Charakterisierung der Ca -abhängigen Proteinkinase LeCPK1 · kurzer Zeit anschwellen und so eine...

Charakterisierung der

Ca2+-abhängigen Proteinkinase LeCPK1

aus Lycopersicon esculentum

Institut für Pflanzenwissenschaften der ETH ZürichBiochemie und Physiologie der Pflanzen

Prof. Dr. N. Amrhein

Betreuer:Dr. Andreas Schaller

Diplomarbeitvon Frank Rutschmann

Zürich, im April 2001

II

ZUSAMMENFASSUNG

Die Calcium-abhängige Proteinkinase LeCPK1 aus Lycopersicon esculentum und zwei C-

terminale Teilpeptide der Plasmamembran-H+-ATPase PMA2 von Nicotiana plumbaginifolia

wurden als GST-Fusionsproteine heterolog in E. coli exprimiert und anschliessend durch spezi-

fische Bindung an eine Glutathion Sepharose-Matrix aus bakteriellen Extrakten gereinigt. Die

C-Termini der Plasmamembran-H+-ATPase wurden in vitro durch die LeCPK1 phosphoryliert.

Diese Phosphorylierungen waren Ca2+-abhängig und fanden an den C-Termini selbst statt und

nicht am GST-Anteil der Fusionsproteine. Sie wurden durch die allgemeinen Proteinkinase-

Inhibitoren Staurosporin und K-252a, nicht aber durch KN-62 und Bisindolmaleimid unter-

drückt. Bei der Phosphorylierung von Plasmamembran-Vesikeln durch die LeCPK1 konnte

weder eine Aktivierung noch eine Inaktivierung der H+-ATPase nachgewiesen werden.

Ferner wurde die Bindung von Ca2+ an die LeCPK1 mittels Fluoreszenz-Spektrometrie unter-

sucht, wobei sich hochaffine (Kd = 0.6 µM) und niedrigaffine (Kd = 55 µM) Bindestellen unter-

scheiden liessen. Durch Expression der Proteinkinase in einem in vitro Transkriptions-

/Translationssystem wurde gezeigt, dass die LeCPK1, nicht aber eine Gly2Ala-Mutante des

Enzyms N-terminal myristoyliert wird. Die Myristoylierung erwies sich als notwendig für eine

Lokalisation der LeCPK1 an der Plasmamembran. So liess sich die mit dem "Enhanced Green

Fluorescent Protein" fusionierte und in Allium cepa oder Lycopersicon peruvianum exprimierte

LeCPK1 im Bereich der Plasmamembran nachweisen, während die nicht-myristoylierte

Gly2Ala-Mutante im Cytosol und im Kern vorzufinden war.

III

INHALTSVERZEICHNIS

I. Einleitung

1.1 Die Plasmamembran-H+-ATPase 1

1.2 Regulation der Plasmamembran-H+-ATPase 4

1.2.1 Die H+-ATPase wird durch die Bindung von 14-3-3-Proteinen aktiviert 41.2.2 Auch Lysophosphatidylcholin aktiviert die Plasmamembran-H+-ATPase 61.2.3 Die H+-ATPase wird durch Phosphorylierung auch deaktiviert 71.2.4 Hypothetisches Modell der Regulation der H+-ATPase 7

1.3 Die Rolle von Ca2+-abhängigen Proteinkinasen für die Phosphorylierung 9der Plasmamembran-H+-ATPase

1.4 Vorausgehende Arbeiten und Zielsetzung 12

II. Materialien und Methoden

2.1 Pflanzen, Bakterienstämme und Vektoren 13

2.2 Medien 15

2.3 Chemikalien

2.3.1 PCR, Plasmid-DNA-Isolierung und Agarosegel-Elektrophorese 172.3.2 DNA-Sequenzierung 182.3.3 Glutathion Sepharose-Affinitätschromatographie 182.3.4 SDS-PAGE 192.3.5 TRICIN-SDS-PAGE 202.3.6 Verschiedenes 21

2.4 Methoden

2.4.1 Expression und Isolierung der GST-Fusionsproteine in/aus E. coli 222.4.2 Reinigung der GST-Fusionsproteine 222.4.3 In vitro-Phosphorylierung der mit GST fusionierten C-Termini der H+-ATPase 232.4.4 In vitro-Phosphorylierung des C-Terminus der H+-ATPase (CT66) 242.4.5. Aktivitätsbestimmung der Plasmamembran-H+-ATPase 252.4.6 Amplifizierung der cDNAs CDPKwt und CDPKmut mittels PCR 262.4.7 Ligation der amplifizierten cDNAs in die Vektoren pBluescript SK(-) und pcl60 272.4.8 Transformation von kompetenten E. coli-Zellen 282.4.9 Isolierung von Plasmid-DNA (Mini Prep) aus E. coli 282.4.10 Analyse der Ligationsprodukte durch Restriktion der Plasmid-DNA 292.4.11 DNA-Sequenzanalyse 292.4.12 Amplifizierung und Isolierung der Konstrukte in/aus E. coli (Midi Prep) 292.4.13 In vitro-Transkription/Translation und Myristoylierung der LeCPK1 302.4.14 Transformation von Zwiebelepidermiszellen und transiente Expression 31

der Fusionsproteine CDPKwt-EGFP und CDPKmut-EGFP2.4.15 Transformation von Lycopersicon peruvianum-Suspensionskulturzellen und 32

transiente Expression der Fusionsproteine CDPKwt-EGFP und CDPKmut-EGFP2.4.16 Titration einer GST-CDPK-Lösung mit CaCl2 unter paralleler Aufnahme 33

des Fluoreszenz-Spektrums

IV

III. Resultate

3.1 Expression und Aufreinigung der GST-Fusionsproteine GST-CT56 und GST-CT66 34sowie des GST-Proteines selbst

3.2 In vitro-Phosphorylierung der Plasmamembran-H+-ATPase 37

3.3 Phosphorylierung des vom GST-Peptid abgetrennten C-Terminus der 39Plasmamembran-H+-ATPase

3.4 Die Wirkung von Proteinkinase-Inhibitoren auf die Phosphorylierung 41des C-Terminus der Plasmamembran-H+-ATPase

3.5 Der Einfluss einer Phosphorylierung der H+-ATPase auf die Aktivität der Protonenpumpe 44

3.6 In vitro-Transkription-/Translation und Myristoylierung der LeCPK1 48

3.7 Transiente Expression der Fusionsproteine CDPKwt-EGFP und CDPKmut-EGFP 52in Zwiebelepidermiszellen

3.8 Transiente Expression der Fusionsproteine CDPKwt-EGFP und CDPKmut-EGFP 55in Lycopersicon peruvianum-Zellen aus Suspensionskultur

3.9 Titration einer GST-CDPK-Lösung mit CaCl2 unter paralleler Aufnahme 57des Fluoreszenzspektrums

IV. Diskussion 59

4.1 Die Bindung von Calcium an die LeCPK1 60

4.2 Subzelluläre Lokalisation der LeCPK1 64

4.3 Phosphorylierung der Plasmamembran-H+-ATPase 68

4.4 Die Rolle der LeCPK1 in pflanzlichen Abwehrreaktionen 72

V. Literatur 74

VI. Anhang

6.1 Sequenz der LeCPK1-cDNA 81

6.2 Standardkurve für die Aktivitätsbestimmung der Plasmamembran-H+-ATPase 83

1. Einleitung Seite 1

I. EINLEITUNG

1.1 Die Plasmamembran-H+-ATPase

Die Plasmamembran-H+-ATPase spielt in der Physiologie von Planzen und Pilzen eine Schlüs-

selrolle. Sie gehört zu der grossen, ubiquitären Familie von P-Typ-ATPasen, welche Kationen

wie K+ und Na+ (Tiere), Cd2+ und Cu2+ (Bakterien) und Ca2+ (Pilze, Pflanzen, Tiere) durch

Zellmembranen transportieren (Palmgren et al., 1998). Die Plasmamembran-H+-ATPase von

Pflanzen und Pilzen koppelt die Hydrolyse von ATP mit dem Protonentransport durch die

Plasmamembran. Ein solcher Transport verursacht sowohl eine pH-Differenz (? pH) als auch

eine Membranpotentialdifferenz (? E), welche beide Komponenten der protonenmotorischen

Kraft (proton motive force, pmf oder ? p) darstellen. Dieser elektrochemische Gradient treibt

dann sekundär aktivierte Transporter an, welche Ionen oder andere Verbindungen entgegen

ihres Konzentrationsgradienten durch die Membran transportieren.

Solche Transporter sind entweder Kanäle, welche mit grosser Geschwindigkeit Ionen befördern

und deren Öffnung häufig durch das Membranpotential reguliert wird. Oder es sind Carrier,

welche selektiv Makromoleküle und organische Verbindungen wie Zucker oder Aminosäuren

im Uniport, Symport oder Antiport mit Protonen durch die Membran schleusen (Ward et al.,

1998). Die beschriebenen Transportvorgänge bilden die Grundlage von vielen adaptiven Vor-

gängen in Pflanzen gegenüber sich verändernden Umweltbedingungen.

So transportieren zum Beispiel Pflanzen mit hoher Salztoleranz überschüssiges cytosolisches

Na+ durch einen Na+/H+-Antiport entweder in die Vakuole oder ganz aus der Zelle heraus (Niu

et al., 1995). Auch die Regulation des Turgordrucks (Osmoregulation) wird durch eine sekun-

där aktive Aufnahme von Ionen in die Zelle ermöglicht, angetrieben durch den von der Plas-

mamembran-H+-ATPase aufrecht erhaltenen Protonengradienten. Die dadurch erzielte höhere

Salzkonzentration im Zellinnern bewirkt einen Wassereinstrom in die Zelle und einen Anstieg

des Zellturgors. Auf diese Weise können beispielsweise Schliesszellen von Spaltöffnungen in

kurzer Zeit anschwellen und so eine Öffnung der Stomata bewirken (MacRobbie, 1998). Durch

Veränderung des Zellturgors werden auch Blattbewegungen (Ausrichtung der Blattflächen

nach der Sonne oder seismonastische Reaktionen, z.B. bei Mimosa pudica) möglich.


Eine weitere Rolle der Plasmamembran-H+-ATPase liegt in der Zellexpansion. Gemäss der

Säurewachstums-Theorie wird nach einem Auxin-Stimulus durch eine Ansäuerung des

Apoplasten die Zellwand plastisch verformbar und es kommt aufgrund des Turgordruckes zu

einer Zunahme des Zellvolumens. An diesen Vorgängen ist die Plasmamembran-H+-ATPase

mitbeteiligt (Cosgrove, 1997). In welcher Weise Auxin aber dieses Säurewachstum initiiert und

über welche Transduktionswege die "Wachstumssignale" vermittelt werden, ist noch unbe-

kannt.

Die Plasmamembran-H+-ATPase ist ein integrales Membranprotein, dessen Monomer aus zehn

Transmembranhelices und vier cytoplasmatischen Bereichen besteht (Abb. 1). Sowohl der C-,

als auch der N-Terminus liegen auf der cytoplasmatischen Seite (Auer et al., 1998). Obwohl

die Quartärstruktur noch nicht aufgeklärt wurde, geht man davon aus, dass das Protein haupt-

sächlich als Dimer vorkommt (Bowman et al., 1985), wobei aber bereits das Monomer mit ei-

ner Masse von ca. 100 kDa katalytisch aktiv ist (Goormaghtigh et al., 1986). Der Mechanismus

des Protonentransportes ist bislang unbekannt. Durch Mutantenanalysen weiss man aber, dass

die kleine cytoplasmatische Schleife (Abb. 1) für die Kopplung der ATP-Hydrolyse mit dem

Protonentransport verantwortlich ist (Wach et al., 1996). Der grosse cytoplasmatische Loop

enthält einen für P-Typ-ATPasen typischen Aspartat-Rest (Asp536 in Abb. 1), welcher während

des katalytischen Zyklus phosphoryliert wird. Ausserdem befindet sich dort auch die ATP-

bindende Region (Pardo und Slayman, 1988). Während über die Funktion der N-terminalen

Region wenig bekannt ist, weiss man, dass die C-terminale Region als autoinhibitorische Do-

mäne und dadurch als wichtiger Regulator der Plasmamembran-H+-ATPase wirkt (Palmgren et

al., 1990).


Abb. 1: Struktur der Plasmamembran-H+-ATPasen PMA1 von Saccharomyces cerevisiae und PMA2 vonNicotiana plumbaginifolia.

Die Funktion der durch Dreiecke und Kreise hervorgehobenen Aminosäuren wurde durch zielgerichtete Mutatio-nen untersucht, die zum Austausch bzw. zur Deletion dieser Aminosäuren führten. Die in Quadern angegebenenAminosäuren sind konserviert und beiden Protonenpumpen gemeinsam (nach Portillo, 2000; Morsomme undBoutry, 2000; Morsomme et al., 2000)..A: Kleine cytosolische Schleife; hier findet u.a. die Kopplung der ATP-Hydrolyse mit dem H+-Transport statt.B: Grosse cytosolische Schleife; an dieser katalytische Domäne wird ATP gebunden und hydrolysiert. Dabei bil-det Asp536 das für P-Typ-ATPasen typische intermediäre Aspartyl-Phosphat.C: C-terminale Domäne; besitzt autoinhibitorische, regulatorische Funktionen und kann 14-3-3-Proteine binden.N: N-terminale Domäne; besitzt regulatorische, noch weitgehend unverstandene Funktionen.

Das Enzym verwendet als Substrat MgATP, dessen Hydrolyse eng mit dem Protonentransport

verknüpft ist. Die meisten Isoformen des Proteins arbeiten optimal bei einem pH von 6.6 und

besitzen eine spezifische Aktivität in gereinigten Plasmamembranen von 1 bis 2 µmol Pi

/min/mg. Der Km-Wert für MgATP variiert zwischen 0.3 und 1.4 mM (Vara und Serrano,

1982).

Die Plasmamembran-H+-ATPase wird von einer Multigenfamilie codiert. So wurden u.a. in

Arabidopsis thaliana zwölf Gene identifiziert, in Nicotiana plumbaginifolia neun und in Ly-

copersicon esculentum sieben. Die codierenden Sequenzen können in zwei Subfamilien einge-

teilt werden, deren Trennung schon vor der evolutiven Aufspaltung der Samenpflanzen in Mo-

nocotyledonen und Dicotyledonen erfolgte (Moriau et al., 1993).

A

B

zielgerichtete Mutationenbei der PMA2 vonNicotiana plumbaginifolia

zielgerichtete Mutationenbei der PMA1 vonSaccharomyces cerevisiae


Die einzelnen Isoenzyme der H+-ATPase werden in der Pflanze je nach Zelltyp, Gewebe, Ent-

wicklungsstadium und Umweltbedingungen differenziell exprimiert, wobei verschiedene Iso-

formen in der gleichen Zelle koexistieren können. Northern Blots, in situ-Hybridisierungen

und Untersuchungen mit Antikörpern zeigten, dass Plasmamembran-H+-ATPasen u.a. in Wur-

zelhaaren, der Wurzelhaube, in der Blatt-Epidermis, in Schliesszellen, im Leitgewebe, in Pol-

lenkörnern, im Tapetum der Antheren und in sich entwickelnden Samen vorkommen, wobei es

lokal zu starken Anhäufungen kommen kann (Morsomme und Boutry, 2000).

1.2 Regulation der Plasmamembran-H+-ATPase

Wie schon erwähnt, kann die Expression der Plasmamembran-H+-ATPase abhängig von Zell-

typ, Gewebe, Entwicklungsstadium und Umweltbedingungen stark variieren, sowohl in der

Menge translatierten Proteins als auch in der Zusammensetzung der exprimierten Isoformen.

Zusätzlich zur transkriptionellen und posttranslationellen Regulation besteht eine weitere Mög-

lichkeit der Regulation in der Steuerung der Aktivität bereits vorhandener Enzyme.

1.2.1 Die Plasmamembran-H+-ATPase wird durch die Bindung von 14-3-3-Proteinenaktiviert

Die Plasmamembran-H+-ATPase besitzt eine C-terminale Region (Abb. 1), welche das Enzym

autoinhibieren kann. Entfernt man z.B. die letzten 51 Aminosäuren des C-Terminus der H+-

ATPase AHA2 von Arabidopsis thaliana durch Trypsinbehandlung oder durch genetische De-

letion, so steigt die katalytische Effizienz, d.h. der Km-Wert für das Substrat MgATP sinkt und

vmax nimmt zu (Palmgren et al., 1990). Ferner wurde festgestellt, dass es zu einer Steigerung

der H+-ATPase-Aktivität nach Bindung von 14-3-3-Proteinen kommt (Oecking et al., 1997;

Jahn et al., 1997). Erst kürzlich wurde gezeigt, dass diese 14-3-3-Proteine direkt an die C-

terminale Region binden, und zwar an die zweitletzte, in allen H+-ATPasen konservierte Ami-

nosäure, das Threonin947 der H+-ATPase PMA2 von Nicotiana plumbaginifolia (Svennelid et

al., 1999; Maudoux et al., 2000).


14-3-3-Proteine sind hochkonservierte, ubiquitär in eukaryotischen Zellen vorhandene Proteine,

welche andere Enzyme und Transkriptionsfaktoren in ihrer Aktivität modulieren können (Fin-

nie et al., 1999). Für die Interaktion mit 14-3-3-Proteinen haben sich wenige Konsensus-

Motive als wichtig erwiesen, in welchen sich oft phosphorylierte Aminosäuren befinden (Fin-

nie et al., 1999; Moorhead et al., 1999). 14-3-3 Proteine treten meist als Dimere auf und kön-

nen so zwei Zielmoleküle gleichzeitig binden und diese durch Assoziation regulieren.

Das Bindungsmotiv für 14-3-3-Proteine am C-Terminus der Plasmamembran-H+-ATPase

PMA2 von Nicotiana plumbaginifolia lautet ...QQxYTV (Abb. 27 auf Seite 69). Eine 14-3-3-

Bindung an diese Domäne ist nur dann möglich, wenn das hervorgehobene Threonin phospho-

ryliert vorliegt (Camoni et al., 1999; Svennelid et al., 1999; Fuglsang et al., 1999). Es zeigte

sich aber, dass in Anwesenheit von Fusicoccin (einem Toxin des Pilzes Fusarium amygdalii)

eine Phosphorylierung des Threonins für eine 14-3-3-Protein-Bindung an den C-Terminus nicht

notwendig ist, da Fusicoccin den 14-3-3-Protein-H+-ATPase-Komplex offenbar genügend sta-

bilisiert. Allerdings kann eine solche phosphorylierungs-unabhängige 14-3-3-Bindung durch

ein kompetitierendes, ATPase-ähnliches Peptid viel leichter verhindert werden, als wenn das

Threonin phosphoryliert vorliegt (Svennelid et al., 1999). Nach gegenwärtiger Vorstellung

macht die Plasmamembran-H+-ATPase nach Bindung eines oder mehrerer 14-3-3-Proteine an

ihren C-Terminus eine Konformationsänderung durch, durch die es zur Aktivierung des En-

zyms kommt (Abb. 2).

Kürzlich ist allerdings gezeigt worden, dass sich die beiden Subfamilien von pflanzlichen

Plasmamembran-H+-ATPasen hinsichtlich dieser C-terminalen Regulation unterscheiden

könnten. Während die zur Subfamilie I gehörende Isoform PMA2 aus Nicotiana plumbaginifo-

lia dem obigen Regulationsmechanismus unterworfen ist, wird die PMA4 aus Nicotiana plum-

baginifolia, welche der Subfamilie II angehört, am zweitletzen, C-terminalen Threonin nur

schwach phosphoryliert und in ihrer Aktiviät nur geringfügig moduliert. Ausschlaggebend für

diese differenzielle Regulation ist der viertletzte, konservierte Aminosäure-Rest am C-Termi-

nus, der bei der H+-ATPasen der Subfamilie I ein Serin, bei jenen der Subfamilie II aber ein

Histidin darstellt (Damly und Boutry, 2001).


Abb. 2: Modell der Aktivierung von H+-ATPasen durch Fusicoccin (Oecking et al.,1997).

A: Zwei Plasmamembran-H+-ATPasen asso-ziieren und bilden ein aktives Dimer.Die Aktivität der H+-Pumpe wird durch denautoinhibitorischen Effekt der C-Termini aberlimitiert.

B: 14-3-3-Protein-Dimere binden an die au-toinhibitorischen C-Termini der H+-ATPasenund bilden einen transienten Komplex, andem möglicherweise noch weitere Proteinebeteiligt sind. Dadurch wird die Aktivität desEnzyms erhöht.

C: Fusicoccin-Bindung stabilisiert den Kom-plex und hält die H+-ATPase im aktiven Zu-stand.

(Taiz und Zeiger, 1998)

1.2.2 Auch Lysophosphatidylcholin aktiviert die Plasmamembran-H+-ATPase

Es wurde gezeigt, dass auch Lysophosphatidylcholin (LPC) die H+-ATPase aktivieren kann

(Pedchenko et al., 1990; Palmgren et al., 1991). Die Bindestelle der H+-ATPase für LPC

konnte aber bisher noch nicht ermittelt werden (Gomes et al., 1996; Morsomme et al., 1998).

Lysophosphatidylcholin (LPC) entsteht durch die Spaltung von Phosphatidylcholin in LPC und

freie Fettsäuren. Diese Reaktion wird durch das in Pflanzen vorhandene Enzym Phospholipase

A2 katalysiert. Die Phospholipase A2 (PLA2) ist bekannt als ein wichtiger Regulator in tieri-

schen Systemen, der unter anderem den ersten Schritt der Eicosanoid-Biosynthese katalysiert.

In Pflanzen wird eine Beteiligung der PLA2 an Wundabwehr-Reaktionen postuliert (Narvaez-


Vasquez et al., 1999). Das Enzym könnte via LPC als second messenger auch an der Regulati-

on der H+-ATPase beteiligt sein.

