Aus der Klinik für kleine Klauentiere und · Aus der Klinik für kleine Klauentiere und...

Aus der Klinik für kleine Klauentiere und

forensische Medizin und Ambulatorischen Klinik

der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Untersuchungen zum Lungenadenomatose-Status einer mutterlos aufgezogenen Heidschnuckenherde

mittels Polymerase-Kettenreaktion

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

vorgelegt von

Katja Voigt

aus Esslingen

Hannover 2004

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. M. Ganter

1. Gutachter: Prof. Dr. M. Ganter

2. Gutachterin: Prof. Dr. B. Grummer

Tag der mündlichen Prüfung: 2. Juni 2004

Diese Arbeit wurde durch die Niedersächsische Tierseuchenkasse,

die Heinrich-Behrens-Stiftung sowie durch ein Stipendium im Rahmen des

Niedersächsischen Graduiertenförderungsgesetzes (März bis Dezember 2001)

unterstützt

für

die „Döhler Herde“

INHALTSVERZEICHNIS

INHALTSVERZEICHNIS

Inhalt Seite

Abkürzungsverzeichnis............................................................................... 15

1. EINLEITUNG............................................................................................... 19

2. LITERATURÜBERSICHT........................................................................... 21

2.1 Lungenadenomatose (LA)........................................................................ 21

2.1.1 Historisches................................................................................................. 21

2.1.2 Klinische Symptome.................................................................................... 22

2.1.3 Pathologie................................................................................................... 23

2.1.3.1 Pathomorphologische Befunde.............................................. 23

2.1.3.2 Vorkommen von Metastasen................................................. 24

2.1.3.3 Sekundärinfektionen.............................................................. 25

2.1.3.4 Histologie............................................................................... 25

2.1.4 Ätiologie...................................................................................................... 26

2.1.4.1 Historisches........................................................................... 26

2.1.4.2 Retroviridae............................................................................ 28

2.1.4.3 Jaagsiekte Retrovirus (JSRV)................................................ 29

2.1.4.4 Endogene Retroviren............................................................. 31

2.1.5 Pathogenese............................................................................................... 32

2.1.5.1 Pathogenese der klinischen Symptome................................. 32

2.1.5.2 Zelltropismus und mögliche Mechanismen der

Onkogenese durch JSRV...................................................... 33

2.1.6 Epidemiologie.............................................................................................. 36

2.1.6.1 Verbreitung............................................................................ 36

2.1.6.2 Verluste in infizierten Herden................................................. 36

2.1.6.3 Übertragungswege................................................................. 37

2.1.6.4 Inkubationszeit und Altersverteilung...................................... 37

INHALTSVERZEICHNIS

2.1.6.5 Begünstigende Faktoren / genetische Disposition,

Resistenzentwicklung und Immunreaktion............................. 38

2.1.6.6 Befall anderer Tierarten......................................................... 40

A Ziegen.................................................................................... 40

B Mufflons................................................................................. 41

C Andere Tierarten.................................................................... 41

2.1.7 Vorkommen und Bedeutung der Lungenadenomatose in Deutschland...... 41

2.1.8 Vorkommen und Bedeutung der Lungenadenomatose in der

Heidschnuckenzucht................................................................................... 43

2.1.9 Diagnostik und Nachweisverfahren............................................................. 44

2.1.9.1 Klinische Untersuchung......................................................... 44

2.1.9.2 Serologie und Virusanzüchtung............................................. 46

2.1.9.3 Thoraxperkussion.................................................................. 46

2.1.9.4 Ultraschalluntersuchung........................................................ 47

2.1.9.5 Endoskopie............................................................................ 47

2.1.9.6 Bronchoalveoläre Lavage...................................................... 48

A Endoskopische Entnahme von Trachealsekret-

und Lungenspülproben.......................................................... 48

B Transtrachealer Zugang......................................................... 49

C Nicht-invasive Techniken zur Entnahme von

Lungenspülproben unter Feldbedingungen........................... 50

2.1.9.6.1 Anwendung der BAL zur Diagnostik der

Lungenadenomatose................................................... 52

A Sekretzytologie............................................................ 52

B Biochemische Untersuchung....................................... 52

2.1.9.7 Röntgenuntersuchung............................................................ 53

2.1.9.8 Lungenbiopsie........................................................................ 54

2.1.9.9 Pathologie.............................................................................. 55

2.1.9.10 Eignung der genannten Verfahren zur Kontrolle von

Sanierungsverfahren.............................................................. 55

INHALTSVERZEICHNIS

2.2 Verfahren zum Virusnachweis................................................................. 56

2.2.1 Blocking ELISA, Immunhistochemie,

Restriktionsenzymanalyse........................................................................... 56

2.2.2 Polymerase-Kettenreaktion......................................................................... 56

2.2.2.1 Prinzip und Historisches........................................................ 56 2.2.2.2 Nested PCR / Heminested PCR............................................ 57

2.2.2.3 Auswertung der PCR............................................................. 58

2.2.2.4 U3 heminested PCR zum Nachweis von JSRV..................... 58

2.2.2.4.1 Anwendung der U3 hn PCR zum Virusnachweis in

verschiedenen Proben und Geweben......................... 59

2.2.2.5 Risiken der PCR.................................................................... 63

A Unspezifische Reaktionen..................................................... 63

B Falsch-positive Ergebnisse.................................................... 63

C Falsch-negative Ergebnisse................................................... 64

2.2.2.6 Kontrollen............................................................................... 65

2.3 Maßnahmen zur Kontrolle und Bekämpfung der Lungenadenomatose......................................................................... 66

2.3.1 Kontrollmaßnahmen in der Heidschnuckenzucht........................................ 66

2.3.2 Kontrolle und Sanierungsversuch durch Managementmaßnahmen........... 67

2.3.3 Eradikation der Lungenadenomatose in Island........................................... 68

2.3.4 Sanierung mittels Embryotransfer............................................................... 69

2.3.5 Sanierung mittels mutterloser Lämmeraufzucht am Beispiel

der Maedi-Visna-Infektion........................................................................... 70

2.3.6 Versuch der Lungenadenomatose-Sanierung mittels

mutterloser Aufzucht................................................................................... 71

2.3.6.1 Geschichte des Sanierungsprojekts...................................... 71

INHALTSVERZEICHNIS

3. TIERE, MATERIAL UND METHODEN....................................................... 75

3.1 Fortführung der Sanierung im Frühjahr 2001......................................... 75

3.2 Herden........................................................................................................ 76

3.2.1 Schneverdinger Herde................................................................................ 76

3.2.2 Döhler Herde............................................................................................... 77

3.2.3 weitere Herden des VNP............................................................................. 77

3.2.4 Haltung, Ställe und Weideflächen............................................................... 78

3.3 Tiere und Probenmaterial......................................................................... 79

3.3.1 Tiere und Probenmaterial aus LA-positiven Herden................................... 79

A Sektionstiere .................................................................................... 79

B Schlachttiere..................................................................................... 80

C Lämmerblutproben........................................................................... 81

3.3.2 Tiere und Probenmaterial aus der mutterlos aufgezogenen

(Döhler) Herde............................................................................................ 83

A Sektionen.......................................................................................... 83

B Schlachttiere..................................................................................... 83

C Lungenspülproben............................................................................ 84

3.4 Klinische Untersuchung........................................................................... 85

3.4.1 Sektionstiere............................................................................................... 85

3.4.2 Schlachttiere............................................................................................... 87

3.4.3 Klinische Untersuchung der Döhler Herde.................................................. 87

3.5 Probenentnahme....................................................................................... 88

3.5.1 Blutentnahme.............................................................................................. 88

3.5.2 Lungenspülproben...................................................................................... 88

A Entnahme von Lungenspülproben nach

endotrachealer Intubation................................................................. 88

B Entnahme von Lungenspülproben mithilfe

eines flexiblen Endoskops................................................................90

3.5.3 Gewebeproben............................................................................................ 90

A Entnahme von Gewebeproben bei Schlachttieren........................... 90

INHALTSVERZEICHNIS

B Entnahme von Gewebeproben während der Sektion....................... 93

3.6 Probenbearbeitung................................................................................... 93

3.6.1 Allgemeine Maßnahmen............................................................................. 93

3.6.2 Buffy-Coat-Präparation............................................................................... 94

3.6.3 Lungenspülproben...................................................................................... 95

3.6.4 Formalinfixierung, Paraffineinbettung, Herstellung von

Gewebeschnitten und histologische Untersuchung.................................... 97

3.7 Gesamt-DNA-Isolierung............................................................................ 97


3.7.2 Gesamt-DNA-Isolierung aus Buffy-Coat- und Lungenspülprobenzellen..... 97

3.7.3 Gesamt-DNA-Isolierung aus Gewebeproben.............................................. 99

3.7.4 Präparationskontrollen................................................................................ 99

3.7.5 Konzentrations- und Reinheitsbestimmung der DNA................................. 100

3.8 molekularbiologische Untersuchungen.................................................. 101


3.8.2 Nachweis von JSRV mittels PCR (U3 LTR PCR)....................................... 102

3.8.3 Heminested (hn) PCR................................................................................. 105

3.8.4 Grenzwert-Positivkontrollen........................................................................ 107

3.8.5 Visualisierung der PCR-Produkte im Agarosegel....................................... 108

3.9 Validierung der PCR................................................................................. 109

3.9.1 Template-Kontrolluntersuchungen.............................................................. 110

3.9.2 Bestimmung der Nachweisgrenze der PCR am Modell

mit Plasmid versetzter DNA........................................................................ 111

3.9.3 Bestimmung der Nachweisgrenze des Gesamtsystems

(Probenbearbeitung / DNA-Extraktion / PCR-Untersuchung)

am Modell mit JS7-Zellen versetzter Rinderblutproben.............................. 112

3.9.3.1 Vorversuche zum Zusatz von JS7-Zellen

zu Rinderblutproben .............................................................. 113

A Vergleich der Isolierung von Gesamt-DNA aus Buffy-Coat

mit einer Methode zur Gewinnung von DNA aus Vollblut...... 113

INHALTSVERZEICHNIS

B Probenentnahme, Zusatz von JS7-Zellen

und Buffy-Coat-Präparation................................................... 113

C Isolierung von Gesamt-DNA aus Vollblut............................... 114

D DNA-Konzentrationsbestimmung und PCR-Untersuchung... 115

3.9.3.2 Detaillierte Bestimmung der Nachweisgrenze des

Gesamtsystems..................................................................... 115

3.9.4 Southern Blot.............................................................................................. 117

3.9.5 Sequenzierung von PCR-Produkten........................................................... 118

4. ERGEBNISSE............................................................................................. 121

4.1 weiterer Verlauf der Sanierung mittels mutterloser Aufzucht.............. 121

4.2 Ergebnisse der klinischen, pathologisch-anatomischen und histologischen Untersuchung von Tieren aus LA-positiven Herden... 121

4.2.1 klinisch untersuchte Tiere (Sektionstiere)................................................... 121

4.2.1.1 Einteilung in die klinischen Gruppen und Gegenüber-

stellung der Ergebnisse der pathologisch-anatomischen

und pathohistologischen Untersuchung................................. 121

4.2.1.2 Einteilung in Kategorien anhand der Lungenbefunde............ 125

4.2.1.3 Vorkommen von Metastasen und

anderen Tumorerkrankungen................................................. 126

4.2.2 Schlachttiere............................................................................................... 127

4.2.2.1 Ergebnisse der Lebenduntersuchung.................................... 127

4.2.2.2 Pathologisch-anatomische und

histologische Untersuchung................................................... 127

4.2.2.3 Vorkommen von Metastasen................................................. 128

4.3 Ergebnisse der klinischen, pathologisch-anatomischen und histologischen Untersuchung der Schneverdinger Herde.................... 128

4.3.1 Anzahl LA-positiver Tiere............................................................................ 129

4.3.2 Vorkommen anderer Lungenerkrankungen in der

Schneverdinger Herde................................................................................ 130

INHALTSVERZEICHNIS

4.4 Altersverteilung an Lungenadenomatose erkrankter Tiere.................. 131

4.5 Praktikabilität der BAL und Probenqualität............................................ 133

4.5.1 Praktikabilität und Zeitaufwand der Entnahme von BAL-Proben nach

endotrachealer Intubation............................................................................ 133

4.5.1.1 Kosten.................................................................................... 133

4.5.1.2 Immobilisation und Wartezeit................................................. 134

4.5.1.3 Komplikationen...................................................................... 135

4.5.2 Qualität der Lungenspülproben................................................................... 136

4.5.2.1 Rückgewinnungsvolumen und

makroskopische Beurteilung.................................................. 136

4.5.2.2 Zellintegrität........................................................................... 137

4.5.2.3 Erzielte DNA-Konzentration................................................... 137

4.5.3 Blutproben................................................................................................... 137

4.5.3.1 Zellintegrität nach Buffy-Coat-Präparation............................. 137

4.5.4 Kontrolle der DNA-Qualität.......................................................................... 138

4.5.4.1 Konzentrations- und Reinheitsbestimmung der DNA............ 138

4.5.4.2 Template-Kontrolluntersuchungen......................................... 139

4.6 Validierung der PCR................................................................................. 139

4.6.1 Nachweisgrenze vor dem Hintergrund von Wasser

(Grenzwert-Positivkontrollen)...................................................................... 139

4.6.2 Nachweisgrenze vor dem Hintergrund von 800 – 1000 ng

genomischer DNA (Inhibitionskontrollen).................................................... 140

4.6.3 Nachweisgrenze des Gesamtsystems (Probenbearbeitung/DNA-

Extraktion/PCR-Untersuchung) am Modell mit JS7-Zellen versetzter

Rinderblutproben......................................................................................... 146

4.6.3.1 Vergleich der Isolierung von Gesamt-DNA aus

Buffy-Coat mit einer Methode zur Gewinnung von DNA

aus Vollblut (Vorversuche)..................................................... 146

4.6.3.2 Nachweisgrenze des Gesamtsystems................................... 150

INHALTSVERZEICHNIS

A Nachweisgrenze der U3 LTR PCR am Modell mit

JS7-Zellen versetzter Rinderblutproben.................................150

B Nachweisgrenze der hn PCR am Modell mit

JS7-Zellen versetzter Rinderblutproben.................................152

4.6.4 Southern Blot.............................................................................................. 154

4.6.5 Sequenzierung der PCR-Produkte.............................................................. 156

4.7 Untersuchung von Proben aus positiven Herden.................................. 158

4.7.1 Probenübersicht (positive Herden)................................................... 158

4.7.2 Ergebnisse der PCR-Untersuchungen aus den positiven Herden... 159

4.7.2.1 Tiere mit makroskopisch nachweisbaren Tumoren

(Kategorie I)........................................................................... 159

4.7.2.2 Tiere mit lediglich histologisch nachweisbaren

Läsionen (Kategorie II)........................................................... 163

4.7.2.3 Histologisch negative Tiere (Kategorie IV)............................. 164

4.7.2.4 Statistische Bewertung der Ergebnisse................................. 166

4.7.2.5 Histologisch fragliche Tiere (Kategorie III)............................. 170

4.7.2.6 Untersuchung von Lämmern aus einer positiven Herde........ 173

A Übersicht................................................................................ 173

B Ergebnis der PCR-Untersuchung der Lungenspülproben...... 173

C Ergebnisse der PCR-Untersuchung der Blut- und

Gewebeproben von vier ausgewählten Lämmern.................. 175

4.8 Untersuchung von Tieren und Probenmaterial aus der Döhler Herde................................................................................ 176

4.8.1 Klinische Untersuchung der Döhler Herde.................................................. 176

4.8.2 Sektionen verendeter Tiere......................................................................... 176

4.8.3 Untersuchung der Altböcke......................................................................... 178

4.8.4 Untersuchung der Schlachtlungen.............................................................. 178

4.8.4.1 Makroskopische Untersuchung.............................................. 178

4.8.4.2 Systematische Histologie....................................................... 179

INHALTSVERZEICHNIS

4.8.4.3 Untersuchung der Lungenlymphknoten

mittels PCR............................................................................ 181

4.8.4.4 Weiterführende Untersuchungen bei den drei Tieren mit

histologisch fraglichem bzw. positivem Ergebnis.................. 181

4.8.5 Untersuchung des Muttertieres des Lammes mit bestätigter

Lungenadenomatose................................................................................... 182

4.8.6 Untersuchung der Lungenspülproben......................................................... 183

5 DISKUSSION.............................................................................................. 185

5.1 Lungenadenomatose bei Heidschnucken.............................................. 185

5.1.1 Altersverteilung und Disposition.................................................................. 185

5.1.2 Atypische Lungenadenomatose.................................................................. 186

5.1.3 Metastasen und andere Tumorerkrankungen............................................. 187

5.2 Untersuchungsverfahren......................................................................... 188

5.2.1 Eignung der klinischen Untersuchung zur Diagnose der LA....................... 188

5.2.2 Blutproben................................................................................................... 189

5.2.3 BAL nach endotrachealer Intubation........................................................... 189

5.3 Molekularbiologische Untersuchungen.................................................. 192

5.3.1 Vor- und Nachteile des Nachweises proviraler DNA gegenüber

dem RNA-Nachweis mit RT-PCR................................................................ 192

5.3.2 Untersuchungen zum Ausschluß falsch-negativer Resultate und

Bestimmung der Nachweisgrenze.............................................................. 193

5.3.3 Untersuchungen zum Ausschluß falsch-positiver Resultate....................... 195

5.4 Untersuchung von Proben aus positiven Herden.................................. 196

5.4.1 PCR aus Blutproben................................................................................... 196

5.4.2 PCR aus Lungenspülproben....................................................................... 198

5.4.3 PCR aus Gewebeproben............................................................................ 199

5.5 Untersuchung der mutterlos aufgezogenen Herde................................ 200

5.5.1 Beurteilung des Sanierungserfolges........................................................... 200

INHALTSVERZEICHNIS

5.5.2 Mögliche Ursachen für das Vorkommen von Lungenadenomatose

in der Döhler Herde..................................................................................... 203

5.5.3 Konsequenzen............................................................................................ 206

6. SCHLUSSFOLGERUNGEN....................................................................... 209

7. ZUSAMMENFASSUNG.............................................................................. 211

8. SUMMARY................................................................................................. 215

9. LITERATURVERZEICHNIS....................................................................... 219

10. ANHANG.................................................................................................... 259

I. Geräte und Verbrauchsmaterialien für die Probenentnahme...................... 259

A Gewebeproben................................................................................. 259

B Blutproben........................................................................................ 259

C Lungenspülproben............................................................................ 260

II. Geräte für die Laboruntersuchungen.......................................................... 261

III. Verbrauchsmaterialien für die Laboruntersuchungen................................. 263

IV. Gebrauchslösungen.................................................................................... 264

A Herstellung der Lösungen................................................................ 264

B Zutaten für Gebrauchslösungen....................................................... 266

V. Tabellenverzeichns..................................................................................... 267

VI. Abbildungsverzeichnis................................................................................ 273

VII. Danksagung................................................................................................ 275

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen

ad. us. vet. zum Gebrauch in der Veterinärmedizin

AMG Arzneimittelgesetz

atyp. atypisch / atypische

BAL bronchoalveoläre Lavage

BALF bronchoalveoläre Lavage-Flüssigkeit

bidest. bidestillata (doppelt destilliert)

bp Basenpaare

bzw. beziehungsweise

CA Capsid

cDNA copy-DNA

DEPC Diethylpyrocarbonat

dest. destillata

diNaEDTA Dinatrium-EDTA

DNA Desoxyribonukleinsäure

DNAse Desoxyribonuklease

dNTP Desoxyribonukleotidtriphosphat

e.V. eingetragener Verein

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

eitr. eitrig

ELISA enzyme-linked immunosorbant assay

Entn. Entnahme

ESRV endogenous sheep retroviruses

et al. et alii

GAPDH Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase

ggf. gegebenenfalls

ggr. geringgradig

GPI Glycosylphosphatidylinositol

Gr. Gruppe

h Stunde(n)

hämolys. hämolysierend / hämolysierende

HE Hämalaun-Eosin


hgr. hochgradig

histolog. histologisch

hn heminested

Hyal-2 Hyaluronidase 2

hyperplast. hyperplastisch / hyperplastisches

i.v. intravenös

J Jahr / Jahre

JSRV Jaagsiekte Retrovirus

Kat. Kategorie

kat.-eitr. katarrhalisch-eitrig

kb Kilobasen

klass. klassisch / klassische

klin. Verd. klinischer Verdacht

klin. klinisch

LA Lungenadenomatose

Ln. med. caud. Lymphonodus mediastinalis caudalis

Ln. Lymphonodus

Lok. Lokalisation

LTR long terminal repeat

LUFA Landwirtschaftliche Untersuchungs- und

Forschungsanstalt

m männlich

m/V Masse pro Volumen

MA Matrix

mgr. mittelgradig

Mon Monate

MPMV Mason-Pfizer Monkey Virus

MRI Moredun Research Institute

MwSt. Mehrwertsteuer

NC Nucleocapsid

n Anzahl

o.b.B ohne besonderen Befund

OD optische Dichte


OM Ohrmarke

OPA ovine pulmonary adenocarcinoma

orf open reading frame

p.a. pro analysi

PBS phosphate buffered saline

PCR Polymerase-Kettenreaktion

pers. persönlich / persönliche

prolif. proliferiert / proliferiertes

PVC Polyvinylchlorid

RNA Ribonukleinsäure

RNAse Ribonuklease

RT-PCR PCR nach reverser Transkription

SD Standardabweichung

sog. sogenannt

SPA sheep pulmonary adenomatosis

SU surface protein

TÄHAV Tierärztliche Hausapothekenverordnung

Taq Thermus aquaticus

TBE Tris-Borat-EDTA

TE Tris-EDTA

TM transmembrane protein

U.K. United Kingdom

unverd. unverdächtig

UV ultraviolett

VLH Verband Lüneburger Heidschnuckenzüchter e.V.

VNP Verein Naturschutzpark e.V.

VR1, VR2, VR3 variable Region 1, 2, 3

w, weibl. weiblich

zahlr. zahlreich

zit. zitiert

ZNS zentrales Nervensystem

zzgl. zuzüglich

EINLEITUNG 19

1. EINLEITUNG Die Lungenadenomatose des Schafes ist eine ansteckende, durch ein Retrovirus

(Jaagsiekte Retrovirus, JSRV) hervorgerufene Erkrankung (PERK et al. 1971;

HERRING et al. 1983; PALMARINI et al. 1999a), das Eigenschaften der Typ-B und

Typ-D Retroviren aufweist (VERWOERD et al. 1980a; SHARP et al. 1983; YORK et

al. 1991). Nach einer Inkubationszeit von in der Regel sechs bis zwölf Monaten

(DUNGAL et al. 1938; WANDERA 1968), die jedoch auch mehrere Jahre erreichen

kann (VERWOERD et al. 1985), führt sie durch die Ausbildung progressiver primärer

Lungentumoren unter dem Bild einer chronischen respiratorischen Erkrankung mit

verringerter Belastungsfähigkeit, erhöhter Atemfrequenz, gelegentlichem Husten,

rasselnden Atemgeräuschen, hochgradigem Nasenausfluß und chronischer

Abmagerung letztlich zum Tod. Eine Heilung ist nicht möglich (SHARP und DE LAS

HERAS 2000).

Die Verluste durch die Lungenadenomatose können in neu infizierten Herden bis zu

50 – 80% des Tierbestandes ausmachen (DUNGAL et al. 1938). In bereits

endemisch infizierten Herden belaufen sich die jährlichen Verluste durch die

Erkrankung auf 2 –10% des Bestandes. (SHARP und DE LAS HERAS 2000).

Innerhalb der Herdbuchzuchtherden der Grauen gehörnten Heidschnucken wurde

Lungenadenomatose 1992 erstmals eindeutig diagnostiziert (GANTER 1999) und

breitete sich in der relativ kleinen Zuchtpopulation schnell aus. Seit 1998 ist

nachweislich auch eine genetisch wertvolle Stammzuchtherde betroffen. Aufgrund

der mit der Erkrankung einhergehenden großen Verluste und der damit verbundenen

existentiellen Bedrohung für eine selten gewordene alte Nutztierrasse wurde im Jahr

1998 an der Klinik für kleine Klauentiere in Zusammenarbeit mit dem Verband

Lüneburger Heidschnuckenzüchter e.V. (VLH), dem Verein Naturschutzpark e.V.

(VNP), der Niedersächsischen Tierseuchenkasse und den örtlichen Veterinärämtern

ein groß angelegter Sanierungsversuch ins Leben gerufen. Ziel des Projektes war

zur Erhaltung des genetischen Potentials die Sanierung einer wertvollen

20 EINLEITUNG

Stammzuchtherde von der Lungenadenomatose mittels mutterloser Aufzucht der

Lämmer.

Die hier vorgestellten Untersuchungen befassen sich mit der Entwicklung eines

praxistauglichen Nachweisverfahrens, das mit höherer Sicherheit als die

herkömmlichen Verfahren (klinische Untersuchung, Röntgen, Lungenbiopsie,

zytologische und biochemische Untersuchung von Lungenspülproben) am lebenden

Tier die Überprüfung der Lungenadenomatose-Unverdächtigkeit einer solchen

sanierten Herde ermöglicht, sowie dessen Anwendung zur Untersuchung der

mutterlos aufgezogenen Herde auf Lungenadenomatose. Besondere

Berücksichtigung fand die Untersuchung von Lungenspül- und Blutproben mittels

Polymerase-Kettenreaktion sowie die Untersuchung der Schlachttiere aus der

mutterlos aufgezogenen Herde im Untersuchungszeitraum Herbst 2000 bis Ende

2003.

LITERATURÜBERSICHT 21

2. LITERATURÜBERSICHT

2.1 Lungenadenomatose (LA)

2.1.1 Historisches

Der erste dokumentierte Bericht über das Vorkommen der Lungenadenomatose

stammt aus dem Jahr 1825 in Südafrika. Es handelte sich um den Brief eines

Distriktverwalters namens P. AUCAMP am Kap der Guten Hoffnung an eine

übergeordnete Behörde, in dem er innerhalb von drei Monaten den Verlust von über

800 Schafen aus seinem Distrikt durch eine von ihm als Jaagziekte (afrikaans:

Hetzseuche) bezeichnete, vermutlich ansteckende Erkrankung beklagte (TUSTIN

1969). Die erste wissenschaftliche Beschreibung der klinischen Symptome und

pathologischen Veränderungen aus dieser Region wurde 1891 durch HUTCHEON

vorgenommen (zit. nach MITCHELL 1915). In Europa wurden die Symptome und

charakteristischen Lungenläsionen erstmals durch DYKES und McFADYEAN (1888)

beschrieben, zu diesem Zeitpunkt jedoch als eine neuartige Lungenwurmerkrankung

angesehen. In Deutschland erfolgte die Erstbeschreibung durch EBER (1892, zit.

nach EBER 1899). Der Begriff Jaagsiekte wurde unter anderem von ROBERTSON

(1904) und zahlreichen anderen internationalen Autoren übernommen. Daneben

wurden im angloamerikanischen Sprachraum verschiedene Begriffe wie sheep

pulmonary adenomatosis (SPA), ovine pulmonary carcinoma und ovine bronchiolo-

alveolar carcinoma verwendet. In jüngster Vergangenheit wurde die Übereinkunft

getroffen, die Erkrankung künftig international als ovine pulmonary adenocarcinoma

(OPA) zu bezeichnen (YORK und QUERAT 2003). Im deutschen Sprachraum hat

sich der Begriff Lungenadenomatose eingebürgert (OLAFSSON 1939; PALLASKE

1954; JAKOB und KRAUSE 1965; SCHULZ et al. 1965; GEISEL 1975; PROSKE und

WIEGAND 1991).

22 LITERATURÜBERSICHT

2.1.2 Klinische Symptome

DUNGAL et al. (1938) betonen den sehr schleichenden Verlauf der Erkrankung, der

es in den Anfangsstadien selbst für einen erfahrenen Untersucher unmöglich macht,

infizierte Tiere als solche zu erkennen. Als erste klinische Symptome fallen

verminderte Belastungsfähigkeit, Kurzatmigkeit und erschwerte Atmung auf, die den

Tieren den Eindruck verleihen, als seien sie gehetzt worden. Zum Teil wird auch

Husten beobachtet (ROBERTSON 1904; MITCHELL 1915; DUNGAL et al. 1938),

dieser wird jedoch von SHARP und ANGUS (1990) nicht als Hauptsymptom

angesehen. Sofern keine Sekundärinfektionen bestehen, zeigen die Tiere kein

Fieber. Die Futteraufnahme ist bis zuletzt erhalten, dennoch magern erkrankte Tiere

zunehmend ab. In fortgeschritteneren Erkrankungsstadien zeigen sie feucht-

rasselnde Atemgeräusche, die zuletzt auch ohne Phonendoskop wahrnehmbar sind,

sowie im Endstadium schaumig-serösen Nasenausfluß, hochgradige Dyspnoe sowie

Kachexie (MITCHELL 1915; DUNGAL et al. 1938; DE MARTINI und YORK 1997;

SHARP und DE LAS HERAS 2000). Durch Anheben der Tiere an den

Hintergliedmaßen (sog. „Schubkarrentest“) können in der Regel ca. 30 – 50 ml bis

hin zu 300 ml dieser Lungenflüssigkeit gewonnen werden (SHARP und DE LAS

HERAS 2000).

Häufig kommt es im Endstadium zu Sekundärinfektionen, insbesondere durch

Mannheimia haemolytica (SHARP und DE LAS HERAS 2000). Es erkranken

überwiegend erwachsene Schafe mit einer Häufung der Fälle bei drei bis vier Jahre

alten Tieren (MITCHELL 1915; HUNTER und MUNRO 1983), Tumoren wurden

jedoch in einzelnen Fällen bereits bei zwei Monate alten Lämmern oder erst im Alter

von bis zu elf Jahren festgestellt (SHARP und DE LAS HERAS 2000). DE LAS

HERAS et al. (2000) beschreiben sogar das Auftreten von Lungenadenomatose bei

einem drei Tage alten Lamm. Eine Heilung erkrankter Tiere ist nicht möglich

(DUNGAL et al. 1938; SHARP und DE LAS HERAS 2000).


2.1.3 Pathologie

2.1.3.1 Pathomorphologische Befunde

Das pathologisch-anatomische und histologische Bild der Lungenadenomatose ist in

fortgeschrittenen Fällen in der Regel eindeutig. Bei der Erkrankung kommt es zur

Ausbildung primärer Lungentumoren (EBER 1892, zit. nach EBER 1899), die heute

als Adenokarzinome eingestuft werden (GARCIA-GOTI et al. 2000; DE LAS HERAS

et al. 2003). Sie ist die häufigste Tumorerkrankung des Schafes. In einer

südafrikanischen Studie über das Vorkommen von Neoplasien bei Schafen handelte

es sich bei 436 von 673 Tumorerkrankungen (64,8%) um Lungenadenomatose.

Außer diesen wurden lediglich vier andere Tumoren des Respirationstraktes

festgestellt (BASTIANELLO 1982). Eine britische Studie kommt zu ähnlichen

Ergebnissen. Demnach handelte es sich bei 71,4% aller untersuchten Schaftumoren

um Lungenadenomatose. Andere Lungentumoren wurden in den 679 untersuchten

Fällen nicht beobachtet (ROSS und WILLIAMS 1983).

Der Tumorcharakter der Erkrankung war anfänglich umstritten. Gegner dieser

Theorie waren unter anderem COWDRY (1925a, b), PALLASKE (1929, 1954),

MÖSENFECHTEL (1937), McFADYEAN (1938) und EYLAU (1953), frühe

Befürworter sind neben EBER (1892, 1899) auch AYNAUD (1926), DE KOCK

(1929a) und SCHULZ et al. (1965).

Klassische Lungenadenomatose

Zu Beginn der Erkrankung sind einzelne Tumorknötchen zu finden. Mit

fortschreitender Erkrankung konfluieren die Läsionen, mit häufig vollständiger

Konsolidierung der rechten und linken Spitzenlappen, des Lobus medius, Lobus

accessorius und der cranioventralen Anteile der beiden Hauptlappen. In

fortgeschrittenen Fällen ist die Lunge deutlich vergrößert und im Vergleich zu

normalen Schaflungen bis zu fünfmal schwerer. Die neoplastischen Gebiete sind

fest, grau bis leicht rosa und gegenüber benachbartem, gesundem Lungengewebe


leicht erhaben. Häufig findet man im Grenzbereich eine schmale emphysematöse

Zone. Im Anschnitt zeigt sich schaumige Flüssigkeit in den Luftwegen, deren Menge

erhebliche Ausmaße annehmen kann (DUNGAL et al. 1938; SHARP und ANGUS

1990). Diese Form wird als klassische Lungenadenomatose bezeichnet (GARCIA-

GOTI et al. 2000).

Atypische Lungenadenomatose

Von dieser Ausprägung wird neuerdings eine sogenannte atypische Form der

Erkrankung abgegrenzt (GARCIA-GOTI et al. 2000), deren Charakteristika jedoch

auch in früheren Arbeiten bereits beschrieben wurden (CUBA CAPARO et al. 1961;

SCHULZ et al. 1965). Diese insgesamt seltenere, von SCHULZ et al. (1965) jedoch

als häufigere Form beschriebene Ausprägung zeigt sich in einzelnen bis multiplen,

wenige Millimeter messende Knötchen, die hart, rund bis sternförmig, weiß und

trocken sind (CUBA CAPARO et al. 1961; SCHULZ et al. 1965; GARCIA-GOTI et al.

2000).

2.1.3.2 Vorkommen von Metastasen

Gelegentlich kommt es zur Metastasierung in regionäre Lymphknoten, selten auch

zu extrathorakalen Metastasen (AYNAUD 1926; CUBA CAPARO et al. 1961; NOBEL

et al.1969; SHARMA et al. 1975a; SHARP und ANGUS 1990). GEISEL und

BOMHARD (1977) beziffern das Vorkommen von Metastasen aus den

Untersuchungen verschiedener internationaler Autoren auf 3 - 13% der untersuchten

Fälle. In einer neueren Arbeit an ostdeutschem Schlachthofmaterial wurden bei der

Untersuchung der Mediastinallymphknoten von 63 Tieren in fünf Fällen (7,9 %)

Lymphknotenmetastasen gefunden (PROSKE und WIEGAND 1991). Metastasen

wurden außerhalb der regionären Lymphknoten in der Pleura, der Skelett- und

Herzmuskulatur sowie verschiedenen inneren Organen beschrieben (NOBEL et

al.1969; WANDERA 1971; GEISEL und BOMHARD 1977; HUNTER und MUNRO

1983).


2.1.3.3 Sekundärinfektionen

Fortgeschrittene Fälle gehen regelmäßig mit Sekundärinfektionen einher, so dass

das pathologische Bild durch bakterielle Pleuropneumonien kompliziert werden kann

(DE KOCK 1929a; SHARP und ANGUS 1990). Doppelinfektionen mit JSRV und

Maedi-Visna-Virus sind nicht selten (SHARP und ANGUS 1990; GONZALEZ et al.

1993). In solchen Fällen fehlt in der Regel das klinische Symptom des hochgradigen

Nasenausflusses (GANTER 1996). Nach bisherigen Erkenntnissen können die

Stammzuchtherden der grauen gehörnten Heidschnucken als frei von Maedi-Visna

angesehen werden (GANTER 2004, pers. Mitteilung).

2.1.3.4 Histologie

Die Tumoren entsprechen histologisch einem papillären, seltener azinären oder

soliden bronchioloalveolären Adenokarzinom. Proliferationen von in der Regel eher

gutartigen histologischen Kriterien (wenig infiltratives Wachstum, geringe Mitoserate,

hoher Differenzierungsgrad der Tumorzellen) finden sich im Bereich der Alveolen

und des bronchiolären Epithels (EBER 1899; DE KOCK 1929a; GARCIA-GOTI et al.

2000; DE LAS HERAS et al. 2003). Sie entstehen durch Proliferation von Typ II

Pneumozyten sowie Clara-Zellen (NISBET et al. 1971; PLATT et al. 2002). Trotz der

beschriebenen Wachstumscharakteristika werden die Läsionen aufgrund der

wiederholt beschriebenen Metastasierungstendenz heute als Adenokarzinom

bezeichnet (DE LAS HERAS et al. 2003).

Die Läsionen sind gekennzeichnet von kubischen bis hochprismatischen

Tumorzellen und wenig Stroma, das in geringen Mengen mononukleäre Zellinfiltrate

und Bindegewebsfasern enthält. In benachbarten, noch nicht neoplastisch

veränderten Gebieten sind die Alveolen in charakteristischer Weise mit vergrößerten

Makrophagen gefüllt. Die atypischen Läsionen gleichen diesem Bild histologisch

weitgehend, weisen jedoch in der Regel eine hochgradige Infiltration mit


mononukleären Zellen sowie eine deutliche Vermehrung des Bindegewebes auf

(GARCIA-GOTI et al. 2000).

2.1.4 Ätiologie

2.1.4.1 Historisches

Verschiedenste Ursachen wurden im Laufe der Zeit für die Entstehung der typischen

Lungenveränderungen verantwortlich gemacht. DYKES und McFADYEAN (1888)

sowie McFADYEAN (1894, 1920), AYNAUD (1926) und PALLASKE (1929) hielten

Lungenwürmer für den ursächlichen Erreger. Chronische Reizungen (EBER 1899;

DE KOCK 1929b) sowie eine Protozoeninfektionen (EBER 1899; ROBERTSON

1904) wurden ebenfalls diskutiert. Eine mögliche Virusätiologie der Erkrankung

wurde zeitgleich von anderen Autoren postuliert (MITCHELL 1915; DUNGAL et al.

1938, 1946; McFADYEAN 1938; MACKAY und NISBET 1966; WANDERA 1968).

Den im Zusammenhang mit Lungenadenomatose isolierten Mykoplasmen (MACKAY

et al. 1963) und Chlamydien (WANDERA 1971) maß man keine ätiologische

Bedeutung bei (MACKAY und NISBET 1966; WANDERA 1971).

Die Virustheorie erhielt neue Nahrung durch den Nachweis von Herpesviren durch

MACKAY (1969a, b). MACKAY und NISBET (1971), MARTIN et al. (1976), DE

VILLIERS und VERWOERD (1980) sowie SCOTT et al. (1984) berichten jedoch von

gescheiterten Versuchen, mittels experimenteller Infektion mit ovinen Herpesviren

Lungenadenomatose-typische Läsionen zu erzeugen. Verschiedene Autoren

kommen daher übereinstimmend zu dem Schluß, dass das ovine Herpesvirus

zumindest nicht das alleinige ätiologische Agens bei der Entstehung der Tumoren

sein kann (MARTIN et al. 1976; DE VILLIERS und VERWOERD 1980; SCOTT et al.

1984; LIEBERMANN und ROHRBACH 1990). MARTIN et al. (1976) sowie DE

VILLIERS und VERWOERD (1980) diskutieren seine mögliche Rolle als Cofaktor bei

der Krankheitsentstehung.


Erste Hinweise auf die Beteiligung von Retroviren an dem Krankheitsgeschehen

erbrachten PERK et al. (1971) durch ultrastrukturelle Untersuchungen, in denen sie

Retrovirus-ähnliche Partikel nachweisen konnten. Diese Beobachtungen wurden in

weiteren Untersuchungen bestätigt (VERWOERD et al. 1980b; ANGUS et al. 1985).

Die letztgenannten Autoren bemerkten morphologische Ähnlichkeiten der

nachgewiesenen Partikel mit Typ B und Typ D Retroviren. Die morphologische

Beobachtung von Retroviren wurde gestützt durch den Nachweis von Aktivitäten der

reversen Transkriptase im Zusammenhang mit Partikeln, die für Retroviren typische

Dichten zeigten (PERK et al. 1974; MARTIN et al. 1976; VERWOERD et al 1980b;

HERRING et al. 1983). Die beiden letztgenannten Autorengruppen bestätigten

aufgrund biochemischer Untersuchungen ebenfalls die Ähnlichkeit des Virus mit Typ

B und Typ D Retroviren. Weitere morphologische, biochemische und serologische

Untersuchungen legten den Schluß nahe, dass es sich bei dem als Jaagsiekte

Retrovirus (JSRV) bezeichneten Erreger vermutlich um ein neues Virus ohne nähere

Verwandtschaft zu anderen Retroviren, evtl. sogar um eine neue Gattung innerhalb

der Familie der Retroviridae handelte (VERWOERD et al. 1983; PAYNE et al. 1983).

Dass durch eine experimentelle Infektion mit dem neu entdeckten Retrovirus die

Induktion Lungenadenomatose-spezifischer Läsionen sowie klinischer Erkrankungen

möglich ist, zeigten die Versuche verschiedener Autoren (MARTIN et al. 1976;

VERWOERD et al. 1980b; HERRING et al. 1983; SHARP et al. 1983). Die Frage

nach möglichen Cofaktoren stand jedoch nach wie vor im Raum (MARTIN et al.

1976; DE VILLIERS und VERWOERD 1980; DE MARTINI et al. 1987). Ebenso war

die pathogenetische Rolle JSRV-ähnlicher endogener Retroviren (ESRV) lange Zeit

unklar (YORK et al. 1992; HECHT et al. 1994; PALMARINI et al. 1996a; PALMARINI

et al. 1999a). Den letzten Beweis, dass wie vermutet allein JSRV und nicht ESRV

oder ein Zusammenwirken verschiedener Faktoren die Ursache für die Erkrankung

ist, erbrachten PALMARINI et al. (1999a) mithilfe von Infektionsversuchen mit einem

infektiösen molekularen Klon des exogenen Virus und konnten somit zeigen, dass

JSRV notwendig und ausreichend ist, um Lungenadenomatose zu induzieren.


2.1.4.2 Retroviridae Bei der Familie der Retroviren handelt es sich um behüllte RNA-Viren, deren

Erbinformation auf zwei identischen, 7 - 12 kb großen, linearen einzelsträngigen

RNA-Molekülen von positiver Polarität gespeichert ist. Das Virion hat einen

Durchmesser von etwa 100 bis 150 nm. Eine familientypische Eigenschaft ist ihre

Replikationsstrategie mithilfe des Enzyms reverse Transkriptase. Dieses Enzym

transkribiert die virale RNA in lineare doppelsträngige DNA, die anschließend in das

Genom der infizierten Zelle integriert wird (sog. provirale DNA). Nach seiner

Integration in das Wirtsgenom nutzt das Provirus die Mechanismen der Zelle für

seine Transkription und Translation.

Man unterscheidet anhand der Organisation des Virusgenoms zwischen einfachen

und komplexen Retroviren. Alle Retroviren weisen drei Hauptdomänen mit

Informationen für virale Proteine auf, gag (interne Strukturproteine für Matrix (MA),

Capsid (CA) und Nucleocapsid (NC)), pol (reverse Transkriptase und Integrase) und

env (Glycoproteine der Hülle: SU (surface) und TM (transmembrane)), sowie

zusätzlich eine kleinere Domäne (pro), die die virale Protease codiert. Terminale

Sequenzen am 5’- und 3’-Ende sind für die Regulation der viralen Genexpression

verantwortlich. Sie beinhalten eine Region R, die an beiden Enden des Genoms

vorkommt, sowie je eine Region U5 und U3, deren Vorkommen jeweils auf das 5’-

Ende bzw. das 3’-Ende des RNA-Stranges begrenzt ist. Im Zuge der reversen

Transkription erhält die resultierende provirale DNA an beiden Enden sogenannte

long terminal repeats (LTR), die Sequenzen von beiden Enden der viralen RNA in

der Reihenfolge U3-R-U5 enthalten (VOGT 1997; PALMARINI und FAN 2003).

Das Genom komplexer Retroviren weist zusätzliche Informationen für regulatorische

Proteine auf. Manche onkogenen Retroviren beinhalten inkorporierte Fragmente

bestimmter zellulärer Gene (c-onc oder proto-Onkogene), die bei ihrer Integration in

das Virusgenom Veränderungen erfahren haben und damit zu viralen Onkogenen

(v−onc) geworden sind (VOGT 1997; PALMARINI und FAN 2003). Anhand des

Vorhandenseins oder Fehlens solcher Onkogene und der damit verbundenen


Schnelligkeit der Tumorinduktion bzw. der Fähigkeit der Transformation von

Zellkulturen werden onkogene Retroviren historisch auch in akut transformierende

und nicht akute Retroviren eingeteilt (VOGT 1997; FAN et al 2003).

Weiterhin ist die Familie in sieben Gruppen eingeteilt, die den taxonomischen Rang

einer Gattung haben: alpha-, beta-, gamma-, delta- und epsilon-Retroviren sowie die

Lenti- und die Spumaviren (PALMARINI und FAN 2003).

2.1.4.3 Jaagsiekte Retrovirus (JSRV)

JSRV gehört aufgrund seiner Genomorganisation zu den einfachen Retroviren mit

long terminal repeats (LTR), gag, pol, pro und env Regionen. Strukturell bestehen

keine Hinweise auf bekannte Onkogene oder andere Sequenzen, die normalerweise

mit Tumorentstehung assoziiert sind (HECHT et al. 1996b; FAN et al. 2003). Es

nimmt in seinen Eigenschaften eine Zwischenstellung zwischen Typ-B und Typ-D

Retroviren ein (VERWOERD et al. 1980b; SHARP et al. 1983; YORK et al. 1991),

wobei die Sequenzen für das Capsid eher den Typ-D, die der env-Region eher den

Typ-B Retroviren zuzuordnen sind (DE MARTINI und YORK 1997). Heute wird das

Virus als ein beta-Retrovirus klassifiziert. Diese Gattung beinhaltet Viren vom B- und

D-Typ (PALMARINI und FAN 2003). Neben morphologischen Beobachtungen

sprachen auch serologische Untersuchungen aufgrund von Kreuzreaktionen mit

Antiseren gegen das Haupt-Coreprotein anderer beta-Retroviren wie des Mason-

Pfizer Monkey Virus, MPMV, (SHARP und HERRING 1983), Squirrel Monkey

Retrovirus und Langur Virus (KAJIKAWA et al 1990) schon früh für eine enge

antigenetische Verwandtschaft.

Die Sequenzierung des Genoms von JSRV gelang erstmals an einem

südafrikanischen Virusisolat (YORK et al. 1991, 1992). PALMARINI et al. (1999a)

sowie DE MARTINI et al. (2001) erstellten die Sequenzen von zwei weiteren Isolaten

(JSRV21 bzw. JSRVJS7). Weitere Teilsequenzen aus Isolaten verschiedener

geographischer Herkunft sind ebenfalls untersucht (HECHT et al. 1994; BAI et al.

1996, 1999; PALMARINI et al. 1996a; ROSATI et al. 2000).


Demnach ist die Länge des RNA-Genoms etwa 7,4 kb, die des Provirus ca. 7,8 kb.

Neben den klassischen retroviralen Genen gag, pro, pol und env wurde ein

zusätzlicher offener Leserahmen identifiziert, der als orf-x bezeichnet wird und

dessen Funktion bislang unbekannt ist (PALMARINI et al. 1999a; ROSATI et al.

2000; PALMARINI und FAN 2003).

Zwischen den bekannten Virusisolaten ist eine große Homologie erkennbar. Es wird

jedoch zwischen einem afrikanischen (Typ I) und einem europäischen/

nordamerikanischen Stamm (Typ II) unterschieden (BAI et al. 1996). So weisen die

beiden Isolate JSRV21 und JSRVJS7 eine 99,2%ige Übereinstimmung auf. Beide

stammen aus Großbritannien, wurden jedoch in einem Abstand von zehn Jahren

gewonnen. Diese beiden zeigen zu dem südafrikanischen Isolat eine

Übereinstimmung von 93,3% (PALMARINI und FAN 2003).

Eine Besonderheit des Virus scheint eine relativ hohe Resistenz gegenüber

Einflüssen zu sein, durch die die meisten anderen Retroviren inaktiviert werden

(PALMARINI und FAN 2003). So wurde der Titer eines mit einer JSRV-Hülle

versehenen retroviralen Vektors durch physikalische Einflüsse (Temperatur,

wiederholtes Einfrieren und Auftauen, Zentrifugation) nicht beeinfußt, während

derselbe Vektor mit Hüllproteinen des Murinen Leukämievirus eine 30 bis 40%ige

Titerreduktion aufwies. Eine Resistenz der Virushülle von JSRV wurde auch

gegenüber Surfactant (Survanta, ein in der Humanmedizin verwendetes

Surfactantpräparat boviner Herkunft) festgestellt, während dieselben Vektoren in der

Hülle anderer Viren durch Surfactant 80% an Aktivität einbüßten. Gegenüber

üblichen Desinfektionsmitteln zeigten JSRV-Vektoren keine erhöhte Resistenz.

(COIL et al. 2001).

Die Expression großer Mengen von JSRV erfolgt nahezu ausschließlich in den

infizierten Tumorzellen (PALMARINI et al. 1995), provirale DNA und in manchen

Fällen auch virale RNA konnte mit sensitiven Nachweismethoden jedoch auch in

verschiedenen lymphatischen Geweben und in Leukozyten nachgewiesen werden

(PALMARINI et al. 1996b; HOLLAND et al. 1999).


2.1.4.4 Endogene Retroviren

Endogene Retroviren sind in zahlreichen Wirbeltieren einschließlich des Menschen

nachgewiesen worden (HECHT et al. 1996a; VOGT 1997). Sie werden als Relikte

vergangener retroviraler Infektionen angesehen, die zu einem frühen evolutionären

Zeitpunkt in das Wirtsgenom integriert und bei Befall von Keimzellen weitervererbt

wurden (HECHT et al. 1996a, b; DE MARTINI et al. 2003).

Im Genom gesunder Schafe finden sich regelmäßig 15 bis 20 Kopien endogener

Gensequenzen (endogenous sheep retroviruses, ESRV), die der Sequenz von JSRV

sehr ähnlich sind (YORK et al. 1992; HECHT et al. 1994, 1996a). Endogene

retrovirale Sequenzen wurden auf mindestens 15 der 28 Schafchromosomen

identifiziert und sie sind augenscheinlich zufällig verteilt (CARLSON et al. 2003).

Lange Zeit war deren Rolle in der Pathogenese der Erkrankung unklar. Zusätzlich

standen sie der Entwicklung molekularbiologischer Nachweisverfahren für JSRV im

Wege. Dies änderte sich erst, als es durch die Arbeiten von PALMARINI et al.

(1996a) gelang, mithilfe unterschiedlicher Restriktionsenzym-Schnittstellen zwischen

endogenen retroviralen Sequenzen und dem exogenen JSRV zu unterscheiden. BAI

et al. (1996) erkannten Unterschiede zwischen JSRV und ESRV in der Sequenz der

U3-Region des LTR. Auf der Basis dieser Informationen gelang es, JSRV-spezifische

Primer für einen Virusnachweis mittels PCR zu entwickeln (PALMARINI et al.

1996b). Eine Sequenzanalyse ergab weitere Unterschiede zwischen JSRV und

ESRV in der env-Region (BAI et al. 1999).

ESRV werden in geringen Mengen in Bronchialepithel exprimiert (PALMARINI et al.

2000b). Der Hauptort der Genexpression scheint jedoch der weibliche Genitaltrakt zu

sein (PALMARINI et al. 2000b, 2001a). Eine Expression von ESRV findet auch in

fetalen Geweben statt (SPENCER et al. 2003). Eine ätiologische Bedeutung von

ESRV an der Entstehung der Lungenadenomatose wird als unwahrscheinlich

angesehen. Es wird jedoch die Möglichkeit der Induktion einer Immuntoleranz

gegenüber JSRV diskutiert, die das beobachtete Fehlen einer Immunantwort

(SHARP und HERRING 1983; ORTIN et al. 1998; SUMMERS et al. 2002) erklären


könnte (SPENCER et al. 2003; DE MARTINI et al. 2003; PALMARINI et al. 2004).

Dieser Theorie widersprechen nach der Meinung von PALMARINI die Ergebnisse

von SHARP et al. (unveröffentlicht, zit. nach SHARP und DE MARTINI 2003) nicht,

denen eine experimentelle Induktion der Antikörperbildung durch rekombinante

Proteine (CA und SU) in Adjuvans gelang, da ein Durchbrechen einer erworbenen

Immuntoleranz unter dem Einfluß von Adjuvantien wiederholt beschrieben wurde

(PALMARINI et al. 2004). Ein positiver Effekt der Expression von ESRV ist eine

kompetitive Hemmung des Eintritts von JSRV in die Zelle sowie des Austritts neuer

JSRV-Partikel aus der Zelle durch Besetzen von Rezeptoren durch ESRV

(PALMARINI et al. 2004).

2.1.5 Pathogenese

2.1.5.1 Pathogenese der klinischen Symptome

Durch das Tumorwachstum kommt es zu einer Verringerung der für den

Gasaustausch zur Verfügung stehenden Alveolarfläche. Klinische Symptome einer

Dyspnoe treten erst dann auf, wenn die Fläche des verdichteten Lungengewebes so

groß ist, dass ein angemessener Gasaustausch nicht mehr möglich ist. Dies ist

natürlicherweise zuerst in Belastungssituationen zu erkennen (WANDERA 1971;

VERWOERD et al. 1985). Nach den Untersuchungen von GANTER trat eine

respiratorische Partialinsuffizienz erst bei Tieren auf, bei denen mindestens 30% des

Lungenparenchyms makroskopisch tumorös entartet waren. Bei Feststellung einer

respiratorischen Globalinsuffizienz waren regelmäßig mindestens 50% der Lungen

makroskopisch tumorös verändert (GANTER 2004, pers. Mitteilung). Der Tod der

Tiere tritt letztlich durch Hypoxie, respiratorische Azidose und Herz-

Kreislaufversagen ein (VERWOERD et al. 1985).

Die tumorös entarteten Typ II Pneumozyten und Clara-Zellen haben einen hohen

Differenzierungsgrad und haben sich ihre sekretorische Aktivität erhalten (PLATT et


al. 2002; SHARP und DE MARTINI 2003). Typ II Pneumozyten sind die Produzenten

eines feinen Phospholipidfilms, des Surfactant, der in gesunden Lungen das

Alveolarlumen auskleidet. Diese Substanz wirkt als spezifisches Detergens und

reduziert die Oberflächenspannung der Alveolarwand um den Faktor fünf bis zehn.

