Aus der Medizinischen Klinik I im ... · 7 Verzeichnis der Abkürzungen A. dest. Aqua destillata...

Aus der Medizinischen Klinik I

im Berufsgenossenschaftlichen Universitätsklinikum Bergmannsheil der Ruhr-Universität Bochum

Direktor: Prof. Dr. med. H. H. Klein

Untersuchungen zum Einfluss des oralen Antidiabetikums Metformin auf die hepatische Glukoseproduktion im Zellmodell

Inaugural-Dissertation zur

Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer

Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von Christoph Alexander Mues

aus Krefeld 2009

Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr Referent: Prof. Dr. med. H. H. Klein Koreferent: Prof. Dr. med. Dr. h.c. Diethelm Tschöpe Tag der Mündlichen Prüfung: 20. 04. 2010

Meiner lieben Familie gewidmet

4

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 13

1.1 Pathophysiologie des Typ-2-Diabetes und Rolle des Metformins 13

1.2 Mögliche Ansatzpunkte der Metforminwirkung 16

1.3 Insulinsignaltransduktion 19

1.4 Crosstalk zwischen AMPK und der Insulinsignaltransduktion 23

2 Arbeitshypothese und Fragestellung 25

3 Materialien und Methoden 26

3.1 Zellbiologische Arbeitstechniken 26

3.1.1 Zelllinien 26

3.1.2 Zellkulturmedien 26

3.1.3 Subkultivierung 27

3.1.4 Zellen einfrieren / auftauen 28

3.1.5 Zellstimulation 28

3.2 Proteinchemische Arbeitstechniken 29

3.2.1 Proteinbestimmung - BCA Protein Assay 29

3.2.2 Promotoraktivitätsbestimmung - Luciferase Assay System 29

3.2.3 Polyacrylamidgelelektrophorese / Western Blot 30

3.2.4 Erneutes Beproben (Re-Blot) 34

3.2.5 Coomassie – Färbung 35

3.2.6 Ponceau – Färbung 36

3.2.7 ELISA 36

3.2.8 Apoptosedetektion -TUNEL Assay 38

3.2.9 ATP-Konzentrationsbestimmung - ATP-Lite luminescence ATP

Detection Assay System 40

3.3 Molekularbiologische Arbeitstechniken 42

3.3.1 Gesamt-RNA-Extraktion 42

3.3.2 Photometrische RNA-Quantifizierung 43

3.3.3 Agarose-Gelelektrophorese 44

5

3.3.4 cDNA – Synthese 45

3.3.5 PCR von Glucose-6-Phosphatase und β-Actin 46

3.3.6 Real time quantitative PCR 48

3.4 Statistische Auswertung 50

4 Ergebnisse 52

4.1 Regulation der Glukose-6-Phosphatase 52

4.1.1 Regulation der Glukose-6-Phosphatase-Promotoraktivität in

Abhängigkeit von Insulin 52


Abhängigkeit von Metformin 53

4.1.3 Effekte von Insulin und Metformin auf die Glukose-6-Phosphatase

mRNA 55

4.1.4 Regulation gesteigerter Glukose-6-Phosphatase-Promotoraktivität

in Abhängigkeit von Metformin und Insulin 56

4.1.5 Effekte der AMPK auf die Glukose-6-Phosphatase-

Promotoraktivität in Abhängigkeit von Insulin, Metformin und

AICAR 58

4.1.6 Effekte der AMPK auf gesteigerte Glukose-6-Phosphatase-


AICAR 60

4.2 Beeinflussung der Threonin-Phosphorylierung 172 an AMPK durch Insulin,

Metformin, AICAR und Compound C 62

4.3 ATP-Konzentrationen in H4-Zellen unter dem Einfluss von Insulin und

Metformin 64

4.4 Effekte von Insulin und Metformin auf die Apoptose 66

4.5 Beeinflussung der Tyrosin-Phosphorylierung des Insulinrezeptors durch Insulin

und Metformin 70

4.6 Beeinflussung der Serin-Phosphorylierung an Akt/PKB durch Insulin,

Metformin und PI3-Kinase-Inhibitoren 71

4.7 Beeinflussung der Serin-Phosphorylierung an GSK3 durch Insulin und

Metformin 74

6

5 Diskussion 76

5.1 Ergebnisdiskussion 76

5.2 Grenzen und Einordnung 80

6 Zusammenfassung 82

7 Literaturverzeichnis 85

7

Verzeichnis der Abkürzungen

A. dest. Aqua destillata

AICAR 5-Aminoimidazol-4-Carboxamid Ribosid

AK Antikörper

Akt/PKB Proteinkinase B

AMP Adenosinmonophosphat

AMPK AMP-activated protein kinase

ANOVA analysis of variance

APS Ammoniumpersulfat

ATP Adenosintriphosphat

BCA bicinchoninic acid

bp Basenpaare

BSA bovine serum albumine

CaCl2 Calciumchlorid

cDNA complementary DNA

cm centimeter

CO2 Kohlendioxid

dBcAMP Dibutyryl cyclic AMP

DMEM Dulbecco´s modified Eagle´s Medium

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA desoxyribonucleic acid

dNTP Desoxynucleosidtriphosphat

DPP Dipeptidyl-Peptidase

DTT Dithiothreitol

DXM dexamethason

ECL enhanced chemoluminescence

EDTA Ethylendiamintetraacetat

ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay

ERK extracellular signal-regulated kinase

EtBr Ethidiumbromid

FACS Fluorescence Activated Cell Sorting

8

FCS fetal calf serum

FITC Fluorescein-5-isothiocyanat

FKHR forkhead in rhabdomyosarcoma

FOXO Forkhead box protein

FRET Fluorescence resonance energy transfer

G6Pase Glucose-6-Phosphatase

GLP Glucagon-like peptide

GLUT Glucosetransporter

GSK-3 Glycogensynthase-Kinase-3

h Stunde

H2O Wasser

HBS HEPES buffered saline

HCl Salzsäure

HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid

HRP horseradish peroxidase

IR Insulinrezeptor

IRS1 Insulinrezeptor Substrat 1

JNK c-Jun N-terminale Kinase

kb Kilobasen

kDa Kilodalton

KHK Koronare Herzkrankheit

LAR Luciferase Assay Reagent

LY LY294002

mA Milliampere

MAPK Mitogen-aktivierte Kinase

MgSO4 Magnesiumsulfat

MODY Maturity Onset Diabetes of the Young

mRNA messenger RNA

mTOR mammalian target of rapamycin

Na3VO4 Trinatriumvanadattrihydrats

Na4P2O7 Tetranatriumdiphosphat, Natriumpyrophosphat

NaCl Natriumchlorid

9

NaF Natriumfluorid

NT-BPF NaCl, Tris, BSA, Pyrophosphat, Fluorid

pAVK periphere arterielle Verschlusskrankheit

PBS phosphate buffered saline

PCOS polycystic ovary syndrome

PCR Polymerase Chain Reaction

PDK phosphatidylinositol-dependent kinase

PEPCK Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase

PI3-K Phosphatidylinositol 3-Kinase

PIP2 Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat

PIP3 Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphat

PKB Proteinkinase B

PKC Proteinkinase C

PPAR peroxysome proliferator-activator receptor

PTEN phosphatase and tensin homolog

PTP1B Protein-Tyrosin-Phosphatase 1B

RLU relative light units

RNA ribonucleic acid, Ribonukleinsäure

Rpm rounds per minute

RT Raumtemperatur

RT-PCR Reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion

Ser Serin

SHIP2 SH2-domain containing inositol 5-phosphatase 2

ß-ME beta-Mercaptoethanol

TAE Tris-Acetat-EDTA

TBS Tris-gepufferte-Saline

TBST TBS + Tween

TE Tris-EDTA

TEMED Tetramethylethylendiamin

Thr Threonin

Tris Trishydroxymethylaminomethan

10

TUNEL terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated 2’-deoxyuridine 5’-

triphosphate-biotin nick end labeling

Tween Polyoxyethylensorbitolmonolaurat

U Units (Enzymeinheiten)

U/min Umdrehungen pro Minute

UKPDS United Kingdom Prospective Diabetes Study

v/v Volumen pro Volumen

w/v Gewicht pro Volumen

WM Wortmannin

11

Verzeichnis der Abbildungen

Abb. 1: Galega officinalis, Strukturformel Metformin 19

Abb. 2: Insulinsignaltransduktion 22

Abb. 3: Crosstalk zwischen AMPK und Insulinsignaltransduktion 24

Abb. 4: Glukose-6-Phosphatase-Promotoraktivität in Abhängigkeit verschiedener

Insulinkonzentrationen 52

Abb. 5: Glukose-6-Phosphatase-Promotoraktivität in Abhängigkeit verschiedener

Metforminkonzentrationen 54

Abb. 6: Glukose-6-Phosphatase mRNA quantifiziert mittels real-time PCR 55

Abb. 7: Gesteigerte Promotoraktivität der Glukose-6-Phosphatase in Abhängigkeit

von unterschiedlichen Konzentrationen Metformin und 10-6M Insulin 57

Abb. 8: Effekt von Compound C (40µM) auf die Glukose-6-Phosphatase-

Promotoraktivität in Abhängigkeit von Insulin (10-6M), Metformin (2mM)

oder AICAR (1mM) 59

Abb. 9: Effekt von Compound C (40µM) auf gesteigerte Glukose-6-Phosphatase-

Promotoraktivität in Abhängigkeit von Insulin (10-6M), Metformin (2mM)

oder AICAR (1mM) 61

Abb. 10: Effekt von Compound C auf den Phosphorylierungsstatus von AMPK

Threonin 172 (Western Blot) 62

Abb. 11: Effekt von Compound C auf den Phosphorylierungsstatus von AMPK

Threonin 172 (ELISA) 63

Abb. 12: ATP-Konzentrationen in H4 II E Zellen in Abhängigkeit unterschiedlicher

Konzentrationen Metformin und 10-6M Insulin 65

Abb. 13: Fluoreszenmikroskopische Apoptosebestimmung von H4 II E Zellen unter

verschiedenen Bedingungen 67

12

Abb. 14: Fluoreszenzmikroskopische Bilder von:

a) unbehandelten H4 II E Zellen

b) mit 10-6M Insulin stimulierten H4 II E Zellen

c) mit 2mM Metformin stimulierten H4 II E Zellen

d) mit 5 Units DNase stimulierten H4 II E Zellen

in 40-facher Vergrößerung mit einem 490nm Filter für FITC. 69

Abb. 15: Bestimmung des Phosphorylierungsstatus am Insulinrezeptor an Tyrosin

1162/1163 70

Abb. 16: Effekt der PI3-Kinase-Inhibitoren Wortmannin und LY294002 auf den

Phosphorylierungsstatus von Akt/PKB Serin 473 abhängig von Insulin 72

Abb. 17: Effekt der PI3-Kinase-Inhibitoren Wortmannin und LY294002 auf den

Phosphorylierungsstatus von Akt/PKB Serin 473 abhängig von

Metformin 72

Abb. 18: Phosphorylierungsstatus an Akt/PKB an Serin 473 in Abhängigkeit von

Insulin und Metformin 73

Abb. 19: Phosphorylierungsstatus der Glykogen-Synthase-Kinase3β (GSK3β) an

Serin 9 75

13

1 Einleitung

1.1 Pathophysiologie des Typ-2-Diabetes und Rolle des Metformins

Diabetes mellitus (im Folgenden kurz: Diabetes) ist eine der häufigsten

endokrinologischen Erkrankungen. Er beruht auf einem absoluten oder relativen Mangel

an Insulin, in dessen Folge es zu einer gestörten Glukosetoleranz und häufig erhöhten

Blutzuckerspiegeln kommt. Die beim Diabetes oft über Jahre erhöhten Blutzuckerspiegel

führen bei vielen Erkrankten zu Schäden am Nerven- und Blutgefäßsystem.

Die Ätiologie des Diabetes wurde 1997 von der American Diabetes Association (ADA) in

Typ 1, Typ 2, Typ 3 (MODY, genetische Defekte der Insulinwirkung, chronische

Pankreatitis, Endokrinopathien, medikamentös induziert, Infektionen, genetische

Syndrome) und den Gestationsdiabetes klassifiziert.

Die Gesamtprävalenz der manifest an Diabetes erkrankten Bevölkerung weltweit betrug

im Jahr 2000 ca. 2,8 %. Es wird vermutet, dass sich diese Zahl bis zum Jahr 2030 auf 4,4 %

erhöhen wird. Absolut bedeutet dies, dass die Anzahl an Menschen mit Diabetes von 171

Millionen auf 366 Millionen weltweit steigen wird. Der wichtigste demografische Wandel

bezüglich der Diabetesprävalenz wird die Zunahme der über 65 Jährigen in der

Bevölkerung sein. Jeder 7. wird schätzungsweise betroffen sein. Hochprävalenzbereich

stellen vor allem industrialisierte Länder dar. Hierbei ist zu bedenken, dass ca. 85 % aller

Diabetesfälle dem Typ-2-Diabetes zugeordnet werden können. Ein Typ-1-Diabetes liegt

schätzungsweise bei 5–7 % aller Diabetesfälle vor [61].

Während der Typ-1 Diabetes aufgrund einer Autoimmunreaktion, durch die es zur

kontinuierlichen Zerstörung der β-Zellen des endokrinen Pankreas kommt, in einem

absoluten Insulinmangel endet, kommt es beim Typ-2-Diabetes durch bisher nicht

vollständig verstandene Mechanismen zu einer Insulinresistenz und gestörter

Insulinsekretion mit daraus resultierendem relativen Insulinmangel. Beiden gemeinsam

sind im Endstadium eine verminderte Aufnahme von Glukose in periphere Gewebe und

eine ungehemmte Glukoneogenese der Leber.

Das Auftreten eines Typ-2-Diabetes korreliert mit der Prävalenz von Übergewicht und

dem metabolischen Syndrom. So wurde durch statistische Untersuchungen belegt, dass

14

Typ-2-Diabetes eine deutlich erhöhte Prävalenz in industrialisierten Ländern gegenüber

Entwicklungsländern aufweist, wofür in erster Linie die übermäßige Kalorienaufnahme

verantwortlich gemacht wird [17]. Der Trend zur Entwicklung von Übergewichtigkeit,

metabolischem Syndrom und anschließendem Typ-2-Diabetes nimmt immer noch zu und

setzt sich auch zunehmend in jüngeren Bevölkerungsschichten durch, sodass der früher

gängige Begriff „Altersdiabetes“ für einen Typ-2-Diabetes nicht mehr angebracht und

auch irreführend ist [45, 51]. Diese Entwicklung ist besorgniserregend und stellt mit den

dadurch verbundenen Folgen (KHK, Apoplexie, Niereninsuffizienz, pAVK mit Gangrän und

Amputationen von Extremitäten, Erblindung und vielem mehr) einen erheblichen

Schaden für die Betroffenen wie auch für die Volkswirtschaft dar. Weitere

Forschungsanstrengungen auf diesem Gebiet mit dem Ziel der Entwicklung neuer

Therapiestrategien, insbesondere für den Typ-2-Diabetes, sind daher unerlässlich.

Jede Therapie des Typ-2-Diabetes hat die Steigerung der körperlichen Aktivität, die

Umstellung der Ernährung, die Schulung und Motivation des Patienten zum Ziel. Erst nach

Erfolglosigkeit dieser Maßnahmen sollte medikamentös in den Stoffwechsel eingegriffen

werden. Hierbei werden Mono- oder Kombinationstherapien der verfügbaren

Medikamente angewendet [36].

α -Glukosidasehemmer wirken inhibierend auf die α-Glucosidasen im Dünndarm und

bewirken dadurch eine Hemmung der Spaltung von Disacchariden, was zu einer

verminderten Glukoseaufnahme aus dem Darm in das Blut führt.

Sulfonylharnstoffe stimulieren die Freisetzung von Insulin durch die Blockade von ATP-

abhängigen Kalium-Kanälen in den β-Zellen des Pankreas. Ebenfalls fördernd auf die

Insulinproduktion wirken die sogenannten „Glinide“.

Thiazolidindione, auch Glitazone genannt, wirken aktivierend auf den Transkriptionsfaktor

PPARγ und verstärken somit auf bislang noch ungeklärte Weise die Signaltransduktion

von Insulin [38]. Thiazolidindione bewirken zusätzlich eine Aktivierung der AMPK [14].

Zu den neusten Möglichkeiten der Typ-2-Diabetes-Therapie gehören die Glucagon-like-

peptide-1 (-GLP-1)-Analoga (Inkretin-Mimetika/ Exenatide) und die Dipeptidyl-Peptidase-

4 (-DPP-4)-Inhibitoren. Während der Nahrungsaufnahme wird im Dünndarm das Hormon

Glucagon-like Peptid 1 freigesetzt, das in den β-Zellen des Pankreas die Ausschüttung von

Insulin bewirkt. GLP-1 wird vom menschlichen Organismus schnell abgebaut. GLP-1-

15

Analoga ähneln dem menschlichen GLP-1 und erhalten den Insulin-sezernierenden Reiz.

GLP-1 wird durch Dipeptidyl-Peptidasen abgebaut. Eine spezifische Hemmung dieser

Peptidasen durch DPP-4-Inhibitoren verlängert die Wirkung von GLP-1 [1, 9, 48].

Erst wenn mit oralen Antidiabetika keine ausreichende Blutzuckereinstellung möglich ist,

sehen die Leitlinien eine Insulin-Therapie vor [36].

Im aktuellen Leitlinienentwurf der Deutschen Diabetes Gesellschaft (DDG) ist Metformin

das Mittel der ersten Wahl zur Behandlung von Patienten mit Typ-2-Diabetes. Diese

Empfehlung gilt nicht nur zur Behandlung übergewichtiger Patienten, sondern auch zur

Behandlung normalgewichtiger Diabetiker. Nur bei Kontraindikationen für Metformin

oder Metforminunverträglichkeit werden andere orale Antidiabetika zur Monotherapie

empfohlen. Metformin kann, wenn seine blutzuckersenkende Wirkung nicht ausreicht,

mit anderen oralen Antidiabetika (Sulfonylharnstoffe, Glinide, Glitazone, GLP-1-Analoga,

DPP-4-Inhibitoren, Acarbose) kombiniert werden. Auch wenn eine Insulintherapie nötig

wird, wird Metformin aufgrund seines insulinsparenden Effekts und des Effekts im Sinne

einer Verhinderung der Gewichtszunahme meist beibehalten. Auch in der United

Kingdom Prospective Diabetes Study (UKPDS) wurden die günstigen Eigenschaften von

Metformin dargelegt. Metformin war in einer speziellen Teilstudie bei stark

Übergewichtigen mit Sulfonylharnstoffen und Insulin verglichen worden und erwies sich

hier als besonders vorteilhaft. Die Studienergebnisse der UKPDS haben weiterhin gezeigt,

dass Metformin zu einer signifikanten Reduktion von mikro- und makrovaskulären

Komplikationen beiträgt [54].

Metformin und andere Biguanide sind Wirkstoffe, die aus der französischen Lilie (Galega

officinalis, auch Geißraute) isoliert wurden (siehe Abb. 1). Erste Beobachtungen über die

blutzuckersenkende Wirkung von Guaniden wurden bereits um 1910 beschrieben. Es

wurde damals angenommen, dass die Nebenschilddrüsen für die Elimination von

Guaniden verantwortlich sind. Bei parathyreoidektomierten Menschen und Hunden

wurden erhöhte Guanid-Spiegel im Blut in Verbindung mit Hypoglykämien festgestellt

und darüber ein Zusammenhang zwischen Guaniden und antihyperglykämischer Wirkung

dargestellt [59]. Seit den späten 1950er-Jahren wird Metformin in Europa zur Behandlung

des Typ-2-Diabetes verwendet. In den USA wird Metformin erst seit 1994 zur Behandlung

16

des Typ-2-Diabetes eingesetzt [63]. Metformin senkt in vivo den Blutzuckerspiegel von

Typ-2-Diabetikern vor allem durch eine Hemmung der hepatischen Glukoneogenese. Es

besteht ein hoher First-pass-Effekt an der Leber. Bei Typ-2-Diabetikern wird die

Plasmakonzentration von Metformin mit 10-20 µM angegeben [21].

In der Portalvene werden höhere, bisher nicht gemessene Konzentrationen vermutet. 10-

20 µM Metformin gelten im Zellversuch als submaximal, um die Effekte von Metformin zu

aktivieren [21]. In Zellversuchen werden Metforminkonzentrationen von 1–10 mM in der

Literatur beschrieben. Die zur Effektauslösung von Metformin benötigte Konzentration ist

damit in Zellversuchen wesentlich höher als bei der Therapie des Typ-2-Diabetes in vivo.

Dieser Umstand wird dadurch erklärt, dass in vielen kultivierten Zellen der zur

hepatischen Metforminaufnahme benötigte organische Kationentransporter-1 (OCT1)

nicht exprimiert und dadurch die Aufnahme von Metformin erschwert wird [50, 58].

Interessant ist, dass trotz der großen Beliebtheit dieses Medikaments und großem

Forschungsaufwand der genaue Wirkmechanismus von Metformin nicht bekannt ist.

