Aus$dem$Institut$für$Medizinische$Biochemie$und ...

Aus$dem$Institut$für$Medizinische$Biochemie$und$Molekularbiologie$

(Direktor$Prof.$Dr.$rer.$nat.$habil.$Reinhard$Walther)$

der$Universitätsmedizin$der$ErnstEMoritzEArndtEUniversität$Greifswald$

$

Thema:$$

$

Vergleichende+Promotoranalyse+Irbesartan5regulierter+Gene+unter+rapid5pacing+

in+vivo+im+Schwein+und+Identifizierung+potentiell+regulierender+

Transkriptionsfaktorbindungsstellen+

$

$

InauguralEDissertation$$

zur$

Erlangung$des$akademischen$Grades$

$

Doktor$der$Medizin$$

(Dr.$med.)$

$

der$$

Universitätsmedizin$$

der$

ErnstEMoritzEArndtEUniversität$Greifswald$

2014$

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vorgelegt$von$

Christoph$Aderkast$

geboren$am$01.08.1986$

in$Berlin$

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Greifswald,$am$11.04.2014

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Dekan:$Prof.$Dr.$med.$dent.$Reiner$Biffar$

1.$Gutachter:$$

2.$Gutachter:$

3.$Gutachter:$

Ort,$Raum:$

Tag$der$Disputation:$

Prof. Dr. U. Lendeckel

Prof. Dr. J. Kockskämper

Universitätsmedizin Greifswald, Seminarraum O.88

10.07.2015

Inhaltsverzeichnis$$

$ 3$

Inhaltsverzeichnis+

+

1.+Einleitung...............................................................................................................................+8+

1.1.$Vorhofflimmern..................................................................................................................................$8$

1.2.$Therapie$des$Vorhofflimmerns....................................................................................................$9$

1.2.1.$Antikoagulative$Therapie........................................................................................................$10$

1.2.2.$FrequenzE$und$Rhythmuskontrolltherapie......................................................................$10$

1.3.$Pathophysiologie$des$Vorhofflimmerns...................................................................................$11$

1.3.1.$Strukturelles$Remodeling........................................................................................................$12$

1.3.1.1.$Rolle$des$ReninEAngiotensinEAldosteronESystems................................................$13$

1.3.2.$Elektrisches$Remodeling..........................................................................................................$14$

1.4.$Promotormodule................................................................................................................................$14$

$

2.+Zielstellung+der+Arbeit.......................................................................................................+16+

$

3.+Material+und+Methoden.....................................................................................................+17+

3.1.$Material..................................................................................................................................................$17$

3.1.1.$Chemikalien$und$Reagenzien.................................................................................................$17$

3.1.2.$Verbrauchsmaterialien.............................................................................................................$20$

3.1.3.$Geräte...............................................................................................................................................$20$

3.1.4.$Zelllinie............................................................................................................................................$22$

3.1.5.$Computerprogramme................................................................................................................$22$

3.2.$Methoden...............................................................................................................................................$23$

3.2.1.$Promotordefinition....................................................................................................................$23$

3.2.2.$Identifikation$der$cisEElemente$und$vergleichende$Promotoranalyse................$23$

3.2.3.$Vektorherstellung$(pTHand1EKX)$......................................................................................$23$

3.2.3.1.$Herstellung$eines$Hand1ETranskripts$mit$passenden$Ligationsstellen........$25$

3.2.3.2.$Klonieren$des$Hand1ETranskripts$in$den$Vektor$pTRACERECMV...................$25$

3.2.3.3.$Transformation$und$Aufzucht$in$E.coli$XL1Eblue...................................................$26$

3.2.3.4.$Präparation$des$Plasmids$aus$der$E.coliEKultur......................................................$26$

3.2.4.$Zellkultur$der$HLE1EZellen.......................................................................................................$27$

3.2.4.1.$Auftauen$der$Zellen.............................................................................................................$28$

3.2.4.2.$Passagieren$der$Zellen.......................................................................................................$28$

3.2.4.3.$Herstellen$von$Kryokonserven.......................................................................................$29$


$ 4$

3.2.4.4.$Aussaat$der$Zellen................................................................................................................$30$

3.2.4.5.$rapidEpacing$in$vitro............................................................................................................$30$

3.2.4.6.$Überexpression$von$Hand1..............................................................................................$30$

3.2.5.$ProteinE$und$RNAEIsolierung..................................................................................................$31$

3.2.5.1.$RNAEPräparation..................................................................................................................$32$

3.2.5.2.$Proteinpräparation..............................................................................................................$32$

3.2.6.$Nukleinsäureanalytik................................................................................................................$33$

3.2.6.1.$Photometrische$RNAEKonzentrationsbestimmung...............................................$33$

3.2.6.2.$RTEPCR......................................................................................................................................$33$

3.2.6.3.$Quantitative$realEtime$PCR...............................................................................................$34$

3.2.6.4.$Gelelektrophorese$der$cDNA...........................................................................................$35$

3.2.7.$Proteinanalyse..............................................................................................................................$36$

3.2.7.1.$BRADFORDEAssay................................................................................................................$36$

3.2.7.2.$SDSEPage...................................................................................................................................$37$

3.2.7.3.$WesternEBlot...........................................................................................................................$39$

3.2.8.$Datenauswertung........................................................................................................................$41$

$

4.+Ergebnisse..............................................................................................................................+42+

4.1.$in$silico....................................................................................................................................................$42$

4.1.1.$Genauswahl$und$Gruppierung...............................................................................................$42$

4.1.2.$Promotordefinition....................................................................................................................$44$

4.1.3.$Vorhersage$hypothetischer$Transkriptionsfaktorbindungsstellen......................$44$

4.1.4.$Promotorvergleich......................................................................................................................$44$

4.1.4.1.$Vergleich$der$Bindungsstellen$von$supprimierten$und$induzierten$$

Promotoren............................................................................................................................$44$

4.1.4.2.$Verteilung$der$differentiellen$Bindungsstellen$über$den$$

rapidEpacingEEffekt.............................................................................................................$46$

4.1.4.3.$Verteilung$der$differentiellen$Bindungsstellen$über$den$IrbesartanEEffekt$

der$supprimierten$Gene...................................................................................................$48$

4.2.$ex$vivo.....................................................................................................................................................$50$

4.2.1.$Hand1EExpression$im$Schwein.............................................................................................$50$

4.3.$in$vitro....................................................................................................................................................$51$

4.3.1.$Hand1EExpression$in$HLE1EKardiomyozyten..................................................................$51$

4.3.1.1.$zeitabhängige$Hand1EExpression$während$rapidEpacing..................................$51$


$ 5$

4.3.1.2.$Hand1EExpression$unter$rapidEpacing$und$Irbesartan........................................$52$