Clara-Zellen sezernieren ein Sekret, das durch proteolytische Enzyme oder andere

Stoffe Schleim und Zelldetritus auflösen kann und somit einer Verlegung der

Luftwege entgegenwirkt (LEONHARDT 1990; LIEBICH 1993). Durch die große

Anzahl und sekretorische Aktivität der Tumorzellen kommt es mit zunehmender

Tumorausdehnung zu einer Ansammlung von Sekret (Lungenflüssigkeit) in den

Alveolen und Luftwegen (NISBET et al 1971; SHARP und DE MARTINI 2003; FAN et

al. 2003). Eine weitere Beeinträchtigung des Gasaustausches durch die

Flüssigkeitsansammlung und feucht-rasselnde, diskontinuierliche Atemgeräusche

sind die Folge, sowie im Endstadium einer unkomplizierten Erkrankung der Abgang

von großen Mengen Lungenflüssigkeit über die Nase, der durch den sog.

Schubkarrentest provoziert werden kann (SHARP und DE LAS HERAS 2000). In

manchen Fällen, z.B. bei Sekundärinfektionen (DUNGAL 1946; GANTER 1996) oder

der atypischen Lungenadenomatose (GARCIA-GOTI et al. 2000), kann dieses

Symptom jedoch auch fehlen.

2.1.5.2 Zelltropismus und mögliche Mechanismen der Onkogenese durch JSRV

Der Tropismus retroviraler Infektionen wird im wesentlichen durch Glycoproteine der

Hülle und die long terminal repeats (LTR) bestimmt. PALMARINI et al. (2000a)

konnten zeigen, dass JSRV LTR eine wichtige Rolle für den Tropismus dieser Viren

für epitheliale Zellen der Lunge einnimmt.

Die Mechanismen der Onkogenese nach einer Infektion mit JSRV sind noch nicht

abschließend geklärt. Das Genom von JSRV enthält keine bekannten Onkogene

oder andere bekannten, mit Tumorentstehung assoziierten Sequenzen (HECHT et

al. 1996b; FAN et al. 2003). Die Bedeutung der Region orf-x im Virusgenom, die


keine Homologie zu anderen bekannten retroviralen Genorten aufweist, wurde als

mögliches Onkogen diskutiert (COUSENS et al. 1999; FAN et al. 2003). Gegen diese

Theorie spricht sein paralleles Vorkommen in den nicht onkogenen endogenen

Retroviren (PALMARINI et al. 2000b; ROSATI et al. 2000) sowie die Tatsache, dass

die entsprechende Region im Genom des mit JSRV eng verwandten und ebenfalls

onkogenen Enzootic Nasal Tumour Virus, (ENTV, der Erreger des enzootischen

Siebbeinkarzinoms der Schafe) zwei Stop-Codons aufweist, damit also bei diesem

Virus kein offener Leserahmen im eigentlichen Sinne ist. Da vermutet wird, dass

beide Viren einen analogen Mechanismus der Onkogenese haben, erscheint die

Beteiligung von orf-x an diesem Prozeß unwahrscheinlich (COUSENS et al. 1999).

Eine andere prinzipielle Möglichkeit der Tumorentstehung durch Retroviren ist die

Aktivierung zellulärer proto-Onkogene durch die Insertion an der entsprechenden

Stelle in das Wirtszellgenom (VOGT 1997). Bei der Untersuchung der

Integrationsstellen von JSRV im Schafgenom verschiedener Tumorproben wurden

70 verschiedene Integrationsstellen auf 20 der 28 Schafchromosomen identifiziert.

Es scheint sich demnach hierbei um eine zufällige Verteilung ohne Bedeutung für die

Tumorentstehung zu handeln (FAN et al. 2003).

Die Eigenschaft der raschen Tumorinduktion insbesondere nach experimenteller

Infektion von neugeborenen Lämmern (SHARP et al. 1983) deutet darauf hin, dass

JSRV den akut transformierenden Retroviren zuzuordnen ist (FAN et al. 2003).

Weitere Hinweise hierauf und auf das Vorhandensein eines Onkogens liefert die

gelungene Transformation muriner Fibroblastenzellkulturen (NIH 3T3-Zellen)

(MAEDA et al. 2001). Diese Autorengruppe konnte orf-x endgültig als mögliches

Onkogen ausschließen, lieferte jedoch Hinweise, dass JSRV Hüllproteine für die

Transformation verantwortlich sind. Als JSRV-Rezeptor in der Zellmembran wurde

Hyaluronidase 2 (Hyal-2) identifiziert. Dieses Protein ist in die Membran mithilfe einer

Glycosylphosphatidylinositol-Verbindung (GPI) eingebaut, welche häufig an der

zellulären Signalübertragung beteiligt ist (RAI et al. 2001). Hyal-2 wird als mögliches

Tumorsuppressorgen angesehen (RAI et al. 2001; FAN et al. 2003).


FAN et al. (2003) diskutieren auf der Grundlage dieser Ergebnisse drei mögliche

Mechanismen einer Hüllprotein-induzierten Onkogenese durch JSRV:

1. Bindung von JSRV Hüllprotein (SU) an Hyal-2 auf der Zelloberfläche. Dies

könnte die mögliche tumorunterdrückende Funktion der Hyal-2 ausschalten.

Eine zweite Möglichkeit ist eine Wachstumsstimulation nach Bindung an Hyal-

2 durch Signalübertragung in das Zellinnere über GPI.

2. Bindung von JSRV SU an ein anderes Protein der Zellmembran (nicht Hyal-2)

und Stimulation des Zellwachstums durch dieses andere Membranprotein.

3. Bindung des Transmembranproteins (TM) von JSRV mithilfe seines

zytoplasmatischen Endes an ein zytoplasmatisches Protein, das wiederum

Zellwachstum induziert.

PALMARINI et al. (2000b) beschrieben weitreichende Homologien in der Sequenz

der endogenen Retroviren mit der des JSRV. Zwei variable Regionen (VR1 und VR2)

wurden innerhalb des gag Gens, eine weitere (VR3) innerhalb des env Gens

identifiziert. Die Region VR3 codiert unter anderem für das zytoplasmatische Ende

des Transmembranproteins (TM) der Virushülle. Anhand in vitro hergestellter

chimärischer Virushüllen, die einerseits endogenes TM und exogenes SU enthielten

und umgekehrt, wurde die Transformationskapazität dieser Chimären in murinen

Fibroblastenzellkulturen überprüft. Eine Transformation wurde lediglich durch die

Kombination exogenes TM – endogenes SU, nicht aber durch die Kombination

endogenes TM – exogenes SU induziert. Eine weitere Chimäre, die in einer

ansonsten ausschließlich exogenen Hülle lediglich den durch VR3 codierten Teil des

TM-Proteins endogener Herkunft enthielt, konnte ebenfalls keine Transformation der

Zellen hervorrufen (PALMARINI et al. 2001b). Das exogene TM und insbesondere

die exogene VR3-Region sind folglich notwendig für eine Zelltransformation

(PALMARINI et al. 2001b; LIU et al. 2003). Weitere Versuche konnten zeigen, dass

das 141 Aminosäuren lange Carboxy-terminale Ende des exogenen TM-Proteins für

eine Transformation von Fibroblastenzellkulturen ausreichend ist (CHOW et al.

2003). Der genaue Mechanismus der Zelltransformation durch JSRV TM ist derzeit

Objekt intensiver Untersuchungen an verschiedenen in-vitro-Modellen (FAN et al.


2003; CHOW et al. 2003; DANILKOVICH-MIAGKOVA et al. 2003; MAEDA et al.

2003; ZAVALA et al. 2003), jedoch noch nicht abschließend geklärt. CHOW et al.

(2003) äußern die Vermutung, dass für eine Onkogenese in vivo zusätzlich zur

Expression von JSRV TM weitere Faktoren nötig sind.

2.1.6 Epidemiologie

2.1.6.1 Verbreitung

Mit Ausnahme von Australien und Neuseeland ist die Lungenadenomatose in einer

Vielzahl von Ländern auf allen Kontinenten verbreitet. (SHARP und DE LAS HERAS

2000). Aus den beiden letztgenannten Ländern wurde jeweils ein Fallbericht bekannt,

in dem bei einem Einzeltier ein Adenom der Lunge diagnostiziert wurde. In beiden

Fällen gehen die Autoren jedoch von einer nicht-infektiösen Ursache der

Veränderungen aus (DALEFIELD und ALLEY 1988; HOOPER und ELLARD 1995).

Island ist seit 1952 durch radikale Eradikationsmaßnahmen ebenfalls frei von

Lungenadenomatose (SIGURDSSON 1958; PALSSON 1985).

2.1.6.2 Verluste in infizierten Herden

Die Verluste durch die Lungenadenomatose können in neu infizierten Herden bis zu

50 bis 80% des Tierbestandes erreichen (DUNGAL et al. 1938). In bereits endemisch

infizierten Herden belaufen sich die jährlichen Verluste durch die Erkrankung auf

2 - 10% des Bestandes. Etwa 50% aller Todesfälle sind in solchen Beständen mit

Lungenadenomatose assoziiert und bei bis zu 20% der aus einer Herde

aussortierten Schlachtschafe liegt die Erkrankung vor (SHARP und DE LAS HERAS

2000).


2.1.6.3 Übertragungswege

Die Einschleppung in Bestände erfolgt durch Zukauf von bzw. Kontakt mit infizierten

Tieren. Auf dem Wege des engen Kontaktes mit infizierten Tieren erfolgt auch die

Ausbreitung innerhalb eines einmal infizierten Bestandes, wobei die Übertragung

auch in der Inkubationszeit möglich ist (MITCHELL 1915; DUNGAL et al. 1938). In

der Außenwelt ist das Virus nur kurze Zeit lebensfähig (VERWOERD 1990).

Die Übertragung erfolgt überwiegend aerogen (DUNGAL et al. 1938, 1946; TUSTIN

1969; WANDERA 1971; DE LAS HERAS et al. 2003), wobei sowohl die Inhalation

virushaltiger, zellfreier Aerosole als auch die Transplantation von Tumorzellen mit

ausgehustetem Lungensekret möglich sind (VERWOERD und DE VILLIERS 1980).

Die intrauterine Übertragung wurde lange Zeit aufgrund verschiedener Experimente

und Beobachtungen als unwahrscheinlich angesehen (DUNGAL 1946; TUSTIN

1969; VERWOERD 1990). Der Erregernachweis in fetalen Geweben sowie die

Beschreibung eines JSRV-assoziierten Tumors bei einem drei Tage alten Lamm (DE

LAS HERAS et al. 2000) lässt jedoch auch einen intrauterinen Übertragungsweg

möglich erscheinen. Eine orale Übertragung kann nach derzeitigem Kenntnisstand

ebenfalls nicht völlig ausgeschlossen werden (DE LAS HERAS et al. 2003).

2.1.6.4 Inkubationszeit und Altersverteilung

In neu infizierten Herden scheint die Inkubationszeit unter natürlichen Bedingungen

etwa sechs bis acht Monate zu betragen (DUNGAL et al. 1938). Andere Autoren

postulieren eine Inkubationszeit zwischen neun Monaten und drei Jahren

(MARKSON und TERLECKI 1964; VERWOERD et al. 1985). Unter natürlichen

Bedingungen erkranken daher selten Tiere, die jünger sind als sieben bis neun

Monate. Eine Häufung der Fälle wird im Alter von drei bis vier Jahren beschrieben

(MITCHELL 1915; HUNTER und MUNRO 1983; SHARP und DE LAS HERAS 2000).

Aufgrund experimenteller Übertragungsstudien scheinen alle Altersgruppen für die

Infektion empfänglich zu sein (DE LAS HERAS et al. 2003), die Effektivität


experimenteller Übertragungsversuche nimmt nach den Beobachtungen von

VERWOERD (1990) jedoch mit zunehmendem Alter ab, so dass er vermutet, dass

natürliche Infektionen hauptsächlich im Lämmeralter vorkommen. Nach

intratrachealer Inokulation von Tumorgewebe oder Lungenflüssigkeit in einige

Monate alte Lämmer oder erwachsene Schafe betrug die Inkubationszeit bis zum

Auftreten klinischer Erkrankungen fünf bis zwölf Monate (TUSTIN 1969; WANDERA

1971; MARTIN et al. 1976). Bei Verwendung gefroren gelagerten Materials wurde

nach 14 Monaten nur eine beginnende Tumorentwicklung festgestellt

(SIGURDSSON 1958). Nach intratrachealer Infektion unter 24 Stunden alter Lämmer

mit konzentrierter Lungenflüssigkeit reduzierte sich die Inkubationszeit auf drei bis

sechs Wochen, in Einzelfällen sogar auf vier bis sechs Tage (SHARP et al. 1983).

2.1.6.5 Begünstigende Faktoren / genetische Disposition, Resistenz-entwicklung und Immunreaktion

DUNGAL et al. (1938), MARKSON und TERLECKI (1964), sowie MACKAY und

NISBET (1966) weisen auf bestimmte Haltungs- und Managementfaktoren hin, die

die Ausbreitung der Erkrankung innerhalb einer Herde begünstigen. Hierzu gehören

z.B. die winterliche Aufstallung in kleinen, schlecht belüfteten Ställen, wie sie zu

Zeiten des großen Seuchenzuges im Island der 30iger Jahre üblich war, ein

regelmäßiges nächtliches Aufstallen oder Zusammentreiben in Pferchen, zum

Beispiel zum Zwecke des Melkens oder die längerfristige Stallhaltung unter

intensiven Produktionsbedingungen.

Verschiedene Autoren diskutieren eine mögliche Rassedisposition (DUNGAL et al.

1938; HUNTER und MUNRO 1983; VERWOERD 1990) oder sogar familiäre

Einflüsse (DE KOCK 1958; TUSTIN 1969). Demnach scheinen bestimmte Rassen

oder Bockfamilien resistenter zu sein als andere (SHARP und ANGUS 1990).

VERWOERD (1990) schildert ein Experiment, bei dem gleichgeschlechtliche

Zwillingslämmer unter identischen Bedingungen mit JSRV infiziert wurden. Eines

entwickelte innerhalb von sechs Wochen eine klinische Erkrankung, an der es starb,


das zweite Tier zeigte nach Ablauf von zwei symptomlosen Jahren lediglich einzelne

kleine Tumorknötchen in der Lunge. Er schließt daraus, dass manche Individuen

eine erhöhte Resistenz gegenüber der Erkrankung aufweisen oder entwickeln.

Es bestehen klinische Hinweise darauf, dass sich in infizierten Herden eine gewisse

Resistenz gegenüber der Erkrankung einstellt. Während die Verluste in neu

infizierten Herden zu Beginn mit 50 – 60% exorbitant hoch sein können, pendeln sie

sich im Verlauf der Jahre meist zwischen 5% und 10% ein (TUSTIN 1969;

VERWOERD et al. 1985). In Kenia wurde ein Abfall der Mortalität von zunächst

durchschnittlich 30% auf 1 – 5% beobachtet (WANDERA 1971). Als mögliche

Ursachen für dieses Phänomen kommen eine vermutlich immunologisch bedingte

Resistenzentwicklung der Tiere durch persistierenden Erregerkontakt in endemisch

infizierten Herden (TUSTIN 1969; VERWOERD 1990), eine Auslese in Richtung

genetisch widerstandsfähigerer Individuen oder Änderungen in Haltung und

Management, die im Laufe der Zeit aufgrund des Vorhandenseins der Erkrankung in

den betroffenen Herden eingeführt wurden, in Frage (WANDERA 1971).

Der Nachweis humoraler Antikörper ist bei natürlicher und experimenteller Infektion

bislang nicht gelungen (SHARP und HERRING 1983; VERWOERD 1990; ORTIN et

al. 1998; SUMMERS et al. 2002). Frühe Impfversuche waren nicht erfolgreich

(TUSTIN 1969). Eine experimentelle Induktion der Antikörperbildung durch

rekombinante Proteine (CA und SU) in Adjuvans gelang jedoch SHARP und

Mitarbeitern (unveröffentlicht, zit. nach SHARP und DE MARTINI 2003). Ob diese

eine protektive Wirkung haben, bedarf weiterer Untersuchungen. SUMMERS et al.

(2002) beobachteten bei JSRV-infizierten Lämmern eine reduzierte

lymphoproliferative Antwort auf die Stimulation mit bestimmten mitogenen

Substanzen, so dass die Autoren eine mögliche immunsuppressive Funktion von

JSRV postulieren. Veränderungen im Differentialzellbild bei natürlichen

Krankheitsfällen konnten bei experimentell infizierten Tieren nicht nachvollzogen

werden. Die Autoren führen diese auf unter natürlichen Bedingungen häufig

vorkommende Sekundärinfektionen zurück (SUMMERS et al. 2002).


2.1.6.6 Befall anderer Tierarten

A Ziegen

Bereits HUTCHEON (1905, zitiert nach MITCHELL 1915) äußerte den Verdacht,

dass auch Ziegen an Lungenadenomatose erkranken können. Dies wurde durch

anekdotische Berichte, z.B. aus Peru (CUBA CAPARO et al. 1961) und Ungarn

(GLAVITS et al. 1996) bestätigt. In diversen Regionen Indiens wurden von

verschiedenen Autoren Untersuchungen an Schlachtorganen und natürlich

verendeten Ziegen vorgenommen. Aus einem Untersuchungsgut von mehreren

hundert bis mehreren tausend Schlachtlungen wurden Prävalenzen zwischen 0,45%

und 0,58 % ermittelt (BHAGWAN und SINGH 1972; BANERJEE und GUPTA 1979;

DADHICH und SHARMA 1995). Lungenadenomatose-typische Läsionen wiesen

auch 0,72% der natürlich verendeten Ziegen auf (SRIRAMAN et al. 1982). Aus

Griechenland wurde von einem Vorkommen von 0,21% bei 1410 Schlachtziegen

berichtet (STEFANOU et al. 1975).

Die experimentelle Übertragung von Lungenadenomatose auf Ziegen ist

verschiedenen Autoren ebenfalls gelungen. Sie berichten jedoch nach einer

experimentellen Infektion übereinstimmend vom Fehlen klinischer Erscheinungen

sowie lediglich dezenten pathologisch-anatomischen Veränderungen, die dem Bild

der atypischen Form der Lungenadenomatose des Schafes glichen (SHARMA et al.

1975b; SHARP et al. 1986; TUSTIN et al. 1988). Ziegen scheinen demnach

gegenüber Lungenadenomatose wesentlich resistenter zu sein als Schafe. (SHARP

und DE MARTINI 2003). Dies wird auch durch Beobachtungen in den

Heidschnuckenherden des Vereins Naturschutzpark e. V. (VNP) bestätigt. Bei den in

den drei Gebrauchsherden mit den Schafen unter gleichen Bedingungen gehaltenen

Ziegen sind bislang trotz zum Teil extrem hoher Inzidenz und Verlustrate bei den

Schafen klinische Erkrankungen bei Ziegen noch nie beobachtet worden

(KOOPMANN 2004; GANTER 2004, pers. Mitteilungen). In Einzelfällen können nach


natürlicher Infektion jedoch auch bei Ziegen klinische Symptome beobachtet werden

(GLAVITS et al. 1996; GANTER 2004, pers. Mitteiung).

B Mufflons

Neben Ziegen ist auch die natürliche Übertragung auf Mufflons (Ovis musimon)

belegt. Diese erfolgte akzidentell durch Kontakt von zur Auswilderung vorgesehenen

Mufflons zu einer JSRV-infizierten Schafherde auf Sardinien. Nach Auswilderung

dieser Tiere ist die Erkrankung nun auch in der Wildpopulation der Mufflons

Sardiniens verbreitet (SANNA et al. 2001).

C Andere Tierarten

Andere Tierarten oder der Mensch erkranken nach derzeitigem Kenntnisstand nicht

an Lungenadenomatose. Die experimentelle Übertragung auf kleine Labortiere ist

lediglich durch subkutane Injektion von Tumormaterial in Nacktmäuse gelungen

(DUNGAL 1946; COETZEE et al. 1976; VERWOERD und DE VILLIERS 1980).

2.1.7 Vorkommen und Bedeutung der Lungenadenomatose in Deutschland

In Deutschland wurde Lungenadenomatose erstmals durch EBER (1892; zit. nach

EBER 1899) beschrieben. In den Jahren 1891 bis 1895 stellte er bei insgesamt 21

Schlachtlungen bzw. Schlachtlungenteilen von Schafen multiple Adenome fest,

deren detaillierte Beschreibung mit dem pathologisch-anatomischen und

histologischen Bild der Lungenadenomatose übereinstimmt (EBER 1899). In den

folgenden Jahrzehnten folgen anekdotische Berichte über einzelne Fälle

(MÖSENFECHTEL 1937) oder seuchenartige Ausbrüche in einzelnen Herden

(EYLAU 1953; PALLASKE 1954; JAKOB und KRAUSE 1965). Die Einschleppung

der Lungenadenomatose nach Island mit der Folge eines verheerenden


Seuchenzuges geht auf die Einfuhr einer Gruppe von Karakul-Zuchtböcken aus

Deutschland im Jahr 1933 zurück, von denen vermutlich einer mit

Lungenadenomatose infiziert war (DUNGAL et al. 1938). Dieser Bock hatte etwa ein

halbes Jahr nach seiner Eingliederung in die später als erstes erkrankte Herde

Anzeichen einer respiratorischen Erkrankung gezeigt und war von den sommerlichen

Gebirgsweiden nicht zurückgekehrt. Der Kadaver wurde nicht aufgefunden

(OLAFSSON 1939). MIESSNER (1939) betont, dass der Herkunftsbetrieb der

importierten Tiere unter steter tierärztlicher Kontrolle stand und eine der

Lungenadenomatose vergleichbare Erkrankung dort niemals beobachtet worden sei,

was von DUNGAL (1939) auf ein mögliches „verborgenes Dasein“ in einer schon

längere Zeit infizierten Population zurückgeführt wird.

Verschiedene Autoren haben das Vorkommen der Lungenadenomatose in

unterschiedlichen Regionen Deutschlands anhand von Schlachtorganen untersucht.

Im Einzugsgebiet des Schlachthofes München wurde bei der Untersuchung von 1000

Schlachtlungen überwiegend adulter Tiere kein Fall von Lungenadenomatose

diagnostiziert. Bayern wurde aufgrund dessen als frei von Lungenadenomatose

angesehen. Die in einer Lunge festgestellte, von den Verfassern als „bronchioläres

Adenom“ bezeichnete Veränderung wurde von diesen als ein spontaner, primärer

Lungentumor angesprochen (SEDLMEIER et al. 1966). Sie wies der Beschreibung

nach jedoch Ähnlichkeit mit den für Lungenadenomatose charakteristischen

Läsionen auf (WEILAND 1966). Im Jahr 1969 wurden auch aus diesem Bundesland

zwei Fälle von Lungenadenomatose berichtet (SCHIEFER und KAST 1969). Dass es

sich in Bayern keineswegs um eine ausgesprochen seltene Erkrankung handelt,

betonen GEISEL et al. (1973), die neben dem anekdotischen Nachweis der

Lungenadenomatose in Sektionsmaterial die systematische Untersuchung von

Schlachtlungen am Schlachthof München betrieben und bei 0,317% der

geschlachteten Tiere Lungenadenomatose nachweisen konnten. SCHULZ et al.

(1965) berichten von einem Vorkommen von acht Fällen in 1000 konfiszierten

Schlachtlungen der Schlachtstätten Hannover, Berlin und Hamburg. Hochgerechnet

auf die Gesamtzahl der geschlachteten Tiere entspricht dies etwa 0,2% der


Schlachtschafe. Im internationalen Vergleich liegt Deutschland damit nach

Zusammenstellungen von WEILAND (1966) sowie SCHULZ und WEILAND (1968)

im Mittelfeld. In Spanien wurden Prozentsätze von ca. 0,05 bis 0,08%, in Peru von

0,5 bis 0,6%, in Chile 0,1% sowie in der Sowjetunion 0,25% ermittelt. PROSKE und

WIEGAND (1990) fanden in 6738 untersuchten Lungen aus der Normalschlachtung

an sechs verschiedenen ostdeutschen Schlachtbetrieben bei 103 Tieren (1,5%)

Veränderungen aufgrund von Lungenadenomatose. Dabei bemerkten sie deutliche

regionale Unterschiede (zwischen 0,2 und 2,5%).

2.1.8 Vorkommen und Bedeutung der Lungenadenomatose in der Heidschnuckenzucht

Innerhalb der Herdbuchzuchtherden der Grauen gehörnten Heidschnucken wurde

Lungenadenomatose 1992 erstmals eindeutig diagnostiziert (GANTER 1999). Im

Jahre 1993 wurde die Erkrankung in einer Herde im Gebiet der Lüneburger Heide

festgestellt und breitete sich in der relativ kleinen Zuchtpopulation schnell aus. Seit

1998 sind nachweislich auch eine Stamm- und sieben Gebrauchsherden, die dem

Verband Lüneburger Heidschnuckenzüchter e.V. (VLH) angehören, betroffen. Als

Folge daraus wurde von seiten des Zuchtverbandes ein Überwachungsprogramm

anhand der verpflichtenden Untersuchung von Schlachtlungen ins Leben gerufen.

Die Beschickung der traditionellen Auktion in Müden/Örtze bleibt zur Verhinderung

der weiteren Ausbreitung in der Zuchtpopulation Lungenadenomatose-

unverdächtigen Stammzucht- und Herdbuchherden vorbehalten. Im Zuge dieses

Überwachungsprogrammes wurde festgestellt, dass ca. ein Viertel der etwa 11.500

registrierten Zuchtschafe aus Lungenadenomatose-positiven Herden stammt. Aus

den verfügbaren Daten zu Heidschnuckenschlachtungen im Raum Lüneburger Heide

und Südheide ergeben sich für unterschiedliche Herden positive LA-Befunde bei 1,5

bis 29% der Schlachttiere (KRÄMER 2001).


Nach den Beobachtungen in den betroffenen Heidschnuckenherden scheinen diese

gegenüber anderen Schafrassen wesentlich früher zu erkranken. So weisen

aufgrund persönlicher Beobachtungen (GANTER 2000; KOOPMANN 2000, pers.

Mitteilungen) etliche der routinemäßig im Alter von sieben bis zwölf Monaten

geschlachteten Lämmer bereits Symptome einer klinischen Lungenadenomatose

auf. Einige erreichen aufgrund einer Lungenadenomatose-Erkrankung selbst dieses

Alter nicht und verenden vorzeitig. KRÄMER (2001) konnte bei der Untersuchung

von 47 Lämmern, die im Rahmen des Sanierungsversuches mittels mutterloser

Aufzucht bei ihren Müttern in der infizierten Herde verblieben, im Alter von

fünfeinhalb bis acht Monaten in vierzehn Fällen (29,8%) Lungenadenomatose

feststellen. Von diesen Tieren waren bereits fünf (10,6%) klinisch erkrankt.

2.1.9 Diagnostik und Nachweisverfahren 2.1.9.1 Klinische Untersuchung

Der klinische Untersuchungsgang des Atemtraktes ist für das Rind ausführlich von

STÖBER (1990b) und PRINGLE (1992a) beschrieben. Er ist im Wesentlichen auf

das Schaf übertragbar (WORKU 1994; GANTER 1996). Für die klinische

Untersuchung stehen die Methoden der Adspektion, olfaktorischen Prüfung,

Palpation, Perkussion und Auskultation zur Verfügung (STÖBER 1990a).

Eine Erhöhung der Atemfrequenz und Intensität kann auch durch andere Ursachen

als eine respiratorische Erkrankung begründet sein. Hierzu gehören z.B.

Kreislaufinsuffizienz, Anämie, raumfordernde Prozesse im Bauchraum, metabolische

Azidose oder die Thermoregulation. Andere Ursachen respiratorischer Symptome

müssen daher durch eine gründliche Untersuchung des gesamten Tieres und aller

Organsysteme ausgeschlossen werden (STÖBER 1990b). Insbesondere beim Schaf

unterliegt die Atemfrequenz einer großen Variation. Die Atmung ist für das Schaf das

wichtigste Instrument der Thermoregulation und wird bei gesunden Tieren vor allem

durch die Umgebungstemperatur und den Grad der Bewollung beeinflusst. Bei


gesunden, geschorenen Merinoland- und Schwarzkopfschafen wurde bei einer

Umgebungstemperatur von unter 20°C eine Ruhefrequenz von durchschnittlich 53

(+/- 28) Atemzügen pro Minute ermittelt. Bei Heidschnucken lag dieser Wert bei 43

(+/- 23) Atemzügen pro Minute. Bewollte Schafe bei einer Temperatur von über 20°C

wiesen durchschnittliche Ruheatemfrequenzen von 79 (+/- 27, für Merino- und

Schwarzkopfschafe) bzw. 97 (+/- 29, für Heidschnucken) Atemzüge pro Minute auf

(YOUSSEF 1986).

Während der langen Inkubationszeit ist die klinische Diagnose der

Lungenadenomatose mit den derzeit zur Verfügung stehenden Mitteln nicht möglich.

Zum Zeitpunkt der ersten sichtbaren Krankheitserscheinungen sind in der Regel

bereits ausgedehnte Lungenläsionen vorhanden (MACKAY und NISBET 1966;

TUSTIN 1969; VERWOERD et al. 1985). Die klinische Verdachtsdiagnose gründet

sich dann auf die Anzeichen einer progressiven, nicht fieberhaften respiratorischen

Erkrankung, die mit fortschreitender Abmagerung bei erhaltener Freßlust einhergeht.

Atemnot, insbesondere nach Belastung, feucht-rasselnde (diskontinuierliche)

Atemgeräusche, die in fortgeschrittenen Fällen sogar ohne Phonendoskop

wahrnehmbar sind, und gelegentlich Husten sind weitere Symptome (siehe 2.1.2).

Pathognomonisch ist im Endstadium der Erkrankung die Ansammlung großer

Mengen Flüssigkeit im Respirationstrakt, die bei Anheben der Hinterbeine über die

Nasenlöcher abfließt (DUNGAL 1946). In manchen Fällen, z.B. bei

Sekundärinfektionen (DUNGAL 1946; GANTER 1996) oder der atypischen

Lungenadenomatose (GARCIA-GOTI et al. 2000), kann dieses Symptom jedoch

auch fehlen.


2.1.9.2 Serologie und Virusanzüchtung

Das Fehlen einer nachweisbaren und diagnostisch nutzbaren Antikörperreaktion

(SHARP und HERRING 1983; ORTIN et al. 1998; SUMMERS et al. 2002) machen

einen frühzeitigen Nachweis einer stattgefundenen Infektion mit JSRV derzeit

unmöglich. Die zunächst vermutete diagnostische Verwertbarkeit eines

serologischen Tests (ELISA) auf der Grundlage einer Kreuzreaktivität gegen das

Major Core Protein p27 des Mason Pfizer Monkey Virus (KWANG et al. 1995) wurde

von ORTIN et al. (1998) widerlegt.

Obwohl es verschiedenen Arbeitsgruppen gelungen ist, Tumorzellen zu kultivieren

(TUSTIN und GEYER 1971; COETZEE et al. 1976; VERWOERD et al. 1980a;

SHARP et al. 1985; JASSIM et al. 1987; DE MARTINI et al. 2001) und für

verschiedene Zwecke zu nutzen, ist es bis 1999 nicht gelungen, Zellkulturen mit

JSRV zu infizieren. PALMARINI et al. (1999b) gelang dies für verschiedene ovine

Zellinien mithilfe eines in vitro hergestellten infektiösen Klons von JSRV21. Die in vitro

infizierten Zellinien produzierten jedoch nur äußerst geringe Virusmengen

(PALMARINI et al 1999b). Die Infektion von Zellkulturen mit Feldvirus ist bislang

nicht gelungen. Ein Virusnachweis mit klassischen virologischen Methoden durch in-

vitro-Infektion von Zellkulturen ist daher nach wie vor nicht möglich. Dies ist

hauptsächlich auf die extreme Spezialisierung von JSRV auf die Expression in Typ II

Pneumozyten und Clara-Zellen zurückzuführen, die sehr schwierig zu kultivieren sind

und ihren Differenzierungsstatus in der Zellkultur innerhalb kürzester Zeit einbüßen

(PALMARINI et al. 2000a).

2.1.9.3 Thoraxperkussion Nach den Untersuchungen von GANTER (1996) wird die Thoraxperkussion als eine

wenig sensitive und wenig spezifische Untersuchungsmethode angesehen. Neben

der praktischen Einschränkung, dass hierfür beim Schaf eine großflächige Schur des

Thorax nötig ist, wurden zwar bei allen untersuchten klinischen


Lungenadenomatose-Fällen Dämpfungsbezirke festgestellt. Auch in anderen

Untersuchungsgruppen (an anderen Lungenerkrankungen leidende Schafe) war dies

jedoch der Fall, und beginnende Läsionen unter Faustgröße bleiben bei dieser

Untersuchung unerkannt (GANTER 1996).

2.1.9.4 Ultraschalluntersuchung

Die transkutane Ultraschalluntersuchung ist eine vergleichsweise preisgünstige

Methode, die mithilfe tragbarer Ultraschallgeräte auch problemlos in Beständen

durchgeführt werden kann (SCOTT und GESSERT 1998). Durch die

Ultraschalluntersuchung des Thorax ist es möglich, an geschorenen Tieren

subpleural gelegene Veränderungen wie z. B. Abszesse oder eine Verdichtung des

Lungengewebes darzustellen (PUSTERLA et al. 1995; SCOTT und GESSERT

1998). Bei lungengesunden Tieren läßt sich das Lungenparenchym aufgrund der

Reflektion der Schallwellen nicht darstellen. Beurteilt werden können jedoch die

verschiedenen Schichten der Brustwand und die Pleura (BRAUN et al. 1996; SCOTT

und GESSERT 1998). In fortgeschrittenen Fällen mit ausgedehnten Tumoren sowie

zur gezielten Entnahme von Lungenbiopsien (MATHIS und SUTTERLÜTTI 1990;

PUSTERLA et al. 1995) kann die Ultrasonographie daher hilfreich sein. In tieferen

Gewebeschichten gelegene Tumoren sind jedoch ultrasonographisch nicht

darstellbar (REEF et al. 1991; SCOTT und GESSERT 1998), was diese

Untersuchungsmethode neben dem erheblichen Aufwand (Schur, Zeitaufwand) für

eine zuverlässige Frühdiagnostik ungeeignet erscheinen lässt.

2.1.9.5 Endoskopie

Mithilfe flexibler Endoskope ist eine Beurteilung von Nase, Kehlkopf, Trachea und

Bronchien möglich. Die normale Trachealschleimhaut des Wiederkäuers ist

feuchtglänzend, weißlich bis graurosa und von feinen Blutgefäßen durchzogen

(STÖBER 1990b; PRINGLE 1992b). Die Bronchoskopie und fiberoptische


Probenentnahme ist für alle großen Haustierarten einschließlich des Schafes

beschrieben und vielfach angewendet worden (BEGIN et al. 1981; WHITWELL und

GREET 1984; PRINGLE und VIEL 1986; PRINGLE et al. 1988; HEILMANN et al.

1988; WORKU 1994; GANTER 1996; VALARCHER et al. 1999). Nach GANTER

(1996) ist die Bronchoskopie beim Schaf am stehenden, mithilfe eines Halfters und

durch einen Helfer fixierten Tier nach Lokalanästhesie der Nasenschleimhaut und

des Kehlkopfes einfach durchzuführen.

2.1.9.6 Bronchoalveoläre Lavage

Für den Erregernachweis bei Erkrankungen des unteren Respirationstraktes ist die

Entnahme von Tracheobronchialsekret oder Lungenspülproben einer

Nasentupferentnahme überlegen (McLAUGHLIN und MISKE 1980; KIMMAN et al.

1986; STÖBER 1990b; HOFMANN 1991; PRINGLE 1992b; ESPINASSE et al. 2001;

CALDOW 2001). Verschiedene Verfahren zur Probengewinnung sind beschrieben:

A Endoskopische Entnahme von Trachealsekret- und Lungenspülproben

Die Durchführung einer bronchoalveolären Lavage (BAL) mithilfe eines flexiblen

Endoskops bietet die Möglichkeit der gezielten Probenentnahme aus dem unteren

Respirationstrakt bei gleichzeitiger optischer Kontrolle. Das Verfahren ist nicht

invasiv und kann wiederholt an demselben Tier durchgeführt werden (HEILMANN et

al. 1988). Eine ausführliche Literaturübersicht über die Anwendung der BAL beim

Schaf einschließlich eines detaillierten Methodenvergleichs ist bei GANTER (1996)

zu finden. Derselbe (1993; 1996) standardisierte die fiberoptische Entnahme von

Lungenspülproben beim Schaf und führte umfangreiche zytologische, biochemische

und mikrobiologische Untersuchungen an Lungenspülproben von gesunden und an

verschiedenen Lungenerkrankungen (einschließlich der Lungenadenomatose)

leidenden Schafen durch. Unter Lokalanästhesie der Nasenschleimhaut und des

Larynx zeigten die meisten Tiere wenig Abwehrverhalten. Bei allen Tieren wurde


eine Spülung des Bronchus trachealis mit insgesamt 100 ml körperwarmer, steriler

0,9%iger Kochsalzlösung in fünf Fraktionen durchgeführt. Nach Instillation jeder

Fraktion wurde die Spülflüssigkeit sofort mithilfe einer Vakuumpumpe wieder

abgesaugt. Bei klinisch gesunden Tieren betrug das Rückgewinnungsvolumen im

Mittel 71,8% (+12,8). Die Alveolarmakrophagen stellten mit 78-100% die größte

Zellfraktion, Lymphozyten (0-13%) und neutrophile Granulozyten (0-12%) waren in

geringen Mengen ebenfalls häufig nachweisbar. Trotz der Vorteile der hohen

Kontrollierbarkeit und Standardisierbarkeit der fiberoptischen Probenentnahme sind

ihrer breiten Anwendung aus Kostengründen in der Nutztierpraxis Grenzen gesetzt

(HEILMANN et al. 1988). WORKU (1994) wandte das endoskopische Verfahren als

Referenzverfahren zur Erprobung alternativer Probengewinnungstechniken aus dem

unteren Atemtrakt des Schafes an. Auch für andere Tierarten sind alternative

Techniken zur intravitalen Probenentnahme beschrieben (MANSMANN und KNIGHT

1972; McLAUGHLIN und MISKE 1980; FOGARTY et al. 1983; HEILMANN 1988;

STÖBER 1990b; PRINGLE 1992b). Daneben wird in vielen Fällen für meist

wissenschaftliche Fragestellungen auch die postmortale Spülung exenterierter

Lungen genutzt (CORDIER et al. 1990; LEROUX et al. 1995; LEGASTELOIS et al.

1997; KIRAN et al. 2000).

B Transtrachealer Zugang

Der transtracheale Zugang zur Gewinnung von Sekret- oder Spülproben aus dem

unteren Atmungstrakt umgeht eine mögliche Probenkontamination aus der Nasen-

oder Maulhöhle (MANSMANN und KNIGHT 1972; McLAUGHLIN und MISKE 1980;

MAIR 1987; ESPINASSE et al. 1991; HOFMANN 1991; PRINGLE 1992b). Es ist

eine mit einfachen Mitteln und geringen Investitionskosten auch unter

Praxisbedingungen durchführbare Methode. Die gewonnenen Proben sind für den

kulturellen bakteriologischen und virologischen Erregernachweis geeignet

(ESPINASSE et al. 1991; PRINGLE 1992b). Die zytologische Untersuchung des

Trachealsekretes ist jedoch nicht immer aussagekräftig (WOOLUMS et al. 1991). Bei


Pferden, erwachsenen Rindern sowie Kälbern und Schafen ist die Entnahme

transtrachealer Spülproben unter Lokalanästhesie beschrieben. Mithilfe eines

Trokars wird nach chirurgischer Vorbereitung und subkutaner Infiltration mit einem

Lokalanästhetikum je nach Autor direkt oder erst nach Anlegen eines Hautschnittes

die Trachealwand zwischen zwei Knorpelspangen durchstoßen und ein

Plastikschlauch in das Tracheallumen eingeführt. Die Spülung erfolgt mit 10 - 30 (bis

100) ml steriler Kochsalzlösung, die Aspiration des Sekretes mit einer Pumpe oder

einer Spritze (MANSMANN und KNIGHT 1972; McLAUGHLIN und MISKE 1980;

STÖBER 1990b; HOFMANN 1991; ESPINASSE et al. 1991; PRINGLE 1992b;

WORKU 1994). Mögliche Komplikationen sind Blutungen, Husten, lokale Infektionen

oder ein lokalisiertes Emphysem (MANSMANN und KNIGHT 1972; McLAUGHLIN

und MISKE 1980; PRINGLE 1992b).

WORKU (1994) erprobte zwei verschiedene Techniken der transtrachealen

Probenentnahme beim Schaf und verglich sie mit bronchoskopisch entnommenen

Lungenspülproben. Einerseits wurde analog der beim Rind beschriebenen Technik

(McLAUGHLIN und MISKE 1980) nach transtrachealer Punktion eine Spülung mit

10 - 20 ml physiologischer Kochsalzlösung durchgeführt. Parallel dazu wurde eine

transtracheale Zytobürsten-Probenentnahme untersucht. Von den 36 transtrachealen

Spülproben waren nur zwölf (33%) für die zytologische Untersuchung geeignet. Bei

17 Tieren (47%) konnte keine Spülflüssigkeit zurückgewonnen werden, sieben

Proben (19%) enthielten größere Blutbeimengungen. Von den 43 Zytobürstenproben

waren 25 (58%) für die zytologische Untersuchung geeignet (WORKU 1994).

C Nicht-invasive Techniken zur Entnahme von Lungenspülproben unter Feldbedingungen

Aufgrund des hohen materiellen Aufwandes ist die Anwendung der fiberoptischen

Probenentnahme in der Nutztierpraxis eingeschränkt (HEILMANN et al. 1988). Die

notwendige Zwischensterilisation des Instrumentariums limitiert die Anwendung

dieser Technik weiter, wenn zu einem Zeitpunkt Proben von mehreren Tieren


gewonnen werden sollen (HEILMANN et al. 1988; CALDOW 2001). Der invasive

Charakter der transtrachealen Techniken lässt dieses Verfahren für

Routineuntersuchungen ebenfalls weniger geeignet erscheinen (MAIR 1987;

CALDOW 2001).

Eine mit einfachen Mitteln am unsedierten Tier durchzuführende Methode zur

Gewinnung von Lungenspülproben wurde von FOGARTY et al. (1983) für das Kalb

beschrieben. Die Tiere wurden mit gestrecktem Kopf fixiert und ein Tubus mit einem

Innendurchmesser von 8 mm über die Nase in die Trachea eingeführt. Durch diesen

wurde eine 1,5 m lange Ernährungssonde mit einem Außendurchmesser von 6 mm

in die Trachea ein- und weiter vorgeschoben, bis das distale Ende der

Ernährungssonde in einem Bronchus steckenblieb. Es folgte die Spülung mit 180 ml

PBS in einer einzigen Fraktion. Die Spülflüssigkeit wurde dann mit einer Spritze

aspiriert. Das Rückgewinnungsvolumen betrug regelmäßig etwa ein Drittel des

eingesetzten Volumens. Auch nach wiederholter Spülprobenentnahme zeigten die

Kälber keine respiratorischen Symptome. Bei der systematischen histologischen

Untersuchung der Lungen konnten keine Läsionen nachgewiesen werden. Die

Ernährungssonde gelangte stets in den rechten Zwerchfellslappen (FOGARTY et al.

1983). KIMMAN et al. (1986) wandten diese Methode bei 98 lungenkranken Kälbern

an. Sie konnten von einem Spülvolumen von 60 ml regelmäßig zwischen 30 und

50 ml zurückgewinnen. Die Methode wird von ihnen als einfach und für

Feldbedingungen geeignet beschrieben. Eine Verschlechterung des Zustandes der

Kälber während oder nach der Probenentnahme wurde nicht beobachtet. CALDOW

(2001) betont die Notwendigkeit der Anwendung von Gleitgel, um ein Steckenbleiben

des inneren Tubus im äußeren Tubus zu verhindern.

HEILMANN et al. (1988) entwickelten eine Methode für die Entnahme von

Lungenspülproben am narkotisierten Kalb. Nach endotrachealer Intubation wurde

durch den Tracheotubus bzw. ein in die Luftröhre eingeführtes starres Endoskop ein

ca. 100 cm langer, 6 mm dicker Katheterschlauch eingeführt und mit bis zu fünf

Fraktionen zu 20 ml gespült. Die Aspiration der Spülflüssigkeit erfolgte ebenfalls über

eine Spritze.


2.1.9.6.1 Anwendung der BAL zur Diagnostik der Lungenadenomatose A Sekretzytologie

Das Differentialzellbild aus der nasal abfließenden Lungenflüssigkeit oder

bronchoalveolärer Lavage-Flüssigkeit (BALF) kann zur Untermauerung einer

klinischen Verdachtsdiagnose genutzt werden. Zahlenmäßig überwiegen hier häufig

Makrophagen und neutrophile Granulozyten. Ebenfalls regelmäßig anzutreffen sind

runde oder sphärische Haufen epithelialer Zellen sowie einzelne jugendliche Zellen.

Spezifisch für Lungenadenomatose sind allerdings lediglich Tumorzellhaufen

(GANTER 1996). NOBEL et al. (1970) konnten derartige Zellcluster in spontaner

Lungenflüssigkeit von sieben Schafen stets nachweisen. In 14 von 24 Fällen (58,3%)

mit fortgeschrittenen Tumoren wurden derartige Zellhaufen aus bronchoskopisch

gewonnenen Lungenspül- oder -sekretproben ebenfalls festgestellt (GANTER 1993).

KIRAN et al. (2000) konnten in 26 von 53 (49,1%) mithilfe des „Schubkarrentests“

gewonnenen Proben von Lungenflüssigkeit einzelne neoplastische Zellen oder

Tumorzellhaufen nachweisen. In postmortal an isolierten Schlachtorganen

gewonnenen Lungenspülproben wiesen die selben Autoren in allen 102 untersuchten

Fällen mit makroskopisch nachweisbaren Tumoren Tumorzellcluster oder einzelne

neoplastische Zellen nach.

B Biochemische Untersuchung Darüber hinaus kann der klinische Verdacht durch den Nachweis einer erhöhten

Aktivität des Enzyms Alkalische Phosphatase in der BALF erhärtet werden. Dieses

wird von den tumorös veränderten Typ II Pneumozyten in großen Mengen produziert

(GANTER 1993). Der Nachweis einer Aktivität der Alkalischen Phosphatase von

>444 U/l in der epithelial lining fluid wies bei den untersuchten 42

Lungenadenomatose-positiven Tieren (davon 13 Tiere mit klinischer


Lungenadenomatose) eine Sensitivität von 51% und eine Spezifität von 90% auf

(GANTER 1996).

2.1.9.7 Röntgenuntersuchung

Weitere Möglichkeiten der intravitalen Diagnostik zur Absicherung einer klinischen

Verdachtsdiagnose ergeben sich aus der Röntgenuntersuchung des Thorax. Diese

ist bei kleinen Wiederkäuern und Kälbern problemlos durchführbar. Durch Vorziehen

der Vordergliedmaßen kann der gesamte Thorakalbereich röntgenologisch

dargestellt werden (PRINGLE 1992b). Gesunde Tiere weisen scharf abgegrenzte

Herz- und Zwerchfellschatten sowie eine nahezu vollständige Schwärzung des

Lungenfeldes auf. Im craniodorsalen und dorsalen Bereich ist das Lungenfeld durch

die Schulter- und Rückenmuskulatur geringgradig verschattet. Der spitzovale

Herzschatten erreicht caudoventral den Zwerchfellsschatten. Zudem sind regelmäßig

die Trachea, die beiden Hauptbronchien, die Vena cava cranialis und caudalis sowie

die Aorta und einige Lungengefäße darstellbar. Veränderte Befunde bei

lungenkranken Tieren beinhalteten je nach Art der Erkrankung Verdichtungsherde

(Verschattungen) unterschiedlichen Grades, Verteilungsmusters und

unterschiedlicher Abgrenzbarkeit, Bronchographie, sowie eine diffuse, eher granuläre

Strukturierung des Lungenparenchyms. Diese Befunde lassen oftmals zwar eine

Verdachtsdiagnose zu, eine ätiologische Diagnose kann hierdurch jedoch nicht

gestellt werden (GANTER 1996). Die Anwendung der Thoraxradiologie bleibt in der

Schafpraxis aufgrund des hohen apparativen Aufwandes wenigen wertvollen

Zuchttieren vorbehalten (SCOTT und GESSERT 1998).

GANTER (1993; 1996) konnte bei allen 24 untersuchten Lungenadenomatose-Fällen

Verschattungsherde in der Lunge nachweisen. In fortgeschrittenen Fällen waren in

der Regel große Lungenareale homogen verdichtet. Nach den Arbeiten von WYN-

JONES und CLARKSON (1984) können mithilfe der röntgenologischen

Untersuchung in der Lunge von Schafen Echinococcus-granulosus-Zysten von


>0,75 cm nachgewiesen werden. Demnach können verdächtige Läsionen schon früh

festgestellt, in diesem Stadium jedoch von Verdichtungen des Lungengewebes

aufgrund anderer Ursachen nicht mit Sicherheit abgegrenzt werden. Der hohe

apparative Aufwand macht dieses Untersuchungsverfahren für die Untersuchung

größerer Tierzahlen ungeeignet (GANTER 1996).

2.1.9.8 Lungenbiopsie

Die Entnahme von Lungenbiopsien ist entweder transbronchial unter endoskopischer

Sichtkontrolle (BEGIN et al. 1981) oder auf dem transkutanen Weg möglich

(PRINGLE und VIEL 1986; PRINGLE 1992b; PUSTERLA et al. 1995). Bei der

Verwendung großkalibriger Nadeln ist dieses Verfahren in der Humanmedizin mit

einer hohen Komplikationsrate von 10 - 30% an Pneumothorax und Blutungen

behaftet. Die ultraschallgeführte Feinnadelbiopsie wird bei peripheren

Lungentumoren jedoch als ein mit einer hohen diagnostischen Treffsicherheit und

geringen Komplikationen verbundenes Verfahren angesehen (MATHIS und

SUTTERLÜTTI 1990). PRINGLE (1992b) beschreibt die transthorakale

Lungenbiopsie auch beim Wiederkäuer als einen sowohl praktikablen als auch gut

tolerierten Eingriff, der unter Lokalanästhesie am wachen oder sedierten Tier

durchgeführt werden kann. PUSTERLA et al. (1995) gelang der intravitale Nachweis

der Lungenadenomatose durch die histologische Untersuchung einer unter

Ultraschallkontrolle gewonnenen Lungenbiopsie. Das untersuchte Tier war jedoch

bereits hochgradig klinisch erkrankt und bei der Sektion erwiesen sich ca. 75% des

Lungenparenchyms als tumorös verändert. Der invasive Charakter sowie die geringe

Wahrscheinlichkeit, in einem Feinnadelbioptat beginnende Läsionen bei einem

klinisch gesunden Tier nachweisen zu können, machen auch diese Methode für die

Frühdiagnostik der Lungenadenomatose ungeeignet.


2.1.9.9 Pathologie

Neben der pathologisch-anatomischen und histologischen Untersuchung (siehe

2.1.3) stehen weitere Verfahren zum Nachweis der Virusätiologie der beobachteten

Läsionen zur Verfügung. Bereits DE KOCK (1929a) stellte fest, dass es

außerordentlich schwierig ist, sehr frühe Läsionen, die ohne makroskopisch

erkennbare Tumoren einhergehen, von entzündlich oder reaktiv bedingter

Hyperplasie des Bronchialepithels zu unterscheiden. Daran hat sich bis heute auch

für erfahrene Pathologen nichts geändert (VERWOERD 1990; BRÜGMANN 2004,

DE LAS HERAS 2004, pers. Mitteilungen).

Mit immunhistochemischen Verfahren kann die Virusätiologie der Läsionen durch

Nachweis viraler Antigene (CA und SU) abgesichert werden (PALMARINI et al. 1995;

GARCIA-GOTI et al. 2000; DE LAS HERAS 2004, pers. Mitteilung). SANNA et al.

(2001) führten auf der Basis der Arbeiten von PALMARINI et al. (1996b) einen

Nachweis mittels in-situ PCR. Neben den Tumorzellen wiesen auch die

Alveolarmakrophagen in den veränderten Regionen ein deutlich positives Signal auf.

2.1.9.10 Eignung der genannten Verfahren zur Kontrolle von Sanierungsverfahren

Die einzige praktikable Möglichkeit zur Kontrolle von Sanierungsverfahren stellen

bislang die klinische und pathologische Untersuchung dar (PARKER et al. 1998). Die

klinische Untersuchung ist aufgrund der langen Inkubationszeit hierfür wenig

geeignet, zumal schon DUNGAL et al. (1938) beobachteten, dass Ansteckungen

bereits während der subklinischen Phase der Erkrankung vorkommen können. Die

pathologische Untersuchung erlaubt lediglich retrospektive Studien. Die regelmäßige

pathomorphologische Untersuchung der Schlachtlungen ist jedoch ein geeignetes

Verfahren für das Monitoring des Gesundheitsstatus einer Herde.


2.2 Verfahren zum Virusnachweis

2.2.1 Blocking ELISA, Immunhistochemie, Restriktionsenzymanalyse

Verschiedene Methoden sind zum Nachweis von JSRV in Organmaterial entwickelt

worden. Mithilfe eines blocking ELISA und eines immunhistochemischen Verfahrens

konnten PALMARINI et al. (1995) Virus bzw. Capsidantigen ausschließlich im

Respirationstrakt (Tumorgewebe, Lungenflüssigkeit) sowie in einer Probe eines

regionären Lymphknotens erkrankter Schafe nachweisen. Das Vorkommen von 15

bis 20 Kopien endogener Retroviren (s. 2.1.4.4) im Genom gesunder Schafe, die der

Sequenz von JSRV sehr ähnlich sind (YORK et al. 1992; HECHT et al. 1994), hat

lange Zeit die Entwicklung molekularbiologischer Nachweisverfahren behindert.

