zweiten

Versuchsdurchganges bereits zum Zeitpunkt der Aufstallung agglutinierende

Antikörper gegen Mycoplasma synoviae ermittelt. Durch eine Untersuchung mit dem

KPL-ELISA (MS) konnten unspezifische Reaktionen ausgeschlossen werden. Bei

den Hennen des dritten Versuchsdurchganges waren zum Zeitpunkt der

Klinikankunft und später keine agglutinierenden Antikörper gegen M. synoviae

festgestellt werden. In dem Serum, welches post mortem am Versuchsende

gewonnen wurde, konnten jedoch bei insgesamt 35 von 79 Hennen in der Serum-

Schnellagglutination Antikörper gegen MS nachgewiesen werden. Die Überprüfung

dieser Ergebnisse im KPL-ELISA (MS) ergab, dass es sich hierbei nicht um

unspezifische Reaktionen mit MG handelte. Aufgrund der Dynamik der

94

Antikörperentwicklung dürften sich die Hennen jedoch erst nach den Impfungen mit

der MG-Vakzine mit Mycoplasma synoviae infiziert haben. Rückblickend ist der

Infektionszeitpunkt jedoch nicht eindeutig zu klären. Die Übertragung von M.

synoviae könnte möglicherweise während der MG-Infizierung geschehen sein, da die

Hennen hierzu aus den Isolierställen herausgenommen werden mussten.

Nach der zweiten Vakzination waren bei fast allen getesteten Hennen der drei

Impfgruppen agglutinierende Antikörper gegen MG nachweisbar. Die Seren der

Hennen der Kontrollgruppen blieben dagegen negativ. Nach der Belastungsinfektion

konnten auch in den Seren der Hennen der Kontrollgruppen agglutinierende

Antikörper gegen MG nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der serologischen

Untersuchungen in den einzelnen Versuchsdurchgängen sind in den Tabellen 6 bis 8

dargestellt.

Tabelle 6: Häufigkeit des Nachweises agglutinierender Antikörper gegen MG und MS im Versuch 1

Kontrollgruppe Impfgruppe MG MS MG MS

SSA 1*2 0 / 21*1 21 / 21 14 / 20 20 / 20 SSA 2*3 0 / 21 21 / 21 20 / 20 19 / 20 SSA 3*4 40 / 40 40 / 40 40 / 40 40 / 40

*1Anzahl positiver Proben / Gesamtprobenanzahl *2 Zeitpunkt der 2. Impfung der Impfgruppe und Blutentnahme zur Überprüfung des serologischen Status *3 Zeitpunkt der experimentellen Infizierung beider Versuchsgruppen und Blutentnahme zur Überprüfung des serologischen Status *4 Versuchsende; Blutentnahme zur Überprüfung des serologischen Status und Tötung und Sektion aller Versuchstiere

Tabelle 7: Häufigkeit des Nachweises agglutinierender Antikörper gegen MG und MS im Versuch 2

Kontrollgruppe Impfgruppe MG MS MG MS

SSA 1*2 0 / 20*1 19 / 20 20 / 20 19 / 20 SSA 2*3 0 / 19 18 / 19 20 / 20 20 / 20 SSA 3*4 35 / 40 40 / 40 35 / 36 36 / 36

*1 Anzahl positiver Proben / Gesamtprobenanzahl *2 Zeitpunkt der 2. Impfung der Impfgruppe und Blutentnahme zur Überprüfung des serologischen Status *3 Zeitpunkt der experimentellen Infizierung beider Versuchsgruppen und Blutentnahme zur Überprüfung des serologischen Status *4 Versuchsende; Blutentnahme zur Überprüfung des serologischen Status und Tötung und Sektion aller Versuchstiere

95

Tabelle 8: Häufigkeit des Nachweises agglutinierender Antikörper gegen MG und MS im Versuch 3

Kontrollgruppe Impfgruppe MG MS MG MS

SSA 1*2 0 / 21*1 0 / 21 19 / 20 0 / 20 SSA 2*3 0 / 20 0 / 20 21 / 21 0 / 21 SSA 3*4 39 / 39 17 / 39 40 / 40 18 / 40

*1Anzahl positiver Proben / Gesamtprobenanzahl *2 Zeitpunkt der 2. Impfung der Impfgruppe und Blutentnahme zur Überprüfung des serologischen Status *3 Zeitpunkt der experimentellen Infizierung beider Versuchsgruppen und Blutentnahme zur Überprüfung des serologischen Status *4 Versuchsende; Blutentnahme zur Überprüfung des serologischen Status und Tötung und Sektion aller Versuchstiere

4.3.2. Hämagglutinationshemmungstest (HAH)

Die Ergebnisse des HAH-Tests belegen, daß die Impfungen zur Bildung von

spezifischen HA-hemmenden Antikörpern gegen MG führt. Vier Wochen nach der

ersten Vakzination sind in allen drei Impfgruppen AK nachzuweisen, wobei die

Nachweishäufigkeit in den einzelnen Gruppen zwischen 60 und 95 % schwankt.

Nach der zweiten Impfung wurden in allen untersuchten Seren HA-hemmende

Antikörper gefunden. Bis zum Zeitpunkt des Challenge sind positive Reaktionen nur

in den Impfgruppen zu finden, bei Versuchsende weisen alle Hennen spezifische

Antikörper auf.

Die Anzahl der positiven Reagenten im Verhältnis zu den gewonnenen Proben ist

den Tabellen 9 bis 11 zu entnehmen.

Tabelle 9: Häufigkeit des Nachweises spezifischer Antikörper gegen MG im HAH

im 1. Versuch

Kontrollgruppe Impfgruppe HAH 1*2 0 / 21*1 12 / 20 HAH 2*3 0 / 21 20 / 20 HAH 3*4 40 / 40 40 / 40

*1Verhältnis positiver Proben / Gesamtprobenanzahl *2 Zeitpunkt der 2. Impfung der Impfgruppe und Blutentnahme zur Überprüfung des serologischen Status *3 Zeitpunkt der experimentellen Infizierung beider Versuchsgruppen und Blutentnahme zur Überprüfung des serologischen Status *4 Versuchsende; Blutentnahme zur Überprüfung des serologischen Status und Tötung und Sektion aller Versuchstiere

96

Tabelle 10: Häufigkeit des Nachweises spezifischer Antikörper gegen MG im HAH im 2. Versuch

Kontrollgruppe Impfgruppe HAH 1*2 0 / 20*1 19 / 20 HAH 2*3 0 / 19 20 / 20 HAH 3*4 40 / 40 36 / 36