4.3.1.2.1.$pacingEabhängige$Hand1EExpression$unter$Irbesartaneinfluss................$53$

4.3.1.2.2.$IrbesartanEabhängige$Hand1EExpression$während$rapidEpacing............$54$

4.3.1.2.3.$Hand1EExpression$in$Abhängigkeit$von$der$elektrophysiologischen$$

Alteration..........................................................................................................................$56$

4.3.2.$Untersuchung$potentieller$Hand1ETargetgene..............................................................$57$

4.3.2.1.$E2F8EExpression$in$HLE1EKardiomyozyten..............................................................$58$

4.3.2.1.1.$zeitabhängige$Expression$während$rapidEpacing...........................................$58$

4.3.2.1.2.$E2F8EExpression$unter$rapidEpacing$und$Irbesartan....................................$58$

4.3.2.1.2E1.$pacingEabhängige$E2F8EExpression$unter$Irbesartaneinfluss............$59$

4.3.2.1.2E2.$IrbesartanEabhängige$E2F8EExpression$während$rapidEpacing........$61$

4.3.2.1.2E3.$E2F8EExpression$in$Abhängigkeit$von$der$elektrophysiologischen$$

Alteration..................................................................................................................$63$

4.3.2.2.$PPP2R5BEExpression$in$HLE1EKardiomyozyten.....................................................$64$

4.3.2.2.1.$zeitabhängige$Expression$während$rapidEpacing...........................................$64$

4.3.2.2.2.$PPP2R5BEExpression$unter$rapidEpacing$und$Irbesartan...........................$65$

4.3.2.2.2E1.$rapidEpacingEabhängige$PPP2R5BEExpression$unter$$

Irbesartaneinfluss.................................................................................................$66$

4.3.2.2.2E2.$IrbesartanEabhängige$PPP2R5BEExpression$während$$

rapidEpacing............................................................................................................$68$

4.3.2.2.2E3.$PPP2R5BEExpression$in$Abhängigkeit$von$der$$

elektrophysiologischen$Alteration................................................................$70$

4.3.3.$Expressionszusammenhang$zwischen$Hand1$und$E2F8...........................................$71$

4.3.3.1.$E2F8ERegulation$in$Abhängigkeit$der$Hand1EExpressionsänderung............$71$

4.3.3.2.$Hand1ERegulation$in$Abhängigkeit$der$E2F8EExpressionsänderung............$72$

4.3.4.$Expressionszusammenhang$zwischen$Hand1$und$PPP2R5B..................................$73$

4.3.4.1.$PPP2R5BERegulation$in$Abhängigkeit$der$Hand1EExpressionsänderung...$73$

4.3.4.2.$Hand1ERegulation$in$Abhängigkeit$der$PPP2R5BEExpressionsänderung...$74$

4.3.5.$Hand1EÜberexpression.............................................................................................................$75$

$

5.+Diskussion..............................................................................................................................+79+

5.1.$V$HAND1E47_01$als$differentielle$Transkriptionsfaktorbindungsstelle$$

IrbesartanEregulierter$Gene$bei$simuliertem$VHF$in$vivo$im$Schwein......................$79$


$ 6$

5.2.$V$HAND1E47_01EHäufigkeit$steht$im$Zusammenhang$mit$der$Größe$des$$

Irbesartaneffektes.............................................................................................................................$80$

5.3.$Hand1$als$bedeutender$kardialer$Transkriptionsfaktor..................................................$80$

5.4.$Funktionelle$Verbindung$zwischen$HAND1,$rapidEpacing$und$Irbesartan..............$81$

5.5.$Der$Transkriptionsfaktor$E2F8...................................................................................................$85$

5.6.$Funktioneller$Zusammenhang$zwischen$E2F8,$rapidEpacing$und$Irbesartan........$85$

5.7.$Gegensinnige$Regulation$von$HAND1$und$E2F8..................................................................$87$

5.8.$Die$regulatorische$Untereinheit$B56β$(PPP2R5B)$der$PP2A.........................................$88$

5.9.$Funktioneller$Zusammenhang$zwischen$PPP2R5B,$rapidEpacing$und$$

Irbesartan..............................................................................................................................................$89$

5.10.$Einfluss$der$HAND1EExpression$auf$die$PPP2R5BEExpression..................................$90$

5.11.$Hand1EÜberexpression.................................................................................................................$91$

5.12.$Unterschied$zwischen$in$vivo$und$in$vitroEBefunden.....................................................$92$

$

6.+Zusammenfassung...............................................................................................................+94+

$

7.+Anhang....................................................................................................................................+95+

7.1.$Anhang$für$Material$und$Methoden...........................................................................................$95$

7.2.$Anhang$für$Ergebnisse....................................................................................................................$97$

7.2.1.$Promotoren$der$supprimierten$Gene.................................................................................$97$

7.2.2.$Promotoren$der$induzierten$Gene.......................................................................................$100$

7.2.3.$Bindungsstellenvorhersage$für$die$Promotoren$der$supprimierten$Gene........$103$

7.2.3.1.$NR4A3........................................................................................................................................$103$

7.2.3.2.$E2F8............................................................................................................................................$104$

7.2.3.3.$MYOM2......................................................................................................................................$106$

7.2.3.4.$CRABP1.....................................................................................................................................$107$

7.2.3.5.$H2AFY2.....................................................................................................................................$108$

7.2.3.6.$ADAMTS6.................................................................................................................................$110$

7.2.3.7.$NUDT12....................................................................................................................................$112$

7.2.3.8.$Stox1...........................................................................................................................................$114$

7.2.3.9.$RGS2...........................................................................................................................................$115$

7.2.3.10.$PPP2R5B................................................................................................................................$116$

7.2.3.11.$CENPE.....................................................................................................................................$117$

7.2.3.12.$RERG........................................................................................................................................$119$


$ 7$

7.2.4.$Bindungsstellenvorhersage$für$die$Promotoren$der$induzierten$Gene..............$121$

7.2.4.1.$CXCL9.........................................................................................................................................$121$

7.2.4.2.$PTX3...........................................................................................................................................$123$

7.2.4.3.$CTGF...........................................................................................................................................$124$

7.2.4.4.$TNFRSF12A.............................................................................................................................$126$

7.2.4.5.$PHLDA2.....................................................................................................................................$127$

7.2.4.6.$SH3RF2......................................................................................................................................$128$

7.2.4.7.$MAFF..........................................................................................................................................$129$

7.2.4.8.$S100A9......................................................................................................................................$131$

7.2.4.9.$ABHD5.......................................................................................................................................$132$

7.2.4.10.$IRFD1.......................................................................................................................................$134$