1.2.3 Die Plasmamembran-H+-ATPase wird durch Phosphorylierung auch deaktiviert

Im Gegensatz zu den bisher erwähnten Resultaten gibt es auch einige Experimente, welche

zeigen, dass eine Phosphorylierung der Plasmamembran-H+-ATPase nicht zu einer Aktivie-

rung, sondern zu einer Inaktivierung der Protonenpumpe führen kann.

Schon 1988 wurde gezeigt, dass eine Plasmamembran-H+-ATPase aus Wurzelzellen von Avena

sativa an Serin- und Threonin-Resten calciumabhängig phosphoryliert wird (Schaller und

Sussman, 1988). Ausserdem wurde gezeigt, dass eine H+-ATPase von Lycopersicon esculen-

tum von einer membrangebundenen Phosphatase dephosphoryliert und dadurch aktiviert wer-

den kann. Diese Aktivierung erfolgte in Abhängigkeit eines Elicitors von Cladosporium ful-

vum. Nach Entfernen des pilzlichen Elicitors nahm die H+-ATPase-Aktivität wieder ab in Ab-

hängigkeit einer Rephosphorylierung, welche durch verschiedene Proteinkinasen in zwei

Schritten durchgeführt wurde. Am ersten Phosphorylierungsschritt ist vermutlich eine Protein-

kinase C-ähnliche Kinase, am zweiten eine Ca2+/Calmodulin-abhängige Proteinkinase (CaM-

KII oder CCaMK) beteiligt, wobei der zweite Schritt nicht ohne vorausgegangenen ersten

Schritt ablaufen kann (Xing et al., 1996). Auch in vitro-Experimente mit Membranfraktionen

aus Nicotiana plumbaginifolia (Desbrosses et al., 1998) und mit rekonstituierten Proteoliposo-

men aus Beta vulgaris (Lino et al., 1998) zeigten, dass eine Dephosphorylierung die Plasma-

membran-H+-ATPase aktivieren kann, während eine Ca2+-abhängige Phosphorylierung das

Enzym deaktiviert.

1.2.4 Hypothetisches Modell der Regulation der H+-ATPase

Wie oben dargestellt wurde, kann eine Phosphorylierung der H+-ATPase sowohl zu einer Stei-

gerung, als auch zu einer Verminderung der protonen-pumpenden Aktivität des Enzyms führen.

Nach Morsomme (2000) hat die H+-ATPase in nicht-phosphoryliertem Zustand eine geringe

Grundaktivität (Abb. 3a), die durch Phosphorylierung ausserhalb des C-Terminus weiter ver-

mindert wird (Abb. 3b). C-terminale Phosphorylierung des Enyzms hingegen ermöglicht die

Bindung von 14-3-3-Proteinen sowie Dimerisierung und resultiert in einer Aktivierung der H+-


Pumpe (Abb. 3c). Weitere Phosphorylierung des C-Terminus hat möglicherweise eine Disso-

ziation der 14-3-3-Proteine zur Folge (C. Oecking, Bochum, pers. Mitteilung).

Abb. 3: Hypothetisches Modell der Regulation der Plasma-membran- H+-ATPase (Morsomme und Boutry, 2000).

A: Im nicht-phosphorylierten Zustand besitzt die Plasmamem-bran-H+-ATPase eine niedrige Grundaktivität.

B: Phosphorylierung der Plasmamembran-H+-ATPase an einerbisher nicht ermittelten Stelle ausserhalb des C-Terminus (alsrotes Viereck dargestellt) führt zur Inaktivierung der Protonen-pumpe.

C: Phosphorylierung an der zweitletzten Aminosäure des C-Terminus ermöglicht die Bindung eines 14-3-3-Protein-Dimers und führt zur Aktivierung des Enzyms. Eine vergleich-bar starke Aktivierung wie durch 14-3-3-Proteine ist auchdurch Bindung von Lysophosphatidylcholin (LPC, als Dreieckdargestellt) an einer unbekannten Stelle (evtl. ausserhalb desC-Terminus) möglich.

Der hier orangefarben dargestellte Abschnitt des C-Terminusist für die Autoinhibierung der Protonenpumpe durch Bindungan die katalytische Domäne verantwortlich, während der blaumarkierte Bereich das 14-3-3-Dimer binden kann.

C

A

B


1.3 Die Rolle von Ca2+-abhängigen Proteinkinasen für die Phosphorylierungder Plasmamembran-H+-ATPase

Viele der oben beschriebenen Phosphorylierungen der Plasmamembran-H+-ATPase sind Ca2+-

abhängig. Durch Einsatz von spezifischen Inhibitoren kann der Typ der beteiligten Kinase be-

stimmt werden. So wurde kürzlich eine Plasmamembran-assoziierte Proteinkinase aus Wurzel-

zellen von Zea mays gereinigt und festgestellt, dass sie eine Ca2+-abhängige Aktivität aufwies.

Das Enzym war in der Lage, die Plasmamembran-H+-ATPase in vitro am C-Terminus zu phos-

phorylieren (Camoni et al., 1998). Die Kinase konnte durch Calmodulin nicht aktiviert, aber

durch Calmodulin-Antagonisten inhibiert werden. Diese Eigenschaften sind typisch für eine

Ca2+-abhängige Proteinkinase (Ca2+-dependent protein kinase, auch calmodulin-like domain

protein kinase genannt).

Ca2+-abhängige Proteinkinasen (CDPKs) sind Enzyme, die bisher nur in Pflanzen und Protozo-

en, nicht aber in Hefen oder im Tierreich gefunden wurden (Hunter und Plowman, 1997). Sie

sind die einzigen pflanzlichen Proteinkinasen, die durch Ca2+ direkt aktiviert werden. Es exi-

stieren zahlreiche Isoformen des Enzyms (alleine in Arabidopsis thaliana sind es 39), welche in

bisher sieben Subfamilien eingeteilt werden (Satterlee und Sussman, 1998; Harmon et al.,

2000). Die CDPKs besitzen eine katalytische Domäne mit Serin/Threonin-Proteinkinase-

Aktivität (Stone und Walker, 1995). Diese katalytische Domäne wird in Abwesenheit von Ca2+

durch eine autoinhibitorische Domäne inaktiviert. Eine benachbarte Calmodulin-ähnliche Do-

mäne enthält bis zu vier EF-Hand-Motive und ist damit fähig, freie Ca2+-Ionen zu binden (Abb.

4). Es wird postuliert, dass durch diese Ca2+-Bindung die Calmodulin-ähnliche Domäne eine

unmittelbar benachbarte Region der autoinhibitorischen Domäne binden kann, wodurch das

Enzym aktiviert wird (Binder et al., 1994; Harmon et al., 1994; Yoo und Harmon, 1996).

Eine weitere, variable Domäne unbekannter Funktion am N-Terminus enthält bei den meisten

CDPK-Isoformen ein N-Myristoylierungs-Motiv. An ein Glycin, das Teil dieses Motives ist,

wird während der Translation Myristinsäure (eine gesättigte C14-Fettsäure) kovalent über eine

Peptidbindung gebunden (Russell et al., 1994). Diese Modifizierung vergrössert die Hydropho-

bizität des N-Terminus und könnte zusammen mit weiteren posttranslationellen Änderungen

(siehe Abschnitt 4.2) zur Verankerung der CDPK in Zellmembranen führen (Yalovsky et al.,

1999). Tatsächlich wurden schon CDPKs von Hordeum vulgare (Klimczak und Hind, 1990),

Avena sativa (Schaller et al., 1992), Nicotiana plumbaginifolia (Iwata et al., 1998) und Oryza

sativa (Martin und Busconi, 2000) aus Plasmamembran-Fraktionen gereinigt.


Zu den bisher identifizierten membranständigen Substraten der CDPKs gehören u.a. die schon

erwähnte Plasmamembran-H+-ATPase von Avena sativa (Schaller und Sussman, 1988) und

Zea mays (Camoni et al., 1998), ein Tonoplasten-Wasserkanal (a-TIP) von Arabidopsis thalia-

na (Johnson und Chrispeels, 1992), ein Vakuolen-Chlorid-Kanal in Schliesszellen von Vicia

faba (Pei et al., 1996), eine Ca2+-Pumpe (ACA2) in der ER-Membran von Arabidopsis thaliana

(Hwang et al., 2000) und Nodulin-26, ein integraler Membrantransporter in der Peribakteroid-

Membran von N-fixierenden Bakterien in Wurzelknöllchen von Glycine maximus (Weaver et

al., 1991). Zwei gut charakterisierte cytosolische Substrate sind die Nitrat-Reduktase (Douglas

et al., 1998) und die Sucrosephosphat-Synthase (McMichael, 1995) aus Blättern von Spinacea

oleracea. Beide Substrate können durch dieselbe CDPK (AtCPK3 aus Arabidopsis thaliana)

phosphoryliert und damit inaktiviert werden (McMichael, 1995). Es ist also denkbar, dass eine

einzige CDPK diese zwei wichtigen Schlüsselenzyme reguliert. Allerdings lassen die vielen

existierenden Isoformen in ein und derselben Pflanze auf indivuelle Rollen der einzelnen

CDPKs in verschiedenen Signaltransduktions-Kaskaden schliessen (Harmon et al., 2000).


1 MGGCFSKKYT QQDANGHRAG RRVNQAYQKP PQPQPERPYQ PQPQQERPYQ

51 PPPQPAYQPP PQPKPQPQPH PVPVTVQSGQ PQDQMQGPHM NNILGKPFEE

101 IRKLYTLGKE LGRGQFGVTY YCTENSTGNP YACKSILKRK LVSKNDREDM

151 KREIQIMQHL SGQPNIVEFK GAYEDRQSVH LVMELCAGGE LFDRIIARGY

201 YSEKDAAEII RQIVNVVNIC HFMGVMHRDL KPENFLLTSK DENAMLKATD

251 FGLSVFIEEG KVYRDIVGSA YYVAPEVLRR SYGKEADVWS AGVILYILLS

301 GVPPFWAETE KGIFNTILKG EIDFQSDPWP SISNSAKDLI RKMLTQEPRK

351 RITSAQVLEH PWLRLGEASD KPIDSAVLSR MKQFRAMNKL KKLALKVIAE

401 NLSEEEIKGL KAMFHNIDTD NSGTITYEEL KSGLARLGSK LTETEVKQLM

451 EAADVDGNGS IDYIEFITAT MHRHRLERDE HLFKAFQHFD KDHSGFITRD

501 ELENAMKEYG MGDEATIKEI IAEVDTDNDG RINYEEFCAM MRSGTTQPQQ

551 KLF

Abb. 4: Die Aminosäuresequenz der LeCPK1 aus Lycopersicon esculentum. Die verschiedenen Funktionen dermarkierten Domänen werden im Text näher erläutert. Die Position der durch Fettdruck hervorgehobenen Trypto-phan-Reste innerhalb der dreidimensionalen Struktur der LeCPK1 wirkt sich auf die im Abschnitt 3.9 gemesseneFluoreszenz der Proteinlösung aus.

Variable Domäne

Katalytische Domäne

Autoinhibitorische Domäne

EF-Hand

EF-HandEF-Hand

EF-Hand


1.4 Vorausgehende Arbeiten und Zielsetzung

Im Rahmen der dieser Arbeit vorausgehenden Diplomarbeit (Stalder, 2000) wurde eine CDPK

aus einer cDNA-Bibliothek von Lycopersicon esculentum kloniert und sequenziert. Die

LeCPK1 benannte Kinase weist eine hohe Aminosäuresequenz-Ähnlichkeit (94 %) mit der

NtCPK1 aus Nicotiana tabacum (Yoon et al., 1999) auf. Sie besteht aus 553 Aminosäuren und

besitzt die klassischen Domänen einer CDPK, u.a. eine Ca2+-bindende Domäne mit vier Ca2+-

Bindestellen (Abb. 4). Eine Northern Blot-Analyse zeigte, dass das Protein vor allem in Wur-

zeln, Blüten und noch undifferenzierten Zellen exprimiert ist, aber auch in den Kotyledonen

und Blättern. Während eine Verwundung der Tomatenblätter zu keinem höheren LeCPK1-

Transkriptspiegel führte, induzierte eine Fusicoccin-Behandlung der Pflanzen nach vier Stun-

den eine maximale Akkumulation der Transkripte. Die LeCPK1-cDNA wurde als GST-

Fusionsprotein (GST-CDPK) in E. coli exprimiert und aus bakteriellen Extrakten gereinigt. Für

die GST-CDPK wurde Ca2+-Bindung an die C-terminale Domäne nachgewiesen. Die Protein-

kinase zeigte Ca2+-abhängige Autophosphorylierung an Serin- und Threonin-Resten und für die

Phosphorylierung des synthetischen Peptids Syntide-2 wurde ein Km-Wert zwischen 82 und 89

µM ermittelt.

Im Rahmen der vorliegenden Diplomarbeit sollte die Bindung von Ca2+ an die LeCPK1 cha-

rakterisiert werden. Ferner sollte geprüft werden, ob die Proteinkinase myristoyliert wird und

inwiefern sich dies auf die intrazelluläre Lokalisation des Proteins auswirkt. Ausserdem sollte

untersucht werden, ob die Plasmamembran-H+-ATPase ein Substrat der LeCPK1 ist und ob

eine mögliche Phosphorylierung sich auf die Aktivität der Protonenpumpe auswirkt.

2. Material und Methoden Seite 13

II. MATERIALIEN UND METHODEN

2.1 Pflanzen, Bakterienstämme und Vektoren

Lycopersicon peruvianum Suspensionskultur in Nover-Medium (zur Verfügung ge-stellt von D. Frasson, ETH Zürich).Die Kulturen wurden wöchentlich passagiert und am Tagder Passage aufgearbeitet.

Allium cepa Küchenzwiebel (COOP, Zürich)

E. coli K12 PR745 Expressions-Stamm für die GST-CT56 und GST-CT66-Fusionsproteine (zur Verfügung gestellt von C. Oecking,Ruhr-Universität, Bochum).

E. coli TOP10' F' {lacIq Tn10 (TetR)} mcrA ? (mrr-hsdRMS-mcrBC) F 80lacZ? M15 ? lacX74 recA1 deoRaraD139 ? (ara-leu) 7697 galU galK rpsL (StrR) endA1nupG(Invitrogen One Shot®)

pGEX-4T-1 Ermöglicht die Expression eines GST-Fusionsproteins unterKontrolle des mit IPTG induzierbaren tac-Promoters. Dieproteolytische Spaltung des zu exprimierenden Proteins vonder GST-Domäne ist mit Thrombin möglich.(Amersham Pharmacia Biotech)

pGEX-G Derivat des pGEX-3X-Vektors(Amersham Pharmacia Biotech)Erlaubt die Expression eines GST-Fusionsproteins unterKontrolle des mit IPTG induzierbaren tac-Promoters. Dieproteolytische Spaltung des zu exprimierenden Proteins vonder GST-Domäne ist mit dem Faktor Xa möglich.(Görlach und Schmid, 1996)

pSK pBluescript SK(-) (Stratagene)Ermöglicht die in vitro-Transkription einer cDNA unter derKontrolle des T7-Promotors durch die T7 RNA-Polymerase.


pcl60 Derivat des pBluescript SK-Vektors (Stratagene)Ermöglicht die transiente Expression eines fluoreszierendenEGFP-Fusionsproteines (Enhanced Green Fluorescent Pro-tein, Clontech) unter der Kontrolle des 35S-Promotors (ausdem Cauliflower Mosaic Virus) in pflanzlichen Zellen (zurVerfügung gestellt von Claudio Lupi, Biotechnologie derPflanzen, ETH Zürich).


2.2 Medien

Die Chemikalien stammen, sofern ihre Herkunft im Text nicht speziell erwähnt wird,von Fluka, Buchs SG.

LB-Medium 25 g LB Broth, Miller(DIFCO Laboratories, Detroit, MI, USA)ddH2O ad 1 Literautoklaviert (20 min)

LBAmp Medium 25 g LB Broth, Miller (DIFCO)(für Flüssigkulturen) ddH2O ad 1 Liter

autoklaviert (20 min)Nach Abkühlung (ca. 60 C°) Zugabe von1 ml Ampicillin- Stocklösung (100 mg/ml, sterilfiltriert)

LBAmp Agar 25 g LB Broth, Miller (DIFCO)(für Petrischalen) 20 g Agar (DIFCO)

ddH2O ad 1 Literautoklaviert (20 min)Nach Abkühlung (ca. 60 C°) Zugabe von1 ml Ampicillin Stocklösung (100 mg/ml, sterilfiltriert)steril in Petrischalen abgefüllt

MS-Agar 4.43 g Murashige and Skoog-Medium (MS, Duchefa)(für Petrischalen) 20 g Agar (DIFCO)

ddH2O ad 1 Literautoklaviert (20 min)steril in Petrischalen abgefüllt

Nover-Medium 44.3 g Murashige and Skoog-Medium,(für Flüssigkulturen) Basal Salt with Minimal Organics (MSMO, Sigma)

30 g Sucrose170 mg KH2PO4

5 mg a-Naphtylessigsäure (NAA)2 mg N-Benzyladenin (BA)1 ml Vitamine AT 1000xddH2O ad 10 Literautoklaviert (20 min)


Plasmolyse-Agar 44.3 g Murashige and Skoog-Medium,(für Petrischalen) Basal Salt with Minimal Organics (MSMO, Sigma)

100 g Sucrose170 mg KH2PO4

5 mg a-Naphtylessigsäure (NAA)2 mg N-Benzyladenin (BA)1 ml Vitamine AT 1000x20 g Agar (DIFCO)ddH2O ad 1 Literautoklaviert (20 min)steril in Petrischalen abgefüllt

Vitamine AT 1000x 500 mg Vitamin B1-HCl(250 ml) 250 mg Nicotinsäure

25 mg p-Aminobenzoesäure125 mg Pyridoxin-HCl1250 mg Cholinchlorid250 mg Calcium D(+)-Panthothenate2.5 mg Folsäure (0.1 mg/ml in 0.1 N NaOH)2.5 ml Biotin (0.1 mg/ml in 0.1 N NaOH)2.5 ml Cyanocobalamin (0.1 mg/ml)pH 6.2 mit KOHddH2O ad 250 mlsterilfiltrieren


2.3 Chemikalien

Alle Lösungen wurden nach Sambrook et al. (1989) angesetzt.

2.3.1 PCR, Plasmid-DNA-Isolierung und Agarosegel-Elektrophorese

Polymerasen Pwo DNA-Polymerase (Roche Diagnostics)Taq DNA-Polymerase (Roche Diagnostics)T7 RNA-Polymerase (Promega)

PCR-Puffer 2 mM MgSO4 (Roche Diagnostics)1x Reaktionspuffer (Roche Diagnostics)200 µM dNTP-Mix (MBI Fermentas)

Enzyme EcoRI und EcoRI-Puffer (MBI Fermentas)NotI und NotI-Puffer (MBI-Fermentas)XbaI und Puffer Y (MBI-Fermentas)T4 DNA-Ligase und 10x Ligationspuffer (MBI Fermentas)Thrombin (Amersham Pharmacia Biotech)

Mini Prep-Puffer 25 mM Tris / HCl, pH 7.550 mM Glucose10 mM EDTAautoklaviert (20 min)

TE-Puffer 10 mM Tris / HCl, pH 8.01 mM EDTAautoklaviert (30 min)

1x TAE 40 mM Tris / AcOH, pH 8.01 mM EDTAautoklaviert (30 min)

50x TAE 242 g Tris57.1 ml Essigsäure100 ml 0.5 M EDTA, pH 8.0ddH2O ad 1 Literautoklaviert (30 min)

0.8 % (w/v) Agarosegel 0.8 g Agarose (Eurobio)100 ml ddH2O2 ml 50x TAElösen unter erhitzen10 µl EtBr (5 mg/ml)


6x DNA-Probenpuffer 0.25 % w/v Bromphenolblau0.25 % w/v Xylencyanol FF30 % Glycerin in Wasser

DNA-Marker 140 µl TE-Puffer(200 µl) 20 µl 1 kb DNA Ladder (1 µg/µl, GIBCO BRL)

40 µl 6x DNA-Probenpuffer

1x Laufpuffer 80 ml 50x TAE(4 Liter) 200 µl EtBr

ddH2O ad 4 Liter

2.3.2 DNA-Sequenzierung

Sequenziergelmix SequaGel XR (National Diagnostics)

Ladepuffer 80 % Formamid20 % 25 mM EDTA, pH 8.050 mg/ml Blue Dextran

10x TBE (Laufpuffer) 108 g Tris55 g Borsäure8.3 g EDTA, pH 8.0ddH2O ad 1 Literautoklaviert (30 min)

2.3.3 Glutathion Sepharose-Affinitätschromatographie

Glutathion Sepharose 4B 10 ml geliefert in 20% (v/v) EtOH(Amersham Pharmacia Biotech)

Puffer A 10 mM NaCl(30 ml) 1 mM EDTA

50 mM Tris/HCl, pH 8.0autoklaviert (30 min)frisch dazugegeben:– 1 mM PMSF– 1 Spatelspitze DNAse (Promega)

Waschpuffer 50 mM Tris/HCl, pH 8.0

Elutionspuffer 10 mM reduziertes Glutathion (Roche Diagnostics)50 mM Tris/HCl, pH 8.0


2.3.4 SDS-PAGE

30 % (w/v) Monomerengemisch 29.2 % (w/v) Acrylamid (Bio-Rad)0.8 % (w/v) Bisacrylamid (Bio-Rad)

Trenngelpuffer 1.5 M Tris/HCl, pH 8.80.4 % (w/v) SDS

Sammelgelpuffer 0.5 M Tris/HCl, pH 6.80.4 % (w/v) SDS

SDS-Polyacrylamidgel Trenngel:(10% w/v, zwei 1.5 mm Gele) 6 ml 30% (w/v) Monomerengemisch (Bio-Rad)

7.5 ml ddH2O4.5 ml Trenngelpuffer60 µl Ammoniumpersulfat 10% (w/v, Amreco)13.5 µl TEMED (Bio-Rad)

Sammelgel:1.25 ml 30% (w/v) Monomerengemisch5 ml ddH2O2.1 ml Trenngelpuffer25 µl Ammoniumpersulfat 10%15 µl TEMED

2x SDS-Probenpuffer 1.5 ml Sammelgelpuffer(5 ml) 1 ml 20 % (w/v) SDS

0.5 ml 87 % (v/v) Glycerin0.5 ml ß-Mercaptoethanol1 Spatelspitze Bromphenolblau1.5 ml ddH2O

Protein-Marker 5 % (w/v) SDS-PAGE Standards, low range (Bio-Rad)in SDS-Probenpuffer

10x SDS-Laufpuffer 150 g Tris/HCl, pH 8.3(5 Liter) 720 g Glycin

50 g SDSddH2O ad 5 Liter

Gelfärbelösung 2.5 g Coomassie Brilliant Blue R 250(1 Liter) 900 ml Methanol techn.