PALMARINI et al. (1996a) gelang erstmals die Unterscheidung zwischen endogenen

und exogenen Gensequenzen durch eine für JSRV spezifische Restriktionsenzym-

Schnittstelle. Mit RT-PCR und anschließender ScaI-Digestion des PCR-Produktes

konnte exogenes Virus ebenfalls ausschließlich in Tumorgewebe, Lungenflüssigkeit

und regionären Lymphknoten nachgewiesen werden. Derselben Arbeitsgruppe

(PALMARINI et al. 1996b) gelang schließlich mithilfe JSRV-spezifischer Primer die

Entwicklung eines direkten Nachweisverfahrens von JSRV mittels Polymerase-

Kettenreaktion.

2.2.2 Polymerase-Kettenreaktion

2.2.2.1 Prinzip und Historisches

Die Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) ist eine in-vitro-

Methode zur Vervielfältigung spezifischer DNA-Fragmente (SAIKI et al. 1985;

MULLIS und FALOONA 1987). Das Prinzip beruht auf einer Hitzedenaturierung des

DNA-Doppelstranges, gefolgt von einem Schritt der Anlagerung spezifischer

Oligonukleotidmoleküle, sogenannter Primer, an eine entsprechende komplementäre


Region des jeweiligen DNA-Einzelstranges. Die Primersequenzen werden so

ausgewählt, dass sie die zu amplifizierende Region flankieren. Mithilfe einer DNA-

Polymerase wird ausgehend von dem Primermolekül ein neuer komplementärer

DNA-Strang synthetisiert. Durch Wiederholung dieser Schritte in mehreren Zyklen

kommt es zu einer exponentiellen Vermehrung der von dem Primerpaar begrenzten

Sequenz, da jedes in einem vorangegangenen Zyklus synthetisierte Molekül als

erneute Amplifikationsvorlage dient. In der Anfangsphase wurde eine thermolabile

DNA-Polymerase verwendet, die während der Hitzedenaturierung inaktiviert wurde

und daher für jeden Zyklus neu hinzugegeben werden musste (SAIKI et al. 1985;

MULLIS und FALOONA 1987). Der Einsatz einer thermostabilen Polymerase,

gewonnen aus einem hitzeliebenden Bakterium, Thermus aquaticus (Taq),

vereinfachte das Verfahren ungemein (SAIKI et al. 1988). Durch moderne PCR-

Automaten (Thermocycler) wurde das Verfahren zusätzlich praktikabler und hat in

verschiedensten molekularbiologischen Anwendungsgebieten eine rasante

Verbreitung gefunden (HAAS 1992; BELAK und BALLAGY-PORDANY 1993;

NEWTON und GRAHAM 1994; GASSEN et al. 1994; WINK und WEHRLE 1994).

2.2.2.2 Nested PCR / Heminested PCR

Eine Möglichkeit zur Steigerung der Sensitivität, aber auch der Spezifität der PCR-

Untersuchung ist die Durchführung einer sogenannten nested PCR. Dabei wird eine

kleine Menge des PCR-Produkts eines ersten Durchlaufes als Amplifikationsvorlage

für eine zweite PCR verwendet. Die verwendeten Primer binden innerhalb des ersten

Produktes, so dass man nach einem zweiten Durchlauf ein entsprechend kürzeres

Produkt erhält (MULLIS und FALOONA 1987; BELAK und BALLAGY-PORDANY

1993; NEWTON und GRAHAM 1994). Sofern nur ein Primer des zweiten Paares

innerhalb des ersten PCR-Produktes lokalisiert ist, spricht man von einer heminested

PCR. Während die Anzahl der Amplifikate in einer PCR theoretisch mit der Anzahl

der Zyklen exponentiell ansteigt, sind diesem Anstieg in praxi Grenzen gesetzt. Mit

einer einfachen PCR erreicht man in der Regel eine etwa 106-fache Amplifikation.


Durch einen zweiten PCR-Durchlauf mit nested oder heminested Primern kann das

Gesamtergebnis auf das 1011-1012-fache der Ausgangsmenge gesteigert werden

(BELAK und BALLAGY-PORDANY 1993).

2.2.2.3 Auswertung der PCR

Die häufigste Form der Darstellung von PCR-Produkten ist die Gelelektrophorese

und Färbung mit Ethidiumbromid oder anderen Fluoreszenzfarbstoffen, wodurch die

Banden unter UV-Bestrahlung sichtbar werden (NEWTON und GRAHAM 1994;

WINK und WEHRLE 1994; SAMBROOK et al. 1989). Die Größe des PCR-Produktes

kann mithilfe eines Größenmarkers auf dem Gel abgeschätzt werden (MULLIS und

FALOONA 1987). Silberfärbung, Restriktionsenzymanalyse, Southern-Blot-

Hybridisierung oder eine Sequenzierung sind weitere Möglichkeiten der

Charakterisierung von PCR-Produkten (NEWTON und GRAHAM 1994). In jüngerer

Vergangenheit entwickelte Real-time PCR-Geräte detektieren die Zunahme eines

Fluoreszenzsignales bereits während der laufenden Reaktion (ABU AL-SOUD und

RADSTRÖM 2001).

2.2.2.4 U3 heminested PCR zum Nachweis von JSRV PALMARINI et al. (1996b) machten sich für die Entwicklung eines PCR-Nachweises

Unterschiede zwischen JSRV und ESRV in der U3-Region des long terminal repeat

(LTR) zunutze. ESRV weist in dieser Region eine 30 bp lange Insertion gegenüber

JSRV auf (BAI et al. 1996, PALMARINI et al. 1996b). Nach DNA-Extraktion aus

Probenmaterial bzw. nach reverser Transkription der isolierten RNA erfolgt mithilfe

eines Primers, der diese 30 bp überbrückt, d.h. der komplementär zu jeweils etwa 10

Nukleotiden vor und hinter dieser Sequenz ist, eine selektive Bindung des Primers an

JSRV-cDNA bzw. provirale DNA und damit eine selektive Amplifikation der exogenen

viralen Sequenzen. In einer nachgeschalteten zweiten PCR mit heminested (hn)

Primern wird aus dem 176 bp langen Produkt des ersten Amplifikationszyklus ein

133 bp langes Stück weiter vervielfältigt. Das Endprodukt wird elektrophoretisch


dargestellt. Dieses Verfahren ist gegenüber dem der ScaI-Digestion etwa 105-fach

sensitiver und es gelang, bei klinisch erkrankten Tieren virale RNA sowie provirale

DNA auch in lymphatischen Geweben außerhalb des Respirationstraktes (periphere

Lymphknoten, Milz, Knochenmark und Thymus) sowie in Leukozyten nachzuweisen

(PALMARINI et al. 1996b).

2.2.2.4.1 Anwendung der U3 hn PCR zum Nachweis von JSRV in verschiedenen Proben und Geweben

Verschiedene Arbeitsgruppen haben dieses Verfahren seither als Referenzverfahren

(GARCIA-GOTI et al. 2000) bzw. für weitere Untersuchungen (HOLLAND et al. 1999;

PALMARINI et al. 1999a, DE LAS HERAS et al. 2000; GONZALEZ et al. 2001;

SANNA et al. 2001) genutzt.

Nach den Ergebnissen von PALMARINI et al. (1996b) wurden 102-103 Kopien von

JSRV vor einem Hintergrund von 500 ng genomischer DNA bzw. 102 Kopien von

JSRV vor dem Hintergrund von 107 Kopien von ESRV LTR erfolgreich amplifiziert. Es

wurde sowohl der Nachweis viraler RNA mittels RT-PCR als auch der Nachweis

proviraler DNA bei natürlich und experimentell infizierten Tieren durchgeführt. Die

Ergebnisse sind (als Anzahl positiver Proben pro Anzahl untersuchter Proben) in

Tabelle 1 dargestellt.


Tabelle 1: Nachweis von Jaagsiekte Retrovirus RNA und proviraler DNA aus Probenmaterial natürlich und experimentell infizierter Tiere mit klinischer Lungenadenomatose (PALMARINI et al. 1996b)

Natürliche Infektion Experimentelle Infektion Probe

RNA DNA RNA DNA

Tumorgewebe/

Lungenflüssigkeit

18 / 18 6 / 6 4 / 4 4 / 4

Mediastinallymphknoten 6 / 6 6 / 6 4 / 4 3 / 3

andere Lymphknoten 2 / 9 0 / 9 - -

Milz 4 / 5 0 / 5 3 / 4 2 / 4

Knochenmark 2 / 5 2 / 4 2 / 3 1 / 3

Thymus - - 2 / 4 0 / 4

Niere 1 / 6 1 / 6 0 / 3 0 / 3

Haut 0 / 4 0 / 4 - -

Plasma 0 / 2 - 0 / 6 -

Leukozyten 3 / 7 0 / 6 - -

Angaben als Anzahl positiver Proben pro Anzahl untersuchter Proben

HOLLAND et al. (1999) erbrachten durch den Nachweis von JSRV proviraler DNA in

T- und B-Lymphozyten sowie Monozyten weitere Hinweise auf eine disseminierte

Infektion. Bei der Untersuchung von Leukozyten aus dem Blut natürlich infizierter,

klinisch kranker Schafe konnten sie bei fünf von acht Tieren JSRV nachweisen. Bei

jeweils acht Parallelamplifikationen aus je 200 ng genomischer DNA waren jedoch

maximal zwei Ansätze pro Tier positiv. Vorabuntersuchungen hatten gezeigt, dass

das PCR-System in der Lage ist, eine Kopie der JSRV proviralen DNA im PCR-

Ansatz zu detektieren (HOLLAND et al. 1999). Aus diesen Beobachtungen schlossen

die genannten Autoren auf eine sehr niedrige provirale Bürde der Leukozyten und

gehen davon aus, dass vermutlich weniger als eine von 240.000 Zellen infiziert ist.

Bei experimentell infizierten Lämmern konnten sie das Virus bereits sieben Tage

post infectionem zu einem Zeitpunkt, als noch keine histologischen Anzeichen für


Lungenadenomatose feststellbar waren, in Zellen aus mediastinalen Lymphknoten

nachweisen. Auch hier war die provirale Bürde, gemessen an der Zahl positiver

PCR-Reaktionen, sehr gering. Nach experimenteller Infektion gelang der Nachweis

aus Leukozyten bei einem von dreizehn Lämmern am 14. Tag, bei einem weiteren

am 28. Tag post infectionem (HOLLAND et al. 1999).

Spanische Untersuchungen konnten in 28% der Blutproben von Schafen aus einer

mit Lungenadenomatose infizierten Herde JSRV nachweisen. Aufgrund dieses

Screenings wurden 15 PCR-positive und fünf PCR-negative Tiere aus dieser Herde

ausgewählt und viermal in monatlichen Intervallen nachuntersucht. Während dieser

Zeit wurde lediglich bei neun der 15 zunächst positiven Tiere ein erneut positives

Untersuchungsergebnis erzielt, jedoch auch bei vier der initial negativen Tiere.

(GARCIA-GOTI 1999, zit. nach SHARP und DE MARTINI 2003).

GONZALEZ et al. (2001) untersuchten die Nachweisbarkeit von JSRV in Blutproben

und Geweben von zehn natürlich infizierten Tieren mit klassischer, sechs Tieren mit

atypischer Lungenadenomatose, zehn klinisch gesunden Kontakttieren aus einer

Lungenadenomatose-positiven Herde sowie zehn Kontrolltieren aus einem

Lungenadenomatose-freien Bestand. Es wurden jeweils sechs Parallel-

amplifikationen aus jeweils 300 ng DNA pro Probe durchgeführt. Eine Probe wurde

als positiv gewertet, wenn mindestens einer dieser Ansätze eine positive Reaktion

zeigte. Bei den Kontrolltieren wurde aus keiner der untersuchten Proben ein positives

Ergebnis erzielt. Für die übrigen drei Gruppen und eine Auswahl der untersuchten

Proben sind die Ergebnisse in Tabelle 2 zusammengefasst. Die

Untersuchungsergebnisse sind als Anzahl positiver Proben pro Anzahl untersuchter

Proben der jeweiligen Kategorie dargestellt.


Tabelle2: Nachweis von JSRV proviraler DNA aus Probenmaterial von Tieren mit klassischer und atypischer Lungenadenomatose (LA) sowie klinisch gesunden Kontakttieren (GONZALEZ et al. 2001) Probe klassische LA atypische LA Kontakttiere

Leukozyten 10 / 10 5 / 6 4 / 10

Milz 4 / 10 2 / 6 2 / 10

unverändertes

Lungengewebe

10 / 10 3 / 4 1 / 10

Mediastinallymphknoten 10 / 10 5 / 6 2 / 10

Tumorgewebe 10 / 10 6 / 6 nicht verfügbar

Angaben als Anzahl positiver Proben pro Anzahl untersuchter Proben

Auch in fetalen Geweben bzw. fetalem Blut von ungeborenen Lämmern zweier an

Lungenadenomatose erkrankter Muttertiere wurde JSRV mittels U3 hn PCR

nachgewiesen. In einem dritten Fall waren alle untersuchten fetalen Proben negativ.

Weiterhin wurde bei einem drei Tage alten Lamm makroskopisch und histologisch

ein Bild wie bei Lungenadenomatose diagnostiziert. Die Läsionen erwiesen sich

durch Nachweis von JSRV-spezifischen Genomsequenzen mittels PCR und von

JSRV CA mittels immunhistochemischer Untersuchung als ein Fall von

Lungenadenomatose. Das Muttertier des Lammes wies keinerlei makroskopisch oder

histologisch (einschließlich immunhistochemisch) nachweisbare Läsionen auf. Die

PCR—Untersuchung von Leukozyten, Lungengewebe und mediastinalem

Lymphknoten des Mutterschafes ergab jedoch für alle drei Proben ein positives

Ergebnis (DE LAS HERAS et al. 2000).

Mittels in-situ PCR wurde neben den Tumorzellen und Zellen der regionären

Lymphknoten auch ein stark positives Signal von den Alveolarmakrophagen erhalten.

Ob diese selbst infiziert sind oder ob die Amplifikation von phagozytiertem Material

infizierter Zellen herrührt, ist nicht geklärt (SANNA et al. 2001).


2.2.2.5 Risiken der PCR

Eine ausführliche Literaturübersicht über mögliche Probleme der PCR ist bei

SCHEIBNER (2000) gegeben. Prinzipiell sind unspezifische Amplifikate, falsch-

positive und falsch-negative Ergebnisse möglich.

A Unspezifische Reaktionen

Die Bildung unspezifischer Amplifikate oder Primer-Dimere während der

Vorbereitungszeit der PCR bei Raumtemperatur (CHOU et al. 1992) kann durch

Arbeiten auf Eis oder hot-Start-Techniken verringert werden. Letztere beinhalten die

Zugabe einer oder mehrerer essentieller Zutaten (in der Regel der Polymerase) erst

nach initialer Denaturierung der Matrize oder die Trennung des Enzyms von dem

restlichen Reaktionsgemisch durch eine Wachsschicht. Diese schmilzt während der

ersten Denaturierungsphase und sorgt so für eine Vermischung der

Reaktionskomponenten zum exakt richtigen Zeitpunkt (NEWTON und GRAHAM

1994). Oligonukleotid-Inhibitoren der DNA-Polymerase, die bei Temperaturen über

40°C ihre Wirkung verlieren, ermöglichen die Vorbereitung des Reaktionsansatzes

bei Raumtemperatur und eliminieren die für oben genannte hot-Start-Verfahren

nötigen zusätzlichen Arbeitsschritte (DANG und JAYASENA 1996 ).

B Falsch-positive Ergebnisse

Aufgrund ihrer hohen Sensitivität ist die PCR ein für mögliche Kontaminationen sehr

anfälliges Verfahren. Dies gilt in ganz besonderem Maße für die nested PCR (KWOK

und HIGUCHI 1989; PERSING 1991; HAAS 1992; BELAK und BALLAGY-

PORDANY 1993). Mögliche Kontaminationsquellen und damit Ursache falsch-

positiver Ergebnisse sind bereits bei der Probenentnahme gegeben (NEWTON und

GRAHAM 1994). Im Labor selbst können sie durch Kreuzkontamination zwischen

verschiedenen Proben, Kontamination mit PCR-Produkten („carry-over“) oder


geklonter Plasmid-DNA entstehen (KWOK und HIGUCHI 1989; PERSING 1991).

Durch entsprechende Maßnahmen wie räumliche Trennung und separate

Gerätschaften für die einzelnen Arbeitsschritte, das Autoklavieren und Aliquotieren

von Lösungen, Tragen von Handschuhen, Wechsel der Arbeitskleidung, sorgfältiges

Arbeiten, um Aerosolbildung zu vermeiden, Verwendung gestopfter Pipettenspitzen

sowie die Anwendung adäquater Kontrollen kann dieses Risiko minimiert werden.

UV-Bestrahlung und Behandlung mit einmolarer HCl zerstört DNA und kann daher

zur Dekontamination genutzt werden. Autoklavieren degradiert DNA zu Partikeln von

sehr niedrigem Molekulargewicht (KWOK und HIGUCHI 1989). Zum Umgang mit

Produktkontaminationen sind verschiedene prae- und post-PCR-

Sterilisationsverfahren beschrieben (ISAACS et al. 1990; CIMINO et al. 1990;

PERSING 1991).

C Falsch-negative Ergebnisse

Falsch-negative Ergebnisse können durch ungeeignete PCR-Bedingungen oder

Primer oder durch eine Hemmung der PCR-Reaktion durch in der Probe enthaltene

Inhibitoren entstehen (HAAS 1992). Als solche wurde eine Vielzahl von Substanzen

identifiziert (WILSON 1997), darunter Komponenten von roten und weißen Blutzellen,

Hämoglobin und Lactoferrin, (ABU AL-SOUD und RADSTÖM 2001), Immunglobulin

G (ABU AL-SOUD et al. 2000) sowie verschiedene Gerinnungshemmer wie EDTA

(ABU AL-SOUD und RADSTÖM 2001) und Heparin (HOLODNIY et al. 1991; WANG

et al. 1992). Auch in anderen klinischen Proben wie Gewebe und Sputum wurde das

Vorhandensein von Inhibitoren beschrieben, diese sind jedoch größtenteils noch

nicht näher charakterisiert. Substanzen, die zur Probenaufbereitung verwendet

werden, sowie Handschuhpuder können darüber hinaus eine PCR-Reaktion

hemmen (WILSON 1997). Die Nachweisgrenze eines PCR-Systems ist zusätzlich

abhängig von der Art der Probenaufbereitung und den verwendeten Reagenzien,

insbesondere der Polymerase (SCHEIBNER 2000). Verschiedene Enzyme können


durch die Anwesenheit inhibitorischer Substanzen in sehr unterschiedlichem Maße

beeinträchtigt werden (ABU AL-SOUD und RADSTRÖM 1998).

2.2.2.6 Kontrollen

Aufgrund der genannten Gefahren ist das konsequente Mitführen adäquater positiver

und negativer Kontrollen unerlässlich. Dies sollte bereits während der

Probenaufbereitung und in allen nachgeschalteten Schritten erfolgen. Kontrollen sind

prinzipiell wie die anderen Proben zu behandeln (KWOK und HIGUCHI 1989;

SCHEIBNER 2000).

Negative Kontrollen dienen der Detektion falsch-positiver Resultate durch

Kontamination. Bekannt negatives Probenmaterial, Wasser sowie

Reaktionskontrollen, die alle PCR-Reagenzien, jedoch keine DNA enthalten, sind

geeignete Negativkontrollen (KWOK und HIGUCHI 1989; NEWTON und GRAHAM

1994; SCHEIBNER 2000).

Ein einfaches Mittel einer Positivkontrolle ist das Mitführen einer bekannt positiven

Probe, die mit den zu präparierenden Proben mitgeführt wird. Dies ermöglicht bereits

eine Kontrolle des Probenaufbereitungsschrittes (SCHEIBNER 2000). Als

Positivkontrollen können weiterhin in Plasmide einklonierte Zielsequenzen verwendet

werden, die den Nachteil einer erhöhten Kontaminationsgefahr tragen, jedoch durch

Verdünnung und den Einsatz einer bekannten Menge an Ziel-DNA als Grenzwert-

Positivkontrollen und damit zur Kontrolle einer gleich bleibenden Sensitivität des

Reaktionssystems dienen können (KWOK und HIGUCHI 1989; NEWTON und

GRAHAM 1994). Der Nachweis amplifizierbarer DNA und damit der Abwesenheit

von Inhibitoren kann durch eine PCR mit Primern für eine andere Zielsequenz, z. B.

ein sogenanntes housekeeping-Gen erbracht werden (NEWTON und GRAHAM

1994; SCHEIBNER 2000). Da diese in jeder Zelle vorkommen, sind sie zur Detektion

einer reduzierten Sensitivität durch Inhibitionen, die den Nachweis von geringen

Mengen Ziel-DNA negativ beeinflussen, jedoch nicht optimal. Besonders geeignet


sind sogenannte interne Kontrollen, die eine direkte Inhibitionskontrolle in jedem

einzelnen PCR-Ansatz ermöglichen (WILSON 1997; SCHEIBNER 2000). 2.3 Maßnahmen zur Kontrolle und Bekämpfung der Lungenadenomatose

2.3.1 Kontrollmaßnahmen in der Heidschnuckenzucht

Aufgrund der hohen Befallsrate der Zuchtpopulation und des verlustreichen

Verlaufes, die die Erkrankung bei Heidschnucken nimmt (siehe 2.1.8), wurden im

Jahr 1996 auf Initiative des Veterinäramtes Celle vom Zuchtverband Maßnahmen zur

Einschränkung der weiteren Ausbreitung in den Herdbuchbetrieben ergriffen. Diese

werden weitgehend als geschlossene Herden gehalten. Tierzukäufe finden nur im

Rahmen der traditionellen Bockauktion in Müden/Örtze statt. Diese wurde daher als

ein Hauptrisikofaktor für eine Weiterverbreitung der Lungenadenomatose in der

Zuchtpopulation angesehen. Als Folge daraus darf die Auktion der Grauen gehörnten

Heidschnucken nunmehr nur noch beschickt werden, wenn der Herkunftsbetrieb an

einem vom VLH festgelegten Monitoring-Programm teilnimmt und aufgrund dessen

als Lungenadenomatose-unverdächtig eingestuft wird. Abhängig von der

Herdengröße muß eine bestimmte Anzahl an dokumentierten Lungenbefunden

vorliegen. Eine von der Bestandsgröße abhängige festgelegte Mindestzahl der

Schlachtlungen aus dem jeweiligen Betrieb muß makroskopisch untersucht werden.

Zusätzlich müssen alle Veränderungen, die Walnußgröße überschreiten, sowie ab

dem Jahr 2004 auch eine Mindestzahl makroskopisch unveränderter Lungen zur

pathologisch-histologischen Untersuchung eingesandt werden. Verendete Tiere, die

älter als zwei Monate sind, sowie vorsorglich geschlachtete Tiere, die Symptome wie

Husten, Nasenausfluß oder Kümmern gezeigt haben, unterliegen ebenfalls der

Untersuchungspflicht. Dieses Monitoring wird von den Veterinärämtern der

beteiligten Landkreise überwacht. Herden mit positivem LA-Nachweis werden von


der Beschickung der Auktionen ausgeschlossen (KRÄMER 2001; GANTER 2004,

pers. Mitteilung).

2.3.2 Kontrolle und Sanierungsversuch durch Managementmaßnahmen

Eine Eindämmung der Erkrankung im Sinne der Minimierung der Verluste kann

durch konsequente sofortige Schlachtung erkrankter oder verdächtiger Tiere und

damit durch eine Senkung des Infektionsdruckes innerhalb einer Herde erreicht

werden. Sofern dies z. B. während der Trächtigkeit oder Säugezeit nicht möglich ist,

sind verdächtige Tiere separat zu halten. Zu diesen Maßnahmen wurde bereits von

HUTCHEON (1891, zit. nach TUSTIN 1969) und MITCHELL (1915) geraten. Der

letztgenannte Autor beobachtete jedoch auch, dass selbst bei konsequentester

Einhaltung dieses Verfahrens eine vollständige Eradikation der Erkrankung nicht

erzielt werden konnte.

Nach Auftreten von Lungenadenomatose in einer Herde einer britischen

landwirtschaftlichen Forschungseinrichtung (ADAS Liscombe) im Jahr 1983 und

nachfolgender Übertragung auf drei weitere Herden derselben Einrichtung wurde der

Versuch einer Sanierung durch strikte Managementmaßnahmen unternommen.

Hierzu zählten die sofortige Merzung klinischer Verdachtsfälle sowie deren

Nachkommen, der Zukauf von gesunden Tieren als Nukleus einer neuen Herde

sowie die getrennte Haltung dieser unverdächtigen Herde von den verdächtigen.

Innerhalb der verdächtigen Herden wurde eine nach Altersgruppen getrennte

Haltung eingeführt, da die älteren Schafe als die größte Infektionsquelle angesehen

wurden. Zu bestimmten Zeiten machte diese strikte Trennung die parallele Haltung

von 13 separaten Herden erforderlich, was selbst für die genannte

Forschungseinrichtung eine nahezu unerfüllbare Herausforderung darstellte. Zudem

verdreifachten sich die Kosten für die Einzäunung von Weideland, während durch die

strikte Merzungspolitik die Erlöse beträchtlich zurückgingen. JONES (1992) selbst rät

deshalb dringend von der Nachahmung ab. In den Jahren 1983 bis 1988 wurden 123

klinische Fälle beobachtet und bestätigt. Im April 1988 trat die letzte klinische


Erkrankung in einer der verdächtigen Herden auf. In der neu aufgebauten

unverdächtigen Herde wurden jedoch trotz des Fehlens klinischer Erkrankungen bei

einzelnen Tieren histologische Läsionen festgestellt (JONES 1992). Selbst mit dem

beschriebenen Maximalaufwand konnte eine vollständige Eliminierung der

Erkrankung nicht erreicht werden.

2.3.3 Eradikation der Lungenadenomatose in Island

Die Einführung einer Gruppe von Karakulböcken aus dem Raum Halle nach Island

im Jahr 1933 hatte schwerwiegende Folgen für die isländische Schafpopulation. Mit

diesen Tieren wurden vier in Island bisher nicht aufgetretene Erkrankungen

importiert, neben Lungenadenomatose auch Maedi-Visna, Paratuberkulose und

Aktinobazillose (PALSSON 1985). Die Einschleppung der Lungenadenomatose geht

vermutlich auf einen Bock dieser Gruppe zurück (DUNGAL et al. 1938) und die

traditionellen Haltungsbedingungen mit mehrmonatiger Stallhaltung im Winter und

gemeinschaftlichen Sommerweiden trugen zu einer raschen Verbreitung innerhalb

der isländischen Schafpopulation bei (DUNGAL et al 1938; PALSSON 1985). Nach

einem verheerenden Seuchenzug in den folgenden Jahren, zu dem auch Maedi-

Visna ihren Beitrag leistete, entschloß sich die Regierung zu einem radikalen

Eradikationsversuch. Kilometerlange Zäune wurden quer durch das Land errichtet

und bewacht, um betroffene Regionen von den Landesteilen zu trennen, in denen

Maedi und Lungenadenomatose bislang noch nicht aufgetreten waren. Die Schafe

dies- und jenseits des Zaunes wurden farblich gekennzeichnet und jeder

Grenzüberschreiter rigoros geschlachtet. Im Jahr 1944 begann man mit der

systematischen Schlachtung sämtlicher Schafe in den betroffenen Gebieten. Als

Grundstock für den Neuaufbau der Herden dienten Jungtiere aus den nicht

betroffenen Gebieten des Landes. Die letzten derartigen Schlachtungen wurden

Ende des Jahres 1952 durchgeführt, 1954 waren in allen betroffenen Gebieten neue

Herden angeschafft. Seit 1952 sind in Island keine Fälle von Lungenadenomatose

mehr aufgetreten. In den Folgejahren kam es wiederholt zu Neuausbrüchen von


Maedi, diese Erkrankung gilt jedoch seit 1965 in Island ebenfalls als ausgerottet.

Insgesamt fielen den beiden Erkrankungen nach Schätzungen mehr als 205.000

Schafe zum Opfer und im Zuge der Eradikationsmaßnahmen wurden mehr als

650.000 Schafe getötet (PALSSON 1985).

2.3.4 Sanierung mittels Embryotransfer

Aus einer Anpaarung von 76 Mutterschafen aus einer Lungenadenomatose-positiven

Herde mit Lungenadenomatose-negativen Böcken wurden in einer Untersuchung

von PARKER et al. (1998) 215 Embryonen gewonnen und mittels Embryotransfer in

Lungenadenomatose-freie Empfängertiere übertragen. Von den 125 geborenen

Lämmern stammten 51 von Muttertieren ab, die nach ihrer Tötung

Lungenadenomatose-spezifische Läsionen in der Lunge aufwiesen. Die

Empfängertiere und die gewonnenen Lämmer wurden fünf Jahre lang als

geschlossene Herde gehalten. In dieser Zeit wurden sie wiederholt mit

Lungenadenomatose-negativen Böcken belegt, um sie einem normalen

reproduktiven Stress auszusetzen, der eventuell eine Krankheitsentstehung

begünstigen könnte. Nach Ablauf der fünf Jahre wurden sowohl die Empfängertiere

als auch die Lämmer getötet und ihre Lungen sowie die Lungenlymphknoten

untersucht. Tiere, die dieses Alter nicht erreichten, wurden zum Zeitpunkt ihres

Todes ebenfalls in gleicher Weise auf Lungenadenomatose untersucht. Keines der

Empfängertiere oder der Lämmer wies nach dieser Zeit Anzeichen spezifischer

Läsionen auf. In gleicher Weise wurden als Nachkommen Lungenadenomatose-

negativer Mutterschafe mit einem Lungenadenomatose-positiven Bock elf

Embryonen gewonnen. Aus diesen gingen nach Übertragung in

Lungenadenomatose-negative Empfängertiere fünf Lämmer hervor, von denen vier

das Alter von fünf Jahren erreichten. Auch diese Empfängertiere und die Lämmer

wiesen zum Zeitpunkt ihres Todes keine spezifischen Lungenveränderungen auf.

Embryotransfer scheint daher eine geeignete Maßnahme zur Elimination der


Erkrankung aus einer Herde bei gleichzeitiger Bewahrung des genetischen Materials

der Spendertiere zu sein.

2.3.5 Sanierung mittels mutterloser Lämmeraufzucht am Beispiel der Maedi-Visna-Infektion

Maedi-Visna wird durch ein Lentivirus hervorgerufen. Sie kann als chronische

respiratorische Erkrankung (Maedi), in ihrer ZNS-Form (Visna), sowie in Form

chronischer Euterentzündungen und Arthritiden ausgeprägt sein. Die Erkrankung

zeigt einen langsamen Verlauf und klinische Symptome treten in der Regel erst bei

Tieren auf, die über drei Jahre alt sind (PALSSON 1990). Unter experimentellen

Bedingungen konnten DE BOER et al. (1979) zeigen, dass in der Geburt von ihren

Maedi-positiven Müttern getrennte und kolostrumfrei separat aufgezogene Lämmer

im Gegensatz zu bei den Müttern verbliebenen Kontrolltieren während einer

achtjährigen Beobachtungszeit weder klinische Symptome noch eine Serokonversion

zeigten. Unter Feldbedingungen erwies sich das Verfahren der mutterlosen Aufzucht

zur Maedi-Visna-Sanierung ebenfalls als erfolgreich (HOUWERS et al. 1983;

HOUWERS 1990). HOUWERS und HOUWERS et al. (1990; 1983) stellen für die

praktische Durchführung der Sanierung folgenden Maßnahmenkatalog auf:

• Sofortige Trennung der Lämmer in der Geburt; Minimierung des Kontaktes zur

Umgebung des Muttertieres

• Räumliche Trennung des Lämmerstalles

• möglichst personelle Trennung, zumindest allgemeine Hygienemaßnahmen

und Wechsel der Schutzkleidung

• Fütterung mit Rinderkolostrum in den ersten 24 Stunden, weitere Aufzucht mit

Schafmilchaustauscher, Heu und Kraftfutter

• Weiterhin getrennte Haltung und Aufzucht von der Muttertierherde

• Wiederholte halbjährliche serologische Untersuchung, beginnend ab dem

Alter von sechs Monaten

• Sofortige Entfernung von eventuellen Reagenten aus der Herde


2.3.6 Versuch der Lungenadenomatose-Sanierung mittels mutterloser Aufzucht

TUSTIN (1969) berichtet von einem Experiment, in dem zehn tragende Muttertiere

aus einer Lungenadenomatose-positiven Herde direkt nach der Geburt getötet

wurden. Vier dieser Muttertiere wiesen makroskopische Tumoren auf. Die Lämmer

wurden getrennt von anderen Schafen mutterlos aufgezogen, fünf Jahre lang separat

gehalten und sie pflanzten sich in dieser Zeit untereinander fort. Weder die mutterlos

aufgezogenen Tiere noch deren Nachkommen zeigten bei der Schlachtung Hinweise

auf eine Lungenadenomatose-Erkrankung.

2.3.6.1 Geschichte des Sanierungsprojekts

Im Jahr 1998 wurde in einer der wenigen großen Stammzuchtherden der Grauen

gehörnten Heidschnucken in der Lüneburger Heide mit über 200-jähriger

Zuchttradition Lungenadenomatose festgestellt. Der Besitzer entschloß sich zur

Schlachtung der gesamten Herde. Im letzten Moment konnten die Landkreise

Harburg und Soltau-Fallingbostel 111 zu diesem Zeitpunkt klinisch unauffällige

Muttertiere zur Erhaltung des wertvollen genetischen Materials dieser Herde

erwerben (GANTER 1999). Diese Tiere bildeten den Grundstock eines

Sanierungsversuches mittels mutterloser Aufzucht, der bei KRÄMER (2001)

ausführlich dargestellt ist. Im Juni 1998 ging diese im folgenden auch als

„Schneverdinger Herde“ bezeichnete Herde in den Besitz des Vereins

Naturschutzpark e.V. (VNP) über, der zu diesem Zeitpunkt an anderen Standorten

noch drei weitere, jeweils ca. 400 Muttertiere umfassende und allesamt mit

Lungenadenomatose infizierte Gebrauchsherden zur Heidepflege besaß.

Im Frühjahr 1999 und 2000 wurde die Schneverdinger Herde während der

Ablammperiode permanent überwacht und die Lämmer direkt nach Geburtshilfe

durch manuellen Auszug von den Müttern getrennt. Sie wurden dann in einen

separat gelegenen Lämmerstall verbracht und dort mit Rinderkolostrum bzw.


Kolostrumersatzpräparaten und anschließend mit Schafmilchaustauscher

großgezogen (KRÄMER 2001; WOLLNY 2000). Auf strikte Hygienemaßnahmen

wurde geachtet (kein Kontakt des Lammes zum Stallboden oder zum Muttertier,

Reinigung und Desinfektion der Hände, Wechsel der Schutzkleidung zwischen

Schaf- und Lämmerstall, räumliche Trennung), eine personelle Trennung war jedoch

aus organisatorischen Gründen während der ersten ein bis zwei Lebenstage der

Lämmer nicht möglich. Unbeobachtet geborene Lämmer sowie ein Teil der

Bocklämmer blieben bei ihren Müttern. Die männlichen Lämmer wurden kastriert, im

folgenden Herbst geschlachtet und ihre Lungen pathomorphologisch sowie

gegebenenfalls pathohistologisch untersucht.

Die weitere Aufzucht und Haltung der mutterlos aufgezogenen Lämmer erfolgte

zunächst getrennt von anderen Schafen im Tierhaus der Klink für kleine Klauentiere

und anschließend bis zum Herbst 2000 in einem landwirtschaftlichen Betrieb ohne

eigene Schafhaltung. Anschließend wurden sie in einen nach zwei Jahren Leerstand

gereinigten und desinfizierten Stall in der Nähe der Ortschaft Döhle in der

Lüneburger Heide verbracht. Diese Herde wird im folgenden daher als „Döhler

Herde“ bezeichnet.

Zu diesem Zeitpunkt wurden ihnen zwei Altböcke zugesellt. Diese stammten aus

kontrollierten Herkünften, bei denen vorberichtlich Lungenadenomatose noch nie in

Erscheinung getreten war. Zum Zeitpunkt der Einführung in die Döhler Herde waren

sie sechs Jahre alt und klinisch gesund. Röntgenologisch bestanden keine Hinweise

auf Lungenveränderungen. Die vorangegangenen eineinhalb Jahre hatten sie in

Quarantäne ohne Kontakt zu anderen Schafen am Institut für Tierzucht und

Tierverhalten des Instituts für Tierzucht der Bundesforschungsanstalt für

Landwirtschaft in Mariensee verbracht und auch zuvor waren sie eingehend klinisch

und röntgenologisch untersucht worden. Im selben Herbst kamen sie in der Döhler

Herde zum Deckeinsatz (KRÄMER 2001).

Entgegen der ursprünglichen Planung, die Schneverdinger Herde nach Abschluß der

Lammzeit 2000 aufzulösen, wurden auch im Frühjahr 2001 aus dieser Herde ca. 100


weibliche und männliche, sowie aus einer der Lungenadenomatose-positiven

Gebrauchsherden des VNP (Tütsberger Herde) weitere ca. 100 weibliche Lämmer

für die mutterlose Aufzucht gewonnen. (siehe 3.1 und 4.1), die weitere Aufzucht

dieser Lämmer nach der Kolostralphase erfolgte im Stall der Döhler Herde

(BIMCZOK 2002).

TIERE, MATERIAL UND METHODEN 75

3. TIERE, MATERIAL UND METHODEN

3.1 Fortführung der Sanierung im Frühjahr 2001

Um ein schnelleres Anwachsen der Döhler Herde auf die gewünschte Kopfgröße von

ca. 400 Muttertieren zu erreichen, wurden auch im Frühjahr 2001 aus der

Schneverdinger Herde ca. 100 weibliche und männliche, sowie aus einer der

Lungenadenomatose-positiven Gebrauchsherden des VNP (Tütsberger Herde)

weitere ca. 100 weibliche Lämmer für die mutterlose Aufzucht gewonnen. Material

und Methoden sind ausführlich bei KRÄMER (2001) beschrieben. Eine

Brunstsynchronisation erfolgte im Herbst 2000 nicht. Es wurden in der Lammzeit die

selben hygienischen Standards eingehalten wie in den Vorjahren (KRÄMER 2001),

d.h. die Muttertiere wurden von Studierenden der Tierärztlichen Hochschule

Hannover und der Autorin rund um die Uhr überwacht. Alle für die Geburtshilfe und

Lämmerversorgung benötigten Utensilien wurden im Schafstall außerhalb der

Reichweite der Mutterschafe gelagert. In der Austreibungsphase wurden die Lämmer

durch sanfte Zughilfe entwickelt und ohne Kontakt zum Stallboden oder dem

Muttertier sofort in mit frischem, sauberem Stroh ausgelegte saubere Plastikkisten

gelegt. In diesen Kisten wurden sie sofort im Anschluß aus dem Schafstall in einen

separat gelegenen, ca. 100 m entfernten Lämmerstall verbracht. Zwischen Schaf-

und Lämmerstall erfolgte der konsequente Wechsel der Schutzkleidung (Stiefel,

Overalls) sowie eine gründliche Reinigung und Desinfektion der Hände. Die

Einrichtung des Lämmerstalles bestand aus neuen Holzhürden zur Abgrenzung der

Boxen. Diese waren mit zugekauften Sägespänen eingestreut. Es standen für die

Lämmer Wärmelampen zur Verfügung. Im Lämmerstall erfolgte ein gründliches

Trockenreiben der Lämmer mit sauberen Handtüchern, das Jodieren des Nabels und

während der ersten 24 Lebensstunden die Versorgung mit Rinderkolostrum.

Anschließend wurden die Tiere in den einige Kilometer entfernten Schafstall nach

Döhle verbracht und dort mit Schafmilchaustauscher weiter aufgezogen (BIMCZOK

2002).

76 TIERE, MATERIAL UND METHODEN

Im Schafstall sowie im Lämmerstall standen Wasser, Seife und

Händedesinfektionsmittel zur Verfügung und wurden regelmäßig genutzt. Alle im

Lämmerstall verwendeten Utensilien wurden nur dort verwendet und waren eigens

für diesen Zweck angeschafft worden. Sie hatten keinerlei Kontakt zur

Muttertierherde.

Nach Abschluß der Lammzeit 2001 wurde die Schneverdinger Herde aufgelöst.

3.2 Herden

3.2.1 Schneverdinger Herde

Diese Herde entstand durch Aufkauf von 111 weiblichen Zuchttieren aus einer

hochgradig mit Lungenadenomatose (LA) befallenen Stammzuchtherde im Jahr 1998

und bildete den Grundstock des bei KRÄMER (2001) detailliert beschriebenen

Sanierungsversuches mittels mutterloser Aufzucht.

Zu Beginn dieser Untersuchungen Ende des Jahres 2000 umfaßte diese Herde 113

Tiere (80 Muttertiere und Zutreter, 28 Lämmer, vier Böcke, ein Hammel)

(KOOPMANN 2003, pers. Mitteilung).

In den beiden Vorjahren hatten die Verluste an Zuchttieren durch Lungen-

adenomatose durchschnittlich ca. 15% betragen. Vierzehn der 47 in der Herde

verbliebenen Lämmer (29,8%) hatten im Alter von fünfeinhalb bis acht Monaten

bereits makroskopisch erkennbare Lungentumoren aufgewiesen. Fünf dieser 14

Tiere (10,6% aller untersuchten Lämmer; n=47) waren in diesem Alter bereits klinisch

erkrankt (KRÄMER 2001). Nach Abschluß der Lammzeit 2001 wurde diese Herde

aufgelöst. Die Mehrzahl (n=50) der Muttertiere wurde im selben Frühjahr

euthanasiert und pathologisch-anatomisch sowie histologisch untersucht.

Lämmerführende Muttertiere sowie die jüngeren Tiere wurden vorübergehend in die

ebenfalls LA-positive Tütsberger Herde (siehe 3.2.3) integriert und bis zum Sommer

2003 gemäß ihrem natürlichen altersgemäßen oder gesundheitsbedingten


Ausscheiden aus der Herde ebenfalls euthanasiert und der postmortalen

Untersuchung zugeführt (n=30). Drei weitere Muttertiere erreichten die Lammzeit im

Jahr 2001 nicht und wurden aufgrund klinischer Lungenadenomatose bereits im

Herbst 2000 eingeschläfert.

3.2.2 Döhler Herde

Diese durch mutterlose Aufzucht von Lämmern aus der Schneverdinger Herde

aufgebaute Herde setzte sich im Herbst 2000 wie folgt zusammen: 100 weibliche

Tiere (51 des Jahrganges 1999, 49 Zutreter aus dem Geburtsjahrgang 2000), vier

mutterlos aufgezogene, gekörte Böcke aus 1999, elf Lammböcke des Jahrganges

2000 und zwei dazugesellte Altböcke aus anderen, Lungenadenomatose-

unverdächtigen Herkünften.

Bis zu diesem Zeitpunkt waren in dieser Herde keine klinischen

Lungenadenomatose-Fälle aufgetreten. Von 55 Bocklämmern der Jahrgänge 1999

und 2000, die im Alter von acht bis 13 Monaten geschlachtet wurden, wies eines im

Schlachtalter von 13 Monaten in einer von vier Lungenlokalisationen nur histologisch

eindeutig als Lungenadenomatose zu identifizierende Läsionen auf. Bei einem

weiteren gleichaltrigen Tier wurde histologisch fokal eine geringgradige Proliferation

des Bronchialepithels festgestellt, so dass Lungenadenomatose histologisch nicht

eindeutig ausgeschlossen werden konnte (KRÄMER 2001).

3.2.3 Weitere Herden des VNP

Auf dem Gebiet des Naturschutzgebietes Lüneburger Heide wurden im Herbst 2000

in Trägerschaft des VNP zusätzlich zu den beiden oben genannten Herdbuchherden

drei weitere, jeweils ca. 400 Muttertiere umfassende Gebrauchsherden zur

Heidepflege gehalten. Diese Herden waren nicht Teil der Herdbuchzucht und alle

drei mit Lungenadenomatose infiziert. Nach ihren Standorten werden diese Herden

im folgenden als „Tütsberger Herde“, „Wilseder Herde“ und „Herde Undeloher


Straße“ bezeichnet. In diesen drei Gebrauchsherden betrugen die Verluste an

Alttieren durch die Lungenadenomatose zum genannten Zeitpunkt zwischen 4% und

14% (KOOPMANN 2000, pers. Mitteilung).

3.2.4 Haltung, Ställe und Weideflächen

Für jede der fünf genannten Herden stehen an räumlich getrennten Standorten

eigene Ställe und Weideflächen zur Verfügung. Sie werden durch jeweils einen fest

angestellten Schäfer betreut und außerhalb der Lammzeit ganzjährig tagsüber auf

Heide- und Grünlandflächen innerhalb des Naturschutzgebietes gehütet. Es

bestehen keine Überschneidungen der Weideflächen. Nachts kehrt die Herde

ganzjährig in den Stall zurück. Die Ställe wurden in den sechziger Jahren in

landschaftstypischer Bauweise errichtet. Ein Steinsockel trägt den ansonsten aus

Holz bestehenden Stall, das Dach ist reetgedeckt, darunter befindet sich ein über

Leitern zugänglicher Heu- und Strohboden. Die Ställe haben keine Fenster,

nachträglich wurden jedoch zum Teil an den Längsseiten Lüftungsklappen

eingebaut. An beiden Giebelseiten befinden sich große Flügeltüren, die ganz oder

halb geöffnet werden können.


3.3 Tiere und Probenmaterial

3.3.1 Tiere und Probenmaterial aus LA-positiven Herden

A Sektionstiere Aus der Schneverdinger Herde und den drei LA-positiven Gebrauchsherden des

VNP wurden insgesamt 124 Tiere an die Klinik für kleine Klauentiere gebracht, dort

eingehend klinisch untersucht und zunächst nach der Entnahme von Blutproben

durch intravenöse Injektion einer Überdosis Pentobarbital (EuthaR77, Essex

Tierarznei) euthanasiert. Da die Untersuchung der Blutproben der ersten LA-

positiven Sektionstiere ein überwiegend negatives Ergebnis lieferte, wurde im

Folgenden dazu übergegangen, zur Erweiterung des intravital gewonnenen

Probenspektrums von den verbleibenden Sektionstieren (n=109) zusätzlich

Lungenspülproben zu gewinnen. Anschließend erfolgte am Institut für Pathologie der

Tierärztlichen Hochschule die Sektion des Tierkörpers1 mit Entnahme von

Gewebeproben (Lungengewebe und Lymphonodus mediastinalis caudalis) für die

histologische Untersuchung sowie die Untersuchung mittels PCR.

Aus dieser Gruppe entstammten 83 Tiere der Schneverdinger Herde, weitere 21 der

Tütsberger Herde, 15 Tiere der Herde Undeloher Straße und drei Tiere der Wilseder

Herde. Für zwei weitere Tiere konnte die Zugehörigkeit zu einer der drei

Gebrauchsherden nicht mehr eindeutig nachvollzogen werden. Die Altersstruktur des

Sektionsgutes ist Abbildung 1 zu entnehmen. Durch die detaillierte Buchführung in

der Herdbuchzucht konnte für alle Tiere der Schneverdinger Herde das exakte Alter

ermittelt werden. Für die Tiere aus den drei Gebrauchsherden lagen derartige Daten

nicht vor. Bei diesen wurde daher eine Zahnaltersbestimmung vorgenommen. Nach

dem Wechsel aller Incisivi ist hiernach eine exakte Altersbestimmung jedoch nicht

mehr möglich, so dass für zehn Tiere lediglich die Aussage „vier Jahre oder älter“

1 Die Sektion und die histologische Untersuchung erfolgte durch Herrn Dr. Michael Brügmann, Abteilung Pathologie des Instituts für Tiergesundheit der Landwirtschaftlichen Untersuchungs- und Forschungsanstalt (LUFA) Nord-West


getroffen werden konnte (zum Zahnwechsel bei Schafen siehe SCHUMMER und

HABERMEHL (1987)). Siebenunddreißig der 124 Sektionstiere (29,8%) waren jünger

als vier Jahre alt; 70,2% waren vier Jahre und älter, die ältesten beiden Tiere waren

elf Jahre alt. Der hohe Anteil älterer Tiere ist durch die überalterte Herdenstruktur der

Schneverdinger Herde bedingt, die einen Großteil des Sektionsgutes ausmachte.

Altersstruktur des Sektionsgutes n=124

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

<1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 >4

Alter (Jahre)

Abbildung 1: Altersstruktur der Sektionstiere aus LA-positiven Herden

B Schlachttiere Zusätzliche Blut- und Gewebeproben sowie bei einer geringen Tierzahl (n=17) auch

Lungenspülproben wurden von insgesamt 127 Schlachttieren aus den genannten

vier Lungenadenomatose-positiven Herden gewonnen. Von diesen Tieren stammten

neun aus der Schneverdinger Herde, 60 Tiere entstammten der Tütsberger Herde,

41 der Herde Undeloher Straße und 17 Tiere der Wilseder Herde. Das genaue Alter

war lediglich von den neun Schneverdinger Tieren bekannt (sieben Lämmer und

zwei Jährlinge), bei den anderen Tieren konnte bei der Lebenduntersuchung an den

Schlachtstätten lediglich eine Einteilung in Lämmer und adulte Tiere vorgenommen

werden. Die Altersstruktur der Schlachttiere ist in Tabelle 3 dargestellt:


Tabelle 3: Altersstruktur der Schlachttiere aus LA-positiven Herden (n=127)

Alter (Jahre) Anzahl relativer Anteil (%)

Lämmer < 1 82 64,6

Adulte (Jährlinge oder älter)

45 35,4

C Lämmerblutproben Während der Lammzeit 2001 und in den folgenden Wochen und Monaten wurden

von 18 in der Tütsberger Herde geborenen und verbliebenen Lämmern regelmäßig

Blutproben entnommen. Die erste Blutprobenentnahme erfolgte bei 17 Tieren direkt

nach der Geburt vor der ersten Kolostrumaufnahme, die zweite Entnahme im Alter

von zehn bis 14 Tagen. Das Lamm mit der Nummer 60 wurde, obwohl es vor Beginn

dieser Studie geboren war und daher keine präkolostrale Blutprobe gewonnen

werden konnte, dennoch in die weiteren Blutprobenentnahmen einbezogen, da seine

Mutter klinisch an Lungenadenomatose erkrankt und es daher einer hohen

natürlichen Infektionsdosis ausgesetzt war. Das Muttertier des Lammes 377 litt

ebenfalls an klinischer Lungenadenomatose. Die Muttertiere der übrigen Lämmer

waren zum Zeitpunkt der Geburt klinisch unauffällig. Es folgten bei allen Tieren

sieben weitere wöchentliche Blutentnahmen bis zum Alter von neun bis zehn

Wochen und eine weitere im Alter von circa fünf Monaten. Zwei Tiere erreichten

dieses Lebensalter nicht. Die genaue Todesursache ist nicht bekannt, da die Tiere

von dem Schäfer nicht zur Untersuchung eingesandt wurden. Im neunten

Lebensmonat wurden von allen verbleibenden Tieren erneut Blutproben und auch

Lungenspülproben entnommen. Ein Tier war zu diesem Zeitpunkt vermutlich durch

Verlust der Ohrmarke nicht mehr auffindbar. Nach Ablauf der Wartezeit des zur

Entnahme der Lungenspülproben angewandten Allgemeinanaesthetikums (siehe

3.5.2 A) wurden 12 Tiere im zehnten Lebensmonat geschlachtet, die Lungen

makroskopisch beurteilt und Gewebeproben für die Histologie und PCR gewonnen.


Ein weiteres Tier wurde im Alter von 15 Monaten geschlachtet und in gleicher Weise

untersucht. Zwei Tiere verblieben als Zutreter in der Herde. Eine Übersicht über

diese Tiere ist in Tabelle 4 gegeben.

Tabelle 4: Übersicht der Lämmer aus der Tütsberger Herde, von denen regelmäßige Blutentnahmen erfolgten Lamm

OM Mutter geboren 1.

Blut-entn.

11. Blutentn.

+ BAL

Schlachtung Lungenbefund (makroskopisch u. histologisch)

377 klin. LA 09.02.2001 09.02. 02.11. 03.12.2001 positiv

372 10.02.2001 10.02. vorab gestorben (keine Hinweise auf LA)

371 10.02.2001 10.02. 02.11. 03.12.2001 fraglich

60 klin. LA 28.01.2001 11.02. 02.11. 03.12.2001 negativ

363 12.02.2001 12.02. 02.11. 02.05.2002 positiv

362 12.02.2001 12.02. 02.11. 03.12.2001 negativ

365 12.02.2001 12.02. Schicksal unbekannt (Ohrmarkenverlust?)

352 13.02.2001 13.02. 02.11. noch im Bestand (Zutreter)

347 13.02.2001 13.02. 02.11. 03.12.2001 negativ

349 13.02.2001 13.02. 02.11. 03.12.2001 negativ

350 13.02.2001 13.02. 02.11. 03.12.2001 negativ

354 13.02.2001 13.02. vorab gestorben (keine Hinweise auf LA)

348 13.02.2001 13.02. 02.11. 03.12.2001 negativ

351 13.02.2001 13.02. 02.11. noch im Bestand (Zutreter)

326 15.02.2001 15.02. 02.11. 03.12.2001 negativ

325 15.02.2001 15.02. 02.11. 03.12.2001 negativ

331 15.02.2001 15.02. 02.11. 03.12.2001 negativ

370 15.02.2001 15.02. 02.11. 03.12.2001 negativ

OM: Ohrmarke; Blutentn.: Blutentnahmetermin klin.: klinisch


3.3.2 Tiere und Probenmaterial aus der mutterlos aufgezogenen (Döhler) Herde

A Sektionen

Im Zeitraum vom Herbst 2000 bis Ende 2003 gelangten neun verendete, über sechs

Monate alte Tiere aus der Döhler Herde zur Sektion2. Die Lungen dieser Tiere

wurden pathohistologisch untersucht und, soweit möglich, Gewebeproben für die

PCR entnommen. Ende des Jahres 2002 wurden die genannten Altböcke aus

züchterischen Gründen aus der Herde entfernt. Sie wurden nach der Entnahme von

Lungenspülproben euthanasiert, am Institut für Pathologie der Tierärztlichen

Hochschule seziert, die Lungen makroskopisch und histologisch untersucht sowie

Lungen- und Lymphknotengewebeproben für die Untersuchung mittels PCR

entnommen.