7.2.4.11.$GTPBP1...................................................................................................................................$135$

$

8.+Abkürzungsverzeichnis.....................................................................................................+137+

$

9.+Literaturverzeichnis...........................................................................................................+140+

$

10.+Wissenschaftliche+Veröffentlichungen......................................................................+159+

$

11.+Eidesstattliche+Erklärung...............................................................................................+160+

$

12.+Danksagung.........................................................................................................................+161+

+

13.+Lebenslauf...........................................................................................................................+162+

+

1.$Einleitung$$

$ 8$

1.+Einleitung+

1.1.+Vorhofflimmern+

Bereits$ vor$ etwa$ 300$ Jahren$ wurde$ Vorhofflimmern$ (VHF)$ erstmals$ beschrieben$

(Schuchert$ et$ al.$ 2006)$ und$ stellt$ heute$ mit$ einer$ Prävalenz$ von$ 0,4E2%$ in$ der$

Allgemeinbevölkerung$ (Schuchert$ et$ al.$ 2006;$ Mewis$ 2009;$ European$ Heart$ Rhythm$

Association$ et$ al.$ 2010;$ Schotten$ et$ al.$ 2011)$ die$ häufigste$ supraventrikuläre$

Tachyarrhythmie$des$Menschen$dar$(Kannel$et$al.$1998;$Go$et$al.$2001).$Die$Angaben$zur$

Prävalenz$der$Erkrankung$schwanken$stark,$es$ist$jedoch$ein$deutlich$altersabhängiger$

Anstieg$ zu$ beobachten,$mit$ einer$ Prävalenz$ von$ 0,5%$ im$Alter$ von$ 50E59$ Jahren$ und$

einer$ Verdopplung$ in$ jedem$ weiteren$ Lebensjahrzehnt,$ dabei$ sind$ Männer$ häufiger$

betroffen$ als$ Frauen$ (Kannel$ et$ al.$ 1998;$Go$ et$ al.$ 2001;$Heeringa$ et$ al.$ 2006).$ In$den$

letzten$ Jahrzehnten$ ist$ die$ Prävalenz$ des$ VHF$ kontinuierlich$ angestiegen$ und$ für$ die$

Zukunft$ wird$ eine$ weitere$ Zunahme$ erwartet$ (Go$ et$ al.$ 2001;$ Hobbs$ et$ al.$ 2005).$

Wesentlich$ ist,$ dass$ asymptomatische$ Ereignisse$ 12Efach$ häufiger$ sind$ als$

symptomatische$(Page$et$al.$1994),$jedoch$ist$die$Mortalität$bei$allen$Patienten$mit$VHF$

um$das$1,5E1,9Efache$erhöht$(Benjamin$et$al.$1998).$$

Am$häufigsten$treten$thrombembolische$Komplikationen$auf$(Wolf$et$al.$1991;$Sohara$et$

al.$ 1997),$ bis$ zu$ 25%$der$ Schlaganfälle$ sind$ auf$ VHF$ zurückzuführen$ (Miyasaka$ et$ al.$

2005),$wobei$ das$Risiko$mit$ fortschreitendem$ Stadium$des$VHF$ ansteigt$ (Bosch$ et$ al.$

2012).$ Patienten$ mit$ gleichzeitiger$ Herzinsuffizienz$ sind$ durch$ eine$ kardiale$

Dekompensation$besonders$gefährdet$und$weisen$eine$schlechtere$Prognose$auf$(Wang$

et$ al.$ 2003;$Mewis$2009).$Gleichzeitig$ zeigen$Patienten$mit$VHF$auch$unabhängig$ von$

manifesten$ Schlaganfällen$ eine$ verminderte$ kognitive$ Leistungsfähigkeit$ und$ ein$

reduziertes$Hippocampusvolumen$(Knecht$et$al.$2008).$Die$Lebensqualität$wird$durch$

VHF$signifikant$eingeschränkt$(Thrall$et$al.$2006).$

Typische$kardiale$Grunderkrankungen$des$VHF$stellen$Mitralklappendefekte$(Nabauer$

et$al.$2009),$arterieller$Hypertonus$(Verdecchia$et$al.$2003),$koronare$Herzerkrankung$

und$Myokardinfarkt$ (Nabauer$et$ al.$ 2009),$ sowie$Herzinsuffizienz$ (Peters$ et$ al.$ 1988)$

dar.$ Des$ Weiteren$ können$ begünstigende$ Lebensumstände$ und$ nicht$ kardiale$

Grunderkrankungen$wie$erhöhter$Alkoholkonsum$(Djoussé$et$al.$2004)$und$endokrine$

Stoffwechselstörungen$ (Forst$ et$ al.$ 2004)$VHF$begünstigen.$Auch$durch$psychosoziale$

Faktoren$ kann$das$Auftreten$ von$VHF$ gefördert$werden$ (Eaker$ et$ al.$ 2004).$ Es$ sollte$

nicht$unerwähnt$bleiben,$dass$in$2,6E30%$der$Fälle$ein$idiopathisches$VHF$vorliegt,$bei$

1.$Einleitung$$

$ 9$

dem$keine$ursächliche$kardiovaskuläre$Erkrankung$identifiziert$werden$kann$(Brand$et$

al.$1985;$Kopecky$et$al.$1987;$Lévy$et$al.$1999,$Chimenti$et$al.$2010).$

Das$Symptomspektrum$des$VHF$gibt$ein$sehr$heterogenes$Bild$ab:$schwerste$Verläufe$

mit$Palpitationen,$Leistungseinschränkungen,$Belastungsdyspnoe$und$AnginaEpectorisE

Symptomatik$ können$ einer$ vollkommenen$ Beschwerdefreiheit$ gegenüberstehen$

(Davidson$ et$ al.$ 1989;$ Mewis$ 2009).$ Auch$ intraindividuell$ zeigt$ das$ Ausmaß$ der$

Beschwerden$ eine$ hohe$ Variabilität$ (Smeets$ 2005).$ VHF$ beeinträchtigt$ durch$ seine$

Symptomatik$ und$ die$ aus$ ihm$ resultierenden$ Komplikationen$ die$ Lebensqualität$ der$

betroffenen$Patienten$ (Lüderitz$et$al.$2000).$Dies$ ist$ selbst$dann$gegeben,$wenn$keine$

strukturelle$Herzerkrankung$vorliegt$(van$den$Berg$et$al.$2001).$

Nach$ dem$ zeitlichen$ Verlauf$ und$ der$ klinischen$ Präsentation$ unterscheidet$ die$

European$Society$of$Cardiology$ fünf$Typen/Stadien$des$VHF$(European$Heart$Rhythm$