*1Verhältnis positiver Proben / Gesamtprobenanzahl *2 Zeitpunkt der 2. Impfung der Impfgruppe und Blutentnahme zur Überprüfung des serologischen Status *3 Zeitpunkt der experimentellen Infizierung beider Versuchsgruppen und Blutentnahme zur Überprüfung des serologischen Status *4 Versuchsende; Blutentnahme zur Überprüfung des serologischen Status und Tötung und Sektion aller Versuchstiere

Tabelle 11: Häufigkeit des Nachweises spezifischer Antikörper gegen MG im HAH

im 3. Versuch

Kontrollgruppe Impfgruppe HAH 1*2 0 / 21*1 16 / 21 HAH 2*3 0 / 20 21 / 21 HAH 3*4 39 / 39 40 / 40

*1Verhältnis positiver Proben / Gesamtprobenanzahl *2 Zeitpunkt der 2. Impfung der Impfgruppe und Blutentnahme zur Überprüfung des serologischen Status *3 Zeitpunkt der experimentellen Infizierung beider Versuchsgruppen und Blutentnahme zur Überprüfung des serologischen Status *4 Versuchsende; Blutentnahme zur Überprüfung des serologischen Status und Tötung und Sektion aller Versuchstiere

Im HAH konnten nach der zweiten Impfung in allen untersuchten Seren spezifische

Antikörper gegen MG nachgewiesen werden. Zur Darstellung der geometrisch

gemittelten Hämagglutinationshemmungstiter wurden die Verdünnungen 1 : 5, 1 : 10

etc. in entsprechende Titerstufen 1, 2, etc. eingeteilt.

Tabelle 12: Geometrische Mittelwerte und Standardabweichung spezifischer MG- Antikörpertiter im HAH im Rahmen der dritten serologischen Untersuchung zum Zeitpunkt des Versuchsendes Kontrollgruppe Impfgruppe

Versuch 1 3,69 ± 0,98 a 4,97 ± 1,24 a Versuch 2 5,01 ± 1,25 5,24 ± 1,17 Versuch 3 7,09 ± 1,37 7,52 ± 1,23

a Differenz zwischen Kontroll- und Impfgruppe ist hochsignifikant (p ≤ 0,001)

97

Die geometrischen Mittelwerte der Titer liegen bei den Impfgruppen über den Werten

der Kontrollgruppen, jedoch ist der Unterschied nur im ersten Versuchsdurchgang

hochsignifikant. Die Ursache für die höheren Titer in den Impfgruppen dürfte in der

Boosterung durch die Belastungsinfizierung liegen.

4.3.3. Enzymgebundener Immunadsorptionstest zum Nachweis von

Antikörpern (ELISA)

Die Untersuchungen wurden grundsätzlich nur im Mycoplasma gallisepticum-ELISA

durchgeführt. Nur zum Ausschluß von unspezifischen Reaktionen in der SSA erfolgte

die Untersuchung im MS-ELISA.

Die Untersuchung der Blutserumproben im ELISA ergab, dass nach der Impfung

Hühner aller Impfgruppen spezifische IgG-Antikörper gegen MG gebildet wurden. Die

Nachweishäufigkeit lag innerhalb der Gruppen vier Wochen nach der ersten Impfung

zwischen 30 und 95 %, nach der zweiten Impfung, zum Zeitpunkt der EBI, zwischen

85 und 100 %.

Das Verhältnis der Anzahl positiver Proben zur Anzahl der untersuchten Proben ist in

den Tabellen 13 bis 15 dargestellt.

Tabelle 13: Nachweis spezifischer Antikörper gegen MG im ELISA im Versuch 1 Kontrollgruppe Impfgruppe

ELISA 1*2 0 / 21*1 6 / 20 ELISA 2*3 0 / 21 17 / 20 ELISA 3*4 40 / 40 40 / 40

*1 Anzahl positiver Proben / Gesamtprobenanzahl *2 Zeitpunkt der 2. Impfung der Impfgruppe und Blutentnahme zur Überprüfung des serologischen Status *3 Zeitpunkt der experimentellen Infizierung beider Versuchsgruppen und Blutentnahme zur Überprüfung des serologischen Status *4 Versuchsende; Blutentnahme zur Überprüfung des serologischen Status und Tötung und Sektion aller Versuchstiere

Tabelle 14: Nachweis spezifischer Antikörper gegen MG im ELISA im Versuch 2 Kontrollgruppe Impfgruppe

ELISA 1*2 0 / 20*1 19 / 20 ELISA 2*3 0 / 19 17 / 20 ELISA 3*4 40 / 40 36 / 36

*1 Anzahl positiver Proben / Gesamtprobenanzahl *2 Zeitpunkt der 2. Impfung der Impfgruppe und Blutentnahme zur Überprüfung des serologischen Status *3 Zeitpunkt der experimentellen Infizierung beider Versuchsgruppen und Blutentnahme zur Überprüfung des serologischen Status *4 Versuchsende; Blutentnahme zur Überprüfung des serologischen Status und Tötung und Sektion aller Versuchstiere

98

Tabelle 15: Nachweis spezifischer Antikörper gegen MG im ELISA im Versuch 3 Kontrollgruppe Impfgruppe

ELISA 1*2 0 / 21*1 16 / 21 ELISA 2*3 0 / 20 21 / 21 ELISA 3*4 39 / 39 40 / 40

*1 Anzahl positiver Proben / Gesamtprobenanzahl *2 Zeitpunkt der 2. Impfung der Impfgruppe und Blutentnahme zur Überprüfung des serologischen Status *3 Zeitpunkt der experimentellen Infizierung beider Versuchsgruppen und Blutentnahme zur Überprüfung des serologischen Status *4 Versuchsende; Blutentnahme zur Überprüfung des serologischen Status und Tötung und Sektion aller Versuchstiere

Aus den Daten in den Tabellen 13, 14 und 15 geht jedoch hervor, dass alle Hühner,

auch die der Kontrollgruppe, nach der EBI spezifische Antikörper (IgG) gegen MG

bildeten. Im Vergleich zwischen den Impf- und Kontrollgruppen fällt auf, dass die

durchschnittlichen Titer in den Impfgruppen über denen der Kontrollgruppen liegen.