B Schlachttiere

Die Lungen sämtlicher Schlachttiere im Zeitraum vom Frühjahr 2001 bis Ende 2003

(n=299) wurden makroskopisch untersucht. Von jedem der insgesamt 105 Tiere, die

zwischen dem Frühjahr 2001 und Frühjahr 2002 geschlachtet wurden, wurden

jeweils Lungengewebeproben und Lymphonodus (Ln.) mediastinalis caudalis für eine

systematische histologische Untersuchung sowie ein Teil des Ln. mediastinalis

caudalis für die Untersuchung mittels PCR entnommen. 104 dieser Tiere waren

Jungtiere im Alter von circa neun bis vierzehn Monaten, ein weiteres Tier war zum

Zeitpunkt der Schlachtung knapp drei Jahre alt (Geburtsjahrgang 1999).

Die 194 geschlachteten Tiere im Zeitraum vom Herbst 2002 bis Ende 2003 (184

Lämmer zwischen neun und vierzehn Monaten, zehn Alttiere der Jahrgänge 1999 bis

2001) wurden aus Kostengründen lediglich makroskopisch beurteilt. Bei

makroskopischen Abweichungen vom Normalbefund, bei sämtlichen geschlachteten 2 Die Sektion und die histologische Untersuchung erfolgte durch Herrn Dr. Michael Brügmann, Abteilung Pathologie des Instituts für Tiergesundheit der LUFA Nord-West


Alttieren (n=10) sowie bei einer Stichprobe makroskopisch unveränderter Lungen

(insgesamt 64 Tiere) wurde zusätzlich eine systematische histologische

Untersuchung durchgeführt. Auf eine routinemäßige Untersuchung der Lymphknoten

mittels PCR wurde bei diesen Tieren aus Kostengründen verzichtet.

C Lungenspülproben

Im Sommer der Jahre 2001 und 2002 wurden von allen Tieren der Geburtsjahrgänge

1999 und 2000 sowie den Altböcken Lungenspülproben für die Untersuchung mittels

PCR entnommen (n=121 im Jahr 2000 bzw. n=119 im Jahr 2001)).

Im Sommer 2003 wurde die Entnahme von Lungenspülproben unter Anleitung der

Autorin durch Frau Sandra Stamm und Herrn Klaus Schlotter (Klinik für kleine

Klauentiere der Tierärztlichen Hochschule) wiederholt. Zu diesem Zeitpunkt wurden

zusätzlich zu den Jahrgängen 1999 und 2000 auch die Tiere des Geburtsjahrganges

2001 (mutterlos aufgezogene Lämmer aus der Schneverdinger und Tütsberger

Herde sowie in der Döhler Herde geborene und durch ihre Mütter aufgezogene

Tiere) in die Probenentnahme einbezogen. Insgesamt wurden im Sommer 2003 von

393 Tieren Lungenspülproben gewonnen.


3.4 Klinische Untersuchung

3.4.1 Sektionstiere

Alle in die Klinik für kleine Klauentiere eingestellten Schafe wurden eingehend

klinisch untersucht und es wurden zu folgenden Punkten Befunde erhoben und

dokumentiert:

A Allgemeinuntersuchung unter Berücksichtigung von

• Haltung

• Verhalten

• Ernährungszustand

• Habitus

• Schleimhautfarbe

• Atemfrequenz

• Pulsfrequenz

• Körpertemperatur

• Zahnalter

B spezielle Untersuchung aller Organsysteme

• Haut/Vlies

• Herz/Kreislaufsystem

• Lymphknoten

• Digestionstrakt

• Bewegungsapparat

• Sinnesorgane/ZNS

• Harn- und Geschlechtsapparat, Euter


C spezielle Untersuchung des Atmungsapparates

• Atemtyp (costoabdominal, vermehrt abdominal, vermehrt costal)

• Nasenausfluß (Charakter und Menge, spontan oder provoziert durch

Anheben an den Hintergliedmaßen; sog. „Schubkarrentest“)

• Husten (spontan oder provoziert durch Kompression der ersten

Trachealspangen)

• Auskultation von Kehlkopf, Trachea und beider Lungen mit Dokumentation

der Lokalisation (laryngotracheal, tracheobronchial, bronchobronchulär),

des Grades (geringgradig, mittelgradig, hochgradig, höchstgradig) und des

Charakters der Atemgeräusche. Deren Benennung wurde nach STÖBER

(1990b) vorgenommen.

Die Tiere wurden anhand der in der Allgemeinuntersuchung und speziellen

Untersuchung des Atmungsapparates erhobenen Befunde in vier klinische Gruppen

eingeteilt:

A klinisch ohne besonderen Befund

B respiratorische Symptome verschiedenen Grades, die Hinweise oder

Verdachtsmomente auf eine Erkrankung des Respirationstraktes geben,

jedoch aufgrund ihres Grades und ihrer Ausprägung eine Abgrenzung

zwischen eventuell beginnender Lungenadenomatose und anderen

Erkrankungen des Atemtraktes nicht erlauben.

(verschärfte Atemgeräusche und/oder kontinuierliche Nebengeräusche

verschiedenen Grades, trockener Husten und ggf. Dyspnoe, jedoch kein Nasenausfluß, keine diskontinuierlichen Nebengeräusche, Schubkkarrentest negativ)


C klinischer Verdacht auf Lungenadenomatose

(kein Nasenausfluß, Schubkarrentest negativ, jedoch pathologische

diskontinuierliche Nebengeräusche mit feuchtem oder rasselndem Charakter)

D klinische Lungenadenomatose

(hochgradige diskontinuierliche Nebengeräusche mit feucht-rasselndem

Charakter sowie spontaner oder provozierter Nasenausfluß; Schubkarrentest positiv, Abgang von schaumig-serösem Sekret)

3.4.2 Schlachttiere

Eine eingehende klinische Untersuchung der Schlachttiere nach obigem Muster

konnte aus Gründen der Betriebsabläufe nicht durchgeführt werden. Die

Lebenduntersuchung beschränkte sich bei diesen Tieren daher auf die Adspektion

mit besonderem Augenmerk auf Atemfrequenz, Atemtyp, spontenen Husten,

spontanen Nasenausfluß sowie bereits ohne Phonendoskop wahrnehmbare

Atemgeräusche.

3.4.3 Klinische Untersuchung der Döhler Herde

Alle Herden des VNP einschließlich der Döhler Herde werden durch den Schaf- und

Ziegengesundheitsdienst von Prof. Dr. M. Ganter betreut. Dies beinhaltet einen

routinemäßigen Turnus von mindestens zwei Bestandsbesuchen im Jahr. Die

Besuchsfrequenz der Döhler Herde durch Prof. Ganter, die Autorin oder andere

Mitarbeiter der Klinik für kleine Klauentiere war aufgrund des beschriebenen

Sanierungsversuches und diverser Probenentahmetermine wesentlich höher. Tiere,

die husteten, wurden sofern sie nicht auf einfache therapeutische Maßnahmen durch

den Haustierarzt ansprachen, prinzipiell baldmöglichst geschlachtet und die Lungen

makroskopisch und histologisch sowie zum Teil mikrobiologisch untersucht.


3.5 Probenentnahme

Alle verwendeten Materialien, Gebrauchslösungen und Geräte sind in einer Liste im

Anhang aufgeführt.

3.5.1 Blutentnahme

Die Blutentnahme erfolgte aus der Vena jugularis mit 10 ml Lithium-heparinisierten

Vacutainern (Fa. Medicalis, Garbsen). Bis zur Weiterverarbeitung der Proben wurden

sie bei 4°C maximal über Nacht gelagert. Bei den zur Sektion vorgesehenen Tieren,

die in der Klinik eingestallt waren, erfolgte die Weiterbearbeitung direkt im Anschluß

an die Entnahme im Labor der Klinik für kleine Klauentiere. Bei den Schlachttieren

konnten die Proben in der Regel erst am Abend des Schlachttages, in Einzelfällen

auch erst am folgenden Morgen weiterverarbeitet werden. Für die Buffy-Coat-

Isolation aus den während der Lammzeit 2001 gewonnenen Lämmerblutproben

wurde in den Räumlichkeiten des VNP auf dem Hof Tütsberg ein Behelfslabor

eingerichtet, so dass keine wesentlichen zeitlichen Verzögerungen in der

Probenbearbeitung auftraten.

3.5.2 Lungenspülproben

A Entnahme von Lungenspülproben nach endotrachealer Intubation

Für die Entnahme der Lungenspülproben wurde ein Verfahren entwickelt, das die

Entnahme von Proben von größeren Tierzahlen auch unter Bestandsbedingungen

ermöglichte. Dies erfolgte durch Adaptation eines für das Kalb beschriebenen

Verfahrens (FOGARTY et al. 1983; CALDOW 2001). Anders als dort beschrieben

war es beim Schaf nicht möglich, über die Nase einzugehen, weil die eingeführten


Schläuche regelmäßig abgeschluckt wurden. Auch ein transtrachealer Zugang

(WORKU 1994) erwies sich als nicht praktikabel.

Die Schafe wurden mittels intravenöser Gabe einer Dosis von 8 - 10 mg/kg Ketamin

(UrsotaminR, Serumwerk Bernburg AG) kurzzeitig immobilisiert, um das Einführen

eines Tubus in die Trachea zu ermöglichen. Nach Wirkungseintritt der Anästhesie

wurde das Schaf von einem Helfer in Brust-Bauchlage verbracht, der Kopf

überstreckt und mithilfe eines Laryngoskopes der Kehlkopf dargestellt. Dieser wurde

über einen Zerstäuber mit zweiprozentigem Lokalanästhetikum (Isocain ad us. vet.,

Selectavet) benetzt und anästhesiert. Ein ca. 40 cm langes Stück klarer PVC-

Schlauch mit einem Innendurchmesser von 0,8 cm und einer Wanddicke von 2 mm

wurde innen mit sterilem Gleitgel (BoviConceptR Gleit-Gel; A. Albrecht GmbH,

Aulendorf) benetzt und auf einen Führungsstab aus Edelstahl geschoben. Mithilfe

dieses Führungsstabes erfolgte unter Sichtkontrolle in der Inspirationsphase

(maximale Öffnung der Stimmritze) die Einführung des „Behelfs-Tracheotubus“ in die

Trachea. Der Führungsstab wurde entfernt, das proximale Ende des PVC-

Schlauches durch den Helfer fixiert, seitlich im Bereich des Diastema aus dem Maul

geführt und der Kopf in eine physiologische Haltung verbracht. Der korrekte Sitz des

Schlauches in der Trachea konnte durch atemsynchrones Beschlagen der klaren

Schlauchwand leicht überprüft werden. Durch diesen Schlauch wurde eine sterile,

100 cm lange Ernährungssonde (Aesculap AG, Melsungen) soweit vorgeschoben,

bis sie in einem kleinen Bronchus zu liegen kam und ein Weiterschieben nicht mehr

möglich war. Wichtig ist die ausreichende Verwendung von Gleitgel, um ein leichtes

Vorwärtsschieben der Sonde in dem PVC-Schlauch zu gewährleisten und ein

vorzeitiges Steckenbleiben zu vermeiden. An der Ernährungssonde wurde zuvor das

mit zwei seitlichen Öffnungen versehene distale Ende mit einer Schere direkt über

diesen abgeschnitten, um eine zentrale Öffnung zu erlangen. Hierdurch wird bei der

Aspiration der Spülflüssigkeit die Bronchialwand geschont. Mit Einwegspritzen

wurden nun in vier Fraktionen jeweils 25 ml sterile 0,9%ige Kochsalzlösung (B.

Braun Melsungen AG) instilliert und sofort wieder aspiriert. Alle vier Spülfraktionen

wurden in einem sterilen Schraubdeckelgefäß gesammelt und bis zur


Weiterverarbeitung gekühlt. PVC-Schlauch und Ernährungssonde wurden aus der

Trachea entfernt und das Schaf bis zum Nachlassen der Ketaminwirkung in Brust-

Bauchlage gelagert. Beide an der Probenentnahme beteiligten Personen trugen

Latex-Handschuhe, die zwischen den Tieren gewechselt wurden. Es standen drei

Laryngoskopspatel zur Verfügung, die zwischen den einzelnen Tieren in

Desinfektionsmittel (HelipurR-Konzentrat in fünfprozentiger Lösung, Fa. Omnilab,

Gehrden) eingelegt und abgewaschen wurden. Mit dem zur Kehlkopfanästhesie

verwendeten Bronchialzerstäuber bestand kein direkter Tierkontakt, er wurde für alle

zu einem Termin zu spülenden Tiere verwendet und anschließend gereinigt und

desinfiziert. An einem Termin wurden jeweils nur Tiere aus Lungenadenomatose-

positiven Herden oder der mutterlos aufgezogenen Herde beprobt. Für jedes Tier

wurde ein eigener, zuvor gereinigter und desinfizierter Führungsstab verwendet. Bei

allen anderen Materialien handelte es sich um Einwegmaterialien.

B Entnahme von Lungenspülproben mithilfe eines flexiblen Endoskops

Bei einzelnen klinisch an Lungenadenomatose erkrankten Tieren wurde nach einer

bei GANTER (1996) detailliert beschriebenen Methode über ein flexibles Endoskop

eine Lungenspülung durchgeführt. Dies diente der Gewinnung eines möglich großen

Probenvolumens, aus dem durch Aliquotierung Positivkontrollen für die PCR

hergestellt wurden.

3.5.3 Gewebeproben

A Entnahme von Gewebeproben bei Schlachttieren

Die Schlachtung der Tiere erfolgte in zwei ortsansässigen handwerklichen

Schlachtbetrieben in Behringen und Egestorf. Die maximale Anzahl bei einem

Schlachttermin beprobter Tiere betrug 20 Stück. Die Betäubung wurde je nach


Betrieb mittels Elektrozange bzw. Bolzenschuß durchgeführt, und die Tiere wurden

gemäß der betriebsinternen Routine entblutet, abgezogen und hergerichtet sowie die

Bauchhöhlenorgane entnommen. Für Tiere aus der Herde Döhle wurde jeweils ein

eigener Schlachttermin anberaumt, an dem außer diesen Tieren keine weiteren

Schafe geschlachtet wurden. Um eine Kreuzkontamination zwischen den einzelnen

Tieren bereits bei der Probennahme zu vermeiden, erfolgte die Eröffnung des Thorax

und die Entnahme der Lunge mit einem sterilen Messer. Hierfür wurden

handelsübliche hitzesterilisierbare Fleischermesser verwendet. Für jedes Tier wurde

ein eigenes, gereinigtes und desinfiziertes, für 20 min bei 121°C und 1,5 bar

autoklaviertes und individuell verpacktes Messer verwendet. Für diese Arbeiten trug

der jeweilige Mitarbeiter armlange Plastikhandschuhe, die zwischen der

Organentnahme bei den einzelnen Tieren gewechselt wurden. Die Lungen wurden

direkt nach der Entnahme einzeln in saubere Plastiktüten verpackt. Eine direkte

weitere Probenentnahme im Schlachtbetrieb war aus Gründen der Betriebsabläufe

nicht möglich. Nach Abschluß der Organentnahme wurden die Lungen daher in die

nahe gelegenen Räumlichkeiten des VNP auf dem Hof Tütsberg verbracht. Dort

wurde jede Lunge makroskopisch beurteilt, die Befunde dokumentiert und Gewebe

von vier definierten Lokalisationen (Pars caudalis des linken Spitzenlappens, Pars

cranialis des rechten Spitzenlappens und rechter und linker Hauptlappen) sowie die

Hälfte des Ln. mediastinalis caudalis für die histologische Untersuchung entnommen

und in zehnprozentigem, neutral gepuffertem Formalin eingelegt. Falls

makroskopisch erkennbare Lungenveränderungen an anderen als den vier

Standardlokalisationen bestanden, wurden von diesen zusätzliche Proben

entnommen. Zudem erfolgte die Entnahme eines Teils des Ln. mediastinalis caudalis

sowie von Lungengewebe von zwei definierten Lokalisationen (Pars caudalis des

linken Spitzenlappens und cranioventraler Teil des rechten Hauptlappens) für die

Untersuchung mittels PCR. Hierfür wurden für jede Probe individuelle, sterile

Bestecke verwendet. Die Probenentnahme erfolgte mit Latexhandschuhen, die

zwischen jeder Lunge gewechselt wurden. Als Arbeitsunterlage dienten saubere

Plastiktüten, von denen ebenfalls für jede Lunge eine neue verwendet wurde. Die für


die Untersuchung mittels PCR vorgesehenen Gewebeproben wurden in 2 ml Safe-

Lock Eppendorfgefäße verbracht und nach Abschluß der Probenentnahme vor Ort in

flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Zeitverzögerung zwischen Schlachtung des

ersten Tieres und Einfrieren der Proben betrug maximal vier Stunden. Nach der

Rückkehr nach Hannover wurden die Proben bis zur Weiterverarbeitung bei –80°C

gelagert.

Die Lokalisation der Standardproben für die histologische Untersuchung ist

Abbildung 2 zu entnehmen.

Abbildung 2: Lokalisation der vier Standard-Lungengewebeproben für die histologische Untersuchung (Darstellung der Lunge in Dorsalansicht nach NICKEL und WILKENS (1987). Die Lage des ventral gelegenen Lobus accessorius ist gestrichelt eingezeichnet. Die Rechtecke kennzeichnen die Lage der für die histologische Untersuchung routinemäßig entnommenen Proben. Zusätzlich wurde auch der im caudalen Mediastinum gelegene Lymphonodus mediastinalis caudalis entnommen)


B Entnahme von Gewebeproben während der Sektion

Die zur Sektion vorgesehenen Tiere wurden an der Klinik für kleine Klauentiere durch

intravenöse Injektion einer Überdosis Pentobarbital (EuthaR 77, Essex Tierarznei)

euthanasiert und an das Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule

Hannover verbracht. Dort erfolgte nach Feststellung des Gewichtes des Tierkörpers

die Sektion durch Herrn Dr. Michael Brügmann, Abteilung Pathologie des Instituts für

Tiergesundheit der LUFA Nordwest. Für jedes Tier wurde ein eigenes, steriles

Sektionsbesteck verwendet und analog der Probenentnahme bei den Schlachttieren

Proben für die histologische Untersuchung sowie die Untersuchung mittels PCR

gewonnen. Die Entnahme letztgenannter Proben erfolgte unter sterilen Kautelen mit

für jede Probe individuellen Bestecken. Zusätzlich wurde die Lunge gewogen. Zur

Ermittlung des Organgewichtes wurden Herz, Zwerchfell, Aorta und Trachea (vor

Abgang des Bronchus trachealis) entfernt. Die für die PCR-Untersuchung

vorgesehenen Gewebeproben wurden zeitnah in flüssigem Stickstoff schockgefroren

und bis zur Weiterverarbeitung bei – 80°C gelagert. Die Zeitverzögerung zwischen

dem Tod des Tieres und dem Einfrieren der Proben betrug maximal zwei Stunden.

3.6 Probenbearbeitung

3.6.1 Allgemeine Maßnahmen

Alle Arbeitsschritte wurden in einem eigens der Probenbearbeitung vorbehaltenen

Raum mit ebenfalls nur für diesen Arbeitsplatz genutzten Geräten unter sterilen

Kautelen durchgeführt. Zwischen den Arbeitsschritten wurden die Arbeitsflächen mit

70%igem Ethanol gereinigt. Bei der Bearbeitung der Proben wurden ständig Latex-

Einweghandschuhe getragen und zwischen den Arbeitsschritten gewechselt. Zur

Herstellung von Puffern verwendete Glasgefäße und Gerätschaften wurden zuvor bei

180°C für 3h ausgebacken. Die Lösungen wurden nach der Herstellung in


ausgebackene Glasgefäße sterilfiltriert. Es wurden ausschließlich DNAse- und

RNAse-freie Mikroreaktionsgefäße verwendet, die vor der Verwendung bei 121°C

und 1,5 bar für 20 min autoklaviert wurden. Es wurden ebenfalls ausschließlich

sterile, DNAse- und RNAse-freie Pipettenspitzen mit Aerosolfilter verwendet.

3.6.2 Buffy-Coat-Präparation

Die Präparation des Buffy-Coat erfolgte durch Zentrifugation, anschließende Lyse

der Erythrozyten mit Tris-gepufferter 0,16 molarer Ammoniumchloridlösung und

zweimalige Waschung der Buffy-Coat-Zellen mit PBS (DEWAR und SHARP 2000,

pers. Mitteilung).

Das durch Li-Heparin gerinnungsgehemmte Vollblut wurde bei 3300 x g bei

Raumtemperatur zehn Minuten zentrifugiert. Die zwischen Erythrozyten und Plasma

deutlich sichtbare, weißliche Buffy-Coat-Schicht wurde mit einer sterilen 3 ml Plastik-

Einmalpasteurpipette (LiquipetteTM, Roth, Karlsruhe) abgenommen und in ein

ebenfalls steriles, unten spitz zulaufendes 15 ml Zentrifugenröhrchen (Greiner

CellStarR, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen) überführt. Das Röhrchen wurde

mit 10 – 15 ml Tris-gepufferter 0,16 molarer Ammoniumchloridlösung aufgefüllt,

geschwenkt und bei Raumtemperatur inkubiert, bis die enthaltenen Erythrozyten

lysiert waren (ca. zwei bis fünf Minuten). Anschließend wurden die Proben erneut bei

2200 x g zehn Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Hierdurch sammelten sich

die Buffy-Coat-Zellen als Pellet am Boden des Röhrchens. Der Überstand wurde

vorsichtig abgegossen und verworfen, und die Röhrchen kopfüber auf saugfähiges

Papier gestellt. Mit einer sterilen Plastik-Pasteurpipette wurde das Pellet in ca. 1 ml

PBS resuspendiert und in ein steriles 1,7 ml Mikroreaktionsgefäß überführt. Dieses

wurde für eine Minute bei Raumtemperatur bei ca. 16.000 x g zentrifugiert. Der

Überstand wurde mit einer Pipette abgenommen und verworfen und das entstandene

Pellet erneut in 1 ml PBS resuspendiert. Diese Suspension wurde jeweils auf zwei

sterile 1,7 ml Mikroreaktionsgefäße aufgeteilt. Es folgte ein zweiter


Zentrifugationsschritt bei 16.000 x g. Der Überstand wurde erneut abpipettiert und

verworfen. Die gewonnenen Pellet wurden bei –80°C eingefroren und bis zur

Weiterverarbeitung gelagert.

Vor der routinemäßigen Anwendung dieser Methode wurden die Leukozyten von 10

Blutproben in 0,9%iger Kochsalzlösung resuspendiert und mithilfe eines

Zytospotverfahrens durch zehnminütige Zentrifugation bei 200 x g und 20°C

(Varifuge 20 RS + Zytosystem; Fa. Heraeus Sepatech GmbH, Osterode) auf

Objektträger verbracht (GANTER 1996). Nach Färbung nach Pappenheim wurden

die Zellen hinsichtlich ihrer Integrität lichtmikroskopisch beurteilt.

3.6.3 Lungenspülproben

Die gewonnenen Spülproben wurden zunächst makroskopisch beurteilt. Hierzu

wurde die Menge der rückgewonnenen Spülflüssigkeit, deren Farbe (durch

eventuelle Schleimhautblutungen) sowie Beimengungen (evtl. Futterpartikel)

dokumentiert. Für den Grad der makroskopisch erkennbaren Blutbeimengungen

wurde eine subjektive Skala von 0 bis 3 (gegebenenfalls unter Verwendung von

Zwischenstufen) genutzt.

0 = makroskopisch ohne Blutbeimengungen

1 = makroskopisch geringgradige Blutbeimengungen

2 = makroskopisch mittelgradige Blutbeimengungen

3 = makroskopisch hochgradige Blutbeimengungen

Die Proben wurden anschließend in eine der Probenmenge entsprechende Anzahl

sterile, unten spitz zulaufende 15 ml Zentrifugenröhrchen (Greiner CellStarR, Greiner

Bio-One GmbH, Frickenhausen) umgefüllt und bei 4°C zehn Minuten bei 200 x g

zentrifugiert. Der Überstand wurde abgegossen und das am Boden des Röhrchens

befindliche Sediment jeweils im verbleibenden Restüberstand mit einer sterilen 3 ml


Plastik-Pasteurpipette (LiquipetteTM , steril, Roth, Karlsruhe) resuspendiert. Sofern

von einem Tier zu Beginn mehrere Zentrifugenröhrchen befüllt wurden, wurden die

resuspendierten Sedimente nun in einem Röhrchen gepoolt. Falls keine oder nur

eine geringgradige Blutbeimengung bestand, wurde das gepoolte Sediment mit einer

sterilen 3 ml Pasteurpipette in ein (je nach geschätzter Zellmenge auch zwei)

ebenfalls steriles 1,7 ml Mikroreaktionsgefäß überführt, bei ca. 16 000 x g

zentrifugiert und der Überstand abpipettiert. Das Pellet wurde bei –80°C eingefroren

und bis zur Weiterverarbeitung gelagert.

Bei größerer Blutbeimengung (2 oder 3) wurde nach dem Poolen des Sediments das

Zentrifugenröhrchen mit 10 bis 15 ml Tris-gepufferter 0,16 molare

Ammoniumchloridlösung aufgefüllt und zwei bis drei Minuten bei Raumtemperatur

inkubiert, bis die Erythrozyten lysiert waren. Anschließend wurden die Proben

entsprechend der Blutprobenpräparation bei 2200 x g zehn Minuten bei

Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abgegossen und

verworfen, und die Röhrchen kopfüber auf saugfähiges Papier gestellt. Mit einer

sterilen Plastik-Pasteurpipette wurde das Pellet in ca. 1 ml PBS resuspendiert und in

ein steriles 1,7 ml Mikroreaktionsgefäß überführt. Dieses wurde für eine Minute bei

Raumtemperatur bei ca. 16.000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde mit einer

Pipette abgenommen und verworfen und das entstandene Pellet erneut in 1 ml PBS

resuspendiert. Es folgte ein zweiter Zentrifugationsschritt bei 16.000 x g. Der

Überstand wurde erneut abpipettiert und verworfen. Das gewonnene Pellet wurde bei

–80°C eingefroren.

Falls Futterbeimengungen vorhanden waren, wurde die Probe vor Beginn zunächst

durch eine Doppelschicht Gaze filtriert und anschließend wie oben beschrieben

weiterbehandelt.

Vor der routinemäßigen Anwendung dieser Methode wurden die Zellpellets von zehn

Lungenspülproben in 0,9%iger Kochsalzlösung resuspendiert und mithilfe eines

Zytospotverfahrens durch zehnminütige Zentrifugation bei 200xg und 20°C (Varifuge

20 RS + Zytosystem; Fa. Heraeus Sepatech GmbH, Osterode) auf Objektträger


verbracht (GANTER 1996). Nach Färbung nach Pappenheim wurden die Zellen

hinsichtlich Ihrer Integrität mikroskopisch beurteilt.

3.6.4 Formalinfixierung, Paraffineinbettung, Herstellung von Gewebeschnitten und histologische Untersuchung

Die entnommenen Gewebeproben wurden mindestens 24 Stunden in

zehnprozentigem, neutral gepuffertem Formalin fixiert. Die Entwässerung in einer

aufsteigenden Alkoholreihe und Paraffineinbettung sowie die Herstellung und

Färbung der Gewebeschnitte erfolgten automatisiert bzw. durch das Personal des

Instituts für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Die histologische

Untersuchung der Gewebeschnitte von jeweils mindestens vier definierten

Lungenlokalisationen sowie des Lymphonodus mediastinalis caudalis in der HE-

Färbung erfolgte durch Herrn Dr. Michael Brügmann, Abteilung Pathologie des

Instituts für Tiergesundheit der LUFA Nordwest.

3.7 Gesamt-DNA-Isolierung


Diese Arbeiten erfolgten in denselben Räumlichkeiten wie die Probenaufbereitung.

Es wurden ebenfalls die unter 3.6.1 beschriebenen allgemeinen Maßnahmen

eingehalten.

3.7.2 Gesamt-DNA-Isolierung aus Buffy-Coat- und Lungenspülprobenzellen

Die Isolierung von Gesamt-DNA aus den genannten Proben erfolgte nach dem

Protokoll für Zellkulturzellen des DNeasyR Tissue Kit der Fa. Qiagen. Das Prinzip


dieses Kits beruht auf der Lyse von Gewebe bzw. Zellen mit anschließender

selektiver Bindung der DNA an die Membran der im Kit enthaltenen Säulen. Es

folgen zwei Wasch-Schritte und anschließend die Elution der gebundenen DNA

mithilfe eines Elutionspuffers. Alle Lösungen mit Ausnahme von PBS und Ethanol

sind im Kit enthalten.

Die tiefgefrorenen Zellpellets wurden aufgetaut und anschließend in 200 µl PBS

resuspendiert. Zu jeder Probe wurden 20 µl Proteinase K und 200 µl Puffer AL

zugegeben. Mit einem Vortex-Gerät wurden die Proben gut durchmischt und

anschließend für zehn Minuten bei 70°C in einem Wasserbad inkubiert.

Anschließend wurden 200 µl 99,8%iges Ethanol zugegeben und erneut gemischt.

Diese Mischung wurde auf eine im Kit enthaltene Säule gegeben und für eine Minute

bei ca. 16.000 x g zentrifugiert. Das Eluat und das Reaktionsgefäß wurden verworfen

und die Säule auf ein neues, ebenfalls im Kit enthaltenes Reaktionsgefäß gesteckt.

Auf die Säule wurden nun 500 µl Puffer AW1 (Waschpuffer 1) gegeben und erneut

bei ca. 16.000 x g zentrifugiert. Erneut wurden Eluat und Reaktionsgefäß verworfen,

die Säule auf ein neues Reaktionsgefäß verbracht und 500 µl Puffer AW2

(Waschpuffer 2) auf die Säule gegeben. Es folgte ein dreiminütiger

Zentrifugationsschritt bei ca. 16.000 x g. Eluat und Reaktionsgefäß wurden verworfen

und die Säule auf ein steriles, nicht im Lieferumfang des Kits enthaltenes, DNAse-

und RNAse-freies Mikroreaktionsgefäß verbracht. Von diesem war zunächst mit

einer mit 70%igem Ethanol gereinigten Schere der Deckel entfernt worden. Auf die

Säule wurden nun 200 µl Puffer AE (Elutionspuffer) gegeben und für eine Minute bei

Raumtemperatur inkubiert. Nach erneuter Zentrifugation bei ca. 16.000 x g für eine

Minute wurde die Säule verworfen und das Eluat mit der gelösten DNA in ein neues,

1,7 ml Mikroreaktionsgefäß überführt. Nach der Konzentrations- und

Reinheitsbestimmung über die OD260- und OD280-Messung im Spektrophotometer (s.

3.2.7.5) wurde die DNA bei –20°C eingefroren.


3.7.3 Gesamt-DNA-Isolierung aus Gewebeproben

Gemäß des Protokolls für Gewebeproben des DNeasyR Tissue Kit wurde mit sterilen

Bestecken nach Auftauen der Probe ein kleines Gewebestück (max 25 mg) in ein

steriles, DNAse- und RNAse-freies 1,7ml Mikroreaktionsgefäß verbracht. Es wurden

180 µl Puffer ATL und 20 µl Proteinase K zugegeben und die Proben mithilfe eines

Vortex gut durchmischt. Anschließend wurden sie bei 55°C in einem

Schüttelwasserbad für mehrere Stunden bis zur vollständigen Auflösung des

Gewebestückes inkubiert. Während dieser Zeit wurden die Proben wiederholt mit

einem Vortex-Gerät gut durchmischt. Nach vollständiger Lyse des Gewebes wurden

200 µl Puffer AL zugegeben, erneut gemischt und bei 70°C für zehn Minuten im

Wasserbad inkubiert. Es folgte die Zugabe von 200 µl 99,8%igem Ethanol und die

Weiterpräparation analog dem oben beschriebenen Protokoll für die Zellproben.

3.7.4 Präparationskontrollen

Bei jeder DNA-Isolierung wurden jeweils eine positive und eine negative

Kontrollprobe mitgeführt und in gleicher Weise wie die anderen zu präparierenden

Proben behandelt. Für die Zellpräparationen handelte es sich hierbei routinemäßig

um BAL-Zellen eines klinisch an Lungenadenomatose erkrankten Schafes aus der

Schneverdinger Herde (Positivkontrolle) und um Buffy-Coat eines klinisch gesunden

Schafes aus einer durch die Schlachtlungenuntersuchung und den Schaf- und

Ziegengesundheitsdienst Hannover langjährig kontrollierten, LA-unverdächtigen

Herde (Negativkontrolle). Für die Isolierung von DNA aus Gewebe wurde als

Positivkontrolle routinemäßig Tumorgewebe eines an Lungenadenomatose

erkrankten Schafes und als Negativkontrolle Gewebe des caudalen mediastinalen

Lymphknotens eines klinisch gesunden Schafes aus einer kontrollierten, LA-

unverdächtigen Herde eingesetzt. BAL-Zellen und Tumorgewebe bzw. Buffy-Coat

und Lymphknoten stammten jeweils von ein und demselben Tier. Die Proben waren

zu Beginn der Arbeit entnommen, aliquotiert und bei -80°C gelagert worden. Diese


Präparationskontrollen wurden im folgenden gemeinsam mit den präparierten Proben

durch alle weiteren Schritte mitgeführt. Für besondere Fragestellungen wurden als

Negativkontrollen zudem Lungen- und Lymphknotengewebe und Leukozyten von

klinisch gesunden isländischen Schafen genutzt, die freundlicherweise von Herrn Dr. G. Georgsson (Institut für experimentelle Pathologie, Keldur-Universität, Reykjavik,

Island) zur Verfügung gestellt wurden. Zudem standen Blutproben gesunder Rinder

(Herkunft: Physiologisches Institut der Tierärztlichen Hochschule) sowie

Lungengewebe eines Rindes (Herkunft: Institut für Pathologie der Tierärztlichen

Hochschule) zur Verfügung.

3.7.5 Konzentrations- und Reinheitsbestimmung der DNA

Nach der Elution der DNA wurde in einem sterilen, DNAse- und RNAse-freien

Mikroreaktionsgefäß eine Verdünnung 1:20 hergestellt. Hierzu wurden 30 µl der

gelösten DNA mit 570 µl DNAse-freiem Wasser (Roth, Karlsruhe) vermischt. Als

Leerwert wurde eine Mischung aus 30 µl Puffer AE und 570 µl Wasser verwendet.

Die photometrische Messung der optischen Dichte (OD) erfolgte mit einem Volumen

von 500 µl in einer Quarzküvette bei einer Wellenlänge von 260 und 280 nm. Die

Reinheit wurde durch Bildung des Quotienten OD260/OD280 bestimmt. Die

Berechnung der Konzentration der verdünnten Lösung erfolgte durch Multiplikation

der OD260 mit dem Faktor 50, da eine OD von 1 einer Konzentration von 50 ng/µl

doppelsträngiger DNA entspricht (SAMBROOK et al. 1989). Durch Multiplikation

dieses Wertes mit dem Verdünnungsfaktor 20 wurde auf die Ausgangskonzentration

der DNA-Lösung in ng/µl hochgerechnet.


3.8 Molekularbiologische Untersuchungen


Alle Arbeitsschritte wurden unter sterilen Kautelen unter größtmöglicher Vorsicht zur

Vermeidung einer Kontamination mit DNAsen oder Fremd-DNA durchgeführt. Es

wurde eine strikte räumliche Trennung zwischen den fünf Arbeitsbereichen

1.) Probenbearbeitung und DNA-Isolierung

2.) Arbeiten mit Plasmid-DNA und JS7-Zellen (Herstellung und Aliquotieren von

Positivkontrollen)

3.) Herstellung des Mastermix

4.) Probenzugabe und Amplifikation sowie

5.) Elektrophorese

eingehalten. Zwischen den Räumen wurden die Arbeitskittel gewechselt. Es standen

an jedem Arbeitsplatz eigene Geräte und Materialien zur Verfügung. Für alle

Arbeitsschritte wurden ungepuderte Einweg-Latexhandschuhe getragen und

zwischen den Arbeitsschritten gewechselt. Die Arbeitsflächen wurden zwischen den

Arbeitsschritten mit 70%igem Ethanol gereinigt. Die zur Herstellung des PCR-

Reaktionsgemisches genutzte Sterilwerkbank wurde regelmäßig für 30 Minuten mit

UV-Licht bestrahlt. Es wurden ausschließlich DNAse- und RNAse-freie

Mikroreaktionsgefäße verwendet, die vor der Verwendung bei 121°C und 1,5 bar für

20 min autoklaviert worden waren. Es wurden ebenfalls ausschließlich sterile,

DNAse- und RNAse-freie Pipettenspitzen mit Aerosolfilter verwendet. Alle Zutaten

des Mastermixes wurden in kleinen Mengen aliquotiert. Es wurde für die

Durchführung der PCR und Verdünnung der Primer ausschließlich kommerziell

erhältliches Wasser für die Molekularbiologie (bidest. und Diethylpyrocarbonat-

(DEPC)-behandelt) verwendet. Bei allen PCR-Amplifikationen wurden in jeder

Reaktionscharge mindestens zwei Negativkontrollen in Form von DEPC-

behandeltem Wasser sowie die negative Präparationskontrolle mitgeführt. In jeder

Reaktionscharge wurden zudem drei Positivkontrollen in Form von Plasmid-DNA in


drei festen Verdünnungsstufen (Grenzwert-Positivkontrollen, siehe 3.8.4) sowie die

positive Präparationskontrolle mitgeführt.

Alle Kontrollen wurden stets wie die übrigen Proben behandelt. Alle Proben wurden

im Dreifachansatz untersucht. Eine Ausnahme bildeten die Lungenspülproben der

Döhler Herde aus dem Jahr 2003. Diese wurden unter Anleitung der Autorin durch

Frau Sabine Uhlenbruck (Klinik für kleine Klauentiere der Tierärztlichen Hochschule)

nach derselben Methode, jedoch lediglich im Doppelansatz untersucht.

3.8.2 Nachweis von JSRV mittels PCR (U3 LTR PCR)

Die verwendeten Primer entstammen der U3-Region der long terminal repeats (LTR).

Die PCR wird im folgenden daher als U3 LTR PCR bezeichnet. Zur Erhöhung der

Sensitivität ist ihr eine heminested (hn) PCR nachgeschaltet (PALMARINI et al.

1996b).

Die Untersuchung der Proben erfolgte mit einigen von DEWAR und SHARP (2000,

pers. Mitteilung) durchgeführten Modifikationen nach der Methode von PALMARINI

et al. (1996b) mit dem Ziel des Nachweises proviraler DNA. Als Amplifikationsvorlage

wurden 800 – 1000 ng Gesamt-DNA in einem Reaktionsvolumen von 50µl

eingesetzt. Das maximal eingesetzte Probenvolumen betrug 25 µl. Unterschiedliche

Probenvolumina wurden durch Vorlage von Wasser in das entsprechende

Reaktionsgefäß ausgeglichen, so dass sich das Volumen des Mastermixes als die

Differenz zwischen dem Gesamtreaktionsvolumen von 50 µl und dem größten

Probenvolumen errechnete.

Das Ansetzen und Aliquotieren des Mastermixes erfolgte unter einer Sterilwerkbank

in einem eigens diesen Arbeiten vorbehaltenen Raum. Diese wurde regelmäßig für

30 Minuten mit UV-Licht bestrahlt. Entsprechend der jeweils einzusetzenden

Probenmenge wurde zunächst in 0,2 ml PCR-Mikroreaktionsgefäße das

entsprechende Ausgleichsvolumen an Wasser vorgelegt. Der Ansatz des Mastermix

erfolgte in autoklavierten, DNAse- und RNAse-freien 2 ml Mikroreaktionsgefäßen.


Die Zutaten wurden durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren gemischt und der

fertige Mastermix auf die PCR-Reaktionsgefäße verteilt. Pro Reaktionscharge wurde

an diesem Arbeitsplatz eine Negativkontrolle in Form von 5 µl DEPC-behandeltem

Aqua bidest. angesetzt und das Reaktionsgefäß unter der Sterilwerkbank

verschlossen. Die Zugabe der Proben einschließlich der positiven und negativen

Präparationskontrollen, der Plasmidkontrollen (s.u.) und einer weiteren Wasser-

Negativkontrolle (Volumen = 5 µl) erfolgte in einem anderen Raum, in dem auch die

Amplifikation stattfand. Die Reaktionskomponenten der U3 LTR PCR und das Zeit-

Temperaturprogramm sind nachfolgend in Tabelle 5 bis 7 aufgeführt. Das zu

erwartende Amplifikat hat eine Größe von 176 bp. Die Primer entsprachen der

Veröffentlichung von PALMARINI et al. (1996b). Sie wurden durch die Firma Roth

(Karlsruhe) synthetisiert. Die Berechnung der Schmelzpunkte erfolgte durch die

Herstellungsfirma.

Tabelle 5: Bezeichnung, Verwendung, Sequenz (nach PALMARINI et al. 1996b) und Schmelzpunkte der Primer für die U3 LTR PCR Bezeich-

nung Verwendung Sequenz (5’=> 3’) Schmelzpunkt

G/C-Regel/2+4-Regel

P-I Forward primer

U3 LTR PCR

TGG GAG CTC TTT GGC AAA AGC

49,2°C / 64°C

P-III

Reverse Primer

U3 LTR PCR

CAC CGG ATT TTT ACA CAA TCA

CCG G

52,6°C / 74°C


Tabelle 6: Reagenzien für die U3 LTR PCR Reagenzien eingesetzte

Konzentration Eingesetztes Volumen pro Reaktionsansatz

10 x PCR-Puffer 10 x 5 µl

MgCl2 25 mmol/l 2µl

Primer P-I 10 mmol/l 1 µl

Primer P-III 10 mmol/l 1 µl

dNTP-Stammlösung 10 mmol/l je dNTP 1 µl

Polymerase: Qiagen

HotStarTaqTM

5 units/µl 0,25 µl

Aqua bidest. ad 50 µl

Als Enzym wurde eine Hot-Start Polymerase verwendet (Qiagen HotStarTaqTM, Fa.

Qiagen, Hilden), so dass den Reaktionszyklen eine initiale Phase der

Enzymaktivierung bei 94°C vorangestellt ist.

Tabelle 7: Zeit-Temperaturprogramm für die U3 LTR PCR Programmschritt Temperatur Dauer Zyklenzahl

Initiale Denaturierung und

Enzymaktivierung

94°C 16 min -

Beginn Zyklus

Denaturierung 94°C 30 sec

Anlagerung 59°C 30 sec

Verlängerung 72°C 30 sec

34

Wiederholungen

Ende Zyklus

Finale Verlängerung 72°C 5 min -

Warten bis Entnahme 6°C unendlich -


3.8.3 Heminested (hn) PCR

Alle Proben, die in der U3 LTR PCR ein negatives oder fraglich positives Ergebnis

(d.h. eine sehr schwache/kaum sichtbare Bande der erwarteten Größe) zeigten,

wurden mittels hn PCR (PALMARINI et al. 1996b) nachuntersucht. Als Template

wurden hierfür 2 µl des Amplifikates der U3 LTR PCR verwendet. Das

Mastermixvolumen betrug konstant 48 µl. Die Arbeitsschritte erfolgten in der gleichen

Weise und unter denselben Bedingungen wie für die U3 LTR PCR beschrieben. Als

Negativkontrolle wurden unter der Sterilwerkbank 2 µl Aqua bidest. eingesetzt und

das Reaktionsgefäß verschlossen. Die Zugabe der Proben erfolgte auch hier in dem

separaten Raum, in dem die Amplifikation stattfand. An diesem Arbeitsplatz wurde

eine zweite Negativkontrolle in Form von 2 µl Aqua bidest. angesetzt. Zudem wurden

die beiden Wasser-Negativkontrollen der U3 LTR PCR sowie die negative

Präparationskontrolle wie alle anderen Proben mit der hn PCR nachuntersucht. Als

Positivkontrollen wurden mindestens die Amplifikate der zwei Plasmidverdünnungen

10-11 und 10-12 (siehe unten) eingesetzt. Das Amplifikat der im ersten Durchlauf

bereits stark positiven Präparations-Positivkontrolle wurde in der hn PCR ebenso wie

alle anderen in der U3 LTR PCR bereits deutlich positiven Proben nicht

nachuntersucht. Das zu erwartende Amplifikat der hn PCR hat eine Größe von 133

bp. Die Primer entsprachen der Veröffentlichung von PALMARINI et al. (1996b). Sie

wurden ebenfalls durch die Firma Roth (Karlsruhe) synthetisiert. Die Berechnung der

Schmelzpunkte erfolgte durch die Herstellungsfirma. Die verwendeten Primer,

Reagenzien und das Zeit-Temperaturprogramm für die hn PCR sind den Tabellen 8

bis 10 zu entnehmen.


Tabelle 8: Bezeichnung, Verwendung, Sequenz (nach PALMARINI et al. 1996b) und Schmelzpunkte der Primer der hn PCR Bezeich-


G/C-Regel/2+4-Regel

P-I Forward primer

hn PCR

TGG GAG CTC TTT GGC AAA

AGC

49,2°C / 64°C

P-VI

Reverse Primer hn PCR

TGA TAT TTC TGT GAA GCA GTG

CC

48,4°C / 66°C

Tabelle 9: Reagenzien für die hn PCR Reagenzien eingesetzte



MgCl2 25 mmol/l 2µl

Primer P-I 10 mmol/l 1 µl

Primer P-VI 10 mmol/l 1 µl


Polymerase: Qiagen

HotStarTaqTM

5 units/µl 0,25 µl



Tabelle 10: Zeit-Temperaturprogramm für die hn PCR

Programmschritt Temperatur Dauer Zyklenzahl


Enzymaktivierung

94°C 16 min -

Beginn Zyklus


Anlagerung 57°C 1 min

Verlängerung 72°C 1 min

34

Wiederholungen

Ende Zyklus



3.8.4 Grenzwert-Positivkontrollen

Um laufend die Sensitivität der PCR-Reaktion zu überprüfen, wurden in jeder

Reaktionscharge insgesamt drei Verdünnungsstufen eines die volle provirale

Sequenz von JSRV enthaltenen Plasmids pCMV2JS21 (PALMARINI et al. 1999a)

eingesetzt. Dieses wurde freundlicherweise von Dr. J. M. Sharp, Moredun Research

Institute, Penicuik, Schottland zur Verfügung gestellt. Ausgehend von einer

gemessenen Ausgangskonzentration der Plasmid-Stammlösung von 2,95 µg DNA/µl

und einer Gesamtmolekülgröße von 11,8 kb (Plasmid 3 kb, Insert 8,8 kb) wurde eine

Konzentration von 2,275 x 1011 Plasmidmolekülen pro µl Stammlösung errechnet

(DEWAR 2000, pers. Mitteilung).

Bis zum Erreichen der Verdünnungsstufe 10-8 wurden die Verdünnungsstufen jeweils

aus 10 µl Stammlösung bzw. vorangegangener Verdünnungsstufe und 990 µl TE-

Puffer hergestellt. Hierdurch wurde mit einem Arbeitsschritt eine Verdünnung um 2

Zehnerpotenzen erreicht. Zwischen jedem Verdünnungsschritt wurden die Lösungen

mithilfe eines Vortex gründlich durchmischt und kurz anzentrifugiert. Zur Herstellung


der Verdünnungsstufen 10-9, 10-10, 10-11 und 10-12 wurden jeweils 100µl der

vorangegangenen Verdünnungsstufe mit 900µl TE-Puffer vermischt. Die

Verdünnungsstufen 10-9, 10-11 und 10-12 wurden routinemäßig als Grenzwert-

Positivkontrollen in jeder PCR-Reaktionscharge eingesetzt. Für diesen Einsatz

wurden sie für die bessere Pipettierbarkeit zunächst 1:5 in TE-Puffer verdünnt,

aliquotiert und bei –20°C eingefroren. Jedes Aliquot wurde nur einmal verwendet und

nach der Entnahme von 5 µl als Positivkontrolle verworfen. Ein positives Ergebnis

war nach DEWAR (2000, pers. Mitteilung) in 100% der Fälle von den

Verdünnungsstufen 10-9 und 10-11 zu erwarten. War das nicht der Fall, so wurde das

Ergebnis der entsprechenden Reaktionscharge nicht gewertet und die Untersuchung

der betroffenen Proben wiederholt. In Tabelle 11 sind die verwendeten

Verdünnungsstufen und die in dem als Kontrolle eingesetzten Volumen von 5µl der

1:5 verdünnten Lösungen (entsprechend 1 µl der Ausgangslösungen) rechnerisch

enthaltene Anzahl der Plasmidmoleküle dargestellt.

Tabelle 11: Rechnerischer Gehalt an Plasmidmolekülen in 5 µl 1:5 verdünnter Plasmidlösung Verdünnungsstufe Moleküle pro 5µl 1:5 verdünnter Lösung

10-9 2,275 x 102 (= 227,5)

10-11 2,275 x 100 (= 2,275)

10-12 2,275 x 10-1 (= 0,2275)

3.8.5 Visualisierung der PCR-Produkte im Agarosegel

Agarose (SeaKemR LE Agarose, Biozym, Hess. Oldendorf) für ein 2%iges (m/V) Gel

wurde in einen Erlenmeyerkolben abgewogen, mit dem entsprechenden Volumen 1x

TBE-Puffer gemischt und im Mikrowellenherd bei 800 W Leistung erhitzt, bis die

Agarose vollständig gelöst war. Nach Abkühlung auf ca. 55 - 65°C wurde die Lösung

mit 5 µl GelStarR Nukleinsäurefarbstoff (Biozym) pro 50 ml Agaroselösung versetzt,


gut durchmischt und blasenfrei in eine vorbereitete Elektrophoresekammer

gegossen. Die Gele wurde stets kurz vor Gebrauch bzw. frühestens am Vorabend

angesetzt und über Nacht in Frischhaltefolie im Kühlschrank gelagert. Als Laufpuffer

wurde 1x TBE verwendet. Zu den PCR-Produkten wurden jeweils 4,5µl Glycerin-

Farbstoffpuffer pipettiert und durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren gemischt. 20

µl dieser Mischung wurde jeweils in die Geltaschen aufgetragen. Als Größenmarker

wurde ein 100 bp-Marker verwendet. 2 µl dieses Längenmarkers wurden mit 2 µl des

Glycerin-Farbstoffpuffers und 18µl 1x TBE vermischt und 20 µl dieser Mischung in

die erste Geltasche gegeben. Die PCR-Produkte wurden je nach Größe des Gels bei

ca. 60 bzw. 90 Volt für ca. eineinhalb Stunden im Agarosegel elektrophoretisch der

Größe nach aufgetrennt. Zur Dokumentation wurden die Gele mithilfe eines

Blaulichttransilluminators bei 460-480 nm durchleuchtet und mit einem digitalen

Aufnahmesystem photographiert und digital gespeichert.

3.9 Validierung der PCR

Neben dem routinemäßigen Mitführen der oben genannten Positiv- und

Negativkontrollen wurden weitere Untersuchungen zum Ausschluß falsch-negativer

und falsch-positiver Resultate durchgeführt. Die Nachweisgrenze der PCR wurde

durch den Zusatz einer bekannten Menge Plasmid zu der Proben-DNA sowie die

Nachweisgrenze des Gesamtsystems einschließlich der vorgeschalteten Schritte der

Probenaufbereitung und DNA-Extraktion durch den Zusatz JSRV-positiver Zellen zu

negativen Proben (Rinderblut) bestimmt. Die Spezifität der nachgewiesenen Banden

wurde durch Southern-Blot-Hybridisierung und Sequenzierung des PCR-Produktes

überprüft.


3.9.1 Template-Kontrolluntersuchungen

Um bei Proben, die in dreimaliger Untersuchung mittels U3 LTR PCR und hn PCR

ein negatives Ergebnis erbracht hatten, ein falsch-negatives Ergebnis durch

mangelhafte DNA-Qualität oder die Präsenz von PCR-Inhibitoren auszuschließen,

wurden diese alle auf die Nachweisbarkeit einer spezifischen Sequenz der

Glycerinaldehyd–3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) untersucht. Die

Untersuchungen erfolgten im Einfachansatz nach einer Methode von DEWAR und

SHARP (2000, pers. Mitteilung). Als Amplifikationsvorlage wurden jeweils ca. 100 ng

DNA verwendet. Unterschiedliche Probenvolumina wurden entsprechend der U3

LTR PCR durch die Vorlage eines entsprechenden Ausgleichsvolumens an Wasser

ausgeglichen. Das Gesamtvolumen des Reaktionsansatzes betrug auch hier 50 µl.

Es wurden entsprechend der U3 LTR PCR jeweils zwei Negativkontrollen in Form

von 5 µl Aqua bidest. mitgeführt, von denen eine im Arbeitsbereich des Herstellens

des Mastermixes, die zweite beim Zupipettieren der Proben angesetzt wurde. Die

Reaktionskomponenten der PCR und das Zeit-Temperaturprogramm sind

nachfolgend (Tabelle 12 bis 14) aufgeführt. Die Schmelzpunkte der Primer wurden

durch die Herstellungsfirma Roth (Karlsruhe) berechnet. Das für jede Probe zu

erwartende Amplifikat hat eine Größe von 388 bp (DEWAR 2000, pers. Mittteilung).

Tabelle 12: Bezeichnung, Verwendung, Sequenz (nach DEWAR und SHARP 2000, pers. Mitteilung) und Schmelzpunkte der Primer für die Glycerinaldehyd–3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH)-PCR Bezeich-


G/C-Regel/2+4-Regel

Primer I Forward primer

GAPDH PCR

TGT TCC AGT ATG ATT CCA

CCC

47,3°C / 62°C

Primer II

Reverse Primer

GAPDH PCR

ATA AGT CCC TCC ACG ATG CC

48,7°C / 62°C


Tabelle 13: Reagenzien für die GAPDH PCR Reagenzien eingesetzte



Primer I 5 mmol/l 1 µl

Primer II 5 mmol/l 1 µl


Polymerase: Qiagen

HotStarTaqTM

5 units / µl 0,25 µl


Tab 14: Zeit-Temperaturprogramm für die GAPDH PCR Programmschritt Temperatur Dauer Zyklenzahl


Enzymaktivierung

94°C 15 min -

Beginn Zyklus


Anlagerung 54°C 1 min

Verlängerung 72°C 1:30min

29

Wiederholungen

Ende Zyklus



3.9.2 Bestimmung der Nachweisgrenze der PCR am Modell mit Plasmid

versetzter DNA

Da die Zielsequenz der GAPDH in jeder Zelle ubiquitär ist, werden durch den

Nachweis eines solchen housekeeping-Gens Sensitivitätsprobleme beim Nachweis


geringer Mengen der Zielsequenz nicht detektiert. Durch eine Untersuchung mit

Plasmid versetzter Proben (DNA aus Blut, BAL und Gewebe) wurde die

Nachweisgrenze der PCR vor dem Hintergrund von 800 – 1000 ng genomischer

DNA bestimmt. Zugleich dienten diese Versuche der Untersuchung auf die

Anwesenheit inhibitorischer Substanzen in den Proben, die möglicherweise lediglich

den Nachweis geringer Mengen der Zielsequenz negativ beeinflussen.