1.2 Mögliche Ansatzpunkte der Metforminwirkung

Der exakte Wirkmechanismus von Metformin ist Gegenstand intensiver Forschung und

noch nicht abschließend geklärt. Beschrieben wurde, dass Metformin ein Aktivator der

AMP-aktivierten Proteinkinase (AMPK) ist [67]. AMPK ist eine heterotrimere

Proteinkinase, bestehend aus einer katalytischen α-Untereinheit, einer Glykogen-

bindenden β-Untereinheit und einer AMP und ATP bindenden γ-Untereinheit. Von der α-

Untereinheit sind zwei Isoformen bekannt (α1 und α2). Die α1-Untereinheit ist ubiquitär,

während die α2-Untereinheit nur in Muskel und Leber exprimiert wird. Beide Isoformen

besitzen eine katalytische, eine autoinhibitorische und eine βγ-bindende Domäne. Von

der β-Untereinheit sind ebenfalls 2 Isoformen bekannt (β1, wird ubiquitär exprimiert, und

β2, wird im Muskel exprimiert), während von der γ-Untereinheit drei Isoformen bekannt

sind (γ1 ubiquitär exprimiert, γ2 in Muskel exprimiert und γ3 in Skelettmuskel exprimiert)

[26, 52]. Die AMPK ist ein empfindlicher Sensor für den zellulären Energiestatus. Im Falle

einer katabolen Stoffwechsellage reichert sich AMP an. Die AMPK reagiert höchst

17

empfindlich auf Änderungen des AMP/ATP-Quotienten. Der ADP/ATP-Quotient ist wegen

der in allen eukaryotischen Zellen vorhandenen Adenylatkinasen, welche 2 ADP zu ATP

und AMP umwandelt, unbedeutend [18]. Steigt der AMP/ATP-Quotient an, wird die

AMPK aktiviert und schaltet anabole ATP-verbrauchende Stoffwechselwege ab, während

katabole ATP-erzeugende Stoffwechselwege aktiviert werden [19]. Auch zellulärer Stress

(z. B. Hypoxie, Ischämie, Glukosemangel [30, 35]) und ATP-verbrauchende Prozesse, wie

muskuläre Aktivität, und Hormone (z. B. die Adipokine Leptin und Adiponektin [39])

können die AMPK aktivieren. Vermehrt entstehende AMP-Moleküle binden an die γ-

Untereinheit der AMPK und bewirken eine Konformationsänderung, die sie zu einem

besseren Substrat ihrer vorgeschalteten Kinase, einem Komplex aus LKB1 und den zwei

akzessorischen Untereinheiten namens STRAD und MO25, werden lässt [21, 47]. Dieser

Komplex phosphoryliert AMPK an Threonin 172 der α-Untereinheit und steigert ihre

Aktivität um das 100-Fache. Eine alleinige allosterische Aktivierung durch AMP resultiert

in einer 10-fach zur Basalrate erhöhten Aktivität. Eine kombinierte allosterische und

durch Phosphorylierung kovalente Aktivierung erhöht die AMPK-Aktivität synergistisch

um das etwa 1000-Fache im Vergleich zur Basalaktivität [47]. Weiterhin ist beschrieben

worden, dass AMPK Calcium-abhängig durch die Calcium-Calmodulin-Kinase und durch

einen ansteigenden Kreatin/Phosphokreatin-Quotienten [42], unabhängig von AMP, an

Threonin 172 phosphoryliert und damit aktiviert werden kann.

Die Aktivierung der AMPK beeinflusst den Metabolismus auf vielfältige Weise:

Kohlenhydratstoffwechsel, Lipidstoffwechsel, Signaltransduktion, Zellproliferation und

Genexpression werden durch die AMPK moduliert. Die wichtigsten Modulationen am

Kohlenhydratstoffwechsel sind die durch GLUT-4-Translokation vermittelte verstärkte

Glukoseaufnahme, eine vermehrte Glykolyse, eine verminderte Expression von Genen der

Glukoneogenese (u. a. PEPCK und G6Pase) und eine verminderte Glykogenolyse.

Außerdem wird die Empfindlichkeit der Muskulatur für Insulin erhöht [20]. AMPK-

abhängige Veränderungen am Lipidstoffwechsel sind eine verminderte

Cholesterinsynthese, eine verminderte Fettsäuresynthese, eine verminderte Lipolyse und

eine vermehrte Fettsäureoxidation. AMPK hemmt weiterhin die Zellproliferation, weshalb

sie auch für onkologische Forschungsbereiche interessant ist [25, 40, 46, 67]. Auch beim

polyzystischen Ovar-Syndrom (PCOS) werden die Wirkungen der AMPK genutzt, um den

18

Menstruationszyklus von Patientinnen mit PCOS zu regulieren und ihre Abortneigung zu

reduzieren [12].

Letztendlich ist immer noch unklar, wie Metformin die AMPK aktiviert. Es wird weder zu

einem AMP-vergleichbaren Analogon metabolisiert noch reguliert Metformin die AMPK

direkt. Auch eine Hemmung von Phosphatasen, die Phospho-AMPK-Threonin 172

dephosphorylieren, konnte bisher nicht nachgewiesen werden [21, 52, 67].

Es wurde jedoch berichtet, dass Metformin, zumindest in höheren Dosen, wie auch

andere Biguanide den mitochondrialen Komplex 1 der Atmungskette inhibieren. Eine

solche Inhibierung könnte zu einem Anstieg des AMP/ATP-Quotienten führen und so

konsekutiv die AMPK aktivieren [10, 23, 43, 53]. Andere Autoren berichten

demgegenüber, dass kein Abfall der ATP-Konzentration und kein Anstieg des AMP/ATP-

Quotienten in Metformin-behandelten Zellen zu messen seien [14, 21]. Xie et al.

beschreiben eine Metformin-abhängige Phosphorylierung der der AMPK vorgeschalteten

Kinase, LKB1 an Serin 428 durch PKCζ mit anschließender Phosphorylierung der AMPK an

Threonin 172 [64].

Ein weiterer Aktivator der AMPK, da es ein AMP-Analogon ist, ist 5-aminoimidazol-4-

carboxamid-1-ß -D-ribofuranosid (AICAR). AICAR wird über Adenosintransporter in die

Zelle aufgenommen und durch Adenosinkinasen zu ZMP (5-aminoimidazol-4-carboxamid

ribonucleosid) phosphoryliert. Es imitiert dann AMP und alle damit verbundenen Effekte

der Hypoxie [57].

Compound C wirkt als reversibler, selektiver Hemmstoff der AMPK und kompetitiert mit

ATP. In Studien hoben Zhou et al. die Effekte von AICAR und Metformin dosisabhängig auf

[67].

19

1.3 Insulinsignaltransduktion

An insulinsensitiven Zellen, z. B. Adipozyten, Hepatozyten und Myozyten, werden über

den Insulinrezeptor die insulinspezifischen Effekte in das Zellinnere vermittelt. Zu diesen

Aufgaben zählen u. a. Glukoseaufnahme, Lipidsynthese, Glykogensynthese,

Proteinsynthese und Zellwachstum/-teilung [15].

Der Insulinrezeptor ist eine heterotetramere transmembrane Tyrosinkinase. Er besteht

aus zwei extrazellulären α-Untereinheiten und zwei transmembranären β-Untereinheiten,

die über Disulfidbrücken kovalent miteinander zu einem α2β2 -Komplex verbunden sind.

Der zytoplasmatische Teil der β-Untereinheit besitzt eine Tyrosinkinase-Domäne, die

durch Ligandenbindung an die α-Untereinheit aktiviert wird [4, 49]. Insulin

(Molekulargewicht 5807 D), ein Polypeptid bestehend aus einer A-Kette mit 21 und einer

B-Kette mit 30 Aminosäuren, die über 2 Disulfidbrücken miteinander verbunden sind,

bindet an die α-Untereinheiten des Insulinrezeptors. Diese Bindung bewirkt eine

Konformitätsänderung des Rezeptors mit nachfolgender Dimerisierung von β-

Untereinheiten, Aufhebung der Blockade der Tyrosinkinase durch die α-Untereinheit und

anschließende Autophosphorylierung von Tyrosinresten (Tyr 1158, 1162, 1163) der β-

Untereinheit [27].

Abb. 1: Galega officinalis, Strukturformel Metformin. Aus der französischen Lilie (Galega officinalis, auch Geißraute) wurde Metformin (1,1-Dimethylbiguanid, Summenformel C4H11N5, molare Masse 165,5 g/mol

−1)

extrahiert.

20

An diesem Punkt der Signalkaskade werden drei Signaltransduktionswege aktiviert (siehe

Abb. 2):

Mitogen-activated-pathway(-MAP)-Kinasen-Kaskade

Phospholipase C/Inositol-1,4,5-triphosphat(-PLC/IP3)-Weg

Phosphatidylinositol-3(-PI3)-Kinase-Kaskade [62]

Sie sind nicht streng isoliert zu betrachten, da sie sich untereinander beeinflussen. Ihre

Interaktionen sind noch nicht vollständig bekannt und Gegenstand aktueller Forschung.

Insbesondere die PI3-Kinase-Kaskade spielt für die Vermittlung metabolischer Effekte

durch Insulin die Hauptrolle.

Die Autophosphorylierung des Insulinrezeptors (IR) an Tyrosinresten ist Voraussetzung für

die weitere Interaktion mit den IR-Substraten (IRS 1-4), die als Andockstellen für weitere

Adaptorproteine mit Phospho-Tyrosin bindenden Domänen (SH2-Domänen) dienen.

Dabei sind insbesondere IRS 1 und IRS 2 wichtig für die Vermittlung des Insulineffekts. IRS

1 ist die vorherrschende Isoform in Muskelzellen, während IRS 2 hauptsächlich in

Hepatozyten vorkommt. IRS 3 (Adipozyten) und IRS 4 (Nervenzellen) spielen eine

untergeordnete Rolle [62]. An den Insulinrezeptor gebundenes IRS wird durch die

Tyrosinkinase-Aktivität des Insulinrezeptors ebenfalls an Tyrosinresten phosphoryliert.

Hierbei sind die Phosphorylierungen an Tyrosin 608 und 628 des IRS von besonderer

Bedeutung [16]. Über diese Phosphorylierungen interagiert IRS mit der regulatorischen

Untereinheit (p85) der PI3-Kinase. Die so an die Zellmembran rekrutierte PI3-Kinase

phosphoryliert mit der katalytischen Untereinheit p110 das Phospholipid

Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) zu Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphat

(PIP3) [56]. An PIP3 kann die phosphoinositide-dependent kinase 1 und 2 (PDK 1, 2)

binden und wird dadurch aktiviert. PDK 1 und 2 aktivieren die Proteinkinase B (PKB/Akt)

durch Phosphorylierung an Serin 473 und Threonin 308 sowie atypische Formen der

Proteinkinase C (PKCζ/λ). PKB und Akt sind Synonyme und beschreiben dasselbe Enzym.

Diese Prozesse finden an der Zellmembran statt. Die aktivierte PKB löst sich von der

Zellmembran und vermittelt intrazelluläre Effekte im Cytosol und im Zellkern [29]. PKB ist

eine Proteinkinase, die wiederum eine Reihe von Proteinen phosphoryliert. Es sind 3

Isoformen der PKB bekannt (PKBα, β, γ), wovon die PKBβ den bedeutendsten Effekt für

21

die Insulinsignaltransduktion zu haben scheint. PKBα wird in Eukaryoten ubiquitär

exprimiert, ebenso PKBγ, aber in geringerem Ausmaß. PKBβ wird vor allem in Insulin-

sensiblen Geweben exprimiert [4, 32]. PKB vermittelt die Effekte von Insulin auf

Glukosetransport, Glykogensynthese, Proteinsynthese, Lipogenese, Suppression der

hepatischen Glukoseproduktion und Genexpression [2]. Direkte Substrate der PKB sind u.

a. die Gruppe der FoxO-Transkriptionsfaktoren und die Glykogen-Synthase-Kinase3

(GSK3) [6]. Weiterhin wird der Einbau von Glukosetransporter Typ 4 (GLUT4) in die

Zellmembran durch die aktive PI3-Kinase über AS160 und PRAS 40 vermittelt. Auch die

Aktivität glukoneogenetischer Schlüsselenzyme, wie der Glukose-6-Phosphatase (G6Pase)

und der Phosphoenolpyruvatcarboxykinase (PEPCK), werden über den PI3-Kinase-Zweig

der Insulinsignaltransduktion beeinflusst [7]. Die G6Pase stellt dabei ein Schlüsselenzym

dar. Sie katalysiert den letzten Schritt der Glukoneogenese. Dabei wird Glukose-6-

Phosphat zu freier Glukose, die aus der Zelle in die Blutbahn exportiert werden kann. Die

G6Pase ist im endoplasmatischen Retikulum in Zellen aller Organe, die Glukoneogenese

betreiben können, vorhanden, also in der Leber, der Nierenrinde und im

Dünndarmepithel. PKB reguliert teilweise über Genexpression die Aktivität der G6Pase.

Der Promotor der G6Pase enthält eine „insulin-responsive sequence“, an der FoxO-

Transkriptionsfaktoren binden und die G6Pase-Expression ermöglichen. Insulin bewirkt

über PKB eine Phosphorylierung von FoxO. Die FoxO-Transkriptionsfaktoren können im

phosphorylierten Zustand nicht am G6Pase-Promotor binden und werden aus dem

Zellkern exportiert. Durch Insulin wird G6Pase reprimiert, während sie bei Abwesenheit

von Insulin exprimiert wird [5].

Dieser Zusammenhang erklärt einen wichtigen Teil der erhöhten Blutzuckerspiegel bei

Patienten mit Diabetes. Durch einen absoluten oder relativen Mangel an Insulin wird das

zelluläre Glukose-6-Phosphat verstärkt hydrolysiert. Glukose kann so nicht mehr in den

Zellen zurückgehalten werden. Glukoneogenese findet statt, obwohl ein vorhandenes

Überangebot an Glukose besteht.

Die Terminierung des Insulinsignals wird u. a. durch spezifische Phosphatasen erreicht.

Bekannt ist die Protein-Tyrosin-Phosphatase 1B (PTP1B), die die Tyrosin-Phosphorylierung

am Insulinrezeptor aufhebt. Weiterhin bekannt sind phosphatase and tensin homologue

22

(PTEN) und SH2-domain containing inositol 5-phosphatase 2 (SHIP2), welche die

Lipidprodukte der PI3-Kinase dephosphorylieren und dadurch das Signal terminieren [11].

Eine weitere Möglichkeit der Beendigung des Insulinsignals stellt die Serin-

Phosphorylierung an IRS1 durch PKB, JNK, ERK, PKC und mTOR dar. Dadurch wird IRS zu

einem schlechteren Substrat für den Insulinrezeptor mit folgender Abnahme des

Insulineffekts [16]. Allerdings wurden auch Serin-Phosphorylierungen IRS1 beschrieben,

die aktivierend auf den Insulinsignaltransduktionsweg wirken, wie z. B.: Phospho-Serin

318 [60].

Es gibt Wirkstoffe, mit denen sich spezifisch einzelne Elemente der PI3-Kinase-Kaskade

hemmen oder aktivieren lassen. Hiervon wurden in der vorliegenden Arbeit die Agenzien

Insulin, Wortmannin und LY294002 verwendet.

Wortmannin hemmt die PI3-Kinase kovalent und irreversibel. LY294002 hemmt die PI3-

Kinase reversibel [4].

Abb. 2: Insulinsignaltransduktion. Dargestellt sind die entscheidenden Stationen der Insulinrezeptorkaskade und bekannte Terminierungsmöglichkeiten des Insulinsignals. Wichtigste Stationen der Kaskade sind der Insulinrezeptor, die PI3-Kinase und Akt/PKB.

23

1.4 Crosstalk zwischen AMPK und der Insulinsignaltransduktion

Die Insulinsignaltransduktion wird aktiviert, wenn Nährstoffe, insbesondere Glukose, die

Insulinsekretion stimulieren. Insulin steht folglich für eine anabole Stoffwechsellage. Der

AMPK-Signalweg wird aktiviert, wenn eine katabole Stoffwechsellage vorliegt,

Kohlenhydratreserven verbraucht werden und der zelluläre Energielevel in Form von ATP

aufrechterhalten werden muss. Dabei werden durch die AMPK ATP-verbrauchende

Stoffwechselwege blockiert, während ATP-erzeugende Stoffwechselwege aktiviert

werden. Man neigt dazu zu vermuten, dass beide Wege sich entgegenstehen. Dies ist

aber nur teilweise der Fall. Es ergeben sich teils gleichgerichtete, teils gegensinnige

Effekte.

Gegenseitige Beeinflussung der Signalwege besteht auf verschiedenen Ebenen. Dies

betrifft insbesondere die Synthese von Proteinen, Glykogen, Cholesterin, Fetten und die

Zellproliferation. AMPK bewirkt eine Minderung aller Synthesevorgänge und der

Zellproliferation, während Insulin diese begünstigt.

Gleichgerichtete Effekte sind zu beobachten in der Regulation des Blutzuckerspiegels.

Beide Signalwege bewirken eine Senkung des Blutzuckers, fördern die Glukoseaufnahme

durch GLUT4 und hemmen die hepatische Glukoneogenese. Die Hemmung der

hepatischen Glukoneogenese bewirkt sowohl durch AMPK als auch durch den

Insulinsignaltransduktionsweg eine verminderte Expression der Glukose-6-Phosphatase.

AMPK und Insulin haben zwei verschiedene Signalwege, die oberhalb des Glukose-6-

Phosphatase-Promotors ineinander fließen [34]. Der FoxO-Transkriptionsfaktor FKHR

(auch FoxO1a) wurde als Bindeglied dieser beiden Signalwege beschrieben. Dabei wird

die G6Pase durch Transaktivierung durch FKHR exprimiert [5]. Insulin bewirkt über

PKB/Akt eine Phoshporylierung von FKHR an Threonin 24, Serin 256 und Serin 319. Hieran

bindet das Protein 14-3-3, welches FKHR aus dem Zellkern exportiert und die

Transaktivierung der G6Pase vermindert. Auch AMPK bewirkt einen Export von FKHR aus

dem Zellkern mit konsekutiver Minderung der G6Pase-Transaktivierung. Allerdings ist

nicht bekannt, wie AMPK FKHR modifiziert, damit es zu den beschriebenen Prozessen

kommt. Sicher ist, dass es sich dabei nicht um Phosphorylierungen an Threonin 24, Serin

256 und Serin 319 handelt [3, 5, 6].

24

Auch andere Mechanismen zur gegenseitigen Beeinflussung zwischen AMPK und

Insulinsignaltransduktionsweg wurden beschrieben. Beispielsweise, dass Insulin über eine

Phosphorylierung durch PKB an Serin 485 und 491 der AMPK deren Aktivierung durch

Phospho-Threonin 172 in einigen Geweben antagonisiert [24]. Oder auch eine AMPK-

abhängige Verstärkung des Insulinsignals, die durch eine Phosphorylierung von IRS an

Serin 789 durch die aktivierte AMPK vermittelt wird [16]. Ein ähnlicher Effekt wird auch

bei körperlichem Training beobachtet: Training aktiviert die AMPK, welche den mTOR-

Singalweg des Insulinrezeptors hemmt. mTOR phosphoryliert IRS an verschiedenen

Serinresten, welche hemmend auf den Insulin-Signaltransduktionsweg wirken. Diese

Hemmung entfällt und das Insulinsignal wird verstärkt [13].

Diese teils unterschiedlichen, teils gleichen Wirkungen und Beziehungen zueinander

lassen auf eine komplexe, gewebespezifische Interaktion der beiden Wege untereinander

schließen. Die Mechanismen, die zur gegenseitigen Beeinflussung führen, sind nicht

vollständig aufgeklärt und Gegenstand intensiver Forschung.

Abb. 3: Crosstalk zwischen AMPK und Insulinsignaltransduktion: Der FoxO-Transkriptionsfaktor FKHR stellt das Bindeglied zum Glukose-6-Phophatase-Promotor der beiden Signalwege von AMPK und Insulinsignaltransduktion dar.

25

2. Arbeitshypothese und Fragestellung

Ziel der Arbeit ist es, mehr über den blutzuckersenkenden Effekt von Metformin auf die

hepatische Glukoneogenese zu erfahren. Hypothese ist dabei, dass Metformin über einen

AMPK-abhängigen Effekt Anschluss an die Insulinsignaltransduktion haben und so die

Glukose-6-Phosphatase auf Promotorebene beeinflussen könnte.

Die spezielle Fragestellung lautet daher:

Hat Metformin einen sich vom Insulin unterscheidenden Effekt auf die

Promotorebene der Glukose-6-Phosphatase und wird dieser Effekt durch AMPK

vermittelt?

Nutzt Metformin Schritte der Insulinsignaltransduktion zur Beeinflussung der

Glukose-6-Phosphatase auf Promotorebene?

Die Untersuchungen werden in einem Zellmodell mit H4-Rattenhepatomzellen

durchgeführt.