Tabelle 16: Geometrische Mittelwerte und Standardabweichung der zum Zeitpunkt der 3. serologischen Untersuchung im ELISA nachgewiesenen spezifischen MG-Antikörpertiter Kontrollgruppe Impfgruppe

Versuch 1 1 : 4127,56 ± 902,16 a 1 : 7882,74 ± 1265,54 b Versuch 2 1 : 5175,85 ± 1265,70 a 1 : 6632,25 ± 1064,78 b Versuch 3 1 : 16422,24 ± 5123,19 a 1 : 22008,42 ± 5685,05 b

a/b Differenz zwischen Kontroll- und Impfgruppe ist hochsignifikant (p ≤ 0,001)

Die im MG-ELISA festgestellten Titer spezifischer Antikörper (IgG) in den

Impfgruppen sind hochsignifikant (p ≤ 0,001) höher als die Titer in der

entsprechenden Kontrollgruppe.

4.4. Ergebnisse der pathologisch-anatomischen Untersuchungen

Bei der Sektion der Gruppen konnten bei den meisten Hennen pathologische

Veränderungen gefunden werden. Zumeist betrafen diese Veränderungen die

Luftsäcke und die serösen Überzüge der übrigen Organe in Thorax und Abdomen.

Die pathologischen Veränderungen betrafen sowohl die thorakalen wie auch die

abdominalen Luftsäcke. Dies zeigt, dass in allen Fällen eine manifeste MG-

Mykoplasmose auf aerogenem Wege mittels MG-Aerosol erzeugt werden konnte.

99

Die Häufigkeit pathologischer Veränderungen einzelner Organe sind in den

folgenden Abbildungen 5, 6 und 7 dargestellt.

Abb. 5: Übersicht über die Anzahl der Organveränderungen bei Legehennen im Versuch 1

Herzbeutel-entzündung

Veränderungen im Bereich der Lungen

MilzschwellungLuftsack-entzündungen

Leberschwellung0

10

20

30

40

An

zah

l bet

roff

ener

Tie

re

Kontrolle

Impfgruppe

Abb. 6: Übersicht über die Anzahl der Organveränderungen bei Legehennen

im Versuch 2

MilzschwellungLeberschwellungVeränderungen im Bereich der Lunge

Herzbeutel-entzündung

Luftsack-entzündungen

0

5

10

15

20

25

30

35

40

An

zah

l bet

roff

ener

Tie

re

Kontrolle

Impfgruppe

100

Diagramm 7: Übersicht über die Anzahl der Organveränderungen bei Legehennen im Versuch 3

Veränderungen imBereich der Lunge

Luftsack-entzündungen

Leberschwellung MilzschwellungHerzbeutel-entzündung

0

5

10

15

20

25

30

35

40

An

zah

l bet

roff

ener

Tie

re

Kontrolle

Impfgruppe

Um das Ausmaß der einzelnen Organveränderungen mit in die Beurteilung

einbeziehen zu können, erfolgte eine Bewertung und numerische Kodierung nach

den unter 3.10. benannten Kriterien. Die errechneten arithmetischen Mittelwerte sind

der nachfolgenden Tabelle 17 zu entnehmen.

Tabelle 17: Arithmetische Mittelwerte der in der Sektion festgestellten Organveränderungen

Organ Versuchsdurchgang 1 Versuchsdurchgang 2 Versuchsdurchgang 3 Kontrolle Impfgruppe Kontrolle Impfgruppe Kontrolle Impfgruppe

Herzbeutel 0,175 0,15 0,15 0,11 0,075 0,05 Lunge 0,45 0,425 0,55 0,16 0,15 0,1 Leber 0,05 0 0 0 0,05 0,025 Milz 0,025 0,025 0,325 0,22 0,025 0,075

Insgesamt waren die Hennen der Kontrollgruppen häufiger von pathologischen

Veränderungen betroffen. Diese Veränderungen waren schwerwiegender als in den

Gruppen der geimpften Hennen. Der Unterschied zwischen den Gruppen ist

insgesamt jedoch nicht signifikant.

101

Im Rahmen der pathologisch-anatomischen Untersuchungen wurde besonderes

Augenmerk auf die Legetätigkeit der einzelnen Hennen gelegt. Die Anzahl der

Hennen mit inaktivem Eierstock sind in der Tabelle 18 dargestellt.

Tabelle 18: Anzahl der Hennen mit inaktivem Eierstock

Versuchsdurchgang 1 Versuchsdurchgang 2 Versuchsdurchgang 3 Kontrolle Impfgruppe Kontrolle Impfgruppe Kontrolle Impfgruppe

Hennen 3* 1 3 2 3 2 *entsprechend der Definition „hochgradige Eierstocksentzündung“; siehe Kap. 3.10.

Durch die Art der Inokulation des Erregers in Form eines Aerosols kam es sowohl in

der Kontroll- als auch in der Impfgruppe zu entzündlichen Veränderungen der

Luftsäcke. Entsprechend der unter 3.10. aufgeführten Bewertung ergaben sich für

die einzelnen Gruppen folgende LSE-Werte, die in der Tabelle 19 dargestellt sind.

Tabelle 19: Arithmetischer mittlerer Luftsackentzündungs-Score-Wert*

Versuch 1 Versuch 2 Versuch 3 Gruppe Kontrolle Impfgruppe Kontrolle Impfgruppe Kontrolle Impfgruppe

LSE-Wert 2.225 1,775a 2 1,278b 2,153 1,975c

* nach YODER (1984) a Differenz zwischen Kontroll- und Impfgruppe ist signifikant (p ≤ 0,05).

b Differenz zwischen Kontroll- und Impfgruppe ist hochsignifikant (p ≤ 0,001).

c Differenz zwischen Kontroll- und Impfgruppe ist nicht signifikant.

In allen drei Versuchsdurchgängen weisen die Ergebnisse darauf hin, daß die

Hennen durch die zweimalige Impfung mit der inaktivierten Vakzine ein partieller

Schutz vor einer Luftsackentzündungen durch MG induziert wurde. Der Vergleich der

LSE-Score-Werte zeigt, dass sich die Impfgruppen von den Kontrollgruppen im

ersten Versuch signifikant und im zweiten Versuch hochsignifikant unterscheiden.

102

4.5. Ergebnisse der kulturell-bakteriologischen Untersuchungen

Die Ergebnisse der kulturellen Untersuchung von Luftröhre, der Lunge und den

Luftsäcken auf Mycoplasma gallisepticum sind den nachfolgenden Tabellen 20 bis

23 zu entnehmen.