Exemplarisch wurde an 29 willkürlich ausgewählten, in dreimaliger Untersuchung in

U3 LTR PCR und hn PCR negativen Gewebeproben (24 Lymphknoten- und 5

Lungengewebeproben) sowie an 32 ebenfalls negativen Zellproben (15 Buffy-Coat-

und 17 BAL-Proben) eine derartige Inhibitionskontrolle durchgeführt. Hierzu wurden

jeweils 800 – 1000 ng DNA der jeweiligen Probe mit jeweils 5 µl der drei als

Grenzwert-Positivkontrollen verwendeten, 1:5 verdünnten Plasmidverdünnungs-

stufen 10-9, 10-11 und 10-12 versetzt. Zusätzlich wurde pro Probe ein erneuter Ansatz

ohne Plasmidzusatz mitgeführt. Das Gesamtprobenvolumen (Proben-DNA und

Plasmidverdünnung) betrug nicht mehr als 25µl. Die Durchführung der Untersuchung

einschließlich Art und Anzahl der mitgeführten Positiv- und Negativkontrollen

entsprach dem oben beschriebenen Protokoll für die U3 LTR und hn PCR. Zusätzlich

wurden sieben weitere Blut- und vier weitere BAL-Proben lediglich mit den ersten

beiden Verdünnungsstufen versetzt und mittels U3 LTR PCR nach obenstehendem

Protokoll untersucht.

3.9.3 Untersuchungen zur Bestimmung der Nachweisgrenze des Gesamt-systems (Probenbearbeitung / DNA-Extraktion / PCR-Untersuchung) am Modell mit JS7-Zellen versetzter Rinderblutproben

Da die Nachweisgrenze einer PCR auch wesentlich durch die Art der

Probenaufbereitung beeinflußt wird (SCHEIBNER 2000), wurde am Modell künstlich

mit einer bekannten Anzahl JSRV-positiver Zellen versetzter Rinderblutproben die

Nachweisgrenze des Gesamtsystems untersucht und mit einem alternativen


Verfahren der DNA-Extraktion aus Vollblut verglichen. Da Lungenadenomatose in

Deutschland und Schottland endemisch ist, ist die Beschaffung von frischen

Blutproben definitiv LA-negativer Schafe aus kontrollierten Beständen sehr schwierig

und stets mit einem Restrisiko behaftet. Aus diesem Grund wurde für diese Versuche

als Negativprobe Rinderblut verwendet. Dieses konnte in größeren Mengen aus

bekannter Herkunft stets frisch beschafft werden, und aufgrund der fehlenden

Empfänglichkeit von Rindern für eine Infektion mit JSRV erfüllte es die

Anforderungen an sicher negatives Probenmaterial. Für die Versuche wurden Zellen

einer permanenten Lungenadenomatose-Tumorzellinie (JS7-Zellen) verwendet. Jede

JS7-Zelle enthält eine Kopie der kompletten proviralen Sequenz von JSRV (DE

MARTINI et al. 2001). Diese Zellen wurden freundlicherweise ebenfalls von Dr. J. M.

Sharp, Moredun Research Institute, Penicuik, Schottland zur Verfügung gestellt.

3.9.3.1 Vorversuche zum Zusatz von JS7-Zellen zu Rinderblutproben

A Vergleich der Isolierung von Gesamt-DNA aus Buffy-Coat mit einer Methode zur Gewinnung von DNA aus Vollblut

In Vorabuntersuchungen an einer kleinen Probenzahl wurde die oben beschriebene

Methode zur Gewinnung von Buffy Coat aus gerinnungsgehemmtem Vollblut mit

anschließender Isolierung von Gesamt-DNA mit dem Qiagen Kit mit einer Methode

zur Isolierung von DNA aus Vollblut verglichen. Diese Untersuchungen wurden durch

die Autorin am Moredun Research Institute (MRI) in Penicuik, Schottland

durchgeführt. Hinsichtlich der Ausstattung des Labors und der allgemeinen

Maßnahmen waren die Untersuchungsbedingungen dort vergleichbar mit denen an

der Klinik für kleine Klauentiere. Die verwendeten Geräte und Reagenzien sind im

Anhang nicht detailliert aufgeführt, da ihre Verwendung sich auf diesen und weitere

nicht im Detail dargestellte Vorversuche beschränkte.


B Probenentnahme, Zusatz von JS7-Zellen und Buffy-Coat-Präparation

Von zwei klinisch gesunden Rindern (Proben 1 und 2) wurden in Li-heparinisierten

Vacutainern insgesamt jeweils ca. 30 ml Blut entnommen. Durch das Personal des

MRI wurde an diesen Proben eine Leukozytenzählung vorgenommen. Das Blut jedes

Rindes wurde zu jeweils 7 ml auf vier sterile Zentrifugenröhrchen verteilt. Die

Gesamtzahl der in 7 ml Blut enthaltenen Leukozyten wurde errechnet und diese

Blutproben wurden mit einer bekannten Anzahl JSRV-positiver Zellen aus einer

permanenten Tumorzellinie (JS7-Zellen, DE MARTINI et al. 2001) im Verhältnis

1:100, 1:1.000 und 1:10.000 versetzt. Die bei – 70°C in Pellets zu jeweils 6,125 x 105

Zellen aliquotiert gelagerten JS7-Zellen (COUSENS 2001, pers. Mitteilung) wurden

hierfür aufgetaut und in 500 µl PBS resuspendiert, so dass man eine Konzentration

von 12,25 x 105 Zellen pro ml erhielt. Die Zugabe der benötigten Zellmenge zu den

Rinderblutproben erfolgte durch Zupipettieren eines entsprechenden Volumens

dieser Stammsuspension. Jede JS7-Zelle enthält eine Kopie der proviralen DNA-

Sequenz von JSRV (DE MARTINI et al. 2001). Dem vierten Aliquot jeder Probe

wurden keine JS7-Zellen zugesetzt. Die Proben wurden anschließend durch

vorsichtiges mehrmaliges Schwenken gemischt. Aus jedem Aliquot jeder Probe

wurden anschließend 500 µl entnommen und für die DNA-Isolierung aus Vollblut in

autoklavierte 2 ml Mikroreaktionsgefäße überführt. Die restlichen 6,5 ml der

jeweiligen Proben wurden dem oben beschriebenen Verfahren zur Buffy-Coat-

Isolation unterworfen. Parallel dazu wurden vier vorab hergestellte Buffy-Coat-Pellets

mit bekannter Zellzahl eines weiteren gesunden Rindes (Probe 3) ebenfalls in

Verhältnis 1:100, 1:1.000 und 1:10.000 mit JS7-Zellen versetzt. Das vierte Aliquot

verblieb auch hier ohne Zusatz. Aus diesen und denen aus den anderen acht Proben

hergestellten Buffy-Coat-Pellets wurde routinemäßig mit dem DNeasyR Tissue Kit

Gesamt-DNA isoliert und in 400µl Puffer AE eluiert.


C Isolierung von Gesamt-DNA aus Vollblut

Die Isolierung erfolgte mit der DNAzolR-Methode (Helena Biosciences, Sunderland,

U.K.) im wesentlichen nach den Angaben des Herstellers mit leichten Modifikationen

durch WALSH (2001, pers. Mitteilung). 500 µl Vollblut wurden in einem 2 ml

Mikroreaktionsgefäß unter einem Abzug mit 1 ml DNAzolR BD (enthält Guanidinium

Thiozyanat) versetzt und mit einem Vortex gemischt. Anschließend wurden 400 µl

Isopropanol zugegeben, die Probe erneut gevortext und für fünf Minuten bei

Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluß wurde die Probe für sechs Minuten bei

Raumtemperatur bei 6.000 x g zentrifugiert. Mit einer gestopften Glas-Mikropipette

wurde der Überstand entfernt. Für jede Probe wurde eine neue Pipette verwendet.

Es wurden erneut 500 µl DNAzolR BD zugegeben und mit einem Vortex-Gerät kräftig

gemischt. Anschließend wurde bei 9.000x g für fünf Minuten bei Raumtemperatur

zentrifugiert. Der Überstand wurde erneut mit einer gestopften Glasmikropipette

abgenommen. Eventuell im Deckel des Reaktionsgefäßes zurückgebliebene

Flüssigkeits- oder Blutreste wurden mit einem Zellstofftuch abgewischt. Zu dem am

Boden des Reaktionsgefäßes sichtbaren Pellet wurde 1 ml 75%iges Ethanol

zugegeben und anschließend gemischt. Im Anschluß wurde erneut bei 16.000 x g für

fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Das Ethanol wurde dekantiert und

restliche Flüssigkeit vorsichtig mit einer Mikropipette abgenommen. Das

Reaktionsgefäß wurde mit offenem Deckel für zwei Minuten stehen gelassen, um

restliches Ethanol verdampfen zu lassen. Danach wurden 200 µl Aqua bidest.

zugegeben, gemischt und zur Unterstützung der Lösung des DNA-Pellets für eine

Stunde in einem Wasserbad bei 60°C inkubiert. Während dieser Zeit wurden die

Proben mehrfach mit einem Vortex-Gerät gemischt.

D DNA-Konzentrationsbestimmung und PCR-Untersuchung

Die Konzentrations- und Reinheitsbestimmung der nach beiden Methoden

präparierten Proben erfolgte wie oben beschrieben durch photometrische


Bestimmung der OD260 und OD280 in einer Verdünnung von 1:10 mit einem

Messvolumen von 100 µl. Es wurden jeweils 800 – 1000 ng DNA in der U3 LTR PCR

wie oben beschrieben eingesetzt. Die Visualisierung der PCR-Produkte erfolgte nach

elektrophoretischer Auftrennung in einem zweiprozentigen Agarosegel durch

Färbung mit Ethidiumbromid. Als Laufpuffer wurde 1 x TBE verwendet.

3.9.3.2 Detaillierte Bestimmung der Nachweisgrenze des Gesamtsystems

Obige Vorversuche wurden zur genauen Bestimmung der Nachweisgrenze des

Gesamtsystems, bestehend aus Buffy-Coat-Präparation, DNA-Isolierung mit dem

Qiagen Kit und anschließender U3 LTR und hn PCR im Labor der Klinik für kleine

Klauentiere weitergeführt. Hierzu wurden in 10 ml Li-heparinisierten Vacutainern

Blutproben einer gesunden Kuh (Herkunft: Physiologisches Institut der Tierärztlichen

Hochschule Hannover) entnommen. Mit einem für Rinderblut geeichten

Blutanalysegerätes (Modell MEK – 6108G, Nihon Kohden, Bad Homburg) wurde in

zweimaliger Messung die Gesamtleukozytenzahl bestimmt. Als Grundlage für die

weiteren Berechnungen wurde der Mittelwert aus beiden Messungen verwendet. Das

Rinderblut wurde mit einer sterilen Plastik-Pasteurpipette zu jeweils 7 ml auf 17

sterile Zentrifugenröhrchen verteilt. Wie oben beschrieben wurde aus bei –70°C

gelagerten JS7-Zellen (DE MARTINI et al. 2001) eine Zellsuspension mit einem

Zellgehalt von 12,25 x 105 Zellen pro ml PBS hergestellt und entsprechende

Volumina dieser Stammsuspension genutzt, um den Rinderblutproben JSRV-haltige

Zellen im Verhältnis 1:100, 1:1.000, 1:2.000, 1:3.000 usw. bis 1:15.000 zuzusetzen.

Eine Blutprobe blieb ohne Zusatz von JS7-Zellen. Rinderblut und zugefügte JS7-

Zellen wurden durch Schwenken der Röhrchen gründlich gemischt und wie oben

beschrieben routinemäßig der Buffy-Coat-Präparation unterworfen. Der zweimalig

mit PBS gewaschene Buffy-Coat wurde gleichmäßig auf jeweils zwei autoklavierte

1,7 ml Mikroreaktionsgefäße aufgeteilt und die Pellets bei –80°C eingefroren. Es

folgten die DNA-Isolierung mit dem Qiagen Kit aus jeweils einem dieser Buffy-Coat-

Pellets und eine Untersuchung von jeweils 800 – 1.000 ng DNA mittels U3-LTR PCR


im Vierfachansatz. In dieser Untersuchung fraglich positive oder negative Proben

wurden in der hn PCR nachuntersucht.

Nach erneuter Blutentnahme von einem gesunden Rind (Herkunft: Physiologisches

Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover) wurden auf identische Weise elf

Rinderblutproben jeweils im Verhältnis 1:1.000, 1:15.000, 1:30.000, 1:40.000,

1:50.000 usw. bis 1:100.000 mit JS7-Zellen versetzt. Um das Pipettieren der kleinen

Mengen JS7-Zellen zu erleichtern, wurde von der Stammsuspension zunächst eine

1:10- und eine 1:100-Verdünnung in PBS hergestellt und entsprechende Volumina

dieser Verdünnungen verwendet. Eine Blutprobe blieb auch hier ohne Zusatz von

JS7-Zellen. Das weitere Vorgehen erfolgte wie oben beschrieben. Nach der DNA-

Isolierung wurden ab der Verdünnungsstufe 1:30.000 jeweils 800 – 1.000 ng DNA

jeweils sechsmal (zweimal im Dreifachansatz) mittels U3 LTR und hn PCR

untersucht. Die Stufen 1:1.000 und 1:15.000 wurden in jeder Reaktionscharge

zusätzlich zu den üblichen Kontrollen jeweils im Einfachansatz als Kontrollen

mitgeführt.

3.9.4 Southern Blot

Zur Verifizierung von in der Darstellung der PCR-Produkte im Agarosegel negativen

Blutprobenergebnissen klinisch erkrankter Tiere und zur Überprüfung der Spezifität

der nachgewiesenen Banden aus positiven Proben wurde unter Anleitung von Frau

Dr. Korinna Huber und mit der freundlichen Hilfe von Frau Alexandra Muscher

(Institut für Physiologie der Tierärztlichen Hochschule) für eine kleine Anzahl Proben

ein Southern Blot durchgeführt. Diese Arbeiten wurden im Labor des Instituts für

Physiologie durchgeführt.

Als Sonde wurden zunächst im Doppelansatz jeweils 10µl der Verdünnungsstufe 10-9

des Plasmids pCMV2JS21 (PALMARINI et al. 1999a) als Template amplifiziert. Die

PCR-Produkte beider Ansätze wurden gepoolt, das gesamte Volumen von 100µl in


einem zweiprozentigen Agarosegel aufgetragen und nach einer Laufzeit von ca. 1 h

bei 50V mit Ethidiumbromid gefärbt. Unter UV-Licht wurde die Bande auf einer

ethanolgereinigten Glasplatte mit einem Skalpell ausgeschnitten und auf zwei

autoklavierte Mikroreaktionsgefäße aufgeteilt. Das Gewicht der Gelausschnitte wurde

durch Differenzwägung bestimmt und die im Agarosegel enthaltene DNA mit dem

JETsorb Kit (Fa. Genomed, Bad Oeynhausen) extrahiert und in 20 µl Aqua dest.

eluiert. Zur Kontrolle des Erfolges der DNA-Extraktion wurden 2 µl des Überstandes

mit 3 µl Glycerin-Farbstofflösung auf ein zweiprozentiges Agarosegel aufgetragen

und nach elektrophoretischer Auftrennung durch Färbung mit Ethidiumbromid unter

UV-Licht dargestellt.

Eine Anzahl positiver und negativer Proben sowie die üblichen Plasmid- und

Wasserkontrollen wurden wie oben beschrieben mittels U3 LTR PCR amplifiziert und

die Amplifikate auf ein zweiprozentiges Agarosegel aufgetragen. Nach

elektrophoretischer Auftrennung bei 60V für eine Stunde und Färbung mit GelStarR

Nucleinsäurefarbstoff wurde das Gel zunächst photographiert und die Bilddatei digital

gespeichert. Die Durchführung eines Southern Blots erfolgte durch Frau Alexandra

Muscher nach etablierten Verfahren (SOUTHERN 1975; SAMBROOK et al 1989).

Der Erfolg des Transfers mittels Kapillar-Blot-Verfahrens wurde durch Färbung des

Gels mit Ethidiumbromid und Durchleuchtung mit UV-Licht kontrolliert. Es waren

keine Banden mehr darstellbar.

Die Durchführung der Prähybridisierung und Hybridisierung mithilfe der zuvor

radioaktiv markierten Sonde (Rediprime II Random Prime Labelling System;

Amersham Pharmacia Biotech) erfolgte ebenfalls durch Frau A. Muscher nach

etablierten Verfahren (SAMBROOK et al. 1989). Da diese Arbeiten überwiegend

nicht von der Autorin selbst durchgeführt wurden, sind die verwendeten Materialien

und Geräte im Anhang nicht im Detail aufgeführt.


3.9.5 Sequenzierung von PCR-Produkten

Zur Überprüfung der Spezifität der im Agarosegel nachgewiesenen Banden wurde

eine Sequenzierung der PCR-Produkte der U3 LTR PCR sowie der GAPDH PCR

durchgeführt. Hierzu wurden zunächst die nach elektrophoretischer Auftrennung

durch Färbung mit Ethidiumbromid unter UV-Licht visualisierten Banden auf einer

ethanolgereinigten Glasplatte mit einem Skalpell ausgeschnitten und auf zwei

autoklavierte Mikroreaktionsgefäße aufgeteilt. Das Gewicht der Gelausschnitte wurde

durch Differenzwägung bestimmt und die im Agarosegel enthaltene DNA mithilfe des

JETsorb Kits (Fa. Genomed, Bad Oeynhausen) extrahiert. Diese Arbeiten wurden im

Labor des Instituts für Physiologie der Tierärztlichen Hochschule durchgeführt. Die

extrahierte DNA wurde in 20 µl Aqua dest. gelöst. Zur Kontrolle des Erfolges der

DNA-Extraktion wurden 2 µl dieser Lösung mit 3 µl Glycerin-Farbstofflösung auf ein

zweiprozentiges Agarosegel aufgetragen und nach elektrophoretischer Auftrennung

durch Färbung mit Ethidiumbromid unter UV-Licht dargestellt. Aus dem restlichen

Eluat wurde durch die Firma AGOWA GmbH, Berlin eine Sequenzierung

vorgenommen. Die Sequenzen wurden unter www.ncbi.nlm.nih.gov über das Basic

Local Alignment Search Tool (BLAST) mit bei GenBank registrierten DNA-

Sequenzen verglichen.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

ERGEBNISSE 121

4 ERGEBNISSE

4.1 weiterer Verlauf der Sanierung mittels mutterloser Aufzucht

Aus der Schneverdinger Herde wurden im Frühjahr 2001 53 weibliche und 50

männliche Lämmer für die mutterlose Aufzucht gewonnen. Elf Lämmer verblieben bei

ihren Müttern und wurden nach der Auflösung der Schneverdinger Herde mit den

Mutterschafen vorübergehend in die Tütsberger Herde integriert.

In derselben Lammzeit wurden aus der Tütsberger Herde 101 weibliche und zwei

männliche Lämmer für die mutterlose Aufzucht gewonnen. Die weitere Aufzucht

dieser Tiere nach Abschluß der Kolostralphase erfolgte durch BIMCZOK (2002) in

Döhle.

Am Ende des Untersuchungszeitraumes im Januar 2004 umfaßte die Döhler Herde

204 Herdbuchmuttern, 162 nicht angekörte Muttertiere, 113 Zutreter, 21 Jungböcke,

neun Böcke und vier Hammel.

4.2 Ergebnisse der klinischen, pathologisch-anatomischen und histo-logischen Untersuchung von Tieren aus LA-positiven Herden

4.2.1 klinisch untersuchte Tiere (Sektionstiere)

4.2.1.1 Einteilung in die klinischen Gruppen und Gegenüberstellung der Ergebnisse der pathologisch-anatomischen und pathohisto-logischen Untersuchung

Aufgrund der Ergebnisse der klinischen Untersuchung zum Zeitpunkt der

Einlieferung an die Klinik für kleine Klauentiere wurden die 124 Sektionstiere aus

positiven Herden wie folgt in die vier klinischen Gruppen A – D eingeteilt:

122 ERGEBNISSE

Gruppe A: Definition: Respirationstrakt klinisch ohne besonderen Befund

In diese Gruppe wurden 32 der 124 untersuchten Tiere eingeordnet (25,8%). Die

Ergebnisse der pathologisch-anatomischen und histologischen Untersuchung der

Tiere aus dieser Gruppe sind in Tabelle 15 zusammengestellt.

Tabelle 15: Ergebnisse der pathologisch-anatomischen und pathohistologischen Untersuchung der Tiere der Gruppe A (n=32) makroskopische und histologische Beurteilung

Anzahl Tiere relativer Anteil(%)

makroskopisch und histologisch o.b.B 14 43,75

pneumonische Veränderungen

(makroskopisch und/oder histologisch) ohne

Beteiligung von LA

13

(alle geringgradig)

40,6

makroskopisch LA, histologisch bestätigt 0 0

makroskopisch keine Hinweise auf LA,

histologisch LA

3 9,4


histologisch fraglich

2 6,25

o.b.B: ohne besonderen Befund LA: Lungenadenomatose

Gruppe B Definition: respiratorische Symptome verschiedenen Grades, jedoch kein Nasenausfluß, keine diskontinuierlichen Nebengeräusche, Schubkkarrentest negativ

Dieser Gruppe wurden 55 Tiere zugeordnet (44,3%des Sektionsgutes). Die

Ergebnisse der makroskopischen und histologischen Untersuchung der Gruppe B

sind Tabelle 16 zu entnehmen.

ERGEBNISSE 123

Tabelle 16: Ergebnisse der pathologisch-anatomischen und pathohistologischen Untersuchung der Tiere der Gruppe B (n=55) makroskopische und histologische Beurteilung

Anzahl Tiere relativer Anteil (%)

makroskopisch und histologisch o.b.B 13 23,6



Beteiligung von LA

25 45,5

makroskopisch LA, histologisch bestätigt 8 14,5


histologisch LA

9 16,4



0 0


Gruppe C Definition: klinischer Verdacht auf Lungenadenomatose (kein Nasenausfluß,

Schubkarrentest negativ, jedoch pathologische diskontinuierliche Nebengeräusche

mit feuchtem oder rasselndem Charakter)

Zwölf der 124 untersuchten Tiere (9,7%) wurden aufgrund der beobachteten

Symptome der Gruppe C zugeordnet. Deren pathologisch-anatomische und

histologische Untersuchungsbefunde sind in Tabelle 17 dargestellt.

124 ERGEBNISSE

Tabelle 17: Ergebnisse der pathologisch-anatomischen und pathohistologischen Untersuchung der Tiere der Gruppe C (n=12) makroskopische und histologische Beurteilung


makroskopisch und histologisch o.b.B 0 0



Beteiligung von LA

0 0



histologisch LA

0 0



0 0


Gruppe D Definition: klinische Lungenadenomatose (hochgradige diskontinuierliche

Nebengeräusche mit feucht-rasselndem Charakter sowie spontaner oder

provozierter Nasenausfluß; Schubkarrentest positiv, Abgang von schaumig-

serösem Sekret)

Bei 25 Tieren (20,2%) konnte bereits klinisch die Diagnose Lungenadenomatose

gestellt werden. Sie wurden zur Gruppe D zusammengefasst. Die Ergebnisse der

pathologisch-anatomischen und histologischen Untersuchung sind in Tabelle 18

zusammengestellt.

ERGEBNISSE 125

Tabelle 18: Ergebnisse der pathologisch-anatomischen und pathohistologischen Untersuchung der Tiere der Gruppe D (n=25) makroskopische und histologische Beurteilung


makroskopisch + histologisch obB 0 0



Beteiligung von LA

0 0



histologisch LA

0 0



0 0


4.2.1.2 Einteilung in Kategorien anhand der Lungenbefunde

Anhand der makroskopischen und histologischen Befunde wurden die Tiere in die

Lungenbefund-Kategorien I bis IV eingeteilt:

Kategorie I: makroskopisch LA, histologisch bestätigt

Kategorie II: makroskopisch keine Hinweise auf LA, histologisch LA

Kategorie III: makroskopisch keine Hinweise auf LA, histologisch fraglich

Kategorie IV: weder makroskopisch noch histologisch Hinweise auf LA

Die Zuordnung der Tiere zu den entsprechenden Lungenbefund-Kategorien ist

Tabelle 19 zu entnehmen. Die Kategorie I umfasst eine relativ heterogene

Tiergruppe, die von klinisch kranken Tieren bis hin zu klinisch weitgehend

126 ERGEBNISSE

unauffälligen Tieren reicht, bei denen jedoch bei der Sektion makroskopisch

erkennbare Tumoren oder tumorverdächtige Areale festgestellt wurden.

Tabelle 19: Einteilung der Sektionstiere aus positiven Herden (n=124) in Kategorien anhand der pathologisch-anatomischen und histologischen Lungenbefunde

Kategorie I II III IV

Definition makroskopisch LA, histologisch

bestätigt

makroskopisch keine Hinweise auf LA, histologisch LA

makroskopisch keine Hinweise auf LA, histolo-gisch fraglich

weder makro-skopisch noch

histologisch Hin-weise auf LA

Anzahl Tiere 45 12 2 65

relativer Anteil (%)

36,3 9,7 1,6 52,4

histologische Beurteilung

positiv 46 % fraglich 1,6 % negativ 52,4%

LA: Lungenadenomatose

Zum Teil wurden gezielt klinisch an LA erkrankte oder verdächtige Tiere der

Untersuchung zugeführt, so dass der ermittelte Prozentsatz von Tieren mit

nachgewiesener LA am Sektionsgut höher ist als der Anteil in den Herkunftsherden.

4.2.1.3 Vorkommen von Metastasen und anderen Tumorerkrankungen

Bei drei der 57 LA-positiven Sektionstiere (5,3%) wurde eine Metastasierung eines

bronchiolo-alveolären Adenokarzinoms der Lunge (Lungenadenomatose) festgestellt.

In einem Fall war der Ln. mediastinalis caudalis betroffen, in einem weiteren Fall

bestand eine Metastasierung in zahlreiche Organe (Pleura, Niere, Leber, Herz). Bei

dem dritten Tier fanden sich Metastasen in der Muskulatur der Hintergliedmaßen. In

allen drei Fällen wurden mittels U3 LTR PCR aus dem unter sterilen Kautelen

entnommenen Gewebe der Tumormetastasen JSRV-spezifische Genomfragmente

nachgewiesen.

Bei einem weiteren, spontan im Bestand verendeten Tier der Schneverdinger Herde

wurde ein metastasierendes Adenokarzinom des Dünndarms (primärer Darmtumor)

ERGEBNISSE 127

diagnostiziert, mit dem Vorkommen von Metastasen in der Lunge, der Pleura, dem

Peritoneum und der Leber. Aus Tumormaterial dieses Tieres konnte mittels U3 LTR

und hn PCR JSRV nicht nachgewiesen werden.

4.2.2 Schlachttiere

4.2.2.1 Ergebnisse der Lebenduntersuchung

Aus der Gruppe der 127 Schlachttiere aus den vier LA-positiven Herden bestand bei

der adspektorischen Schlachttieruntersuchung bei sieben Tieren (5,51%) der

klinische Verdacht auf Lungenadenomatose (ohne Phonendoskop hörbare

diskontinuierliche Nebengeräusche mit feuchtem oder rasselndem Charakter, aber

kein spontaner Nasenausfluß) bzw in drei Fällen (2,36%) bereits eine klinisch

manifeste Lungenadenomatose-Erkrankung (spontaner Nasenausfluß zusätzlich zu

ohne Phonendoskop hörbaren diskontinuierlichen Nebengeräuschen). Die

makroskopische und histologische Untersuchung der Schlachtlungen bestätigte

diesen Verdacht in allen zehn Fällen. Vier weitere Tiere (3,15%) waren vor der

Schlachtung durch Husten aufgefallen. Bei drei dieser Tiere wurden in der Lunge LA-

typische Läsionen makroskopisch und histologisch festgestellt. Die übrigen 113

Schlachttiere (88,98%) waren bei der Lebenduntersuchung unauffällig.

4.2.2.2 Pathologisch-anatomische und histologische Untersuchung

Die Einteilung in die Kategorien I bis IV wurde für die Schlachtlungen in gleicher

Weise wie für die Lungen der Sektionstiere vorgenommen. Eine Übersicht ist in

Tabelle 20 gegeben.

128 ERGEBNISSE

Tabelle 20: Einteilung der Schlachttiere aus positiven Herden (n=127) in Kategorien anhand der pathologisch-anatomischen und histologischen Lungenbefunde


Definition makroskopisch LA, histologisch

bestätigt


makroskopisch keine Hinweise auf

LA, histologisch fraglich

weder makroskopisch

noch histologisch Hinweise auf LA

Anzahl Tiere 20 2 5 100

relativer Anteil (%)

15,7 1,6 3,9 78,7

Histologische Beurteilung

positiv 17,3% fraglich 3,9 % negativ 78,7%

LA: Lungenadenomatose

Die Schlachttiere entstammten Routineschlachtungen ohne eine Vorauswahl der

Tiere, so dass der ermittelte Anteil Lungenadenomatose-erkrankter Tiere der

natürlichen Prävalenz der Erkrankung in den Herkunftsbeständen gleichzusetzen ist.

4.2.2.3 Vorkommen von Metastasen

Bei einem der 22 LA-positiven Schlachttiere (4,55%) wurde eine Metastasierung in

den Ln. mediastinalis caudalis festgestellt.

4.3 Ergebnisse der klinischen, pathologisch-anatomischen und histo-logischen Untersuchung der Schneverdinger Herde

Der Gesundheitszustand der Schneverdinger Herde als Ausgangsherde des

Sanierungsversuches ist hier noch einmal gesondert dargestellt. Da nach Abschluß

der Lammzeit 2001 alle bis dahin noch lebenden erwachsenen Tiere getötet und

untersucht wurden, sind die ermittelten Anteile LA-positiver Tiere der natürlichen

Prävalenz in dieser Herde gleichzusetzen.

ERGEBNISSE 129

4.3.1 Anzahl LA-positiver Tiere

Aus der Schneverdinger Herde gelangten im Rahmen der Auflösung der Herde

insgesamt 83 Tiere zur Sektion, neun Lämmer und Zutreter wurden geschlachtet.

Von diesen 92 Tieren wiesen zwölf (13,0%) klinische Symptome der

Lungenadenomatose auf (Gruppe D), bei zwei weiteren (2,2%) bestand der klinische

Verdacht (Gruppe C). Die Ergebnisse der makroskopischen und histologischen

Untersuchung der Lungen der 92 Schneverdinger Tiere sind in Tabelle 21

dargestellt.

Tabelle 21: Ergebnisse der pathologisch-anatomischen und pathohistologischen Untersuchung der Lungen der Schlacht- und Sektionstiere aus der Schneverdinger Herde (n=92) makroskopische und histologische Beurteilung


makroskopisch und histologisch o.b.B

29 31,5

pneumonische Veränderungen (makroskopisch und/oder histologisch) ohne Beteiligung von LA

34 36,9

makroskopisch LA, histologisch bestätigt

17 18,5


9 9,8

makroskopisch keine Hinweise auf LA, histologisch fraglich

3 3,3

o.b.B.: ohne besonderen Befund LA: Lungenadenomatose

28,3% der untersuchten Tiere wiesen demnach makroskopisch und/oder histologisch

typische Läsionen der Lungenadenomatose auf; 3,3% zeigten ein fragliches

histologisches Ergebnis.

130 ERGEBNISSE

4.3.2 Vorkommen anderer Lungenerkrankungen in der Schneverdinger Herde

Die Hauptbefunde der pathologisch-anatomischen und pathohistologischen

Untersuchung von Tieren mit Lungenläsionen (außer LA) aus der Schneverdinger

Herde (n=34) sind in Tabelle 22 zusammengefaßt. Häufig traten mehr als eine

typische Läsion gleichzeitig auf, so dass Mehrfachnennungen möglich sind. Eine

mikrobiologische Untersuchung wurde aus Kostengründen nicht in allen Fällen

durchgeführt. Als pathogene Erreger wurden z.T wiederholt Mannheimia

haemolytica, Corynebacterium pseudotuberculosis, alpha-hämolysierende

Streptokokken und Arcanobacterium pyogenes nachgewiesen.

Tabelle 22: Vorkommen anderer Lungenerkrankungen in der Schneverdinger Herde

Befund Anzahl % der veränderten

Lungen (n=34)

% der Gesamtzahl der untersuchten

Tiere (n=92) solitäre, vermutlich parasitär bedingte Granulome

3 8,8 3,3

katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie

10 29,4 10,9

abszedierende/apostematöse Pneumonie

19 55,9 20,7

fibröse Pleuritis

8 23,5 8,7

herdförmig ggr. aspiriertes Pflanzenmaterial mit fokaler entzündlicher Reaktion (vermutlich Artefakt als Folge der Lungenspülproben)

5 14,7 5,4

abszedierende Lymphadenitis der Mediastinallymphknoten

3 8,8 3,3

Metastasen eines Adenokarzinoms des Dünndarms

1 2,9 1,1

ggr: geringgradig

ERGEBNISSE 131

4.4 Altersverteilung an Lungenadenomatose erkrankter Tiere

Aufgrund der Beobachtungen in den infizierten Heidschnuckenherden, dass diese

Rasse im Vergleich zu anderen sehr früh zu erkranken scheint (GANTER 2000;

KOOPMANN 2000, pers. Mitteilungen), ist die Altersverteilung der in dieser Studie

untersuchten 79 Fälle von klinisch, makroskopisch und/oder histologisch

nachgewiesener Lungenadenomatose in den Abbildungen 3 und 4 dargestellt.

In Abbildung 3 wurden die klinischen Erkrankungs- bzw. Verdachtsfälle

herausgegriffen. Diese wurden allesamt makroskopisch und histologisch bestätigt.

Aus dieser Gruppe waren 29 von 47 Tieren (61,7%) zwischen vier Monate und zwei

Jahre alt. Bei sechs Schlachttieren war das genaue Alter unbekannt, es handelte

sich jedoch um Tiere, die mindestens Jährlinge oder älter waren. Bei vier weiteren

Tieren konnte das Alter anhand des Zahnbefundes lediglich als vier Jahre oder älter

geschätzt werden.

Altersverteilung klinisch erkrankter bzw. verdächtiger Tiere

n=47

0

2

4

6

8

10

12

14

16

<1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 >4 ?

Alter (Jahre)

Abbildung 3: Altersverteilung klinisch an LA erkrankter und LA-verdächtiger Heidschnucken (Gruppen D und C)

132 ERGEBNISSE

Abbildung 4 stellt die Altersverteilung aller 79 bestätigten Lungenadenomatose-Fälle

dar. Diese beinhalten sowohl klinisch, makroskopisch als auch lediglich histologisch

nachgewiesene Läsionen. Zwölf der untersuchten Tiere waren Schlachttiere, bei

denen eine genaue Altersbestimmung nicht durchgeführt werden konnte. Es

handelte sich hierbei um Tiere, die mindestens Jährlinge oder älter waren.

Die Ergebnisse zeigen, dass Lungenadenomatose-assoziierte Läsionen in allen

Altersgruppen festgestellt wurden. Auch hier zeigt sich jedoch eine Häufung bei sehr

jungen Tieren mit 40 Fällen bei Tieren im Alter von zwei Jahren oder darunter

(50,6%). Die jüngsten betroffenen Tiere waren Zwillingslämmer eines klinisch

erkrankten Muttertieres, die bereits im Alter von vier Monaten eine klinisch manifeste

Lungenadenomatose entwickelt hatten.

Altersverteilung von LA-Läsionen aller Stadien n=79

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

<1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 >4 ?

Alter (Jahre)

Abbildung 4: Altersverteilung LA-positiver Heidschnucken (alle Erkrankungsstadien)

ERGEBNISSE 133

4.5 Praktikabilität der BAL und Probenqualität 4.5.1 Praktikabilität und Zeitaufwand der Entnahme von BAL-Proben nach

endotrachealer Intubation

Zur Entnahme von Lungenspülproben mit der unter 3.5.2 A beschriebenen Methode

ist stets eine weitere Hilfsperson vonnöten. Die Methode ist problemlos unter

Bestandsbedingungen anwendbar. Für die Entnahme größerer Probenzahlen sind

einige vorbereitende Arbeiten empfehlenswert (vorheriges Zuschneiden der PVC-

Schläuche und Aufziehen der NaCl-Lösung in Einwegspritzen), um einen

reibungslosen und raschen Arbeitsablauf zu gewährleisten. Ein geübtes Team kann

bei gleichzeitiger Entnahme von Blutproben auf diese Weise im Durchschnitt neun

Tiere pro Stunde beproben, was einem Zeitaufwand pro Tier von knapp sieben

Minuten entspricht. Eine Tagesleistung von 40 bis 50 Tieren ist realistisch. Danach

treten bei den probennehmenden Personen insbesondere durch das Einfangen und

Umsetzen der Tiere zur i.v.-Applikation des Anästhetikums Ermüdungs-

erscheinungen auf.

4.5.1.1 Kosten

Einmalige Kosten fallen für die Anschaffung eines oder mehrerer Laryngoskop-

Kaltlichtspatel (Modell Miller 4 je € 131,90) sowie des Laryngoskopgriffes mit

Ladegerät (zusammen € 293,50), eines Bronchialzerstäubers (€ 73,90) sowie einer

entsprechenden Anzahl Edelstahl-Rundstangen (im Stahlhandel € 11,06/kg) an

(Netto-Einkaufspreise in € zzgl. MwSt).

134 ERGEBNISSE

Kosten für Verbrauchsmaterialien (Netto-Einkaufspreise in € zzgl. MwSt.)

PVC-Schlauch (ca. 40 cm / Tier): € 0,18 / Tier

Ernährungssonde: € 0,71 / Stück

UrsotaminR: € 0,51 / ml

Gleitgel: € 2,84 / l

Isocain: € 0,02 / ml

0,9% NaCl: € 0,80 / 500ml

Einwegspritzen 5ml: € 0,034 / Stück

Einwegspritzen 20 ml: € 0,085 / Stück

Injektionskanüle: € 0,02 / Stück Latexhandschuhe: € 10,60 / Karton (100 Stück)

Desinfektionsmittel HelipurR-Konzentrat: € 98,25 / 5l Kanister

(€ 0,019 / ml)

(Anwendung als 5%ige Lsg. für 15min oder 1,5%ige Lsg. für 1h)

Schraubdeckeldose, steril: € 0,32 / Stück

Die Kosten an Verbrauchsmaterialien betragen folglich pro Tier unter fünf Euro

(Netto-Einkaufspreise). Als Hauptkostenfaktor schlägt hierbei das UrsotaminR

(Serumwerk Bernburg) zu Buche. Nicht in diese Überschlagsrechnung eingeflossen

sind die Kosten für das Desinfektionsmittel, da sie sehr stark mit dem Volumen und

der Konzentration der angesetzten Lösung sowie der Anzahl der zu einem Termin

beprobten Tiere variieren.

4.5.1.2 Immobilisation und Wartezeit

Eine Vollnarkose mit Erreichen des Toleranzstadiums ist für die Entnahme von

Lungenspülproben nicht notwendig. Der relativ kurze Nachschlaf bei alleiniger

Verwendung von Ketamin-HCl macht diesen Wirkstoff für die erforderliche

kurzzeitige Immobilisation und Sedation für diesen Eingriff ideal. Das Risiko von

ERGEBNISSE 135

Narkosezwischenfällen ist bei klinisch unauffälligen Tieren bei Verwendung einer

Dosis von 8 – 10 mg/kg i.v. sehr gering und eine rasche Anflutung durch intravenöse

Applikation ist die Voraussetzung für einen zügigen Arbeitsablauf. Circa 15 bis 20

Minuten nach dem Eingriff waren die Schafe wieder auf den Beinen. Bei der

Anwendung von Ketamin ist die fehlende Zulassung des Präparates UrsotaminR für

die Tierart Schaf zu beachten, so dass eine Wartezeit von 28 Tagen einzuhalten ist

(§56a AMG und §12 TÄHAV, in: ZRENNER und PAINTNER 2003).

4.5.1.3 Komplikationen

Bei der Entnahme der Spülproben, insbesondere beim Einführen der

Ernährungssonde in die tieferen Luftwege, kann es bei den Tieren zu Husten

kommen. Auch direkt im Anschluß an die Entnahme wurde bei einigen Tieren Husten

beobachtet. Spätestens eine Stunde nach der Probenentnahme waren diese

Symptome abgeklungen und die Tiere zeigten keine negative Beeinflussung ihres

Allgemeinbefindens.

Bei insgesamt 367 von der Autorin durchgeführten Lungenspülprobenentnahmen

traten insgesamt zwei Todesfälle auf (0,54%). In einem Fall handelte es sich um ein

klinisch hochgradig an Lungenadenomatose erkranktes Tier, das in der Narkose

verendete. In einem weiteren Fall trat bei einem klinisch unauffälligen Tier während

der Probenentnahme heftiges Regurgitieren auf. Die Entnahme wurde abgebrochen,

doch das betroffene Tier verendete am folgenden Tag infolge einer akuten

Aspirationspneumonie. Bei 393 nach demselben Verfahren durch andere Personen

durchgeführten Lungenspülungen traten keine weiteren Todesfälle auf. Störungen

des Allgemeinbefindens wurden ebenfalls in keinem Fall beobachtet.

129 Tiere wurden zeitnah nach der Entnahme von Lungenspülproben getötet (109

Sektionstiere aus positiven Herden, 17 Schlachttiere aus positiven Herden, zwei

Altböcke aus der Döhler Herde, ein Jungbock aus Döhle) und ihre Lungen

systematisch makroskopisch und pathologisch-histologisch untersucht. Bei acht

dieser Tiere (6,20%) wurde histologisch eine geringgradige, fokale Aspiration von

136 ERGEBNISSE

Pflanzenbestandteilen in einzelnen Bronchioli mit fokaler reaktiver Entzündung

festgestellt. In keinem dieser Fälle waren nach der Probenentnahme Störungen des

Allgemeinbefindens oder klinische Hinweise auf eine Aspirationspneumonie

aufgetreten. 4.5.2 Qualität der Lungenspülproben

4.5.2.1 Rückgewinnungsvolumen und makroskopische Beurteilung

Insgesamt wurden von der Autorin 367 Lungenspülproben nach endotrachealer

Intubation gewonnen. Nach Abschluß einer Übungsphase wurde für 326

routinemäßig gewonnene Proben eine systematische Beurteilung nach dem unter

3.6.3 beschriebenen Schema vorgenommen. Das durchschnittliche Rück-

gewinnungsvolumen betrug für diese Proben 45 ml. Die Beurteilung bezüglich der

Beimengung von Blut ist Tabelle 23 zu entnehmen. Die Einteilung wurde subjektiv

anhand der makroskopischen Färbung der Probe vorgenommen.

Tabelle 23: makroskopische Beurteilung der Lungenspülproben (n=326)

Blutbeimengungen

Wert 0 0,5 1 1,5 2 3

Grad keine sehr ggr. ggr. ggr.-mgr. mgr. hgr.

Anzahl Proben (%) 55,21 23,93 13,19 2,15 5,21 0,31

Zusammenfassung Anzahl Proben (%)

92,33 7,67

ggr: geringgradig; mgr: mittelgradig; hgr.: hochgradig

Proben, die aufgrund makroskopisch feststellbarer Blutbeimengungen in die Gruppen

0 bis 1 eingeteilt wurden (92,33% des Gesamtprobengutes) konnten ohne den

Zusatzschritt der Lyse der Erythrozyten direkt weiterverarbeitet werden.

ERGEBNISSE 137

Bei Futterverunreinigungen handelte es sich in der Regel um einzelne, maximal ca.

1-2 mm lange, feinzerkaute Pflanzenpartikel, die durch Regurgitieren und Husten in

die Proben gelangten. Dies war bei 39 (11,96%) der 326 beurteilten Proben der Fall.

4.5.2.2 Zellintegrität

Nach Herstellung von nach Pappenheim gefärbten Zytospots aus den Zellpellets von

zehn nach der unter 3.6.3 beschriebenen Methode behandelten Lungenspülproben

war problemlos eine lichtmikroskopische Differenzierung der Zellen möglich.

4.5.2.3 Erzielte DNA-Konzentration

Die 121 im Sommer 2001 in der Döhler Herde entnommenen Lungenspülproben

gelangten zugunsten der in den Folgejahren 2002 und 2003 entnommenen Proben

nicht mehr zur Untersuchung. Aus diesen Proben wurde daher auch keine DNA-

Extraktion vorgenommen. Aus insgesamt 217 von der Autorin mit der Methode der

endotrachealen Intubation entnommenen Lungenspülproben wurde mit dem Qiagen

Kit eine DNA-Extraktion durchgeführt. Aus 12 dieser Proben (5,5%) konnte keine für

die Untersuchung ausreichende DNA-Konzentration (<25 ng/µl) erzielt werden.

4.5.3 Blutproben

4.5.3.1 Zellintegrität nach Buffy-Coat-Präparation

Nach der routinemäßigen Buffy-Coat-Präparation wurden die Leukozytenpellets von

zehn Blutproben in 0,9%iger Kochsalzlösung resuspendiert, verdünnt und mithilfe

eines Zytospotverfahrens durch zehnminütige Zentrifugation bei 200xg und 20°C auf

Objektträger verbracht. Nach Färbung nach Pappenheim war eine

lichtmikroskopische Differenzierung der Zellen möglich.

138 ERGEBNISSE

4.5.4 Kontrolle der DNA-Qualität

4.5.4.1 Konzentrations- und Reinheitsbestimmung der DNA

Die Bestimmung der Konzentration und Reinheit der mit dem Qiagen DNeasy tissue

Kit gewonnenen DNA erfolgte durch photometrische Messung der optischen Dichte

(OD) in einem Volumen von 500 µl in einer Quarzküvette bei einer Wellenlänge von

260 und 280 nm in einer Verdünnung 1:20. Mittelwert, Median und

Standardabweichung der Reinheitswerte (OD260/OD280) sowie der erzielten DNA-

Konzentration in ng/µl (eine OD von 1 entspricht 50 ng/µl doppelsträngiger DNA

(SAMBROOK et al. 1989); anschließend Multiplikation mit dem Verdünnungsfaktor

20) für die einzelnen Probenarten (BAL, Buffy-Coat, Gewebe) sind Tabelle 24 zu

entnehmen. Unter der Rubrik „Gewebeproben“ sind alle präparierten Gewebearten

zusammengefasst. Aus Lymphknoten- und Tumorgewebe waren aufgrund der

höheren Zelldichte stets deutlich höhere DNA-Gehalte zu erzielen als aus

unverändertem Lungengewebe.

Tabelle 24: Konzentration und Reinheit der aus verschiedenen Probenarten gewonnenen DNA

Lungenspülproben n=286

Buffy-Coat-Proben

n=161

Gewebeproben n=546

Reinheit

(OD260/OD280)

Konzentration

( ng/µl)

Reinheit

(OD260/OD280)

Konzentration

( ng/µl)

Reinheit

(OD260/OD280)

Konzentration

( ng/µl)

Mittelwert 1,95 102,22 1,94 117,50 1,95 232,37

Median 1,96 95,25 1,95 96,60 1,93 132,70

SD 0,12 58,14 0,07 72,62 0,16 237,28

SD: Standardabweichung; OD260: optische Dichte bei 260 nm

ERGEBNISSE 139

4.5.4.2 Template-Kontrolluntersuchungen

Insgesamt 583 in dreimaliger Untersuchung in der U3 LTR und hn PCR negative

Proben wurden auf die Nachweisbarkeit einer spezifischen Sequenz der

Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) untersucht. Das Probengut

gliederte sich wie folgt:

Lungenspülproben: n = 170

Buffy-Coat n = 144

Lungengewebe n = 62

Ln. mediastinalis caudalis n = 201

andere Gewebe n = 6

Die Untersuchung erfolgte im Einfachansatz. Aus allen 583 Proben wurde eine

Bande der erwarteten Größe von 388 bp nachgewiesen.

4.6 Validierung der PCR

4.6.1 Nachweisgrenze vor dem Hintergrund von Wasser (Grenzwert-Positivkontrollen)

In jeder Reaktionscharge wurden jeweils 5 µl von drei 1:5 verdünnten

Verdünnungsstufen eines die volle provirale Sequenz von JSRV enthaltenden

Plasmids pCMV2JS21 (PALMARINI et al. 1999a) eingesetzt. Die rechnerisch im

Probenvolumen enthaltene Anzahl an Plasmidmolekülen, ausgehend von der

gemessenen Ausgangskonzentration der Stammlösung, sowie der Prozentsatz

positiver Reaktionen in der U3 LTR PCR und der hn PCR sind Tabelle 25 zu

entnehmen. Sofern eine Plasmidverdünnung bereits in der U3 LTR PCR deutlich

positiv war, wurde nicht in jedem Fall eine hn PCR durchgeführt. Die Anzahl der in

die Berechnung eingegangenen Reaktionen pro Verdünnungsstufe ist in Klammern

140 ERGEBNISSE

gestellt. Sofern nicht mindestens die beiden Verdünnungsstufen 10-9 und 10-11

mindestens in der hn PCR positiv waren, wurde der Ansatz wiederholt. Ein solches

Sensitivitätsproblem trat im Zuge der Verwendung einer neuen Charge des dNTP-

Mixes der Fa. Roth (Rotimix PCR 3) auf, so dass daraufhin die Lieferfirma

gewechselt wurde. Die in diesem Zusammenhang zur Abklärung der Ursache des

Sensitivitätsproblems durchgeführten Reaktionen sind nicht in diese Berechnung

eingeflossen.

Tabelle 25: Prozentsatz positiver Reaktionen der Plasmidkontrollen in der U3 LTR und der hn PCR vor dem Hintergrund von Wasser

Verdünnungs-stufe

Rechnerischer Gehalt an

Molekülen pro 5µl 1:5

verdünnter Lösung

% positiver PCR-

Reaktionen in U3 LTR

PCR

% fraglich positiver

PCR-Reaktionen in U3 LTR PCR

% positiver PCR-

Reaktionen in hn PCR

10-9 2,275 x 102 100 (n=62) - 100 (n=21)

10-11 2,275 x 100 91,9 (n=62) 8,1 (n=62) 100 (n=56)

10-12 2,275 x 10-1 3,8 (n=56) 17,8 (n=56) 77,4 (n=53)

4.6.2 Nachweisgrenze vor dem Hintergrund von 800 – 1000 ng genomischer DNA (Inhibitionskontrollen)

Um einen möglichen Sensitivitätsverlust des Reaktionssystems vor dem Hintergrund

von 800 – 1000 ng DNA durch die Anwesenheit möglicher Inhibitoren oder die

Hintergrund-DNA selbst zu untersuchen, wurden exemplarisch 29 willkürlich

ausgewählte, in dreimaliger Untersuchung in U3 LTR PCR und hn PCR negative

Gewebeproben (24 Lymphknoten- und 5 Lungengewebeproben) sowie 32 ebenfalls

negative Zellproben (15 Buffy-Coat- und 17 BAL-Proben) mit jeweils 5 µl der drei als

Grenzwert-Positivkontrollen verwendeten, 1:5 verdünnten Plasmidverdünnungs-

stufen 10-9, 10-11 und 10-12 versetzt. Zusätzlich wurde pro Probe ein erneuter Ansatz

ERGEBNISSE 141

ohne Plasmidzusatz mitgeführt. Diese Untersuchungen wurden jeweils im

Einfachansatz durchgeführt. In Einzelfällen war die vorhandene Restmenge der

Proben nicht ausreichend, um diesen Leeransatz oder einzelne der genannten

Plasmidverdünnungen mitzuführen. Weiterhin wurden fünf weitere Blut- und vier

weitere BAL-Proben sowie Rinderlungen-DNA lediglich mit den ersten beiden

Verdünnungsstufen versetzt und mittels PCR untersucht. In allen Fällen lieferte der

Ansatz ohne Plasmidzusatz sowohl in der U3 LTR als auch der hn PCR ein erneutes

negatives Ergebnis. Mit Plasmidzusatz wurde für die Verdünnungsstufe 10-9 für alle

Probenarten in 100% der Fälle, für die Verdünnungsstufe 10-11 abhängig von der Art

der Probe in 94,1 – 100 % der Fälle im Einfachansatz ein positives Ergebnis in der

hn PCR erzielt. Bei allen diesen Untersuchungen wurden routinemäßig Positiv- und

Negativkontrollen mitgeführt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind nach

Probenarten getrennt in den Tabellen 26 bis 28 dargestellt.

Tabelle 26 zeigt die Ergebnisse der Inhibitionskontrollen für die Gewebeproben

(n=30). Die Ergebnisse sind getrennt nach denen der U3 LTR und der hn PCR

aufgeführt. In der U3 LTR PCR positive Proben wurden nicht in allen Fällen mit der

hn PCR nachuntersucht.

142 ERGEBNISSE

Tabelle 26: Ergebnis der Inhibitionskontrollen (Gewebeproben)

Plasmid- verdünnungsstufe

positiv in U3 LTR PCR

fraglich in U3 LTR PCR

negativ in U3 LTR PCR

positiv in hn PCR

negativ in hn PCR

nicht untersucht in hn PCR

10-9

n=30

16

(53,3%)

5

(16,7%)

9

(30,0%)

17

(100%)

- 13 (alle positiv in U3 LTR

PCR) 10-11

n=30

10

(33,3%)

6

(20,0%)

14

(46,7%)

28

(96,6%)

1

(3,4%)

1

(positiv in U3 LTR PCR)

10-12

n=27

1

(3,7%)

1

(3,7%)

25

(92,6%)

15

(55,6%)

12

(44,4%)

-

Die relativen Werte (in % der jeweils pro Verdünnungsstufe untersuchten Proben) sind in Klammern gesetzt

In gleicher Weise sind in Tabelle 27 die Ergebnisse für die Blutproben (n=20)

dargestellt.