26

3 Material und Methoden

3.1 Zellbiologische Methoden

3.1.1 Zelllinien

Es wurden folgende Zelllinien verwendet:

H4 II E (ATCC#: CRL-1548)

Rattenhepatomzellen (Rattus norvegicus), adhärent wachsend, Monolayer mit kleinen

Aggregaten

H4 M 1.3

Transgene Rattenhepatomzellen (Rattus norvegicus) mit einem G6Pase

Promotorkonstrukt mit dem Leuchtkäfer-Luciferase-Gen.

Bei Aktivierung der G6Pase durch entsprechende Agonisten, kommt es zur

zeitgleichen Expression von Luciferase. Adhärent wachsend, Monolayer mit kleinen

Aggregaten.

Die Zelllinien wurden ausschließlich in Zellkulturflaschen der Firma TPP (Trasadingen,

Schweiz) mit einer Wachstumsfläche von 150cm² in einem Inkubator mit

wasserdampfgesättigter Atmosphäre, bei 37°C und 5,0% CO2, kultiviert.

3.1.2 Zellkulturmedien

Serumhaltiges Medium:

500ml Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) high Glucose (PAA Laboratories;

Pasching, Österreich )

mit L-Glutamin (584mg/l),

mit Natriumpyruvat (110mg/l)

50ml FCS (HyClone Fetal Bovine Serum; Fa. Perbio, Aalst, Belgien)

5ml Penicillin (EK: 100 U/ml) und Streptomycin (EK: 100 mg/l) als 100-faches

Konzentrat (Biochrom, Berlin)

27

Unter sterilen Kautelen wurden die Materialien vermischt und anschließend über ein

Vakuum-Filtersystem (Membrantyp: PES 0,22µm) der Firma TPP (Trasadingen, Schweiz)

sterilfiltriert.

Serumfreies Medium:

485ml Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)high Glucose (PAA Laboratories;

Pasching, Österreich )

mit L-Glutamin (584mg/l),

mit Natriumpyruvat (110mg/l)

5ml Penicillin (EK: 100 U/ml) und Streptomycin (EK: 100 mg/l) als 100-faches

Konzentrat (Biochrom, Berlin)

0,01 mg/ml Rinderalbumin (BSA)

5ml 1M HEPES (EK: 10mM)

Unter sterilen Kautelen wurden die Materialien vermischt und anschließend über ein

Vakuum-Filtersystem (Membrantyp: PES 0,22µm) der Firma TPP (Trasadingen, Schweiz)

sterilfiltriert.

3.1.3 Subkultivierung

Materialien:

Dulbecco´s PBS ohne Ca & Mg (PAA; Pasching, Österreich )

Trypsin-EDTA (PAA; Pasching, Österreich )

Serumhaltiges Medium

Sterile Zentrifugationsröhrchen

Bei ca. 90%iger Konfluenz wurden die Zellen im Verhältnis 1:10 subkultiviert oder für

Versuche verwendet. Das Medium wurde abgesaugt und die Zellen mit D-PBS gewaschen.

Anschließend wurden sie mit 5ml 1x Trypsin/EDTA für wenige Minuten im Kulturschrank

abgelöst. Das Trypsin wurde anschließend mit 10ml frischem serumhaltigen Medium

deaktiviert. Die Zellsuspension wurde für 5 Minuten bei 23°C und 410x g zentrifugiert.

Der Überstand wurde verworfen, die Zellen in 10 ml frischem Medium resuspendiert und

in frische Zellkulturflaschen bzw. andere Reaktionsgefäße ausgesät.

28

3.1.4 Zellen einfrieren / auftauen

Materialien:

D-PBS ohne Ca2+ & Mg2+

Einfriermedium (10% DMSO in FCS)

Sterile 50ml Falcon-Zentrifugationsröhrchen

Sterile Kryorörchen

Zur längerfristiger Einlagerung von Zellen wurden diese wie oben beschrieben

abtrypsiniert, mit serumhaltigen Medium verdünnt und anschließend für 5 min bei 23°C

und 410x g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Pellet in Einfriermedium

resuspendiert und anschließend in Kryoröhrchen aliquotiert. Um eine schonende

Abkühlung zu ermöglichen, erhielten die Kryoröhrchen eine Zellstoffpapierumwickelung.

Sie wurden bei -80°C gelagert. Zur Reaktivierung der Zellen wurden sie bei

Raumtemperatur aufgetaut und anschließend in serumhaltigem Medium suspendiert,

pelletiert und in Kulturmedium ausgesät.

3.1.5 Zellstimulation

Materialien:

6-Well Zellkultur-Testplatten; 9,03 cm² Wachstumsfläche je Vertiefung (TPP; Trasadingen,

Schweiz)

D-PBS ohne Ca2+ & Mg2+

Serumfreies Medium

Die Medien wurden vom 6-Well entfernt, dieses anschließend 3x mit vorgewärmtem D-

PBS gespült und daraufhin das Versuchsmedium zugegeben. Vor einer

Stimulation/Präinkubation wurden die Zellen 2 Stunden in je 2 ml/Well mit serumfreien

Medium behandelt, um die durch im Serum enthaltene Wachstumsfaktoren verursachte

basale Phosphorylierung der an der Signaltransduktion beteiligten Proteine möglichst

gering zu halten. Das serumfreie Nährmedium wurde entfernt und anschließend das

Stimulationsmedium hinzugegeben. Stimulationszeit und Präinkubationszeit variierten je

nach Versuch.

29

3.2 Proteinchemische Arbeitstechniken

3.2.1 Proteinbestimmung - BCA Protein Assay

Der BCA Protein Assay Kit der Firma Pierce dient der Quantifizierung von

Proteinkonzentrationen in Lösungen mittels Biuret-Reaktion. Proteine reagieren mit Cu2+

Ionen in alkalischer Lösung, dabei entstehen Cu+ Ionen. Diese bilden mit Bicinchinonsäure

(BCA) einen violetten Fabrkomplex, der in seiner Extinktion proportional zur vorhandenen

Menge Protein ist. Dabei wird die Menge Protein relativ zu einer BSA-Eichkurve ermittelt.

Materialien:

BCA Protein Assay (Pierce; Rockford, Illinois, USA)

96-Well Mikrotiterplatte

BSA-Standardreihe

Zellysat

Proteinmengenstandard: Verdünnungsreihe von BSA in Lysepuffer. BSA (100mg/ml)

wurde dazu im entsprechenden Lysepuffer des Zellysates schrittweise auf

unterschiedliche Konzentrationen verdünnt (i.d.R. 0-10000µg/ml). Bei der Wahl des

Lysepuffers wurde darauf geachtet, dass er keine mit dem BCA Assay interferierende

Substanzen enthielt.

5µl Zellysat bzw. Proteinstandard wurden in einer Mikrotiterplatte vorgelegt und mit

100µl einer Reaktionslösung aus BCA Reagent A und B (Mischverhältnis 50:1) versetzt. Ein

Well wurde nur mit 100µl Reaktionslösung befüllt, um einen Leerwert zu erhalten.

Anschließend wurde die Mirkotiterplatte bei 37°C für ca. 60 Minuten inkubiert.

Die Extinktion wurde mit einem Mikroplattenphotometer bei einer Wellenlänge von

562nm gemessen. Aus den Standardwerten wurde eine lineare Eichkurve interpoliert,

anhand derer die Proteinkonzentrationen der Proben ermittelt wurde.

3.2.2 Promotoraktivitätsbestimmung - Luciferase Assay System

Das Luciferase Assay System der Firma Promega ist ein Reportergen-Assay. Der

Promoterregion eines spezifischen Gens, in der vorliegenden Arbeit Glucose-6-

30

Phosphatase, ist die firefly luciferase nachgeschaltet und wird bei Aktivierung des Zielgens

mit exprimiert. Die Luciferase katalysiert eine biolumineszente Reaktion bei

Substratzugabe. Dadurch kann die Promotoraktivität als Lichtemission nachgewiesen und

mit einem Luminometer quantifiziert werden.

Materialien:

H4 M1.3 Zellen

Luciferase Assay System (Fa. Promega, Mannheim)

Luminometer Berthold MiniLuminat LB 9605 (Berthold Technologies, Bad Wildbad)

3,5ml Reaktionsgefäße 55x12mm (Sarstedt, Nümbrecht)

1,5ml Reaktionsgefäße

Vor Versuchsdurchführung wurden Lysepuffer und Luciferase Assay Reagent gemäß

Herstellerangaben angesetzt. Alle für das Luciferase Assay System lysierten Zellen wurden

zuvor 12 Stunden lang mit Agenzien in 6-Wells stimuliert. Anschließend wurde das

Medium entfernt und die Wells mit gekühltem D-PBS 3x gespült. Anschließend wurden

200µl Lysepuffer in die Wells gegeben und die Zellen mit einem Zellschaber abgekratzt.

Das Lysat wurde in 1,5ml Reaktionsgefäße überführt und 1min bei 4°C und 20780x g

zentrifugiert. Der Überstand wurde in frische Reaktionsgefäße überführt und

weiterbehandelt. Aus dem Überstand wurden für die Versuche zur Dosisabhängigkeit der

Wirkung von Metformin und Insulin 5µl Lysat entnommen und mit 25µl Luciferase-

Reagent (LAR) (Verhältnis 1:6) ca. 20 Sekunden in 3,5ml Reaktionsgefäßen für die

luminometrische Messung vermischt. Innerhalb einer Minute wurde die Messung

durchgeführt. Für alle anderen Reportergen-Assays wurden 10µl Lysat und 50µl LAR

verwendet. Die ermittelten relative light units (RLU) wurden anschließend auf die

Proteinmenge normiert.

3.2.3 Polyacrylamidgelelektrophorese / Western Blot

Als Western Blot bezeichnet man die Übertragung und den Nachweis von Proteinen auf

einer Trägermembran. Anschließend werden Zielproteine durch spezifische primäre und

sekundäre Antikörper mittels Peroxidasereaktion nachgewiesen. Vor dem eigentlichen

Blot müssen die zu untersuchenden Proteinlösungen durch eine

31

Polyacrylamidgelelektrophorese entsprechend Größe, Ladung oder anderer Eigenschaften

der Proteine aufgetrennt werden.

Materialien:

Polyklonale Antikörper, proteinspezifisch

Polyklonale Anti-IgG, Peroxidase gekoppelt (DakoCytomation; Glostrup, Dänemark)

NT-BPF (50mM Natriumchlorid,

50mM Tris-base,

50mM Natrium-pyrophosphat,

100mM Natrium-fluorid,

0,1% (m/v) Natrium-Methylhydroxybenzoat,

0,5% (m/v) BSA,

0,05% (m/v) Triton-X 100 pH 7,4

CL-XPosure Film Clear Blue X-Ray Film (Pierce; Rockford, Illinois, USA)

Pierce ECL Western Blotting Substrate (Pierce; Rockford, Illinois, USA)

Zellysat (Proteinmenge vorher mittels BCA Assay quantifiziert)

Roati-Load 1 4x (Roth, Karlsruhe)

Tris-Tricin Electrophoresis Anode Buffer

(24,22g Tris-Base in 800ml H2O,

pH-Einstellung auf 8,9 mit konz. HCl,

mit dest. Wasser ad 1L)

Tris-Tricin Electrophoresis Cathode Buffer

(12,11gr. Tris-Base,

17,92gr. Tricin,

1gr. Natriumdodecylsulfat

mit H2O auf 1L auffüllen)

Massenstandard: PageRuler prestained Protein ladder plus (Fermentas, St. Leon-Rot)

Gel:

dest. Wasser

Tris-Tricin Electrophoresis Gel Buffer

32

(363,4gr. Tris-Base in 500ml H2O,


3,0gr. Natriumdodecylsulfat,

mit H2O auf 1L auffüllen)

30% (m/v) Bisacrylamid Rotiphorese Gel 30 (37,5:1) (Roth, Karlsruhe)

10% (m/v) Ammonium Persulfat (APS)

TEMED

0,5% Bromphenolblau

Isobutanol

Blot:

Nitrocellulose Transfer Membrane (Whatman, Dassel)

Rotilabo-Blottingpapier 1,5mm (Roth, Karlsruhe)

SemiDry Transfer Buffer (48mM Tris-Base,

39mM Gylcin,

0,04% (m/v) Natriumdodecylsulfat in H2O,

40% (v/v) Methanol)

Verwendete Antikörper:

Primär: Phospho-Akt (Serin 473), cell Signaling #4058s

Akt Antibody, cell Signaling #9272

Phospho-AMPKα (Threonin 172), cell Signaling #2531s

AMPKα Antibody, cell Signaling #2532

Phospho-GSK3α/β (Serin 21/9), cell Signaling #9331s

GSK3β Antibody, cell Signaling #9315

Sekundär: Polyclonal goat anti mouse Immunglobulins/HRP, DakoCytomation

P0447

Polyclonal goat anti rabbit Immunglobulins/HRP, DakoCytomation

P0448

Polyclonal rabbit anti goat Immunglobulins/HRP, DakoCytomation

P0449

33

Zelllysate wurden auf ein Polyacrylamidgel aufgetragen und durch das Anlegen einer

elektrischen Spannung (Feldstärke: 5 V/cm) aufgetrennt. Es besitzt zwei Phasen, wobei

die untere Phase ein hochprozentiges Trenngel ist und die obere Phase ein

niederprozentiges Sammelgel. Dadurch werden sehr scharfe Proteinbanden erzielt.

Die Gele hatten eine Größe von 7cm x 9cm bei einer Dicke von 1,5mm. In der

vorliegenden Arbeit wurden ausschließlich 10%ige Tris-Tricin Trenngele verwendet. Die

Stammlösung für die 10% Trenngele wurde folgendermaßen angesetzt: 6,7ml dest. H2O;

6,7ml Gel-Puffer ; 6,7ml 30% Acrylamid.

Die Polymerisation wurde durch die Zugabe von 66,7µl 10% APS und 50µl TEMED

gestartet. Die Mischung wurde sofort in eine vorbereitete Gießform überführt. Um einen

blasenfreien scharfen Abschluss des Trenngels zu erhalten, wurden noch vor der

Auspolymerisation 200µl Isopropanol auf das Gel gegeben. Nach Polymerisation des

Trenngels wurde der Isopropanolüberstand entfernt.

Die Stocklösung für die Sammelgele wurde folgendermaßen angesetzt: 12,5ml dest. H2O;

5ml Gel-Puffer ; 2,5ml 30% Acrylamid; 1 Tropfen Bromphenolblau-Lösung. Die

Polymerisation wurde mit 100µl 10% APS und 80µl TEMED gestartet. Das Sammelgel

wurde auf das Trenngel geben. Noch vor Auspolymerisation wurde der Kunststoffkamm

(Breite: 1,5mm, 10 Spuren) eingepasst. Nach der Polymerisation wurde er vorsichtig

entfernt. Es wurden in den so erhaltenen Taschen des Gels 40µg Protein aufgetragen. Das

benötigte Volumen wurde zuvor durch die Proteinquantifizierung mittels BCA-Assay

ermittelt. Dem Volumen wurde Laemmli-Puffer (4x Roati-Load; Verhältnis Lysat : Roati-

Load; 3:1) zugegeben, vermischt und für 7,5 min. auf 99°C erhitzt, um eine vollständige

Denaturierung der Proteine zu erreichen . Das Gel wurde mit den Proben und einem

Proteinmarker (PageRuler, 2µl) zum Größenvergleich beladen. Zur Elektrophorese wurde

eine elektrische Feldstärke von 2 bis 5 V/cm angelegt, die Kathode war auf der Seite des

Sammelgels angeschlossen. Die Elektrophorese wurde beendet, sobald die Bande aus

Bromphenolblau die Unterkante des Gels erreicht hatte.

Die Proben wurden nach der Auftrennung elektrophoretisch auf eine

Nitrozellulosemembran übertragen. Das Sammelgel wurde dazu entfernt, das Trenngel

mit wenig dest. Wasser gewaschen und in einer semi-dry-Apparatur zwischen zwei Lagen

Rotilabo-Blottingpapier von je 1,5 mm auf ein Nitrozelluloseblatt von 0,2 μm Porendicke

übertragen. Die Nitrozellulosemembran befand sich dabei zwischen Gel und Anode,

34

Nitrozellulose und Filterpapiere wurden vor dem Zusammenbau der Transferapparatur

mit SemiDry Transfer Buffer getränkt. Die Übertragung wurde bei einer Stromdichte von

0,8 mA/cm2 durchgeführt und dauerte zwei Stunden. Nach dem Transfer wurde die

Membran mit Ponceau S gefärbt, um den Transfer zu kontrollieren. Daraufhin wurde die

Membran für 15 Minuten bei Raumtemperatur in NT-BPF inkubiert, um freie

Bindungsstellen auf der Membran mit BSA zu blockieren. Das Gel wurde Coomassie

gefärbt, um die Vollständigkeit der Gelelektrophorese zu kontrollieren.

Die Membran wurde nach dem Blocken über Nacht bei 4°C im primären Antikörper

(Verdünnung nach Herstellerangaben in NT-BPF) geschwenkt. Es schloss sich ein

dreimaliges Waschen für 10 Minuten bei Raumtemperatur der Membran in NT-BPF an.

Anschließend wurde die Membran in den am FC-Fragment Peroxidase-gekoppelten Anti-

IgG sekundären Antikörper (1:5000 bzw. 1:10000 in NT-BPF) für 1 Stunde inkubiert und

danach wieder 3 mal für je 10 Minuten in NT-BPF gewaschen.

In der Dunkelkammer wurde das Chemielumineszenzbild erstellt. Dazu wurden die Pierce

ECL Western Blotting Substrate A+B 1:1 miteinander vermischt und die Membran für 2

Minuten darin inkubiert. Die noch feuchte Membran wurde anschließend in eine

Klarsichtfolie verpackt und zusammen mit einem Röntgenfilm in einer Filmkassette

verschlossen. Die Belichtungszeit betrug immer zuerst 2 Minuten. Der Film wurde

unmittelbar nach der Exposition in einer Filmentwicklungsmaschine(AGFA Curix 60)

automatisch entwickelt. Dem Ergebnis dieser ersten Belichtung wurde die Belichtungszeit

der folgenden Expositionen angepasst (maximal 2 Stunden, minimal 10 Sekunden), um

ein optimal auswertbares Bild zu erhalten. Die Schwärzung des Films gibt die Stellen an

der Membran an, an der sich das untersuchte Protein befindet.

3.2.4 Erneutes Beproben (Re-Blot)

Materialen:

Stripping-Buffer (8gr. Tris-Base,

20gr. Natriumdodecylsulfat in 500ml H2O,


mit H2O auf 1L auffüllen;

vor gebrauch 0,5% v/v β-Mercaptoethanol zugeben)

Nitrocellulosemembran (bereits geblottet und mit AK benetzt)

35

NT-BPF

Polyklonale Antikörper, proteinspezifisch

Primäre und sekundäre Antikörper kann man von einer Membran durch Strippen wieder

entfernen. Dazu wird die Membran für 10 Minuten mit Stripping-Buffer behandelt.

Anschließend wurde erneut in NT-BPF geblockt. Das weitere Vorgehen entspricht der

Anleitung zum Western Blot.

Zu allen Western-Blots, die ein phosphoryliertes Protein nachgewiesen haben, wurde das

Gesamtprotein im Re-Blot bestimmt. Die Phospho-Antikörper wurden mittels Stripping-

Buffer von der Membran gelöst und nach Blockung in einen proteinspezifischen primären

Total-Antikörper inkubiert.

3.2.5 Coomassie – Färbung

Materialien:

Polyacrylamidgel, nach abgelaufener Gelelektrophorese und Blot

Färbelösung:

0,1% (m/v) Coomassie Blau R-250

45% (v/v) Methanol oder vergälltes Ethanol

10% (v/v) Eisessig

Rest dest. Wasser auf 1l

Entfärber:

10% (v/v) Methanol oder vergälltes Ethanol

10% (v/v) Eisessig

Rest dest. Wasser auf 1l

Coomassie Blue ist ein Farbstoff, der an Proteine bindet und daher zur Kontrolle der

Gelelektrophorese genutzt wird. Das Gel wird dazu für einige Minuten in Coomassie-

Lösung inkubiert. Der Farbstoff lagert sich an basische und aromatische Seitenketten von

Aminosäuren an und färbt so die Proteine. Allerdings färbt der Farbstoff zunächst das

gesamte Gel ein. Das eingefärbte Gel wird solange in Entfärberlösung geschwenkt bis die

36

Färbung nur noch an den Proteinen zu sehen ist. Die Färbung dient zur Kontrolle der

elektrophoretischen Auftrennung der Proteine nach dem Transfer auf die

Nitrozellulosemembran. Reste der Proteine befinden sich im Gel.