Tabelle 20: Anzahl von MG - Reisolationen aus Trachea, Lunge und Luftsack

Versuchsdurchgang 1 Versuchsdurchgang 2 Versuchsdurchgang 3 Kontrolle Impfgruppe Kontrolle Impfgruppe Kontrolle Impfgruppe

Luftröhre 40 / 40* 33 / 40 13 /40 28 / 36 34 / 39 30 / 40 Lunge 35 / 40 20 / 40 9 / 40 25 / 36 26 / 34 29 / 40

Luftsack 34 / 40 29 / 40 29 / 40 32 / 36 37 / 39 32 / 40

* Anzahl positiver Proben / Gesamtprobenanzahl

Bei der Gegenüberstellung der kulturellen Untersuchungsergebnisse auf

Mykoplasmen aus Trachea, Lunge und Luftsack ist festzustellen, daß der Nachweis

von MG in den Kontrollgruppen nicht unbedingt häufiger gelang als in den

Impfgruppen. In allen drei Versuchsdurchgängen wurden kulturell nachgewiesene

Mykoplasmen im Immunblotting mit spezifischen MG - Antiseren untersucht und als

Mycoplasma gallisepticum identifiziert.

Im Versuch 2 wurde zusätzlich zur kulturellen Anzüchtung die Untersuchung mit Hilfe

von spezifischen DNS-Sonden nach einer selektiven Replikation eines DNS-

Abschnitts in der PCR durchgeführt. Aus der Impfgruppe konnten bei 36 Proben 34

mal und bei der Kontrollgruppe aus 40 Proben 28 mal Mycoplasma gallisepticum-

Stamm R nachgewiesen werden (SALISCH et al. 1998).

Aus den Organen, die bei der Sektion am Versuchsende entnommen wurden,

konnten sowohl bei pathologisch-anatomisch veränderten Organen als auch bei

unveränderten Organen Bakterien isoliert werden. Die Häufigkeit des Nachweises in

den einzelnen Versuchsdurchgängen ist in den Tabellen 21, 22 und 23 dargestellt.

103

Tabelle 21: Häufigkeit der Anzüchtung von Bakterien aus veränderten und unver- änderten Organen der Hennen im Versuch 1

Organ Kontrollgruppe Impfgruppe Streptokokken Staphylococcus

spp. Coliforme Streptokokken Staphylococcus

spp. Coliforme

Herz 1 2 2 5 1 2 Leber 2 0 1 2 0 1 Milz 3 0 1 3 0 0

Lunge 8 1 4 6 0 5 Luftsack 11 2 5 8 1 4

Tabelle 22: Häufigkeit der Anzüchtung von Bakterien aus veränderten und unver-

änderten Organen der Hennen im Versuch 2

Organ Kontrollgruppe Impfgruppe Streptokokken Staphylococcus

spp. Coliforme Streptokokken Staphylococcus

spp. Coliforme

Herz 6 0 2 4 0 0 Leber 2 0 1 3 0 0 Milz 3 0 2 3 1 0

Lunge 8 0 9 9 0 6 Luftsack 9 2 12 8 0 7

Tabelle 23: Häufigkeit der Anzüchtung von Bakterien aus veränderten und unver-

änderten Organen der Hennen im Versuch 3

Organ Kontrollgruppe Impfgruppe Streptokokken Staphylococcus

spp. Coliforme Streptokokken Staphylococcus

spp. Coliforme

Herz 2 0 3 4 0 5 Leber 0 1 0 1 0 1 Milz 2 0 2 1 1 1

Lunge 8 0 8 6 2 4 Luftsack 11 0 14 4 0 7

Die bakteriologischen Untersuchungen ergaben zwar Unterschiede in der Häufigkeit

von Bakterien, doch beschränkte sich diese auf Unterschiede bei einzelnen Organen.

Generell konnten signifikante Unterschiede zwischen Impf- und Kontrollgruppen nicht

festgestellt werden.

104

5. Diskussion

Ziel dieser Arbeit war es, die Verträglichkeit und Wirksamkeit der Öl-Adjuvans-

Vakzine „TALOVAC 104 MG“ der Firma LAH (Lohmann Animal Health) unter

experimentellen Bedingungen zu prüfen. Der Impfstoff wurde entwickelt, um

Legehennen vor einer MG-assoziierten Minderung der Legeleistung schützen.

Im Rahmen dieser experimentellen Prüfung wurden Junghennen in der 14. und 18.

Lebenswoche mit jeweils 0,5 ml des Impfstoffes subkutan, dorsal im unteren Drittel

des Halses, geimpft. Dieses Impfschema, bot sich, abweichend von der

Impfempfehlung der Herstellerfirma, an, weil in praxi der zweite Impftermin mit dem

Zeitpunkt der Umstallung der Junghennen vom Aufzucht- in den Ablegebetrieb

zusammenfällt und somit die Kosten der aufwendigen Einzeltiervakzination reduziert

werden können (JORDAN u. KLEVEN 1995). Auch von anderen Autoren wurde die

Impfung gegen MG zeitgleich in ähnlicher Weise durchgeführt (HILDEBRAND et al.

1983; GLISSON u. KLEVEN 1984, 1985; TAKLINGTON u. KLEVEN 1985;

SASIPREEYAJAN et al. 1987), ohne dass über eine Störung der Legetätigkeit zu

berichtet worden ist. Lediglich BARBOUR und NEWMAN (1990) und EVANS et al.

(1992) impften ihre Versuchshennen zu einem früheren Zeitpunkt, nämlich in der

zehnten und sechzehnten Lebenswoche.

Die pathologisch-anatomischen Untersuchungen der Hennen am Versuchsende

ergaben am Applikationsort des Impfstoffes entzündlich-granulomatöse Reaktionen,

die bei über 40 % der Tiere über das für diesen Impfstoff akzeptable Maß

hinausgingen. Der Einsatz von Adjuvantien, in diesem Fall Mineralöl, verzögert die

Freisetzung des Antigens und steigert die Makrophagentätigkeit, was wiederum zu

einer vermehrten Antigenpräsentation und Freisetzung von Lymphokinen führt

(BARBOUR et al. 1987; FINGER 1966; JANEWAY und TRAVERS 1997). Gerade bei

nur schwach immunogenen Antigenen ist so die Ausbildung eines langanhaltenden

Impfschutzes möglich (JANEWAY und TRAVERS 1997). STONE et al. (1978) und

YODER (1979) stellten nach Impfung mit einer MG-Öl-Adjuvansvakzine in den

Blutserumproben einen zwei- bis vierfach höheren Antikörpertiter, als in den Seren

der Hühner, die nur mit dem reinen Antigen geimpft worden waren, fest. HAYATSU

105

et al. (1974) konnten durch die Zugabe verschiedener Adjuvantien dagegen keinen

signifikanten Anstieg spezifischer Antikörpertiter gegen MG nachweisen.