Association$et$al.$2010):$

1. Erstereignis$(VHF,$das$klinisch$das$erste$Mal$in$Erscheinung$getreten$ist)$

2. paroxysmales$VHF$(VHF,$das$meist$48$Stunden$dauert,$jedoch$nicht$mehr$als$7$Tage$

und$ohne$therapeutisches$Einwirken$sistiert)$

3. persistierendes$ VHF$ (VHF,$ das$ länger$ als$ 7$ Tage$ anhält,$ es$ kann$ therapeutisch$ in$

einen$Sinusrhythmus$überführt$werden)$

4. longEstanding$ persistent$ VHF$ (VHF,$ das$ über$ 1$ Jahr$ besteht,$ jedoch$ durch$ eine$

Rhythmuskontrolltherapie$in$einen$Sinusrhythmus$überführt$werden$kann)$

5. permanentes$ VHF$ (VHF,$ das$ durch$ therapeutisches$ Einwirken$ nicht$ in$ einen$

Sinusrhythmus$konvertiert$werden$kann)$

$

1.2.+Therapie+des+Vorhofflimmerns+

Aktuell$wird$VHF$hauptsächlich$pharmakologisch$therapiert.$Der$Anteil$der$Behandlung$

mittels$Katheterablation$nimmt$zwar$zu,$ist$jedoch$noch$Patienten$vorbehalten,$die$trotz$

ausgereizter$ medikamentöser$ Therapie$ symptomatisch$ bleiben$ (European$ Heart$

Rhythm$Association$et$al.$2010).$Auch$bei$Verwendung$der$Ablationstechnik$müssen$im$

Anschluß$ bis$ zu$ 90%$ der$ Patienten$ dauerhaft$ medikamentös$ therapiert$ werden$

(Grönefeld$et$al.$2006;$Miller$et$al.$2008).$$

Es$lassen$sich$drei$unterschiedliche$Therapieformen$des$VHF$unterscheiden:$

1. antikoagulative$Therapie$

2. Frequenzkontrolltherapie$

3. Rhythmuskontrolltherapie$

1.$Einleitung$$

$ 10$

1.2.1.$Antikoagulative$Therapie$

Die$ antikoagulative$ Behandlung$ zur$ Verhinderung$ thrombembolischer$ Ereignisse$

mittels$ VitaminEKEAntagonisten$ nimmt$ den$ höchsten$ Stellenwert$ in$ der$

medikamentösen$Therapie$ein$(Fuster$et$al.$2006;$Mewis$2009),$sie$zeigt$einen$deutlich$

positiven$ prognostischen$ Effekt$ (Petersen$ et$ al.$ 1989;$ Stroke$ Prevention$ in$ Atrial$

Fibrillation$Investigators$1991,$1994,$1996;$Corley$et$al.$2004).$Zur$Risikoabschätzung$

für$das$Auftreten$eines$Schlaganfalls$oder$thrombembolischer$Komplikationen$kann$der$

CHADS2E$respektive$CHA2DS2EVAScEscore$dienen.$Eine$Empfehlung$zur$Antikoagulation$

besteht$ ab$ einem$ CHA2DS2EVAScEscore$ ≥2$ (European$ Heart$ Rhythm$ Association$ et$ al.$

2010),$ nach$ neueren$ Empfehlungen$ sogar$ ab$ einem$ Wert$ ≥1$ (Camm$ et$ al.$ 2012).$

Gleichzeitig$ spielen$ neben$ den$ Cumarinderivaten$ zunehmend$ auch$ die$ neuen$ oralen$

Antikoagulantien$ (NOACs)$ wie$ der$ direkte$ Thrombininhibitor$ Dabigatran$ und$ die$

Faktor$XaEInhibitoren$Rivaroxaban$und$Apixaban$eine$größere$Rolle,$bieten$sie$doch$bei$

gleichem$oder$optimalerem$Blutungsrisiko$die$Möglichkeit,$auf$Gerinnungskontrollen$zu$

verzichten$ (Camm$et$al.$2012).$Zur$Zeit$existiert$ jedoch$kein$zugelassenes$Antidot$zur$

Neutralisierung$der$NOACs.$

$

1.2.2.$Frequenz8$und$Rhythmuskontrolltherapie$

Vergleiche$ zwischen$ FrequenzE$ und$ Rhythmuskontrolltherapie$ erbrachten$ in$ großen$

Studien$ keinen$ signifikanten$ Unterschied$ in$ Bezug$ auf$ die$ Überlebensrate$ und$ die$

Häufigkeit$von$Schlaganfällen$(AFFIRM$Investigators$2002;$Opolski$et$al.$2004;$Roy$et$al.$

2008;$Ogawa$et$al.$2009;$Caldeira$et$al.$2012).$Eine$Unterlegenheit$einer$dieser$beiden$

Therapiearten$konnte$bis$heute$nicht$gezeigt$werden$(Caldeira$et$al.$2012;$Dewland$et$

al.$2012).$

Die$ frequenzkontrollierende$ Therapie$ zielt$ darauf$ ab,$ die$ Überleitung$ der$

hochfrequenten$ Vorhofaktion$ auf$ den$ Ventrikel$ zu$ verhindern$ und$ so$ eine$ adäquate$

Herzfunktion$ zu$ gewährleisten.$ Sie$ wird$ heute$ als$ Standardtherapie$ angesehen$ und$

findet$ sowohl$ in$der$ akuten$ als$ auch$ in$der$Langzeitbehandlung$ ihre$Anwendung.$Die$

Herzfrequenz$ sollte$ dabei$ während$ Belastung$ <110$ bpm,$ in$ Ruhe$ <80$ bpm$ liegen$

(European$Heart$ Rhythm$Association$ et$ al.$ 2010).$Wie$ strikt$ diese$ Frequenzkontrolle$

durchgeführt$wird,$hat$bei$der$Langzeittherapie$weder$einen$Einfluss$auf$die$Mortalität,$

noch$auf$die$Lebensqualität$(Van$Gelder$et$al.$2010;$Groenveld$et$al.$2011).$Die$optimale$

Stringenz$sollte$sich$demzufolge$nach$der$Symptomatik$des$Patienten$richten$(European$

Heart$Rhythm$Association$et$al.$2010).$

1.$Einleitung$$

$ 11$

Die$ antiarrhythmische$ Therapie$ hingegen$ versucht$ durch$ direkte$ Beeinflussung$ der$

elektrophysiologischen$ Vorgänge,$ die$ hochfrequente$ Vorhofaktion$ zu$ unterdrücken$

bzw.$die$Bildung$und$Aufrechterhaltung$von$ReentryEKreisen$zu$unterbinden.$Da$für$die$

pharmakologischEantiarrhythmische$ Therapie$ des$ VHF$ kein$ positiver$ prognostischer$