100 ml Essigsäure

Gelfixierlösung 600 ml ddH2O(1 Liter) 300 ml MeOH techn.

100 ml Essigsäure


2.3.5 TRICIN-SDS-PAGE

49.5% (w/v) Monomerengemisch 240 g Acrylamid (Bio-Rad)(500 ml) 7.5 g Bisacrylamid (Bio-Rad)

ddH2O ad 500 ml

Tris-HCl/SDS-Gelpuffer 182 g Tris, pH 8.5(500 ml) 1.5 g SDS

ddH2O ad 500 ml

SDS-Polyacrylamidgel Trenngel:(16.5% w/v, zwei 1.5 mm Gele) 6.6 ml 49.5% (w/v) Monomerengemisch

4.4 ml ddH2O6.6 ml Tris-HCl/SDS-Gelpuffer2.4 ml 87% (v/v) Glycerol100 µl Ammoniumpersulfat 10% (w/v)10 µl TEMED (Bio-Rad)

Sammelgel:1.0 ml 49.5% (w/v) Monomerengemisch8.4 ml ddH2O3.1 ml Tris-HCl/SDS-Gelpuffer65 µl Ammoniumpersulfat 10% (w/v)6.5 µl TEMED (Bio-Rad)

2x SDS-Probenpuffer 1.0 ml 1M Tris, pH 6.8(10 ml) 4 ml 20 % (w/v) SDS

2.75 ml 87 % (v/v) Glycerin0.4 ml ß-Mercaptoethanol1 Spatelspitze Coomassie Brilliant Blue G 250ddH2O ad 10 ml

1x Kathoden-Puffer 12.11 g Tris(1 Liter) 17.92 g TRICIN

1 g SDSddH2O ad 1 Liter

5x Anoden-Puffer 121.1 g Tris, pH 8.9(1 Liter) ddH2O ad 1 Liter


2.3.6 Verschiedenes

Radioaktive Substanzen [?-32P]-ATP (ICN), 4500 Ci/mmol

[35S]-Methionin (Hartmann Analytic), 1000 Ci/mmol

[9,10-3H]-Myristinsäure (Moravek Biochemicals),50 Ci/mmol

Phosphatreagenz Lösung 1:337.5 mg MalachitgründdH2O (ultrarein) ad 745 ml

Lösung 2:10.5 g Ammoniumheptamolybdat [(NH4)6Mo7O24 · 4H2O]4 M HCl ad 245 ml

Lösungen 1 und 2 mischen und während 24 h bei 4 °Cinkubierenin Polyethylenflasche filtrieren0.04 % (v/v) Tergitol NP-10 dazufügen

10x PBS 80 g NaCl2 g KCl14.4 g Na2HPO4

2.4 g KH2PO4

pH 7.4 mit HClddH2O ad 1 Literautoklaviert (30 min)


2.4 Methoden

2.4.1 Expression und Isolierung der GST-Fusionsproteine in/aus E. coli

Zur Expression der Fusionsproteine GST-CT56 und GST-CT66 und des GST-Proteins selbst

(Glutathion S-Transferase) lagen pGEX-4T-1-Expressionsvektoren in Bakterienkolonien (E.

coli K12 PR745) auf LBAmp Agar-Petrischalen vor.

Mit einzelnen Kolonien wurden 2 ml LBAmp-Flüssigkulturen inokuliert und über Nacht bei 37

°C und 220 rpm geschüttelt. Anschliessend überführte man die Zellen in grössere 200 ml

LBAmp-Flüssigkulturen und zog sie wie zuvor bei 37 °C und 220 rpm bis zu einer optischen

Dichte (600 nm) von 0.8 an. Durch Zugabe von sterilem IPTG zu 1 mM wurde die Expression

der Fusionsproteine induziert. Nach 120 min bei 37 °C und 220 rpm wurden die Zellen abzen-

trifugiert (10 min, 7'700 x g, 4 °C) und der Überstand verworfen.

Das Zellsediment wurde dann jeweils mit Hilfe einer 10 ml Stabpipette in 10 ml Puffer A mit

zusätzlich 1 mg/ml Lysozym resuspendiert. Die Lyse erfolgte während 20 min auf Eis, gefolgt

vom mechanischen Zellaufschluss am Sonicator (W-380, Heat Systems, Ultrasonics). Dazu

wurde die Zellsuspension 5 x 30 s mit Ultraschall behandelt. Zelltrümmer sowie unlösliche

Proteine (u.a. in „Inclusion Bodies“) wurden durch Zentrifugation (10 min, 10'000 x g, 4 °C)

entfernt. Der Überstand wurde bis zu seiner Verwendung bei 4 °C gelagert. Aliquote davon

wurden mittels SDS-PAGE analysiert.

2.4.2 Reinigung der GST-Fusionsproteine

Das Reinigungsprinzip der Glutathion Sepharose-Affinitätschromatographie beruht auf der

Fähigkeit des GST-Anteils des Fusionsproteins, an die Glutathion Sepharose-Matrix zu binden.

Es wurden 300 µl Glutathion Sepharose 4B verwendet, was einem Bettvolumen von 200 µl

entspricht. Die Kapazität der Matrix beträgt 5 mg Fusionsprotein pro ml Bettvolumen (Anga-

ben des Herstellers). In einem 15 ml Zentrifugenröhrchen wurden 9.7 ml Puffer A vorgelegt,

300 µl Glutathion Sepharose 4B dazugegeben und geschüttelt. Nach diesem Waschvorgang

wurde die Matrix abzentrifugiert (5 min, 500 x g, 4 °C), der Überstand verworfen und der zu

reinigende Proteinextrakt zugesetzt. Der Ansatz wurde dann im Überkopfschüttler während 30

min gemischt, die Matrix erneut abzentifugiert (5 min, 500 x g, 4 °C) und der Überstand ver-

worfen. Anschliessend wurde dreimal mit je 15 ml Puffer A gewaschen, wieder zentrifugiert (5


min, 500 x g, 4 °C) und die Überstände jeweils verworfen. Dann wurden die Fusionsproteine

von der Matrix eluiert durch Zugabe von 500 µl Elutionspuffer, gefolgt von gründlichem Mi-

schen während 1 min, Abzentrifugieren der Matrix (5 min, 500 x g, 4 °C) und Transferieren des

Überstands in ein 1.5 ml-Reaktionsgefäss. Diese Elution wurde fünfmal wiederholt. Nach der

Analyse der gereinigten Proteine mittels SDS-PAGE wurden Eluatfraktionen, die das Fusions-

protein enthielten, vereinigt, neu aliquotiert und bei –20 °C gelagert.

Die Bestimmung der Proteinkonzentration der gesammelten Elutatfraktionen erfolgte nach

Bradford (1976). Ein Farbreagenz (Coomassie Protein Assay Reagent, Pierce Chem. Co.), ba-

sierend auf Coomassie Brilliant Blue G 250, wurde 1:10 (v/v) mit der zu analysierenden Pro-

teinlösung gemischt und anschliessend im Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 595

nm gemessen. Die Proteinkonzentrationen wurden anhand einer BSA-Eichgerade errechnet.

2.4.3 In vitro-Phosphorylierung der mit GST fusionierten C-Terminider H+-ATPase (GST-CT56 und GST-CT66)

Jeder Teilversuch wurde in einem Totalvolumen von 15 µl durchgeführt, wovon 10 µl auf den

Reaktionspuffer entfielen: 50 mM HEPES pH 7.5, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT, 5 µM ATP, 1

mM EGTA, 1.1 mM CaCl2 und ddH2O (alle angegebenen Konzentration beziehen sich auf das

Totalvolumen des Ansatzes von 15 µl). Um die Ca2+-Abhängigkeit der Reaktion zu testen,

wurde ein zweiter Reaktionspuffer vorbereitet, der kein CaCl2, dafür EGTA in einer Konzen-

tration von 5 mM enthielt.

Nach der Zubereitung der Puffer wurde radioaktiv markiertes [?-32P]-ATP in einer Endkonzen-

tration von 0.03 µM (4500 Ci/mmol) dazugegeben. Daraus resultierte eine spezifische Aktivität

im Ansatz von 5.8 * 105 dpm/pmol ATP. Anschliessend wurden die jeweis eingesetzten Protei-

ne (GST-CDPK: je 0.4 µg, GST-CT56: je 2.7 µg, GST-CT66: je 1.9 µg, GST: je 0.9 µg) in 1.5

ml Reaktionsgefässen vorgelegt und die Reaktionen durch Zugabe des jeweiligen Puffers ge-

startet.

Nach der vorgesehenen Inkubationszeit von 1, 5 oder 25 min bei 25 °C wurden die Reaktionen

durch Zugabe von je 15 µl 2x SDS-Probenpuffer abgestoppt und die Proteine während 5 min

bei 95 °C denaturiert. Anschliessend wurden je 20 µl der Proben auf ein SDS-Polyacrylamidgel

(10 % w/v, Dicke 1.5 mm) geladen und bei 125 V aufgetrennt. Danach wurden die Proteinban-

den während 30 min in Gelfärbelösung (basierend auf Coomassie Brilliant Blue R 250) gefärbt

und das Gel über Nacht in Gelfixierlösung schüttelnd entfärbt. Nach einer zweistündigen Inku-


bation in ddH2O wurde das Gel während 2 h bei 80 °C im Geltrockner getrocknet, ein Röntgen-

film aufgelegt und dieser nach einer Belichtungszeit von 3.5 h maschinell entwickelt.

Die Wirkung von Proteinkinase-Inhibitoren auf die Aktivität der GST-CDPK wurde mit weni-

gen Abweichungen auf gleiche Weise getestet. Den Teilversuchen wurden vor Reaktionsbeginn

zusätzlich 3 µM Fusicoccin (Sigma), 4 µM Staurosporin (Alexis), 2 µM K-252a (Alexis), 5 µM

KN-62 (Alexis) oder 0.2 µM Bisindolmaleimid (Alexis) zugegeben. Ausserdem wurden je 0.2

µg GST-CDPK und 2.8 µg GST-CT66 verwendet. Die Inkubationszeit betrug bei allen Teilver-

suchen 60 min bei 25 °C und die Proteine wurden auf einem SDS-Polyacrylamidgel (8 % w/v,

Dicke 1.5 mm) bei 125 V aufgetrennt.

2.4.4 In vitro-Phosphorylierung des C-Terminus der H+-ATPase (CT66)

Zunächst wurde der GST-Anteil vom Fusionsprotein GST-CT66 proteolytisch abgespalten.

Dazu wurden 35 µg Fusionsprotein mit 14 U Thrombin (1 µg/µl, Amersham Pharmacia Bio-

tech) in 100 µl PBS während 3 h bei 25 °C inkubiert. Danach erfolgte die Phosphorylierung des

CT66-Peptides in einem Totalvolumen von je 20 µl. Davon entfielen je 2.5 µl auf den Reakti-

onspuffer: 50 mM HEPES pH 7.5, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT, 5 µM ATP, 1 mM EGTA, 1.1

mM CaCl2 (alle angegebenen Konzentrationen beziehen sich auf das Endvolumen der Ansätze

von 20 µl). Um die Ca2+-Abhängigkeit der Reaktion zu testen, wurde ein zweiter Reaktionspuf-

fer vorbereitet, der kein CaCl2, dafür EGTA in einer Konzentration von 5 mM enthielt.

Nach der Zubereitung der Puffer wurde radioaktiv markiertes [?-32P]-ATP (4500 Ci/mmol) in

einer Endkonzentration von 0.03 µM dazugegeben. Daraus resultierte eine spezifische Aktivität

im Ansatz von 5.8 * 105 dpm/pmol ATP. Die zu testenden Proteine (GST-CDPK: je 0.4 µg,

CT66: je 5 µg und GST: je 1.1 µg) wurden in 1.5 ml Reaktionsgefässen vorgelegt und die Re-

aktionen durch Zugabe des jeweiligen Puffers gestartet.

Nach der vorgesehenen Inkubationszeit von 5, 25 oder 125 min bei 25 °C wurden die Reaktio-

nen durch Zugabe von je 20 µl 2x SDS-Probenpuffer abgestoppt und die Proteine während 5

min bei 95 °C denaturiert. Anschliessend wurden je 30 µl der Proben über ein TRICIN-SDS-

Polyacrylamidgel (16.5 % w/v, Dicke 1.5 mm, nach Schägger und von Jagow, 1987) bei 80 V

aufgetrennt. Danach wurde das Gel wie oben beschrieben gefärbt, getrocknet und autoradio-

graphiert.


2.4.5 Aktivitätsbestimmung der Plasmamembran-H+-ATPase

Vorinkubation der Plasmamembran-Vesikel zur Phosphorylierung der H+-ATPase:

Die in diesem Versuch verwendeten Plasmamembran-Vesikel wurden aus Blattgewebe von

Lycopersicon esculentum extrahiert und zur Verfügung gestellt von A. Schaller, ETH Zürich.

Sie enthielten 0.75 mg Gesamtprotein/ml Vesikelsuspension. Alle Lösungen wurden mit ul-

trareinem Wasser (Millipore® Filtrationsanlage) unter Verwendung steriler Plastikgefässe ange-

setzt. In 7.5 µl einer Pufferlösung, die 35 mM MES/Tris pH 7.5, 10 mM MgCl2, 3 mM DTT,

50 µM ATP, 1 mM EGTA, 1.1 mM CaCl2 und 330 mM Sucrose enthielt, wurden 6.1 µg GST-

CDPK (in 50 mM Tris/HCl pH 8.0) gegeben. Anschliessend wurde 1 µl Plasmamembran-

Vesikel-Suspension zugegeben und der Ansatz mit einem Totalvolumen von 20 µl während 30

min bei 25 °C vorinkubiert. Parallel dazu wurde ein analoger Ansatz verwendet, der anstelle

der GST-CDPK lediglich 50 mM Tris/HCl pH 8.0 gleichen Volumens enthielt.

Vorbereitung der Messpuffer:

Gleichzeitig zu den Vorinkubationen der Plasmamembran-Vesikel wurden zwei Messpuffer

mit einem Totalvolumen von je 90 µl vorbereitet und auf 38 °C erwärmt: 36 mM MES/Tris pH

6.0 oder 7.3 (je nach Versuch), 56 mM KCl, 5 mM MgSO4, 1 mM NaMoO4, 50 mM NaNO3,

0.02 % (v/v) Triton X-100, 3 mM ATP und fakultativ 1 mM NaVO4. Die angegebenen Kon-

zentrationen beziehen sich auf das Endvolumen von 100 µl bei der nachfolgenden Aktivitäts-

messung.

Aktivitätsmessung:

Durch Zugabe von 10 µl des Vorinkubations-Ansatzes (mit den Plasmamembran-Vesikeln)

zum Messpuffer wurde die Aktivätsmessung gestartet. Nach einer Inkubationszeit von 3, 6 oder

9 min bei 38 °C wurde die Menge des freien Phosphats bestimmt (Lanzetta et al., 1979). Den

Reaktionsansätzen wurde je 1 ml eines Phosphatreagenzes (bestehend aus 0.034 % (w/v) Mala-

chitgrün, 1 % (w/v) Ammoniumheptamolybdat, 0.04 % (v/v) Tergitol NP-10 und 1 M HCl)

zugesetzt, bevor sie während 1 min bei 38 °C inkubiert wurden. Anschliessend wurde die Re-

aktion durch Zugabe von 200 µl 34 % (w/v) Natriumcitrat gestoppt und die Reaktionsgefässe

bei Raumtemperatur im Dunkeln während 2 h aufbewahrt, bevor die Extinktionen bei 660 nm

mit dem Spektrophotometer bestimmt wurden.

Die Konzentration des jeweils entstandenen freien Phosphats wurde anhand einer Standardkur-

ve berechnet, die mit einer KH2PO4-Konzentrationsreihe (1 bis 22 nmol/100 µl in 2 nmol-


Schritten) erstellt wurde (siehe Abschnitt 6.2). Alle Einzelmessungen wurden dreifach ausge-

führt.

2.4.6 Amplifizierung der cDNAs CDPKwt und CDPKmut mittels PCR

Mittels der PCR (polymerase chain reaction) wurden zwei verschiedene LeCPK1-cDNAs am-

plifiziert: CDPKwt und CDPKmut.

CDPKwt codiert für die Wildtyp-LeCPK1, nachfolgend CDPKwt genannt. Für ihre Herstellung

wurde das Primerpaar 5PKwt (5‘-Primer) und 3PKwt (3'-Primer) verwendet. Beide Primer um-

fassten eine XbaI-Restriktions-Schnittstelle, um die Klonierung des PCR-Produktes zu erleich-

tern. Es wurden 10 Amplifikationszyklen (94 °C / 20 s, 52 °C / 30 s, 72 °C / 90 s), anschlie-

ssend 20 Zyklen (94 °C / 20 s, 52 °C / 30 s, 72 °C / 90 s + 5 s pro Zyklus) auf einer PCR-

Maschine (Perkin Elmer Cetus Thermal Cycler) durchgeführt.

CDPKmut codiert für eine LeCPK1-Mutante, nachfolgend CDPKmut genannt, bei der eine

essentielle Aminosäure des Myristoylierungs-Konsensusmotivs ausgetauscht worden ist. Es

handelt sich dabei um eine Gly2Ala-Substitution, die durch Verwendung eines entsprechend

angepassten Primers erreicht wurde. Für die Amplifikation dieser cDNA wurde das Primerpaar

5Pkmut (5'-Primer) und 3PKwt (3'-Primer) verwendet. Damit bei der PCR-Reaktion in der

Mehrzahl mutierte cDNAs amplifiziert wurden, wurden zuerst sechs Zyklen nur mit dem

5PKmut-Primer durchgeführt, um die Ausgangsmenge des erwünschten Templats für die nach-

folgenden Amplifizierungsschritte zu erhöhen. Anschliessend wurden wie oben 10 Zyklen (94

°C / 20 s, 52 °C / 30 s, 72 °C / 90 s), dann 20 Zyklen (94 °C / 20 s, 52 °C / 30 s, 72 °C / 90 s +

5 s pro Zyklus) durchgeführt.

Beide Reaktionen fanden in einem Gesamtvolumen von 100 µl statt, unter Verwendung von je

300 nM Primer-Oligonukleotiden (Microsynth), 300 ng pGEX-G-CDPKwt Templat-cDNA

(Stalder, 2000), 2.5 U Pwo DNA-Polymerase, 200 µM dNTPs, 2 mM MgSO4 und 10 µl Reak-

tionspuffer (10x). Die Ansätze wurden mit ddH2O auf 100 µl Gesamtvolumen ergänzt und mit

zwei Tropfen Öl überschichtet.

Nach der Reaktion wurde ein Aliquot der PCR-Produkte auf einem 0.8 % (w/v) Agarosegel

analysiert. Dann wurde die cDNA durch Phenol- und Phenol-Chloroform (1:1)-Extraktionen

und anschliessende Ethanol-Präzipitation aus dem Reaktionsansatz gereinigt.


2.4.7 Ligation der amplifizierten cDNAs in die Vektoren pBluescript SK(-) und pcl60

Um die beiden cDNAs in die entsprechenden Vektoren ligieren zu können, wurden sowohl die

beiden cDNAs wie auch die Vektor-DNAs mit dem Restriktionsenzym XbaI restringiert.

12 µg des Vektors pBluescript SK(-) (Stratagene) wurden in einem 100 µl-Ansatz mit 60 U

XbaI und 100 µg/ml BSA (MBI Fermentas) in einem entsprechenden Puffer während 60 min

bei 37 °C restringiert und dann während 10 min bei 37 °C mit 2 U CIAP (Calf Intestine Alkali-

ne Phosphatase, MBI Fermentas) dephosphoryliert. Schliesslich wurden die Enzyme während

10 min bei 65 °C hitzeinaktiviert und dann die geschnittene Vektor-DNA mit Phenol- und Phe-

nol-Chloroform (1:1)-Extraktionen und anschliessender Ethanol-Präzipitation gereinigt. Um

eine vollständige Restriktion zu erreichen, wurden diese Schritte zweimal wiederholt. Auf glei-

che Weise wurden 7 µg des Vektors pcl60 vorbereitet.

Die cDNAs (je 4.5 µg) wurden in je einem 40 µl-Ansatz mit 24 U XbaI und 100 µg/ml BSA

während 60 min bei 37 °C inkubiert. Wiederum wurden die Reaktionen durch Hitzeinaktivie-

rung bei 65 °C gestoppt und die geschnittenen cDNAs mittels Phenol- und Phenol-Chloroform

(1:1)-Extraktionen und anschliessender Ethanol-Präzipitation gereinigt. Die gewünschten

cDNA-Fragmente wurden anschliessend auf einem 0.8 % (w/v) Agarosegel aufgetrennt, im

UV-Licht als entsprechende Banden ausgeschnitten und mit dem "Prep-A-Gene® DNA Purifi-

cation Kit" (Bio-Rad) gemäss Protokoll des Herstellers aus dem Gel eluiert.

Je 150 ng der restringierten cDNA (zukünftige Insert-cDNA) wurden dann mit je 100 ng Vek-

tor-DNA in einem 10 µl-Ligationsansatz mit 1 U T4 DNA-Ligase über Nacht bei 16 °C inku-

biert. Nach Hitzeinaktiverung während 10 min bei 65 °C wurden die Ligationsprodukte mit

Ethanol gefällt, getrocknet und in je 2 µl ddH2O aufgenommen.