Über lokale oder systemische Nebenwirkungen der Impfung, wie sie in den eigenen

Versuchen auftraten, haben nur wenige Autoren Angaben gemacht. HILDEBRAND

et al. (1983) berichteten, daß es nach Applikation eines inaktivierten MG-Impfstoffes

in der Halsmitte bei einigen Hennen zur Ausbildung periorbitaler Ödeme kam. Nach

Impfung in den M. pectoralis fanden DROUAL et al. (1990) undurchsichtige Zysten in

den Faszien, welche teilweise von lymphoiden Zellaggregationen umgeben waren.

Nach Impfungen in die Beinmuskulatur kam es zu lokalen Schwellungen, die sich

auch auf benachbarte Gelenke oder Sehnenscheiden ausdehnten (DROUAL et al.

1993). SASIPREEYAJAN et al. (1987) dagegen beschrieben solche Veränderungen

nicht, obwohl bei ihren Versuchen die Impfstoffapplikation direkt an der Schädelbasis

erfolgte.

In den Versuchen 2 und 3 kam es zusätzlich zu einer Verzögerung des Legebeginns

der geimpften Hennen. Dies wird durch die Anzahl der vor dem Zeitpunkt der

Infizierung gelegten Eier belegt. Lediglich BEHR et al. (1991) beobachteten bei

Einsatz eines inaktivierten Impfstoffes in einer Feldstudie eine Verzögerung des

Legebeginns bei geimpften Hennen. Durch eine Vakzination der Legehennen zu

einem früheren Zeitpunkt, wie ihn EVANS et al. (1992) und JORDAN und KLEVEN

(1995) REDMANN und GÖBEL (1991) ohne Angabe von Gründen empfahlen, hätte

die Verzögerung des Legebeginns wie im 2. und 3. Versuch eventuell vermieden

werden können. Ob die Impfung zur Beeinträchtigung des Allgemeinbefindens und

zur Beeinträchtigung der immunologischen Reaktionsfähigkeit der Hennen der

Impfgruppen in den Versuchen B und C und damit zur Manifestation der

Marek´schen Krankheit geführt hat, war nicht zu klären. Jedoch berichteten auch

KATZEN (1969) sowie REDMANN und GÖBEL (1991) über das Auftreten der

Marek´schen Krankheit nach Impfungen gegen Mycoplasma gallisepticum. Diese

Gesundheitsbeeinträchtigungen betrafen Hennen, die mit den Impfstoffchargen 6

und 7 geimpft worden waren. Diese Impfstoffchargen zeigten bei sachgerechter

Lagerung eine von den Herstellerangaben abweichende Entmischungscharakteristik.

Die ungenügende Verträglichkeit dieser Impfstoffchargen kann somit möglicherweise

106

auch durch eine produktionstechnische Komponente bedingt bzw. mitbeeinflusst

worden sein.

Kernanliegen der vorliegenden experimentellen Studie war die Prüfung der

Wirksamkeit der Vakzination mit dem Impfstoff „Talovac 104 MG“ anhand der

Legeleistung, die bei Legehennen ein hochsensibler Indikator für Störungen des

Gesund-heitszustandes darstellt. Mehr als vier Wochen nach der zweiten Impfung

und bei einem Legeleistungsniveau von mindestens 70 % erfolgte die aerogene

Infizierung mit dem MG-Stamm R. Ziel dieser Infizierung war nicht den Status einer

latenten MG-Infektion zu erzeugen, sondern den einer klinisch manifesten Störung

des Gesund-heitszustandes und die damit assoziierte Minderung der Legeleistung.

Bei alleiniger Infizierung mit MG ist dies nur durch Inokulation einer großen

Mykoplasmenanzahl möglich, wie sie unter natürlichen Bedingungen niemals

vorkommt. Die in diesen Versuchen vermittelte Exposition mit MG stellte somit eine

Maximalbelastung dar. Da Mycoplasma gallisepticum in der Außenwelt nur über eine

geringe Tenazität verfügt (HINZ 1993) und somit existenziell vom seinem Wirt

abhängig ist, hat eine Schädigung des Wirtes, die eventuell zum Tod desselben

führt, evolutionsbiologisch für MG keinen Vorteil. Die Persistenz im Wirt und die

vertikale und horizontale Übertragbarkeit garantieren MG das Überleben; daher ist

nach einer Infizierung mit MG die latente Infektion der Normalzustand (HINZ und

RYLL 1996). Stressoren infektiöser (NDV, AIBV, E. coli) und nicht infektiöser Art

(Temperatur, Staub, Schadgase) können das labile Gleichgewicht zwischen

Infektabwehr und MG stören (GIAMBRONE 1989) und zu einer Manifestation einer

Mykoplasmose führen (BEHR et al. 1991). So konnten YODER (1979) und YODER

und HOPKINS (1985), die ihre Versuchshühner nur mit 0,2 ml einer

Mykoplasmenkultur infizierten, bei dem Vergleich der Legeleistung keine

Unterschiede zwischen Impf- und Kontrollgruppe feststellen. Es ist anzunehmen,

dass sie eine Mykoplasmenmenge inokulierten, die lediglich zu einer Infektion, nicht

jedoch zu einer manifesten Erkrankung durch MG führte.

YODER (1983), YODER et al. (1984) und SOERIPTO (1989 a) belasteten die

Hühner zusätzlich mit IBV bzw. sie verbrachten die Hühner p.i. in eine kalte

Umgebung, um eine manifeste Mykoplasmose zu erzeugen. GLISSON und KLEVEN

107

(1984, 1985), EVANS (1992) und ABD-EL-MOTELIB und KLEVEN (1993)

vermochten hingegen durch die alleinige aerogenen Infizierung über ein Aerosol mit

dem MG-Stamm R (1,5x106 bis 3x108 Mykoplasmen je Henne)

Luftsackentzündungen und Legeleistungsminderungen hervorrufen. Eine Infizierung

mit einer derartigen MG-Menge entspricht der Maximalbelastung, wie sie auch in der

vorliegenden Studie durchgeführt wurde. Das Design der in den eigenen

Untersuchungen vorgenommenen experimentellen Belastungsinfizierung (1995/96)

entspricht dem Verfahren, das WHITHEAR et al. (1996) zur Infizierung von Hühnern

beschrieben haben.

Nach der experimentellen Belastungsinfizierung entwickelte sich die Legeleistung in

allen drei Impfgruppen besser als in der jeweils korrespondierenden Kontrollgruppe.