3.2.6 Ponceau – Färbung

Materialien:

Nitrocellulose-Membran, bereits geblottet, ungeblockt

Ponceau S – Färbelösung (0,5g Ponceau S 0,1%,

500ml 5% Essigsäure)

Die Ponceau-Färbung wird verwendet, um Proteine unspezifisch auf

Nitrocellulosemembranen anzufärben und damit den Transfer der Proteine vom

Polyacrylamidgel auf die Membran zu überprüfen. Dazu wird die ungeblockte, geblottete

Membran in Ponceau-Lösung geschwenkt. Die Proteine werden angefärbt und zeigen

damit den Transfer an. Die eingefärbte Membran kann direkt in NT-BPF zum Blocken

unspezifischer Bindungsstellen gegeben werden. Der Farbstoff wird dabei von im

Überschuss vorliegendem BSA absorbiert.

3.2.7 ELISA

ELISA bedeutet Enzyme-linked Immunosorbent Assay. Der ELISA dient dazu, Antigene mit

einer spezifischen Antigen-Antikörper-Reaktion nachzuweisen. Mit einem

enzymgekoppelten Antikörper quantifiziert man durch eine Farbreaktion die Menge des

vorhandenen Antigens.

In der vorliegenden Arbeit wurde auf Prinzip des Double-Antibody-Sandwich-ELISA

zurückgegriffen. Auf dem Boden einer 96-Well-Mikrotiterplatte sind bei dieser Methode

antigenspezifische IgG-Antikörper gebunden. Dieser erste Antikörper wird coating-

Antikörper genannt. Die zu analysierende Lösung wurde in ein Well gegeben und

verbleibt einige Zeit darin damit das Antigen an den coating-Antikörper binden kann.

Nach einem Waschvorgang wird der zweite IgG-Antikörper, ebenfalls proteinspezifisch, in

das Well gegeben. Nach erneutem Waschen wird der Detektions-Antikörper, ein Anti-IgG-

Antikörper mit am FC-Teil gebundener Meerrettichperoxidase (horseredishperoxidase;

37

HRP), in das Well gegeben und wiederum gewaschen. Anschließend wird ein HRP-

Substrat zugegeben, das zu einem farbigen Produkt umgesetzt wird. Dieses wird

photometrisch quantifiziert. Die gemessene Extinktion verhält sich proportional zum

vorhandenen Antigen.

Material:

Akt-Lyse-Puffer (50mM HEPES pH 7,6,

1%v/V Triton x-100,

150mM NaCl,

1mM EDTA,

10%v/v Glycerol,

1mM DTT,

vor Gebrauch 1mM Natriumvanadat und

1mM PMSF hinzugeben)

ELISA Immunoassay Kit (Insulin Rezeptor Tyrosin 1162/1163;

Insulin Rezeptor ß-Subunit;

Akt Serin 473;

Total Akt;

AMPK Threonin 172) (Biorsource; Nivelles, Belgien)

1,5 ml Reaktionsgefäße

Jedem ELISA ging eine Zellstimulation in 6-Wells voraus. Die Stimulationszeit betrug 15

bzw. 30 Minuten. Nach Stimulationsende wurden die H4 II E Zellen 3x mit gekühltem D-

PBS gewaschen und anschließend mit 350µl Akt-Lyse-Puffer für 30 Minuten auf Eis lysiert.

Das Lysat wurde in 1,5ml Reaktionsgefäße überführt und bei 4°C, 20780x g für 10

Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde in neue Reaktionsgefäße überführt, der Rest

verworfen. 10µl der Probe wurden mit 90µl des mitgelieferten „Standard Dilutent Buffer“

verdünnt und anschließend in ein Well der Mirkotiterplatte gegeben. Es schloss sich eine

zweistündige Inkubationszeit bei Raumtemperatur an. Danach wurden die Wells, mit dem

nach Herstellerangaben angesetztem Wasch-Puffer, 4 Mal gespült, um nichtgebundene

Agenzien zu entfernen. Anschließend wurden 100µl der Lösung mit dem 2. Antikörpers in

die Wells gegeben. Nach einer einstündigen Inkubationszeit schloss sich erneut ein

38

viermaliger Waschvorgang an bevor 100µl des detection-Antikörpers für 30 Minuten bei

Raumtemperatur hinzugegeben wurden. Anschließend wurde wieder mit Wasch-Puffer 4

mal gespült. 100µl des mitgelieferten Chromogen-Lösung wurde daraufhin in die Wells

gegeben und für 25 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Anschließend

wurde die Reaktion mit 100µl aus der mitgelieferten „Stop Solution“ beendet und der

entstandene gelbe Farbstoff sofort im Photometer bei 450nm gemessen.

Dem Phospo-ELISA schloss sich immer ein Total-ELISA (außer AMPK Threonin 172) an, um

die Menge Phospho-Protein die Proteingesamtmenge normalisieren zu können. Lediglich

beim AMPK Threonin 172 ELISA wurde auf die Gesamtproteinmenge, mittels BCA Assay

ermittelt, normalisiert, da kein ELISA zur Quantifizierung verfügbar war. Sowohl im

Phospho-ELISA, als auch im Total-ELISA wurden die Signale auf einen im Kit enthaltenen

Massenstandard normiert.

3.2.8 Apoptosedetektion -TUNEL Assay

TUNEL steht für „terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)-mediated 2’-deoxyuridine

5’-triphosphate-biotin nick end labeling“. Ziel dieser Methode ist es, apoptotische Zellen

über DNA-Fragmentation zu detektieren.

Nach Einwirken von Agenzien auf Zellen und auch physiologisch, tritt Apoptose auf. Eine

von vielen Veränderungen, die zu beobachten sind, ist die DNA-Fragmentation. Dabei

entstehen freie 3´-OH Enden an DNA-Strangbrüchen. Die TdT transferiert an Doppel- oder

Einzelstrang-DNA mit freien 3´-OH Enden ein Oligomer aus Digoxigenin-Nukleotiden.

DNA-Fragmente, die mit Digoxigenin-Nukleotiden markiert sind, binden in einem zweiten

Schritt an Anti-Digoxigenin-Antikörper, die mit Fluorescein konjugiert sind. Bei Anregung

mit blauem Licht (488nm) emittiert Fluorescein grünes Licht (max. 520nm), die

Strangbrüche können so fluoreszenzmikroskopisch detektiert werden. Die Zellkerne

wurden mit Ethidiumbromid (1:10000) gegengefärbt und die Präparate durch ein

Fluoreszenzmikroskop fotografiert.

Bei der Auswertung wurden auch morphologische Kriterien herangezogen. Besonders die

Abgrenzung zur Nekrose ist dabei wichtig. Eine Schädigung der DNA durch Agenzien wird

nicht identifiziert, solange sie nicht mit Apoptose einhergeht.

39

Materialen:

ApopTag Plus Fluorescein In Situ Apoptosis Detection Kit (Chemicon International;

Billerica,MA, USA )

1% (m/v)Paraformaldehyd in D-PBS

D-PBS

Ethanol (70% v/v) in Essigsäure (Verhältnis 2:1) auf -20°C gekühlt

4 Objektträgerinkubationsgefäß (coplin jar)

Chamber Slides (Nunc; Naperville, IL, USA)

Wasserdampf gesättigte Kammer, 37°C

Ethidiumbromid

Ribonuklease A (AppliChem, Darmstadt)

DNAse 1 (Qiagen, Hilden)

DNBuffer (300µl 1M Tris-Base pH7,2;

80µl 0,5M MgCl2;

10µl 100mM DTT;

mit dest. H2O auf 10ml bringen)

mikroskopische Deckläser

DakoCytomation Flourescent Mounting Medium (DakoCytomation; Glostrup, Dänemark)

Fluoreszenzmikroskop Axioskop 2 Plus (Carl Zeiss MicroImaging, Jena)

2-3 Tage vor dem Versuch wurden H4 II E Zellen auf Chamber Slides mit 4 Kammern

ausplattiert. Es folgte die Inkubation in serumfreiem Medium mit anschließender

Zellstimulation über 12 Stunden. Nach vorsichtigem Absaugen des Mediums und

Abheben der aufgeklebten Kammern wurden die Zellen sofort für 10 Minuten bei

Raumtemperatur in 1% Paraformaldehyd im coplin jar fixiert. Anschließend wurde es 2x

für je 5 Minuten in D-PBS gewaschen. Es schloss sich eine 5 minütige Inkubation in einem

Ethanol-Essigsäure-Gemisch bei -20°C in einem weiterem coplin jar an mit einem

daraufhin folgendem erneutem Waschvorgang in D-PBS für 5 Minuten. 75µl/5cm²

Objektträgerfläche des im Kit mitgelieferten „Equilibration Buffer“ wurde direkt nach

Probenfixierung vorsichtig auf den Objektträger aufgebracht und mit einem

mitgelieferten Plastikdeckel vorsichtig bedeckt. Durch Kapillarkräfte verteilte sich der

„Equilibration Buffer“ gleichmäßig auf dem Objektträger. Die Kontaktzeit betrug 10

Sekunden. Der „Equilibration Buffer“ wurde vorsichtig vom Objektträger entfernt.

40

55µl/5cm² Objektträgerfläche des im Kit mitgelieferten „Working Strenght TdT Enzyme“

wurde nach Herstellerangaben hergestellt angesetzt, auf den Objektträger aufgebracht

und vorsichtig mit einem Plastikdeckel bedeckt. Es schloss sich eine 1 stündige

Inkubationszeit bei 37°C in einer wasserdampfgesättigten Kammer an. In dieser Zeit

werden die freien 3´OH-Enden der DNA mit Oligomeren aus Digoxigenin-Nukleotiden

konjugiert. Der Objektträger wurde daraufhin für 10 Minuten im coplin jar in „Working

Strength Stop/Wash Buffer“ inkubiert und anschließend 3x für je 1 Minute in D-PBS

gewaschen. Flüssigkeiten wurden nun vorsichtig vom Objektträger entfernt und dieser

anschließend mit 123,5µl „Working Strength Anti-Digoxigenin Conjugate“ benetzt. Ein

Plastikdeckel wurde vorsichtig auf den Objektträger aufgebracht und die Probe

anschließend für 30 Minuten bei 37°C im Dunkeln in einer feuchten Kammer inkubiert. Es

folgte 4x eine 2 minütiges Waschen des Objektträgers in D-PBS.

Die Gegenfärbungslösung (10µg EtBr auf 10ml D-PBS + 10mg Ribonuklease A) wurde

aufgetragen und nach 10 Sekunden mit D-PBS gewaschen. Um die

Immunfluoreszenzfärbung samt Gegenfärbung betrachten zu können wurden 2-3 Tropfen

Dako Eindeckmedium auf den Objektträger aufgebracht und dieser anschließend mit

einem Objektträgerglas versehen. Nach Aushärten des Eindeckmediums wurde die Probe

unter einem Fluoreszenzmikroskop bei 40facher Vergrößerung mit einem 490nm

Exzitationsfilter betrachtet (Filter: ex 490nm, en 520nm).

Es wurden je Versuch und Stimulationsbedingung 5 repräsentative Gesichtsfelder nach

Gesamtzellzahl, Apoptoseanzahl und Nekroseanzahl ausgezählt. Als Positivkontrolle

wurden Strangbrüche in H4 Zellen, durch 5µl DNAse1 und 90µl DNBuffer in 500µl D-PBS

mit 4,5% Glucose gelöst, erzeugt. Die Stimulationszeit betrug 12 Stunden.

3.2.9 ATP-Lite luminescence ATP Detection Assay System

ATP ist die universelle Form unmittelbar verfügbarer Energie in allen metabolisch aktiven

Zellen. Es kann als Marker für Zelllebensfähigkeit herangezogen werden. Das „ATP-Lite

luminescence ATP Detection Assay System“ basiert auf einer Lichtemission, die bei der

Reaktion von D-Luciferin mit Luciferase entsteht. Diese Reaktion ist ATP-abhängig.

Luciferase + Mg2+

ATP + D-Luciferin + O2 Oxyluciferin + AMP + PPi + CO2 + Licht

41

In zuvor stimulierten Zellen kann, nach Lyse und Inaktivierung von ATPasen, der ATP-

Gehalt gemessen werden. Durch Zugabe von D-Luciferin und Luciferase wird die oben

beschriebene Reaktion gestartet. Das dabei emittierte Licht wird luminometrisch

gemessen und ist proportional zur ATP-Konzentration im Zelllysat. Das emittierte

Lichtsignal hat eine Halbwertszeit von 5 Stunden. Zur Quantifizierung der vom

Luminometer gemessenen RLU, wird für jeden Versuch eine ATP-Standardkurve mit

definierten ATP-Mengen ermittelt. Durch zusätzliche Quantifizierung der Proteinmenge

im Zelllysat mittels BCA-Assay ist es möglich, die Stoffmenge ATP pro Stoffmenge Protein

anzugeben (nM ATP pro µg Protein). Dadurch wird es möglich einen ATP-

Konzentrationsabfall durch Nekrose und/oder Apoptose, in Zelllysaten zu ermitteln.

Materialien:

ATP-Lite luminescence ATP Detection Assay System (Perkin Elmer, Rodgau-Jügesheim)

Zellkultur-Testplatten 6-Well (Techno Plastic Products; Trasadingen, Schweiz)

Luminometer Berthold MiniLuminat LB 9605 (Berthold Technologies, Bad Wildbad)

3,5ml Reaktionsgefäße 55x12mm (Sarstedt, Nümbrecht)

1,5ml Reaktionsgefäße

D-PBS

Vor dem Versuch wurden H4 II E Zellen auf 6-Wells ausplattiert. Bei konfluentem

Wachstum wurden die Zellen für 12 Stunden mit Metformin, Insulin oder der

Positivkontrolle stimuliert. Nach Stimualtionsende wurden die Zellen mit gekühltem D-

PBS 3x gespült. Anschließend wurden 200µl mitgelieferter Lysepuffer in jedes Well

gegeben und diese dann 5 Minuten auf einen Schüttler gestellt. Der Lysepuffer inaktiviert

durch Anheben des pH-Wertes ATPasen irreversibel. Jedem Well wurden anschließend

400µl D-PBS zugegeben und solange vermischt bis sich eine homogene, pipettierbare

Lösung bildete. 100µl dieser Lösung wurde in 1,5ml Reaktionsgefäße überführt und mit

50µl vorschriftsmäßig angesetzter „Substrate Solution“ versetzt. In diesem Schritt wird D-

Luciferin und Luciferase dem Lysat zugesetzt. Es schloß sich eine 5 minütige

Inkubationszeit in einem Schüttler an. Anschließend wurden die Reaktionsgefäße für 10

Minuten abgedunkelt. Für die anschließende Messung wurden 30µl des Lysates in die

Meßgefäße des Luminometers überführt und die Lichtemission gemessen.

42

Die ATP-Standardkurve wurde gemäß Herstellerangaben mit Konzentrationen von 0M;

10-9M; 10-8M; 10-7M; 10-6M und 10-5M ATP in H2O ermittelt. Auch hier wurden Volumina

von 30µl zur Messung verwendet.

3.3 Molekularbiologische Arbeitstechniken

3.3.1 Gesamt-RNA-Extraktion

Um die Gesamt-RNA einer Zellpopulation zu erhalten, wurde der RNeasy Mini Kit der

Firma Qiagen verwendet. Nach Isolation der RNA wurde diese photometrisch bei 260nm

quantifiziert und mittels einer Agarose-Gelelektrophorese auf Intaktheit überprüft. Es

folgten cDNA Synthese, PCR und real-time PCR.

Materialien:

RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden)

QIAshredder (Qiagen, Hilden)

ß-Mercaptoethanol

100% Ethanol

70% Ethanol

sterile, RNAse/DNAse freie Pipettenspitzen und 1,5 ml Reaktionsgefäße

Vor Beginn der RNA-Isolation wurden Puffer gemäß Herstellerangaben angesetzt. Den

benötigten Aliquots „Buffer RLT“ wurden 10µl ß-Mercaptoethanol je ml Buffer RLT

zugesetzt. Dem „Buffer RPE“ wurde vor Gebrauch das vierfache Volumen an 100%

Ethanol zugegeben.

H4IIE Zellen wurden in 6-Wells ausplattiert und für 4 Stunden mit Agenzien stimuliert.

Nach Stimulationsende wurden sie 3x mit gekühltem D-PBS gespült. 350µl „Buffer RLT“

wurden je Well zur Lyse hinzugegeben. Das Lysat wurde mit einem Zellschaber vom

Boden der Wells abgekratzt und in QIAshredder zur Verminderung der Viskosität

überführt. Die Lysate wurden für 2 Minuten bei Höchstgeschwindigkeit zentrifugiert.

43

Anschließend wurde die „spin column“ verworfen und mit dem homogenisierten Lysat im

Auffangröhrchen weitergearbeitet. Der Menge Lysat wurde das gleiche Volumen 70%

Ethanol zugegeben und gut vermischt, nicht gevortext. Möglichst viel Lysat, jedoch nicht

mehr als 700µl, wurden nun in „RNeasy spin column“ überführt. Für 15 Sekunden wurden

diese bei 9000 x g zentrifugiert. Der Säulendurchlauf wurde verworfen. Die „spin column“

wurde mit 700µl „Buffer RW1“ gewaschen und für 15 Sekunden bei 9000 x g zentrifugiert.

Der Säulendurchlauf wurde verworfen. 500µl „Buffer RPE“ wurden daraufhin in die „spin

column“ gegeben und für 15 Sekunden bei 9000 x g zentrifugiert. Der Durchlauf wurde

ebenfalls verworfen und der Vorgang wiederholt, diesmal wurde 2 min. zentrifugiert, um

die „spin column“-Reste von Ethanol zuverlässig zu entfernen. Das Auffangröhrchen

wurde durch ein frisches ersetzt und die „spin column“ noch einmal für 1 Minute bei

Höchstgeschwindigkeit zentrifugiert. Auch dieses Auffangröhrchen wurde verworfen. Die

„spin column“ wurde anschließend in mitgelieferte RNAse/DNAse freie 1,5ml

Reaktionsgefäße gestellt. 40µl RNAse freies Wasser wurde direkt auf die Membran der

„spin column“ pipettiert, ohne die Membran mit der Pipettenspitze zu berühren. Es

wurde abschließend für 1 Minute bei 9000 x g zentrifugiert. Die aufgereinigte, isolierte

RNA befand sich nun im 1,5ml Reaktionsgefäß, die „spin column“ wurde verworfen und

die RNA bei 260nm photometrisch quantifiziert.Die RNA wurde bei -80°C aufbewahrt.

3.3.2 Photometrische RNA-Quantifizierung

Die mit dem RNeasy Mini Kit extrahierte Gesamt-RNA wurde photometrisch quantifiziert.

Materialien:

UV-geeignete Küvetten aus Polymethylmethacrylat (Roth, Karlsruhe)

RNAse freies Wasser

Sterile, RNAse/DNAse freie Pipettenspitzen

RNA

Spektrophotometer, Eppendorf BioPhotometer 6131

Zuerst wurde der Nullpunkt des Spektrophotometers mit 50µl RNAse freiem Wasser

gesetzt. Anschließend wurde 1µl RNA mit 49µl RNAse freiem Wasser verdünnt und bei

260nm gemessen. Die Abgelesen Konzentration wurde um den Verdünnungsfaktor

44

korrigiert. Zusätzlich wurden die Extinktionen für die Wellenlängen bei 230nm, 280nm,

320nm ausgemessen.

230nm: spiegelt Verunreinigungen mit z.B. Kohlenhydraten, Peptiden, Phenolen oder

aromatischen Verbindungen wider.

260nm: misst RNA, DNA und Oligonukleotide

280nm: misst Proteine

320nm: misst die Trübung der Lösung und andere Störfaktoren

Über die Extinktionen dieser Wellenlängen kann die Reinheit der RNA beurteilt werden.

Der Quotient aus Extinktion bei 260nm und 280nm (260/280) sollte für reine RNA ≥ 1,6

betragen. Proben mit einem Quotienten ≥ 1,6 wurden weiterverwendet.

3.3.3 Agarose-Gelelektrophorese

Die Agarose-Gelektrophorese ist eine Methode, um DNA und RNA ihrer Größe nach

aufzutrennen. Die negativ geladenen Nukleinsäurestränge wandern dabei von der

Kathode (-) in Richtung Anode (+). Kleine Stränge laufen dabei schneller als große Stränge

und werden mit Hilfe eines Basenstandards in ihrer Länge klassifiziert. Die Nukleinsäuren

wurden durch Zugabe von Ethidiumbromid auf einem UV-Leuchttisch über die

Fluoreszenz der Komplexe aus Nukleinsäure und Ethidiumbromid nachgewiesen.

In der vorliegenden Arbeit wurde diese Methode benutzt, um die Intaktheit von

extrahierter RNA zu kontrollieren und um erhaltene PCR-Produkte darzustellen.

Materialien:

SeaKem LE Agarose (Cambrex; Rockland, ME, USA)

TAE (80mM Tris, 2mM EDTA, 40mM Essigsäure in H2O)

Ethidiumbromid

Gel-loading-Buffer (0,25% w/v Bromphenolblau,

0,25% w/v Xylene cyanole FF,

15% Glycerin in TAE)

DNA/RNA

DNAse/RNAse freies Wasser

Größenstandard GeneRuler 1kB DNA Ladder Plus (Fermentas, St. Leon-Rot)

45

1g Agarose wurde in einer Endkonzentration von 1% (m/v) in TAE in einem

Erlenmeyerkolben suspendiert und aufgekocht bis eine klare Lösung entstand.