Für die Amplifizierung der cDNAs verwendete Primer:

5PKwt: 5‘-CCTCTAGAATGGGTGGTTGTTTTAGCAA-3‘

5PKmut: 5‘-CCTCTAGAATGGCTGGTTGTTTTAGCAAGAAGT-3‘

3PKwt: 5‘-GGTCTAGAGGGAAAAGCTTTTGTTGTGGTTGT-3‘


2.4.8 Transformation von kompetenten E. coli-Zellen

Für die Transformation wurden die vier Ligationsprodukte zu 200 µl kompetenten, auf Eis auf-

getauten E. coli-Zellen (TOP10', Invitrogen One Shot®) gegeben und 5 min auf Eis, 30 s im 42

°C-Wasserbad und wieder 1 min auf Eis inkubiert. Die Ansätze wurden mit 250 µl SOC-

Medium (Invitrogen) ergänzt und während 1 h bei 37 °C mit 150 rpm geschüttelt. Je 125 µl der

Ansätze wurden dann auf LBAmp Agar-Petrischalen ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inku-

biert.

2.4.9 Isolierung von Plasmid-DNA (Mini Prep) aus E. coli

Die Plasmid-DNA wurde nach dem Prinzip der alkalischen Lyse isoliert (Birnboim und Doly,

1979). Mit einzelnen, auf LBAmp Agar-Petrischalen gewachsenen Kolonien wurden je 2 ml

LBAmp-Flüssigkulturen inokuliert. Die Kulturen wurden erneut über Nacht bei 37 °C und 220

rpm auf dem Schüttler inkubiert.

Am darauffolgenden Tag wurden jeweils 1.5 ml der 2 ml-Kulturen bei 14'000 rpm während 2

min in einer Eppendorftischzentrifuge abzentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet

in 100 µl Mini Prep-Puffer resuspendiert. Nach Zugabe von 150 µl 0.2 N NaOH und 1 % (w/v)

SDS wurde die Suspension während 5 min auf Eis inkubiert, dann mit 150 µl 3 M Kaliumacetat

versehen und für weitere 5 min auf Eis gestellt. Durch Zentrifugation (5 min, 14'000 rpm) wur-

den Lipide, Proteine und chromosomale DNA sedimentiert und der Überstand in ein neues 1.5

ml Reaktionsgefäss mit 800 µl vorgelegtem Ethanol transferiert.

Es folgten eine Inkubation auf Eis während 15 min und eine weitere Zentrifugation (15 min,

14'000 rpm), bevor die auf diese Weise präzipitierte Plasmid-DNA in 200 µl TE-Puffer, ent-

haltend 1 µl pankreatische RNAse (10 mg/ml), aufgenommen und anschliessend während 30

min bei 37 °C inkubiert wurde. Dann führte man Extraktionen mit Phenol und mit Phe-

nol/Chloroform (1:1) durch, gefolgt von einer Ethanolfällung der Plasmid-DNA. Das Präzipitat

wurde in 50 µl H2O aufgenommen und bei –20 °C gelagert.


2.4.10 Analyse der Ligationsprodukte durch Restriktion der Plasmid-DNA

Um zu überprüfen, ob die Plasmide ein DNA-Insert enthielten und ob dieses in gewünschter

Orientierung relativ zum T7 bzw. 35S-Promotor in die Vektor-DNA ligiert worden war, wur-

den ca. 400 ng der isolierten Plasmid-DNA in einem 20 µl-Ansatz mit 5 U EcoRI während 1 h

bei 37 °C restringiert. Nachdem die Reaktion durch Hitzeinaktivierung während 10 min bei 65

°C gestoppt worden war, wurden die Restriktionsprodukte mittels eines 0.8 % (w/v) Agarose-

gels aufgetrennt und analysiert.

2.4.11 DNA-Sequenzanalyse

Die DNA-Sequenzierung der Konstrukte erfolgte nach der von Sanger et al. (1977) beschriebe-

nen Kettenabbruchmethode unter Einsatz fluoreszenzmarkierter Dideoxynukleotide. In der

PCR verwendete man in einem Gesamtvolumen von 10 µl 1.6 µl Primer (1.6 pmol T7- sowie

konstruktspezifische Primer, Microsynth), 2 µl Templat-DNA (ca. 250 ng Plasmid-DNA), 4 µl

Reaktionsmix inkl. Taq DNA-Polymerase und Reaktionspuffer (Perkin Elmer) und 2.4 µl

ddH2O. Es wurden 25 Amplifikationszyklen (95 °C / 30 s, 50 °C / 15 s, 60 °C / 240 s) durchge-

führt. Anschliessend wurden die Reaktionsprodukte mit Ethanol gefällt, in 4 µl Ladepuffer auf-

genommen und während 2 min bei 95 °C denaturiert.

Die Trennung der Oligonukleotidstränge erfolgte über ein 5% (w/v) Polyacrylamid-Gel in Ge-

genwart von 8 M Harnstoff und mit 1x TBE als Laufpuffer. Die Elektrophorese dauerte bei

2500 V und 38 W 17 Stunden (ABI 373 DNA Sequencer, Perkin Elmer). Die erhaltenen Daten

wurden mit Hilfe des Software-Paketes der University of Wisconsin Genetics Computer Group

(GCG) analysiert.

2.4.12 Amplifizierung und Isolierung der Konstrukte in/aus E. coli (Midi Prep)

Die Plasmid-DNA jeweils eines Klones wurde in E. coli amplifiziert und durch "Midi Prep"

gereinigt. Dazu wurde mit den entsprechenden 2 ml-Vorkulturen jeweils eine grössere 200 ml

LBAmp-Flüssigkultur in einem 1 Liter-Erlenmeyerkolben inokuliert. Die Kulturen wurden über

Nacht bei 37 °C und 220 rpm auf dem Schüttler inkubiert. Anschliessend konnte die Plasmid-

DNA durch Verwendung des "Eppendorf Perfectprep® Plasmid Midi-Kits" gemäss Protokoll


des Herstellers extrahiert und in 200 µl TE-Puffer aufgenommen werden. Zur Bestimmung der

DNA-Konzentration wurde die Extinktion einer 200-fachen Verdünnung bei 260 nm im Spek-

trophotometer gemessen.

2.4.13 In vitro-Transkription/Translation und Myristoylierung der LeCPK1

Zunächst wurden jeweils 8 µg Vektor-DNA (pSK-CDPKwt oder pSK-CDPKmut) in einem 100

µl-Ansatz mit 50 U NotI während 1 h bei 37 °C inkubiert und dadurch 3'-terminal des cDNA-

Inserts linearisiert. Danach wurde die Reaktion durch Hitzeinaktivierung während 10 min bei

65 °C gestoppt. Nach darauffolgenden Phenol- und Phenol-Chloroform (1:1)-Extraktionen und

einer Ethanolfällung wurden die linearisierten Vektor-DNAs in je 12 µl nukleasefreiem ddH2O

aufgenommen.

Die in vitro-Transkription/Translation vom T7-Promotor des pSK-Vektors aus erfolgte in ei-

nem TNT® gekoppelten Weizenkeimextrakt-System (Promega) nach Angaben des Herstellers.

Für die Transkription/Translation wurden Ansätze mit einem Totalvolumen von jeweils 25 µl

in 1.5 ml Reaktionsgefässen verwendet. Sie enthielten je 0.6 µg linearisierte pSK-CDPKwt-

cDNA oder 1 µg pSK-CDPKmut-cDNA, 12.5 µl Weizenkeimextrakt, 1 µl Reaktionspuffer, 20

U RNAsin (Promega), wahlweise 20 µM Aminosäuren-Mix (ohne Methionin) oder 20 µM

Aminosäuren-Mix (komplett), wahlweise 40 µM [9,10-3H]-Myristinsäure (50 Ci/mmol, Mora-

vek Biochemicals) oder 10 µM [35S]-Methionin (1000 Ci/mmol, Hartmann Analytic) und 0.5 µl

T7 RNA-Polymerase.

Die [9,10-3H]-Myristinsäure, welche als ethanolische Lösung geliefert worden war, trocknete

man zuerst in der Vakuumzentrifuge und resuspendierte sie dann während 15 min im Ultra-

schallbad in 9 µl nukleasefreiem ddH2O. Für die Positivkontrolle wurde anstelle der LeCPK1-

cDNAs 1.5 µg einer für Luciferase codierenden cDNA (Promega) eingesetzt.

Nach Zugabe der RNA-Polymerase als Initiator der Reaktionen wurden die Ansätze während

90 min bei 30 C° inkubiert. Dann wurden die Reaktionen durch Zugabe von je 25 µl 2x SDS-

Probenpuffer abgestoppt und die Proteine während 5 min bei 95 °C denaturiert. Anschliessend

wurden je 5 µl oder 10 µl der Proben auf ein SDS-Polyarcrylamidgel (10 %, Dicke 1.5 mm)

geladen und bei 125 V aufgetrennt.

Die Proteinbanden wurden danach während 30 min in Gelfärbelösung (basierend auf Coomas-

sie Brilliant Blue R 250) gefärbt und das Gel während 30 min in Gelfixierlösung schüttelnd


entfärbt. Anschliessend inkubierte man das Gel während 60 min in 100 ml EN3HANCE(™)-

Lösung (DuPont NEN). Nach einer zweistündigen Inkubation in ddH2O wurde das Gel wäh-

rend 2 h bei 80 °C im Geltrockner getrocknet. Die Fluorographie erfolgte während 60 h bei –80

°C (mit Reflektorfolie) auf Kodak X-OMAT AR-Röntgenfilm. Anschliessend wurde der Film

maschinell entwickelt.

2.4.14 Transformation von Zwiebelepidermiszellen und transiente Expressionder Fusionsproteine CDPKwt-EGFP und CDPKmut-EGFP

Die Transformation von Zwiebelepidermiszellen durch Beschuss mit Goldpartikeln wurde im

Wesentlichen wie von Scott et al. beschrieben durchgeführt (Scott et al., 1999). Von den Un-

terblättern ("Schalen") einer Zwiebel (Allium cepa) wurden ca. 1 cm2 grosse Stücke der Epi-

dermis der Blattinnenseite mit Skalpell und Pinzette abgezogen und auf MS-Agar in Petrischa-

len flach ausgelegt. Anschliessend wurden die drei zu transformierenden cDNAs (CDPKwt-

EGFP, CDPKmut-EGFP und EGFP als Kontrolle), die alle in das Plasmid pcl60 unter Kon-

trolle des 35S-Promotors ligiert worden waren, an Goldpartikel gebunden.

Diese wurden wie folgt vorbereitet: In einem 1.5 ml Reaktionsgefäss wurden 50 mg Goldparti-

kel (Grösse: 1.5 bis 3 µm, Aldrich) in 1 ml 100% EtOH p.a. aufgenommen und am Sonicator

(W-380, Heat Systems, Ultrasonics) während 30 s mit Ultraschall resuspendiert. Danach wur-

den die Partikel bei 14'000 rpm während 30 s in einer Eppendorftischzentrifuge abzentrifugiert,

der Überstand verworfen und das Pellet erneut in 1 ml 100% EtOH p.a. aufgenommen. Nach

fünfmaliger Wiederholung dieser Waschschritte wurden die Partikel an der Luft getrocknet, in

1 ml 50 % Glycerol (v/v) aufgenommen und während 30 s mit Ultraschall resuspendiert. Zum

Schluss lag eine gebrauchsfertige Goldpartikelsupension in einer Konzentration von 50 µg/µl

vor.

Für jedes Konstrukt wurden 30 µl dieser Suspension in einem 1.5 ml Reaktionsgefäss mit 10 µl

Plasmid-DNA (0.4 µg/µl) vermengt, bevor durch Zugabe von 30 µl 2.5 M CaCl2 und 12 µl 0.1

M Spermidin und heftiges Mischen während 3 min die cDNAs an die Goldpartikel gebunden

wurden. Durch schrittweise Zugabe von insgesamt 300 µl 100% EtOH p.a. und einer Inkubati-

on von 30 min bei –20 °C wurde die DNA präzipitiert. Kurz vor der Transformation wurden

die Partikel sedimentiert (14'000 rpm während 30 s in einer Eppendorftischzentrifuge), der et-

hanolische Überstand abgenommen, die Goldpartikel in 25 µl ddH2O aufgenommen und wäh-

rend ca. 20 s mit Ultraschall resuspendiert.


Die Transformation der Zwiebelepidermiszellen erfolgte mittels der Mikroprojektiltechnik. Mit

Hilfe einer Particle Inflow Gun (Eigenbau der Gruppe Biotechnologie der Pflanzen, ETH Zü-

rich) wurden die auf MS-Agar ausgelegten Epidermisstücke mit 7 µl (4 µg) Goldpartikel-

suspension beschossen. Durch einen Heliumdruckstoss von 9 bar wurden die DNA-

beladenenen Goldpartikel in der auf –0.8 bar evakuierten Kammer beschleunigt [Anmerkung:

Die Loch- bzw. Tragegitter für die Petrischalen befanden sich auf Position 3 bzw. 4 (Numerie-

rung der Gitterebenen von oben)]. Zur Expression der transferierten cDNAs wurden die Petri-

schalen nach der Transformation für mind. 24 h in eine Klimakammer (23 °C; Lichtzyklus 16 h

Licht (1 µE * s-1 * m-2) und 8 h Dunkel) gebracht.

Anschliessend wurde jeweils ein Epidermisstück mit einem Tropfen ddH2O auf einen Objekt-

träger gegeben, das Präparat mit einem Deckglas fixiert und sofort mittels eines spektralen,

konfokalen Laser-Scanning Mikroskopes (Leica TCS SP mit Leica DM IRBE) untersucht. Für

die Fluoreszenz-Anregung und konfokale Abrasterung wurde ein ArKr-Laser bei 488 nm ver-

wendet. Emittiertes Licht wurde im Bereich von 500 bis 520 nm detektiert. Für 50 bis 100-

fache Vergrösserungen wurden Luft-Glas-Objektive, für 200 bis 1000-fache Vergrösserungen

Ölimmersionsobjektive verwendet. Die Bildverarbeitung erfolgte mit der Software Leica TCS

NT, Version 1998.

2.4.15 Transformation von Lycopersicon peruvianum-Suspensionskulturzellen undtransiente Expression der Fusionsproteine CDPKwt-EGFP und CDPKmut-EGFP

Jeweils 4 bis 5 ml einer sieben Tage alten Zellsuspensionskultur von Lycopersicon peruvianum

wurden gleichmässig auf Petrischalen (Durchmesser 5 cm) mit Plasmolyse-Agar pipettiert.

Anschliessend wurden die drei zu transformierenden Konstrukte an Goldpartikel gebunden

(siehe Abschnitt 2.4.14). Die Transformation der Lycopersicon peruvianum-Zellen erfolgte

wiederum mittels der Particle Inflow Gun, in welcher eine Petrischale mit der auf Plasmolyse-

Medium verteilten Zellsuspension durch einen Heliumdruckstoss von 6 bar in einer auf –0.9

bar evakuierten Kammer mit 7 µl (4 µg) der obigen, DNA-beladenenen Goldpartikelsuspension

beschossen wurde. [Anmerkung: Die Loch- bzw. Tragegitter für die Petrischalen befanden sich

auf Position 2 bzw. 4 (Numerierung der Gitterebenen von oben)].

Zur Expression der transferierten cDNAs wurden die Petrischalen nach der Transformation für

mind. 24 h in eine Klimakammer (23 °C; Lichtzyklus 16 h Licht (1 µE * s-1 * m-2) und 8 h

Dunkel) gebracht.


Anschliessend wurden die Zellen jeweils einer Petrischale mit einem sterilen Spatel in ein 2.0

ml Reaktionsgefäss überführt, dort mit 1.5 ml Nover-Medium resuspendiert und dann im Über-

kopfschüttler während 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden jeweils 250 µl

Zellsuspension mit einer Pipette auf einen Objektträger gegeben, mit einem Deckglas fixiert

und am spektralen, konfokalen Laser-Scanning Mikroskop untersucht (siehe Abschnitt 2.4.14).

2.4.16 Titration einer GST-CDPK-Lösung mit CaCl2 unter paralleler Aufnahme desFluoreszenz-Spektrums

Ein Milliliter einer 0.5 µM (0.045 mg/ml) GST-CDPK-Lösung (in 50 mM HEPES pH 7.5)

wurde in eine Quarz-Küvette gegeben. Mit einem Fluoreszenz-Spektrophotometer (Kontron

SFM 25, Rotkreuz) wurde das Emissionsspektrum nach Anregung bei 280 nm aufgenommen.

Dabei wurde der Photomultiplier des Spektrometers mit einer Spannung von 430 V betrieben.

Es wurden schrittweise steigende Konzentrationen von CaCl2 (in 50 mM HEPES pH 7.5) zuge-

geben. Nach jedem Titrationsschritt wurde erneut ein Fluoreszenzspektrum aufgenommen. Die

CaCl2-Lösungen lagen in Konzentrationen von 0.1 mM bis 1 M vor und wurden in 2 µl-

Schritten zugesetzt. Die gewonnenen Daten wurden mit den Programmen Excel 97 (Microsoft)

und SigmaPlot 6.0 (SPSS Inc.) ausgewertet.

3. Resultate Seite 34

III. RESULTATE

3.1 Expression und Aufreinigung der GST-Fusionsproteine GST-CT56 undGST-CT66 sowie des GST-Proteines selbst

Um zu untersuchen, ob die Plasmamembran-H+-ATPase ein Substrat der LeCPK1 ist, wurden

zuerst zwei C-terminale Fragmente der Protonenpumpe heterolog exprimiert und gereinigt.

Das Reinigungsprinzip der Glutathion Sepharose-Affinitätschromatographie beruht auf der

Fähigkeit des GST-Anteils des Fusionsproteins, selektiv an die Glutathion Sepharose-Matrix zu

binden.

Dieses Prinzip wurde ausgenutzt, um die LeCPK1 und zwei C-terminale Fragmente der Plas-

mamembran-H+-ATPase PMA2 von Nicotiana plumbaginifolia als GST-Fusionsproteine zu

reinigen. Bei den zwei C-terminalen Teilpeptiden handelt es sich um GST-CT56, ein GST-

Fusionspeptid, das aus den 56 letzten C-terminalen Aminosäuren der Plasmamembran-H+-

ATPase besteht, und GST-CT66, das die 66 letzten C-terminalen Aminosäuren der Plasma-

membran-H+-ATPase umfasst. Zusätzlich wurde das GST-Protein (die Glutathion S-

Transferase) selbst in E. coli exprimiert und gereinigt.

Wie die SDS-PAGE-Analyse ergab, gelang die Aufreinigung der GST-Fusionsproteine mit

hoher Spezifität. Bei den Fusionsproteinen GST-CT56 (Abb. 5) und GST-CT66 (Abb. 6) sind

trotz der bereits während der Lyse eingesetzten Proteasehemmstoffe in den Eluaten kleinere

Degradationsprodukte zu finden, wobei das kleinste auf dem Gel sichtbare Abbauprodukt

wahrscheinlich der Glutathion S-Transferase selbst (Abb. 7) entspricht.


Abb. 5: Reinigung des GST-CT56-Fusionsproteinesdurch Glutathion Sepharose-Affinititätschromatographie.R: Rohextrakt (20 µl von 24 ml Gesamtvolumen).D: Durchfluss (20 µl von 10 ml Gesamtvolumen).E: Vereinigte Eluatfraktionen (3 µl von 3 ml Gesamtvolumen).Das Fusionsprotein besitzt eine errechnete Grösse von 32.3 kDa.

SDS-PAGE-Gel (10%), Coomassie Brilliant Blue-gefärbt,Marker: low molecular weight standards (Bio-Rad).

Abb. 6: Reinigung des GST-CT66-Fusionsproteinesdurch Glutathion Sepharose-Affinititätschromatographie.Gezeigt sind die fünf ersten mit reduziertem Glutathioneluierten Fraktionen (Spuren E1 bis E5). Pro Spurwurden 15 µl von 1 ml Fraktionsvolumen aufgetragen.Das Fusionsprotein besitzt eine errechnete Grösse von 33.3 kDa.


97.4 kDa

31.0 kDa

45.0 kDa

66.2 kDa

14.4 kDa

E1 E2 E3 E4 E5M

97.4 kDa

66.2 kDa

45.0 kDa

31.0 kDa

R D EM

GST-CT66

GST-CT56


Abb. 7: Reinigung der Glutathion S-Transferase (GST)durch Glutathion Sepharose-Affinititätschromatographie.Gezeigt sind die fünf ersten mit reduziertem Glutathioneluierten Fraktionen (Spuren E1 bis E5). Pro Spur wurden15 µl von 500 µl Fraktionsvolumen aufgetragen.Das GST-Protein besitzt eine errechnete Grösse von 26.1 kDa.


97.4 kDa

31.0 kDa

45.0 kDa

66.2 kDa

14.4 kDa

E1 E2 E3 E4 E5M

GST


3.2 In vitro-Phosphorylierung der Plasmamembran-H+-ATPase

Im folgenden in vitro-Phosphorylierungs-Experiment wurde untersucht, ob der C-Terminus der

Plasmamembran-H+-ATPase ein Substrat der LeCPK1 ist. Dazu wurden die gereinigten Fusi-

onsproteine der C-Termini (GST-CT56 und GST-CT66) mit der gereinigten GST-CDPK in

Gegenwart von [?-32P]-ATP inkubiert. Die Reaktionsprodukte wurden mittels SDS-PAGE auf-

getrennt (Abb. 8a) und durch Autoradiographie analysiert (Abb. 8b).