Effekt$ gezeigt$ werden$ konnte$ (Grönefeld$ et$ al.$ 2006),$ kann$ diese$ nur$ als$

symptomatische$ Therapie$ zur$ Verminderung$ der$ Beschwerden$ und$ Verbesserung$ der$

Leistungsfähigkeit$ verstanden$ werden$ (Fuster$ et$ al.$ 2006).$ Diese$ sollte$ dann$ zum$

Einsatz$ kommen,$ wenn$ Patienten$ unter$ ausgereizter$ Frequenzkontrolltherapie$

weiterhin$ symptomatisch$ sind$ (European$ Heart$ Rhythm$ Association$ et$ al.$ 2010).$

Allerdings$ konnte$ gezeigt$ werden,$ dass$ Patienten,$ die$ durch$ eine$ pharmakologische$

Rhythmuskontrolltherapie$ behandelt$ werden,$ eine$ erhöhte$ Hospitalisierungsrate$

aufweisen$(AFFIRM$Investigators$2002).$

Bei$ Patienten$ mit$ bestehendem$ VHF$ oder$ in$ akuten$ Situationen$ kann$ mittels$

elektrischer$ oder$ pharmakologischer$ Kardioversion$ versucht$ werden,$ jene$ wieder$ in$

einen$Sinusrhythmus$zu$konvertieren$(Miller$et$al.$2008;$Mewis$2009),$wobei$jedoch$die$

Erfolgsrate$ sinkt,$ je$ länger$ das$ VHF$ bereits$ besteht$ (Borgeat$ et$ al.$ 1986;$ Nair$ et$ al.$

2011).$Nach$erfolgreicher$Kardioversion$und$unter$Gabe$von$Antiarrhythmika$liegt$die$

Wahrscheinlichkeit$eines$Rezidivs$weiterhin$bei$30E60%$(Grönefeldt$et$al.$2006)$und$ist$

ebenfalls$umso$höher,$je$länger$das$VHF$bereits$bestand$(Mewis$2009).$

$

1.3.+Pathophysiologie+des+Vorhofflimmerns+

Pathophysiologisch$ liegt$ dem$ VHF$ ein$ Selbsterhalt$ der$ hochfrequenten$ Erregung$

zugrunde,$ der$ auf$ das$ Vorhandensein$ von$ ReentryEKreisen$ oder$ ektopen$

hochfrequenten$ Foci$ zurückzuführen$ ist$ (Rubart$ et$ al.$ 2008;$ Mewis$ 2009).$ Kann$ ein$

distinkter$ Bereich$ für$ den$ Frequenzerhalt$ verantwortlich$ gemacht$ werden,$ wird$ von$

einer$ hierarchischen$ Organisation$ gesprochen,$ anderenfalls$ von$ einer$ anarchischen$

(Schotten$ et$ al.$ 2011).$ Häufig$ werden$ ektope$ Foci$ im$ Bereich$ der$ PulmonalE$ oder$

Hohlvenen$ gefunden$ (Haissaguerre$ et$ al.$ 1998;$ Wit$ et$ al.$ 2007).$ Die$ ursächlichen$

ReentryEKreise$können$stabil$oder$instabil$sein.$$In$beiden$Fällen$stellt$eine$Fibrose$ein$

wesentliches$ strukturelles$ Substrat$ dar,$ da$ sie$ eine$ homogene$ Ausbreitung$ der$

Erregungsfront$ verhindern$ kann$ (Li$ et$ al.$ 1999;$ Kostin$ et$ al.$ 2002;$ Tan$ et$ al.$ 2011).$

Diese$ unterschiedlichen$ Mechanismen$ des$ VHF$ können$ sowohl$ singulär$ als$ auch$

kombiniert$vorliegen$(Goette$et$al.$2006).$Patienten$mit$paroxysmalem$VHF$entwickeln$

typischerweise$ im$ zeitlichen$ Verlauf$ über$ ein$ persistierendes$ ein$ permanentes$ VHF,$

1.$Einleitung$$

$ 12$

wobei$ ein$ durch$ VHF$ induziertes$ strukturelles$ und$ elektrisches$ Remodeling$ den$

Selbsterhalt$ und$ die$ Progression$ der$ Erkrankung$ provoziert$ (Wijffels$ et$ al.$ 1995;$

Stewart$et$al.$2002;$Kerr$et$al.$2005;$Lu$et$al.$2008;$European$Heart$Rhythm$Association$

et$al.$2010).$

$

1.3.1.$Strukturelles$Remodeling$

Strukturelles$ Remodeling$ umfasst$ sowohl$ Veränderungen$ der$ Extrazellulärmatrix$

(EZM),$ als$ auch$ intrazellulärer$Strukturen$und$ führt$ so$ zu$verminderter$Kontraktilität$

(Schotten$ et$ al.$ 2001;$ Kostin$ et$ al.$ 2002)$ sowie$ zur$ Verschlechterung$ der$

Erregungsausbreitung$(Spach$et$al.$1997;$Verheule$et$al.$2004).$Die$zugrunde$liegenden$

Mechanismen$ sind$ bis$ heute$ nicht$ hinreichend$ verstanden$ (Tan$ et$ al.$ 2011).$ Es$wird$

jedoch$ angenommen,$ dass$ das$ strukturelle$ Remodeling$ einen$ wesentlichen$

pathogenetischen$ Mechanismus$ darstellt$ (Spach$ et$ al.$ 1997;$ Nattel$ 2004).$ Diese$

Vermutung$wird$auch$durch$klinischen$Studien$gestützt:$Patienten$mit$VHF$zeigen$eine$

massive$ Zunahme$ der$ EZM,$ Hypertrophie,$ myozytäre$ Nekrosen$ und$ Myokarditis$

(Frustaci$et$al.$1991;$Frustaci$et$al.$1997;$Schotten$et$al.$2001;$Kostin$et$al.$2002).$Bei$

Patienten$mit$Risikofaktoren$für$VHF,$wie$z.$B.$Herzinsuffizienz,$Klappenerkrankungen,$

dilatative$und$hypertrophe$Kardiomyopathie$oder$fortgeschrittenes$Lebensalter,$finden$

sich$ gleichfalls$ Fibrosierungen$ (Ohtani$ et$ al.$ 1995;$ Anné$ et$ al.$ 2005,$ Biernacka$ et$ al.$

2011).$ Ebenso$ lässt$ sich$ bei$ Patienten$ mit$ idiopathischen$ VHF$ neben$ lymphatischE$

inflammatorischen$ Infiltraten$ und$ Nekrosen$ eine$ Erhöhung$ des$ kollagenen$

Bindegewebes$nachweisen$(Frustaci$et$al.$1991;$Frustaci$et$al.$1997;$Boldt$et$al.$2006).$