Anschließend wurden der Lösung 5µg EtBr zugegeben. Nach kurzem Abkühlen wurde die

Lösung in einen Gelträger gegossen und ein Plexiglas-Ladekamm eingesteckt. Das Gel

härtete bei Raumtemperatur aus. Anschließend wurde der Kamm entfernt und die

Proben aufgetragen. Die Proben enthielten 5µl Gel-loading-Buffer, 5µl DNAse/RNAse

freies Wasser und 5µl der zu untersuchenden Probe. Die angefärbten DNA/RNA Banden

wurden mit UV-Licht sichtbar gemacht und fotografiert.

Intakte, reine Gesamt-RNA weist scharfe 28S und 18S rRNA Banden im Verhältnis 2:1 auf.

G6Pase Produkte wurden bei 804 bp nachgewiesen. ß-Actin Produkte wurden bei 738 bp

nachgewiesen.

3.3.4 cDNA – Synthese

Mit dem „High Capacity cDNA reverse transkriptase kit“ wurde aus zuvor hergestellter

RNA die dazu komplementäre cDNA synthetisiert. Eine dazu verwendete RNA-abhängige

DNA-Polymerase verwendet Random Hexamer Primer und Desoxynukleosidtriphosphate

(dNTP) um die gesamte RNA in cDNA zu transkribieren. Mit der dadurch erhaltenen cDNA

wurden anschließend PCR und real-time PCR durchgeführt.

Materialien:

High Capacity cDNA reverse transkriptase kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)

RNA aus H4IIE Zellen

Thermocycler (Eppendorf Mastercycler Gradient)

Sterile, RNAse/DNAse freie Pipettenspitzen und Reaktionsgefäße

Es wurden je Probe 5µl RNA mit 5µl RNAse freiem Wasser vermischt und mit 10µl Master

Mix zur cDNA-Synthese verwendet. Der Master Mix setzte sich folgendermaßen

zusammen:

2µl 10x RT Buffer;

0,8µl 25x dNTP Mix;

46

2µl 10x RT Random Hexamer Primer;

4,2µl Nuclease freiem H2O;

1µl Reverse Transkriptase (50 Units/µl)

Master Mix, RNA und Wasser wurden gut vermischt und im Thermocycler zur Reaktion

gebracht.

Das Programm umfasste:

Schritt 1: 25°C 10 min.


Schritt 3: 85°C 5 sec.

Schritt 4: 4°C hold

Die cDNA wurde bei -20°C aufbewahrt.

3.3.5 PCR von Glucose-6-Phosphatase und β-Actin

PCR steht für „Polymerase Chain Reaction“. Es handelt sich dabei um eine Methode, mit

der eine Vervielfältigung und der Nachweis von spezifischer cDNA durch die Verwendung

spezifischer Primer möglich ist. In einem Thermocycler werden dabei in einem ersten

Schritt die DNA-Stränge denaturiert. Im sich anschließenden 2. Schritt kommt es zur

Primerhybridisierung mit anschließender Elongation im 3. Schritt. Diese 3 Schritte werden

20-30 mal wiederholt, wodurch eine exponentielle Vervielfältigung der, durch die

spezifischen Primer festgelegten, DNA-Sequenzen erfolgt.

Vor Verwendung neuer spezifischer Primer wurde in der vorliegenden Arbeit immer eine

Gradienten-PCR an vorangestellt, bei der die Annealing-Temperatur variiert, um die

optimale Annealing–Temperatur für die Primer zu ermitteln und somit das PCR Verfahren

zu etablieren.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Technik der PCR mit anschließender Agarose-

Gelelektrophorese lediglich zur Kontrolle der synthetisierten cDNA verwendet. Eine

47

Quantifizierung von cDNA-Sequenzen wurde nicht durch PCR, sondern mittles real-time

PCR vorgenommen.

Materialien:

Thermocycler


2mM dNTP Mix

Reverse/ forward Primer für:

G6Pase (forward: 5´-TGGAGACTGGTTCAACCTCG-3´;

reverse: 5´-ACGGTCGCACTCTTGCAGAA-3´ )

ß-Actin (forward: 5´-GATATCGCTGCGCTGGTCCGT-3´;

reverse: 5´-CGGAACCGCTCGTTGCCAAT-3´)

Wasser für die Molekularbiologie

10x Reaction Buffer

mi-Taq Polymerase

Die von der Firma Metabion (Martinsried) gelieferten Primer wurden aus ihrer

Ausgangskonzentration von 100pmol/µl heraus, 1:10 verdünnt. Anschließend wurde ein

Master Mix hergestellt, bestehend aus:

10% (v/v) 10x mi-Taq Reaction Buffer;

10% (v/v) 2mM dNTP Mix;

1% (v/v) forward Primer;

1% (v/v) reverse Primer;

74,8% (v/v) Wasser für die Molekularbiologie und

2% (v/v) mi-Taq Polymerase (5 Units/µl) je Probe hergestellt.

2% (v/v) des zu untersuchenden Templates (cDNA) wurde dem Master Mix zu einem

Gesamtvolumen von 25µl zugesetzt.

Die ermittelte optimale annealing-Temperatur lag bei 57°C.

48

Die PCR lief nach folgendem Programm ab:





Schritt 5: GOTO 2 REP 35


Die PCR-Produkte wurden anschließend mit einem 1% Agarosegel analysiert.

3.3.6 Real time quantitative PCR

Eine real-time PCR basiert auf der Technik der herkömmlichen PCR, allerdings bietet sie

zusätzlich die Möglichkeit der Quantifizierung. Hierbei ist es möglich, in jedem Zyklus die

synthetisierte Menge des Zielgens zu untersuchen, daher real time. Die entstehenden

Daten werden während der real-time PCR gewonnen und nicht, wie bei der

herkömmlichen PCR, erst nach Ablauf der Reaktion. Nach jedem Zyklus der real-time PCR

wird eine Fluoreszenzmessung durchgeführt.

Die Fluoreszenz entsteht durch Ausnutzung des FRET (fluorescence resonance energy

transfer). Die TaqMan Gene Expression Assay Primer besitzen am 5´- Ende einen

Fluorochrom-Donor, den Reporter. Am 3´-Ende ist ein Fluorochrom Akzeptor, der

Quencher. Der Quencher reduziert die Fluoreszenz des Reporters. Ist der Abstand von

Reporter zum Quencher klein, ist der FRET groß und die gemessene Fluoreszenz gering.

Ist der Abstand von Reporter zum Qunecher hingegen groß, ist der FRET klein und die

emittierte Fluoreszenz des Reporters groß. Während der PCR lagern sich die Primer an die

zu untersuchenden cDNA an. Im weiterem Verlauf wird das 5´-Ende des Primers von der

5´-Exonuklease-Aktivität der Taq-Polymerase abgespalten. Dadurch werden Reporter und

Quencher getrennt. Die emittierte Fluoreszenz des Reporters erhöht sich und ist damit

proportional zur Menge des PCR Produkts.

49

Als Ergebnis liefert die Anwendungssoftware des Geräts den Ct-Wert (threshold cycle).

Der Ct-Wert beschreibt den Zyklus während der PCR, in dem die gemessene Fluoreszenz

zum ersten Mal signifikant über der gemessenen Fluoreszenz der „No template control“

liegt. In den darauffolgenden Zyklen der real-time PCR ist mit einem exponentiellem

Anstieg der Fluoreszenz für amplifizierte Gene zu rechnen.

Zur relativen Quantifizierung wird ein ubiquitär exprimiertes Protein, in der vorliegenden

Arbeit ß-Actin, als Referenz-cDNA herangezogen. Das Zielgen, in der vorliegenden Arbeit

G6Pase, wird in Relation zum ubiquitär exprimierten ß-Actin gesetzt. Über die Ct-

Vergleichsrechnung („Comparative Ct Method“; ∆∆Ct) lässt sich der relative

Expressionsunterschied einer Probe zwischen der Behandlung und der Kontrolle,

normalisiert zum Referenzgen berechnen. Mit der arithmetrischen Formel, f(x)=2 -∆∆CT,

werden Ziel- und Referenzgen in ein relatives Verhältnis gesetzt, dem Ratio. Dazu wird

erst der ∆Ct-Wert aus der Differenz von Ct-Wert des Zielgens und Ct-Wert des

Referenzgens berechnet (∆Ct=Ct Zielgen – Ct Referenzgen). Anschließend wird der ∆∆Ct-

Wert berechnet. Hierbei wird vom ∆Ct-Wert der zu untersuchenden Probe, der ∆Ct-Wert

der unbehandelten Kontrollprobe subtrahiert. (∆∆Ct=∆Ct Probe - ∆Ct Kontrolle)

Abschließend errechnet man mit 2-∆∆Ct der zu untersuchenden Probe den relativen

Expressionsunterschied zwischen zu untersuchender Probe und der unbehandelten

Kontrolle aus; den Ratio [44].

Materialien:

TaqMan® Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems, 4369542)

TaqMan® Gene Expression Assay Primer:

glucose-6-phosphatase, catalytic (Applied Biosystems, Rn00565347_m1)

actin, beta (Applied Biosystems, Rn01412977_g1)

cDNA

RNAse/DNAse freies Wasser

MicroAmp™ Optical 96-Well Reaction Plate (Applied Biosystems, N8010560)


MicroAmp™ Optical Film Compression Pad (Applied Biosystems, 4312639)

Real-time Cycler (ABI PRISM® 7700 Sequence Detector, Applied Biosystems)

50

Anwendungssoftware (7700 Sequence Detection System, version 1.6 software)

Für jede Probe wurde 3 mal der Ct-Wert für Glucose-6-Phosphatase und ß-Actin

bestimmt. Zuvor hergestellte 20µl cDNA wurden mit 40µl Wasser für die

Molekularbiologie verdünnt. Anschließend wurde der TaqMan® Gene Expression Assay

Master Mix aus 12,5µl Mastermix und 1,25µl Gene Expression Assay Primer je Probe

hergestellt. Zu den 13,75µl TaqMan® Gene Expression Assay Master Mix wurden 11,25µl

der zu untersuchenden cDNA hinzugegeben. Die entstandenen 25µl wurden in ein

MicroAmp™ Optical 96-Well Reaction Plate gegeben, mit einer Folie versiegelt und mit

einem MicroAmp™ Optical Film Compression Pad bedeckt. Als „No template control“

wurde ein Well mit 13,75µl TaqMan® Gene Expression Assay Master Mix und 11,25µl H2O

beladen.

Die real-time PCR lief nach folgendem Programm:

Schritt 1: 50˚C 2 min.


Schritt 3: 95˚C 15 sec.


Schritt 5: GOTO 3 REP 40


51

3.4 Statistische Auswertung

Zur statistischen Auswertung wurde das Programm SigmaStat 3.5 (Fa. Systat Software,

Inc.) verwendet. Zu allen Daten wurden bei der deskriptiven Statistik Mittelwert

(arithmetisches Mittel), Standardabweichung, Standardfehler, Standardfehler des

Mittelwerts (SEM; Streuung der Mittelwerte des Messwertumfangs n) und

Konfidenzintervall des Mittelwerts berechnet. Der SEM wurde in Diagrammen als

Fehlerindikator angegeben. Zur Ermittlung signifikanter Unterschiede wurde eine one

way analysis of variance (ANOVA) durchgeführt. Hiermit wird die Gesamtvarianz aller

unterschiedlichen Messbedingungen auf einen statistisch signifikanten Unterschied

untersucht. Bei einem statistisch signifikanten Unterschied, gibt eine ANOVA keine

Informationen darüber, welche unterschiedlichen Messbedingungen sich signifikant

unterscheiden. Hierzu schließt sich die Dunn´s Methode oder die Holm-Sidak Methode als

Vergleichstechnik an. Für hierdurch errechnete p-Werte wurde als maximale

Irrtumswahrscheinlichkeit ein Signifikanzniveau von α=0,05 festgelegt. p-Werte von ≤0,05

werden gemeinhin statistisch signifikant zum Niveau α angesehen.

52

4 Ergebnisse

4.1 Regulation der Glukose-6-Phosphatase


Abhängigkeit von Insulin

Zunächst sollte untersucht werden, ob Insulin die Promotoraktivität der G6Pase im

Zellmodell senkt. Weiterhin musste eine optimale Konzentration von Insulin für die

anschließenden Zellversuche ermittelt werden. Nach 12-stündiger Inkubation mit Insulin

wurde in H4 M1.3 Zellen die Luciferaseaktivität gemessen. Sie steht in linearer

Abhängigkeit zur G6Pase-Promotoraktivität. Die Insulinkonzentrationen betrugen 10-6M,

10-7M, 10-8M, 10-9M und 10-10M. Eine Probe blieb zur Kontrolle unbehandelt.

Abb. 4: Glukose-6-Phosphatase-Promotoraktivität in Abhängigkeit verschiedener Insulinkonzentrationen. H4 M1.3 Zellen wurden 12 Stunden mit verschiedenen Konzentrationen von Insulin inkubiert. Gemessen wurde anschließend die Luciferaseaktivität des G6Pase-Promotors bezogen auf die Proteinmenge. Die basale Promotoraktivität wurde mit 100 % gleichgesetzt. Angegebene Mittelwerte und SEM stammen aus 6 unabhängigen, jeweils mindestens in Triplikaten durchgeführten Experimenten. ANOVA mit anschließender Holm-Sidak-Vergleichstechnik zeigten für alle Werte einen statistisch signifikanten Unterschied zur unbehandelten 0M-Insulinprobe (p<0,05).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

0M 10(-10)M 10(-9)M 10(-8)M 10(-7)M 10(-6)M

Luci

fera

seak

tivi

tät

(% d

er

bas

ale

n A

ktiv

ität

)

Insulinkonzentration

53

Die luminometrisch ermittelten RLU-Werte (relative light units) wurden auf die Menge an

Protein im Zelllysat normiert. Die Proteinbestimmung wurde mittels BCA-Test

vorgenommen. Dadurch entstandene absolute Werte wurden in Relation zu den

unbehandelten Kontrollproben gesetzt, wobei diese mit 100 % angegeben wurde. Die

Messung wurde 6-mal mindestens im Triplikat durchgeführt.

Dosisabhängig wurde eine Abnahme der Luciferaseaktivität und damit der G6Pase-

Promotoraktivität festgestellt. Statistisch signifikante Änderungen traten bereits bei

10-10M auf (p<0,01). Die Luciferaseaktivität nahm von 0M (100 %) über 10-10M (65,8 %),

10-9M (54,5 %), 10-8M (44,9 %), 10-7M (35,8 %) Insulin stetig bis auf 32,9 % bei einer

Insulin-Konzentration von 10-6M ab. Die maximal ermittelte Hemmung beträgt damit 67,1

% bezogen auf die unbehandelte Probe.

Die Glukose-6-Phosphatase-Promotoraktivität wird konzentrationsabhängig durch Insulin

gesenkt.


Abhängigkeit von Metformin

Es wurde daraufhin untersucht, ob Metformin einen vergleichbaren hemmenden Effekt

auf die G6Pase-Promotoraktivität hat wie Insulin. Zusätzlich sollte für diesen Fall eine

optimale Konzentration von Metformin für sich anschließende Zellversuche ermittelt

werden. Unter identischen Versuchsbedingungen wie zur Ermittlung der Regulation der

G6Pase-Promotoraktivität durch Insulin wurden H4 M1.3 Zellen in unterschiedlich

konzentrierte Metforminlösungen inkubiert. Die Konzentrationen für Metformin betrugen

dabei 0,1mM, 0,5mM, 1mM und 2mM. Eine Probe blieb zur Kontrolle unbehandelt. Die

luminometrisch ermittelten RLU wurden auf die Proteinmenge im Zelllysat mittels BCA-

Test normiert. Dadurch entstandene absolute Werte wurden in Relation zu den

unbehandelten Kontrollproben gesetzt, wobei diese mit 100 % angegeben wurde. Die

Messung wurde 9-mal mindestens im Triplikat durchgeführt.

54

Vergleichbar mit dem Effekt von Insulin zeigte sich eine dosisabhängige Reduktion der

G6Pase-Promotoraktivität mit zunehmender Metforminkonzentration. Statistisch

signifikante Unterschiede konnten ab einer Konzentration von 0,5mM Metformin

(p<0,01) und höher ermittelt werden. Die Luciferaseaktivität nahm von 0mM (100 %) über

0,1mM (98,4 %), 0,5mM (76,7 %) und 1mM (59,4 %) Metformin kontinuierlich bis auf 47,1

% bei einer Metforminkonzentration von 2mM ab. Die maximal ermittelte Hemmung

beträgt damit 52,9 % bezogen auf die unbehandelte Probe.

Die Glukose-6-Phosphatase-Promotoraktivität lässt sich konzentrationsabhängig durch

Metformin senken.

Abb. 5: Glukose-6-Phosphatase-Promotoraktivität in Abhängigkeit verschiedener Metforminkonzentrationen. H4 M1.3 Zellen wurden 12 Stunden mit verschiedenen Konzentrationen Metformin inkubiert. Gemessen wurde anschließend die Luciferaseaktivität des G6Pase-Promotors bezogen auf die Proteinmenge. Die basale Promotoraktivität wurde mit 100 % gleichgesetzt. Angegebene Mittelwerte und SEM stammen aus 9 unabhängigen, jeweils mindestens in Triplikaten durchgeführten Experimenten. ANOVA mit anschließender Holm-Sidak-Vergleichstechnik zeigten für Werte ab einer Metforminkonzentration von 0,5mM einen statistisch signifikanten Unterschied zur unbehandelten 0mM-Metforminprobe (p<0,05).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

0mM 0,1mM 0,5mM 1mM 2mM

Luci

fera

seak

tivi

tät

(% d

er

bas

ale

n A

ktiv

ität

)

Metforminkonzentration

55

4.1.3 Effekte von Insulin und Metformin auf die Glukose-6-Phosphatase

mRNA

Zur Bestätigung des hemmenden Effekts von Insulin und Metformin auf die G6Pase-

Promotoraktivität wurde mittels real-time PCR die mRNA-Menge der G6Pase in H4 II E

Zellen bestimmt. Eine 4-stündige Inkubation in 2mM Metformin bzw. 10-6M Insulin bzw.

serumfreiem Medium zur Kontrolle sowie Gesamt-RNA-Extraktion und cDNA-Synthese

gingen der real-time PCR voraus. Die Daten stammen aus 4 unabhängigen Zellversuchen

je Versuchsbedingung. Zu jeder Probe wurde der Ct-Wert dreifach bestimmt. Die

Auswertung mittels real-time PCR erfolgte parallel in einer Analyse. Über die Ct-

Vergleichsrechnung („Comparative Ct Method“; ∆∆Ct) wurde der relative

Expressionsunterschied zwischen behandelten und unbehandelten Proben, normalisiert

zum Referenzgen (ß-Actin), berechnet. Mittels ANOVA und anschließender Holm-Sidak-

Vergleichstechnik wurden die Relationen statistisch auf Unterschiede untersucht.

Die ermittelten Relationen zeigen, dass der G6Pase-mRNA-Gehalt in H4 II E Zellen sowohl

nach Insulin- als auch nach Metformin-Inkubation signifikant abfällt. Nach Insulin-

Inkubation wurde ein 0,17-facher G6Pase-mRNA-Gehalt im Vergleich zur Kontrollprobe

ermittelt (p<0,01). Nach Metformininkubation wurde ein 0,73-facher G6Pase-mRNA-

Gehalt im Vergleich zur Kontrollprobe ermittelt (p=0,03). Auch der Unterschied des

Abb. 6: Glukose-6-Phosphatase mRNA quantifiziert mittels real-time PCR. H4 II E Zellen wurden für 4 Stunden in 10

-6M Insulin bzw. 2mM Metformin inkubiert. Anschließend wurde mittels real-time PCR und ∆∆Ct-Methode

der G6Pase-mRNA-Gehalt auf ß-Actin normiert und als Vielfaches der Kontrollprobe ermittelt. Angegebene Mittelwerte und SEM stammen aus 4 unabhängigen Zellversuchen. Zu jeder Probe wurde der Ct-Wert dreifach bestimmt. ANOVA mit anschließender Holm-Sidak-Vergleichstechnik wurden zur Ermittlung signifikanter Unterschiede angewandt. * Statistisch signifikanter Unterschied zur Kontrolle (p<0,05)

Statistisch signifikanter Unterschied zur Metforminprobe (p<0,05)

56

G6Pase-mRNA-Gehalts zwischen mit Insulin und Metformin behandelten Zellen ist

signifikant (p<0,01).

Die Glukose-6-Phosphatase-Expression wird durch Insulin und Metformin gesenkt. Insulin

senkt die Glukose-6-Phosphatase-Expression stärker als Metformin.