GST-CT66 wurde zeitabhängig phosphoryliert (Abb. 8b, Spuren 1-3). Daneben war auch eine

zeitabhängige Autophosphorylierung der GST-CDPK zu beobachten. Sowohl die Phosphory-

lierung in trans als auch die Autophosphorylierung erwiesen sich als Ca2+-abhängig (Abb. 8b,

Spur 4). Es fällt auf, dass die Autophosphorylierung erheblich stärker ist als die Phosphorylie-

rung von GST-CT66. Eine mögliche Ursache hierfür ist, dass der Km-Wert vieler CDPKs für

ATP im Falle der Phosphorylierung in trans erheblich höher ist als für die Autophosphorylie-

rung (Chaudhuri et al., 1999). Die Phosphorylierung des C-Terminus GST-CT66 fand also

möglicherweise unter suboptimalen Bedingungen statt. Weiterhin wäre es denkbar, dass mehre-

re Ser/Thr-Reste der GST-CDPK autophosphoryliert werden, während der C-Terminus ledig-

lich eine phosphorylierbare Aminosäure enthält. Darüber hinaus mag die Autophosphorylie-

rung als intramolekulare Reaktion gegenüber einer intermolekularen Reaktion begünstigt sein.

Eine Ca2+-abhängige Phosphorylierung der Glutathion S-Transferase (GST) selbst (Abb. 8b,

Spuren 7 und 8) ist nachweisbar, aber deutlich schwächer als die Phosphorylierung von GST-

CT66 (Abb. 8b, Spuren 3 und 4). Offensichtlich ist also CT66 ein in vitro-Substrat der GST-

CDPK.

Zwischen den für GST-CT56 und GST-CT66 enthaltenen Resultaten waren keine Unterschiede

festzustellen (das GST-CT56-Ergebnis wird deshalb hier nicht gezeigt). Dies lässt darauf

schliessen, dass sich an den zehn zusätzlichen Aminosäuren des GST-CT66 keine zusätzliche

Phosphorylierungsstelle befindet.


Abb. 8: Phosphorylierung des C-Terminus GST-CT66 der Plasmamembran-H+-ATPase durch die GST-CDPK.

A: SDS-PAGE-Gel (10%), Coomassie Brilliant Blue-gefärbt, Marker: low molecular weight standards (Bio-Rad).B: Autoradiographie des unter A gezeigten Gels.

Spuren 1-3: Die aufgetragenen Proben enthalten die GST-CDPK (86.9 kDa) und den C-Terminus GST-CT66(33.3 kDa), die in einem Ca2+-haltigen Puffer während 1, 5 oder 25 min inkubiert wurden.

Spur 4: Ansatz wie 3, aber ohne Ca2+.Spur 5: Ansatz wie 3, aber ohne C-Terminus GST-CT66.Spur 6: Ansatz wie 3, aber ohne GST-CDPK.Spur 7: Ansatz wie 3, aber anstelle des C-Terminus GST-CT66 wurde das GST-Protein selbst (26.1 kDa)

eingesetzt.Spur 8: Ansatz wie 7, aber ohne Ca2+.

97.4 kDa

31.0 kDa

45.0 kDa

66.2 kDa

14.4 kDa

97.4 kDa

31.0 kDa

45.0 kDa

66.2 kDa

11 min

25 min

325 min

4–Ca2+

5–GST-CT66

6–GST-CDPK

7–GST-CT66+GST

8–GST-CT66

+GST-Ca2+

M

GST-CDPK

GST-CT66

GST

GST-CT66

GST-CDPK

A

BGST


3.3 Phosphorylierung des vom GST-Peptid abgetrennten C-Terminus derPlasmamembran-H+-ATPase

Um sicherzustellen, dass die in Abschnitt 3.2 festgestellte Phosphorylierung von GST-CT66

durch die GST-CDPK tatsächlich am C-Terminus der H+-ATPase und nicht etwa am GST-

Peptid des Fusionsproteines stattfindet, wurde der GST-Anteil des Fusionsproteines proteoly-

tisch mit Thrombin abgetrennt. Anschliessend wurden die Phosphorylierungsreaktionen wie in

Abschnitt 3.2 durchgeführt, die Reaktionsprodukte mittels TRICIN-SDS-PAGE aufgetrennt

(Abb. 9a) und durch Autoradiographie analysiert (Abb. 9b).

Der C-Terminus CT66 (26 kDa) wurde zeitabhängig (Abb. 9, Spuren 1 bis 3) und Ca2+-

abhängig (Abb. 9, Spur 4) phosphoryliert, nicht aber das von ihm abgetrennte GST-Peptid (7.3

kDa). Die Phosphorylierung durch die GST-CDPK findet also am C-Terminus CT66 selbst

statt, und nicht etwa am GST-Anteil des Fusionsproteins. Bei Einsatz von GST als Substrat

ohne vorherige Spaltung mit Thrombin ist allerdings eine gewisse Phosphorylierung zu beob-

achten (Abb. 9, Spuren 7 und 8, siehe auch Abb. 7, Spuren 7 und 8). Das legt die Vermutung

nahe, dass einige vom Polylinker des Expressionsplasmids codierte Aminosäuren (C-terminal

der Thrombin-Schnittstelle) eine Phosphorylierungsstelle für die LeCPK1 darstellen.


Abb. 9: Phosphorylierung des vom GST-Peptid abgetrennten C-Terminus CT66 durch die GST-CDPK.

A: TRICIN-SDS-PAGE-Gel (16.5% w/v), Coomassie Brilliant Blue-gefärbt, Marker: polypeptide standards(Bio-Rad).

B: Autoradiographie des unter A gezeigten Gels.

Spuren 1-3: Nach Spaltung des C-Terminus GST-CT66 (33.3 kDa) mit Thrombin wurden die Proteine für5, 25 oder 125 min mit der GST-CDPK (86.9 kDa) inkubiert.

Spur 4: Ansatz wie 3, aber ohne Ca2+.Spur 5: Ansatz wie 3, aber ohne den C-Terminus GST-CT66.Spur 6: Ansatz wie 3, aber ohne die GST-CDPK.Spur 7: Ansatz wie 3, aber mit GST (26 kDa) anstelle des geschnittenen Fusionsproteines GST-CT66.Spur 8: Ansatz wie 7, aber ohne Ca2+.

26.6 kDa

6.5 kDa

14.4 kDa

17.0 kDa

15 min

225 min

3125 min

4–Ca2+

5–CT66

6–GST-CDPK

7–CT66+GST

8–CT66+GST-Ca2+

M

A

B

GST

CT66

CT66 6.5 kDa

14.4 kDa

17.0 kDa

26.6 kDa

GST-CDPK

GST


3.4 Die Wirkung von Proteinkinase-Inhibitoren auf die Phosphorylierung desC-Terminus der Plasmamembran-H+-ATPase

Im Anschluss zu der in 3.2 und 3.3 gezeigten Phosphorylierung des C-Terminus GST-CT66 der

Plasmamembran-H+-ATPase durch die GST-CDPK sollte im vorliegenden Experiment der Ein-

fluss von verschiedenen Proteinkinase-Inhibitoren auf diese Phosphorylierung untersucht wer-

den. Folgende Inhibitoren wurden eingesetzt:

Inhibitor Inhibierte Kinase(n) EingesetzteKonzentration

Spur inAbb. 10

Staurosporin allgemeiner Proteinkina-seinhibitor

4 µM 5

K-252a allgemeiner Proteinkina-seinhibitor

2 µM 6

KN-62 Ca2+/CaM-Kinasen II(CaMKII)

5 µM 7

Bisindolmaleimid Proteinkinase C 0.2 µM 8

Zusätzlich wurde auch die Wirkung von Fusicoccin auf die Phosphorylierung der Protonen-

pumpe untersucht. Dieses Toxin aus dem Pilz Fusicoccum amygdalii aktiviert die Plasmamem-

bran-H+-ATPase (Blum et al., 1988; Johansson et al., 1993), indem es den aktiven Komplex

von 14-3-3-Proteinen und dem C-Terminus der H+-ATPase stabilisiert (Oecking et al., 1997;

Jahn et al., 1997). Ausserdem kann die Systemin-induzierte Alkalisierung des Mediums einer

Suspensionskultur von Lycopersicon peruvianum durch Zugabe von Fusicoccin wirksam unter-

drückt werden (Schaller und Oecking, 1999).

Das Fusionsprotein GST-CT66 wurde mit der GST-CDPK in Gegenwart von [?-32P]-ATP wäh-

rend 60 min inkubiert. Die Reaktionsprodukte wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt (Abb.

10a) und durch Autoradiographie analysiert (Abb. 10b). Sowohl der C-Terminus GST-CT66 als

auch die GST-CDPK selbst wurden wie im unter 3.2 dargestellten Experiment phosphoryliert,

wobei es sich bei der GST-CDPK um eine Autophosphorylierung handelt (Abb. 10, Spur 3).

Beide Phosphorylierungen erwiesen sich wiederum als Ca2+-abhängig (Abb. 10, Spur 1).

Die Zugabe von 3 µM Fusicoccin hatte keine Auswirkungen auf die Phosphorylierung des C-

Terminus der H+-ATPase durch die GST-CDPK (Abb. 10, Spur 4). Offenbar beruht die Proto-

nenpumpe-aktivierende Eigenschaft von Fusicoccin nicht auf der direkten Modulation der

Phosphorylierung selbst, sondern auf anderen Mechanismen, wie z.B. der oben beschriebenen

Stabilisierung eines bereits bestehenden, aktiven Komplexes (siehe Abb. 2 auf Seite 6).


Die allgemeinen Proteinkinase-Inhibitoren Staurosporin und K-252a hingegen schränkten die

Aktivität der GST-CDPK und damit auch die Phosphorylierung des C-Terminus GST-CT66

deutlich ein (Abb. 10, Spuren 5 und 6). Die Verwendung der spezifisch auf andere Kinase-

Typen wirkenden Inhibitoren KN-62 und Bisindolmaleimid dagegen zeigte keine Auswirkun-

gen auf die Phosphorylierung des C-Terminus (Abb. 10, Spuren 7 und 8).


Abb. 10: Wirkung von Proteinkinase-Inhibitoren auf die Phosphorylierung des C-Terminus GST-CT66

A: SDS-PAGE-Gel (10%), Coomassie Brilliant Blue-gefärbt, Marker: low molecular weight standards (Bio-Rad).B: Autoradiographie des unter A gezeigten Gels.

Spur 1 Die GST-CDPK (86.9 kDa) wurde mit dem C-Terminus GST-CT66 (33.3 kDa) in Abwesenheitvon Ca2+ inkubiert (Negativkontrolle).

Spur 2: Ansatz wie 1, aber mit Ca2+, dafür ohne GST-CT66 (Negativkontrolle).Spur 3: Ansatz wie 2, aber mit GST-CT66 (Positivkontrolle).Spuren 4-8: Die GST-CDPK wurde mit dem C-Terminus GST-CT66 im vollständigen Reaktionspuffer unter

Zusatz der oben angegebenen Proteinkinase-Inhibitoren bzw. Fusicoccin inkubiert.

97.4 kDa

45.0 kDa

66.2 kDa

31.0 kDa

1–Ca2+

2–GST-CT66

3Positiv-

kontrolle

4+3 µMFusi-

coccin

5+4 µMStauro-sporin

6+2µMK-252a

7+5 µMKN-62

8+200 nMBisindol-maleimid

A

GST-CDPK

GST-CT66

B

GST-CT66

GST-CDPK

97.4 kDa

45.0 kDa

66.2 kDa

31.0 kDa


3.5 Der Einfluss einer Phosphorylierung der H+-ATPase auf die Aktivität derProtonenpumpe

In den vorausgehenden Experimenten wurde gezeigt, dass der C-Terminus der Plasmamem-

bran-H+-ATPase durch die GST-CDPK in vitro phosphoryliert wird. In diesem Versuch sollte

nun geprüft werden, ob diese Phosphorylierung auch Konsequenzen auf die Aktivität der Pro-

tonenpumpe hat. So wurde der Einfluss der LeCPK1 auf die Aktivität der H+-ATPase in Plas-

mamembranvesikeln aus Lycopersicon esculentum (zur Verfügung gestellt von A. Schaller)

untersucht, wobei die Hydrolyse von ATP durch Quantifizierung des freigesetzten, anorgani-

schen Phosphats gemessen wurde (Abb. 11 zeigt den Versuchsablauf).

Die Phosphatfreisetzung wurde nach Lanzetta et al. (1979) mittels eines Phosphatreagenzes

bestimmt. Dabei kommt es zu einer Komplexbildung des Phosphats mit dem im Reagenz ent-

haltenen Malachitgrün und Molybdat, die zu einer Verschiebung des Absorptionsmaximums

führt. Diese wird als Farbveränderung des Ansatzes von gelb nach grün sichtbar. Durch Mes-

sung der Extinktion bei 660 nm und Vergleich der erhaltenen Werte mit einer Standardkurve

(siehe Abschnitt 6.2) konnte die Menge des durch ATP-Hydrolyse entstandenen freien Phos-

phates bestimmt werden.

Die Aktivität der Plasmamembran-H+-ATPase wurde dann wie folgt errechnet:

∆Ε = Relative Extinktion bei 660 nm

Auf diese Weise wird die Gesamtaktivität aller ATP-hydrolysierenden, Phosphat-freisetzenden

Enzyme ermittelt. Die Aktivität der Plasmamembran-H+-ATPase macht hiervon jenen Teil aus,

der sich als durch Orthovanadat hemmbar erweist. Orthovanadat ist ein starker Inhibitor der P-

Typ-ATPasen, zu denen auch die Plasmamembran-H+-ATPase gehört. Das Anion kompetitiert

dabei mit einem Phosphat des ATPs um die Phosphorylierungsstelle an dem für P-Typ-

ATPasen typischen Aspartat-Rest im aktiven Zentrum der ATP-Hydrolyse (Abb. 1 auf Seite 3).

rve)Standardku aus(Faktor wobei, 1000

in Aktivität ?E

nmolk

?t

k?Epkat

s

pmol =∗∗=

=


Die Differenz der gemessenen Aktivitäten in An- und Abwesenheit von Vanadat entspricht

demzufolge der gesamten Aktivität aller P-Typ-ATPasen. Dies entspricht in guter Näherung

der Plasmamembran-H+-ATPase-Aktivität, da die ebenfalls in der Plasmamembran lokalisier-

ten, zu den P-Typ-ATPasen gehörenden Ca2+-ATPasen quantitativ vernachlässigt werden kön-

nen (Taiz und Zeiger, 1998).

Die Plasmamembran-H+-ATPase PMA2 von Nicotiana plumbaginifolia besitzt eine maximale

Aktivität bei pH 6.0 (C. Oecking, Bochum, pers. Mitteilung). Nimmt man ein ähnliches Opti-

mum für die H+-ATPase-Isoformen von Lycopersicon esculentum an und möchte man eine

Inaktivierung der Protonenpumpe durch die LeCPK1 nachweisen, wäre es sinnvoll, die Mes-

sung in einem Puffer mit diesem pH-Wert durchzuführen. Vermutet man hingegen eine Akti-

vierung der H+-ATPase, müssen Bedingungen gewählt werden, bei denen das Enzym noch kei-

ne maximale Aktivität besitzt, z.B. bei pH 7.5 (C. Oecking, pers. Mitteilung). Da im vorliegen-

den Experiment der Einfluss einer Phosphorylierung durch die LeCPK1 auf die Aktivität der

Protonenpumpe unbekannt war, wurden die Versuche sowohl bei pH 6.0 wie auch bei pH 7.5

durchgeführt.

Übereinstimmend mit dem pH-Optimum der Plasmamembran-H+-ATPase PMA2 von Nicotia-

na plumbaginifolia wurde für die Tomaten-Protonenpumpe bei pH 6.0 gegenüber pH 7.5 eine

dreifach höhere Aktivität gemessen (Abb. 12). Weder bei pH 6.0, noch bei pH 7.5 hatte die

LeCPK1 einen signifikanten Einfluss auf die Aktivität der H+-ATPase (Abb. 12).

P-Typ-ATPasen

Andere ATP-hydrolysierendeEnzme

Gesamtaktivitätohne Vanadat

Aktivitätmit Vanadat

BerechneteAktivitätsdifferenz


Abb. 11: Schematische Darstellung des Versuchsablaufs zur Bestimmung der H+-ATPase-Aktivität

Das Experiment wurde wahlweise mit oder ohne GST-CDPK und Orthovanadat durchgeführt. Die Vorinkubationder Plasmamembran-Vesikel mit der GST-CDPK erfolgte bei pH 7.5, während die Aktivitätsmessung wahlweisebei pH 6.0 oder pH 7.5 durchgeführt wurde.Für eine detaillierte Beschreibung des Versuchsablaufs siehe Abschnitt 2.4.5.

Vorinkubations-Puffer, ±GST-CDPK,Plasmamembran-Vesikel

Messpuffer,±Orthovanadat

+ ATP

+ Phosphatreagenz

+ Natriumcitrat

Messung derExtinktion bei660 nm

2 h bei Raumtemperatur

60 s bei 38 °C

5 min bei 38 °C

Aktivitätsmessung:9 min bei 38 °C

25 min beiRaumtemperatur

Vorinkubation:30 min bei 25 °C

Start

Stop


Abb. 12: Einfluss der GST-CDPK auf die Aktivität der Plasmamembran-H+-ATPase aus Blättern vonLycopersicon esculentum.

Dargestellt sind die Aktivitäten der Plasmamembran-H+-ATPase in Plasmamembran-Vesikeln. Diese ergeben sichaus der Differenz der gemessenen Aktivitäten in An- und Abwesenheit von Orthovanadat im Messpuffer.

Das Experiment bei pH 7.5 wurde doppelt, jenes bei pH 6.0 dreifach in unabhängigen Versuchen durchgeführt,deren Ergebnisse gemittelt wurden. Die Fehlerindikatoren geben die prozentualen Abweichungen von diesen Mit-telwerten an.

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

pH 6.0 pH 7.5

H+-ATPase- Aktivität

[µmol * min-1 * mg

Membranprotein-1]mit CDPK

ohne CDPK


3.6 In vitro-Transkription/Translation und Myristoylierung der LeCPK1

Verschiedene Proteine in Hefe- und Säugetierzellen werden am N-Terminus co-translationell

über eine Peptidbindung mit Myristinsäure verkettet. Dabei katalysiert das Enzym N-

Myristoyltransferase die kovalente Bindung einer Myristinsäure an ein N-terminales Glycin,

das sich unmittelbar hinter dem Start-Methionin (das während der Translation abgespalten

wird) an erster Stelle des Polypeptides befindet (Russell et al., 1994).

Diese Protein-Acylierung scheint für viele Protein-Protein-Interaktionen und auch für die Pro-

tein-Membran-Assoziation bestimmter Proteine von entscheidender Bedeutung zu sein (John-

son et al., 1994). So schafft die ans Protein gebundene, gesättigte C14-Fettsäure eine erhöhte

Hydrophobizität, welche zusammen mit weiteren posttranslationellen Modifikationen ausrei-

chend gross ist, um das Protein in der Plasmamembran verankern zu können (Yalovsky et al.,

1999).

Die Substratspezifität der N-Myristoyltransferase in Hefe- und Säugetierzellen ist aufgeklärt

worden (Towler et al., 1987; Towler et al., 1988): Das erwähnte Glycin ist für eine N-terminale

Myristoylierung absolut notwendig, ebenso unentbehrlich ist eine auf das Glycin folgende un-

geladene Aminoäure. Ferner werden die Aminosäuren Serin und Threonin an Position 5 des

Polypeptides bevorzugt, aber nicht zwingend vorausgesetzt.

Obwohl die Protein-Myristoylierung in Pflanzen noch wenig untersucht ist, lässt die Aminosäu-

resequenz der LeCPK1 vermuten, dass auch dieses Enzym myristoyliert und eventuell in der

Plasmamembran verankert werden könnte. Um eine solche Verankerung nachzuweisen, wurde

der für die N-Myristoylierung essentielle Glycin-Rest mittels zielgerichteter Mutagenese gegen

Alanin ausgetauscht (Abb. 13) und eine mögliche Myristoylierung der Wildtyp-LeCPK1

(CDPKwt) und der Gly2Ala-Mutante (CDPKmut) in einem in vitro-Transkriptions-/Trans-

lationsexperiment untersucht.

Dazu wurden die beiden cDNAs in die XbaI-Schnittstelle des Vektors pBluescript SK(-) (im

folgenden Text pSK genannt) ligiert. Klone, die das cDNA-Insert in richtiger Orientierung re-

lativ zum T7-Promotor des Vektors enthielten, wurden durch Restriktionsanalyse identifiziert

(hier nicht gezeigt) und die Identität der Klone wurde durch Sequenzanalyse bestätigt (Abb.

14).


Abb. 13: N-terminale Aminosäuresequenzen der Wildtyp-LeCPK1 (CDPKwt) und der Gly2Ala-MutanteCDPKmut. Bei der CDPKmut ist der für die N-Myristoylierung essentielle Glycin-Rest mittels zielgerichteterMutagenese gegen Alanin ausgetauscht worden.

PK33 +--------------->T7 <----------------+PK52 <-----------------+PK54 <-----------------+PK53 <-----------------+T3 +------------------>CONSENSUS+--------------------------------------------------------->

|------|------|------|------|------|------|------|------|------|- 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

LePK52 +----->PK53 +----------------->T3 <------------------+PK54 +------------------->PK52 +--------------->PKNT1 +---------------->T7 +-------------->PK33 <----------------+CONSENSUS+----------------------------------------------->

|------|------|------|------|------|------|------|------|------|- 0 300 600 900 1200 1500 1800 2100 2400 2700

Abb. 14: Sequenzbestätigung der Konstrukte pSK-CDPKwt (oben) und pSK-CDPKmut (unten).Für die Sequenzierung der CDPKwt- bzw. CDPKmut-cDNA wurden mehrere Primer für Teilbereiche (je ca. 400Nukleotide) der LeCPK1-cDNAs verwendet. Zusätzlich wurden zwei Primer eingesetzt, die komplementär zu denT7- und T3-Promotorsequenzen des Vektors pBluescript SK(-) waren. Durch Überlappung der Fragmente konntendie gesamten cDNA-Sequenzen bestimmt und überprüft werden.

Diese Primerkarten wurden erstellt mit dem Programm GELASSEMBLE aus dem Softwarepaket GCG der Uni-versity of Wisconsin Genetics Computer Group.

CDPKwt:NH2–Met – Gly – Gly – Cys – Phe – Ser – ...

CDPKmut:NH2–Met – Ala – Gly – Cys – Phe – Ser – ...