Das$ Bild$ dieser$ strukturellen$ Veränderungen$ kann$ zwar$ nicht$ vereinheitlicht$ werden$

(Schotten$ et$ al.$ 2011),$ es$ zeigt$ sich$ jedoch,$ dass$ die$ Störung$ der$ normalen$

Gewebearchitektur$ durch$ Unterbrechung$ der$ seitlichen$ Interzellulärkontakte$ durch$

eine$ Vermehrung$ der$ EZM$ die$ Ausbreitung$ einer$ einheitlichen$ Erregungsfront$ stört$

(Spach$et$al.$1997).$

Experimentell$ konnten$ diese$ klinischen$ Beobachtungen$ in$ Tierexperimenten$

reproduziert$werden,$bei$denen$in$Ziegen$über$vier$Monate$mittels$Schrittmacher$VHF$

simuliert$wurde.$Die$Tiere$zeigten$eine$deutliche$Fibrose,$Myolysen$und$eine$Zunahme$

des$Myozytendurchmessers$ (Ausma$ et$ al.$ 2003).$ In$ einer$weiteren$ Studie$ zeigte$ sich,$

dass$auch$bei$künstlich$erzeugtem$VHF$die$Erfolgsrate$der$Kardioversion$mit$der$Dauer$

der$Stimualtion$deutlich$abnahm$(Verheule$et$al.$2010),$was$den$klinischen$Erfahrungen$

entspricht$(Borgeat$et$al.$1986;$Nair$et$al.$2011).$Die$histologischen$Korrelate$des$VHF$

1.$Einleitung$$

$ 13$

konnten$ ebenfalls$ in$ Tiermodellen$ beobachtet$ werden$ (Boyden$ et$ al.$ 1981;$ Li$ et$ al.$

1999).$ Dennoch$ scheint$ die$ atriale$ Fbrose$ kein$ zwingendes$ Substrat$ für$ VHF$ zu$ sein$

(Neuberger$et$al.$2005).$

1.3.1.1.$Rolle$des$Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems$(RAAS)$

Einen$ wesentlichen$ molekularpathologischen$ Mechanismus$ für$ Entstehung$ und$

Progression$von$VHF$scheint$das$RAAS$darzustellen.$Durch$Goette$et$al.$konnte$gezeigt$

werden,$ dass$ Patienten$ mit$ VHF$ eine$ erhöhte$ Expression$ des$ angiotensin$ converting$

enzyme$(ACE)$aufweisen,$einhergehend$mit$einer$vermehrten$Expression$und$Aktivität$

der$ extracellular$ signalEregulated$ kinase$ 1/2$ (Erk1/2)$ und$mitogenEactivated$ protein$

kinase$ kinase$ 1/2$ (MEK1/2)$ (Goette$ et$ al.$ 2000).$ Ebenso$ scheint$ eine$ direkte$

Korrelation$ zwischen$ atrialer$ Angiotensin$ II$ (AngII)EKonzentration$ und$ dem$ Ausmaß$

der$Vorhoffibrose$bzw.$der$Kollagenproduktion$zu$bestehen$(Brilla$et$al.$1994;$Li$et$al.$

2001).$ Die$ Plasmaspiegel$ von$ Aldosteron$ und$ Renin$ werden$ durch$ VHF$ tendenziell$

erhöht$ (Tuinenburg$ et$ al.$ 1998),$ eine$ Konversion$ zum$ Sinusrhythmus$ senkt$ den$

Aldosteronspiegel$wieder$(Goette$et$al.$2001),$sodass$von$einer$verstärkten$Aktivierung$

des$RAAS$während$VHF$und$durch$dessen$Mechanismen$gesprochen$werden$kann.$

AngII$führt$im$Herzen$direkt$zu$einer$vermehrten$Expression$des$transforming$growth$

factors$beta$(TGFβ)$(Lee$et$al.$1995;$Kupfahl$et$al.$2000)$und$bewirkt$eine$Hypertrophie$

der$ Kardiomyozyten$ (Schultz$ et$ al.$ 2002).$ Der$ Einfluss$ auf$ die$ Kollagenproduktion$

scheint$jedoch$kein$direkter$Effekt$des$AngII$zu$sein,$sondern$erfolgt$sekundär$über$die$

Signalwege$des$TGFβ,$dessen$Überexpression$eine$verstärkte$Produktion$von$Kollagen$I$

und$Kollagen$III$bedingt$(Kupfahl$et$al.$2000).$Es$ist$auch$beschrieben,$dass$AngII$eine$

Inhibition$ der$ Kollagenasen$ bewirkt$ (Brilla$ et$ al.$ 1994).$ Aldosteron$ wirkt$ ebenfalls$

profibrotisch,$führt$zu$Hypertrophie$und$Fortleitungsstörungen$(Reil$et$al.$2011).$

Neben$anderen$führen$diese$Mechanismen$zu$deutlichen$Fibrosierungen,$welche$in$der$

Folge$ die$ reguläre$ Ausbreitung$ der$ Erregungsfront$ behindern$ (Verheule$ et$ al.$ 2004).$

Diese$ Fortleitungsstörungen$ sind$ wahrscheinlich$ auf$ eine$ schlechtere$ Kopplung$ der$

Zellen$ zurückzuführen,$ weil$ die$ zunehmende$ Matrix$ die$ Zellen$ separiert$ und$ damit$

elektrisch$isoliert$(Li$et$al.$1999).$$

Die$ Vermutung,$ dass$ das$ RAAS$ eine$ entscheidende$Rolle$ bei$ der$ Entstehung$ des$ VHF$

spielt,$ wird$ durch$ genetische$ Untersuchungen$ weiter$ gestützt:$ Polymorphismen$ in$

Genen$ des$ RAAS$ (ACE,$ Angiotensinogen,$ AT1ERezeptor)$ stehen$ im$ direkten$

Zusammenhang$mit$dem$VHFERisiko$(Tsai$et$al.$2004;$Tsai$et$al.$2008;$Xiao$et$al.$2010).$

1.$Einleitung$$

$ 14$

Des$Weiteren$zeigte$sich$in$klinischen$Studien$(TRACE$trial,$SOLVD$trial),$dass$durch$die$

Gabe$ von$ ACEEInhibitoren$ bei$ Risikopatienten$ die$ Prävalenz$ von$ VHF$ signifikant$

vermindert$wird$(Pedersen$et$al.$1999;$Vermes$et$al.$2003;$Lévy$2006;$Schneider$et$al.$

2010).$ Ebenso$ konnte$ die$ Rezidivwahrscheinlichkeit$ nach$ Kardioversion$ durch$ Gabe$

von$$Angiotensin$II$Typ$1ERezeptor$(AT1)EAntagonisten$verringert$werden$(Madrid$et$al.$