4.1.4 Regulation gesteigerter Glukose-6-Phosphatase-Promotoraktivität

in Abhängigkeit von Metformin und Insulin

Um den Effekt von Insulin und Metformin auf die G6Pase unter Bedingungen einer

Insulinresistenz mit gesteigerter G6Pase-Promotoraktivität, wie sie beim Typ-2-Diabetes

vorkommt, zu untersuchen, wurden H4 M1.3 Zellen mit 500nM Dexamethason (DXM)

und 500µM Dibutyryladenosin-Monophosphat-Natriumsalz (dBcAMP) einstündig

präinkubiert. Glukokortikoide binden an glucocorticoid response elements des G6Pase-

Promotors, während cAMP an cis-acting sequences des G6Pase-Promotors interagieren.

Beide Mechanismen erhöhen die Expression der Glukose-6-Phosphatase [55].

Anschließend wurden die Zellen zusätzlich in 10-6M Insulin bzw. in verschiedenen

Konzentrationen Metformin (0,1mM, 0,5mM, 1mM, 2mM) für 12 Stunden inkubiert. Eine

Probe wurde nur mit DXM und dBcAMP behandelt. Eine weitere Probe wurde nicht

behandelt und als Kontrolle verwendet.

Mit der bereits oben beschriebenen luminometrisch ermittelten Luciferaseaktivität wurde

die G6Pase-Promotoraktivität bestimmt. Dadurch entstandene absolute Werte wurden in

Relation zu den Kontrollproben gesetzt, wobei diese mit 100 % angegeben wurden. Der

Versuch wurde dreimal im Quadruplikat durchgeführt.

57

Dabei wurde festgestellt, dass die alleinige Inkubation mit DXM und dBcAMP die G6Pase-

Promotoraktivtät auf das ca. 11-Fache der Kontrolle steigerte (100 % auf 1189,4 %). Die

erhöhte Promotoraktivität konnte mit Metformin dosisabhängig gesenkt werden. Für

Metforminkonzentrationen von 0,1mM, 0,5mM und 1mM wurden Promotoraktivitäten

von 732,9 %, 640,6 % und 217,4 % ermittelt. Diese Unterschiede waren nicht signifikant

zur Versuchsbedingung mit alleiniger DXM- und dBcAMP-Inkubation. Eine signifikante

Reduktion der G6Pase-Promotoraktivität konnte bei 2mM Metformin (Promotoraktivität

76,1 %) ermittelt werden (p<0,05). Es kommt zu einer 93,6%igen Hemmung der durch

DXM und dBcAMP erhöhten G6Pase-Promotoraktivität. 10-6M Insulin senkten die G6Pase-

Promotoraktivität auf 71,9 %. Es kommt zu einer 93,9%igen Hemmung der durch DXM

und dBcAMP erhöhten G6Pase-Promotoraktivität (p<0,05). Es besteht kein signifikanter

Abb. 7: Gesteigerte Promotoraktivität der Glukose-6-Phosphatase in Abhängigkeit von unterschiedlichen Konzentrationen Metformin und 10

-6M Insulin. Durch einstündige Präinkubation von H4 M1.3 Zellen in 500nM

DXM und 500µM dBcAMP wurde eine gesteigerte G6Pase-Promotoraktivität erzeugt. Anschließend wurden die Zellen 12 Stunden mit verschiedenen Konzentrationen Metformin oder 10

-6M Insulin inkubiert. Gemessen wurde

die Luciferaseaktivität des G6Pase-Promotors bezogen auf die Proteinmenge. Die basale Promotoraktivität wurde mit 100 % gleichgesetzt. Angegebene Mittelwerte und SEM stammen aus 3 unabhängigen im Quadruplikat durchgeführten Zellversuchen. ANOVA mit anschließender Dunn´s Vergleichstechnik wurden zur Ermittlung signifikanter Unterschiede angewandt. * Statistisch signifikanter Unterschied (p<0,05) zu Versuchsbedingung mit alleiniger DXM- und dBcAMP-

Inkubation.

58

Unterschied in der G6Pase-Promotoraktivität bei Verwendung maximaler

Konzentrationen Insulin und Metformin (p=0,933).

DXM und dBcAMP erzeugen eine Insulinresistenz mit erhöhter G6Pase-Promotoraktivität,

wie sie beim Typ-2-Diabetes vorkommt. Sie lässt sich durch Insulin und Metformin

senken. Dabei ist bei angehobener G6Pase-Promotoraktivität der hemmende Effekt von

Metformin relativ zum Ausgangswert bei nicht gesteigerter G6Pase deutlich stärker und

gleicht nun dem des Insulin.

4.1.5 Effekte der AMPK auf die Glukose-6-Phosphatase-


AICAR

Es sollte untersucht werden, welchen Effekt AMPK auf die G6Pase-Promotoraktivität in

H4 M1.3 Zellen hat und wie dieser durch Insulin, Metformin und AICAR beeinflusst wird.

Hierzu wurde der spezifische AMPK-Inhibitor Compound C verwendet. Compound C

wurde in einer Konzentration von 40µM 30 Minuten vor der 12-stündigen Inkubation mit

10-6M Insulin bzw. 2mM Metformin bzw. 1mM AICAR (AMPK-Aktivator) präinkubiert.

Vergleichend blieb eine gleiche Anzahl Proben ohne Compound-C-Präinkubation. Eine

weitere Probe wurde nicht behandelt und als Kontrolle verwendet. Die luminometrisch

ermittelten RLU wurden auf die Proteinmenge im Zelllysat mittels BCA-Test normiert.

Dadurch entstandene absolute Werte wurden in Relation zu den unbehandelten

Kontrollproben gesetzt, wobei diese mit 100 % angegeben wurde. Der Versuch wurde

dreimal im Triplikat durchgeführt.

59

Insulin und Metformin zeigten die bereits beschriebene Reduktion der G6Pase-

Promotoraktivität. 1mM AICAR reduzierte die basale Promotoraktivität signifikant

(p<0,05) auf 48,5 %. Es zeigte sich eine partielle Aufhebung des Effekts von Insulin und

Metformin auf die G6Pase-Promotoraktivität durch Compound C. Dabei wurde die

Promotoraktivität nach Insulininkubation von 12,8 % durch Compound C auf 47,7 %

erhöht (p<0,01). Vergleichbares wurde für Metformin ermittelt. Hier wurde die

Promotoraktivität nach Metformininkubation von 14,4 % durch Compound C auf 41,8 %

erhöht (p<0,01). Der Effekt von 1mM AICAR konnte durch Compound C komplett

aufgehoben werden (48,5 % auf 112,3 %; p<0,05). Der Unterschied in der

Promotoraktivität zwischen Kontrollprobe (100 %) und der AICAR+Compound-C-Probe

war nicht signifikant (p=0,62).

Abb. 8: Effekt von Compound C (40µM) auf die Glukose-6-Phosphatase-Promotoraktivität in Abhängigkeit von Insulin (10

-6M), Metformin (2mM) oder AICAR (1mM). Compound C wurde 30 min. vor

12-stündiger Inkubation mit 10-6

M Insulin bzw. 2mM Metformin bzw. 1mM AICAR präinkubiert. Vergleichend blieb eine gleiche Anzahl Proben ohne Compound-C-Präinkubation. Gemessen wurde die Luciferaseaktivität des G6Pase-Promotors normiert auf die Proteinmenge. Die basale Promotoraktivität wurde mit 100 % gleichgesetzt. Angegebene Mittelwerte und SEM stammen aus 3 unabhängigen im Triplikat durchgeführten Zellversuchen. ANOVA mit anschließender Dunn´s Vergleichstechnik wurden zur Ermittlung signifikanter Unterschiede angewandt. * Statistisch signifikanter Unterschied (p<0,05) zu Versuchsbedingung mit alleiniger Insulin-Inkubation.

Statistisch signifikanter Unterschied (p<0,05) zu Versuchsbedingung mit alleiniger Metformin-Inkubation.

Statistisch signifikanter Unterschied (p<0,05) zu Versuchsbedingung mit alleiniger AICAR-Inkubation.

60

AMPK ist an der Regulation der G6Pase-Promotoraktivität beteiligt. Ihr hemmender

Einfluss trägt sowohl bei Insulin- als auch bei Metformin-inkubierten Zellen teilweise zur

Reduktion der Promotoraktivität bei. Die Wirkung von AICAR auf die G6Pase-

Promotoraktivität wird primär durch AMPK vermittelt.

4.1.6 Effekte der AMPK auf gesteigerte Glukose-6-Phosphatase-


AICAR

Um den Effekt der AMPK unter Bedingungen einer Insulinresistenz mit gesteigerter

G6Pase-Promotoraktivität, wie sie beim Typ-2-Diabetes vorkommt, auf die

Promotoraktivität der G6Pase zu untersuchen und deren Beeinflussbarkeit durch Insulin,

Metformin und AICAR zu ermitteln, wurden H4 M1.3 Zellen mit 500nM DXM und 500µM

dBcAMP einstündig präinkubiert. Anschließend wurden die Zellen zur Hemmung der

AMPK 30-minütig in 40µM Compound C präinkubiert. Daraufhin wurden die Zellen

zusätzlich 12 Stunden in 10-6M Insulin bzw. 2mM Metformin bzw. 1mM AICAR inkubiert.

Vergleichend blieben eine gleiche Anzahl Probenansätze ohne Präinkubation mit

Compound C, jedoch vorbehandelt mit DXM und dBcAMP. Eine Probe wurde lediglich mit

DXM und dBcAMP behandelt. Die luminometrisch ermittelten RLU wurden auf die

Proteinmenge im Zelllysat mittels BCA-Test normiert. Dadurch entstandene absolute

Werte wurden in Relation zu den einzig mit DXM und dBcAMP behandelten Proben

gesetzt, wobei diese mit 100 % angegeben wurde. Der Versuch wurde viermal im Triplikat

durchgeführt.

61

Metformin und Insulin bewirkten die bereits beobachtete Reduktion der G6Pase-

Promotoraktivität. Auch AICAR reduzierte die Promotoraktivität signifikant von 100 % auf

46,4 % (p<0,05). Compound C hob die Effekte von Insulin und Metformin partiell auf. Die

Promotoraktivität nach Insulininkubation (3,4 %) wurde durch Compound C signifikant auf

9,2 % erhöht (p<0,01). Die Promotoraktivität nach Metformininkubation (9,7 %) wurde

durch Compound C signifikant auf 56,1 % erhöht (p<0,01). Die Promotoraktivität nach

AICAR-Inkubation (46,4 %) wurde durch Compound C komplett aufgehoben und auf 141

% erhöht (p<0,01). Der ermittelte Unterschied zwischen den Proben DXM+dBcAMP (100

%) und DXM+dBcAMP+ 40µM Compound C +1mM AICAR (141 %) ist statistisch signifikant

(p=0,026).

AMPK ist auch an der Regulation der G6Pase-Promotoraktivität unter Insulinresistenz mit

erhöhter G6Pase-Promotoraktivität beteiligt. Metformin vermittelt über AMPK einen Teil

Abb. 9: Effekt von Compound C (40µM) auf gesteigerte Glukose-6-Phosphatase-Promotoraktivität in Abhängigkeit von Insulin (10

-6M), Metformin (2mM) oder AICAR (1mM). H4 M1.3 Zellen wurden eine Stunde in

500nM DXM und 500µM dBcAMP präinkubiert. Anschließend wurde eine 12-stündige Inkubation in Insulin bzw. Metformin bzw. AICAR mit und ohne 30-minütige Präinkubation in 40µM Compound C durchgeführt. Gemessen wurde anschließend die Luciferaseaktivität des G6Pase-Promotors bezogen auf die Proteinmenge. Die basale Promotoraktivität wurde mit 100 % gleichgesetzt. Angegebene Mittelwerte und SEM stammen aus 4 unabhängigen in Triplikat durchgeführten Zellversuchen. ANOVA mit anschließender Dunn´s Vergleichstechnik wurden zur Ermittlung signifikanter Unterschiede angewandt.

*, , Statistisch signifikanter Unterschied (p<0,05) zu entsprechender Versuchsbedingung ohne Compound-C-Inkubation

62

der Hemmung der G6Pase-Promotoraktivität. Compound C ist unter diesen Bedingungen

deutlich weniger effektiv, den Insulineffekt auf die G6Pase-Promotoraktivität zu

antagonisieren als den Metformineffekt. Insulineffekte scheinen bei erhöhter G6Pase-

Promotoraktivität nahezu unabhängig von AMPK vermittelt zu werden. AICAR wirkt auch

unter gesteigerter G6Pase-Promotoraktivität primär über AMPK.

4.2 Beeinflussung der Threonin-Phosphorylierung 172 an AMPK

durch Insulin, Metformin, AICAR und Compound C

Um zu überprüfen, ob Insulin (10-6M), Metformin (2mM) und AICAR (1mM) Einfluss auf

die Threonin-Phosphorylierung 172 an AMPK haben, die diese aktiviert, wurde dieses

Signal im ELISA und Western Blot gemessen. Zu jedem Probenansatz wurde auch ein

entsprechender Versuchsansatz mit einer 30-minütigen Compound-C-Präinkubation

(40µM) durchgeführt. Für den Western Blot wurden H4 II E Zellen 12-stündig inkubiert.

Dem AMPK Phospho-Threonin 172 Blot schloss sich ein AMPK-Total Western Blot an, um

sicherzustellen, dass alle Spuren AMPK besitzen und entsprechende Resultate nicht durch

fehlende Proteine hervorgerufen wurden. Für den ELISA wurden H4 II E Zellen 30-minütig

inkubiert. Dem AMPK Phospho-Threonin 172 ELISA schloss sich ein BCA-Test zur

Ermittlung des Proteingehalts im Zelllysat an. Die gemessene Threonin-Phosphorylierung

wurde auf die Proteinmenge normiert und auf U/ng quantifiziert. Je eine Probe blieb bei

beiden Verfahren unbehandelt. Die Daten des ELISA stammen aus 3 unabhängigen

Zellversuchen je Versuchsbedingung.

Abb. 10: Effekt von Compound C auf den Phosphorylierungsstatus von AMPK Threonin 172 (Western Blot). H4 II E Zellen wurden mit und ohne 30-minütiger Präinkubation in 40µM Compound C durch 10

-6M Insulin bzw.

2mM Metformin bzw. 1mM AICAR 12-stündig stimuliert. Mittels Western Blot wurde spezifisch Phospho AMPK Threonin 172 und Total AMPK nachgewiesen. 100µg Protein wurden in jede Spur des Western Blot aufgetragen.

63

Im Western Blot zeigten sich stärkere Signale für AMPK Thr 172 nach Inkubation in AICAR

bzw. Metformin als für andere Versuchsbedingungen. Auch die unbehandelte Probe und

die mit Insulin behandelte Probe erzeugten Signale für AMPK Thr 172, die allerdings

schwächer sind als die Signale von Metformin und AICAR. Proben mit Präinkubation in

40µM Compound C erzeugten keine Signale für AMPK Thr 172.

Durch ELISA wurden im Western Blot untersuchte Signale quantifiziert. Mittels ANOVA

und anschließender Holm-Sidak-Vergleichstechnik wurden die Daten auf statisitisch

signifikante Unterschiede untersucht.

Ausgehend von der Kontrollprobe steigt die AMPK-Phosphorylierung an Threonin 172

durch Metformin (2mM) signifikant von 0,11 U/ng auf 0,17 U/ng (p<0,01). AICAR (1mM)

erhöht die AMPK-Phosphorylierung an Threonin 172 signifikant auf 0,23 U/ng (p=0,02).

Abb. 11: Effekt von Compound C auf den Phosphorylierungsstatus von AMPK Threonin 172 (ELISA). H4 II E Zellen wurden mit 2mM Metformin, 10

-6M Insulin oder 1mM AICAR inkubiert und mit oder ohne Einfluss von 40µM

Compound C auf ihren Phosphorylierungsstatus an AMPK Threonin 172 untersucht. Compound C wurde 30 Minuten präinkubiert. Es folgte eine 30-minütige Inkubation mit Insulin/Metformin/AICAR. Die Threonin-Phosphorylierung wurde auf den Proteingehalt des Zelllysats normiert. Angegebene Mittelwerte und SEM stammen aus 3 unabhängigen Zellversuchen je Versuchsbedingung. Die Auswertung wurde anschließend in einem ELISA durchgeführt. ANOVA mit anschließender Holm-Sidak-Vergleichstechnik wurden zur Ermittlung signifikanter Unterschiede angewandt.

*, , , Statistisch signifikanter Unterschied (p<0,05) zu entsprechender Versuchsbedingung ohne Compound-C-Inkubation.

64

Insulin erhöht die AMPK-Phosphorylierung an Threonin 172 auf 0,13 U/ng. Der

Unterschied zur Kontrollprobe (0,11 U/ng) ist nicht signifikant (p=0,66). Der Unterschied

zwischen Insulin (0,13 U/ng) und Metformin (0,17 U/ng) ist signifikant (p=0,02).

Alle Versuchsansätze mit Compound-C-Präinkubation senken die AMPK-

Phosphothreonin-Aktivität sowohl unter die Aktivität der Kontrollprobe als auch unter die

Aktivität ihres entsprechenden nicht mit Compound C behandelten Pendants. Die

Aktivität der Kontrollprobe wird von 0,11 U/ng durch Compound C auf 0,07 U/ng gesenkt

(p=0,02). Die Aktivität von Insulin wird von 0,13 U/ng durch Compound C auf 0,07 U/ng

gesenkt (p=0,02). Die Aktivität von Metformin wird von 0,17 U/ng durch Compound C auf

0,08 U/ng gesenkt (p<0,01). Die Aktivität von AICAR wird von 0,23 U/ng durch Compound

C auf 0,09 U/ng gesenkt (p=0,01).

Metformin und AICAR führen zu einer stärkeren Zunahme der Phosphorylierung an AMPK

Threonin 172 als Insulin. Auch Insulin scheint AMPK über die Phosphorylierung an

Threonin 172 zu aktivieren.

4.3 ATP-Konzentrationen in H4-Zellen unter dem Einfluss von

Insulin und Metformin

ATP ist die universelle Form unmittelbar verfügbarer Energie in allen metabolisch aktiven

Zellen und kann als Marker für Zelllebensfähigkeit herangezogen werden. Um

auszuschließen, dass die gezeigten Effekte auf die G6Pase-Promotoraktivität nicht durch

unspezifische Effekte auf die Viabilität der Zellen erfolgte, wurde die ATP-Konzentration in

H4 II E Zellen nach 12-stündiger Inkubation in verschiedenen Metforminkonzentrationen

(0,1mM; 0,5mM; 1mM; 2mM) und 10-6M Insulin gemessen. Durch eine ATP-abhängige

chemische Reaktion wurden luminometrisch Lichtemissionen (in RLU) gemessen, die in

linearer Abhängigkeit zum zellulären ATP-Gehalt stehen. Diese Werte wurden auf den

mittels BCA-Test ermittelten zellulären Proteingehalt normiert und über eine ATP-

Standardkurve auf die Einheit nM ATP/ µg Protein umgerechnet. Die Daten stammen aus

4 unabhängigen, mindestens im Triplikat durchgeführten Zellversuchen je

Versuchsbedingung.

65

Bei den ermittelten Daten zeigte sich nach ANOVA keine signifikante Verminderung der

ATP-Konzentration in H4 II E Zellen (p=0,223).

Die Kontrollprobe hatte eine ATP-Konzentration von 14,914 nM ATP/µg Protein.

Metformin führt zu einer nicht signifikanten Abnahme der ATP-Konzentration. Dabei

verringert sich die ATP-Konzentration nach Inkubation in 0,1mM Metformin auf 13,554

nM ATP/µg Protein, nach Inkubation in 0,5mM Metformin auf 13,873 nM ATP/µg Protein,

nach Inkubation in 1mM Metformin auf 13,704 nM ATP/µg Protein und nach Inkubation

in 2mM Metformin auf 11,125 nM ATP/µg Protein. Insulin (10-6M) führte zu einer nicht

signifikanten Reduktion der ATP-Konzentration auf 14,237 nM ATP/µg Protein.

Der ATP-Gehalt in H4-Zellen nimmt nach Metformin-Inkubation tendenziell, allerdings

nicht statistisch signifikant ab. Ein zytotoxischer Effekt von Metformin und Insulin in den

verwendeten Konzentrationen kann weitestgehend ausgeschlossen werden.

Abb. 12: ATP-Konzentrationen in H4 II E Zellen in Abhängigkeit unterschiedlicher Konzentrationen Metformin

und 10-6

M Insulin. H4 II E Zellen wurden 12-stündig in 0,1mM, 0,5mM, 1mM oder 2mM Metformin sowie in

10-6

M Insulin inkubiert. Anschließend wurde luminometrisch die ATP-Konzentration in nM/µg Protein im Zelllysat

ermittelt. Angegebene Mittelwerte und SEM stammen aus 4 unabhängigen, mindestens im Triplikat

durchgeführten Zellversuchen. Es zeigten sich nach ANOVA keine signifikanten Unterschiede in den ATP-

Konzentrationen (p=0,223).