Die Konstrukte wurden mit dem Restriktionsenzym NotI linearisiert. Anschliessend wurden die

cDNA-codierten Proteine in einem gekoppelten Weizenkeimextrakt in vitro-Transkriptions-

/Translationssystem in Anwesenheit von radioaktiv markierter [9,10-3H]-Myristinsäure oder

[35S]-Methionin exprimiert. Die Translationsprodukte wurden elektrophoretisch aufgetrennt

und die Inkorporation radioaktiven Methionins oder tritiierter Myristinsäure wurde fluoro-

graphisch nachgewiesen (Abb. 15).

Die Proteine CDPKwt und CDPKmut wurden in vergleichbaren Mengen translatiert (Abb. 15,

Spuren 3 und 4). Eine Markierung durch [9,10-3H]-Myristinsäure liess sich für die CDPKwt

(Abb. 15, Spuren 5 und 7), nicht aber für die CDPKmut (Abb. 15, Spuren 6 und 8) nachweisen.

Die LeCPK1 wird also in vitro tatsächlich myristoyliert, und diese Myristoylierung ist abhängig

von der intakten Erkennungssequenz.


Abb. 15: Myristoylierung der LeCPK1 in vitro.

Die cDNAs CDPKwt und CDPKmut wurden in vitro transkribiert und translatiert in Gegenwart von[35S]-Met (Spuren 1-4) oder [9,10-3H]-Myristinsäure (Spuren 5-8).Gezeigt ist eine Fluorographie nach elektrophoretischer Auftrennung der Translationsprodukte.

Spur 1: Als Templat für die Translation wurde eine Luciferase-cDNA benutzt (Positivkontrolle).Spur 2: Transkription/Translation ohne cDNA-Templat (Negativkontrolle).Spuren 3-4: Transkription/Translation der cDNAs pSK-CDPKwt und pSK-CDPKmut in Gegenwart

von [35S]-Met.Spuren 5-8: Transkription/Translation der cDNAs pSK-CDPKwt und pSK-CDPKmut in Gegenwart von

[9,10-3H]-Myristinsäure. Es wurden 5 µl (Spuren 5 und 6) bzw. 10 µl (Spuren 7 und 8)des in vitro-Translationsansatzes analysiert.

Einbau von [35S]-Met

97.4 kDa

31.0 kDa

45.0 kDa

66.2 kDa

1Luciferase-

cDNA

2ohne

cDNA

3pSK-

CDPKwt

4pSK-

CDPKmut

5pSK-

CDPKwt

6pSK-

CDPKmut

7pSK-

CDPKwt

Einbau von [9,10-3H]-Myristinsäure

LeCPK1Luciferase

8pSK-

CDPKmut


3.7 Transiente Expression der Fusionsproteine CDPKwt-EGFP undCDPKmut-EGFP in Zwiebelepidermiszellen

Nachdem im Abschnitt 3.6 gezeigt worden ist, dass die CDPKwt, nicht aber in die CDPKmut

N-terminal myristoyliert wird, wurden hier die Auswirkungen der Myristoylierung auf die Lo-

kalisation der LeCPK1 in vivo untersucht.

Dazu wurden die beiden cDNAs, die für die CDPKwt und die CDPKmut codieren, in die XbaI-

Schnittstelle des Vektors pcl60 ligiert. Klone, die das cDNA-Insert in richtiger Orientierung

relativ zum 35S-Promotor des Vektors enthielten, wurden durch Restriktionsanalyse identifi-

ziert (hier nicht gezeigt), und die Identität der Klone wurde durch Sequenzierung bestätigt

(Abb. 16).

PK33 +--------------->PKNT <-----------------+PK52 <--------------+PK54 <------------------+PK53 <---------------------+CONSENSUS+--------------------------------------------------------->

|------|------|------|------|------|------|------|------|------|- 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

LePK52 +-->PK53 +------------------->PK54 +----------------->PK52 +----------------->PKNT1 +----------------->PK33 <--------------+CONSENSUS+--------------------------------------------------------->

|------|------|------|------|------|------|------|------|------|- 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

Abb. 16: Sequenzbestätigung der Konstrukte pcl60-CDPKwt (oben) und pcl60-CDPKmut (unten).

Für die Sequenzierung der CDPKwt- bzw. CDPKmut-cDNA wurden mehrere Primer für Teilbereiche (je ca. 450Nukleotide) der LeCPK1-cDNAs verwendet. Zusätzlich wurden zwei Primer so eingesetzt, dass auch die angren-zenden Teile des Vektors, die das Insert umgeben, sequenziert wurden. Durch Überlappung der Fragmente konn-ten die gesamten cDNA-Sequenzen bestimmt und überprüft werden.

Diese Primerkarten wurden erstellt mit dem Programm GELASSEMBLE aus dem Softwarepaket GCG der Uni-versity of Wisconsin Genetics Computer Group.


Das Green Fluorescent Protein (GFP) ist ein fluoreszierendes Protein aus der pazifischen

Qualle Aequorea victoria (Chalfie und Tu, 1994) das bei Anregung mit Blaulicht (488 nm)

ohne die Zugabe von exogenen Substraten oder Kofaktoren Grünlicht (508 nm) emittiert. Pro-

teine, die an das 26 kDa grosse GFP gekoppelt werden, können in vivo am Fluoreszenz-

mikroskop lokalisiert werden. Das hier eingesetzte EGFP (Enhanced GFP, Clontech) weist

nach Substitution zweier Aminosäuren des Chromophors eine gegenüber dem Wildtyp-GFP um

ein Mehrfaches erhöhte Fluoreszenz auf (Cubitt et al., 1995).

Mittels der Mikroprojektiltechnik wurden Zwiebelepidermiszellen mit den cDNA-Konstrukten

pcl60, pcl60-CDPKwt und pcl60-CDPKmut transformiert. Alle drei Plasmide enthielten die

cDNA für das EGFP unter der Kontrolle des 35S-Promotors. Die Konstrukte pcl60-CDPKwt

und pcl60-CDPKmut codierten dabei für die CDPKs in C-terminaler Fusion mit EGFP. Zur

transienten Expression der cDNAs wurden die Zellen nach der Transformation während mind.

24 h inkubiert und dann mittels eines spektralen, konfokalen Laser-Scanning Mikroskopes un-

tersucht.

Das EGFP selbst (Abb. 17) liess sich sowohl im Cytoplasma als auch im Nukleus nachweisen,

wobei die Fluoreszenz im Vergleich mit den anderen Konstrukten relativ stark war. Die Va-

kuole, die bei den vollturgeszenten Epidermiszellen fast das ganze Zellvolumen erfüllt, blieb

ausgespart. Das Fusionsprotein CDPKwt-EGFP war im Bereich der Plasmamembran lokalisiert

(Abb. 18). Weder im Kern, noch im Cytoplasma war eine Fluoreszenz festzustellen. Das Fusi-

onsprotein CDPKmut-EGFP befand sich hingegen (wie das EGFP selbst) im Cytoplasma und

im Zellkern, nicht aber im Bereich der Plasmamembran (Abb. 19). Offenbar ist für eine Asso-

ziation mit der Plasmamembran eine intakte Myristoylierungsstelle erforderlich.


Abb. 17: Zwiebelepidermiszelle, transformiert mit pcl60.

Das transient exprimierte EGFP befindet sich im Cytoplasma und im Nukleus (N), nicht aber in der Vakuole (V).(200-fache Vergrösserung, Überlagerung des Durchlichtbildes mit dem grünen Fluoreszenz-Signal)

Abb. 18: Zwiebelepidermiszelle, transformiert mit pcl60-CDPKwt.

Das transient exprimierte Fusionsprotein CDPKwt-EGFP befindet sich im Bereich der Plasmamembran (PM).(200-fache Vergrösserung, Überlagerung des Durchlichtbildes mit dem grünen Fluoreszenz-Signal)

Abb. 19: Zwiebelepidermiszelle, transformiert mit pcl60-CDPKmut.

Das transient exprimierte Fusionsprotein CDPKmut-EGFP befindet sich im Cytoplasma (C) und im Nukleus (N).(200-fache Vergrösserung, Überlagerung des Durchlichtbildes mit dem grünen Fluoreszenz-Signal)

50 µm

50 µm

50 µm

N

N

PM

N

C

V

V

V


3.8 Transiente Expression der Fusionsproteine CDPKwt-EGFP undCDPKmut-EGFP in Lycopersicon peruvianum-Zellen aus Suspensionskultur

Im vorausgehenden Experiment wurde die mit dem EGFP fusionierte LeCPK1 heterolog in

Zwiebelepidermiszellen exprimiert. Dabei konnte die Wildtyp-Kinase im Bereich der Plasma-

membran lokalisiert werden. Weil es sich bei der hier klonierten und untersuchten LeCPK1 um

ein Protein aus L. esculentum handelt und eine Rolle dieser Proteinkinase in der Alkalisie-

rungsantwort von L. peruvianum-Zellen auf Systemin vermutet wird, wurden im vorliegenden

Experiment L. peruvianum-Zellen transformiert. Sieben Tage alte Zellen einer Suspensions-

kultur von L. peruvianum wurden also in ähnlicher Weise wie die Zwiebelepidermiszellen

mittels der Mikroprojektiltechnik mit den Konstrukten pcl60, pcl60-CDPKwt und pcl60-

CDPKmut transformiert. Anschliessend wurde die Lokalisation der transient exprimierten und

fluoreszierenden Proteine im spektralen, konfokalen Laser-Scanning Mikroskop untersucht.

Die L. peruvianum-Zellen, deren Durchmesser etwa achtmal kleiner war als die Länge der

Zwiebelepidermiszellen, wiesen eine für Suspensionskulturzellen typische kugelige Form auf.

Die Zentralvakuole wurde jeweils von vielen cytoplasmatischen Bereichen ("Cytoplasma-

Strängen") durchzogen. Weil die Zellen leicht plasmolysiert waren, hatte sich der Protoplast an

einigen Stellen von der Zellwand gelöst (Abb. 20 und 22).

Die Lokalisation der überexprimierten Proteine stimmte mit der in den Zwiebelepidermiszellen

weitgehend überein: Das EGFP selbst wurde sowohl im Cytoplasma als auch im Kern löslich

exprimiert, nicht aber in der Vakuole (Abb. 20). Das Fusionsprotein CDPKwt-EGFP war aus-

schliesslich im Bereich der Plasmamembran lokalisiert (Abb. 21). Das CDPKmut-EGFP-

Fusionsprotein hingegen befand sich wie das EGFP selbst im Cytoplasma und im Kern (Abb.

22). Auch in den L. peruvianum-Zellen wirkte sich also das Fehlen einer Myristoylierungsstelle

in der CDPKmut auf die intrazelluläre Lokalisierung der Kinase aus.


Abb. 20: Lycopersicon peruvianum-Zelle aus Flüssigkultur,transformiert mit dem Konstrukt pcl60.

Das transient exprimierte EGFP befindet sich im Cytoplasma(C) und im Nukleus (N), nicht aber in der Vakuole (V). DerProtoplast hat sich an gewissen Stellen von der Zellwandgelöst, was auf eine leichte Plasmolyse hindeutet.

(1000-fache Vergrösserung, Überlagerung des Durchlicht-bildes mit dem grünen Fluoreszenz-Signal)

Abb. 21: Lycopersicon peruvianum-Zelle aus Flüssigkultur,transformiert mit dem Konstrukt pcl60-CDPKwt.

Das transient exprimierte Fusionsprotein CDPKwt-EGFPbefindet sich im Bereich der Plasmamembran (PM). ImZellkern und den cytoplasmatischen Bereichen ist keineFluoreszenz sichtbar.


Abb. 22: Lycopersicon peruvianum-Zelle aus Flüssigkultur,transformiert mit dem Konstrukt pcl60-CDPKmut.

Das transient exprimierte Fusionsprotein CDPKmut-EGFPbefindet sich im Cytoplasma und im Nukleus.


10 µm

10 µm

10 µm

N

N

N

C

C

PM

V

V

V


3.9 Titration einer GST-CDPK-Lösung mit CaCl2 unter paralleler Aufnahmedes Fluoreszenzspektrums

Die CDPKs verfügen über eine C-terminale, Calmodulin-ähnliche Domäne mit bis zu vier

Ca2+-Bindestellen, sogenannten EF-Hand-Motiven. Es wird vermutet, dass durch Bindung von

freien Ca2+-Ionen die Calmodulin-ähnliche Domäne eine unmittelbar benachbarte Region der

katalytischen Domäne binden kann, wodurch das Enzym aktiviert wird (Binder et al., 1994;

Harmon et al., 1994; Yoo und Harmon, 1996). Die dadurch verursachte Konformationsände-

rung führt möglicherweise zu einer veränderten Tryptophan-Fluoreszenz. Hier sollte durch

Messung solcher Änderungen während der Titration der GST-CDPK mit CaCl2 die Dissoziati-

onskonstanten für Calcium ermittelt werden.

Mit zunehmender Ca2+-Konzentration im Ansatz nahm die relative Fluoreszenz gegenüber den

Anfangswerten über das gesamte Spektrum nichtlinear ab (Abb. 23a), was auf eine Konforma-

tionsänderung der GST-CDPK nach Ca2+-Bindung hinweist. Nach der Titration wurde die stei-

gende Ca2+-Konzentration im Ansatz gegen die bei 325 nm maximale, relative Fluoreszenzab-

nahme aufgetragen (Abb. 23b). Anschliessend wurde durch mathematische Interpolation ver-

sucht, die Messpunkte dem Graphen einer stöchiometrischen Funktion zuzuordnen.

Dabei beschrieb die zweifach hyperbolische Funktion

x = Ca2+-Konzentration im Ansatz [µM]

y = Relative Fluoreszenzabnahme bei 325 nm [%]

den Verlauf der gegebenen Messpunkte am besten (mit einem Determinationskoeffizienten

Rsqr von 0.993), wenn die Konstanten b und d auf Werte von von 0.59 µM und 54.85 µM ge-

setzt wurden. b und d repräsentieren dabei zwei verschiedene Dissoziationskonstanten, die als

Mittelwerte aus zwei unabhängig durchgeführten Experimenten erhalten wurden.

Offenbar besitzen von den vier Ca2+-Bindestellen der LeCPK1 je zwei eine niedrige Dissoziati-

onskonstante von 0.6 µM (bzw. eine hohe Ca2+-Affinität), während die anderen beiden Binde-

stellen eine hohe Dissoziationskonstante von 55 µM (bzw. eine niedrige Affinität für Ca2+)

aufweisen.

xd

xc

xb

xaf(x)y

+∗+

+∗==


Abb. 23: Relative Fluoreszenzabnahme der GST-CDPK bei der Titration mit CaCl2.

A: Bei der Titration einer 0.5 µM GST-CDPK-Lösung mit CaCl2 nimmt die relative Fluoreszenz nach Anregungbei 280 nm über das gesamte Spektrum ab.

B: Auftragung der relativen Fluoreszenzabnahme bei 325 nm. Die Punkte repräsentieren die gemessenen Werte,während die ausgezogene Linie den Graphen der angegebenen, interpolierten Funktion darstellt. Die angege-benen Konstanten b und d der Funktion entsprechen zwei verschiedenen Dissoziationskonstanten der vierCa2+-Bindestellen der GST-CDPK.

Die GST-CDPK-Lösung lag in 50 mM HEPES-Puffer pH 7.5 vor. Die CaCl2-Titration erfolgte in 2 µl-Schrittenbis zu einer Konzentration von 0.46 mM im Ansatz. Gezeigt ist der erste von zwei unabhängig durchgeführtenVersuchen. Die Daten wurden mit den Programmen Excel 97 (Microsoft) und SigmaPlot 6.0 (SPSS Inc.) ausge-wertet.

300 320 340 360 380 4000

20

40

60

80

100

120

140R

elat

ive

Flu

ores

zenz

[%]

Wellenlänge der Fluoreszenz [nm]

0 100 200 300 400 500

0

10

20

30

40

50

Ca2+-Konzentration [µM]

Rel

ativ

e F

luor

esze

nzab

nahm

e [%

]

b

ei 3

25 n

m

Data fitting according to equationf = a*x/(b+x)+c*x/(d+x)

b = Kd 1: 0.6 µMd = Kd 2: 66 µM

ohne Ca2+

0.46 mM Ca2+

A

B

4. Diskussion Seite 59

IV. DISKUSSION

Bei einer ersten Charakterisierung der LeCPK1 nach der Klonierung des Enzyms aus einer

cDNA-Bibliothek von Lycopersicon esculentum wurde festgestellt, dass eine Fusicoccin-

Behandlung von Tomatenblättern zu einer erhöhten Akkumulation von LeCPK1-Transkripten

führte (Stalder, 2000).

Es wurde deshalb vorgeschlagen, dass die LeCPK1 an der Regulation von Abwehrreaktionen

der Tomatenpflanze bei pathogener Infektion oder Verwundung durch Herbivoren beteiligt sein

könnte. Eine mögliche Funktion der LeCPK1 wäre dabei die Modulierung der Aktivität der

Plasmamembran-H+-ATPase, welche an den erwähnten Abwehrreaktionen beteiligt ist (Blum

et al., 1988; Johansson et al., 1993;Vera-Estrella et al., 1994; Schaller und Oecking, 1999).

Um eine Rolle in einer Pathogen-induzierten Signaltransduktionkette einnehmen zu können,

müsste die LeCPK1 durch Ca2+-Konzentrationen, wie sie in der lebenden Zelle auftreten, akti-

viert werden können. Zudem müsste sie Zugang zum potentiellen Substrat besitzen, was bei

einer Co-Lokalisation der LeCPK1 und der H+-ATPase an der Plasmamembran gewährleistet

wäre. Ausserdem wäre es notwendig, dass die LeCPK1 die H+-ATPase als Substrat erkennen

und phosphorylieren könnte.

Diese drei Bedingungen für eine Funktion der LeCPK1 in einer Pathogen-induzierten Signal-

transduktionskette wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit untersucht und sollen im Fol-

genden diskutiert werden.


4.1 Die Bindung von Calcium an die LeCPK1

Es wurde bereits von Stalder gezeigt, dass die C-terminale Domäne der LeCPK1 eine funktio-

nelle, Ca2+-bindende Domäne ist (Stalder, 2000). Für die mit GST fusionierte LeCPK1, nicht

aber ein um 143 Aminosäuren am C-Terminus verkürztes Fusionsprotein, konnte die Bindung

von 45Ca2+ nachgewiesen werden. Zudem wurde gezeigt, dass die Ser/Thr-Proteinkinase-

Aktivität der LeCPK1 sowohl von Ca2+ als auch von der Ca2+-bindenden Domäne abhängig ist

(Stalder, 2000). Diese Befunde stehen im Einklang mit gängigen Vorstellungen, nach denen es

in Folge von Ca2+-Bindung zu einer Konformationsänderung pflanzlicher CDPKs kommt, die

zur Aktivierung der Kinase führt. Im inaktiven Zustand blockiert die zentrale, autoregulatori-

sche Domäne als Pseudosubstrat den Zugang zum aktiven Zentrum. Eine Ca2+-induzierte Kon-

formationsänderung entfernt die autoregulatorische Domäne, wodurch das aktive Zentrum zu-

gänglich und die Proteinkinase aktiviert wird (Harmon et al., 1994; Yoo und Harmon, 1996;

Huang et al., 1996).

Derartige Konformationsänderungen gehen oft mit Veränderungen im Fluoreszenzspektrum

des Proteins einher, die auf Veränderungen in der molekularen Umgebung aromatischer Ami-

nosäuren (insbesondere Trp) zurückzuführen sind. In der Tat finden sich in der katalytischen

Domäne der LeCPK1 vier Trp-Reste (an den Positionen 289, 306, 329 und 362; Abb. 4 auf

Seite 11). Infolge veränderter Exposition dieser Trp-Reste nach Ca2+-Bindung und dadurch

induzierter Konformationsänderung ist bei der Aktivieung der LeCPK1 eine Änderung der

Tryptophan-Fluoreszenz zu erwarten.

Bei Titration der Proteinkinase mit CaCl2 wurde mit zunehmender Menge gebundenen Calci-

ums eine Abnahme der relativen Fluoreszenz über das gesamte Spektrum festgestellt, welche

bei 325 nm am ausgeprägtesten war. Dabei wurden zwei Klassen von Calcium-Bindestellen

beobachtet, die sich deutlich in ihrer Affinität unterschieden. Die grösste Fluoreszenzänderung

war bei Absättigung der hochaffinen Bindestellen (Kd = 0.6 µM) zu beobachten, bei der Kon-

zentration also, die vermutlich in vivo zur Aktivierung des Enzyms führt. Bei Sättigung der

weniger affinen Bindestellen (Kd = 55 µM) waren dagegen nur noch geringfügige Änderungen

festzustellen. Allerdings muss hier einschränkend gesagt werden, dass die Bindung von Calci-

um in Abwesenheit von Substraten gemessen wurde. Es ist durchaus möglich, dass sich die

Affinität für Ca2+ in Anwesenheit eines Kinasesubstrats von den gemessenen Werten unter-

scheidet (Lee et al., 1998).


Die Ca2+-bindende Domäne pflanzlicher CDPKs weist strukturelle Verwandtschaft mit Calmo-

dulin auf. Calmodulin ist ein in eukaryotischen Zellen ubiquitär vorhandenes, regulatorisches

Protein mit einem Molekulargewicht von 17 kDa, das durch die Bindung von Ca2+-Ionen an

vier Bindestellen einer Konformationsänderung unterworfen ist (Alberts et al., 1994). Bei die-

ser Veränderung der räumlichen Struktur werden zwei hydrophobe Taschen exponiert, mit de-

nen Calmodulin an viele verschiedene Zielproteine binden und diese in ihrer Aktiviät modulie-

ren kann. Die Ca2+-Bindestellen von Calmodulin werden durch vier Helix-Loop-Helix-Motive,

sogenannte EF-Hand-Domänen, gebildet. Eine solche Bindestelle besteht aus 36 Aminosäuren,

von denen zwölf an der Koordination des Ca2+-Kations ins Protein beteiligt sind, während die

übrigen Reste zwei a-Helices bilden, welche die Bindestelle umgeben (Abb. 24b). Je zwei be-

nachbarte EF-Hand-Motive werden durch ein antiparalleles ß-Faltblatt verbunden, das durch

eine Konformationsänderung eine kooperative Bindung von Ca2+ an die beiden Bindestellen

ermöglicht. Eine 2 nm lange, flexible a-Helix schliesslich verbindet das EF-Hand-Paar am N-

Terminus des Calmodulins mit den zwei Bindestellen am C-Terminus (Abb. 24a, Babu et al.,

1985).