2002).$

$

1.3.2.$Elektrisches$Remodeling$

Einen$weiteren$wesentlichen$pathophysiologischen$Mechanismus$stellt$das$elektrische$

Remodeling$ dar.$ Dieses$ umfasst$ die$ Veränderungen$ der$ elektrophysiologischen$

Eigenschaften$ der$ Kardiomyozyten,$ welche$ in$ der$ Summe$ zu$ einer$ Verkürzung$ der$

Refraktärzeit$und$Lateralisierung$der$elektrotonen$Erregungsausbreitung$führen,$was$in$

der$ Folge$ eine$ Verkürzung$ der$ Wellenlänge$ bedingt$ und$ damit$ die$ Entstehung$ von$

ReentryEKreisen,$ begünstigt$ (Goette$ et$ al.$ 2006).$ Aus$ der$ Literatur$ ergibt$ sich$ ein$

teilweise$ sehr$ widersprüchliches$ Bild$ über$ die$ Alterationen$ der$ unterschiedlichen$

Ionenkanäle.$ Einen$ stabilen$ Indikator$ für$ das$ Vorliegen$ VHFEspezifischer$

elektrophysiologischer$ Veränderungen$ stellt$ jedoch$ die$ α1CEUntereinheit$ des$

spannungsabhängigen$ LETyp$ Calciumkanals$ (CACNA1C)$ dar,$ deren$ Expression$ sich$

sowohl$ in$Patienten$mit$VHF$als$auch$in$experimentellen$Modellen$homogen$reduziert$

fand$(Schotten$et$al.$2011).$

$

1.4.+Promotormodule+

Promotoren$ bestehen$ aus$ dem$ Kernpromotor$ und$ den$ weiter$ upstream$ gelegenen$

proximalen$ Promotorelementen,$ welche$ zusammen$ mit$ Enhancern,$ Silencern$ und$

Insulatoren$ sowohl$ die$ grundlegenden$ als$ auch$ spezifischen$ transkriptionellen$

Regulationseinheiten$ eukaryotischer$ Gene$ darstellen$ (Alberts$ et$ al.$ 2008;$ Riethoven$

2010).$ Hier$ werden$ die$ konvergierenden$ Signalnetzwerke$ zur$ Induktion$ oder$

Suppression$der$Genexpression$integriert$(Alberts$et$al.$2008;$Yilmaz$et$al.$2010).$Meist$

ist$ unter$ physiologischen$Bedingungen$ ein$ einziger$Transkriptionsfaktor$ (TF)$ nicht$ in$

der$Lage,$die$Transkription$zu$regulieren.$Oft$wird$eine$Vielzahl$von$TF$notwendig$und$

sowohl$ die$ Interaktion$ zwischen$ diesen$ als$ auch$ die$ Kombination$ distinkter$ TF$

vermitteln$ eine$ differenzierte$ und$ adäquate$ Reaktion$ auf$ entsprechende$

entwicklungsbiologische,$ physiologische$ und$ umweltbedingte$ Anforderungen$ (Alberts$

et$ al.$ 2008;$ Riethoven$ 2010;$ Yilmaz$ et$ al.$ 2010).$ Eine$ organisierte$ Anordnung$ von$

1.$Einleitung$$

$ 15$

definierten$ Transkriptionsfaktorbindungsstellen$ (TFBS)$ im$ Promotor$ in$ festgelegter$

Reihenfolge,$ konstantem$ Abstand$ und$ konstanter$ Orientierung$ zueinander$ wird$ als$

Promotormodul$ bezeichnet$ (Klingenhoff$ et$ al.$ 1999).$ Abweichend$ davon$ existieren$

weitere$ Definitionen,$ die$ jedoch$ keinen$ klaren$ Angaben$ zum$ Abstand$ der$ einzelnen$

TFBS$untereinander,$ deren$Anordnung$und$Orientierung$machen$ (Arnone$et$ al.$ 1998;$

Firulli$ et$ al.$ 1997;$ Wasserman$ et$ al.$ 1998;$ Yuh$ et$ al.$ 1998;$ Krivan$ et$ al.$ 2001).$ Bei$

bekannter$ Promotorsequenz$ können$ darin$ enthaltene$ TFBS$ mithilfe$ entsprechender$

Datenbanken$ und$ Programme$ in$ silico$ vorhergesagt$ werden$ (Ghosh$ 1990,$ 2000;$

Wingender$et$ al.$1996;$Kolchanov$et$ al.$2002;$Matys$et$ al.$2006).$Anschließend$ergibt$

sich$ die$ Möglichkeit,$ computergestützt$ durch$ statistische$ Verfahren$ Module$

vorherzusagen,$ die$ in$ den$ Promotoren$ gleichsinnig$ regulierter$ Gene$ enthalten$ sein$

könnten,$ wobei$ die$ Wahrscheinlichkeit$ gesteigert$ werden$ kann,$ wenn$ Module$

speziesvergleichend$gesucht$werden$ (Döhr$et$al.$2005;$Cohen$et$al.$2006).$Ausgehend$

von$diesen$Promotormodulen,$die$evolutionär$stark$konserviert$sind$(Döhr$et$al.$2005;$

Cohen$ et$ al.$ 2006),$ lassen$ sich$ durch$ erneute$ globale$ Promotoranalysen$ Gene$

vorhersagen,$ die$ zu$ dem$ SituationsE$ oder$ StimulusEspezifischen$ Set$ regulierter$ Gene$

gehören.$Somit$wird$eine$zuordnende$ Identifizierung$von$Genen$und$eine$ funktionelle$

Verknüpfung$möglich,$ was$ in$ entsprechenden$ Studien$ bereits$ gezeigt$ werden$ konnte$

(Fessele$et$al.$2002;$Döhr$et$al.$2005;$Cohen$et$al.$2006;$Augustin$et$al.$2011;$Sun$et$al.$

2012).$

2.$Zielstellung$der$Arbeit$$

$ 16$

2.+Zielstellung+der+Arbeit+

Die$Aktivierung$des$ReninEAngiotensinESystems$und$insbesondere$erhöhte$PlasmaE$und$

Gewebekonzentrationen$ von$ Angiotensin$ II$ stellen$ einen$ wichtigen$ pathogenetischen$

Faktor$ für$ die$ Entstehung$ und$ Progression$ des$ Vorhofflimmerns$ dar.$ Entsprechend$

zeigen$AT1EAntagonisten$wie$Irbesartan$bei$Patienten$mit$VHF$sowie$in$entsprechenden$

experimentellen$Modellen$protektive$Effekte.$Die$zugrundeliegenden$Mechanismen$sind$

bisher$nicht$vollständig$verstanden.$$

Vorarbeiten$unter$Verwendung$eines$RAP$ in$vivoEModells$ zeigten,$dass$ Irbesartan$die$