Tabelle 27: Ergebnis der Inhibitionskontrollen (Blutproben)

Plasmidver-dünnungsstufe




positiv in hn PCR

negativ in hn PCR


10-9

n=20

15

(75%)

3

(15%)

2

(10%)

15

(100%)

- 5

(alle positiv in U3 LTR

PCR) 10-11

n=20

12

(60%)

2

(10%)

6

(30%)

15

(100%)

- 5

(alle positiv in U3 LTR

PCR) 10-12

n=15

1

(6,7%)

3

(20%)

11

(73,3%)

12

(80%)

3

(20%)

-

Die relativen Werte (in % der jeweils pro Verdünnungsstufe untersuchten Proben) sind in Klammern gesetzt

ERGEBNISSE 143

Die Abbildungen 5 und 6 zeigen die elektrophoretische Darstellung der Produkte der

U3 LTR bzw. hn PCR von sieben mit Plasmid versetzten Blutproben sowie der

entsprechenden Kontrollen.

Abbildung 5: Elektrophoretische Darstellung des Ergebnisses der U3 LTR PCR mit Plasmid versetzter Blutproben. Das Produkt ist 176 Basenpaare (bp) lang Bezeichnung der Spuren: 1 Probe 1, ohne Plasmidzusatz 1/1 Probe 1, mit 5 µl 1:5 verdünnter Stufe 10-9 des Plasmids pCMVJS21 1/2 Probe 1, mit 5 µl 1:5 verdünnter Stufe 10-11 des Plasmids pCMVJS21 1/3 Probe 1, mit 5 µl 1:5 verdünnter Stufe 10-12 des Plasmids pCMVJS21 Die Bezeichnung der Proben 2 bis 7 erfolgte in gleicher Weise 8 positive Kontrollprobe, BAL eines an LA erkrankten Schafes 9 negative Kontrollprobe, Buffy-Coat eines LA-negativen Schafes 10 5 µl 1:5 verdünnte Stufe 10-9 des Plasmids pCMVJS21 11 5 µl 1:5 verdünnter Stufe 10-11 des Plasmids pCMVJS21 12 5 µl 1:5 verdünnter Stufe 10-12 des Plasmids pCMVJS21 13 Wasser-Negativkontrolle I 14 Wasser-Negativkontrolle II In den äußeren Spuren wurde als Längenstandard ein 100bp-Marker aufgetragen

144 ERGEBNISSE

Alle Proben außer der bereits in der U3 LTR PCR deutlich positiven Probe Nr. 8

wurden in der hn PCR nachuntersucht. Das Ergebnis ist in Abbildung 6 dargestellt.

Abbildung 6: Elektrophoretische Darstellung des Ergebnisses der hn PCR mit Plasmid versetzter Blutproben. Das Produkt hat eine Größe von 133 Basenpaaren (bp). Die Bezeichnung der Spuren entspricht Abbildung 5. Probe 8 entfällt. Zusätzlich wurden zwei neue Wasser-Negativkontrollen (Proben 15 und 16) mitgeführt: 1 Probe 1, ohne Plasmidzusatz 1/1 Probe 1, mit 5 µl 1:5 verdünnter Stufe 10-9 des Plasmids pCMVJS21 1/2 Probe 1, mit 5 µl 1:5 verdünnter Stufe 10-11 des Plasmids pCMVJS21 1/3 Probe 1, mit 5 µl 1:5 verdünnter Stufe 10-12 des Plasmids pCMVJS21 Die Bezeichnung der Proben 2 bis 7 erfolgte in gleicher Weise 8 entfällt aufgrund des deutlich positiven Ergebnisses in der U3 LTR PCR 9 negative Kontrollprobe, Buffy-Coat eines LA-negativen Schafes 10 Verdünnungstufe 10-9 des Plasmids pCMVJS21 11 Verdünnungsstufe 10-11 des Plasmids pCMVJS21 12 Verdünnungsstufe 10-12 des Plasmids pCMVJS21 13 Wasser-Negativkontrolle I 14 Wasser-Negativkontrolle II 15 Wasser-Negativkontrolle III 16 Wasser-Negativkontrolle IV In den äußeren Spuren wurde als Längenstandard ein 100bp-Marker aufgetragen

ERGEBNISSE 145

Tabelle 28 zeigt die Ergebnisse der Inhibitionskontrollen für 21 Lungenspülproben.

Tabelle 28: Ergebnis der Inhibitionskontrollen (BAL-Proben)

Plasmidver-dünnungsstufe




positiv in hn PCR

negativ in hn PCR


10-9

n=21

11

(52,4%)

5

(23,8%)

5

(23,8%)

17

(100%)

- 4

(alle positiv in U3 LTR PCR)

10-11

n=21

6

(28,6%)

4

(19,0%)

11

(52,4%)

16

(94,1%)

1

(5,9%)

4

(alle positiv in U3 LTR PCR)

10-12

n=17

0 0 17

(100%)

6

(35,3%)

11

(64,7%)

-

Die relativen Werte (in % der jeweils pro Verdünnungsstufe untersuchten Proben) sind in Klammern gesetzt Zusammenfassung und Beurteilung

Die Ergebnisse der Untersuchungen zur Nachweisgrenze vor dem Hintergrund von

800 – 1000 ng DNA sind für alle Probenarten in Tabelle 29 zusammengefaßt:

Tabelle 29: Zusammenfassung der Inhibitionskontrollen für alle Probenarten; n = 71

Plasmid- verdünnungsstufe

% positiver PCR-Reaktionen in U3

LTR PCR

%fraglicher PCR-Reaktionen in U3

LTR PCR

% positiver PCR-Reaktionen in hn

PCR 10-9 59,2 (n=71) 18,3% (n=71) 100 (n=49)

10-11 39,4 (n=71) 16,9 (n=71) 96,7 (n=61)

10-12 3,4 (n=59) 6,8 (n=59) 55,9 (n=59)

Die Sensitivität der Blutprobenuntersuchung mit der heminested PCR scheint

ungeachtet der relativ kleinen Probenzahl der des Nachweises von Plasmid-DNA vor

dem Hintergrund von Wasser zu entsprechen. Auffallend ist jedoch ein deutlicher

146 ERGEBNISSE

Sensitivitätsverlust der U3 LTR PCR bei allen untersuchten Probenarten im Bereich

aller drei Verdünnungsstufen. Bis hin zur Stufe 10-11 wird dieser bei den Blutproben

zu 100% und bei den Gewebe- und den Lungenspülproben zu 96,6 bzw. 94,1%

durch den Einsatz der heminested PCR wettgemacht. Die sichere Nachweisgrenze

von JSRV vor dem Hintergrund von 800-1000 ng genomischer DNA im

Einfachansatz aus allen untersuchten Probenmaterialien kann daher, entsprechend

der in der Verdünnungsstufe 10-9 rechnerisch enthaltenen Molekülzahl mit etwa 230

JSRV-Molekülen angegeben werden. Da aufgrund des in etwa 80% der Fälle

ebenfalls positiven Ergebnisses der Verdünnungsstufe 10-12 vor dem Hintergrund von

Wasser davon ausgegangen werden muß, dass der tatsächliche Gehalt an

amplifizierbaren Molekülen höher als der errechnete ist (für ein positives Ergebnis

muß mindestens ein Zielmolekül im Ansatz vorhanden sein), muß die

Nachweisgrenze realistischer mit etwa 230 – 1000 Plasmidmolekülen vor dem

Hintergrund von 800 – 1000 ng genomischer DNA angegeben werden. In

durchschnittlich 96,7% der Fälle kann in den verschiedenen untersuchten Proben im

Einfachansatz auch die Verdünnungsstufe 10-11, entsprechend zwischen zwei und

zehn Plasmidmolekülen, vor dem Hintergrund genomischer DNA detektiert werden.

Durch Anwendung eines Mehrfachansatzes kann die Nachweisgrenze hier auf

nahezu 100% gesteigert werden.

4.6.3 Nachweisgrenze des Gesamtsystems (Probenbearbeitung / DNA-Extraktion / PCR-Untersuchung) am Modell mit JS7-Zellen versetzter Rinderblutproben

4.6.3.1 Vergleich der Isolierung von Gesamt-DNA aus Buffy-Coat mit einer Methode zur Gewinnung von DNA aus Vollblut (Vorversuche)

Konzentrations- und Reinheitsbestimmung der DNA

Die Bestimmung der OD260 und OD280 erfolgte für die nach beiden Verfahren

präparierten Proben in einer Verdünnung 1/10 mit einem Messvolumen von 100µl.

ERGEBNISSE 147

Mit beiden Verfahren wurden brauchbare DNA-Konzentrationen erzielt. Die

Durchschnittswerte lagen für die mithilfe des Qiagen DNeasyR tissue kits präparierten

Proben (Elution in 400µl Puffer AE) bei 37,96 ng/µl, bei den nach der DNAzolR-

Methode bearbeiteten Proben bei 48,54 ng/µl. Beide Probengruppen unterschieden

sich deutlich in ihren Reinheitswerten (OD260/OD280). Die Werte der OD260/OD280 sind

im einzelnen in Tabelle 30 dargestellt.

Tabelle 30: Vergleich der OD260/OD280 für mit verschiedenen Verfahren aus mit JS7-Zellen versetzten Proben isolierter DNA Verhältnis JS7-

Zellen zu Rinderleukozyten

Qiagen DNeasyR tissue kit

DNAzolR

1:100 1,94 1,55

1:1.000 1,96 1,32

1:10.000 1,99 1,28

Probe 1

ohne Zusatz 1,95 1,55

1:100 1,96 1,65

1:1.000 1,95 1,62

1:10.000 1,97 1,60

Probe 2

ohne Zusatz 1,95 1,59

1:100 1,92 -

1:1.000 2,06 -

1:10.000 1,85 -

Probe 3

(Buffy-Coat

Pellet)

ohne Zusatz 1,90 -

Mittelwert (+ SD) 1,95 (+ 0,05) 1,52 (+ 0,13)

SD: Standardabweichung; OD260: optische Dichte bei 260 nm

148 ERGEBNISSE

PCR-Ergebnisse

Abbildung 7: vergleichende elektrophoretische Darstellung der PCR-Produkte von mit verschiedenen Verfahren zur DNA-Extraktion präparierten, mit JS7-Zellen versetzten Rinderblutproben. Die mit schwarzer Schrift gekennzeichneten Spuren beinhalten die mit dem Qiagen DNeasyR Kit präparierten Proben. Die mit der DNAzolR-Methode präparierten Proben sind weiß beschriftet. Die mitgeführten Kontrollen sind mit den Buchstaben a bis h gekennzeichnet.

Die Bezeichnung der Spuren ist wie folgt: 1/1 Probe 1, Rindervollblut, versetzt mit JS7-Zellen im Verhältnis 1:100 1/2 Probe 1, Rindervollblut, versetzt mit JS7-Zellen im Verhältnis 1:1.000 1/3 Probe 1, Rindervollblut, versetzt mit JS7-Zellen im Verhältnis 1:10.000 1/4 Probe 1, Rindervollblut, ohne Zusatz von JS7-Zellen

ERGEBNISSE 149

2/1 Probe 2, Rindervollblut, versetzt mit JS7-Zellen im Verhältnis 1:100 2/2 Probe 2, Rindervollblut, versetzt mit JS7-Zellen im Verhältnis 1:1.000 2/3 Probe 2, Rindervollblut, versetzt mit JS7-Zellen im Verhältnis 1:10.000 2/4 Probe 2, Rindervollblut, ohne Zusatz von JS7-Zellen 3/1 Probe 3, Rinder-Buffy-Coat, versetzt mit JS7-Zellen im Verhältnis 1:100 3/2 Probe 3, Rinder-Buffy-Coat, versetzt mit JS7-Zellen im Verhältnis 1:1.000 3/3 Probe 3, Rinder-Buffy-Coat, versetzt mit JS7-Zellen im Verhältnis 1:10.000 3/4 Probe 3, Rinder-Buffy-Coat, ohne Zusatz von JS7-Zellen a Plasmidkontrolle, Verdünnungsstufe 10-9 b Plasmidkontrolle, Verdünnungsstufe 10-11

c Plasmidkontrolle, Verdünnungsstufe 10-12

d Plasmidkontrolle, unverdünnt e Plasmidkontrolle, Verdünnungsstufe 10-4 f Plasmidkontrolle, Verdünnungsstufe 10-6 g Wasser-Negativkontrolle I h Wasser-Negativkontrolle II

a) PCR-Ergebnisse der mit dem Qiagen DNeasyR tissue Kit präparierte Proben

Es ergaben sich, wie aus Abbildung 7 ersichtlich, keine Hinweise auf offensichtliche

Unterschiede in der Nachweisgrenze zwischen dem Zusatz von JS7-Zellen zu der

frischen Blutprobe (Proben 1 und 2) im Vergleich zum Zusatz zu dem bereits

präparierten Leukozytenpellet (Probe 3) bei anschließender DNA-Extraktion mit dem

Qiagen DNeasy tissue kit. Die JS7-Zellen scheinen folglich bei der Buffy-Coat-

Präparation keinen die Nachweisgrenze beeinflussenden Schaden zu nehmen. Bei

beiden gespikten Frischblutproben erhielt man wie bei der gespikten Buffy-Coat-

Probe jeweils im Dreifachansatz eine deutliche Bande der erwarteten Größe für das

Zellverhältnis 1:100, jeweils eine etwas schwächere, jedoch nach wie vor deutliche

Bande für das Zellverhältnis 1:1000. Zusätzlich waren bei beiden Frischblutproben 1

und 2 für das Verhältnis 1:10.000 jeweils in zwei von drei Ansätzen eine sehr

schwache Bande erkennbar, während in dieser Stufe alle drei Ansätze der gespikten

Buffy-Coat-Probe (Probe 3) negativ blieben. Die ohne Zusatz von JS7-Zellen für jede

der drei Proben ebenfalls im Dreifachansatz durchgeführte Untersuchung verlief für

alle drei Proben negativ.

150 ERGEBNISSE

b) PCR-Ergebnisse der nach der DNAzolR-Methode (Helena Biosciences,

Sunderland, U.K.) präparierte Proben

Jeweils ein Aliquot der verschiedenen Stufen der Proben 1 und 2 wurde nach dem

Zusatz der entsprechenden Menge der JS7-Zellen abgenommen und einer Methode

der DNA-Extraktion aus Vollblut unterzogen. Für die Stufe 1:100 erhielt man für

beide Proben im Dreifachansatz eine deutlich positive, spezifische Bande, in der

Stufe 1:1000 zeigte nur die Probe 1 in einem von drei Ansätzen eine schwach

positive Bande. Alle übrigen Ansätze zeigten ein negatives Ergebnis. Überdies

schien die mit dieser Methode gewonnene DNA aufgrund der Darstellung im

Agarosegel zum Teil degradiert zu sein.

4.6.3.2 Nachweisgrenze des Gesamtsystems

A Nachweisgrenze der U3 LTR PCR am Modell mit JS7-Zellen versetzter Rinderblutproben

Die Untersuchung von jeweils 800 – 1.000 ng DNA mittels U3-LTR PCR der

verschiedenen Stufen der mit JS7-Zellen versetzten Rinderblutproben erfolgte im

Vierfachansatz. In dieser Untersuchung fragliche oder negative Proben wurden in der

hn PCR nachuntersucht. Die Ergebnisse der Untersuchungen zur Feststellung der

Nachweisgrenze der U3 LTR PCR sind in Tabelle 31 zusammengefasst.

ERGEBNISSE 151

Tabelle 31: Nachweisgrenze der U3 LTR PCR am Modell mit JS7-Zellen versetzter Rinderblutproben

Verhältnis JS7-

Zellen:Rinderleukozyten

Ergebnis der U3 LTR PCR

Ergebnis der hn PCR

1:100 + + + + nicht untersucht





1:5000 + + (+) + nicht untersucht



1:8000 + + (+) + nicht untersucht


1:10.000 + + + + nicht untersucht

1:11.000 + + + (+) nicht untersucht

1:12.000 + + + + nicht untersucht

1:13.000 ((+)) (+) + (+) + + + +

1:14.000 ((+)) + ((+)) (+) + + + +

1:15.000 ? + (+) ((+)) + + + +

ohne Zusatz - - - - - - - -

Untersuchung jeweils im Vierfachansatz +: positiv; (+): schwach positiv; ((+)): sehr schwach positiv; -: negativ; ?: fraglich positiv (d.h. extrem schwache, kaum erkennbare Bande der erwarteten Größe) ++++: vier Ansätze positiv

Bis zur Stufe 1:12.000 wurde jeweils in allen vier Ansätzen in der U3 LTR PCR ein

eindeutig positives Ergebnis erzielt. In den darauffolgenden Stufen wurden die

Banden so schwach, dass eine Nachuntersuchung mit der hn PCR nötig wurde.

152 ERGEBNISSE

B Nachweisgrenze der hn PCR am Modell mit JS7-Zellen versetzter Rinderblutproben

Diese Untersuchungen erfolgten ab der Stufe 1:30.000 (Verhältnis JS7-

Zellen:Rinderleukozyten) zweimal im Dreifachansatz. Jeweils 800 – 1000 ng DNA

wurden mittels U3 LTR PCR und hn PCR untersucht. Die Stufen 1:1000 und

1:15.000 wurden in jeder Reaktionscharge zusätzlich zu den üblichen Kontrollen

jeweils im Einfachansatz als Kontrollen mitgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 32

dargestellt.

Tabelle 32: Nachweisgrenze der hn PCR am Modell mit JS7-Zellen versetzter Rinderblutproben

Verhältnis JS7-Zellen:Rinderleukozyten


Ergebnis der hn PCR

1:1000 + + nicht untersucht

1:15.000 + - + +

1:30.000 (+) (+) (+) - - - + + + + + +

1:40.000 (+) (+) ? - - - + + + + + +

1:50.000 (+) (+) ? - - - + + + + - +

1:60.000 ? ? - - - - + + + - + +

1:70.000 - - - - - - - + - + + -

1:80.000 - - - - - - + + + + + +

1:90.000 - - - - - - - + - + + +

1:100.000 - - - - - - - - - - + -

ohne Zusatz - - - - - - - - - - - -

Untersuchung ab der Stufe 1:30.000 jeweils zweimal im Dreifachansatz +: positiv; (+): schwach positiv; -: negativ ?: fraglich positiv (d.h. extrem schwache, kaum erkennbare Bande) ++++++: sechs Ansätze positiv

Nach einem notwendigen Wechsel des Lieferanten der dNTP’s von der Fa. Roth

(RotimixR PCR 3) zur Fa. Biometra (Finnzymes dNTP Mix) im Januar 2003 wurden

diese Untersuchungen an denselben Proben wiederholt. Für diese Neubestimmung

ERGEBNISSE 153

der Nachweisgrenze wurden die Stufen 1:100, 1:1.000, 1:3.000, 1:9.000 und

1:11.000 aus Tabelle 30 und 1:15.000, 1:30.000 und 1:40.000 aus Tabelle 32 jeweils

im Dreifachansatz, die Stufen 1:50.000 bis 1:100.000 sowie die Probe ohne Zusatz

von JS7-Zellen aus Tabelle 32 jeweils sechsmal (zweimal im Dreifachansatz)

untersucht. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 33 zusammengefaßt.

Tabelle 33: Nachweisgrenze der U3 LTR und hn PCR am Modell mit JS7-Zellen versetzter Rinderblutproben bei Verwendung von Finnzymes dNTP’s

Verhältnis JS7-Zellen:Rinderleukozyten


Ergebnis der hn PCR

1:100 + + + nicht untersucht



1:9000 (+) + + + + +

1:11.000 (+) (+) (+) + + +

1:15.000 - - - + + +

1:30.000 - - - + + +

1:40.000 - - - + + +

1:50.000 - - - - - - + + + - + +

1:60.000 - - - - - - + - + + + -

1:70.000 - - - - - - + + - + + +

1:80.000 - - - - - - + - - + + +

1:90.000 - - - - - - - - - - - -

1:100.000 - - - - - - - + - + - -

ohne Zusatz - - - - - - - - - - - -

Untersuchung im Dreifachansatz, ab der Stufe 1:50.000 jeweils zweimal im Dreifachansatz: +: positiv; (+): schwach positiv; -: negativ ?: fraglich positiv (d.h. extrem schwache, kaum erkennbare Bande) +++: drei Ansätze positiv

154 ERGEBNISSE

Bis zur Verdünnungsstufe 1:40.000 wurde mittels hn PCR mit beiden verwendeten

Nukleotidmischungen in allen untersuchten Ansätzen ein JSRV-spezifisches

Genomfragment detektiert. Danach wurde der Nachweis unzuverlässig. Nach den

vorliegenden Ergebnissen ist jedoch damit zu rechnen, dass bei Untersuchung eines

Dreifachansatzes ein positives Ergebnis (d.h. mindestens einer von drei Ansätzen

positiv) mit beiden verwendeten Nukleotidmischungen bis etwa zur Stufe 1:80.000

erreicht wird. 4.6.4 Southern Blot

Eine Anzahl in der U3 LTR PCR positiver Gewebeproben sowie negativer Blutproben

von an Lungenadenomatose erkrankten Tieren wurden mit den üblichen Plasmid-

und Negativkontrollen einem Southern-Blot unterworfen und mithilfe einer radioaktiv

markierten Sonde (Rediprime II Random Prime Labelling System; Amersham

Pharmacia Biotech) dargestellt. Das als Blotvorlage dienende Agarosegel und die

geblottete Nitrocellulosemembran sind in Abbildung 8 und 9 dargestellt. Alle auf dem

Agarosegel deutlich sichtbaren Banden stellen sich auch auf der geblotteten

Membran dar. Zusätzlich zeigt die Plasmidverdünnungsstufe 10-12 (Probe Nr. 18) ein

schwaches Signal. Die überprüften Blutproben klinisch erkrankter Tiere (Proben 7 bis

11) sowie die Wasser-Negativkontrollen (Proben 19 und 20) sind auch im Southern

Blot negativ.

ERGEBNISSE 155

Abbildung 8: Agarosegel vor Durchführung des Southern Blot

Bezeichnung der Spuren: 1 bis 6: Blutproben-DNA aus dem MRI 7 bis 11: Blutproben von Heidschnucken mit klinischer LA 12 bis 15: Gewebeproben LA-positiver Heidschnucken 16: Plasmidverdünnungsstufe 10-9 17: Plasmidverdünnungsstufe 10-11 18: Plasmidverdünnungsstufe 10-12 19 und 20: Wasser-Negativkontrollen

156 ERGEBNISSE

Abbildung 9: Geblottete Nitrozellulosemembran

Bezeichnung der Spuren: 1 bis 6: Blutproben-DNA aus dem MRI 7 bis 11: Blutproben von Heidschnucken mit klinischer LA 12 bis 15: Gewebeproben LA-positiver Heidschnucken 16: Plasmidverdünnungsstufe 10-9 17: Plasmidverdünnungsstufe 10-11 18: Plasmidverdünnungsstufe 10-12 19 und 20: Wasser-Negativkontrollen

4.6.5 Sequenzierung der PCR-Produkte

Zur Überprüfung der Spezifität der nachgewiesenen Banden wurde eine

Sequenzierung der PCR-Produkte der U3 LTR PCR sowie der GAPDH PCR

durchgeführt. Diese wurde durch die Firma AGOWA GmbH, Berlin vorgenommen.

ERGEBNISSE 157

a) GAPDH PCR

Aus dem 388 bp langen Reaktionsprodukt der GAPDH PCR aus einer

Lungenspülprobe wurde ein 279 bp langes Teilstück sequenziert:

5’ - AGC TCA TCA TCA ATG GAA AGG CCA TCA CCA TCT TCC AGG AGC GAG

ATC CTG CCA ACA TCA AGT GGG ATG ATG CTG GTG CTG AGT ACG TGG

TGG AGT CCA CTG GGG TCT TCA CTA CCA TGA AGA AGG CTG GGG CTC

ACT TGA AGG GTG GCA CCA AGA GGG CAT CAT CTC TGC GCC TTC TGC

CGA TGC CCC CAT GTT TGT GAT GGG CGT GAA CCA GAG AAG TAT AAC ACC

CTC ATG ATT GTC AGC AAT GCC TCC TGC ACC ACC AAC TGC TTG TCC CCC

CC – 3’

b) U3 LTR PCR

Aus dem 176 bp langen Reaktionsprodukt der LTR PCR aus Tumorgewebe eines

klinisch kranken, mit Feldvirus infizierten Schafes wurde ein 117 bp langes Teilstück

sequenziert:

5’ – GCC ACC CTC AAG AAT TTT TAA AGG CTC TTA AGG CTC GGA TGT TTG

CTT TTG GCA CTG CTT CAT AGA AAT ACC AGG AAA TCT GAT TAT ATA AGA

ATC CGG TGA TTG TGT AAA AAT CCG – 3’

Die Sequenzen wurden unter www.ncbi.nlm.nih.gov über das Basic Local Alignment

Search Tool (BLAST) mit bei GenBank registrierten DNA-Sequenzen verglichen.

Das Produkt der GAPDH PCR wies eine Basensequenzhomologie von 94% zu

Sequenzen der Ovis aries Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase auf

(GenBank accession no. AF030943)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

158 ERGEBNISSE

Für das Produkt der U3 LTR PCR wurde eine 98%ige Basensequenzhomologie zum

Genom des britischen JSRV-Stammes JS21 ermittelt (GenBank accession no.

AF105220).

4.7 Untersuchung von Proben aus positiven Herden

4.7.1 Probenübersicht (positive Herden)

Entgegen den Literaturangaben (HOLLAND et al. 1999; GONZALEZ et al. 2001)

sowie den Erfahrungen von DEWAR und SHARP (2000; pers. Mitteilung) erwies sich

die Untersuchung von Blutproben bei den untersuchten Heidschnucken in

Voruntersuchungen als wenig vielversprechend (selbst von klinisch erkrankten

Tieren wurden überwiegend negative Ergebnisse erzielt), so dass im Laufe der

Untersuchungen dazu übergegangen wurde, neben den unter 3.9 und 4.6

beschriebenen Untersuchungen zur Abklärung möglicher falsch-negativer Resultate

von den zur Sektion vorgesehenen Tieren und einigen Schlachttieren auch

Lungenspülproben zu entnehmen. Dies war bei den ersten Tieren nicht erfolgt, so

dass nicht von allen Tieren Lungenspülproben für die PCR-Untersuchung zur

Verfügung standen. Bei den Tieren der Kategorie IV wurde auf die routinemäßige

Untersuchung der Blut- und Lungengewebsproben aus Kostengründen zugunsten

der vielversprechenderen Untersuchung von Lungenspülproben und Ln.

mediastinalis caudalis verzichtet.

Eine Übersicht über die Anzahl und Art der untersuchten Proben von Sektions- und

Schlachttieren der verschiedenen Kategorien aus positiven Herden ist in Tabelle 34

gegeben.

ERGEBNISSE 159

Tabelle 34: Probenübersicht (positive Herden); Anzahl mit der PCR untersuchter Proben von Schlacht- und Sektionstieren der verschiedenen Kategorien


Definition makroskopisch LA, histologisch bestätigt

n = 65 (davon Gruppe D n=28 /

Gruppe C n = 19)

makroskopisch keine Hinweise

auf LA, histologisch LA

n = 14

makroskopisch keine Hinweise auf LA, histo-

logisch fraglich

n = 7

weder makroskopisch

noch histologisch

Hinweise auf LA

n = 72

BAL n = 39 (Gr. D n=17 / Gr. C n=12)

n = 12 n = 3 n = 67

Blut n = 57 (Gr. D n=24 / Gr. C n=19)

n = 13 n = 6 n = 4

Ln. mediastinalis

caudalis

n = 58 (Gr. D n=25 / Gr. C n=19)

n = 11 n = 7 n = 66

Tumorgewebe n = 57 (Gr. D n=26 / Gr. C n=19)

- - -

makroskopisch unverändertes Lungengewebe

n = 25 (Gr. D n=7 / Gr. C n=9)

n = 11 n = 7 n = 7

n = Anzahl Tiere/Proben der entsprechenden Kategorie. Für die Kategorie I wurden zusätzlich zur Gesamtzahl die entsprechenden Zahlen der klinischen Untergruppen D (klinisch krank) und C (klinischer Verdacht) in Klammern dahinter gesetzt. Gr: Gruppe; LA: Lungenadenomatose Ln.: Lymphonodus

4.7.2 Ergebnisse der PCR-Untersuchungen aus den positiven Herden

4.7.2.1 Tiere mit makroskopisch nachweisbaren Tumoren (Kategorie I) Definition der Kategorie I: makroskopisch LA, histologisch bestätigt

Die 65 Tiere der Kategorie I umfassen ein recht heterogenes Probengut – sie setzen

sich zusammen aus 28 klinisch an Lungenadenomatose erkrankten Tieren (klinische

160 ERGEBNISSE

Gruppe D, Schubkarrentest positiv), 19 Tieren der klinische Gruppe C (Verdacht auf

Lungenadenomatose) und 18 Tieren, die bei der klinischen Untersuchung wenig oder

keine Verdachtsmomente auf eine respiratorische Erkrankung lieferten (Gruppen A

und B), die jedoch bei der Sektion makroskopisch Lungenadenomatose-verdächtige

Läsionen aufwiesen. Die Größe dieser Läsionen war zum Teil sehr gering (ca.

Kirschgröße).

Das Ergebnis der PCR-Untersuchung der verschiedenen Proben bei dreifacher

Untersuchung mittels U3 LTR und gegebenenfalls hn PCR ist für die klinischen

Untergruppen und die Probengesamtheit der Kategorie I in den Tabellen 35 bis 39

dargestellt. Ein Untersuchungsergebnis wurde als positiv gewertet, wenn in

mindestens einem von drei Ansätzen ein positives PCR-Ergebnis erzielt wurde und

alle mitgeführten Negativkontrollen ein negatives Ergebnis aufwiesen.

Tabelle 35: Ergebnis der PCR-Untersuchung von Lungenspülproben von Tieren der Kategorie I (n=39)

U3 LTR PCR + + +

hn PCR

+ + +

hn PCR

+ + -

hn PCR

+ - -

U3 LTR und hn PCR

- - - 16 1 - - - klin. krank

n=17 positiv: 100 % negativ: 0 %

12 - - - - klin. Verd. n=12 positiv: 100 % negativ: 0 %

7 - 1 - 2 klin. LA-unverd. n= 10 positiv: 80 % negativ: 20%

35 1 1 - 2 Gesamtheit der Kat. I

n=39 positiv: 94,9 % negativ: 5,1%

Die Untersuchung erfolgte für jede Probe im Dreifachansatz; n=Anzahl Tiere +++: alle drei Ansätze positiv; ++-: zwei von drei Ansätzen positiv; + - -: einer von drei Ansätzen positiv; - - -: alle drei Ansätze negativ; unverd.: unverdächtig; klin.: klinisch; Verd.: Verdacht

ERGEBNISSE 161

Tabelle 36: Ergebnis der PCR-Untersuchung von Blutproben (Buffy-Coat) von Tieren der Kategorie I (n=57)

U3 LTR PCR + + +

hn PCR + + +

hn PCR + + -

hn PCR + - -

U3 LTR und hn PCR

- - - - 2 1 1 24 klin. krank

n=24 positiv: 20 % negativ: 80%

- - - - 19 klin. Verd. n=19 positiv: 0 % negativ: 100%

- - - - 14 klin. LA-unverd. n= 14 positiv: 0 % negativ: 100%

- 2 1 1 53 Gesamtheit der Kat. I


Die Untersuchung erfolgte für jede Probe im Dreifachansatz; n=Anzahl Tiere +++: alle drei Ansätze positiv; ++-: zwei von drei Ansätzen positiv; + - -: einer von drei Ansätzen positiv; - - -: alle drei Ansätze negativ

Tabelle 37: Ergebnis der PCR-Untersuchung von Gewebeproben des Ln. mediastinalis caudalis von Tieren der Kategorie I (n=58)

U3 LTR PCR + + +

hn PCR + + +

hn PCR + + -

hn PCR + - -

U3 LTR und hn PCR

- - - 16 5 2 2 - klin. krank


10 4 1 - 4 klin. Verd. n=19 positiv: 78,9 % negativ: 21,1%

7 - 2 2 3 klin. LA-unverd. n= 14 positiv: 78,6 % negativ: 21,4%

33 9 5 4 7 Gesamtheit der Kat. I



162 ERGEBNISSE

Tabelle 38: Ergebnis der PCR-Untersuchung von Tumorgewebe bzw tumorverdächtigem Gewebe von Tieren der Kategorie I (n=57)

U3 LTR PCR + + +

hn PCR + + +

hn PCR + + -

hn PCR + - -

U3 LTR und hn PCR

- - - 26 - - - - klin. krank


18 - - - - klin. Verd. n=18 positiv: 100 % negativ: 0 %

12 1 - - - klin. LA-unverd. n= 13 positiv: 100 % negativ: 0 %

56 1 - - - Gesamtheit der Kat. I



Tabelle 39: Ergebnis der PCR-Untersuchung von makroskopisch unverändertem Gewebe von Tieren der Kategorie I (n=25)

U3 LTR PCR + + +

hn PCR + + +

hn PCR + + -

hn PCR + - -

U3 LTR und hn PCR

- - - 4 1 - - 2 klin. krank


3 2 - - 2 klin. Verd. n=7 positiv: 71,4 % negativ: 28,6%

3 2 2 - 4 klin. LA-unverd. n= 11 positiv: 63,6 % negativ: 36,4%

10 5 2 - 8 Gesamtheit der Kat. I



ERGEBNISSE 163

4.7.2.2 Tiere mit lediglich histologisch nachgewiesener Lungen-adenomatose (Kategorie II)

Definition der Kategorie II: makroskopisch keine Hinweise auf LA, histologisch LA

nachgewiesen

Diese 14 Tiere entstammen alle den klinischen Gruppen A und B. Das

Untersuchungsergebnis der verschiedenen Proben dieser Tiere ist in Tabelle 40

zusammengefasst.

Tabelle 40: Ergebnis der PCR-Untersuchung von BAL-, Blut- und Gewebeproben von Tieren der Kategorie II (n=14)

U3 LTR PCR + + +

hn PCR + + +

hn PCR + + -

hn PCR + - -

U3 LTR und hn PCR

- - - 4 2 - 3 3 BAL


- - - - 13 Blut


3 - - 2 6 Ln. mediastinalis

caudalis n=11

positiv: 45,5 % negativ: 54,5%


Zusätzlich wurden von elf dieser Tiere jeweils makroskopisch unverändertes

Lungengewebe von zwei Lungenlokalisationen mittels PCR untersucht. Bei zwei

Tieren wurde in beiden Lokalisationen ein positives Ergebnis erzielt, dabei aus

mindestens einer Lokalisation bereits in der U3 LTR PCR. Bei fünf weiteren Tieren

wurde in der hn PCR aus jeweils einer Lokalisation JSRV detektiert (3x +++; 1x ++-;

1x +--), während die Untersuchung der jeweils zweiten Lokalisation des

entsprechenden Tieres ein negatives Ergebnis lieferte. Mit einer Untersuchung von

164 ERGEBNISSE

zwei Lungenlokalisationen wurde demnach JSRV bei sieben Tieren (63,6%)

nachgewiesen. Bei vier Tieren (36,4%) war die dreimalige Untersuchung beider

Lokalisationen negativ.

4.7.2.3 histologisch negative Tiere (Kategorie IV) Definition der Kategorie IV: weder makroskopisch noch histologisch Hinweise auf LA

Von den 72 Tieren dieser Kategorie wurden zunächst lediglich die Lungenspülproben

und Gewebe des Ln. mediastinalis caudalis mittels PCR untersucht. Diese

Ergebnisse sind in Tabelle 41 dargestellt.

Tabelle 41: Ergebnis der PCR-Untersuchung von BAL- und Gewebeproben von Tieren der Kategorie IV (n=72)

U3 LTR PCR + + +

hn PCR + + +

hn PCR + + -

hn PCR + - -

U3 LTR und hn PCR

- - - 1 2 - 1 63 BAL


- - 1 - 65 Ln. mediastinalis

caudalis n=66

positiv: 1,5 % negativ: 98,5%


Die insgesamt vier Tiere mit positivem Nachweis von JSRV-spezifischen

Genomfragmenten mittels PCR aus der Lungenspülprobe (bei einem Tier zusätzlich

auch aus dem Lymphknoten) sind sehr wahrscheinlich als falsch-negative Befunde

der histologischen Untersuchung anzusehen. Bei allen vier Tieren bestanden weder

klinisch noch makroskopisch Hinweise oder Verdachtsmomente auf eine

Lungenadenomatose-Erkrankung. Aus dem asservierten Gewebe konnte jedoch bei

zwei dieser vier Tiere der positive JSRV-Nachweis bestätigt werden. Die

ERGEBNISSE 165

Untersuchungsergebnisse dieser vier Tiere sind im Detail der Tabelle 42 zu

entnehmen.

Tabelle 42: Übersicht über die Untersuchungsergebnisse der vier PCR-positiven Tiere aus Kategorie IV (histologisch negativ)

Tier 1 OM 1683

Tier 2 OM 1701

Tier 3 OM 1727

Tier 4 OM 60

klin. Befund 7 Jahre, w klinisch o.b.B

7 Jahre, w klinisch o.b.B

7 Jahre, w klinisch o.b.B

10 Monate, m klinisch o.b.B Mutter an LA

erkrankt makro-

skopisch keine Hinweise auf LA, rechter cranio-

ventraler Hauptlappen

solitärer, ca. 1,5 cm großer Abszeß

keine Hinweise auf LA



histologisch subakute bis chronische

abszedierende Herdpneumonie

o.b.B o.b.B o.b.B

PCR BAL U3 LTR - - - hn + - -

U3 LTR + + + U3 LTR (+)(+)(+) hn + + +

U3 LTR - - - hn + + +

PCR Ln. med.

caud.

U3 LTR - - - hn - - -

U3 LTR - - - hn + + -

U3 LTR - - - hn - - -

U3 LTR - - - hn - - -

PCR Lungenge-

webe

2 Lokalisationen U3 LTR - - -

hn - - -

2 LokalisationenU3 LTR - - -

hn - - -

2 Lokalisationen U3 LTR - - -

hn - - -

1. Lokalisation U3 LTR - - -

hn + - - 2. Lokalisation

negativ Die PCR-Untersuchung erfolgte für jede Probe im Dreifachansatz; OM: Ohrmarke; o.b.B.: ohne besonderen Befund U3 LTR: Ergebnis der U3 LTR PCR; hn: Ergebnis der hn PCR +++: alle drei Ansätze positiv; (+)(+)(+):alle drei Ansätze schwach positiv; ++-: zwei von drei Ansätzen positiv; + - -: einer von drei Ansätzen positiv; - - -: alle drei Ansätze negativ

166 ERGEBNISSE

4.7.2.4 Statistische Bewertung der Ergebnisse

Der Wert eines diagnostischen Tests wird mit zwei Maßzahlen beschrieben. Die

Sensitivität eines Tests besagt, mit welcher Wahrscheinlichkeit tatsächlich Kranke als

krank, die Spezifität, mit welcher Wahrscheinlichkeit tatsächlich Gesunde als gesund

erkannt werden (GUGGENMOOS-HOLZMANN und WERNECKE 1995).

Das fehlen eines sogenannten „Golden Standard“ macht die statistische Bewertung

der Ergebnisse dieser Untersuchung schwierig. Ein sicheres Nachweisverfahren für

eine stattgefundene Infektion mit JSRV existiert bislang nicht. Sowohl bei der

systematischen histologischen Untersuchung als auch bei der PCR aus den

verschiedenen Proben können falsch-negative Resultate auftreten. Aufgrund der

Spezifität der Primer sind falsch-positive Ergebnisse der PCR primär durch

Laborkontaminationen möglich. Durch adäquate Kontrollen kann dies weitestgehend

ausgeschlossen werden. Das Restrisiko sporadischer Kontaminationen, bei denen

es zu einem falsch-positiven Ergebnis einer Probe kommt, ohne dass gleichzeitig ein

positives Ergebnis bei einer der Negativkontrollen auftritt, ist nicht quantifizierbar.

Falsch-positive oder fragliche Ergebnisse in der histologischen Untersuchung können

durch Fehlinterpretationen von Hyperplasien des Bronchialepithels aufgrund anderer

Ursachen zustande kommen.

Die Ermittlung der Sensitivität des Nachweises von JSRV aus verschiedenen

intravital zu gewinnenden Proben ist daher nur in Relation zu der hier als

Referenzmethode verwendeten histologischen Untersuchung möglich. Sie errechnet

sich wie folgt:

Anzahl positiver Proben mit der untersuchten Methode Relative Sensitivität (%) = x 100 Anzahl positiver Proben mit der Referenzmethode

Falsch-positive Resultate sind aufgrund der oben genannten Schwierigkeiten nicht

quantifizierbar, und im Grenzbereich beginnender Läsionen stoßen beide

Untersuchungsverfahren an ihre Grenzen, so dass hier falsch-negative Befunde

ERGEBNISSE 167

auftreten können. Die Berechnung einer relativen Spezifität auf der Grundlage der

Einordnung eines histologisch negativen Ergebnisses als „richtig negativ“ und

eventueller positiver PCR-Befunde von diesen Tieren als „falsch-positiv“ ist daher

nicht uneingeschränkt zulässig. Die Untersuchungen histologisch negativer und

zugleich PCR-positiver Tiere haben gezeigt, dass das positive PCR-Ergebnis der

Lungenspülprobe in drei von vier Fällen durch unabhängige Untersuchung von

Organmaterial mittels PCR oder eine Mehrfachuntersuchung der Probe verifiziert

werden konnte.

Da die Blutproben der histologisch negativen Tiere aufgrund der extrem niedrigen

Sensitivität einer PCR aus diesem Probenmaterial aus Gründen der Kostenersparnis

nicht untersucht wurden, kann eine Berechnung der relativen Spezifität für diese

Probenart nicht durchgeführt werden. Unter Berücksichtigung der genannten

Einschränkungen berechnet sich die relative Spezifität wie folgt:

Anzahl negativer Proben mit der untersuchten Methode Relative Spezifität (%) = x 100 Anzahl negativer Proben mit der Referenzmethode

Bezogen auf die Gesamtheit aller histologisch bestätigten Lungenadenomatose-Fälle

(Tiere der Kategorie I und II) wurden für die PCR-Untersuchung von

Lungenspülproben, Blutproben und des Lymphonodus mediastinalis caudalis (als

mögliche Alternativmethode zur Histologie in der Schlachttieruntersuchung) die in

Tabelle 43 und 44 dargestellten relativen Sensitivitäten und Spezifitäten ermittelt. Sie

wurden sowohl für die hier durchgeführte Untersuchung der Proben im

Dreifachansatz, als auch für eine Untersuchung im Einfachansatz berechnet. Für

letztere Berechnung wurden Proben als im Einfachansatz detektierbar eingeordnet,

wenn in sie in allen drei Ansätzen ein positives Ergebnis gezeigt hatten. Der

Möglichkeit, dass auch ein Teil der Proben mit zwei oder lediglich einem positiven

Ergebnis in den drei untersuchten Ansätzen mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit

bei einer Untersuchung im Einfachansatz ein positives Ergebnis zeigen wird, wurde

dahingehend Rechnung getragen, dass die Hälfte der Proben mit zweifach positivem

168 ERGEBNISSE

Ergebnis und ein Drittel der Proben mit einfach positivem Ergebnis ebenfalls als im

Einfachansatz detektierbar eingestuft wurden.

Tabelle 43: Relative Sensitivität der PCR-Untersuchung (Tiere der Kategorie I und II) im Vergleich zur systematischen Histologie (vier Lungenlokalisationen)

Relative Sensitivität Probenart Anzahl untersuchter Proben Dreifachansatz Einfachansatz

BAL 51 90,2 % 85,3 %

Blut 70 5,7 % 4,0 %

Ln. med. caud. 69 81,2 % 71,7 %

Ln. med. caud.: Lymphonodus mediastinalis caudalis

Tabelle 44: Relative Spezifität der PCR-Untersuchung im Vergleich zur systematischen Histologie (vier Lungenlokalisationen), berechnet für die Gesamtheit der Tiere der Kategorie IV (n=67 bzw. n=66)

Relative Spezifität Probenart Anzahl untersuchter Proben Dreifachansatz Einfachansatz

BAL 67 94,0 % 95,0 %

Ln. med. caud. 66 98,5 % 99,2 %

Es wurde bereits darauf hingewiesen, dass das histologisch negative Ergebnis von

mindestens drei der vier PCR-positiven Tiere der Kategorie IV (siehe Tabelle 41 und

42) aufgrund der Ergebnisse einer wiederholten Untersuchung der Proben bzw. des

parallelen Nachweises von JSRV aus Gewebematerial mittels PCR als falsch-negativ

betrachtet werden muß. Diese drei falsch-negativen histologischen Befunde dürfen

daher nicht in die Berechnung der Spezifität einbezogen werden. Für die

verbleibende Anzahl mutmaßlich richtig-negativer histologischer Befunde von 64

bzw. 63 Tieren ergibt sich daher für eine PCR-Untersuchung im Dreifach- und

Einfachansatz von Lungenspül- und Lymphknotengewebeproben die in Tabelle 45 dargestellte relative Spezifität.

ERGEBNISSE 169

Tabelle 45: Relative Spezifität der PCR-Untersuchung im Vergleich zur systematischen Histologie (vier Lungenlokalisationen), berechnet für die richtig-negativen histologischen Befunde der Tiere der Kategorie IV (n=64 bzw n=63)

Relative Spezifität Probenart Anzahl untersuchter Proben Dreifachansatz Einfachansatz

BAL 64 98,4 % 99,5 %

Ln. med. caud. 63 100 % 100 %

Die in Tabelle 34 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die PCR-Untersuchung von

Lungenspülproben ein geeignetes diagnostisches Hilfsmittel ist, um einen klinischen

Verdacht auf Lungenadenomatose zu bestätigen. Bei allen klinisch erkrankten Tieren

und allen Tieren mit klinischem Verdacht wurde JSRV mittels PCR aus einer

Lungenspülprobe nachgewiesen. Für einen erfahrenen Kliniker ist eine derartige

Untersuchung in diesem fortgeschrittenen Erkrankungsstadium jedoch sicherlich oft

entbehrlich. Interessant ist daher für die Untersuchung in Sanierung befindlicher

Herden oder die Ankaufsuntersuchung von Einzeltieren die relative Sensitivität der

PCR-Untersuchung von Lungenspülproben von Tieren, bei denen bei eingehender

klinischer Untersuchung keine Hinweise auf eine mögliche Lungenadenomatose-

Erkrankung bestehen (klinische Gruppen A und B), bei denen jedoch postmortal

makroskopisch und/oder histologisch Lungenadenomatose nachgewiesen wurde. Zu

diesem Zweck wurden die Untersuchungsergebnisse der Lungenspülproben sowie

der Blut- und Gewebeproben klinisch LA-unverdächtiger Tiere der Kategorie I mit

denen der Kategorie II in der Tabelle 46 zusammengefasst.

170 ERGEBNISSE

Tabelle 46: Ergebnis der PCR-Untersuchung von BAL-, Blut- und Gewebeproben von klinisch LA-unverdächtigen Tieren der Kategorien I und II

U3 LTR PCR + + +

hn PCR + + +

hn PCR + + -

hn PCR + - -

U3 LTR und hn PCR

- - - 11 2 1 3 5 BAL


- - - - 27 Blut


10 - 2 4 9 Ln. mediastinalis

caudalis n=25

positiv: 64 % negativ: 36%

Bei der Durchführung eines Dreifachansatzes beträgt die relative Sensitivität der

PCR-Untersuchung von Lungenspülproben klinisch LA-unverdächtiger Tiere

demnach 77,3 %. Eine Untersuchung im Doppelansatz reduziert die relative

Sensitivität auf 70,5%, im Einfachansatz auf 65,9 %.

4.7.2.5 histologisch fragliche Tiere (Kategorie III)

Die Untersuchungsergebnisse der Proben der histologisch fraglichen Tiere aus den

positiven Herden (Kategorie III) sind für die sieben Tiere dieser Kategorie in Tabelle

47 zusammengestellt. Bei zwei Tieren konnte das histologische Ergebnis mittels

PCR erhärtet werden. Es war jeweils jedoch nur eine der untersuchten Proben

positiv. Bei den übrigen Tieren verlief die PCR-Untersuchung aller vorhandenen

Proben negativ. Interessant ist ein Tier (Ohrmarke Nr. 1606), das zum Zeitpunkt der

Sektion mit einem Fetus (Scheitel-Steiß-Länge ca. 14 cm) tragend war. Unter sterilen

Kautelen entnommenes fetales Lungen- und Thymusgewebe wurde ebenfalls jeweils

im Dreifachansatz mittels PCR untersucht. Während die Untersuchung des

Lungengewebes ein negatives Ergebnis lieferte, war einer von drei Ansätzen bei der

Untersuchung des fetalen Thymus in der heminested PCR positiv. Bei der

ERGEBNISSE 171

Wiederholung im Sechsfachansatz war einer von sechs Ansätzen in der hn PCR

positiv. Sämtliche mitgeführten Negativkontrollen waren negativ. Eine erneute PCR-

Untersuchung im Sechsfachansatz nach einer erneuten DNA-Extraktion aus

asserviertem Thymusgewebe konnte das positive Ergebnis jedoch nicht

reproduzieren.

172 ERGEBNISSE

ERGEBNISSE 173

4.7.2.6 Untersuchung von Lämmern aus einer positiven Herde

A Übersicht

Eine Übersicht der 18 Lämmer aus der Tütsberger Herde, von denen im Jahr 2001

regelmäßige Blutprobenentnahmen erfolgten, ist in Tabelle 4 (Kapitel 3.3.1 C)

gegeben. Im neunten Lebensmonat wurden von 15 dieser Tiere Lungenspülproben

entnommen. Von 13 Lämmern konnten im Alter von zehn bis 15 Monaten

Schlachtbefunde und histologische Befunde erhoben werden.

B Ergebnis der PCR-Untersuchung der Lungenspülproben

Die Lungenspülproben der 13 Lämmer, von denen postmortale Lungenbefunde

erhoben werden konnten, wurden jeweils im Dreifachansatz mittels U3 LTR und hn

PCR untersucht. Die Ergebnisse der klinischen, pathologisch-anatomischen und

histologischen Untersuchung sowie der Untersuchung der BAL mittels PCR sind in

Tabelle 48 dargestellt.

174 ERGEBNISSE

Tabelle 48: Ergebnisse der klinischen, pathologisch-anatomischen und histologischen Untersuchung der Tütsberger Lämmer und molekularbiologische Untersucnung der Lungenspülproben Lamm Mutter Klinischer

Befund am 2.11.01

Lungenbefund (histologisch)

PCR BAL

377 klin. LA Gruppe B rechter und linker Spitzen- und Hauptlappen Bild wie

bei LA; solitäre Lymphknotenmetastase

U3 LTR (+)(+)(+) hn + + +

371 unauffällig Gruppe A fraglich negativ

60 klin. LA Gruppe A negativ U3 LTR - - - hn + + +

363 unauffällig Gruppe B 1 Hauptlappenlokalisation makroskopisch und

histologisch Bild wie bei LA

U3 LTR - - - hn + + -

362 unauffällig Gruppe A negativ negativ









Gruppe A: klinisch ohne besonderen Befund; Gruppe B: respiratorische Symptome, jedoch klinisch keine konkreten Hinweise auf LA U3 LTR: Ergebnis der U3 LTR PCR; hn: Ergebnis der hn PCR; alle Untersuchungen im Dreifachansatz; +++: alle drei Ansätze positiv; (+)(+)(+): alle drei Ansätze schwach positiv; ++-: zwei von drei Ansätzen positiv; - - -: alle drei Ansätze negativ

ERGEBNISSE 175

C Ergebnisse der PCR-Untersuchung der Blut- und Gewebeproben von vier ausgewählten Lämmern

Aufgrund der Ergebnisse der histologischen Untersuchung, der PCR-Untersuchung

der Lungenspülproben und des Vorberichtes (zum Teil klinisch an LA erkrankte

Muttertiere) wurden die vier Lämmer mit den Ohrmarken 377, 371, 60 und 363 zur

weiteren Untersuchung ausgewählt. Alle elf Blutproben dieser vier Lämmer wurden

jeweils im Dreifachansatz mittels U3 LTR und hn PCR untersucht. Zusätzlich wurden

Gewebeproben des Ln. mediastinalis caudalis sowie von zwei Lungenlokalisationen

ebenfalls im Dreifachansatz in der PCR untersucht. Die Ergebnisse dieser

Untersuchungen sind in Tabelle 49 dargestellt:

Tabelle 49: Ergebnisse der PCR-Untersuchung der Blutproben sowie Gewebe- und BAL-Proben von vier ausgewählten Lämmern Lamm

OM BAL Blutproben Ln. med.

caud. Lungengewebe

377 U3 LTR (+)(+)(+) hn + + +

6. Entnahme (44. Lebenstag):

U3 LTR - - - hn + - -

übrige 10 Proben negativ

U3 LTR (+)(+)(+) hn + + +

U3 LTR + + +

371 negativ Zu allen 11 Entnahme-zeitpunkten:

negativ

negativ 2 Lokalisationennegativ

60 U3 LTR - - - hn + + +

Zu allen 11 Entnahme-zeitpunkten:

negativ

negativ 1 von 2 Lokalisationen U3 LTR - - -

hn + - - 363 U3 LTR - - -

hn + + - Zu allen 11 Entnahme-

zeitpunkten: negativ

U3 LTR - - - hn + - -

U3 LTR + + +

OM: Ohrmarke; U3 LTR: Ergebnis der U3 LTR PCR; hn: Ergebnis der hn PCR; alle Untersuchungen im Dreifachansatz; +++: alle drei Ansätze positiv; (+)(+)(+): alle drei Ansätze schwach positiv; ++-: zwei von drei Ansätzen positiv; +- -:einer von drei Ansätzen positiv; - - -: alle drei Ansätze negativ

176 ERGEBNISSE

4.8 Untersuchung von Tieren und Probenmaterial aus der Döhler Herde

4.8.1 Klinische Untersuchung der Döhler Herde

Zu keinem Zeitpunkt wurden bei Bestandsbesuchen im Rahmen der

Herdenbetreuung durch den Schaf- und Ziegengesundheitsdienst, bei zahlreichen

Probenentnahmeterminen oder durch den für respiratorische Erkrankungen stark

sensibilisierten Schäfer Hinweise auf klinische Lungenadenomatose-Erkrankungen

festgestellt. Andere respiratorische Erkrankungen traten im Untersuchungszeitraum

lediglich als Einzelfälle auf. Tiere, die Husten zeigten, wurden prinzipiell

baldmöglichst geschlachtet und ihre Lungen makroskopisch und histologisch

untersucht.