66

4.4 Effekte von Insulin und Metformin auf die Apoptose

Eine Abnahme der ATP-Konzentration in Zellen kann ein Zeichen für Zelltod sein. Um

einen eventuellen Zelltod durch Metformin und Insulin in den verwendeten

Konzentrationen genauer verifizieren zu können, wurde mittels

Immunfluoreszenzmikroskopie das Auftreten von Apoptose untersucht. Während des

programmgesteuerten Zelltods durchläuft die Zelle verschiedene klar definierte

morphologische und funktionelle Stadien. Unter anderem kommt es zu DNA-

Strangbrüchen mit freiwerdenden 3´-OH-Enden. Diese wurden genutzt, um sie mit

Fluoreszenzfarbstoffen sichtbar zu machen. Zusätzlich zur Fluoreszenzfärbung wurden

auch morphologische Kriterien der Apoptose zur Auswertung hinzugezogen. Die meist

fixationsbedingte Nekrose wurde durch morphologische Kriterien abgegrenzt. H4 II E

Zellen wurden dazu 12 Stunden in 2mM Metformin bzw. 10-6M Insulin inkubiert. Als

Positivkontrolle wurden zur Validierung des Messverfahrens 5 Units DNase eingesetzt.

Eine Probe blieb unbehandelt, ist repräsentativ für die physiologisch vorkommende

Apoptose und gilt als Kontrollprobe. Bei 40-facher Vergrößerung wurden je

Versuchsbedingung 5 repräsentative Gesichtsfelder hinsichtlich Gesamtzellzahl, Zahl

apoptotischer und nekrotischer Zellen untersucht. Der Versuch wurde dreimal

durchgeführt. Absolute Werte der Apoptoseanzahl wurden in Relation zur Gesamtzellzahl

angegeben.

67

In den Kontrollproben waren 3,43 % der Zellen apoptotisch. Dies entspricht dem

physiologischen Apoptosevorkommen. 4,81 % der Zellen der Kontrollproben waren

nekrotisch. Mit 10-6M Insulin behandelte Zellen waren zu 4,53 % apoptotisch und zu 3,59

% nekrotisch. Mit 2mM Metformin behandelte Zellen waren zu 6,58 % apoptotisch und zu

6,55 % nekrotisch. Die Positivkontrolle zeigte durch DNA-Fragmentation 43,57 %

apoptotische und 9,56 % nekrotische Zellen. ANOVA mit anschließendem Dunn´s

Vergleichstest zeigte, dass die Unterschiede in der relativen Apoptoseanzahl zwischen

Kontrollprobe und Insulin bzw. Metformin nicht statistisch signifikant waren (p>0,05).

Auch der Unterschied zwischen Insulin und Metformin ist statistisch nicht signifikant

(p>0,05). Signifikant erhöht hingegen war die Apoptoseanzahl der Positivkontrolle zu allen

anderen Proben (p<0,05). Bei Vergleich der Nekroseanzahl zeigten ANOVA und Dunn´s

Vergleichstechnik ein ähnliches Bild. Bei mit Metformin behandelten Zellen waren

gegenüber unbehandelten Zellen und mit Insulin behandelten Zellen keine statistisch

signifikant erhöhten Unterschiede zu ermitteln (p<0,05). Lediglich die Positivkontrolle

hatte zur Kontrollprobe eine signifikant erhöhte Nekroseanzahl (p>0,05).

Abb. 13: Fluoreszenmikroskopische Apoptosebestimmung von H4 II E Zellen unter verschiedenen Bedingungen. H4 II E Zellen wurden 12 Stunden mit 2mM Metformin oder 10

-6M Insulin oder 5 Units DNAse (Positivkontrolle)

behandelt. Es wurde die relative Apoptoseanzahl (in %) bezogen auf die Gesamtzellzahl angegeben. Angegebene Mittelwerte und SEM stammen aus 3 unabhängigen Experimenten, wobei jeweils 5 Gesichtsfelder je Versuchsbedingung fluoreszenzmikroskopisch ausgewertet wurden. ANOVA mit anschließendem Dunn´s Vergleichstest wurden zur Ermittlung signifikanter Unterschiede angewandt. * Statistisch signifikanter Unterschied zur unbehandelten Probe (p<0,05).

68

Die Apoptoseanzahl nimmt durch Metformin tendenziell, allerdings nicht signifikant zu.

Ein zytotoxischer Effekt von Metformin und Insulin in den verwendeten Konzentrationen

kann weitestgehend ausgeschlossen werden.

69

a) b)

c) d)

Abb. 14: Fluoreszenzmikroskopische Bilder von: a) unbehandelten H4 II E Zellen b) mit 10

-6M Insulin behandelten H4 II E Zellen

c) mit 2mM Metformin behandelten H4 II E Zellen d) mit 5 Units DNase behandelten H4 II E Zellen

in 40-facher Vergrößerung mit einem 490nm Filter für FITC.

70

4.5 Beeinflussung der Tyrosin-Phosphorylierung des

Insulinrezeptors durch Insulin und Metformin

Um zu prüfen, ob Metformin den Insulinrezeptor zur Vermittlung seiner Effekte auf die

G6Pase benutzt, wurde der Phosphorylierungsstatus des Insulinrezeptors mittels ELISA

untersucht. Dabei wurde spezifisch nach dem Signal von Phospho-Tyrosin 1162 und 1163

gesucht, welche als entscheidend für die Aktivierung des Insulinrezeptors angesehen

werden. H4 II E Zellen wurden zu diesem Zweck in 2mM Metformin oder 10-6M Insulin

(Positivkontrolle) für 15 Minuten inkubiert. Eine gleiche Anzahl Proben blieb unbehandelt.

Dem Phospo-ELISA schloss sich ein Total-ELISA an, bei dem die β-Untereinheit des

Insulinrezeptors quantifiziert wurde, um die Menge Phospho-Tyrosin auf die

Rezeptormenge quantifizieren zu können. Die Werte wurden in U/ng angegeben. Die

Daten stammen aus 8 unabhängigen Zellversuchen je Versuchsbedingung. Die

Auswertung wurde anschließend in einem ELISA durchgeführt.

Abb. 15: Bestimmung des Phosphorylierungsstatus am Insulinrezeptor an Tyrosin 1162/1163. Nach 15-minütiger Inkubationszeit von H4 II E Zellen in 2mM Metformin bzw. 10

-6M Insulin wurde die Tyrosin-Phosphorylierung an

Tyrosin 1162/1163 ermittelt. Die angegebenen Mittelwerte und SEM stammen aus 8 unabhängigen Zellversuchen. Die Auswertung wurde anschließend in einem ELISA durchgeführt. ANOVA mit anschließender Dunn´s Vergleichstechnik wurden zur Ermittlung signifikanter Unterschiede angewandt. * Statistisch signifikanter Unterschied zur unbehandelten Probe (p<0,05).

71

Mittels ANOVA und Dunn´s Vergleichstechnik wurde eine signifikante Zunahme der

Tyrosin-Phosphorylierung zwischen den unbehandelten Proben und 10-6M Insulin

beobachtet (p<0,05). Insulin erhöhte die Tyrosin-Phosphorylierung der unbehandelten

Zellen von 0,02 U/ng auf 0,16 U/ng. Ein signifikanter Unterschied in der Tyrosin-

Phosphorylierung zwischen unbehandelten Proben und Metformin war nicht feststellbar

(p>0,05). Die Tyrosin-Phosphorylierungen dieser beiden Probenansätze blieben mit 0,02

U/ng identisch. Der Unterschied zwischen Insulin (10-6M) und Metformin (2mM) ist

signifikant (p<0,05).

Metformin hat keinen Effekt auf den Insulinrezeptor an den untersuchten Stellen.

4.6 Beeinflussung der Serin-Phosphorylierung an Akt/PKB durch

Insulin, Metformin und PI3-Kinase-Inhibitoren

Unterhalb des Insulinrezeptors wird insulinabhängig Akt/PKB phosphoryliert. Um

herauszufinden, inwieweit Metformin Akt/PKB in ihrer Aktivität beeinflusst, wurde der

Phosphorylierungsstatus von Akt/PKB Serin 473 mittels Western Blot und ELISA

untersucht. Wortmannin und LY294002 wurden verwendet, um PI3-Kinase-abhängige

Effekte von Insulin und Metformin zu verhindern und diese damit präzise in Verbindung

mit Akt/PKB zu bringen. Für Western Blots wurden H4 II E Zellen 12 Stunden mit 2mM

Metformin bzw. mit 10-6M Insulin inkubiert. Eine Probe blieb unbehandelt. Einige

Probenansätze wurden einstündig mit 10-7M Wortmannin bzw. 10-4M LY294002

präinkubiert. Die PI3-Kinase-Inhibitoren wurden in DMSO gelöst. Um sicherzustellen, dass

DMSO als Lösemittel keinen Effekt auf die Serin-Phosphorylierung von Akt/PKB hat,

wurde eine entsprechende Kontrolle verwendet. Dem Phospho-Serin 473 Blot schloss sich

ein Akt/PKB-Total Western Blot an, um sicherzustellen, dass alle Spuren Akt/PKB besitzen

und entsprechende Resultate nicht durch fehlende Proteine hervorgerufen wurden.

72

Es wurde beobachtet, dass eine Inkubation der Zellen mit Insulin die Serin-

Phosphorylierung an Akt/PKB steigerte. Hemmung der PI3-Kinase durch Präinkubation

der Zellen in 10-7M Wortmannin mit anschließender Insulin-Inkubation führte zu einer

partiellen Minderung der Serin-Phosphorylierung. Präinkubation mit LY294002 und

anschließender Insulin-Inkubation führte zu einer kompletten Aufhebung des

Insulineffekts an der Serin-Phosphorylierung der Akt/PKB. DMSO hatte keinen Einfluss auf

den Phosphorylierungsstatus.

Weiterhin wurde beobachtet, dass eine Inkubation in 2mM Metformin nicht zu einer

Änderung der Serin-Phosphorylierung an Akt/PKB Serin 473 führte. Probenansätze mit

zusätzlicher Hemmung der PI3-Kinase durch einstündige Präinkubation mit 10-7M

Abb. 16: Effekt der PI3-Kinase-Inhibitoren Wortmannin und LY294002 auf den Phosphorylierungsstatus von

Akt/PKB Serin 473 abhängig von Insulin. Nach 1-stündiger Präinkubation von H4 II E Zellen mit 10-4

M LY294002

oder 10-7

M Wortmannin wurde 12 Stunden lang mit 10-6

M Insulin inkubiert. Positivkontrolle ist eine einzig mit

10-6

M Insulin behandelte Probe. Einige Proben wurden nicht mit PI3-Kinase-Inhibitoren behandelt. Mittels

Western Blot wurden Phospho Akt Serin 473 und Total Akt nachgewiesen. 40µg Protein wurden je Spur

aufgetragen.

Abb. 17: Effekt der PI3-Kinase-Inhibitoren Wortmannin und LY294002 auf den Phosphorylierungsstatus von

Akt/PKB Serin 473 abhängig von Metformin. Nach 1-stündiger Präinkubation von H4 II E Zellen mit 10-4

M LY

294002 oder 10-7

M Wortmannin wurde 12 Stunden lang mit 2mM Metformin inkubiert. Positivkontrolle ist eine

einzig mit 10-6

M Insulin behandelte Probe. Einige Proben wurden nicht mit PI3-Kinase-Inhibitoren behandelt.

Mittels Western Blot wurde Phospho Akt Serin 473 und Total Akt nachgewiesen. 40µg Protein wurden je Spur

aufgetragen.

73

Wortmannin bzw. 10-4M LY294002 führten zu keiner Änderung der Serin-

Phosphorylierung an Akt/PKB Serin 473. Als Positivkontrolle diente eine mit 10-6M Insulin

inkubierte Probe. Hier war eine deutliche Zunahme der Serin-Phosphorylierung

festzustellen.

Zur Quantifizierung der Western Blots (Abb. 16 und 17) wurde ELISA verwendet. Dabei

wurde die Phospho-Serin 473 Aktivität an Akt/PKB gemessen. Dem Phospo-ELISA schloss

sich ein Akt-Total-ELISA an, um die Menge Phospho-Serin auf Gesamt-Akt/PKB

quantifizieren zu können. Resultierende Werte wurden in U/ng angegeben. Die Daten

stammen aus 7 unabhängigen Zellversuchen je Versuchsbedingung. Die Auswertung

wurde in einem ELISA durchgeführt. Die Inkubationszeit betrug 15 Minuten.

Mittels ANOVA und anschließender Dunn´s Vergleichstechnik wurde eine signifikante

Zunahme der Aktivität von Phosphoserin 473 an Akt/PKB nach Inkubation der Zellen in

10-6M Insulin im Vergleich zur unbehandelten Probe (p<0,05) ermittelt. Die Serin-

Phosphorylierung stieg von 0,03 U/ng auf 0,37 U/ng an. Inkubation der Zellen in 2mM

Abb. 18: Phosphorylierungsstatus an Akt/PKB an Serin 473 in Abhängigkeit von Insulin und Metformin. Nach 15-minütiger Inkubationszeit von H4 II E Zellen in 2mM Metformin bzw. 10

-6M Insulin wurde die Serin-

Phosphorylierung an Akt Serin 473 ermittelt. Angegebene Mittelwerte und SEM stammen aus 7 unabhängigen Zellversuchen je Versuchsbedingung. Die Auswertung wurde anschließend in einem ELISA durchgeführt. ANOVA mit anschließender Dunn´s Vergleichstechnik wurden zur Ermittlung signifikanter Unterschiede angewandt. * Statistisch signifikanter Unterschied zur unbehandelten Probe (p<0,05).

74

Metformin führte zu keiner signifikanten Zunahme der Serin-Phosphorylierung 473 an

Akt/PKB im Vergleich zur unbehandelten Probe (p>0,05). Die Serin-Phosphorylierung lag

unter beiden Bedingungen bei 0,03 U/ng. Der Unterschied in der Serin-Phosphorylierung

zwischen Insulin und Metformin ist signifikant (p>0,05).

Metformin hat keinen Effekt auf Akt/PKB an den untersuchten Stellen. Insulin aktiviert

Akt über eine Phosphorylierung an Serin 473. Dieser Effekt ist durch PI3-Kinase-

Inhibitoren reversibel.

4.7 Beeinflussung der Serin-Phosphorylierung an GSK3 durch

Insulin und Metformin

Ein bekanntes direktes Substrat der Akt/PKB ist die GSK3β. Die Beeinflussung des Signals

an Phospho-Serin 9 der GSK3β wurde in Abhängigkeit von Insulin und Metformin mittels

Western Blot dargestellt, um den Aktivitätszustand des Enzyms beurteilen zu können.

H4 II E Zellen wurden dazu 12 Stunden in 10-6M Insulin bzw. 1mM Metformin bzw. 2mM

Metformin inkubiert. Durch einstündige Präinkubation identischer Versuchsansätze mit

10-7M Wortmannin wurde die oberhalb der GSK3β gelegene Akt/PKB gehemmt. In zwei

Versuchsansätzen wurde die Wirkung einer kombinierten Stimulation der Zellen mit

10-6M Insulin und 1 bzw. 2mM Metformin untersucht. Dem Phospho-Serin 9 Blot schloss

sich ein GSK3β-Total Blot an, um sicherzustellen, dass alle Spuren GSK3β besitzen und

entsprechende Resultate nicht durch fehlende Proteine hervorgerufen wurden.

Erzeugte Signale im Phospho-Blot wurden densidometrisch auf GSK3-Total-Protein

normiert und mittels ANOVA auf statistisch signifikante Unterschiede untersucht.

75

Es wurde festgestellt, dass GSK3β bereits unter basalen Bedingungen an

Serin 9 phosphoryliert ist (0,113 gemessene durchschnittliche Intensität). Durch Insulin

wird die Serin-Phosphorylierung an GSK3β auf 0,371 *gemessene durchschnittliche

Intensität] erhöht. Eine Inkubation der Zellen mit Metformin führt unabhängig von dessen

Konzentration zu keiner statistisch signifikanten Erhöhung der Serin-Phosphorylierung an

GSK3β (1mM Metformin 0,147; 2mM Metformin 0,12 gemessene durchschnittliche

Intensität). Eine kombinierte Inkubation mit 10-6M Insulin und 1mM Metformin bzw.

2mM Metformin führt zu einer Erhöhung der Serin-Phosphorylierung an GSK3β (10-6M

Insulin + 1mM Metformin: 0,43 gemessene durchschnittliche Intensität; 10-6M Insulin +

2mM Metformin: 0,457 gemessene durchschnittliche Intensität). Die Signale sind nicht

signifikant stärker als bei alleiniger Inkubation des Versuchsansatzes mit 10-6M Insulin.

Der PI3-Kinase-Inhibitor Wortmannin antagonisiert den Effekt von Insulin, so dass sich die

Signale nicht signifikant von denen der unbehandelten Probe unterscheiden.

Metformin hat keinen Effekt auf GSK3β an den untersuchten Stellen.

Insulin bewirkt eine Zunahme der Serin-Phosphorylierung der GSK3β an Serin 9 über

Akt/PKB. Eine Zunahme der Serin-Phosphorylierung in simultan mit Insulin und

Metformin inkubierten Zellen beruht einzig auf dem Effekt von Insulin.

GSK3β ist im phosphorylierten Zustand inaktiv. Dadurch wird die unterhalb gelegene

Glykogensynthase nicht phosphoryliert und bleibt damit aktiv.

Abb. 19: Phosphorylierungsstatus der Glykogen-Synthase-Kinase3β (GSK3β) an Serin 9. H4 II E Zellen wurden 12-

stündig in 10-6

M Insulin, 1mM und 2mM Metformin inkubiert. Wortmannin wurde bei einigen Proben einstündig

präinkubiert. Mittels Western Blot wurden Phospho GSK3β Serin 9 und Total GSKβ nachgewiesen. 100µg Protein

wurden je Spur aufgetragen.

76

5 Diskussion

5.1 Ergebnisdiskussion

Wichtigster Befund dieser Arbeit ist, dass Metformin die Promotoraktivität der Glukose-6-

Phosphatase konzentrationsabhängig hemmt. Passend zur Beeinflussung der Glukose-6-

Phosphatase-Promotoraktivität fanden wir auch eine metforminabhängige Reduktion der

Glukose-6-Phosphatase mRNA. Durch diese Beobachtungen lässt sich die Hauptwirkung

von Metformin, nämlich die Hemmung der hepatischen Glukoneogenese, im Zellmodell

erklären.

Dieser Befund, dass Metformin seine Effekte auf die hepatische Glukoneogenese

mitunter auf transkriptioneller Ebene auslöst, steht im Einklang mit früheren Befunden in

verschiedenen Zellkultur- und Tiermodellen [22, 42, 52, 65, 67], unter anderem von

Morioka et al. [41], die ebenfalls in H4-Zellen eine metforminabhängige Abnahme der

mRNA-Konzentration gezeigt haben. Allerdings wurde bisher noch nicht die Beeinflussung

des Glukose-6-Phosphatase-Promotors beschrieben.

Um zu überprüfen, ob sich das Ausmaß der Hemmung der hepatischen Glukoneogenese

durch Metformin oder Insulin unterscheidet, wurden parallel die Effekte von Insulin und

Metformin auf die Glukose-6-Phosphatase-Promotoraktivität untersucht. Dabei konnten

wir frühere Arbeiten bestätigen, dass auch Insulin die Glukose-6-Phosphatase-

Promotoraktivität beeinflusst [5]. Bei Verwendung beider Substanzen in maximaler

Konzentration war der Effekt von Insulin auf die Glukose-6-Phosphatase-

Promotoraktivität ca. 1,2-fach stärker als Metformin.

Um eine Insulinresistenz mit gesteigerter Glukose-6-Phosphatase-Promotoraktivität, wie

sie beim Typ-2-Diabetes vorkommt, zu simulieren, wurden H4-Zellen mit cAMP und

Dexamethason vorbehandelt und es wurden erneut die Effekte von Metformin und

Insulin verglichen. Dabei zeigte sich, dass bei derart angehobener Glukose-6-

Phosphatase-Promotoraktivität der hemmende Effekt von Metformin relativ zum

Ausgangswert deutlich stärker war und nun dem des Insulin glich.

77

In weiteren Experimenten wurden die Mechanismen der Metformin- bzw. Insulin-

bedingten Hemmung der Glukose-6-Phosphatase-Promotoraktivität untersucht.

Compound C, ein selektiver Hemmstoff der AMPK, reduzierte den Effekt von Metformin

und Insulin zu etwa 50 %, was eine Rolle der AMPK bei der Regulation der oben

genannten Promotoraktivität nahelegt. Wurde das gleiche Experiment nach

vorausgegangener Stimulation der Zellen mit cAMP und Dexamethason durchgeführt, war

Compound C deutlich weniger effektiv, den Insulineffekt auf die Glukose-6-Phosphatase-

Promotoraktivität zu antagonisieren, als den Metformineffekt. Dies könnte darauf

hinweisen, dass zumindest unter den Bedingungen einer erhöhten Glukose-6-

Phosphatase-Promotoraktivität die Metforminwirkung auf den Glukose-6-Phosphatase-

Promotor stärker AMPK-abhängig ist als die Insulinwirkung. Das AMP-Analogon AICAR,

ein AMPK-Aktivator, führte ebenfalls sowohl unter Normalbedingungen als auch unter

Bedingungen einer gesteigerten Glukose-6-Phosphatase-Promotoraktivität zu einer

Hemmung der Glukose-6-Phosphatase-Promotoraktivität. In beiden Fällen war es

möglich, den Effekt von AICAR durch Compound C vollständig zu antagonisieren, was

darauf hinweist, dass AICAR seine Effekte auf die Glukose-6-Phosphatase-

Promotoraktivität primär über AMPK vermittelt.