Der Unterschied zwischen der Impf- und der Kontrollgruppe war im 1. Versuch nur

schwachsignifikant, im 2. und 3. Versuch jedoch hochsignifikant. Mit einer sehr

ähnlichen Vakzine „TALOVAC 104 MG“ (andere Zusammensetzung des Adjuvans)

konnten BEHR et al. (1991, 1993) unter Feldbedingungen ebenfalls einen Schutz vor

einer Legeleistungsminderung induzieren. Während KHAN (1986) keine

Schutzwirkung nach einer einmaligen Impfung mit einer inaktivierten Öl-Adjuvans-

Vakzine feststellen konnte, bestätigen die Ergebnisse der vorliegenden Studie die

von HILDEBRAND et al. (1983), GLISSON und KLEVEN (1984, 1985), EVANS et al.

(1992) sowie SASIPREEJAJAN et al. (1987). Prozentual war die Entwicklung der

Legeleistung der geimpften Hennen nach der EBI um 9 % bis 14 % besser als die

der Kontrollgruppen. Diese Zahlen decken sich mit den Angaben von CARPENTER

et al. (1981), GLISSON (1987), MALLISON (1983 a) und MOHAMMED et al. (1987)

über MG-bedingte Legeleistungsminderungen. Ein antiinfektiöser Schutz durch die

Vakzination konnte nicht festgestellt werden. Bei der kulturellen Untersuchung von

Luftröhre, Lunge und Luftsäcken auf MG konnten in der Anzahl der reisolierten

Mykoplasmen keine signifikanten Unterschiede zwischen Impf- und Kontrollgruppen

festgestellt werden. KLEVEN (1985); TALKINGTON und KLEVEN (1985) und

YAGIHASHI (1987, 1992) berichten zwar, dass nach einer Impfung es zu einer

Verminderung der aus der Trachea zu reisolierenden Mykoplasmen kommt bzw. eine

108

größere Anzahl für eine Infektion notwendig ist; ein Schutz vor einer Infektion besteht

jedoch nicht (KLEVEN 1994).

Vor der ersten Vakzination konnten in keiner der untersuchten Blutserumproben

spezifische agglutinierende Antikörper gegen MG nachgewiesen werden. Da auch

die untersuchten Seren der Hennen der Kontrollgruppen bis zum Zeitpunkt der

experimentellen Belastungsinfizierung negativ waren, können die in diesen

Versuchen verwandten Hühner als MG-frei angesehen werden (HINZ 1977 und

1978; KLEVEN 1975). Nach Impfung mit einer MG-Vakzine kommt es bei MG-freien,

immunkompetenten Hühnern binnen drei bis vier Wochen zur Bildung spezifischer

agglutinierender Antikörper, die mittels Serum-Schnellagglutination nachgewiesen

werden können (AVAKIAN und LEY 1993; HINZ 1988; HINZ et al. 1991). In der

vorliegenden Studie konnten nach der zweiten Vakzination in allen in der SSA und im

HAH untersuchten Blutserumproben spezifische Antikörper gegen MG nachgewiesen

werden. Auch im ELISA wurden in allen Impfgruppen, jedoch nicht in allen

untersuchten Seren, spezifische Immunglobuline des Typs IgG gefunden. Auch dies

spricht für die Ausbildung einer protektiven Immunität und somit für einen Erfolg der

Impfung (GLISSON und KLEVEN 1984, 1985; KHAN et al. 1986; LIN und KLEVEN

1982 b; RODRIGUEZ und KLEVEN 1980 a, b). Nach der experimentellen Infizierung

stiegen die Serumtiter der geimpften Tiere deutlich an und lagen bei Versuchsende

über den in den Kontrollgruppen festgestellten Werten. Im 1. Versuch war die

Differenz zwischen der Impf- und Kontrollgruppe sowohl bei denen im HAH als auch

im ELISA ermittelten Werten hochsignifikant; in den Versuchen 2 und 3 zeigten sich

lediglich im ELISA hochsignifikante Unterschiede der Antikörpertiter. Einen ähnlichen

Anstieg der Antikörpertiter nach einer Infektion stellten SOERIPTO et al. (1989 b)

und YODER und HOPKINS (1985) fest. Bei ihnen lag der ermittelte Serumtiter der

Impfgruppe über dem der Kontrollgruppe. Dagegen wiesen die Blutserumproben der

geimpften Hühner in den Versuchen von SASIPREEYAJAN et al. (1987) und

YODER et al. (1984) nach einer EBI keine höheren Antikörpertiter als die der

Kontrolltiere auf.

NAKAMURA et al. (1995) konnten in ihren Untersuchungen grundsätzlich einen

Schutz vor MG nur dann feststellen, wenn sie auch spezifische Antikörper

109

nachweisen konnten. ELFAKI et al. (1992), SOERIPTO et al. (1989 b), YAGIHASHI

et al. (1992) und YODER et al. (1984) fanden eine positive Korrelation zwischen der

Höhe spezifischer Antikörpertiter gegen MG und dem Schutz vor

Luftsackentzündungen nach einer experimentellen Belastungsinfizierung. Dagegen

war eine solche Korrelation in den Versuchen von KARAKA und LAM (1986 a) nicht

festzustellen. ABD-EL-MOTELIB und KLEVEN (1993) sowie WHITHEAR et al.

(1990) konnten bei mit MG-Vakzine geimpften Legehennen ebenfalls keine

Korrelation zwischen der Höhe der ermittelten Antikörpertiter und der Häufigkeit und

Schwere von Luftsackveränderungen feststellen. Auch in der vorliegenden Studie

wiesen die geimpften Hennen höhere Antikörpertiter auf, jedoch waren bei der

pathologisch-anatomischen Untersuchung keine signifikanten Unterschiede im

Ausmaß und Schwere der Luftsackentzündungen zwischen Impf- und

Kontrollgruppen festzustellen. Trotz der maximalen Erregerbelastung war es möglich

einen Impfschutz nachzuweisen, obwohl in den Luftsäcken pathologisch-

anatomische Veränderungen festzustellen waren (HINZ 1988).

Die serologischen Untersuchungen ergaben einen deutliche Unterschied zwischen

der Höhe der spezifischen Antikörpertiter in den Versuche 1 und 2 im Vergleich zum

Versuch 3. Trotz der Aufbewahrung der Seren bei – 70° C könnte ein Grund hierfür

die durch die Dauer der Lagerung bedingte Abnahme der nachweisbaren

Antikörpertiter sein, da die Untersuchungen im HAH und ELISA erst nach Abschluß

des 3. Versuchs durchgeführt wurden (TIMMS 1971). Andererseits ist die Höhe der

Antikörpertiter auch abhängig von dem verwendeten Impfstamm (RODRIGUEZ und

KLEVEN 1980 b). BRADBURY (1975) und BENICINA und DORRER (1989) konnten

nachweisen, dass Hühner, bei denen eine latente Infektion mit M. synoviae vorlag,

nach einer EBI mit MG geringere spezifische Antikörpertiter entwickelten.