Die Ca2+-Bindung von Calmodulin wurde eingehend untersucht, u.a. mittels isothermaler Mi-

kro-Titrationskalorimetrie (Gilli et al., 1998). Dabei stellte sich heraus, dass die zwei C-ter-

minalen Bindestellen mit den Dissoziationskonstanten von 0.54 µM und 0.81 µM hochaffin

sind, während die gegenüberliegenden EF-Hand-Motive niedrigaffine Bindestellen enthalten

(Kd = 2.27 µM und 10 µM). Diese Asymmetrie setzt sich auch in der Art der Ligandenbindung

fort. So sind die Bindungen auf der C-terminalen Seite Enthalpie- und Entropie-getrieben, wäh-

rend die diejenige am N-Terminus ausschliesslich Entropie-getrieben ist.


Abb. 24: Calmodulin aus dem Hirngewebe von Homo sapiens.

A Dreidimensionales Strukturmodell von Calmodulin. Jeweils ein Ca2+-Ion wird in einem Helix-Loop-Helix-Motiv, der sogenannten EF-Hand-Domäne, gebunden. Je zwei EF-Hand-Domänen werden durch ein ß-Faltblattzusammengehalten und mit den gegenüberliegenden zwei Bindestellen über eine lange, flexible a-Helix verbun-den. (nach Babu et al., 1988; Strukturmodell von B. Rupp, Lawrence Livermore National Laboratory, Universityof California)

B Schematische Aufzeichnung der Peptidsequenz von Calmodulin. Jeweils zwölf Aminosäuren bilden einenLoop und sind an der Ca2+-Bindung beteiligt. Dabei wird das Kation siebenfach koordiniert, wobei als siebterBindungspartner ein Wassermolekül (nicht gezeigt) dient. Die grünlich gefärbten Aminosäuren bilden a-Helices,die ungefärbten ß-Faltblatt-Strukturen (nach Babu et al., 1988; Darstellung von J. I. Garcia, St. Edward's Univer-sity, Austin, Texas).

Für die in dieser Arbeit charakterisierte LeCPK1 sagt das Programm "PROSITE" (http://www.-

expasy.ch) ebenfalls vier EF-Hand-Motive voraus (Abb. 4 auf Seite 11). Die wichtige Rolle

dieser EF-Hand-Domänen in der Ca2+-Bindung und Regulation von Ca2+-abhängigen Protein-

kinasen ist von Hong et al. gezeigt worden (Hong et al., 1996).

Es ist wahrscheinlich, dass die bei der Titration der GST-CDPK beobachteten zwei Klassen

von Ca2+-Bindestellen den zwei hoch- und niederaffinen Bindestellen des Calmodulins entspre-


chen. Auch für eine CDPK aus Plasmodium falciparum ist durch zielgerichtete Mutagenese

gezeigt worden, dass sich die vier EF-Hand-Motive funktionell unterscheiden. Mutationen in

den zwei Bindestellen nahe der katalytischen Domäne hatten drastische Effekte auf die Ca2+-

Bindung und die Aktivität der Kinase, während Mutationen in den zwei C-terminalen EF-

Hand-Motiven nur geringfügige Konsequenzen hatten (Zhao et al., 1994). Dieser Befund unter-

stützt die Interpretation, dass Ca2+-Bindung an die hochaffine Klasse von Bindestellen relevant

für die Aktivierung der LeCPK1 ist. In der Tat scheint die Bindung von 1 bis 2 Mol-

Äquivalenten Ca2+ ausreichend für die Aktivierung der CDPKs zu sein (Zhao et al., 1994; Lee

et al., 1998). Die cytoplasmatische Konzentration freien Calciums liegt im Ruhezustand typi-

scherweise bei 0.1 µM oder tiefer und erhöht sich bei Stimulation der Zelle auf Werte um 1

µM. Mit einer Dissoziationskonstante von 0.6 µM für die hochaffinen Bindestellen ist die

LeCPK1 in der Lage, mit einer Aktivierung auf diese Änderung der Konzentration freien Cal-

ciums zu reagieren.

In weitergehenden Versuchen könnten mittels isothermaler Titrations-Mikrokalorimetrie alle

vier Dissoziationskonstanten sowie die thermodynamischen Parameter Bindungsenthalpie ∆H,

freie Reaktionsenthalpie ∆G sowie die Entropie ∆S der Ca2+-Bindung an die LeCPK1 bestimmt

werden. Erst die Aufklärung der dreidimensionalen Struktur einer CDPK jedoch wird die Kon-

formationsänderung der Kinase bei Ca2+-Bindung endgültig bestätigen können.

Abschliessend soll darauf hingewiesen werden, dass sowohl für die Bestimmung der Ca2+-

Affinität als auch in den H+-ATPase-Phosphorylierungs-Experimenten ein GST-Fusionsprotein

der LeCPK1 eingesetzt worden ist. Obwohl die Glutathion-S-Transferase lediglich ein Viertel

des Fusionsproteines GST-CDPK ausmacht und das Fusionsprotein alle Charakteristika einer

CDPK aufwies, ist nicht ganz auszuschliessen, dass es aufgrund dieser Modifikation im Ver-

gleich zur Wildtyp-Kinase veränderte Eigenschaften besitzt. Alle Versuche, den GST-Teil des

Fusionsproteines nach erfolgter Reinigung mit dem Faktor Xa proteolytisch abzuspalten,

scheiterten jedoch, da diese Protease die Peptidsequenz nicht nur an der dafür vorgesehenen

Schnittstelle, sondern auch innerhalb der LeCPK1-Sequenz schnitt (nicht gezeigt). Der Ort der

internen Spaltung wurde durch N-Terminale Sequenzierung des Abbauproduktes ermittelt

(nicht gezeigt). Aber auch durch Zerstörung dieser Erkennungssequenz innerhalb der LeCPK1-

Sequenz durch zielgerichtete Mutation zweier Aminosäuren konnte die unerwünschte Proteoly-

se durch den Faktor Xa nicht ganz verhindert werden (Frick, 2001).


4.2 Subzelluläre Lokalisation der LeCPK1

Die vorgeschlagene Rolle der LeCPK1 als Regulator der Plasmamembran-H+-ATPase erfordert

eine räumliche und zeitliche Co-Lokalisation von H+-ATPase und LeCPK1. Stalder zeigte be-

reits, dass die LeCPK1 in Blättern von Tomatenpflanzen exprimiert wird und dass die Tran-

skripte nach Behandlung mit Fusicoccin akkumulieren (Stalder, 2000). Die subzelluläre Lokali-

sation der LeCPK1 ist aber bisher nicht untersucht worden. Die Primärstruktur der LeCPK1

weist keine ausgedehnten Bereiche hydrophober Aminosäuren auf, die auf Membranständigkeit

hindeuten würden. Eine solche könnte daher allenfalls durch posttranslationelle Modifikationen

bewirkt werden. So wäre eine Lipid-Modifizierung durch kovalente Bindung von mehrfach

gesättigten Fettsäuren (Myristinsäure, C14 oder Palmitinsäure, C16) oder Prenylierung (Farne-

sylierung, C15 oder Geranylgeranylierung, C20) denkbar (Resh, 1999 und Rodriguez-Concep-

tion et al., 1999). Eine Myristoylierung des Aminoterminus ist nach co-translationeller Ab-

spaltung des Start-Methionins möglich. Hierbei wird die Aminogruppe eines N-terminalen

Glycin-Restes mit der Carboxylatgruppe der Myristinsäure verknüpft. Befindet sich in der Nä-

he des Myristinsäure-bindenden Glycins ein Cystein-Rest, kann das Protein an dieser Stelle

palmitoyliert werden (Mumby, 1997). Dabei wird Palmitinsäure über eine reversible Thioester-

bindung durch eine Palmitoyltransferase an die Sulfhydrylgruppe des Cysteins gebunden

(Casey, 1995).

Für eine Verankerung des Proteins in der Plasmamembran reicht alleinige Myristoylierung

nicht aus (Peitzsch und McLaughlin, 1993). Die "kinetic bilayer trapping"-Hypothese postu-

liert, dass ein myristoyliertes Protein zwar mit der Plasmamembran assoziieren kann, aber erst

durch eine dort stattfindende Palmitoylierung in der Membran verankert wird (Abb. 25a und

25c, Shahinian und Silvius, 1995). Eine Myristoylierung an Gly2 erleichtert die Palmitoylierung

an Cys3, ist aber dafür nicht unbedingt notwendig (Degtyarev et al., 1994).

Im Falle der Prenylierung kommt es zur Bildung einer Thioetherbindung zwischen Farnesyl

bzw. Geranylgeranyl und dem Cystein-Thiol einer konservierten, C-terminalen Sequenz, der

sogenannten CaaX-Box. In diesem Motiv repräsentiert a eine beliebige aliphatische Aminosäu-

re und X im Falle von Geranylgeranylierung ein Leucin, im Falle von Farnesylierung ein Serin,

Methionin, Cystein, Alanin oder Glutamin (Zhang und Casey, 1996; Rodriguez-Conception et

al., 1999). Bei der Prenylierung werden alle C-terminal vom modifizierten Cystein liegenden

Aminosäuren abgespalten und das neue Carboxy-Ende methyliert. Wie bei der Myristoylierung


und Palmitoylierung kann auch durch Prenylierung die subzelluläre Lokalisation eines Proteins

beeinflusst werden. Ausserdem werden durch die hydrophoben Prenyl-Gruppen unter Umstän-

den neue Protein-Protein-Interaktionen möglich (Rodriguez-Conception et al., 1999).

Neben den erwähnten kovalenten Modifikationen spielt auch die Nettoladung des Proteins für

eine mögliche Membran-Assoziation eine Rolle; ist sie positiv, oder besitzt das Protein eine

exponierte, polybasische Domäne, so ist eine Interaktion mit den negativ geladenen, polaren

Kopfgruppen der Membran-Phospholipide auch dann möglich, wenn das Protein nur einfach

acyliert vorliegt (Abb. 25b, Bhatnagar und Gordeon, 1997). Gleichmassen ist eine Verankerung

eines einfach acylierten Proteins möglich, wenn dieses mit einem anderen Membranprotein

interagiert und die Assoziation mit der Plasmamembran dadurch unterstützt wird (Abb. 25d).

Durch eine solche Interaktion kann ein acyliertes Protein auch spezifisch mit der Membran

eines bestimmten Organells interagieren, an der sich der Bindungspartner befindet.

Myristinsäure

Abb. 25: Die Membran-Assoziation von myristoylierten Proteinen (nach Resh, 1999)

A: Für die Verankerung eines einfach myristoylierten Proteines in der Membran sind weitere Faktoren erforder-lich: siehe B-D.B: Eine polybasische Domäne des Proteins ermöglicht zusätzliche, elektrostatische Wechselwirkungen mit densauren Kopfgruppen der Phospholipide.C: Eine oder zwei zusätzliche Palmitinsäureketten erhöhen die hydrophoben Interaktionen mit der Membran.D: Auch Protein-Protein-Interaktionen mit membrangebundenen Proteinen können die Membraninteraktion voneinfach acylierten Proteinen verstärken.

Myristin-säure undpolybasischeDomäne

Myristin-säure und Pal-mitinsäure

Myristinsäureund Protein-Protein-Interaktion

A B C D


Während eine Prenylierung der LeCPK1 auszuschliessen ist, deutet die aminoterminale Se-

quenz des Enzyms auf eine mögliche Modifizierung durch Myristinsäure und Palmitinsäure

hin. Eine kovalente Bindung der Myristinsäure wurde experimentell nachgewiesen und erwies

sich als abhängig vom Glycin-Rest an zweiter Position des Polypeptids (siehe Abschnitt 3.6).

Ein Glycin-Rest an dieser Position wird als essentiell für die Myristoylierung erachtet (Johnson

et al., 1994). Übereinstimmend war im Falle der Gly2Ala-Mutante (CDPKmut) keine Myri-

stoylierung nachzuweisen. Eine Palmitoylierung an Cys4 der LeCPK1 ist wahrscheinlich, wurde

aber im Rahmen dieser Arbeit nicht untersucht. Darüber hinaus weist der Aminoterminus der

LeCPK1 auch einige basische Aminosäuren auf (Lys7 und Lys8, Abb. 26), die eine Membran-

Assoziation der LeCPK1 zusätzlich unterstützen könnten.

Abb. 26: Hypothetische Struktur des N-Terminus der posttranslationell modifizierten LeCPK1.Das Start-Methionin wurde bei der Translation abgespalten. Der Glycin-Rest wurde bei der CDPKmut durch einAlanin ersetzt, was mit hoher Wahrscheinlichkeit sowohl eine Myristoylierung als auch eine Palmitoylierung ver-unmöglichte.

Eine Aminoterminale Myristoylierung wurde in vitro auch für eine CDPK aus Zucchini nach-

gewiesen (Ellard-Ivey et al., 1999). Bei einer CDPK aus Oryza sativa konnte in vitro neben der

Myristoylierung auch eine Palmitoylierung der Proteinkinase gezeigt werden (Martin und

Busconi, 2000).

Die subzelluläre Lokalisation der LeCPK1 wurde nach transienter Expression in Fusion mit

dem Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) untersucht. Die LeCPK1 befand sich aus-

schliesslich im Bereich der Plasmamembran, sowohl in transformierten Zellen der Zwiebelepi-

dermis als auch in Zellen von Lycopersicon peruvianum aus Suspensionskultur (siehe Ab-

schnitte 3.7 und 3.8). Im Gegensatz dazu erwies sich die Gly2Ala-Mutante der LeCPK1 als

löslich und fand sich im Cytoplasma und im Kern, ebenso wie das EGFP selbst. Eine Myri-

stoylierung an Gly2 und die vermutlich sich anschliessende Palmitoylierung an Cys4 sind also

notwendig und hinreichend für die Lokalisierung der LeCPK1 auf der cytoplasmatischen Seite

der Plasmamembran.

Gly – Gly – Cys – Phe – Ser – Lys – Lys – ...

Myristat Palmitat

+ +


Es ist bemerkenswert, dass das nicht-myristoylierte Fusionsprotein CDPKmut-EGFP im Kern

vorzufinden war, obwohl es mit einem Molekulargewicht von 87 kDa im Gegensatz zum EGFP

selbst (26 kDa) eigentlich zu gross ist, um passiv vom Cytoplasma durch die Kernporen in den

Nucleus zu diffundieren (Nigg, 1997; Buchanan et al., 2000).

Ein passiver Eintritt in den Kern mag durch die starke, transiente Überexpression des Proteins

im Cytoplasma begünstigt sein. Eine andere Erklärungsmöglichkeit wäre, dass die Aminosäure-

Sequenz von EGFP ein schwaches Kernlokalisierungssignal enthält, welches bei normaler My-

ristoylierung nicht zum Tragen kommt. In der Tat gleicht das Motiv Pro347-Arg348-Lys349-

Arg350 der LeCPK1 dem Kernlokalisierungssignal des "SV40 largeTAntigen" (gemäss Se-

quenzvergleich mit dem Programm "PSORT" auf http://www.expasy.ch).

Es wäre also denkbar, dass die LeCPK1 unter bestimmten Umständen auch im Kern auftritt.

Obwohl es sich nämlich bei den diskutierten Lipid-Modifikationen um kovalente Veränderun-

gen des Proteins handelt, ist dadurch die Lokalisation des Proteins nicht notwendigerweise sta-

tisch und unveränderlich. So ist beispielsweise Recoverin, ein Ca2+-bindendes Protein, das die

Membran-assoziierte Rhodopsinkinase in den retinalen Stäbchenzellen von Vertebraten inhi-

biert, stets myristoyliert. Nur in Folge von Ca2+-Bindung aber wird die Myristinsäurekette so

exponiert, dass eine reversible Verkankerung in der Plasmamembran und eine Inaktivierung der

Rhodopsinkinase möglich ist. Ca2+ ist hier also Regulator für den Aufenthalts- und Wirkungs-

ort des Recoverin-Proteines (Ames et al., 1997). Auch das in Flagellen von Trypanosoma cruzi

vorkommende "flagellar calcium binding protein", das N-terminal sowohl myristoyliert als

auch palmitoyliert wird, assoziiert nur nach Ca2+-Bindung mit der Plasmamembran des Flagel-

lums (Godsel und Engman, 1999).

Ein ähnlicher Mechanismus könnte auch im Falle der LeCPK1 zu einer Stimulus-abhängigen

Lokalisation im Kern oder der Plasmamembran führen. Viele der bisher untersuchten CDPKs

sind im Kern (Li et al., 1991, Pisum sativum) und/oder in Assoziation mit der Plasmamembran

(Schaller et al., 1992, Avena sativa; Klimczak und Hind, 1990, Hordeum vulgare; Ivata et al.,

1998, Nicotiana tabacum; Abo-El-Saad und Wu, 1995, Oryza sativa; Verhey et al., 1993,

Cucurbita pepo; Baizabal-Aguirre und de la Vara, 1997, Beta vulgaris; Ohto und Nakamura,

1995, Nicotiana tabacum) nachgewiesen worden. Kürzlich wurde bei der Charakterisierung

einer CDPK aus Mesembryanthemum crystallinum festgestellt, dass die Proteinkinase abhängig

von der extrazellulären Ca2+-Konzentration entweder Plasmamembran-assoziiert oder löslich

im Kern lokalisiert vorliegt (Patharkar und Cushman, 2000). Ein derartiges Phänomen war al-


lerdings bei transienter Expression von CDPKwt-EGFP in Zellen von Lycopersicon peruvia-

num nicht zu beobachten. Auch nach Chelatierung extrazellulären Calciums durch EGTA oder

nach Behandlung der Zellsuspension mit Systemin erwies sich das Fusionsprotein als Plasma-

membran-assoziiert. Die Signifikanz des putativen Kernlokalisierungssignals bleibt also vorerst

ungeklärt.

4.3 Phosphorylierung der Plasmamembran-H+-ATPase

In den Abschnitten 3.7 sowie 3.8 wurde gezeigt, dass die untersuchte LeCPK1 in vivo Plasma-

membran-assoziiert ist. Weil sie sich damit in der Nähe der Plasmamembran befindet, wäre es

denkbar, dass die Protonenpumpe ein Substrat der Proteinkinase ist.

Die Aktivität der Plasmamembran-H+-ATPase wird u.a. durch die autoinhibitorisch wirkende

C-terminale Domäne moduliert. Werden die letzten 51 Aminosäuren des C-Terminus der H+-

ATPase AHA2 von Arabidopsis thaliana durch Trypsin-Behandlung entfernt, nimmt die proto-

nenpumpende Aktivität der H+-ATPase zu (Palmgren et al., 1990 und Palmgren et al., 1991).

Bereits 1988 wurde gezeigt, dass die Plasmamembran-H+-ATPase aus Wurzeln von Avena sa-

tiva Ca2+-abhängig phosphoryliert wird (Schaller, 1988). Ferner wurde festgestellt, dass die H+-

ATPase aus Blättern von Spinacia oleracea an Thr948, der zweitletzten Aminosäure am C-

Terminus der Protonenpumpe, phosphoryliert wird (Olsson et al., 1998).

Es wäre also denkbar, dass die LeCPK1 die H+-ATPase im Bereich des C-Terminus phospho-

rylieren und damit die Aktivität der Protonenpumpe beeinflussen kann, was im Rahmen dieser

Arbeit untersucht wurde.

Im Phosphorylierungs-Experiment (siehe Abschnitt 3.2) wurde gezeigt, dass die LeCPK1 die

C-Termini GST-CT56 und GST-CT66 der Plasmamembran-H+-ATPase in vitro phospho-

rylieren kann. Durch Abspaltung des GST-Anteils konnte gezeigt werden, dass die Phosphory-

lierung am C-Terminus selbst und nicht etwa am GST-Anteil des Fusionsproteins stattfindet

(siehe Abschnitt 3.4). Dies steht mit ähnlichen Versuchen im Einklang, bei denen ebenfalls die

C-terminale Region einer Plasmamembran-H+-ATPase aus Wurzelzellen von Zea mays durch

eine (unbekannte) Ca2+-abhängige Proteinkinase in vitro phosphoryliert wurde (Camoni et al.,

1998).


Die Tatsache, dass praktisch keine Unterschiede zwischen der Phosphorylierung des längeren

(66 AS) und des kürzeren (56 AS) C-Terminus feststellbar waren, wurde bereits im Ergebni-

steil diskutiert. Offenbar befinden sich an den zehn zusätzlichen Aminosäuren des längeren C-

Terminus keine Phosphorylierungsstellen. Dies ist insofern erstaunlich, als doch durch diese

zehn zusätzlichen Aminosäuren eine mögliche Erkennungsstelle für pflanzliche CDPKs gene-

riert wird (...KLFS..., Abb. 27). Die von den CDPKs erkannte Konsensus-Sequenz lautet

R/KxxS/T (Roberts und Harmon, 1992).

Von den anderen Ser/Thr-Resten des CT56 befinden sich keine in einem Kontext, der dem obi-

gen Konsensus von CDPK-Substraten entspricht. Im Falle von Thr923 und Ser930 (Abb. 27) be-

findet sich aber vier bzw. fünf Reste zuvor eine basische Aminosäure. Obwohl diese Distanz

nicht optimal ist (in der Konsensus-Sequenz befindet sich die basische Aminosäure drei Reste

vor dem Ser/Thr), mag sie zur Substraterkennung ausreichen.