4.8.2 Sektionen verendeter Tiere

Die Befunde der neun im Untersuchungszeitraum natürlich verendeten Tiere sind in

Tabelle 50 dargestellt. Sie wurden routinemäßig durch Herrn Dr. Michael Brügmann

(Abteilung Pathologie des Instituts für Tiergesundheit der LUFA Nord-West)

untersucht. Bei allen Tieren wurde routinemäßig auch eine systematische

histologische Untersuchung der Lunge durchgeführt. Makroskopische oder

histologische Hinweise auf Lungenadenomatose wurden bei keinem der

untersuchten Tiere festgestellt.

ERGEBNISSE 177

Tabelle 50: Sektionsbefunde verendeter Tiere > 6 Monate aus der Döhler Herde (Herbst 2000 bis Ende 2003) Todesjahr Alter Geschlecht klinischer Befund Sektionsbefund

2000 1,5 J w perakut verendet Myokardose ungeklärter Ursache

2001 6 Mon w im Elektrozaun hängend tot aufgefunden

histologisch mittelgradig alveoläre katarrhalisch-eitrige

Herdpneumonie (Mikrobiologie: mgr.

unspezifischer Keimgehalt) 2001 2 J w perakut verendet hgr. Cholangitis +

Pericholangitis eosinophilica ungeklärter Ursache

2002 2 J m Husten, nach kurzer Zeit trotz antibiotischer Behandlung

verendet

hgr. katatarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie; keine

mikrobiologische Untersuchung

2002 3 J m Husten, nach kurzer Zeit trotz antibiotischer Behandlung

verendet

hgr. eitrig-nekrotisierende Bronchopneumonie;

Mikrobiologie: hgr. alpha-hämolys. Streptokokken, hgr. Arcanobacterium pyogenes,

mgr. unspezifischer Keimgehalt

2003 2 w Über Raufe gesprungen und

hängengeblieben, nach 24 h verendet

hgr. Muskeltrauma der Hintergliedmaßen,

Myoglobinurie

2003 2 w Zurückbleiben hinter der Herde, Festliegen; nach

24 h verendet

Fibrinopurulente Endometritis; Volvolus jejuni

2003 4 w perakut verendet Lunge o.b.B; Todesursache unklar

2003 1 J w perakut verendet Clostridium-perfringens- Enterotoxämie

o.b.B: ohne besonderen Befund; w: weiblich; m: männlich; J: Jahre; Mon: Monate; mgr.: mittelgradig; hgr.:hochgradig; hämolys.: hämolysierend

178 ERGEBNISSE

4.8.3 Untersuchung der Altböcke

Ende des Jahres 2002 wurden die von Herbst 2000 an in der Döhler Herde als

Deckböcke genutzten Altböcke aus züchterischen Gründen aus der Herde entfernt.

Zu diesem Zeitpunkt waren sie ca. acht Jahre alt. Beide Tiere waren klinisch gesund

und zeigten insbesondere keine Anhaltspunkte für das Vorliegen respiratorischer

Erkrankungen (klinische Gruppe A). Beide Tiere wurden nach Entnahme von Blut-

und Lungenspülproben euthanasiert. Es bestanden bei beiden Tieren weder

pathomorphologisch noch histologisch Anhaltspunkte für das Vorliegen einer

Lungenadenomatose.

Die vor der Euthanasie gewonnenen Lungenspülproben wurden ebenso wie

Gewebeproben des Ln. mediastinalis caudalis und zweier Lungenlokalisationen

jeweils im Dreifachansatz mittels PCR untersucht. Diese Untersuchungen verliefen

für alle genannten Proben negativ. Auch im Sommer 2002 waren im Rahmen der

Herdenuntersuchung von diesen Tieren Lungenspülproben entnommen worden.

Diese Proben waren in dreifacher PCR-Untersuchung ebenfalls negativ.

4.8.4. Untersuchung der Schlachtlungen

4.8.4.1 Makroskopische Untersuchung

Bei keiner der 299 untersuchten Schlachtlungen bestand makroskopisch der

Verdacht auf Lungenadenomatose. Häufige Befunde waren solitäre,

stecknadelkopfgroße, vermutlich parasitär bedingte Granulome (n = 45), fokale,

sublobulär begrenzte oder straßenförmige Atelektasen (n = 33) und fleckige

Rötungen aufgrund agonal bedingter Blutaspiration (n = 61). Bei 15 der untersuchten

Lungen (5,0%) bestand makroskopisch der Verdacht auf pneumoniebedingte

Veränderungen. Eine mikrobiologische Untersuchung wurde lediglich in zwei Fällen

durchgeführt. Als pathogene Keime wurden alpha-hämolysierende Streptokokken

ERGEBNISSE 179

und in einem Fall Mannheimia haemolytica nachgewiesen. Corynebacterium

pseudotuberculosis oder Pseudotuberkulose-verdächtige Läsionen wurden nicht

nachgewiesen.

4.8.4.2 Systematische Histologie

Von insgesamt 169 Schlachttieren (56,5% der im Untersuchungszeitraum

geschlachteten Tiere) wurden mindestens vier definierte Lungenlokalisationen sowie

der Lymphonodus mediastinalis caudalis histologisch untersucht. Sofern an anderen

Lokalisationen makroskopische Veränderungen bestanden, wurden hiervon

Zusatzproben genommen. Alle elf in der Zeit vom Frühjahr 2001 bis Ende 2003

geschlachteten Alttiere sind in dieser Untersuchungsgruppe enthalten. Von diesen

Tieren waren drei jeweils knapp fünf Jahre alt, zwei Tiere waren vier Jahre, vier

waren drei Jahre und zwei Tiere zwei Jahre alt. Bei den übrigen Tieren handelte es

sich um Schlachtlämmer im Alter von neun bis 14 Monaten.

Bei einem im Frühjahr 2001 geschlachteten, ca. 13 Monate alten mutterlos

aufgezogenen Lamm des Geburtsjahrganges 2000 wurde histologisch in einer der

vier untersuchten Lokalisationen die Diagnose Lungenadenomatose gestellt. Bei

einem weiteren gleichaltrigen Tier bestand in einer Hauptlappenlokalisation fokal

eine mittelgradige Proliferation von Bronchialepithel mit dem Verdacht auf maligne

Transformation. Lungenadenomatose konnte histologisch weder bestätigt noch

ausgeschlossen werden. Die Untersuchungsergebnisse dieser beiden Tiere sind

bereits in die Arbeit von KRÄMER (2001) eingeflossen.

Eine weitere histologisch fragliche Diagnose wurde bei einem im Alter von ca.

viereinhalb Jahren geschlachteten Alttier des Geburtsjahrganges 1999 gestellt. Hier

wurde in einer Spitzenlappenlokalisation eine umschriebene Atelektase infolge

geringgradiger subakuter katarrhalisch-eitriger Herdpneumonie diagnostiziert.

Innerhalb dieser Lokalisation fand sich fokal geringgradig hyperplastisches Epithel

des bronchioloalveolären Überganges. Lungenadenomatose konnte histologisch

180 ERGEBNISSE

weder bestätigt noch ausgeschlossen werden. Bei den übrigen 166 untersuchten

Tieren bestanden histologisch keine Anhaltspunkte für das Vorliegen einer

Lungenadenomatose. Die detaillierte makroskopische und histologische Beurteilung

der Lungen der drei oben genannten Tiere ist in Tabelle 51 zusammengefasst.

Tabelle 51: makroskopische und histologische Untersuchungsergebnisse von Tieren mit histologischem Verdacht auf bzw. histologisch nachgewiesener LA aus der Döhler Herde Schlacht- nummer

Alter makroskopisch histologisch

119 13 Mon mgr. bis hgr. punktförmige bis flächenhafte Blutungen.

Dorsal am rechten Hauptlappen ca. 5 mm im

Durchmesser großer, farblich nicht abgegrenzter, ggr.

verfestigter Bereich

Ln.: o.b.B; rechter und linker Spitzenlappen: hgr.

intrabronchioläre und –alveoläre Blutaspiration; rechter und linker

Hauptlappen: in einer Lokalisation Bild wie bei

Lungenadenomatose 121 13 Mon ggr. bis mgr. punktförmige bis

flächenhafte Blutungen Ln.: o.b.B; rechter und linker Spitzenlappen: o.b.B; rechter und linker Hauptlappen: fokal

mgr. Proliferation von Bronchialepithel, Verdacht auf

maligne Transformation 1865 4,5 J dorsal in beiden Hauptlappen

ca. 0,5 – 1 cm große, blaurötliche Verfärbungen

Ln.: o.b.B; rechter und linker Spitzenlappen: in einer

Lokalisation umschriebene Atelektase infolge

geringgradiger katarrhalisch-eitriger subakuter

Herdpneumonie, innerhalb dieser Lokalisation fokal

geringgradig hyperplastisches Epithel des bronchioloalveolären

Überganges; histologisch keine eindeutigen

Anhaltspunkte für das Vorliegen einer Lungen-

adenomatose; rechter und linker Hauptlappen: o.b.B

Mon: Monate; J: Jahre; ggr.: geringgradig; mgr.: mittelgradig; hgr.: hochgradig; o.b.B.: ohne besonderen Befund

ERGEBNISSE 181

4.8.4.3 Untersuchung der Lungenlymphknoten mittels PCR

Gewebeproben des Lymphonodus mediastinalis caudalis der 105 im Zeitraum vom

Frühjahr 2001 bis Frühjahr 2002 geschlachteten Tiere (104 Lämmer der

Geburtsjahrgänge 2000 und 2001 sowie ein ca. dreijähriger Bock) wurden jeweils im

Dreifachansatz mittels U3 LTR und hn PCR auf JSRV untersucht. Bei dem Tier Nr.

119 mit histologisch nachgewiesener Lungenadenomatose konnte diese Diagnose

bestätigt werden. In zwei von drei untersuchten Ansätzen konnten mittels hn PCR

JSRV-spezifische Genomfragmente nachgewiesen werden. Bei allen anderen

untersuchten Tieren (einschließlich des histologisch fraglichen Tieres Nr. 121) verlief

die PCR-Untersuchung negativ. Von dem im Herbst 2003 geschlachteten Tier Nr.

1865 stand kein frisches Gewebe für die PCR-Untersuchung zur Verfügung.

4.8.4.4 Weiterführende Untersuchungen bei den drei Tieren mit histo-logisch fraglichem bzw. positivem Ergebnis

An formalinfixiertem, in Paraffin eingebettetem Gewebe dieser drei Tiere wurde

durch Prof. Dr. M. de las Heras (Abteilung Pathologie der veterinärmedizinischen

Fakultät der Universität Zaragoza) freundlicherweise eine immunhistochemische

Untersuchung durchgeführt. Zusätzlich wurde von den Tieren Nr. 119 und 121

Lungengewebe von zwei Lokalisationen sowie der Ln. mediastinalis caudalis jeweils

im Dreifachansatz mittels PCR untersucht. Von dem Tier mit der Nummer 1865 stand

kein frisches Lungengewebe für die PCR zur Verfügung, jedoch wurden von diesem

Tier die Lungenspülproben aus dem Jahr 2002 routinemäßig im Dreifachansatz und

aus dem Jahr 2003 insgesamt achtmal untersucht. Von diesem Tier wurden zudem

aus dem asservierten formalinfixierten Lungengewebe sechs weitere Lokalisationen

in der HE-Färbung histologisch beurteilt.

Die Ergebnisse dieser weiterführenden Untersuchungen sind in Tabelle 52

zusammengefasst:

182 ERGEBNISSE

Tabelle 52: Weiterführende Untersuchungen bei Tieren mit positivem oder fraglichem histologischem Ergebnis

Tier-nummer

Immunhistochemie1 PCR Ln. med.

caud.

PCR Lungen-gewebe

PCR BAL

Weitere Histologie

(HE) 119 positiv positiv

(hn + + -)in 2 Lokali-sationen negativ

- -

121 negativ negativ in 2 Lokali-sationen negativ

- -

1865 einzelne sehr schwach angefärbte

Zellen; fraglich

- - 2002: 3x negativ

2003: 8x negativ

In 6 Lokali-sationen negativ

1 M. DE LAS HERAS (2001, 2004; pers. Mitteilung)

4.8.5 Untersuchung des Muttertieres des Lammes mit bestätigter Lungen-adenomatose

Aufgrund der Führung der Schneverdinger und der Döhler Herde als

Herdbuchbetrieb war die Abstammung des Lammes Nr. 119 eindeutig

nachvollziehbar. Das Muttertier wurde im Rahmen der Auflösung der Schneverdinger

Herde im Frühjahr 2001 an der Klinik für kleine Klauentiere klinisch untersucht,

anschließend euthanasiert und am Institut für Pathologie seziert und Gewebeproben

für die histologische Untersuchung gewonnen. Für die PCR-Untersuchung standen

von diesem Tier Lungenspülprobe, Blutprobe, Lymphonodus mediastinalis caudalis

sowie Gewebe von zwei Lungenlokalisationen zur Verfügung.

Zum Zeitpunkt der beschriebenen Untersuchungen war das Muttertier sieben Jahre

alt. Es zeigte klinisch keinerlei Hinweise auf eine respiratorische Erkrankung

(Einordnung in die klinische Gruppe A) oder Erkrankungen anderer Organsysteme.

Makroskopisch war die Lunge ohne besonderen Befund, und in den vier histologisch

untersuchten Lokalisationen bestanden keinerlei Hinweise auf das Vorliegen einer

Lungenadenomatose oder anderer respiratorischer Erkrankungen. Die jeweils

ERGEBNISSE 183

dreimalige Untersuchung des Lymphonodus mediastinalis caudalis, zweier

Lungenlokalisationen, der Lungenspül- und der Blutprobe mittels U3 LTR und hn

PCR verlief für alle Proben negativ.

4.8.6 Untersuchung der Lungenspülproben

Die im Sommer 2001 entnommenen Lungenspülproben wurden zugunsten der zu

späteren Zeitpunkten entnommenen Proben nicht weiter untersucht.

Von den 119 entnommenen Proben aus dem Jahr 2002 waren 110 für die

Untersuchung mittels PCR geeignet. Aus neun Proben war aufgrund schlechter

Probenqualität (zu geringe Rückgewinnungsmenge / zu geringer Zellgehalt) die

gewonnene DNA-Konzentration für eine PCR-Untersuchung zu gering. Zum

Zeitpunkt der Probenentnahme waren die Tiere drei bzw. zwei Jahre alt. Alle 110

Proben wurden jeweils im Dreifachansatz mittels U3 LTR und hn PCR untersucht.

Bei diesen Untersuchungen konnten aus keiner Probe JSRV-spezifische

Genomfragmente nachgewiesen werden.

Im Sommer 2003 wurden durch Frau Sandra Stamm und Herrn Klaus Schlotter

(Klinik für kleine Klauentiere) von 393 Tieren Lungenspülproben gewonnen. Die Tiere

waren zum Zeitpunkt der Probenentnahme vier, drei und zwei Jahre alt. Bei 40

Tieren wurde die Probenentnahme aufgrund schlechter Probenqualität wiederholt.

Insgesamt standen danach von 378 Tieren jeweils eine geeignete Probe für die

PCR-Untersuchung zur Verfügung. Die Bearbeitung und Untersuchung der Proben

erfolgte unter Anleitung der Autorin durch Frau Sabine Uhlenbruck, Klinik für kleine

Klauentiere. Jede Probe wurde jeweils im Doppelansatz mittels U3 LTR und hn PCR

untersucht. Bei diesen Untersuchungen konnten aus keiner Probe JSRV-spezifische

Genomfragmente nachgewiesen werden.

Insgesamt wurden im Sommer 2002 92,4%, im Sommer 2003 96,2% aller zum

Entnahmezeitpunkt in der Herde befindlichen, zwei und mehr Jahre alten Tiere

untersucht.

184 ERGEBNISSE

DISKUSSION 185

5. DISKUSSION

5.1 Lungenadenomatose bei Heidschnucken

5.1.1 Altersverteilung und Disposition

Berichte von einer vergleichsweise frühen Erkrankung der Heidschnucken an

Lungenadenomatose (GANTER 2000; KOOPMANN 2000, pers. Mitteilungen)

konnten durch diese Untersuchungen bestätigt werden. Klinische Erkrankungen und

LA-typische Läsionen wurden zwar in allen Altersgruppen bis in das hohe Alter von

zehn Jahren beobachtet, es bestand jedoch eine deutliche Häufung bei um ein Jahr

alten Tieren. 61,7% der klinischen Erkrankungen bzw. 50,6% der nachgewiesenen

Läsionen traten bei Tieren auf, die zwei Jahre oder jünger waren. Lämmer unter

einem Jahr machten 10,6% der klinischen Erkrankungsfälle bzw. 15,2% der Fälle mit

LA-typischen Läsionen aus. Der Median lag in der Gruppe der klinisch erkrankten

Tiere bei einem Jahr, in der Gruppe der Tiere mit LA-typischen Läsionen aller

Stadien bei zwei Jahren. Demgegenüber werden klinische Erkrankungen bei

Lämmern in der Literatur als Seltenheit beschrieben (HUNTER und MUNRO 1983;

SHARP und DE LAS HERAS 2000). Aus verschiedenen geographischen Regionen

wird eine Häufung der klinischen Erkrankungen bei drei bis vier Jahre alten Tieren

beobachtet (MITCHELL 1915; HUNTER und MUNRO 1983; SHARP und DE LAS

HERAS 2000).

Dieses frühe Auftreten und die hohen durchschnittlichen jährlichen Verluste von 4%

bis 15% der Zuchttiere (KOOPMANN 2000, pers. Mitteilung; KRÄMER 2001) in den

Herden des VNP, gepaart mit den Ergebnissen der vorliegenden Untersuchungen,

dem Nachweis von Lungenadenomatose-typischen Läsionen bei 17,3% der

Schlachtlämmer und 28,3% der untersuchten Tiere aus der Schneverdinger Herde,

lassen eine besondere Empfänglichkeit der Heidschnucken gegenüber dieser

186 DISKUSSION

Erkrankung vermuten. Eine vermehrte Empfänglichkeit bestimmter Rassen oder

Zuchtlinien ist in der Literatur wiederholt beschrieben (DUNGAL et al. 1938; DE

KOCK 1958; TUSTIN 1969; HUNTER und MUNRO 1983; SHARP und ANGUS

1990), so dass eine genetische Disposition bzw. verminderte Resistenz dieser Rasse

denkbar ist. Die Verwandtschaft der Heidschnucken zu den isländischen Schafen,

die ebenfalls zu den kurzschwänzigen, behornten nordischen Heideschafen gehören

(OLAFSSON 1939), kann ebenfalls als ein Hinweis auf eine mögliche genetische

Disposition gewertet werden. Auch in Island traten in einem Ausmaß Verluste auf,

die aus anderen Regionen bislang unbekannt waren (DUNGAL et al. 1938).

Auch die traditionellen Haltungsbedingungen der Heidschnucken mit regelmäßiger

nächtlicher Aufstallung während des ganzen Jahres sowie mehrwöchiger

kontinuierlicher Stallhaltung in der Lammzeit in schlecht belüfteten Ställen, die

insbesondere in lämmerführenden Herden eine beträchtliche Besatzdichte erreichen

können, tragen sicherlich zu dem verlustreichen Verlauf der Erkrankung bei dieser

Rasse bei. DUNGAL et al. (1938), MARKSON und TERLECKI (1964), sowie

MACKAY und NISBET (1966) haben auf einen Einfluß derartiger

Haltungsbedingungen auf die Ausbreitung der Erkrankung in infizierten Herden

hingewiesen.

5.1.2 Atypische Lungenadenomatose

In allen untersuchten Fällen entsprachen die Läsionen dem Bild der sogenannten

klassischen Lungenadenomatose (siehe 2.1.3.1). Die Läsionen der atypischen

Lungenadenomatose sind in der Literatur aus Südamerika, Deutschland und Spanien

beschrieben (CUBA CAPARO et al. 1961; SCHULZ et al. 1965; GARCIA-GOTI et al.

2000). Beide Formen können in derselben Herde vorkommen, und Unterschiede in

den beteiligten Virusisolaten wurden nicht gefunden (DE LAS HERAS et al. 2003).

Ob das Vorkommen der atypischen Läsionen mit dem zeitgleichen Vorkommen

anderer Erkrankungen, z.B. der Maedi-Visna-Virusinfektion korreliert ist, ist nicht

DISKUSSION 187

untersucht. Der hohe Durchseuchungsgrad spanischer Schafherden mit Maedi-Visna

(GONZALEZ et al. 1993), gepaart mit der häufigen Beobachtung atypischer Läsionen

in diesem Land (GARCIA-GOTI et al. 2000) sowie fehlende Beobachtungen

atypischer Läsionen aus Schottland (HUNTER und MUNRO 1983; SHARP und

ANGUS 1990), wo Maedi kaum eine Rolle spielt, lassen einen Zusammenhang

möglich erscheinen. Die Herdbuchzuchten der Grauen gehörnten Heidschnucken

sind nach derzeitigem Kenntnisstand frei von Maedi-Visna (GANTER 2004,

persönliche Mitteilung).

5.1.3 Metastasen und andere Tumorerkrankungen

Bei vier der 79 untersuchten Tiere mit makroskopischen und/oder histologischen

Läsionen von Lungenadenomatose wurde eine Metastasierung festgestellt. Dies

entspricht einem Prozentsatz von 5,1% und liegt im Rahmen dessen, was in der

Literatur genannt wird (GEISEL und BOMHARD 1977). Es muß jedoch darauf

hingewiesen werden, dass eine gezielte Untersuchung auf Metastasen nicht

durchgeführt wurde. Es wurde routinemäßig lediglich ein Gewebeschnitt des

Lymphonodus mediastinalis caudalis angefertigt. Es ist möglich, dass bei

Untersuchung mehrerer Schnittebenen und weiterer regionärer Lymphknoten

zusätzliche Fälle von Metastasen gefunden worden wären.

In einem weiteren Fall wurden in der Lunge Metastasen eines Dünndarmkarzinoms

festgestellt. Das makroskopische Bild dieser sekundären Lungentumoren war

deutlich verschieden von dem der klassischen Lungenadenomatose. Sie zeigten sich

als weißlich-derbe, multifokale, bis zu 5 mm im Durchmesser messende

Herdveränderungen, die histologisch einem infiltrativ wachsenden Adenokarzinom

entsprachen. Weitere Metastasen befanden sich in Leber, Pleura und Peritoneum.

Eine Verwechslung solcher Veränderungen mit dem Bild der atypischen

Lungenadenomatose ist insbesondere im Falle des Übersehens des Primärtumors

möglich. Das Dünndarmkarzinom der Schafe wird von ROSS und WILLIAMS (1983)

als eine ebenfalls häufige Tumorerkrankung der Schafe beschrieben.

188 DISKUSSION

5.2 Untersuchungsverfahren

5.2.1 Eignung der klinischen Untersuchung zur Diagnose der LA

Schwierigkeiten bei der klinischen Untersuchung des Atemtraktes des Schafes

entstehen dadurch, dass die Atemfrequenz sehr stark durch äußere Einflüsse

variiert. Neben der Temperatur und Bewollung spielen auch Stressfaktoren wie das

Betreten des Stalles durch Personen (YOUSSEF 1986) eine Rolle. Gerade die in

großen Herden in Hütehaltung gehaltenen Heidschnucken sind den direkten Umgang

mit Menschen wenig gewöhnt und durch das zur Untersuchung notwendige Handling

starken Stressfaktoren ausgesetzt. Durch eine Intensivierung der Atmung wird auch

die Intensität der auskultierbaren Atemgeräusche erhöht (STÖBER 1990b), so dass

eine klinische Unterscheidung zwischen einer derartigen Beeinflussung und

dezenten Veränderungen bei subklinischen Lungenerkrankungen schwer möglich ist.

Bei Tieren, die lediglich aufgrund subjektiv geringgradig verschärfter Atemgeräusche

in die klinische Gruppe B eingeordnet wurden, kam es daher zu Fehleinschätzungen.

23,6 % der Tiere der Gruppe B wiesen weder pathomorphologisch nach histologisch

nachweisbare Lungenveränderungen auf. In gleicher Weise sind Fehleinschätzungen

bei den klinisch als gesund eingeordneten Tieren vorgekommen. In dieser Gruppe

wiesen 40,6% geringgradige pneumonische Veränderungen und 9,4 % histologisch

nachweisbare Läsionen einer beginnenden Lungenadenomatose auf, die klinisch

trotz eingehender Untersuchung nicht nachweisbar waren. Makroskopisch

erkennbare Tumoren und mittel- oder hochgradige pneumonische Veränderungen

wurden in dieser Gruppe nicht nachgewiesen.

In fortgeschrittenen Erkrankungsfällen der Lungenadenomatose wird die

diagnostische Sicherheit der klinischen Untersuchung deutlich besser. Bei allen zwölf

Tieren, bei denen aufgrund des Vorhandenseins diskontinuierlicher Nebengeräusche

trotz des fehlenden pathognomonischen Symptoms des Nasenausflusses

(Schubkarrentest negativ) der klinische Verdacht auf Lungenadenomatose geäußert

wurde, wurde dieser Verdacht pathologisch-anatomisch und histologisch bestätigt.

DISKUSSION 189

5.2.2 Blutproben

Der Nachweis von JSRV in weißen Blutzellen klinisch erkrankter Tiere, gesunder

Kontakttiere sowie in der Inkubationszeit einer experimentellen Infektion durch

verschiedene Autoren (PALMARINI et al. 1996b; HOLLAND et al. 1999; DE LAS

HERAS et al. 2000; GONZALEZ et al. 2001) ließ die Hoffnung auf ein praktikables

Verfahren zur Frühdiagnose der Lungenadenomatose durch eine Untersuchung von

Blutproben mittels PCR aufkommen. Die Lösung des Problems, wie eine in

Sanierung befindliche Herde auf ein mögliches Vorkommen von

Lungenadenomatose überprüft werden könnte ohne sie komplett zu schlachten, wie

dies von PARKER et al. (1998) praktiziert wurde, schien in greifbare Nähe gerückt.

Untersuchungen an größeren Tierzahlen bezüglich einer Eignung der

Blutuntersuchung mittels PCR als Diagnostikum lagen nicht vor. Nach den

Erfahrungen von DEWAR und SHARP (2000, pers. Mitteilung) war jedoch bei

Lungenadenomatose-erkrankten Schafen nahezu immer mit einem positiven PCR-

Befund der Blutprobe zu rechnen.

Nachdem erste eigene Untersuchungen an Blutproben klinisch an

Lungenadenomatose erkrankter Heidschnucken in der Mehrzahl der Fälle ein

negatives Ergebnis lieferten, wurde neben der Abklärung möglicherweise falsch-

negativer Resultate der Blutprobenuntersuchung (siehe 3.9 und 4.6) dazu

übergegangen, parallel die diagnostische Eignung einer weiteren intravital zu

gewinnenden Probenart zu untersuchen.

5.2.3 BAL nach endotrachealer Intubation

Aufgrund der Tatsachen, dass sich in dem Lungensekret erkrankter Tiere große

Virusmengen (SHARP und DE LAS HERAS 2000) sowie Tumorzellen (NOBEL et al.

1970; VERWOERD und DE VILLIERS 1980; GANTER 1996; KIRAN et al. 2000)

befinden und dass in den Untersuchungen von SANNA et al. (2001) auch die

Alveolarmakrophagen deutlich JSRV-positiv waren, erschien eine intravital

190 DISKUSSION

entnommene Lungenspülprobe das ideale Probenmaterial. Die wesentlich einfachere

Entnahme von Nasentupfern wurde nicht näher in Betracht gezogen, da sie durch

ihre Entfernung vom Ort der Läsionen eine deutlich geringere Sensitivität bei Tieren

vermuten ließ, die noch keinen exzessiven Nasenausfluß aufwiesen. Intravital

gewonnene Lungenspülproben wurden auch von anderen Autoren z.B. bei Kälbern

für einen Virusnachweis mittels PCR genutzt (VALARCHER et al. 1999).

Das Verfahren der transtrachealen Aspiration unter Lokalanästhesie (WORKU 1994)

erwies sich zur Gewinnung von Lungenspülproben in eigenen Untersuchungen durch

das Auftreten von Blutungen als nicht praktikabel. WORKU (1994) selbst beschreibt

sehr schlechte Rückgewinnungsraten, und der invasive Charakter wurde als ein

weiterer großer Nachteil der Methode (auch hinsichtlich der Akzeptanz bei den

Schäfern) angesehen. Die direkte Übertragung eines für das Kalb beschriebenen

Verfahrens (FOGARTY et al. 1983; CALDOW 2001), in dem eine Intubation über den

ventralen Nasengang erfolgt und eine Lungenspülung über einen durch diesen

Tubus in die Lunge vorgeschobenen Schlauch möglich ist, war nach eigenen

Versuchen auf das Schaf nicht möglich, da auch bei Überstrecken des Kopfes der

über die Nase eingeführte äußere Schlauch regelmäßig abgeschluckt wurde. Die

bronchoskopische Entnahme wurde aus Praktikabilitätsgründen wegen der zu

untersuchenden großen Tierzahl sowie aufgrund der Gefahr der Kreuzkontamination

bei der Probenentnahme für diesen Untersuchungszweck als ungeeignet erachtet.

Praktikabilität und Probleme der BAL nach endotrachealer Intubation

Gegenüber der fiberoptischen Entnahme von Lungenspülungen bietet die hier

entwickelte Technik den Vorteil, dass sie problemlos in Beständen auch für eine

größere Tierzahl anwendbar ist. Die überwiegende Verwendung von

Einwegmaterialien ermöglicht den Ausschluß von Kreuzkontaminationen bei der

Probenentnahme. Die vergleichsweise niedrigen Anschaffungskosten und sehr

geringen Kosten für Verbrauchsmaterialien sind weitere Vorteile gegenüber der

DISKUSSION 191

Nutzung eines Bronchoskops. Das Rückgewinnungsvolumen von durchschnittlich

45% ist zufriedenstellend, liegt jedoch deutlich unter dem von durchschnittlich 71,8%

bei der fiberoptischen Entnahme (GANTER 1996). Aus 94,5% der von der Autorin

gewonnenen Lungenspülproben konnte eine für den Untersuchungszweck

ausreichende DNA-Konzentration mit einem durchschnittlichen Reinheitswert

(OD260/OD280) von 1,95 gewonnen werden.

Das Risiko ist trotz der Notwendigkeit einer medikamentellen Immobilisation sehr

gering. Bei einer Gesamtzahl von 760 im Rahmen dieser Untersuchungen von der

Autorin und anderen Mitarbeitern der Klinik für kleine Klauentiere entnommenen

Lungenspülproben traten zwei Todesfälle auf (0,26%). Eines dieser Tiere war

hochgradig an Lungenadenomatose erkrankt und wies daher ein deutlich erhöhtes

Narkoserisiko auf. Ein weiteres klinisch gesundes Tier starb an einer

Aspirationspneumonie, nachdem es während der Probenentnahme zu heftigem

Regurgitieren gekommen war.

Husten war zum Zeitpunkt der Entnahme und kurz darauf ein häufig beobachtetes

Symptom, das jedoch nach spätestens einer Stunde bei den Tieren nicht mehr

beobachtet wurde. Anhaltende Symptome als Hinweis einer respiratorischen

Erkrankung oder eine Verschlechterung des Allgemeinbefindens bei bereits

erkrankten Tieren wurde in keinem weiteren Fall beobachtet. Auffallend ist jedoch bei

11,96% der Proben eine Beimengung von kleinsten Futterpartikeln sowie bei 6,20%

der zeitnah nach der Entnahme der Spülprobe getöteten und untersuchten Tiere eine

fokale Aspiration von Pflanzenmaterial. Obwohl eine schwerwiegende

Aspirationspneumonie nur in 0,13% der Fälle auftrat, ist dies als ein Nachteil der

Methode anzusehen, da neben einer Gefährdung der Probanden auch die Qualität

der Proben und damit ihre Verwendbarkeit für andere Fragestellungen leidet. Ein

mikrobiologischer Nachweis aus einer futterverunreinigten Probe ist zum Beispiel

wenig sinnvoll. FOGARTY et al. (1983) ließen die Kälber vor Entnahme von

Lungenspülproben acht Stunden hungern. Eine Phase der Nahrungskarenz erscheint

daher auch für die hier beschriebene Methode bei Schafen sinnvoll. Ein für andere

192 DISKUSSION

Eingriffe üblicher Zeitraum bei erwachsenen Schafen ist eine Nahrungskarenz von

etwa 24 Stunden (GANTER 2004, pers. Mitteilung). Dies wird in praxi insbesondere

bei Weidehaltung größerer Bestände jedoch sicher nicht immer einzuhalten sein.

5.3 Molekularbiologische Untersuchungen

5.3.1 Vor- und Nachteile des Nachweises proviraler DNA gegenüber dem RNA-Nachweis mit RT-PCR

Die Eigenschaft der Retroviren, ihre virale RNA mithilfe des viruseigenen Enzyms

reverse Transkriptase in DNA umzuschreiben und als provirale Sequenz in das

Wirtszellgenom zu integrieren (VOGT 1997), ermöglicht es, einen Nachweis aus

genomischer DNA zu führen. Während PALMARINI et al. (1996b) aus Leukozyten

lediglich JSRV-RNA nachweisen konnten, gelang HOLLAND et al. (1999) auch der

Nachweis proviraler DNA in weißen Blutzellen. Alle weiteren in der Literatur

beschriebenen Untersuchungen (DE LAS HERAS et al. 2000; GONZALEZ et al.

2001; SANNA et al. 2001) wurden ebenfalls auf der Basis des Nachweises proviraler

DNA geführt. Dem Vorteil einer möglicherweise größeren Anzahl an RNA-

Zielmolekülen in einer JSRV-exprimierenden Zelle stehen die Nachteile einer für den

RNA-Nachweis benötigten RT-PCR gegenüber. Hierzu ist es nötig, die aus dem

Probenmaterial isolierte RNA in vitro mithilfe einer reversen Transkriptase in cDNA

(copy-DNA) umzuschreiben (GASSEN et al. 1994). Dieser zusätzliche Arbeitsschritt

führt zu einer Erhöhung des Aufwandes und damit der Kosten einer Untersuchung.

Jeder zusätzliche Schritt birgt zudem ein zusätzliches Risiko der Kontamination.

Nach einer Literaturübersicht bei SCHEIBNER (2000) liegt die Effizienz der reversen

Transkription zwischen 10 und 90%, so dass mit diesem Schritt unter Umständen ein

erheblicher Sensitivitätsverlust einhergehen kann. Durch die besondere Anfälligkeit

der RNA erfordert die Laborarbeit zusätzliche Vorsichtsmaßnahmen (SCHEIBNER

2000).

DISKUSSION 193

5.3.2 Untersuchungen zum Ausschluß falsch-negativer Resultate und Bestimmung der Nachweisgrenze

Aus klinischen Proben und insbesondere aus Blutproben sind verschiedene Stoffe

beschrieben, die eine PCR-Reaktion vollständig hemmen oder ihre Nachweisgrenze

negativ beeinflussen können (ABU AL-SOUD und RADSTÖM 2001; HOLODNIY et

al. 1991; WILSON 1997). Die mögliche Anwesenheit solcher inhibitorischer

Substanzen wurde durch eine erfolgreiche Amplifikation einer Sequenz des GAPDH-

Gens aus allen in der hn PCR negativen Proben ausgeschlossen. Da diese

Zielsequenz jedoch in jeder Zelle ubiquitär ist, werden durch den Nachweis eines

solchen housekeeping-Gens Sensitivitätsprobleme beim Nachweis geringer Mengen

der Zielsequenz nicht detektiert. Durch eine exemplarische Untersuchung mit

Plasmid versetzter Proben konnte eine die Nachweisgrenze der heminested PCR

von zwei bis zehn Plasmidmolekülen beeinflussende Hemmung für die 20

untersuchten Blutproben ausgeschlossen werden. Für die Gewebe- und

Lungenspülproben wurde eine geringgradige Sensitivitätsminderung beobachtet, die

nur noch in 96,6 bzw. 94,1% der Fälle im Einfachansatz eine Detektion von zwei bis

zehn Plasmidmolekülen vor dem Hintergrund von 800 – 1000 ng genomischer DNA

ermöglichte. Eine deutliche Hemmung wurde jedoch für die U3 LTR PCR für alle

Probenarten beobachtet, die durch eine Nachuntersuchung in der hn PCR für den

Nachweis von 230 – 1000 Plasmidmolekülen zu 100%, für den Nachweis von 2 bis

10 Plasmidmolekülen zu durchschnittlich 96,7% ausgeglichen wurde. Die

Durchführung der hn PCR ist zum Ausschluß falsch-negativer Resultate daher

unbedingt erforderlich.

Nach SCHEIBNER (2000) wird die Nachweisgrenze eines PCR-Systems auch durch

die Methode der Probenaufbereitung beeinflusst. Für diese Arbeit wurden die

gleichen Probenbearbeitungs- und DNA-Isolationsverfahren wie im Labor des

Moredun Research Institute (MRI) angewendet. Dennoch beobachten die dortigen

Mitarbeiter bei der Untersuchung schottischer Proben einen deutlich höheren Anteil

PCR-positiver Blutproben (DEWAR und SHARP 2000, pers. Mitteilung). Um

194 DISKUSSION

laborinterne Variablen auszuschließen, wurden Proben der untersuchten

Heidschnucken sowohl durch das Personal des MRI als auch durch die Autorin

selbst mit unverändertem Ergebnis unter den Bedingungen des MRI nachuntersucht.

Ein alternatives Verfahren der DNA-Extraktion aus Vollblut wurde getestet und für

ungeeignet befunden.

Auch die Nachweisgrenze des Detektionssystems für die PCR-Produkte hat einen

Einfluß auf die Gesamtsensitivität der Untersuchung. Die Southern Blot-

Hybridisierung gilt hier als die sensitivste Methode für den Nachweis von PCR-

Produkten (BELAK und BALLAGI-PORDANY 1993). Selbst mit dieser sensitiven

Methode wurde bei einer Auswahl negativer Blutproben von klinisch erkrankten

Tieren das negative Ergebnis der Agarosegelelektrophorese bestätigt.

Die Nachweisgrenze des Gesamtsystems bestehend aus Buffy-Coat-Isolation, DNA-

Extraktion und PCR-Untersuchung wurde am Modell künstlich mit JSRV-positiven

Zellen (JS7-Zellen, DE MARTINI et al. 2001) versetzter Rinderblutproben bestimmt.

Für einen sicheren Nachweis von JSRV im Einfachansatz liegt sie bei dem Verhältnis

1:12.000 von JS7-Zellen zu Rinderleukozyten, für die heminested PCR bei 1:40.000.

Bei einer Untersuchung im Dreifachansatz ist bis zu einem Verhältnis von 1:80.000

mit einem positiven Ergebnis (d.h. mindestens 1 von 3 Ansätzen positiv) der

heminested PCR zu rechnen.

Die für jeden Reaktionsansatz mitgeführten Grenzwert-Positivkontrollen

(Plasmidverdünnungen vor dem Hintergrund von Wasser) erwiesen sich zur

Detektion von Sensitivitätsproblemen der PCR als adäquat. Während bei Einsatz

einer neuen Charge des zunächst verwendeten Nukleotidgemisches der Fa. Roth

(RotiMixR PCR 3, Roth, Karlsruhe) die klinische Positivprobe weiterhin ein deutlich

positives Signal in der U3 LTR PCR zeigte, entfielen die stets zu erwartenden

schwachen Banden der Plasmidverdünnungsstufen 10-9 und 10-11. Das Problem

konnte auf die neu eingesetzte Charge zurückgeführt und durch einen Wechsel des

Lieferanten eliminiert werden.

DISKUSSION 195

5.3.3 Untersuchungen zum Ausschluß falsch-positiver Resultate

Bei jeder DNA-Extraktion wurde eine bekannt negative Probe mit präpariert. Zudem

wurden je eine Wasser-Negativkontrolle bei der Vorbereitung des

Reaktionsgemisches sowie zum Zeitpunkt der Zugabe der Proben-DNA angesetzt.

Bei Durchführung einer heminested PCR wurden diese drei Negativkontrollen wie

alle anderen Proben nachuntersucht. Zusätzlich wurden zwei weitere neue

Negativkontrollen angesetzt. Während der eigenen Untersuchungen trat in keinem

Fall ein positives PCR-Ergebnis aus einer der Negativkontrollen auf. Durch die

Untersuchung im Dreifachansatz konnte eine mögliche sporadische Kontamination

ebenfalls weitgehend ausgeschlossen werden. Mit hundertprozentiger Sicherheit ist

bei Proben mit sehr geringem Virusgehalt, bei denen nur einer der drei Ansätze ein

positives Ergebnis liefert, eine Unterscheidung zwischen einer sporadischen

Kontamination und einem richtig-positiven Ergebnis nicht möglich. Dies kann durch

eine Wiederholung der Untersuchung weiter abgeklärt werden. In fraglichen Fällen

wie bei positiven PCR-Befunden von histologisch negativen oder fraglichen Tieren

wurde eine derartige Wiederholungsuntersuchung regelmäßig durchgeführt.

Bei der routinemäßigen Untersuchung der im Sommer 2003 entnommenen 378

Lungenspülproben aus der Döhler Herde durch Frau Sabine Uhlenbruck, Klinik für

kleine Klauentiere, trat zu einem Zeitpunkt ein positives Ergebnis in der zweiten

Wasser-Negativkontrolle auf (Ansatz zum Zeitpunkt der Zugabe der Proben-DNA).

Zeitgleich war von sechs der in dieser Charge untersuchten Proben je einer der zwei

Ansätze in der hn PCR positiv. Von keiner dieser Proben konnte in bis zu neunfacher

Nachuntersuchung dieses positive Ergebnis reproduziert werden. Die sechs

betroffenen Tiere wurden vorsorglich geschlachtet. Bei der pathologisch-

anatomischen sowie histologischen Untersuchung konnte Lungenadenomatose nicht

nachgewiesen werden. Die ersten Untersuchungsergebnisse wurden daraufhin als

falsch-positiv gewertet und die Tiere als negativ eingeordnet. Weitere Vorfälle dieser

Art traten nicht auf, sie verdeutlichen jedoch die Gefahr, die von einem hohen

196 DISKUSSION

Probendurchsatz und dem diagnostischen Einsatz einer nested PCR trotz höchster

Vorsichtsmaßnahmen ausgeht.

Durch Southern-Blot-Hybridisierung (SOUTHERN 1975; SAMBROOK et al. 1989)

und eine Sequenzierung des PCR-Produktes konnte exemplarisch die Spezifität der

nachgewiesenen Banden gezeigt werden.

5.4 Untersuchung von Proben aus positiven Herden

5.4.1 PCR aus Blutproben

Die Beobachtung einer Virämie in frühen Infektionsstadien bei experimentell

infizierten Lämmern durch HOLLAND et al. (1999) konnte unter natürlichen

Infektionsbedingungen bestätigt werden. Von drei Lämmern, die sich innerhalb der

ersten zehn Lebensmonate nachweislich mit JSRV infiziert hatten sowie einem

histologisch fraglichen Lamm konnten jedoch bei regelmäßiger Blutentnahme

lediglich bei einem der zum Zeitpunkt der Schlachtung makroskopisch LA-positiven

Tiere zu einem Entnahmezeitpunkt im Alter von sechs Wochen JSRV aus dem Buffy-

Coat nachgewiesen werden. Die Mutter dieses Tieres war an Lungenadenomatose

erkrankt, so dass das Lamm einer hohen natürlichen Infektionsdosis ausgesetzt war.

Lediglich einer der untersuchten drei Ansätze wies zu dem genannten Zeitpunkt ein

positives Ergebnis auf. Zu allen folgenden Entnahmeterminen verlief die

Blutuntersuchung negativ. Die Nachweisbarkeit von JSRV im Blut scheint daher

entweder, wie von GARCIA-GOTI (1999, zit. nach SHARP und DE MARTINI 2003)

beobachtet, ein transientes Phänomen zu sein, oder die Zahl infizierter Leukozyten

ist so gering, dass sie in den meisten Fällen unter der Nachweisgrenze liegt.

Während HOLLAND et al. (1999) bei fünf von acht klinisch erkrankten Tieren JSRV

aus weißen Blutzellen nachweisen konnten, gelang dies GONZALEZ et al. (2001) in

15 von 16 Fällen mit makroskopischen Läsionen sowie bei vier von zehn gesunden

Kontakttieren.

DISKUSSION 197

Der Nachweis von JSRV aus Blutproben beschränkte sich in den eigenen

Untersuchungen demgegenüber zusätzlich zu dem oben genannten Lamm auf vier

Tiere, die bereits deutliche klinische Symptome einer Lungenadenomatose-

Erkrankung zeigten (Gruppe D). Bei Tieren aus anderen klinischen Gruppen sowie

bei Tieren ohne nachweisbare Läsionen konnte mit Ausnahme des oben genannten

sechs Wochen alten Lammes in keinem Fall ein positives Blutprobenergebnis erzielt

werden. Bezogen auf die Gruppe der klinisch erkrankten Tiere konnte daher lediglich

bei 20% der Tiere JSRV aus einer Blutprobe nachgewiesen werden. Bezogen auf

alle Tiere mit makroskopischen Läsionen (Kategorie I) reduziert sich der Anteil auf

7%, bezogen auf die Gesamtheit der LA-positiven Tiere (Kategorie I und II) auf 5,7%.

Diese Zahlen beziehen sich auf die Untersuchung im Dreifachansatz. Ein solcher ist

für den routinemäßigen Einsatz eines Diagnostikverfahrens nicht finanzierbar. Für

eine Untersuchung im Einfachansatz reduziert sich die relative Sensitivität der

Blutprobenuntersuchung im Vergleich zur systematischen Histologie auf lediglich

4,0%. Nach den vorliegenden Ergebnissen ist ein Nachweis von JSRV aus

Blutproben als diagnostisches Hilfsmittel ungeeignet, zumal bei Tieren, die bereits

das pathognomonische Symptom des hochgradigen Nasenausflusses zeigen, eine

aufwendige Laboruntersuchung obsolet ist.

Inwiefern die Diskrepanz der Ergebnisse zwischen den eigenen Untersuchungen und

den Erfahrungen anderer Untersucher (DEWAR und SHARP 2000, pers. Mitteilung;

GONZALEZ et al. 2001) durch mögliche Rasseunterschiede bei den untersuchten

Tieren, mögliche Unterschiede im Virusstamm oder andere Faktoren bedingt ist,

müsste weiter untersucht werden. Die Sequenz des in der PCR nachgewiesenen

LTR-Fragmentes wies eine 98%ige Basensequenzhomologie zu dem britischen LA-

Isolat JS21 auf. Untersuchungsbedingte Unterschiede sowie falsch-negative

Resultate wurden weitestgehend ausgeschlossen.

198 DISKUSSION

5.4.2 PCR aus Lungenspülproben

Eine Untersuchung von Lungenspülproben zum Nachweis von JSRV wurde von

anderen Autoren bislang nicht durchgeführt, so dass Vergleichsdaten hierzu fehlen.

Nach Literaturangaben ist jedoch bei der PCR-Untersuchung der Lungenflüssigkeit

klinisch erkrankter Schafe in 100 % der Fälle mit einem positiven Ergebnis zu

rechnen (PALMARINI et al. 1996b; GONZALEZ et al. 2001; DEWAR und SHARP

2000, pers. Mitteilung). Diese Beobachtung wurde in den eigenen Untersuchungen

bestätigt. Die Lungenspülproben klinisch erkrankter Tiere wiesen in 100% der Fälle

ein positives Ergebnis, überwiegend bereits im ersten PCR-Durchgang auf. Eine

Nachuntersuchung mit der hn PCR war nur in einem Fall nötig. Die PCR-

Untersuchung von Lungenspülproben ist folglich ein geeignetes diagnostisches

Hilfsmittel, um einen klinischen Verdacht auf Lungenadenomatose zu bestätigen.

Bezogen auf alle Tiere mit nachgewiesenen LA-typischen Läsionen aller Stadien

betrug die relative Sensitivität der PCR-Untersuchung aus Lungenspülproben im

Vergleich zur histologischen Untersuchung von vier Lungenlokalisationen 90,2% mit

einer relativen Spezifität von 98,4%. Definiert man eine klinisch nicht nachweisbare

Lungenadenomatose anhand des Fehlens des pathognomonischen Symptoms des

Abgangs von Lungenflüssigkeit (negativer „Schubkarrentest“), so ergibt sich für die

Tiere der Gruppe A, B und C eine relative Sensitivität der PCR-Untersuchung von

Lungenspülproben im Dreifachansatz von 85,3% (im Einfachansatz 77,9%). Für die

Untersuchung einer klinisch gesund erscheinenden Herde, in der respiratorische

Symptome eine Seltenheit darstellen, ist die Berechnung der relativen Sensitivität für

klinisch LA-unverdächtige Tiere (Gruppen A und B) interessant. Im Dreifachansatz

liegt sie bei 77,3%. Eine Untersuchung im Doppelansatz reduziert die relative

Sensitivität auf 70,5%, im Einfachansatz auf 65,9 %.

In Anbetracht der Tatsache, dass am lebenden Tier ein Diagnostikum mit einer

höheren Sensitivität bei vergleichbarer Spezifität derzeit nicht existiert, wurde das

Verfahren der PCR-Untersuchung von Lungenspülproben für die Untersuchung der

wertvollen Zuchttiere der mutterlos aufgezogenen Döhler Herde angewendet.

DISKUSSION 199

Die Röntgenuntersuchung ist daneben ein Verfahren, mit dem zwar bereits dezente

Lungenläsionen erkannt werden können (WYN-JONES und CLARKSON 1984).

Diese können jedoch vielfältiger Ätiologie sein und der apparative Aufwand lässt

lediglich Einzeltieruntersuchungen zu. Das Verfahren der Lungenspülung nach

endotrachealer Intubation ermöglicht auch Herdenuntersuchungen in großem Stil.

Trotz der vergleichsweise niedrigen Materialkosten für die Probenentnahme sind bei

Mitberechnung der Arbeitszeit der Aufwand und die Kosten für die Probennahme und

die folgenden Laboruntersuchungen jedoch sicherlich ein limitierender Faktor für eine

weitere Anwendung auf Herdenbasis. Im Zuge einer Ankaufsuntersuchung wertvoller

Zuchttiere kann die PCR aus Lungenspülproben im Zusammenhang mit einer

gründlichen klinischen und gegebenenfalls röntgenologischen Untersuchung die

diagnostische Sicherheit jedoch wesentlich erhöhen. Eine „Freiheit von

Lungenadenomatose“ kann jedoch bei negativem Ergebnis für Einzeltiere nicht

bescheinigt werden. Hinsichtlich der besseren Kontrollierbarkeit der PCR für einen

möglichen diagnostischen Einsatz wäre die Entwicklung eines internen

Inhibitionsstandards wünschenswert.

5.4.3 PCR aus Gewebeproben

Die PCR-Untersuchung aus Gewebeproben ist ein geeignetes Mittel, in histologisch

fraglichen Fällen zu einer Abklärung der möglichen Virusätiologie beobachteter

Läsionen beizutragen (DE LAS HERAS et al. 2000; SANNA et al. 2001). Die relative

Sensitivität der PCR-Untersuchung des Ln. mediastinalis caudalis im Vergleich zur

histologischen Untersuchung von vier Lungenlokalisationen beträgt bei

Untersuchung im Dreifachansatz 81,2%, im Einfachansatz 65,2%. Dem stehen

lediglich 1,5% (im Einfachansatz 0,76%) positive PCR-Befunde bei histologisch

negativen Tieren gegenüber. Der erhöhte Aufwand für eine kontaminationsfreie

Probenentnahme und die durch die Notwendigkeit der Durchführung einer nested

PCR höheren Laborkosten sprechen zusätzlich gegen einen routinemäßigen Einsatz

der PCR-Untersuchung von Lungenlymphknoten zur Herdenüberwachung. Die

200 DISKUSSION

histologische Untersuchung ist daher am toten Tier nach wie vor das praktikabelste,

kostengünstigste und sicherste Verfahren zum Nachweis von Lungenadenomatose.

Für die geschilderten Untersuchungen wurde die histologische Beurteilung

sämtlicher Proben durch einen in der Beurteilung von Schaflungen sehr erfahrenen

Pathologen durchgeführt, was die diagnostische Sicherheit sicherlich positiv

beeinflusst. Für verbleibende fragliche Fälle und weniger erfahrene Untersucher

kann die PCR hier eine wertvolle Ergänzung sein.

Es muß darauf hingewiesen werden, dass die makroskopische Untersuchung allein

zum Ausschluß von Lungenadenomatose nicht ausreichend ist. Von den 79

untersuchten Tieren mit LA-typischen Lungenläsionen wiesen 14 (21,5%) lediglich

histologisch nachweisbare Veränderungen auf. Auch bei makroskopisch

unveränderten Lungen ist daher eine systematische histologische Untersuchung

mehrerer Lungenlokalisationen unverzichtbar. Der Verband Lüneburger

Heidschnuckenzüchter e.V. hat dem Rechnung getragen und seit 2004 die obligate

histologische Untersuchung einer Stichprobe in sein Herdenüberwachungsprogramm

aufgenommen.