Die in den Versuchen 1 und 2 zum Zeitpunkt der Aufstallung in die Klinik bestehende

Infektion mit MS, stellte eine zusätzliche Belastung der Hennen dar. Zwar konnten

nach der Impfung und nach der Infizierung bei allen Hennen spezifische

Antikörpertiter gegen MG nachgewiesen werden, jedoch lagen diese Titer deutlich

unter den Werten, die bei den Hühnern in Versuch 3 ermittelt wurden; diese waren

zum Zeitpunkt der Aufstallung MS-frei, infizierten sich wahrscheinlich während sie

110

zur EBI aus den Isolierställen gebracht wurden mit MS. Bei einer kulturell

nachgewiesenen, latenten Infektion von Hühnern mit MG und MS konnten BENICINA

et al. (1991) zwar hohe spezifische Antikörpertiter gegen MS nachweisen, während

sie in der SSA und im HAH keine spezifischen Antikörper für MG fanden.

Ob die Remontierung einer Legehennenherde durch den Zukauf geimpfter aber MG-

freier Junghennen für den Besitzer einer latent MG infizierten Legehennenherde

(multiple-age) sinnvoll ist, entscheidet im wesentlichen die Wirtschaftlichkeit dieser

Maßnahme. Die Kosten für die Impfung trägt zunächst der Junghennenaufzüchter,

sie bewirken jedoch letztendlich einen höheren Preis des einzelnen Tieres für den

Legehennenhalter. Ausgehend von einer Verbesserung der durchschnittlichen

Legeleistung um 5% innerhalb der Legeperiode - entsprechend einer Anzahl von 12

bis 15 Eiern je Henne - und einem zu erzielenden Verkaufspreis je Ei von ca. 10 bis

15 Pfennig (bei einem hohen Anteil der Eigenvermarktung), ist ein Mehrerlös von bis

zu DM 2,25 je Henne möglich. Hierbei sind stärkere Legeleistungsminderungen

durch Cofaktoren infektiöser und nicht infektiöser Art, die bessere Futterverwertung

sowie die Verminderung der Eischalenqualität, wie sie bei latent MG-infizierten

Hennen zum Ende der Legeperiode auftreten, noch nicht berücksichtigt. Diesem

Mehrerlös entgegen stehen die Kosten des Junghennenaufzüchters, die sich für die

zweimalige Vakzination der Junghennen auf ca. 50 bis 60 Pfennig je Henne

belaufen. Diese Kosten setzen sich aus dem Preis für den Impfstoff sowie für die

Applikation zusammen und sind abhängig von der Anzahl der zu impfenden Tiere

und dem Management des Junghennenaufzüchters (Pöppel 2001).

Die Untersuchungsergebnisse belegen die Wirksamkeit des Impfstoffes „Talovac 104

MG“ gegen eine MG-bedingte Legeleistungsminderungen. Auch aus wirtschaftlichen

Gesichtspunkten ist die Impfung MG-freier Junghennen vor Einstallung in einen

latent mit MG-infizierten Legehennenbetrieb sinnvoll.

111

6. Zusammenfassung

In einer experimentellen Studie wurde die Verträglichkeit und Wirksamkeit der

inaktivierten Öl-Adjuvans-Vakzine „TALOVAC 104 MG“* der Firma Lohmann Animal

Health, 27472 Cuxhaven untersucht. Als Kriterium für die Wirksamkeit des

Impfstoffes wurde die Legeleistung vor und nach einer experimentellen

Belastungsinfizierung mit Mycoplasma gallisepticum herangezogen. In drei

Versuchsdurchgängen wurden drei Chargen des Impfstoffes getestet. Jeder

Versuchsdurchgang umfaßte je eine Impf- und Kontrollgruppe bestehend aus je 40

Hennen. Den Hennen der Impfgruppen wurde zweimal, nämlich in der 14. und 18.

Lebenswoche, 0,5 ml des Impfstoffes subkutan, dorsal im Bereich der Halsbasis,

verabreicht. Bei einer Legeleistung von mindestens 70 % erfolgte die

Belastungsinfizierung mit dem virulenten Mycoplasma gallisepticum-Stamm R über

ein erregerhaltiges Aerosol. Die Legeleistung beider Gruppen wurde vor und nach

der Infizierung dokumentiert. Zur Kontrolle der serologischen Immunreaktionen

wurden Blutproben genommen.

Bei allen geimpften Hennen entstanden lokale entzündlich-granulomatöse

Reaktionen, die bei über 40 % der Hennen über das für Impfstoff dieser Art

tolerierbare Maß hinausgingen. Bei einigen Hennen trat darüber hinaus eine leichte

Störung des Allgemeinbefindens auf, die zu einer Verzögerung des Legebeginns

führte. Die Legeleistung der geimpften Hennen lag nach der Belastungsinfektion

signifikant über der Legeleistung der Hennen der Kontrollgruppen. In zwei

Versuchsdurchgängen war dieser Unterschied hochsignifikant (p≤0,001).

Nach der zweiten Impfung konnten in allen untersuchten Blutserumproben der

geimpften Hennen spezifische agglutinierende und HA-hemmende Antikörper

nachgewiesen werden. Vier Wochen nach der Belastungsinfizierung lagen die im

ELISA ermittelten Serumtiter (GMT) der Impfgruppen hochsignifikant über denen der

Kontrollgruppen (p≤0,001).

*Die Adjuvanszusammensetzung des MG-Impfstoffes ist inzwischen geändert

worden.

112

7. Summary Hanns-Dietrich Graack 2001:

Experimental study on the safety and effectiveness of an inactivated Mycoplasma

gallisepticum (MG) oil-adjuvans-vaccine in layers.

This experimental study was thought to examine safety and effectiveness of the

inactivated oil-adjuvans-vaccine “Talovac 104 MG”* manufactured by Lohmann

Animal Health, Cuxhaven, Germany.