Eine weitere Möglichkeit wäre die Phosphorylierung von Threonin947 (Abb. 27), wie dies kürz-

lich bei der (auch hier verwendeten) Plasmamembran-H+-ATPase PMA2 von Nicotiana plum-

baginifolia (Svennelid et al., 1999; Maudoux et al., 2000) gezeigt worden ist. Diese Stelle kann

nach Phosphorylierung ein 14-3-3-Protein-Dimer binden und so die H+-ATPase aktivieren.

509 DQLAIGKETG RRLGMGTNMY PSSALLGQTK DESIASLPID ELIEKADGFA GVFPEHKYEI

569 VKRLQARKHI CGMTGDGVND APALKKADIG IAVDDATDAA RSASDIVLTE PGLSVIISAV

629 LTSRAIFQRM KNYTIYAVSI TIRIVLGFML LALIWKFDFP PFMVLIIAIL NDGTIMTISK

689 DRVKPSPLPD SWKLAEIFTT GVVLGGYLAM MTVIFFWAAY ETDFFPRVFG VSTLQKTATD

749 DFRKLASAIY LQVSTISQAL IFVTRSRSWS FVERPGLLLV VAFLIAQLVA TLIAVYANWA

809 FAAIEGIGWG WAGVIWLYNL VFYFPLDIIK FLIRYALSGR AWDLVLEQRI AFTRKKDFGK

869 EQRELQWAHA QRTLHGLQVP DTKLFSEATN FNELNQLAEE AKRRAEIARQ RELHTLKGHV

929 ESVVKLKGLD IETIQQSYTV-COOH

Abb. 27: Die 440 C-terminalen Aminosäuren der Plasmamembran-H+-ATPase PMA2 von Nicotianaplumbaginifolia. Das vollständige Protein inkl. N-Terminus umfasst 948 Aminosäuren.

Sequenz des verwendeten Teilpeptides CT66, das die 66 C-terminalen AS umfasst.Sequenz des verwendeten Teilpeptides CT56, das die 56 C-terminalen AS umfasst.

Rot: Die zusätzlichen 10 Aminosäuren des Teilpeptides CT66.Blau: Das Thr947, welches durch Phosphorylierung ein 14-3-3-Protein-Dimer binden kann.Kursiv: Mögliche Erkennungsstellen für eine Phosphorylierung durch die GST-CDPK

(phosphoryliert würden Ser894, Thr923 und/oder Ser930).


Der Ort der Phosphorylierung soll im Rahmen weiterführender Arbeiten in Zusammenarbeit

mit M. Piotrowski (Ruhr-Universität, Bochum) mit Hilfe der Massenspektrometrie eindeutig

bestimmt werden.

Um mehr über die Auswirkungen der gezeigten Phosphorylierung und damit die Funktion der

LeCPK1 zu erfahren, wurde ein Experiment durchgeführt, bei dem Plasmamembran-Vesikel in

An- oder Abwesenheit der GST-CDPK inkubiert wurden und anschliessend die Aktivität der

Plasmamembran-H+-ATPase gemessen wurde.

In bisher durchgeführten Experimenten zeigte eine Phosphorylierung der H+-ATPase keine

einheitlichen Auswirkungen auf die Aktivität der Protonenpumpe. So führte eine Dephosphory-

lierung der H+-ATPase von Lycopersicon esculentum durch eine Phosphatase nach Zugabe ei-

nes Elicitors von Cladosporium fulvum zu einer Aktivierung der Protonenpumpe (Vera-Estrella

et al., 1994). Eine anschliessende Ca2+-abhängige Rephosphorylierung, die von zwei verschie-

denen Proteinkinasen durchgeführt wurde, deaktivierte die Protonenpumpe wieder (Xing et al.,

1996). In ähnlicher Weise führte die Dephosphorylierung einer Plasmamembran- H+-ATPase

aus Nicotiana plumbaginifolia zu einer Aktivierung des Enzyms (Desbrosses et al.. 1998).

Auch Experimente mit rekonstituierten Proteoliposomen aus Beta vulgaris (Lino et al., 1998)

zeigten, dass die H+-ATPase-Aktivität durch Ca2+-abhängige Phosphorylierung reduziert wird.

In den erwähnten Beispielen führte die Phosphorylierung der H+-ATPase jeweils zu einer De-

aktivierung der Protonenpumpe. Bei einer Phosphorylierung am C-Terminus des Enzyms

kommt es jedoch zu einer Aktivierung des Enzyms. So wird die Plasmamembran-H+-ATPase

aus Nicotiana plumbaginifolia durch eine unbekannte Proteinkinase an der zweitletzten, kon-

servierten Aminosäure des C-Terminus (dem Thr947) phosphoryliert (Camoni et al., 1999;

Svennelid et al., 1999; Fuglsang et al., 1999). Dies ermöglicht die Bindung eines 14-3-3-

Protein-Dimers an den C-Terminus, wodurch die Protonenpumpe aktiviert wird (Oecking et al.,

1997; Jahn et al., 1997; Maudoux et al., 2000). Auch die H+-ATPase in Schliesszellen von Vi-

cia faba wird bei Bestrahlung mit Blaulicht durch Phosphorylierung der zweitletzten Ami-

nosäure am C-Terminus und anschliessende Bindung von 14-3-3-Proteinen aktiviert (Kinoshita

und Shimazaki, 1999).


Die unterschliedlichen Konsequenzen einer Phosphorylierung der Plasmamembran-H+-ATPase

werden mit dem in der Einführung erwähnten Regulationsmodell (Morsomme und Boutry,

1999; Abb. 3 auf Seite 8) wie folgt erklärt: Nach Phosphorylierung an einer bisher nicht ermit-

telten Stelle der H+-ATPase (evtl. ausserhalb des C-Terminus) befindet sich die Protonenpumpe

in einem inaktiven Zustand (Abb. 3b). Ist das Enzym hingegen wie oben beschrieben am kon-

servierten Threonin des extremen C-Terminus phosphoryliert, erfolgt die Bindung eines 14-3-

3-Protein-Dimers und die Aktivierung der H+-ATPase (Abb. 3c) . Eine gänzlich nicht-phospho-

rylierte H+-ATPase besitzt eine vergleichsweise niedrige Grundaktivität (Abb. 3a). Falls die

LeCPK1 den C-Terminus der H+-ATPase auch dann phosphoryliert, wenn die Protonenpumpe

als integrales Membranprotein vorliegt, wäre gemäss diesem Modell eine Aktivitätsverände-

rung der Protonenpumpe zu erwarten.

Im Abschnitt 3.5 wurde aber festgestellt, dass die Proteinkinase die Aktivität der Plasma-

membran-H+-ATPase in Membranvesikeln nicht signifikant beeinflusst.

Eine Ursache für dieses Ergebnis könnte der Zustand der Plasmamembran-H+-ATPase vor der

Inkubation mit der GST-CDPK sein. Ist die H+-ATPase bereits zu diesem Zeitpunkt vollständig

phosphoryliert (z.B. durch das Fehlen cytosolischer Phosphatasen), ist eine Modulation der

Aktivität durch die Kinase nicht mehr möglich. Eine andere Erklärungsmöglichkeit wäre, dass

sich in den Vesikel-Membranen bereits viele membranintegrale oder Membran-assoziierte Ki-

nasen befinden, welche die Plasmamembran-H+-ATPase während des Experimentes unabhän-

gig von der exogenen GST-CDPK-Zugabe phosphorylieren können. Eine solche endogene Ki-

naseaktivität wurde bereits bei der in vitro-Phosphorylierung von Membranvesikeln aus Nicoti-

ana plumbaginifolia in Gegenwart eines ATP- und Mg2+-haltigen Puffers, nicht aber einer exo-

gen zugegebenen Proteinkinase festgestellt (Svennelid et al., 1999). Vielleicht liegt der C-

Terminus der Plasmamembran-integrierten H+-ATPase aber auch in räumlich anderer Kon-

formation vor als der kurze, isolierte C-Terminus CT66. Dies hätte zur Folge, dass das Substrat

von der LeCPK1 evtl. nicht mehr erkannt und phosphoryliert werden könnte.

Es ist aber auch möglich, dass eine Phosphorylierung am C-Terminus der H+-ATPase tatsäch-

lich stattfindet, ohne aber eine Aktivitätsveränderung zu bewirken. Eine Aktivierung setzt

nämlich gemäss Regulationsmodell zusätzlich zur Phosphorylierung die Bindung eines 14-3-3-

Protein-Dimers voraus (Morsomme und Boutry, 1999; Abb. 3 auf Seite 8). Die löslichen, cyto-

plasmatischen 14-3-3-Proteine sind aber in der gereinigten Membranvesikel-Suspension gar

nicht mehr vorhanden, was eine Aktivierung über diesen Mechanismus ausschliesst.


4.4 Die Rolle der LeCPK1 in pflanzlichen Abwehrreaktionen

Schon seit längerem ist bekannt, dass Elicitoren von pathogen Pilzen oder Bakterien die Akti-

vität der Plasmamembran-H+-ATPase modulieren können (Blum et al., 1988; Johansson et al.,

1993).

So bewirkte beispielsweise ein Elicitor aus Cladosporium fulvum eine Aktivierung der Proto-

nenpumpe von Lycopersicon esculentum über eine Phosphatase-abhängige Dephosphorylierung

(Vera-Estrella et al., 1994). Ausserdem wurde gezeigt, dass bei Zugabe des pflanzlichen Pep-

tidhormons Systemin das Wachstumsmedium von Lycopersicon peruvianum-Suspensions-

kulturzellen alkalisiert wird, was möglicherweise auf eine Deaktivierung der Plasmamembran-

H+-ATPase zurückzuführen ist (Schaller und Oecking, 1999). Eine Hemmung der H+-ATPase

mittels geeigneter Inhibitoren führt zu einer verstärkten Transkription mehrerer "systemic

wound response proteins" (SWRPs) in Tomatenpflanzen. Im Gegensatz dazu wurde die H+-

ATPase bei Zugabe von Fusicoccin aktiviert und das Wachstumsmedium dadurch angesäuert.

In Tomatenpflanzen unterdrückt Fusicoccin die Transkription der SWRPs. Anstelle der SWRPs

wurden andere, "pathogenesis-related" (PR)-Proteine verstärkt transkribiert (Schaller und Oek-

king, 1999). Diese unterschiedliche Regulation der H+-ATPase stellt offenbar eine differen-

zierte Antwort auf verschiedene, pathogene Umwelteinflüsse dar.

Da für die Modulation der H+-ATPase-Aktivität in einigen Fällen eine Ca2+-abhängige Phos-

phorylierung notwendig ist (Schaller und Sussman, 1988; Lino et al., 1998; Camoni et al.,

1998), stellt sich die Frage, ob die untersuchte LeCPK1 an einer der oben erwähnten Signal-

transduktionen beteiligt sein könnte.

Die oben erwähnte Plasmamembran-H+-ATPase aus Lycopersicon esculentum, die nach Ein-

wirkung eines Elicitors von Cladosporium fulvum durch eine Phosphatase dephosphoryliert und

aktiviert wurde (Vera-Estrella et al., 1994), wurde 30 min später durch zwei Ca2+-abhängige

Phosphorylierungen wieder rephosphoryliert, was die ursprüngliche H+-ATPase-Aktivität wie-

der herstellte (Xing et al., 1996). Bei den beiden beteiligten Proteinkinasen handelte es sich

aber wahrscheinlich nicht um CDPKs, sondern um eine Proteinkinase C und eine Ca2+/CaM-

Kinase II (Xing et al., 1996). Auf der anderen Seite wird die Systemin-induzierte Alkalisie-

rungsreaktion in Zellkulturen von Lycopersicon peruvianum durch die Proteinkinase-

Inhibitoren K-252a und Staurosporin unterdrückt (Schaller und Oecking, 1999). Die gleichen


Inhibitoren hemmen auch die in vitro-Phosphorylierung des C-Terminus der Protonenpumpe

(siehe Abschnitt 3.4), was auf die Beteiligung einer CDPK im Wundsignaltransduktionsweg

hinweist. Auch die Aktivierung einer bisher unbekannten CDPK durch den Avr9-Elicitor von

Cladosporium fulvum in Suspensionskulturzellen von Nicotiana tabacum weist auf eine Rolle

von CDPKs in pflanzlichen Abwehrreaktionen hin (Romeis et al., 2000). Zudem wurde in

Blättern von Zea mays unmittelbar nach Applikation von verschiedenen pilzlichen Elicitoren

oder der Infektion durch die Pilze selbst die Transkription einer spezifischen CDPK-Isoform

aktiviert (Murillo et al., 2001). Die Zunahme der CDPK-Transkripte war jeweils begleitet von

der Akkumulation eines für Zea mays typischen PR-Proteins. Bemerkenswert ist, dass sich das

differenzielle Expressionsmuster der CDPK und dasjenige des PR-Proteins im Verlaufe der

Infektion stark glichen.

Auch die hier untersuchte LeCPK1 erfüllt wichtige Bedingungen, die für die Beteiligung an der

Signaltransduktion als Antwort auf eine pathogene Infektion oder Verwundung notwendig sind.

So wurde gezeigt, dass die LeCPK1 durch eine Ca2+-Konzentration, wie sie in der lebenden

Zelle auftreten kann, aktiviert wird (siehe Abschnitt 3.9). Zudem befindet sie sich in vivo durch

Lokalisation an der Plasmamembran in der Nähe der H+-ATPase (siehe Abschnitte 3.7 und

3.8). Ferner kann die LeCPK1 in vitro den C-Terminus der Plasmamembran-H+-ATPase phos-

phorylieren (siehe Abschnitte 3.2 bis 3.4). Ausserdem weist die erhöhte Transkription der Pro-

teinkinase nach Fusicoccin-Behandlung auf eine mögliche Funktion der LeCPK1 in der Ab-

wehrreaktion der Tomatenpflanze hin (Stalder, 2000).

So könnte die Plasmamembran-H+-ATPase nach einer pilzlichen Infektion durch die Proteinki-

nase phosphoryliert und aktiviert werden. Die LeCPK1 könnte aber auch eine Rolle in der Sy-

stemin-induzierten Wundantwort spielen und die H+-ATPase durch Phosphorylierung inaktivie-

ren. Gegen diese Möglichkeit spricht allerdings, dass nach Verwundung von Tomatenblättern

keine erhöhte LeCPK1-Transkription festgestellt werden konnte. Ausserdem konnte im Rah-

men der vorliegenden Arbeit weder eine Aktivierung noch eine Inaktivierung der Plasmamem-

bran-H+-ATPase durch die LeCPK1 nachgewiesen werden (siehe Abschnitt 3.5). In weiterfüh-

renden Studien könnte dieser Nachweis in Gegenwart von 14-3-3-Proteinen vielleicht doch

noch erbracht werden. Auch das Aufspüren weiterer LeCPK1-Substrate mittels der "yeast-two-

hybrid"-Methode könnte zu einer Aufklärung der Funktion der LeCPK1 beitragen.

5. Referenzen Seite 74

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6. Anhang Seite 81

VI. ANHANG

6.1 Sequenz der LeCPK1-cDNA

1 GGCAAGTGGG GAAAAAGCCT AGAAAAATAA CAAGGGCAAA AGCTGGCAAA

51 GAAAGTGTGT AGCATTTTCA TGGAGTTTTT TCCCATGAAG TCAATGAAGA

101 GGGTTCAAAA CGTTGGCATT TTCTGATCTG TGGAATATCT TTTAGGTTGT

151 TGTTTTTTTT GTAACTTGTT GAGGAATTGA AGTATCCAAA GTTCAATCTT

201 GTTGAATAGA CTGTAGAAAT GGGTGGTTGT TTTAGCAAGA AGTATACCCA

251 ACAAGATGCT AATGGGCATA GGGCAGGAAG AAGAGTTAAT CAAGCATATC

301 AAAAACCACC ACAACCCCAG CCAGAAAGGC CATATCAGCC TCAGCCCCAG

351 CAGGAAAGGC CATATCAGCC ACCGCCACAG CCAGCATATC AGCCACCGCC

401 ACAGCCAAAG CCACAACCTC AGCCCCACCC TGTTCCTGTT ACTGTGCAGT

451 CTGGACAGCC CCAAGACCAA ATGCAAGGAC CCCATATGAA TAACATATTG

501 GGAAAGCCTT TTGAGGAAAT TAGAAAGCTC TATACACTTG GGAAAGAATT

551 GGGTAGGGGT CAGTTTGGAG TGACTTACTA TTGTACTGAG AACTCAACTG

601 GGAACCCTTA TGCTTGCAAG TCCATACTTA AGAGGAAGCT TGTAAGCAAG

651 AATGATAGGG AGGATATGAA GAGGGAAATT CAGATTATGC AGCATTTGAG

701 TGGGCAGCCA AACATTGTGG AATTCAAGGG TGCTTATGAA GATAGGCAGT

751 CAGTACACCT TGTGATGGAA CTTTGTGCTG GAGGAGAGTT GTTTGACAGG

801 ATTATCGCCC GTGGATATTA CTCAGAGAAG GATGCTGCTG AGATTATTAG

851 ACAGATTGTA AATGTTGTTA ACATTTGCCA TTTCATGGGT GTCATGCATA

901 GGGATCTCAA GCCAGAGAAT TTCTTACTGA CTAGTAAGGA TGAAAATGCT

951 ATGTTGAAGG CAACTGATTT TGGACTTTCT GTCTTCATTG AAGAAGGGAA

1001 GGTGTACCGT GATATAGTTG GTAGTGCATA TTATGTTGCC CCTGAAGTGT

1051 TGCGGCGTAG TTATGGGAAG GAAGCAGATG TATGGAGTGC AGGTGTTATT

1101 TTGTATATTC TGCTCAGTGG TGTACCTCCA TTTTGGGCTG AAACTGAAAA

1151 GGGAATATTT AATACCATAC TAAAAGGAGA AATTGACTTC CAAAGTGATC

1201 CATGGCCATC AATATCAAAT AGTGCCAAGG ACCTTATTCG GAAAATGCTA

1251 ACGCAGGAGC CAAGGAAGAG AATTACTTCC GCGCAAGTTC TTGAACATCC

6. Anhang Seite 82

1301 ATGGCTTCGA CTTGGAGAAG CATCAGATAA GCCAATAGAC AGTGCAGTCC

1351 TGTCCAGAAT GAAGCAGTTC AGAGCAATGA ACAAGCTCAA AAAACTCGCA

1401 TTGAAGGTCA TTGCGGAAAA TTTATCTGAA GAAGAAATCA AGGGTCTGAA

1451 AGCTATGTTT CACAACATTG ATACGGACAA TAGTGGCACA ATCACTTATG

1501 AAGAACTGAA GTCGGGATTG GCTCGGCTTG GATCAAAGCT AACGGAGACT

1551 GAAGTCAAGC AACTCATGGA AGCTGCTGAT GTGGATGGAA ATGGATCAAT

1601 TGATTACATT GAGTTTATTA CTGCAACGAT GCATAGACAT CGGCTAGAAA

1651 GGGATGAGCA TCTTTTTAAA GCTTTTCAGC ATTTTGACAA GGACCATAGT

1701 GGATTCATCA CGCGAGATGA ATTGGAAAAC GCTATGAAGG AATATGGTAT

1751 GGGTGATGAG GCCACCATCA AGGAGATAAT CGCAGAGGTG GACACTGACA

1801 ATGACGGTAG GATCAATTAC GAGGAGTTCT GTGCTATGAT GAGAAGTGGA

1851 ACAACACAAC CACAACAAAA GCTTTTCTAG TGCATCGAGA GCAAATTACC

1901 CTTGCAACGA GCAGAGAACG TTCACCAGCC AGCACGATGG AGAGATGTCT

1951 ATCACGAGAG GATCAGTAAC TTAACATACT TCCATATTTC TTCAATCCTT

2001 CAGCTATCTT CAAAAAGCAC TGGAGTACAT GAGACCTTTT TCGTGTAGGT

2051 TGAGTTCGCG TGGAAAATGT GTGTATAGCT AGTTAATGGT ATATTTCGAG

2101 TTTCTTGTAA TGTATTTGAT CCCCCTTCGT AATTTTGTGT GGATCGCGTT

2151 GTGAAGTTGA CCTCCCGTAG AGATTATAAC AAGACAATCT GAATATAGCT

2201 TTATGCTTGA AAAAAAAAAA AAAAAAAAA

Abb. 28: Die cDNA-Sequenz der LeCPK1 aus Lycopersicon esculentum cv. Castelmart II.Das Open Reading Frame (ORF) beginnt mit dem Startcodon für Methionin an Position 219 und endet mit demStopcodon an Position 1880. Die Adeninbase an Position 1792 weicht ab von der ursprünglich durch Stalder(2000) bestimmten Guaninbase.

6. Anhang Seite 83

6.2 Standardkurve für die Aktivitätsbestimmung der Plasmamembran-H+-ATPase

Abb. 29: Standardkurve, die für die Bestimmung der freien Phosphatkonzentration bei der Aktivitätsmessung derPlasmamembran-H+-ATPase verwendet wurde. Zur Berechnung der im Diagramm angegebenen Gleichung wurdeeine Regressionsgerade über die Resultate der Einzelmessungen gelegt.

y = 0.0877x - 0.0035

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

0 5 10 15 20 25

nmol Pi pro 100 µl Testansatz

E 660

DANK...

...gebührt vor allem Andreas Schaller, der mich mit viel Geduld und Humor in die Materie unddie praktische Arbeit im Labor einführte.

Auch Andreas Hiltbrunner, Roger Kuhn und Anne Samland sei herzlich gedankt für die Einfüh-rung in die Mikroprojektil-Transformationstechnik, die konfokale Mikroskopie und die Fluo-reszenz-Spektrometrie.

Grossen Dank möchte ich auch David Frasson, Ursula Frick, Felix Hauser, Yoann Huet, Wer-ner Schmidt und Jochen Strassner und allen anderen Mitgliedern der Arbeitsgruppe ausdrückenfür die überaus angenehme und freundliche Zusammenarbeit.

Zum Schluss möchte ich mich ganz herzlich bei Prof. Nikolaus Amrhein für seine grosszügigeGastfreundschaft bedanken.

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Charakterisierung der Ca -abhängigen Proteinkinase LeCPK1 · kurzer Zeit anschwellen und so eine...

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