Um zu überprüfen, ob Insulin, Metformin und AICAR Einfluss auf die Threonin-

Phosphorylierung 172 an AMPK haben, die diese aktiviert, wurde dieses Signal im ELISA

und Western Blot gemessen. Dabei wurde festgestellt, dass Metformin und AICAR zu

einer stärkeren Zunahme der Phosphorylierung an AMPK Threonin 172 führen als Insulin.

Auch Insulin scheint AMPK über die Phosphorylierung an Threonin 172 zu aktivieren.

Hemmung der AMPK durch Compound C reduzierte die Threonin-Phosphorylierung 172

an AMPK signifikant in allen Versuchsbedingungen. Metformin, Insulin und AICAR

scheinen daher AMPK über die Phosphorylierung an Threonin 172 zu aktivieren und so

Effekte auf die hepatische Glukoneogenese auszuüben.

Um zu prüfen, wie Metformin den Glukose-6-Phosphatase-Promotor beeinflusst und ob

sich dies von Mechanismen des Insulins unterscheidet, wurden die Effekte von Metformin

und Insulin auf wichtige Schlüsselstellen der Insulinsignaltransduktion (Insulinrezeptor,

PKB/Akt, GSK3β) mittels ELISA und Western Blot verglichen. Dabei wurden klare Effekte

78

des Insulins auf die Aktivitäten und Phosphorylierungen dieser Signalproteine gefunden.

Metformin hatte keinerlei Effekt. So veränderte Metformin weder Phosphorylierungen an

Tyrosin 1162 und 1163 des Insulinrezeptors, die diesen aktivieren, noch konnten Einflüsse

von Metformin auf Phosphorylierung von Akt/PKB an Serin 473 festgestellt werden. Bei

Insulinstimulation erfolgt die Phosphorylierung an Serin 473 gemeinsam mit der

Phosphorylierung an Threonin 308 und ist Marker einer aktiven Akt/PKB. Schließlich

wurde auch die basale Phosphorylierung an Serin 9 der GSK3β von Metformin nicht

beeinflusst. Dieser Befund, dass Metformin die Insulinsignaltransduktion bis zur Ebene

der PKB/Akt nicht beeinflusst, steht im Einklang mit früheren Befunden an verschiedenen

Zellkulturmodellen [8, 28, 31, 36, 37], die ebenfalls keine Interaktionen von Metformin

mit Schritten der Insulinsignaltransduktion feststellten.

Andere Arbeiten unserer Arbeitsgruppe, die nicht Teil dieser Doktorarbeit sind, haben

herausgefunden, dass sowohl Insulin als auch AMPK den forkhead transcription factor

FKHR (FoxO1a), ein direktes Substrat der PKB, aus dem Zellkern exportieren und die

Transaktivierung des Glukose-6-Phosphatase-Promotors verringern. Dies weist darauf hin,

dass auf dieser Ebene die Signalwege von Insulin und Metformin im Hinblick auf die

Stimulation des Glukose-6-Phosphatase-Promotors zusammenkommen. Dabei ist die Art

und Weise, wie AMPK die FKHR Effekte vermittelt, noch weitgehend unklar.

Nach wie vor ist fraglich, wie Metformin AMPK aktiviert. Eine Hypothese ist, dass es über

die Hemmung des mitochondrialen Komplex 1 zu einer verminderten ATP-Synthese

kommt, was zu einem Anstieg des AMP/ATP-Quotienten führen und konsekutiv die AMPK

aktivieren würde [10, 23, 43, 53, 66]. Passend zu dieser Hypothese fanden wir einen

tendenziellen, allerdings nicht statistisch signifikanten Abfall des zellulären ATP-Gehaltes.

Dies deutet darauf hin, dass eine Hemmung des mitochondrialen Komplex 1 der

Atmungskette mit konsekutiver AMPK Aktivierung durchaus möglich ist, diese Hemmung

letztendlich jedoch nicht beweist. Somit kann leider auch diese Arbeit diese seit Jahren

diskutierte Frage nicht beantworten. Andererseits zeigen der fehlende bzw. geringe Abfall

des ATP sowie der fehlende Anstieg der Apoptoserate bei konstanter Zellzahl in

Gegenwart von Metformin, dass die in dieser Arbeit gemessenen Effekte des Metformin

nicht durch unspezifische Effekte auf die Viabilität der Zellen erfolgte. Andere Autoren

79

berichten hingegen über konstant bleibende zelluläre AMP- und ATP-Gehalte [14, 21]. Sie

geben keinen Wirkmechanismus an, argumentieren aber, dass Metformin weder zu

einem AMP-vergleichbaren Analogon metabolisiert wird, noch dass Metformin die AMPK

direkt reguliert. Auch eine Hemmung von Phosphatasen, die Phospho-AMPK Threonin

172 dephosphorylieren, konnte bisher nicht nachgewiesen werden [21, 52, 67]. Der

exakte Wirkmechanismus von Metformin auf die Atmungskette bleibt weiterhin

ungeklärt.

Zusammenfassend zeigen die hier erhobenen Daten, dass Metformin, wie Insulin, die

Glukose-6-Phosphatase-Promotoraktivität hemmt und vermutlich über diesen

Mechanismus die Glukose-6-Phosphatase-Aktivität reduziert und so die hepatische

Glukoseproduktion hemmt. Der Signalweg, über den Metformin die Glukose-6-

Phosphatase-Promotoraktivität hemmt, unterscheidet sich von dem des Insulin

dahingehend, dass zumindest die initialen Schritte der Insulinsignaltransduktion bis zur

Ebene der Akt/PKB durch Metformin nicht beeinflusst werden. Bekanntermaßen führen

allerdings sowohl Insulin als auch eine Steigerung der AMPK-Aktivität zu einem Export von

FKHR aus dem Zellkern und damit zu einer verminderten Transaktivierung des Glukose-6-

Phosphatase-Promotors. Auf dieser Stufe könnten somit die Signale zusammenlaufen, da

Metformin, wie in dieser Arbeit gezeigt, zu einer Stimulierung der AMPK führt. Eine

Steigerung der AMPK-Aktivität scheint entscheidend für die Hemmung der Glukose-6-

Phosphatase-Promotoraktivität durch Metformin zu sein. Ob diese Stimulation durch eine

Hemmung der ATP-Produktion erfolgt, konnte in dieser Arbeit letztendlich nicht geklärt

werden.

80

5.2 Grenzen und Einordnung

H4-Zellen zeichnen sich durch eine günstige Insulinempfindlichkeit und eine erhaltene

Regulation glukoneogener Gene aus. Sie sind deshalb hervorragend für die Untersuchung

insulinabhängiger Stoffwechselprozesse geeignet [33]. Eine Übertragung der Ergebnisse

auf den menschlichen Organismus ist aber nicht uneingeschränkt zulässig, weil

immortalisierte Rattenhepatomzellen mit Kälberserum in Kultur gehalten wurden und

parakrine Einflüsse des Organismus nicht auf die Zellen einwirken.

Weiterhin gelten die verwendeten Konzentrationen von Insulin, Metformin, AICAR,

Wortmannin, LY294002 und Compound C von der Literatur zwar als anerkannt, allerdings

ist die Übertragbarkeit dieser Konzentrationen außerhalb des verwendeten Zellmodells

nicht möglich.

PCR und real-time PCR reagieren sehr empfindlich auf Fremd-DNA und Verunreinigungen.

Sie können Messungen stören und verfälschen. Durch die Verwendung von speziell

ausgewiesenen DNA-, RNA-, DNAse- und RNAse-freien Reaktionsgefäßen, sowie eine

vorausgehende spezielle Reinigung der Arbeitsflächen wurde das Risiko einer

Kontamination so gering wie möglich gehalten. Zusätzlich wurden Positiv- und

Negativkontrollen in den Versuch integriert, um einen fehlerhaften Ablauf des Versuchs

zu bemerken.

Bei der Messung des zellulären ATP-Gehalts muss eine Kontamination mit ATPasen

bedacht werden. ATPasen sind überall vorhanden, besonders an menschlicher Haut. Um

deren Einfluss möglichst gering zu halten, wurden alle Arbeitsflächen vor

Versuchsdurchführung gründlich gereinigt und verwendete Handschuhe mehrfach

während des Versuchs gewechselt. Speziell als ATPasen-frei ausgewiesene

Reaktionsgefäße waren nicht vorhanden. Es wurden die bereits oben angegebenen DNA-,

RNA-, DNAse- und RNAse-freien Reaktionsgefäße verwendet. Ebenfalls wurden Positiv-

und Negativkontrollen in die Versuche integriert, um einen eventuell fehlerhaften Ablauf

des Versuchs zu bemerken.

81

Zur Apoptosedetektion wurde ein TUNEL Assay verwendet. Die Daten wurden nicht

durchflusszytometrisch gemessen, sondern fluoreszenzmikroskopisch. Es können dabei

nicht alle Zellen und Apoptosevorgänge detektiert werden. Nur eine Stichprobe von als

repräsentativ geltenden Gesichtsfeldern wurde zur Datenerhebung herangezogen. Diese

Form der Datenerhebung ist per se mit Fehlern behaftet. Fixationsbedingt kam es zu

Beschädigungen mit folgender Nekrose von Zellen.

Der verwendete Double-Antibody-Sandwich-ELISA zeichnet sich durch eine hohe

Sensitivität bei der Proteinmengendetektion aus. Wesentlicher Nachteil dieser Methode

ist die geringe Spezifität. Proteine mit ähnlichen Peptidsequenzen oder ähnlicher Affinität

zum Coating-Antikörper können kreuzreagieren und so das Messergebnis verfälschen. Um

die Möglichkeit dieses Fehlers auszuschließen, wurden zu allen durch ELISA

quantifizierten Versuchen Western Blots angefertigt, um spezifischen Proteinnachweis

mit sensitiver Proteinquantifizierung zu korrelieren.

82

6 Zusammenfassung

Problem:

Typ-2-Diabetes ist eine chronische Stoffwechselkrankheit, deren Auftreten mit dem

metabolischen Syndrom assoziiert ist. Obwohl in den meisten Leitlinien (u. a. auch der

Deutschen Diabetes Gesellschaft) Metformin Mittel der ersten Wahl zur Therapie des

Typ-2-Diabetes ist, ist der genaue Wirkmechanismus nicht bekannt. Metformin senkt in

vivo den Blutzuckerspiegel primär durch Hemmung der hepatischen Glukoneogenese.

Hypothese dieser Arbeit ist, dass Metformin über AMP-aktivierte Protein-Kinase (AMPK)

Anschluss an die Insulinsignaltransduktion haben und so die Glukose-6-Phosphatase

(G6Pase) auf Promotorebene beeinflussen könnte. Die Fragestellung lautet: Hat

Metformin einen sich vom Insulin unterscheidenden Effekt auf die Promotorebene der

G6Pase und wird dieser Effekt durch AMPK vermittelt? Nutzt Metformin Schritte der

Insulinsignaltransduktion zur Beeinflussung der G6Pase auf Promotorebene?

Methoden:

Im Zellmodell mit H4-Rattenhepatomzellen (Rattus norvegicus) wurden die Effekte von

Metformin und Insulin auf die hepatische Glukoneogenese gegenübergestellt. Die

G6Pase-Promotoraktivität wurde mittels Luciferase-Reporter-Assay, die G6Pase m-RNA

mittels real-time PCR quantifiziert. Um bei einzelnen Versuchen eine Insulinresistenz mit

gesteigerter G6Pase-Promotoraktivität, wie sie beim Typ-2-Diabetes vorkommt, zu

simulieren, wurden H4-Zellen mit cAMP und Dexamethason vorbehandelt. Um

auszuschließen, dass die Ergebnisse der G6Pase-Promotoraktivität durch unspezifische

Effekte auf die Viabilität der Zellen oder deren ATP-Spiegel erfolgten, wurden ATP-Gehalt

und Apoptose-Immunfluoreszenz gemessen. Schließlich wurden mit Western Blot und

ELISA Phosphorylierungen und Aktivitäten wichtiger an der Insulinsignaltransduktion

beteiligter Proteine gemessen.

83

Ergebnisse:

Sowohl Metformin als auch Insulin senkten konzentrationsabhängig die G6Pase-

Promotoraktivität. Dabei war bei jeweils maximaler Konzentration der Testsubstanzen der

Effekt von Insulin ca. 1,2-fach stärker als der des Metformin. Unter Bedingungen

gesteigerter G6Pase-Promotoraktivität verstärkte sich der Effekt von Metformin relativ

und glich dem des Insulin. Compound C, ein selektiver Hemmstoff der AMPK, reduzierte

den Effekt von Metformin und Insulin auf die G6Pase Promotoraktivität partiell, Effekte

von AICAR (AMP-Analogon) wurden vollständig antagonisiert. Unter Bedingungen

gesteigerter G6Pase-Promotoraktivität war Compound C weniger effektiv, den

Insulineffekt zu antagonisieren, als den Metformineffekt. Bei den untersuchten

Schaltstellen der Insulinsignaltransduktion wurde keine Aktivierung des Insulinrezeptors

(durch Phosphorylierung an Tyrosin 1162 und 1163), der Akt/PKB (durch

Phosphorylierung an Serin 473), der GSK3β (durch Phosphorylierung an Serin 9) durch

Metformin nachgewiesen. Der ATP-Gehalt sank in Abhängigkeit von Metformin

tendenziell, jedoch nicht signifikant ab. Der Apoptoseanstieg in Abhängigkeit von

Metformin war nicht signifikant.

Diskussion:

Wichtigster Befund dieser Arbeit ist, dass Metformin die Promotoraktivität der G6Pase

konzentrationsabhängig hemmt. Auch Insulin hemmt die G6Pase-Promotoraktivität, dies

sogar stärker als Metformin. Unter Bedingungen gesteigerter G6Pase-Promotoraktivität

verstärkt sich die Metforminwirkung relativ und ist mit der Wirkung von Insulin

vergleichbar. Dabei konnten wir zeigen, dass die Effekte von Metformin und Insulin auf

die G6Pase-Promotoraktivität teilweise durch Compound C antagonisiert werden und

damit eine Rolle der AMPK bei der Regulation der G6Pase-Promotoraktivität nahelegen.

Weiterhin stellten wir eine verstärkte Compound-C-Wirkung unter Bedingungen

gesteigerter G6Pase-Promotoraktivität in Abhängigkeit von Metformin, jedoch kaum von

Insulin fest. Dies weist darauf hin, dass unter Bedingungen erhöhter G6Pase-

Promotoraktivität die Metforminwirkung auf den G6Pase-Promotor stärker-AMPK

abhängig ist als die Insulinwirkung. In jedem Fall ist eine Steigerung der AMPK-Aktivität

entscheidend für die Hemmung des G6Pase-Promotors durch Metformin. Um zu prüfen,

wie Metformin den G6Pase-Promotor beeinflusst und ob sich dies von Mechanismen des

84

Insulin unterscheidet, wurden die Effekte von Metformin und Insulin auf wichtige

Schlüsselstellen der Insulinsignaltransduktion (Insulinrezeptor, PKB/Akt, GSK3β)

verglichen. Wir stellten dabei keine Interaktionen von Metformin mit den untersuchten

Schlüsselstellen fest. Der Signalweg, über den Metformin die G6Pase-Promotoraktivität

hemmt unterscheidet sich von dem des Insulin dahingehend, dass zumindest die initialen

Schritte der Insulinsignaltransduktion bis zur Akt/PKB durch Metformin nicht beeinflusst

werden. Andere Arbeiten unserer Arbeitsgruppe, die nicht Teil dieser Doktorarbeit sind,

zeigen, dass sowohl Insulin als auch AMPK den forkhead transcription factor FKHR, ein

direktes Substrat der PKB, aus dem Zellkern exportieren und die Transaktivierung des

G6ase-Promotors verringern. Auf dieser Stufe könnten somit die Signale

zusammenlaufen, da Metformin, wie in dieser Arbeit gezeigt, zu einer Stimulierung der

AMPK führt. Allerdings konnte nicht abschließend geklärt werden, wie es zur AMPK-

Aktivierung durch Metformin kommt. Am wahrscheinlichsten ist eine Hemmung des

Komplex 1 der Atmungskette mit daraus resultierendem Anstieg des AMP-Gehalts und

konsekutiver Aktivierung der AMPK. Diese führt zu einer Hemmung der G6Pase-

Promotoraktivität, welche eine Verminderung der G6Pase-Aktivität zur Folge hat. Eine

Hemmung der G6Pase-Aktivität dürfte in vivo den Effekt des Metformins auf die

hepatische Glukoseproduktion erklären. Hierauf deutet die ermittelte leicht absinkende

ATP-Konzentration ohne wesentlichen Anstieg der Apoptose hin, beweist es aber

letztendlich nicht.

85

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Danksagung

Herrn PD Dr. Andreas Barthel danke ich für die Überlassung des interessanten Themas,

seine stete Diskussionsbereitschaft und sein Interesse an der Thematik dieser Arbeit.

Herrn Prof. Dr. Klein danke ich für die Überlassung eines Arbeitsplatzes in seinem Labor

sowie sein Interesse an meinen Ergebnissen.

Herrn Dr. Konstantinos Manolopoulos danke ich für die ausgezeichnete Betreuung und

die anregenden Diskussionen.

Mein ganz besonderer Dank gilt Herrn Dr. Wolfgang Schechinger, der immer Zeit hatte,

sich aller Probleme rund um diese Dissertation anzunehmen. Ohne die stundenlangen

Diskussionen mit ihm und ohne seine kritischen Anmerkungen wäre es mir nicht möglich

gewesen, die Dissertation in dieser Form durchzuführen.

Weiterhin möchte ich mich ganz herzlich bei Frau Christine Fischer-Lahdo bedanken, die

mir erstklassige Unterstützung von der ersten Minute an hat zukommen lassen und mich

stets motiviert hat, das Ziel nicht aus den Augen zu lassen.

Bei Herrn Peter Korsten möchte ich mich für seine zahlreichen geopferten Wochenenden

bedanken, in denen er mit mir die real-time PCR am Universitätsklinikum Düsseldorf

durchgeführt hat.

Bei Herrn Dr. Zhou möchte ich mich für die technische Unterstützung für die Western

Blots bedanken.

Außerdem danke ich meiner Familie und meinen Freunden, die für mich auch in

schwierigen Situationen Verständnis zeigten und mich unterstützten.

Lebenslauf

Persönliche Angaben

Name Christoph Alexander Mues

Geburtsdatum/-ort 04.10.1982 in Krefeld

Staatsangehörigkeit deutsch

Schullaufbahn

08/1989 – 07/1993 Gerhard-Hauptmann Grundschule in Duisburg

08/1993 – 06/2002 Albert-Einstein-Gymnasium in Duisburg

Abschluss: allgemeine Hochschulreife

Studium

10/2003 – 12/2009 Humanmedizin, Ruhr-Universität-Bochum

09/2005 1. Abschnitt der ärztlichen Prüfung

08/2008 – 07/2009 Praktisches Jahr

12/2009 2. Abschnitt der ärztlichen Prüfung

Praktisches Jahr

Innere Medizin: Bergmannsheil Bochum

Universitätsklinikum der Ruhr-Universität-Bochum

Chirurgie: Bergmannsheil Bochum


Anästhesiologie: Bergmannsheil Bochum


Ärztliche Tätigkeit

seit 01/2010 Assistenzarzt in der medizinischen Klinik I − Kardiologie,

Pneumologie und Angiologie; Universitätsklinikum RWTH

Aachen

Praktische Erfahrung

10/2002 – 07/2003 Wehrersatzdienst:

Malteser-Hilfsdienst Krefeld

(Krankentransport/Rettungsdienst)

09/2003 – 10/2007 Tätigkeit im Krankentransport beim MHD Ratingen (stud.

Hilfskraft)

10/2004 – 02/2005 Vorpräparand der Anatomie, Ruhr-Uni-Bochum

10/2002 – 10/2007 ehrenamtliche Tätigkeit in der Sondereinsatzgruppe (SEG)

MHD Krefeld

Wissenschaftliche Arbeit

03/2006 – 08/2009 aktives Mitglied der endokrinologischen Forschungsgruppe,

Bergmannsheil Bochum, Medizinische Klinik 1,


07/2009 Publikation in der Zeitschrift „Hormone and Metabolic

Research“, Thieme : Mues C, Zhou J, Manolopoulos K,

Korsten P, Schmoll D, Klotz LO, Bornstein SR, Klein HH,

Barthel A; Regulation of Glucose-6-phosphatase Gene

Expression by Insulin and Metformin

Zusatzqualifikationen

10/2002 Ausbildung zum Rettungshelfer beim MHD Krefeld

09/2003 Ausbildung zum Rettungssanitäter beim MHD Aachen

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