The criterion for the effectiveness was the egg yield before and after an experimental

infection of the population with Mycoplasma gallisepticum. Three lots of the vaccine

were tested in three experiments. Each experiment included one vaccination and one

control group of 40 hens, respectively. Hens of the vaccination group received 0,5 ml

of the vaccine subcutaneously in the caudal aspect of the neck at the 14th and 18th

week of age. When an egg yield of at least 70 % was reached both groups were

exposed to an airborne infection with the virulent R-strain of Mycoplasma

gallisepticum. The egg yields of both groups were recorded before and after the

infection. To control the serological immune response blood samples were taken.

In all vaccinated hen local inflammatory granulomatomatous reactions develop. In

40 % of these hens they were more pronounced tha is tolerated with this kind of

vaccine. Additionally some hens showed a slightly poorer general health, which

resulted in a delayed begin of egg production. After the experimental infection the

egg yield of the vaccinated hens was significantly higher than that of the control

groups. In two lots the difference was highly significant (p<0,001).

After the second vaccination in all examined blood samples of the vaccinated hens

specific agglutinating and haemagglutination-inhibiting antibodies were found. With a

high significance four weeks after the experimental infection the mean serum titers

(GMT) in ELISA of the vaccination groups were higher than in the control groups.

* The composition of the oil-adjuvans has meanwhile be changed.

113

8. Literaturübersicht ABD-EL-MOTELIB, T. Y., u. S. H. KLEVEN (1993): A comparative study of Mycoplasma gallisepticum vaccines in young chickens. Avian Dis. 37, 981 - 987 ADLER, H.E. (1958): A PPLO slide agglutination test for the detection of infectious sinusitis of turkeys. Poult. Sci. 37, 1116 - 1123 ADLER, H. E. u. J. M. L. DA SILVA (1970): Immunization against Mycoplasma gallisepticum. Avian Dis. 14, 763 - 769 ADLER, H. E., D. Mc MARTIN u. M. SHIFRINE (1960): Immunization against mycoplasma infections in poultry. Am. J. Vet. Res. 21, 482 - 485 AVAKIAN, A. P. u. D. H. LEY (1993): Protected immune response to Mycoplasma gallisepticum demonstrated in respiratory-tract washings from M. gallisepticum - infected chickens. Avian Dis. 37, 697 - 705 BARBOUR, E. K., u. J. A. NEWMAN (1990): Preliminary data of efficacy of Mycoplasma gallisepticum vaccines containing different adjuvants in laying hens. Vet. Immunol. Immunopathol. 26, 115 - 123 BARBOUR, E. K., J. A. NEWMAN, V. SIVANANDAN, D. A. HALVORSON u. J. SASIPREEYAJAN (1987): Protection and immunity in commercial chicken layers adminstered Mycoplasma gallisepticum liposomal bacterins. Avian Dis. 31, 723 - 729 BEARD, C. W., u. B. C. EASTERDAY (1965): An aerosol apparatus for the exposure of large and small animals: description and operating characteristics. Am. J. Vet. Res. 26, 174 - 182 BEHR, K., K.-H. HINZ, U. JOCHIMS, M. RYLL, H. LÜDERS u. W. LEHMACHER (1993): Über die Wirksamkeit einer inaktivierten Mycoplasma gallisepticum - Ölemulsionsvakzine bei Legehühnern unter Feldbedingungen. Arch. Geflügelk. 57, (1): 35 - 41

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9. Anhang 9.1. verwendete Nährmedien und Lösungen Flüssigmedium nach FREY et. al. (1968) Mycoplasma Broth Base 22, 3 g Vitamins 100 x for Basal Medium Eagle (Modified) Flow 0,25 ml Glukose (Merck) 3,0 g Penicillin-G Natriumsalz (Sigma) 1.000.000 I. E. Thallium (I)-acetat (RiedelDe-Haen) 200 mg Phenolrot 1 % Lsg. (Merck) 2,7 ml Schweineserum 100 ml Ampuwa ad 1000 ml für das Festmedium zusätzlich: Noble-Agar (Difco) 15 g es entfällt der Zusatz von Phenolrot Mycoplasma Broth Base : Pepton 140 (Gibco) 7,5 g Pepton 110 (Gibco) 2,5 g Yeast Extrakt (Gibco) 5,0 g NaCl (Merck) 5,0 g KCl (Merck) 0,4 g Magnesiumsulfat MgSO4 x 7 H2O (Merck) 0,2 g Dinatriumhydrogenphosphat Na2HPO4 (Riedel-De-Haen) 1,6 g Kaliumdihydrogenphosphat KH2PO4 (Merck) 0,1 g Alsever´s Lösung; ph-Wert: 6,1 Glukose (Merck) 20,5 g Natriumzitrat (Merck) 8,0 g Zitronensäure (Merck) 0,55 g Natriumchlorid (Merck) 4,2 g Aqua bidest. ad 1000 ml

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0,01 M Phosphat-0,15 M NaCl-Puffer-Lösung Ausgangslösung 1: NaH2PO4 x H2O 1,38 g NaCl 8,77 g Aqua bidest. ad 1000 ml Ausgangslösung 2: Na2HPO4 1,42 g NaCl 8,77 g Aqua bidest. ad 1000 ml 0,01 M Phosphat-0,15 M NaCl-Puffer Ausgangslösung 1: 296 ml Ausgangslösung 2: 704 ml

Danksagungen

Die Erstellung dieser Arbeit und die Durchführung der Versuche wäre ohne die

Unterstützung und Hilfe anderer schwer möglich gewesen. Ich bedanke mich bei

allen, die mir geholfen haben.

Ich danke ganz besonders Herrn Prof. Dr. K.-H. Hinz für die freundliche Überlassung

des Themas und seine jederzeit gewährte geduldige Unterstützung und menschliche

und fachliche Hilfestellung bei der Anfertigung dieser Arbeit.

Ich danke der Firma Lohmann Annimal Health, Cuxhaven, für die finanzielle

Unterstützung des Projektes.

Ich danke allen Mitarbeitern der Klinik für Geflügel der Tierärztlichen Hochschule

Hannover, die mir bei der Durchführung des praktischen Teils der Arbeit

unterstützten, besonders möchte ich mich bei Frau Rita Leise und bei Frau Sonja

Bertram bedanken.

Ich danke Herrn Dr. Werner Holländer, Fraunhofer Institut für Toxikologie und

Aerosolforschung, Hannover, für die Informationen über die Konstruktion und Betrieb

der Infektionskammer.

Ich danke Herrn Dr. Heimberg und Herrn Dr. Rohn für die Hilfe bei der statistischen

Auswertung der Ergebnisse.

Bei meiner Familie, bei Frau Dr. Annette Gabriel und Frau Dr. Christine Lendl möchte

ich mich für die jederzeit gewährte Hilfe ganz besonders bedanken.