5.5 Untersuchung der mutterlos aufgezogenen Herde

5.5.1 Beurteilung des Sanierungserfolges

In den Jahren 1999 bis 2001 wurden insgesamt 390 Tiere für die mutterlose Aufzucht

gewonnen (WOLLNY 2000; KRÄMER 2001; BIMCZOK 2002). Bei keinem der

inzwischen 509 Zuchttiere (Stand Januar 2004) sind im Laufe der seit

Sanierungsbeginn vergangenen fünf Jahre klinische Lungenadenomatose-

Erkrankungen aufgetreten. Die ältesten Tiere der Herde sind inzwischen fünf Jahre

alt und haben damit das Alter, in dem die meisten Heidschnucken an

Lungenadenomatose erkranken, weit überschritten (siehe Kapitel 4.4).

DISKUSSION 201

Von den jeweils ältesten Tieren, das heißt den Tieren, bei denen die

Wahrscheinlichkeit am größten ist, dass sie bereits Lungenadenomatose-typische

Läsionen entwickelt haben könnten, wurden für die PCR-Untersuchung

Lungenspülproben entnommen. So wurden im Jahr 2002 von den 119 Tieren der

Geburtsjahrgänge 1999 und 2000 110 und im Jahr 2003 von den 393 Tieren der

Jahrgänge 1999, 2000 und 2001 378 Lungenspülproben mittels PCR untersucht.

Dies entspricht für das Entnahmejahr 2002 92,4%, für das Jahr 2003 96,2% aller

zum Entnahmezeitpunkt in der Herde befindlichen, zwei und mehr Jahre alten Tiere.

Bei keinem dieser Tiere konnte in drei- bzw. zweifacher Untersuchung ein JSRV-

spezifisches Genomfragment nachgewiesen werden.

Alle 299 im Untersuchungszeitraum geschlachteten Tiere wurden makroskopisch auf

Lungenadenomatose untersucht. Bei 169 Schlachttieren (56,5%) wurde zusätzlich

eine systematische histologische Untersuchung durchgeführt. Zusätzlich wurden 23

weitere Schlachtlämmer des ersten Jahrganges durch KRÄMER (2001) untersucht.

Diese wiesen weder makroskopisch noch histologisch LA-typische Läsionen auf. In

einem Fall (0,31% der insgesamt 322 Schlachtlungen) wurde Lungenadenomatose

histologisch nachgewiesen und mittels Immunhistochemie und PCR bestätigt. Bei

zwei weiteren Tieren konnte ein histologisch fragliches Ergebnis durch

weiterführende Untersuchungen als negativ eingeordnet werden.

Auch alle neun im Untersuchungszeitraum verendeten, über sechs Monate alten

Tiere wiesen keine Hinweise auf Lungenadenomatose auf. Mit den verschiedenen

Verfahren (klinische Herdenuntersuchung bei 509 Zuchttieren, PCR-Untersuchung

der Lungenspülproben von 378 dieser Zuchttiere (bei 110 dieser Tiere in zwei

aufeinanderfolgenden Jahren) sowie postmortale Untersuchung bei 331 Schlacht-

und Sektionstieren) wurden insgesamt 840 Tiere (mutterlos aufgezogene Tiere und

deren Nachkommen) untersucht. Bei einem dieser 840 Tiere konnten beginnende

Läsionen der Lungenadenomatose nachgewiesen werden, was einem relativen

Anteil von 0,12% entspricht. Bezogen auf die Gesamtzahl der mutterlos

aufgezogenen Tiere (n=390) liegt der Anteil nachgewiesener LA-Fälle bei 0,26%.

202 DISKUSSION

Diesen Zahlen stehen ein Anteil von 17,3% makroskopisch und/oder histologisch LA-

positiver Schlachttiere aus den positiven Herden des VNP und 29,8% LA-positiver

Lämmer aus der Schneverdinger Herde, durchschnittlich 15% Verluste durch

klinische Lungenadenomatose in der Schneverdinger Herde (KRÄMER 2001) sowie

ein Anteil von 28,3% makroskopisch und/oder histologisch LA-positiver Tiere zum

Zeitpunkt der Auflösung der Schneverdinger Herde gegenüber. Obwohl eine

100%ige Eradikation der Lungenadenomatose zunächst nicht erreicht werden

konnte, konnte die Prävalenz der Erkrankung extrem gesenkt werden. Parallel dazu

wurden andere Lungenerkrankungen ebenfalls deutlich reduziert.

Pseudotuberkulose-verdächtige Läsionen und Corynebacterium pseudotuberculosis

wurden im Gegensatz zur Schneverdinger Herde bei keinem der Döhler Tiere

nachgewiesen.

Nach LORENZ (1990) kann aufgrund des Stichprobenumfangs eine Schätzung der

Prävalenz einer Erkrankung in einer Herde vorgenommen werden. Für die 509

Zuchttiere der heutigen Herde wurde anhand der im Sommer 2003 untersuchten 378

Lungenspülproben eine solche Schätzung vorgenommen. Von diesen 378 im

Doppelansatz untersuchten Proben können bei einer relativen Sensitivität dieser

Untersuchung von 70,5% (siehe Kapitel 5.4.2) 266 Tiere als richtig-negativ

angesehen werden. Anhand dieser Stichprobe von 266 negativen Tiere kann

angenommen werden, dass mit 95%iger Sicherheit die Prävalenz der Erkrankung in

der heutigen Döhler Herde unter 1% liegt.

Auch bei der Maedi-Visna-Sanierung sind „Durchbrüche“ beschrieben. In einem

ersten Feldversuch in elf kleinen Beständen trat in zwei Betrieben im Zeitraum bis 36

Monate nach der Geburt bei zwei bzw. einem mutterlos aufgezogenen Lamm eine

Serokonversion auf (HOUWERS et al. 1983). In den Niederlanden wurde das

Verfahren der mutterlosen Aufzucht fester Bestandteil des nationalen Maedi-

Kontrollprogramms. Nach den Berichten von HOUWERS (1990) traten in 23 der

DISKUSSION 203

beteiligten 185 Herden Serokonversionen auf, die 1,1% der über 5000 mutterlos

aufgezogenen Tiere betrafen.

5.5.2 Mögliche Ursachen für das Vorkommen von Lungenadenomatose in der

Döhler Herde

Als mögliche Ursachen für das Auftreten von Lungenadenomatose in der mutterlos

aufgezogenen Herde wurden von KRÄMER (2001) folgende Punkte genannt.

1. infizierte Ei- oder Samenzellen

2. diaplazentare Übertragung

3. perinataler Erregerkontakt (im Stallmilieu der infizierten Muttertierherde

oder durch Erregerverschleppung der Lammhelfer vom Schaf- in den

Lämmerstall)

4. Einschleppung von Lungenadenomatose durch die zugesellten Altböcke

5. Einschleppung des Erregers durch Personenkontakt (Personal, Touristen)

6. Erregerpersistenz im Stall

Eine Erregerpersistenz im Schafstall erscheint nach zwei Jahren Leerstand,

Bodenaushub, Reinigung und Desinfektion sowie Ausstattung mit neuen Raufen und

Hürden unwahrscheinlich, zumal das Virus in der Außenwelt wenig resistent und

gegenüber handelsüblichen Desinfektionsmitteln empfindlich ist (VERWOERD 1990;

COIL et al. 2001). Gegen eine Neueinschleppung des Virus durch das Personal

wurden durch Haltung der Döhler Herde als eine geschlossene Herde mit eigenem

fest angestelltem Schäfer und strikte Hygieneregeln Vorsichtsmaßnahmen getroffen.

Zu den allgemeinen Hygienemaßnahmen zählten Stiefeldesinfektion,

bestandseigene Schutzkleidung, Zutrittsverbot für fremde Personen und bei

Bestandsbesuchen oder Schur wurde diese Herde stets als erstes vor den positiven

Gebrauchsherden besucht. Trotz getrennter Weideflächen und sogenannter

204 DISKUSSION

Sicherheitszonen, in denen keine Beweidung stattfindet (KOOPMANN 2003, pers.

Mitteilung) ist eine Erregerverschleppung von benachbarten Herden durch

Wildwiederkäuer oder den regen Touristenverkehr zumindest denkbar. Im

Naturschutzgebiet Lüneburger Heide kommen neben zahlreichen anderen Wildarten

auch Mufflons vor (ZIMMERMANN 2004, pers. Mitteilung), die nach den

Untersuchungen von SANNA et al. (2001) ebenfalls für Lungenadenomatose

empfänglich sind und daher als mögliche Überträger fungieren könnten. Das

betroffene positive Lamm war jedoch die meiste Zeit in einer Bockgruppe auf einer

eingezäunten Weide in der Nähe des Schafstalles gehalten worden und hatte

insofern wenig Möglichkeiten für einen Kontakt mit Wanderern und Wildwiederkäuern

(KOOPMANN 2001, pers. Mitteilung). Die beiden der Herde im Herbst 2000

zugesellten Altböcke konnten durch die vorliegenden Untersuchungen als mögliche

Infektionsquelle weitestgehend ausgeschlossen werden. Nach ihrer Entfernung aus

der Herde im Herbst 2002 zeigten sie weder klinische noch pathologisch-

anatomische oder histologische Hinweise auf Lungenadenomatose. Die dreimalige

Untersuchung einer Lungenspülprobe sowie von Gewebe des Lymphonodus

mediastinalis caudalis und zweier Lungenlokalisationen mittels PCR verlief für beide

Tiere negativ. Infizierte Keimzellen sind nach den Untersuchungen von PARKER et

al. (1998) ebenfalls sehr unwahrscheinlich. Es bleiben folglich noch die Möglichkeiten

einer intrauterinen (diaplazentaren) Übertragung sowie einer perinatalen Infektion,

die näher diskutiert werden müssen.

Intrauterine Übertragung

Das Ergebnis des Sanierungsversuches legt die Vermutung nahe, dass der

intrauterine Übertragungsweg, wenn überhaupt, eine untergeordnete Rolle spielt.

Eine intrauterine Übertragung ist nach den Ergebnissen von DE LAS HERAS et al.

(2000) durch den Erregernachweis in fetalen Geweben sowie die Beschreibung

eines JSRV-assoziierten Tumors bei einem drei Tage alten Lamm durchaus möglich.

Auch durch die eigenen Untersuchungen konnten Hinweise auf die Möglichkeit einer

DISKUSSION 205

intrauterinen Infektion erbracht werden. Bei einem histologisch fraglichen tragenden

Muttertier mit positivem BAL-Ergebnis wurde aus dem Thymus des Fetus in einem

von drei bzw. bei Wiederholung der PCR in einem von sechs Ansätzen ein JSRV-

spezifisches Genomfragment nachgewiesen. Alle mitgeführten Negativkontrollen

waren negativ. Eine erneute PCR-Untersuchung im Sechsfachansatz nach einer

erneuten DNA-Extraktion aus asserviertem Thymusgewebe konnte das positive

Ergebnis jedoch nicht reproduzieren. Das Lungengewebe dieses Fetus war in

dreimaliger Untersuchung negativ. Ein klinisch erkranktes Tier sowie ein klinisch

weitgehend unauffälliges Tier mit pathologisch-anatomisch feststellbaren Tumoren

waren zum Zeitpunkt der Sektion ebenfalls tragend. Bei beiden Tieren konnte aus

fetalen Geweben (Thymus, Lunge) JSRV mittels PCR nicht nachgewiesen werden.

Das Muttertier des mutterlos aufgezogenen Lammes mit positivem histologischem

Befund (Geburtsjahrgang 2000) konnte anhand detaillierter Buchführung identifiziert

werden. Es war klinisch unauffällig und wurde im Rahmen der Auflösung der

Schneverdinger Herde im Frühjahr 2001 getötet und eingehend untersucht. Weder

pathomorphologisch noch histologisch bestanden Hinweise auf

Lungenadenomatose. Alle von diesem Tier verfügbaren Proben (BAL, Blut, Ln.

mediastinalis caudalis, zwei Lungenlokalisationen) waren in dreimaliger PCR-

Untersuchung negativ. In dem von DE LAS HERAS et al. (2000) beschriebenen Fall

des drei Tage alten Lammes mit LA-typischen Läsionen hatte das Muttertier

ebenfalls keinerlei makroskopisch oder histologisch (einschließlich

immunhistochemisch) nachweisbare Läsionen aufgewiesen. Die PCR-Untersuchung

einer Blutprobe sowie von Lungengewebe und Gewebe des mediastinalen

Lymphknotens war jedoch bei diesem Tier für alle drei Proben positiv. Die

Beobachtung einer intermittierenden Virämie durch GARCIA-GOTI (1999, zit. nach

SHARP und DE MARTINI 2003) lassen eine intrauterine Übertragung im Fall des

Döhler Lammes zwar möglich erscheinen. Aufgrund des negativen

Untersuchungsergebnisses sämtlicher Proben des Muttertieres ist sie jedoch

unwahrscheinlich.

206 DISKUSSION

Perinatale Infektion

Aufgrund der beschriebenen besonderen Empfänglichkeit neugeborener Lämmer für

eine Infektion mit JSRV (SHARP et al. 1983; VERWOERD 1990) erscheint eine

perinatale Infektion trotz größtmöglicher Vorsichtsmaßnahmen im vorliegenden Fall

am wahrscheinlichsten. Eine solche ist möglich, da der Geburtshelfer durch die wilde

Natur der Heidschnucken häufig gezwungen ist, das Muttertier vorher einzufangen

und seine Hände dadurch möglicherweise mit dem Erreger kontaminiert werden

(KRÄMER 2001). Im dritten Jahr der Sanierung waren die Überwachungsschichten

daher nach Möglichkeit mit zwei Personen besetzt. Auch die Utensilien zur

Geburtshilfe und die zum Lämmertransport genutzten Kisten stellen eine mögliche

Infektionsquelle dar, da sie zwar außerhalb der Reichweite der Mutterschafe gelagert

wurden, jedoch für ein schnelles Eingreifen innerhalb des Schafstalles bereitgehalten

werden mussten und damit zwangsläufig mit möglicherweise erregerhaltiger Stalluft

in Kontakt kamen. Die Lammhelfer selbst, die in Personalunion auch die Versorgung

der neugeborenen Lämmer übernahmen, stellen trotz strikter Hygienemaßnahmen

und Wechsel der Schutzkleidung ebenfalls ein mögliches Risiko dar (KRÄMER

2001).

5.5.3 Konsequenzen

Eine Übertragung von Lungenadenomatose ist bereits in der langen subklinischen

Phase der Erkrankung möglich (DUNGAL et al. 1938). Ab welcher Größe der

Läsionen eine solche Übertragung stattfinden kann, entzieht sich der Möglichkeit

einer gezielten Untersuchung. Bei Auftreten klinischer Symptome sind in der Regel

bereits ausgedehnte Tumoren vorhanden (MACKAY und NISBET 1966; TUSTIN

1969; VERWOERD et al. 1985). Inwiefern eine fokale, lediglich histologisch

nachweisbare Läsion bereits das Potential einer Infektion anderer Tiere in sich birgt,

ist nicht geklärt. Eine solche ist angesichts des minimalen Ausmaßes der

nachgewiesenen Läsion bei dem positiven Lamm sicherlich unwahrscheinlich, jedoch

DISKUSSION 207

theoretisch möglich. Die Haltung des histologisch positiven Lammes in einer

separaten Bockgruppe, die wenig Kontakt zur übrigen Herde hatte und von der ein

Großteil der anderen Bocklämmer zeitgleich mit dem betroffenen Tier im Frühjahr

2001 geschlachtet wurde, reduzieren das Risiko einer Weiterverbreitung der Infektion

innerhalb der Herde weiter.

Seit Entfernen des Bocklammes aus der Herde sind inzwischen nahezu drei Jahre

vergangen. Die Häufung früher Erkrankungsfälle in den positiven Herden legt eine

vergleichsweise kurze Inkubationszeit bei Heidschnucken nahe, so dass in der

Zwischenzeit klinische Erkrankungen hätten auftreten müssen, zumal sich durch die

Fortführung der Sanierung im Frühjahr 2001 sowie durch den eigenen Nachwuchs

der Döhler Herde eine große Anzahl hochempfänglicher Jungtiere in der Herde

befand. Die Wahrscheinlichkeit, dass durch das LA-positive Bocklamm weitere Tiere

infiziert wurden, ist nach menschlichem Ermessen daher gering.

Durch die Untersuchung der Mehrzahl der in der Herde vorhandenen Alttiere mittels

Lungenspülung und PCR (im Sommer 2002 von 92,4% und im Sommer 2003 von

96,2% aller zum Entnahmezeitpunkt in der Herde befindlichen, zwei und mehr Jahre

alten Tiere) konnten weitere LA-Fälle weitgehend ausgeschlossen werden. Die

Herde kann daher heute mit ausreichender Sicherheit als LA-unverdächtig

angesehen werden.

208 DISKUSSION

SCHLUSSFOLGERUNGEN 209

6. SCHLUSSFOLGERUNGEN

• Als praktikables Verfahren des Lungenadenomatose-Monitorings und der

Herdenuntersuchung steht die pathologisch-anatomische und histologische

Untersuchung von Schlachtlungen zur Verfügung.

• Am lebenden Tier sind Herdenuntersuchungen durch die Untersuchung von

Lungenspülproben mittels PCR möglich, da mit der Methode zur Entnahme

von Lungenspülproben nach endotrachealer Intubation ein praxistaugliches

Verfahren zur Entnahme von Lungenspülproben unter Feldbedingungen zur

Verfügung steht. Die PCR-Untersuchung von Lungenspülproben weist am

lebenden Tier im Vergleich zu anderen Verfahren die derzeit höchste

diagnostische Aussagekraft auf.

• Die relative Sensitivität der PCR-Untersuchung von Lungenspülproben beträgt

im Vergleich zur histologischen Untersuchung von vier Lungenlokalisationen

für alle Stadien der LA 90,2% bei einer relativen Spezifität von 98,4%. Für

klinisch unauffällige Tiere mit pathologisch-anatomisch oder histologisch

nachgewiesenen LA-typischen Läsionen beträgt die relative Sensitivität

77,3%.

• Die Untersuchung von Blutproben mittels PCR ist aufgrund einer relativen

Sensitivität von lediglich 5,7% diagnostisch wertlos.

• Die PCR-Untersuchung des Lymphonodus mediastinalis caudalis ist im

Vergleich zur histologischen Untersuchung von vier Lungenlokalisationen mit

einer relativen Sensitivität von 81,2% dieser in der postmortalen Untersuchung

unterlegen. Die PCR-Untersuchung von Gewebeproben kann zur Abklärung

fraglicher Fälle jedoch hilfreich sein.

210 SCHLUSSFOLGERUNGEN

• Die mutterlose Aufzucht der Lämmer ist mit einem geringen Restrisiko ein für

die Sanierung einer Herde von der Lungenadenomatose geeignetes

Verfahren.

• Bei 840 mit verschiedenen Verfahren untersuchten Tieren wurde in der

mutterlos aufgezogenen Döhler Herde im Jahr 2001 ein histologisch positives

Schlachtlamm identifiziert. Die diaplazentare Übertragung der LA ist zwar

selten, aber möglich. In diesem Fall konnte sie durch Untersuchung des

Muttertieres weitestgehend ausgeschlossen werden. Mit 95%iger Sicherheit

beträgt die Prävalenz der Erkrankung in der heutigen Herde unter 1%. Die

Herde kann daher heute als Lungenadenomatose-unverdächtig betrachtet

werden.

ZUSAMMENFASSUNG 211

7. ZUSAMMENFASSUNG

Katja Voigt

Untersuchungen zum Lungenadenomatose-Status einer mutterlos aufgezogenen Heidschnuckenherde mittels Polymerase-Kettenreaktion

Im Rahmen eines Versuchs der Sanierung einer wertvollen Heidschnuckenherde von

der Lungenadenomatose durch mutterlose Aufzucht wurde die diagnostische

Anwendbarkeit der Untersuchung von Blut- und Lungenspülproben mittels

Polymerase-Kettenreaktion (PCR) untersucht.

Für die Entnahme von Lungenspülproben (BAL) wurde ein kostengünstiges und

unter Feldbedingungen auch für die Probennahme bei größeren Tierzahlen

geeignetes Verfahren entwickelt. Unter kurzzeitiger medikamenteller Immobilisation

erfolgt nach endotrachealer Intubation über eine durch den Behelfs-Tracheotubus

eingeführte Sonde eine Lungenspülung mit vier Fraktionen á 25ml steriler 0,9%

NaCl-Lösung. Von 94,5% der untersuchten Tiere konnte eine für den

Untersuchungszweck brauchbare Probe gewonnen werden. Die Methode ist

risikoarm, es besteht jedoch ein geringes Risiko von tödlichen

Aspirationspneumonien (0,13% von 760 beprobten Tieren).

Die relative Sensitivität und Spezifität des Nachweises proviraler DNA des

Jaagsiekte Retrovirus (JSRV) aus Blut- und Lungenspülproben sowie Gewebe des

Lymphonodus (Ln.) mediastinalis caudalis mittels PCR im Vergleich zur

histologischen Untersuchung der Lunge wurden an Proben von 124 Sektions- und

127 Schlachttieren aus Lungenadenomatose (LA)-positiven Heidschnuckenherden

bestimmt. Zusätzlich wurden die Ergebnisse der klinischen Untersuchung mit den

Ergebnissen der postmortalen Untersuchung verglichen und weitere Daten zu der

Altersverteilung erkrankter Tiere und der Prävalenz der Erkrankung in der LA-

positiven Muttertierherde ermittelt.

212 ZUSAMMENFASSUNG

61,7% der klinisch erkrankten Tiere (n=47) und 50,6% der Tiere mit makroskopisch

und/oder histologisch nachgewiesenen Läsionen (n=79) waren zwei Jahre alt oder

jünger. Der Median lag in der Gruppe der klinischen Erkrankungen bei einem Jahr, in

der Gruppe der Tiere mit LA-typischen Läsionen bei zwei Jahren. Die jüngsten

erkrankten Tiere waren vier Monate, das älteste zehn Jahre alt. Die Prävalenz

histologisch bestätigter LA betrug bei den Schlachttieren aus positiven Herden 17,3%

und in der Herde, aus der die Mehrzahl der Lämmer für die mutterlose Aufzucht

gewonnen wurden (sog. „Schneverdinger Herde“) 28,3%.

Die klinische Untersuchung weist nur in fortgeschrittenen Erkrankungsstadien eine

hohe diagnostische Sicherheit auf. Bei klinisch unauffälligen Tieren und Tieren mit

lediglich geringgradigen oder unspezifischen respiratorischen Symptomen (Summe:

n=87) aus den positiven Herden wurden bei der pathologisch-anatomischen und

histologischen Untersuchung in 23,0% der Fälle LA-typische Läsionen

nachgewiesen.

Für die PCR-Untersuchung von Blutproben wurde im Vergleich zur Histologie von

vier Lungenlokalisationen eine relative Sensitivität von 5,7% ermittelt. Die PCR-

Untersuchung von Lungenspülproben wies eine relative Sensitivität von 90,2%

(n=51) und eine relative Spezifität von 98,4% auf (n=64). Für die Untersuchung des

Ln. mediastinalis caudalis wurde im Vergleich zur Histologie von vier

Lungenlokalisationen eine relative Sensitivität von 81,2% (n=69) und eine relative

Spezifität von 100% (n=63) ermittelt.

Zur Untersuchung der inzwischen auf 509 Zuchttiere angewachsenen mutterlos

aufgezogenen Herde wurde unter anderem das Verfahren der makroskopischen und

histologischen Untersuchung der Schlachtlungen angewendet. Die Lungen

sämtlicher im Untersuchungszeitraum vom Herbst 2000 bis Ende 2003

geschlachteter Tiere (n=299) wurden pathologisch-anatomisch, sowie von 56,5%

zusätzlich histologisch untersucht. Von 105 Tieren wurde außerdem Gewebe des Ln.

mediastinalis caudalis mittels PCR untersucht. Daneben erfolgte eine regelmäßige

klinische Begutachtung der Herde sowie im Sommer 2002 und 2003 jeweils die

ZUSAMMENFASSUNG 213

Entnahme von Lungenspülproben bei allen über zwei Jahre alten Tieren und deren

Untersuchung mittels PCR. Bei einem im Frühjahr 2001 im Alter von 13 Monaten

geschlachteten Lamm wurde eine lediglich histologisch nachweisbare LA-typische

Läsion festgestellt. Die PCR-Untersuchung des Ln. mediastinalis caudalis sowie eine

immunhistochemische Untersuchung bestätigten diesen Fall. Durch Untersuchung

der im Herbst 2000 der Herde zugesellten Altböcke sowie des Muttertieres des

histologisch positiven Lammes konnte eine Neueinschleppung der LA durch die

zugekauften Böcke sowie eine diaplazentare Übertragung weitestgehend

ausgeschlossen werden. Am wahrscheinlichsten ist als Infektionsquelle eine

perinatale Infektion im Stallmilieu der infizierten Muttertierherde.

Weitere positive Befunde traten für alle mit den verschiedenen genannten Verfahren

untersuchten Tiere und Proben nicht auf. Drei Jahre nach dem Entfernen des

histologisch positiven Tieres aus der Herde sind in der Herde keine klinischen

Erkrankungen oder Verdachtsfälle aufgetreten. Die geschätzte Prävalenz möglicher

weiterer LA-Fälle in der Herde liegt mit 95%iger Sicherheit unter 1%. Die Herde kann

daher heute als Lungenadenomatose-unverdächtig angesehen werden.

214 ZUSAMMENFASSUNG

SUMMARY 215

8. SUMMARY

Katja Voigt

Studies on the presence of Ovine Pulmonary Adenocarcinoma in a motherless reared flock of German Heath Sheep by use of polymerase chain reaction

The diagnostic value of polymerase chain reaction (PCR) testing of blood and

bronchoalveolar lavage (BAL) samples was evaluated as part of a clinical trial to

eradicate OPA from a severely infected flock by snatching the lambs at birth and

rearing them artificially.

A simple and ecomomical technique for BAL sampling in sheep was developed,

which can be used for sampling large numbers of animals under field conditions.

After a short-term medical immobilisation the animal is intubated endotracheally and

a smaller tube introduced into the lower airways. The lavage is performed using four

aliquots of 25 ml sterile 0.9% NaCl solution. A decent sample for the intended PCR

examination could be obtained from 94.5% of the animals examined. The method

bears a very low risk of fatal aspiration pneumonia (0.13% of the 760 animals that

had been sampled).

The relative sensitivity and specificity of a PCR test for proviral DNA from blood and

BAL samples as well as the caudal mediastinal lymph node was evaluated using

histological examination as golden standard. Samples from 124 animals designated

for post mortem examination as well as 127 slaughter sheep from OPA-infected

flocks were obtained for that purpose. In addition, the results of a thorough clinical

examination were compared to those of gross pathology and histology, and

additional information was gathered on the age distribution of diseased animals and

on the prevalence in slaughter animals from infected flocks and in the maternal flock

where the motherless reared lambs were taken from.

216 SUMMARY

Of the 47 animals with clinical or clinically suspected OPA 61.7% were two years old

or younger, as well as 50.6% of the 79 animals with grossly or histologically proven

lesions. The median of the age of clinical cases was one year, while the median was

two years for the group of animals with grossly or histologically proven lesions. The

youngest animals that showed clinical OPA were four months old, the oldest one was

ten years. The prevalence in slaughter animals from infected flocks was 17.3% and

in the maternal flock as high as 28.3%.

Clinical examination is of high diagnostic value in advanced cases only. In 87

apparently clinically healthy sheep or animals showing just very slight or inconclusive

respiratory signs, 23.0% showed grossly or histologically discernable lesions of OPA.

PCR testing of blood samples resulted in a relative sensitivity of 5.7% compared to

the results of histological examination. It can therefore be considered as useless for

diagnostic purposes. PCR testing of BAL samples showed a relative sensitivity of

90.2% (n=51) and a relative specificity of 98.4% (n=64). The relative sensitivity of

PCR testing of tissue samples from the caudal mediastinal lymph node is 81.2%

(n=69) with a relative specificity of 100% (n=63).

The motherless reared flock has now grown to a number of 509 breeding stock.

Among several techniques to examine this flock for the presence of OPA gross

pathological and histological examination of slaughter specimen was applied. The

lungs of all the 299 animals slaughtered between autumn 2000 and the end of 2003

were examined grossly. 56.5% of these were also examined histologically. In

addition, 105 lymph node samples were examined by PCR. A regular clinical

examination of the flock was performed and in summer 2002 und 2003 BAL samples

for PCR examination were taken from all animals older than two years of age. OPA

was diagnosed histologically (there were no discernible gross lesions) in one lamb 13

months old, which was slaughtered in spring 2001. This diagnosis was confirmed by

PCR testing of the lymph node sample and immunohistochemistry. Examination of

the two rams that had been introduced into the flock and of the positive lamb’s

mother did exclude re-introduction of OPA into the flock and intrauterine

transmission. The most likely source of infection appears to be perinatal infection.

SUMMARY 217

There was not obtained any other positive result from any other of the samples or

animals described above, and no clinical or suspicious cases have been seen during

the three years that have passed since the histologically positive animal was

removed from the flock.

The estimated prevalence of possible other cases of OPA in the remaining flock is

less than 1 % with a statistical confidence of 95%. Today OPA can be considered as

eradicated from this flock.

218 SUMMARY

LITERATURVERZEICHNIS 219

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Untersuchungen zu Atemfrequenz, Herzfrequenz und Körpertemperatur von Schafen

bei Stallhaltung


ZAVALA, G., C. PRETTO, Y.-H.J. CHOW, L.A. JONES, A. ALBERTI, E. GREGO,

M. DE LAS HERAS u. M. PALMARINI (2003):

Relevance of Akt phosphorylation in cell transformation induced by Jaagsiekte Sheep

Retrovirus

Virology 312, 95-105

ZRENNER, K. u. K. PAINTNER (2003):

Arzneimittelrechtliche Vorschriften für Tierärzte

Deutscher Apotheker Verlag, Stuttgart

ANHANG 259

10. ANHANG

I. Geräte und Verbrauchsmaterialien für die Probenentnahme

A Gewebeproben 10 % neutral gepuffertes Formalin Bezug über Institut für Pathologie,

Tierärztliche Hochschule Hannover

Besamungsbehälter Rinderproduktion Niedersachsen

Bestecke : J. Lehnecke, Schortens

Aesculap Schere BC323130,

Pinzette, chir.,11,5 cm, Zähne 1x2

Dewargefäß, Edelstahl Landgraf, Langenhagen

EuthaR 77 Essex Tierarznei, München

Fleischermesser, hitzesterilisierbar Schlachthofbedarf

Flüssiger Stickstoff Rinderproduktion Niedersachsen

Gefrierbeutel, 30 l Schlachthofbedarf

Kälte-Schutzhandschuhe Landgraf, Langenhagen

Latexhandschuhe: RotiprotectR Latex Roth, Karlsruhe

Rektalisierhandschuhe, 100 cm Tierärztebedarf

Runddosen aus Polyethylen, 500 ml Engelbrecht, Edermüde

Safe-Lock Tubes 2,0 ml, Eppendorf Bezug über Omnilab, Gehrden

B Blutproben

Vacutainer, Li-Heparin, 10 ml Medicalis, Garbsen

Vacutainer Kanüle 20G 1 1/2“ Medicalis, Garbsen

Vacutainer Hütchen Medicalis, Garbsen

260 ANHANG

C Lungenspülproben BoviConceptR Gleit-Gel A. Albrecht, Aulendorf

Bronchialzerstäuber Karl Storz, Tuttlingen Desinfektionsmittel: HelipurR-Konzentrat Omnilab, Gehrden

Desinfektionswannen

Edelstahl-Rundstangen, Durchm. 0,6cm Stahlhandel

Einwegspritzen, 20ml (BD DiscarditTM)

Einwegspritzen 5 ml (BD DiscarditTM) Fa. Transatlantic, Bremen

Ernährungssonde, geschlossen, abgerundete

Spitze, 2 seitliche Augen, Trichteran-

satz (Luer), Länge 100 cm, steril Aesculap AG, Melsungen.

Handtücher

Injektionskanüle (BD MicrolanceTM)

18G 1 1/2“: 1,2x40 Fa. Transatlantic, Bremen

Isocain ad us. vet. Selectavet, Weyarn-Holzolling

Isotone Kochsalzlösung 0,9%

zur i.v. Infusion B. Braun, Melsungen Laryngoskop mit

Laryngoskopspatel Miller 4 (207mm,

Breite am distalen Ende 15,9mm)

F.O.NT 3,5V Ladegriff, komplett

mit NT 200 Ladegerät Heine Optotechnik, Herrsching

Latexhandschuhe: RotiprotectR Latex Roth, Karlsruhe

Müllbeutel

PVC Schlauch, klar,

GuttasynR TOL 0,8 cm x 2mm Vertrieb: Frommeyer, Isernhagen.

Schraubdeckeldosen, 90 ml, steril Roth, Karlsruhe

UrsotaminR Serumwerk Bernburg AG,

ANHANG 261

II. Geräte für die Laboruntersuchungen

Biometra Standard Power Pack P25 Biometra, Göttingen

Blaulichttransilluminator Flu-O-Blu,

Wellenlänge 460 – 480 nm Biozym , Hess. Oldendorf;

Blutbildanalysegerät Modell MEK – 6108G Nihon Kohden, Bad Homburg

Computer mit Bildbearbeitungsprogramm

Gel Pro 3 Biozym, Hess. Oldendorf

Dampfsterilisator

GETINGE AB GE 2606 EC-1 / P20278

Digitalkamera Sony, Modell XC-0003P

Color video camera module +

TV zoom lens 1:16 / 12,5 – 75

mit Kaiser Orange Filter Bezug über Biozym, Hess. Oldendorf

Elektrophoresekammern Biozym, Hess. Oldendorf

ComPhor Midi Gelelektrophoresesystem SN 00082102,

ComPhor Mini Gelelektrophoresesystem,

Kamm Standard 10 Zähne, 1mm, für ComPhor Mini;

Kamm Standard, 20 Zähne, 1mm, für ComPhor Midi;

Gefrierschränke -20°C Gefriertruhe -80°C Glaswaren für Laborbedarf

ausgebacken bei 180°C für 3 h Bezug über Landgraf, Langenhagen Laborspülmaschine MIELABOR G 7783 Multitronic, Miele

Lichtmikroskop Leica DMLB, Okular 10x, Objektiv 100x

Magnetrührer Mikrowelle SHARP R-202 Elektrofachhandel

pH-Meter: Mikroprozessor pH-Meter Omnilab, Gehrden

Photometer Uvikon 930 Spectrophotometer

Uvikon XL, Bio-Tek Instruments Kontron Instruments

262 ANHANG

Pipetten: Probenaufbereitung: Eppendorf Research 100-1000 µl; Biozym PreCision 20 – 200 µl Biozym PreCision 2-20 µl Mastermix Eppendorf Reference 0,1-10 µl Eppendorf Research 2-20 µl Eppendorf Research 10-100 µl Eppendorf Research 20-200 µl Eppendorf Research 100-1000 µl Geräteraum Eppendorf Research 10-100 µl Biozym PreCision 0,5 – 10 µl Biozym PreCision 2 – 20 µl

Elektrophorese Eppendorf Research 10-100 µl Biozym PreCision 0,5 – 10 µl Biozym PreCision 2 – 20 µl Quarzkuvette

Reverse-Osmose-Anlage RO 20 Fa. Werner, Leverkusen

Schüttelwasserbad GFLR 1083 GFL Gesellschaft für Labortechnik

mbH, Burgwedel

Schutzbrille :Gold Vision Blue Block GV Biozym, Hess. Oldendorf

Sterilbank: HeraSafe, Sicherheitswerkbank Heraeus (Kendro Laboratory

Products); Osterode

Thermocycler: Eppendorf Mastercycler Eppendorf, Wesseling

Trockenschrank: Köttermann R 2717

Vortex Mastermix: MS2 Minishaker IKA R; Omnilab, Gehrden

Vortex Probenaufbereitung: Vortex Genie 2R G 560E, Scientific Industries, Inc.

Bezug über Omnilab, Gehrden

Wasserstrahlpumpe

Zentrifuge Hauptlabor: Varifuge 20 RS Heraeus, Osterode

Zentrifuge Mastermix: Biofuge pico Heraeus, Osterode

Zentrifuge Probenaufbereitung: Biofuge pico Heraeus, Osterode

ANHANG 263

III. Verbrauchsmaterialien für die Laboruntersuchungen

Agarose: SeaKemR LE Agarose Biozym, Hess. Oldendorf

Dampfsterilisationsverpackung, 7,5 cm

200 m Rolle Heiland, Hamburg

dNTP-Mix: RotiMixR PCR 3 Roth, Karlsruhe

Finnzymes dNTP-Mix Biometra, Göttingen

Ethanol 99,8% Roth, Karlsruhe Gaze :Topper8, Gaze-Kompressen,

7,5 x 7,5 cm Johnson&Johnson; Norderstedt GelStarR Nukleinsäurefarbstoff Biozym, Hess. Oldendorf

Greiner CellStarR Röhrchen, 15 ml Greiner Bio-One GmbH,

Frickenhausen

Latexhandschuhe: RotiprotectR Latex Roth, Kralsruhe

Nitrilhandschuhe: RotiprotectR Nitril Roth, Karlsruhe

Pasteurpipette, 3 ml, steril, graduiert:

LiquipetteTM , steril Roth, Karlsruhe

PeqGOLD 100 bp DNA-Leiter Peqlab, Erlangen

Pipettenspitzen (Eppendorf) Bezug über Omnilab, Gehrden

epT.I.P.S. Filter 0,1 – 10 µl

epT.I.P.S. Filter 2 – 100 µl,

epT.I.P.S. Filter 20 – 300 µl

epT.I.P.S. Filter 50 – 1000 µl

Primer Roth, Karlsruhe

Qiagen DNeasyR Tissue kit (250) Qiagen, Hilden

Qiagen HotStarTaqTM Qiagen, Hilden

Reaktionsgefäße, steril, DNAse/RNAse-frei: Roth, Karlsruhe

0,2ml: Mµlti Ultra TubesR, 0,2ml

0,65ml: MµltiR-Reaktionsgefäße, 0,65 ml, farblos,

1,7ml: MµltiR-Reaktionsgefäße, 1,7 ml, farblos,

264 ANHANG

Safe-Lock Tubes 2,0 ml, Eppendorf Bezug über Omnilab, Gehrden

SteritopTM, 500 ml und StericupTM 250 ml Millipore, Schwalbach

Wasser für die Molekularbiologie,

DEPC-behandelt Roth, Karlsruhe

Wasser, doppelt destilliert, 30l Kanister Roth, Karlsruhe

IV. Gebrauchslösungen

A Herstellung der Lösungen 10x TBE Tris (Molekulargewicht 121,1) 108 g

Borsäure 55 g

diNaEDTA 9,3 g

demineralisiertes Wasser ad 1000 g

(pH sollte ca. 8,3 sein, nicht einstellen)

für die Herstellung der Arbeitslösung 1 in 10 verdünnen. Aufbewahrung bei 4°C

Für alle folgenden Puffer alle Gerätschaften und Flaschen vor Verwendung zur

Pufferherstellung bei 180°C für 3 h ausbacken

1x TE

10 mmol/l Tris, 1 mmol/l EDTA (pH 8,0) in doppelt autoklaviertem (autokl.) Aqua

dest. pH mit 1N HCl einstellen, anschließend sterilfiltrieren. Bei 4°C aufbewahren

für 1/2 l für 1 l

Tris 605,7 mg 1,2114 g

EDTA 146,15 mg 292,3 g

2x autokl. Aqua bidest. ad 500 ml ad 1000 ml

ANHANG 265

Erythrozyten-Lysispuffer (Tris-gepufferte 0,16 mol/l NH4Cl-Lösung)

Lösung A: 0,16 mol/l NH4Cl (Molekulargewicht 53,49)

NH4Cl 8,3 g

2x autokl. Aqua bidest ad 1000 ml

Lösung B 0,17 mol/l Tris (Molekulargewicht 121,1)

Tris 20,6 g

in 900 ml Aqua bidest (doppelt autokl.) auflösen, pH mit HCl auf 7,65

einstellen

dann mit Aqua bidest. (doppelt autokl.) auf 1000 ml auffüllen.

Für die Herstellung der Arbeitslösung 450 ml der Lösung A mit 50 ml der Lösung B

mischen und sterilfiltrieren. Alle Lösungen (A, B u. Arbeitslösung bei 4°C

aufbewahren)

PBS (pH 7,4)

NaCl 137 mmol/l

KCl 2,7 mmol/l

Na2HPO4 8,1 mmol/l

KH2PO4 1,12 mmol/l

sterilfiltrieren und bei 4°C aufbewahren

für 1 l:

NaCl 8,006 g

KCl 201,31 mg

Na2HPO4 1,15 g

KH2PO4 152,42 mg

266 ANHANG

Ladungspuffer für Elektrophorese

Stammlösung:

Bromphenolblau 0,25%

Xylencyanol 0,25%

30% Glycerol (autoklaviert)

zur Herstellung der Arbeitslösung:

100µl Stammlösung + 1 ml 30% Glycerol (autoklaviert)

B Zutaten für die Herstellung der Gebrauchslösungen

Ammoniumchlorid > 99,5% p.a. Roth, Karlsruhe

Borsäure USP, BP, PH.EUR Roth, Karlsruhe

Bromphenolblau Na-Salz Roth, Karlsruhe Demineralisiertes Wasser aus eigener reverse Osmose-Anlage (für TBE)

Di-Natrium-EDTA p.a. Roth, Karlsruhe

Doppelt destilliertes Wasser Roth, Karlsruhe

Glycerol, > 99,5%, p.a. Roth, Karlsruhe

HCl 1N Merck, Darmstadt KCl > 99,5% p.a.. Roth, Karlsruhe

KH2PO4, wasserfrei, p.a. Roth, Karlsruhe

Na2HPO4, wasserfrei, p.a. Roth, Karlsruhe

NaCl p.a. Merck, Darmstadt

Tris-Puffer p.a. Roth, Karlsruhe

Xylencyanol Roth, Karlsruhe

ANHANG 267

V. Tabellenverzeichnis

Tabelle Seite

Tabelle 1: 60 Nachweis von Jaagsiekte Retrovirus RNA und proviraler DNA aus Probenmaterial natürlich und experimentell infizierter Tiere mit klinischer Lungenadenomatose (PALMARINI et al. 1996b)

Tabelle2: 62 Nachweis von JSRV proviraler DNA aus Probenmaterial von Tieren mit klassischer und atypischer Lungenadenomatose (LA) sowie klinisch gesunden Kontakttieren (GONZALEZ et al. 2001)

Tabelle 3: 81

Altersstruktur der Schlachttiere aus LA-positiven Herden Tabelle 4: 82 Übersicht der Lämmer aus der Tütsberger Herde, von denen regelmäßige Blutentnahmen erfolgten

Tabelle 5: 103 Bezeichnung, Verwendung, Sequenz (nach PALMARINI et al. 1996b) und Schmelzpunkte der Primer für die U3 LTR PCR

Tabelle 6: 104 Reagenzien für die U3 LTR PCR

Tabelle 7: 104 Zeit-Temperaturprogramm für die U3 LTR PCR

Tabelle 8: 106

Bezeichnung, Verwendung, Sequenz (nach PALMARINI et al. 1996b) und Schmelzpunkte der Primer der hn PCR

268 ANHANG

Tabelle Seite

Tabelle 9: 106

Reagenzien für die hn PCR

Tabelle 10: 107

Zeit-Temperaturprogramm für die hn PCR

Tabelle 11: 108 Rechnerischer Gehalt an Plasmidmolekülen in 5 µl 1:5 verdünnter Plasmidlösung

Tabelle 12: 110

Bezeichnung, Verwendung, Sequenz (nach DEWAR und SHARP 2000, pers. Mitteilung) und Schmelzpunkte der Primer für die Glycerinaldehyd–3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH)-PCR

Tabelle 13: 111

Reagenzien für die GAPDH PCR

Tabelle 14: 111

Zeit-Temperaturprogramm für die GAPDH PCR

Tabelle 15: 122

Ergebnisse der pathologisch-anatomischen und pathohistologischen Untersuchung der Tiere der Gruppe A

Tabelle 16: 123

Ergebnisse der pathologisch-anatomischen und pathohistologischen Untersuchung der Tiere der Gruppe B

Tabelle 17: 124

Ergebnisse der pathologisch-anatomischen und pathohistologischen Untersuchung der Tiere der Gruppe C

ANHANG 269

Tabelle Seite

Tabelle 18: 125

Ergebnisse der pathologisch-anatomischen und pathohistologischen Untersuchung der Tiere der Gruppe D

Tabelle 19: 126

Einteilung der Sektionstiere aus positiven Herden in Kategorien anhand der pathologisch-anatomischen und histologischen Lungenbefunde

Tabelle 20: 128

Einteilung der Schlachttiere aus positiven Herden in Kategorien anhand der pathologisch-anatomischen und histologischen Lungenbefunde

Tabelle 21: 129

Ergebnisse der pathologisch-anatomischen und pathohistologischen Untersuchung der Lungen der Schlacht- und Sektionstiere aus der Schneverdinger Herde

Tabelle 22: 130 Vorkommen anderer Lungenerkrankungen in der Schneverdinger Herde

Tabelle 23: 136

makroskopische Beurteilung der Lungenspülproben

Tabelle 24: 138

Konzentration und Reinheit der aus verschiedenen Probenarten gewonnenen DNA

Tabelle 25: 140

Prozentsatz positiver Reaktionen der Plasmidkontrollen in der U3 LTR und der hn PCR vor dem Hintergrund von Wasser

Tabelle 26: 142

Ergebnis der Inhibitionskontrollen (Gewebeproben)

270 ANHANG

Tabelle Seite

Tabelle 27: 142

Ergebnis der Inhibitionskontrollen (Blutproben)

Tabelle 28: 145

Ergebnis der Inhibitionskontrollen (BAL-Proben)

Tabelle 29: 145

Zusammenfassung der Inhibitionskontrollen für alle Probenarten

Tabelle 30: 147

Vergleich der OD260/OD280 für mit verschiedenen Verfahren aus mit JS7-Zellen versetzten Proben isolierter DNA

Tabelle 31: 151

Nachweisgrenze der U3 LTR PCR am Modell mit JS7-Zellen versetzter Rinderblutproben

Tabelle 32: 152

Nachweisgrenze der hn PCR am Modell mit JS7-Zellen versetzter Rinderblutproben

Tabelle 33: 153

Nachweisgrenze der U3 LTR und hn PCR am Modell mit JS7-Zellen versetzter Rinderblutproben bei Verwendung von Finnzymes dNTP’s

Tabelle 34: 159

Probenübersicht (positive Herden); Anzahl mit der PCR untersuchter Proben von Schlacht- und Sektionstieren der verschiedenen Kategorien

Tabelle 35: 160

Ergebnis der PCR-Untersuchung von Lungenspülproben von Tieren der Kategorie I

ANHANG 271

Tabelle Seite

Tabelle 36: 161

Ergebnis der PCR-Untersuchung von Blutproben (Buffy-Coat) von Tieren der Kategorie I

Tabelle 37: 161

Ergebnis der PCR-Untersuchung von Gewebeproben des Ln. mediastinalis caudalis von Tieren der Kategorie I

Tabelle 38: 162

Ergebnis der PCR-Untersuchung von Tumorgewebe bzw tumorverdächtigem Gewebe von Tieren der Kategorie I

Tabelle 39: 162

Ergebnis der PCR-Untersuchung von makroskopisch unverändertem Gewebe von Tieren der Kategorie I

Tabelle 40: 163

Ergebnis der PCR-Untersuchung von BAL-, Blut- und Gewebeproben von Tieren der Kategorie II

Tabelle 41: 164

Ergebnis der PCR-Untersuchung von BAL- und Gewebeproben von Tieren der Kategorie IV

Tabelle 42: 165

Übersicht über die Untersuchungsergebnisse der vier PCR-positiven Tiere aus Kategorie IV (histologisch negativ)

Tabelle 43: 168

Relative Sensitivität der PCR-Untersuchung (Tiere der Kategorie I und II) im Vergleich zur systematischen Histologie (vier Lungenlokalisationen)

272 ANHANG

Tabelle Seite

Tabelle 44: 168

Relative Spezifität der PCR-Untersuchung im Vergleich zur systematischen Histologie (vier Lungenlokalisationen), berechnet für die Gesamtheit der Tiere der Kategorie IV

Tabelle 45: 169

Relative Spezifität der PCR-Untersuchung im Vergleich zur systematischen Histologie (vier Lungenlokalisationen), berechnet für die richtig-negativen histologischen Befunde der Tiere der Kategorie IV Tabelle 46: 170

Ergebnis der PCR-Untersuchung von BAL-, Blut- und Gewebeproben von klinisch LA-unverdächtigen Tieren der Kategorien I und II

Tabelle 47: 172

Übersicht über die Untersuchungsergebnisse der histologisch fraglichen Tiere

Tabelle 48: 174

Ergebnisse der klinischen, pathologisch-anatomischen und histologischen Untersuchung der Tütsberger Lämmer und molekularbiologische Untersucnung der Lungenspülproben

Tabelle 49: 175

Ergebnisse der PCR-Untersuchung der Blutproben sowie Gewebe- und BAL-Proben von vier ausgewählten Lämmern

Tabelle 50: 177

Sektionsbefunde verendeter Tiere > 6 Monate aus der Döhler Herde (Herbst 2000 bis Ende 2003)

Tabelle 51: 180

makroskopische und histologische Untersuchungsergebnisse von Tieren mit histologischem Verdacht auf bzw. histologisch nachgewiesener LA aus der Döhler Herde

ANHANG 273

Tabelle Seite

Tabelle 52: 182

Weiterführende Untersuchungen bei Tieren mit positivem oder fraglichem histologischem Ergebnis

VI. Abbildungsverzeichnis

Abbildung Seite

Abbildung 1: 80 Altersstruktur der Sektionstiere aus LA-positiven Herden

Abbildung 2: 92

Lokalisation der vier Standard-Lungengewebeproben für die histologische Untersuchung

Abbildung 3: 131

Altersverteilung klinisch an LA erkrankter und LA-verdächtiger Heidschnucken (Gruppen D und C)

Abbildung 4: 132

Altersverteilung LA-positiver Heidschnucken (alle Erkrankungsstadien)

Abbildung 5: 143

Elektrophoretische Darstellung des Ergebnisses der U3 LTR PCR mit Plasmid versetzter Blutproben.

Abbildung 6: 144

Elektrophoretische Darstellung des Ergebnisses der hn PCR mit Plasmid versetzter Blutproben.

274 ANHANG

Abbildung Seite

Abbildung 7: 148

vergleichende elektrophoretische Darstellung der PCR-Produkte von mit verschiedenen Verfahren zur DNA-Extraktion präparierten, mit JS7-Zellen versetzten Rinderblutproben

Abbildung 8: 155

Agarosegel vor Durchführung des Southern Blot

Abbildung 9: 156

Geblottete Nitrozellulosemembran

ANHANG 275

VII. Danksagung

Mein besonderer Dank gilt

Martin für all die Räume, seine Menschlichkeit und Unterstützung, seinen Einsatz für meine

Finanzierung, die Ermöglichung zweier Gastaufenthalte in Schottland, seine Toleranz

gegenüber dem Wunsch, unbedingt nebenbei arbeiten zu müssen sowie sein Engagement in

der „heißen Phase“

Mike Sharp, Pat und Chris sowie allen Mitarbeitern des Moredun Research Institute für die

Gastfreundschaft, eine Einführung in die Tücken der PCR, gute Ideen und die Überlassung

von Positivkontrollen, sowie ganz besonders Pat für Ihren Sarkasmus und ihren Humor

Korinna für positive Energie, ihre stete Hilfsbereitschaft, die Überwindung von

Institutsgrenzen und ihre Funktion als „PCR-Beraterin“

Michael für die hervorragende Zusammenarbeit bei den Sektionen und die Begutachtung

ungezählter Schaflungen, obwohl er Lungenadenomatose langweilig findet...

Ilona und Bea für ihre Blutspenden

Andreas und Tobias für ihre Gastfreundschaft in der Lammzeit und danach, sowie für ihre

Küche, ihre Waschmaschine und zahlreiche Heideausflüge

Silvio, Uwe mit Familie und Herrn Salzmann für ihr trotz mancher Vorbehalte gegen „die

Wissenschaft“ großes Engagement für die Sanierung, sowie Mützen, warme Eier, Lektüre

und Kuchen im kalten Schafstall

Allen Lammhelfern für ihren Einsatz, durchwachte und durchfrorene Nächte und den Spaß,

den wir hatten

276 ANHANG

Der Landschlachterei Albers, Egestorf, besonders Herrn Ewald Albers für Kaffee, das

Tragen zu kleiner Handschuhe, eine Fortbildung in Sachen vorbildlicher Schafschlachtung

und seine unkomplizierte Mitarbeit

sowie den Mitarbeitern der Landschlachterei Meier, Behringen, ebenfalls für die Mitarbeit

bei der Probennahme und ein Kontrastprogramm

Klaus für seinen unglaublichen Einsatz und seine guten Ideen, seine unbezahlbare Hilfe bei

der Entnahme der Lungenspülproben und unterhaltsame Heidefahrten,

sowie Klaus und Sandra für die Entnahme der Lungenspülproben im Sommer 2003

Babs für Puffer und Lösungen, Sabine für ihren Kampf mit den Lungenspülproben, sowie

zusätzlich Jutta, Antje und Thekla für gute Laune im Labor

Elke für den Steri und ihren Erfindergeist sowie Herrn Fiedler und Herrn Richter für

unzählige Fahrten zur Patho

Tanja, Klaus, Thorsten, Steffi und Saskia für die Versorgung zahlloser Heidschnucken

allen nicht namentlich genannten Mitarbeitern der Klinik für kleine Klauentiere für das

gute Arbeitsklima

Jan, Arnim und „Schweinchen Dick“ für Unterstützung rund um den Apfel

Gordon für seinen Küchentisch, beständige Kritik, Platz im Gefrierschrank, Garp, die

schönen Seiten des Lebens, sowie Gordon und den „Jungs“ für den Heimwerkerkurs

Korinna, Martin Runge, Isa und Ursula für wertvolle Anregungen, Alexandra für Hilfe beim

Blot und Hakan für eine Übersetzung aus dem Türkischen

sowie last but not least Frauke für Gemüsesuppe und „Ben Hur“ (den ich im übrigen bis

heute nicht gesehen habe...)!!!

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