Expression$ von$ mehr$ als$ 200$ Genen$ beeinflusst.$ Woraus$ sich$ die$ Frage$ nach$ den$

zugrundeliegenden$Regulationsmechanismen$ergibt.$

Die$hier$vorgelegte$Arbeit$hat$die$Beantwortung$folgender$Fragestellungen$zum$Ziel:$

+

Charakterisierung+ von+ Promotoren+ Irbesartan5regulierter+ Gene+ unter+ rapid+

pacing+in+vivo+(Schwein)++

1. Zeichnen$ sich$ die$ Promotoren$ IrbesartanEregulierter$Gene$ durch$ die$Anwesenheit$

gemeinsamer$Transkriptionsfaktorbindungsstellen$(TFBS)$aus?$

2. Unterscheiden$ sich$ Promotoren$ IrbesartanEinduzierter$ bzw.$ –supprimierter$ Gene$

hinsichtlich$der$Art$und$Häufigkeit$distinkter$TFBS?$

3. Korreliert$ die$ Häufigkeit$ solcher$ diskriminierenden$ TFBS$ mit$ der$ Stärke$ des$

IrbesartanEbedingten$Genexpressionseffektes?$

+

Verifizierung+ potentieller+ Irbesartan5gesteuerter+ Transkriptionsfaktorbindung5

stellen+unter+rapid+pacing+in+vitro+(HL515Kardiomyozyten)++

1. Beeinflusst$ rapid$ pacing$ in$ vitro$ die$ Expression$ präferentieller$

Transkriptionsfaktoren$(TF)$für$IrbesartanEgesteuerte$TFBS$und$

2. korreliert$dies$mit$der$Änderung$der$Expression$von$TFEZielgenen?$

3. Entsprechen$die$Ergebnisse$dieser$in$vitro$Untersuchungen$denen$aus$dem$in$vivo$

Modell?$

$

3.$Material$und$Methoden$$

$ 17$

3.+Material+und+Methoden+

3.1.+Material+

3.1.1.$Chemikalien$und$Reagenzien$

Produkt+ + + + + + Hersteller+

ε$–Aminocapronsäure$ $ $ $ Sigma$

Acrylamid$Rotiphorese®$Gel$30$ $ $ ROTH$

Acrylan®$ $ $ $ $ $ Antiseptika$

antiEGAPDHEIgG$(Kaninchen)$ $ $ Cell$Signaling$

antiEeHandEIgG$(Ziege;$Sc$9413)$ $ $ Santa$Cruz$

antiEKaninchenEIgG$(Ziege)$$ $ $ Cell$Signaling$

antiEZiegeEIgG$(Rind)$ $ $ $ Dianova$

Agarose$ $ $ $ $ $ Biozym$

Ammoniumperoxodisulfat$ $ $ $ ROTH$

L(+)EAscorbinsäure$ $ $ $ $ ROTH$

Bromphenolblau$ $ $ $ $ Feinchemie$K.EHEKallies$KG$

BSA$Fraktion$V$ $ $ $ $ ROTH$

CHAPS$$ $ $ $ $ $ ROTH$

CLAYCOMBEMedium$$ $ $ $ SAFC$Biosciences$

Coomassie$Brilliantblau$GE250$ $ $ Fluka$

deionisiertes$Wasser$ $ $ $ Millipore$

Dinatriumhydrogenphosphat$ $ $ ROTH$

1,4EDithiothreitol$ $ $ $ $ ROTH$

Dimethylsulfoxid$ $ $ $ $ AppliChem$

DPBS$ $ $ $ $ $ $ Gibco$

EDTA$ $ $ $ $ $ $ ROTH$

Essigsäure$(≥95,9%)$ $ $ $ ROTH$ $

Ethanol,$unvergällt$(96%)$ $ $ $ Universitätsapotheke$

Ethanol,$vergällt$(96%)$ $ $ $ Universitätsapotheke$

Fibronektin$ $ $ $ $ $ Sigma$

Fetales$Kälberserum$$ $ $ $ SAFC$Biosciences$

FilmEEntwickler$ $ $ $ $ AGFA$

FilmEFixierer$$ $ $ $ $ AGFA$

Formaldehyd$$ $ $ $ $ ROTH$

Formamid$ $ $ $ $ $ ROTH$


$ 18$

GeneRuler™$DNA$Ladder$Mix$ $ $ Fermentas$

LEGlutamin$ $ $ $ $ $ PAA$Laboratories$

Glycin$$ $ $ $ $ $ ROTH$

Guanidiniumhydrochlorid$ $ $ $ AppliChem$

Harnstoff$ $ $ $ $ $ ROTH$

HyperPAGE$Prestained$Protein$Marker$ $ Bioline$

Inkubator$Clean$ $ $ $ $ AppliChem$

IPTG$ $ $ $ $ $ $ ROTH$

Irbesartan$ $ $ $ $ $ SanofiEAventis$

Isopropanol$ $ $ $ $ $ ROTH$

Kaliumdihydrogenphosphat$ $ $ Merck$

LBEAgar$ $ $ $ $ $ ROTH$

LBEMedium$ $ $ $ $ $ ROTH$

LumiGLO®$ $ $ $ $ $ Cell$Signaling$

2EMercaptoethanol$ $ $ $ $ SERVA$

Methanol$ $ $ $ $ $ ROTH$

MiniElute™$Gel$Extraction$Kit$ $ $ Qiagen$

MOPS$ $ $ $ $ $ $ ROTH$

Natriumazid$ $ $ $ $ $ ROTH$

Natriumchlorid$ $ $ $ $ ROTH$

Natriumdodecylsulfat$ $ $ $ ROTH$

Natronlauge$ $ $ $ $ $ ROTH$

Noradrenalin$$ $ $ $ $ Sigma$

PageRuler™$Prestained$Protein$Ladder$ $ Fermentas$

Penicillin/Streptomycin$ $ $ $ PAA$Laboratories$

peqGOLD$TriFast™$ $ $ $ $ peqlab$

Phosphorsäure$ $ $ $ $ ROTH$

Ponçeau$S$ $ $ $ $ $ SERVA$

pTRACERECMV$ $ $ $ $ Invitrogen$

QIAquick®$Gel$Extraction$Kit$ $ $ Qiagen$

RedSafe™$ $ $ $ $ $ Intron$Biotechnology$

RevertAid™$First$Strand$cDNA$Synthesis$Kit$ Fermentas$

RNase$A$ $ $ $ $ $ ROTH$

Roti®EBlock$ $ $ $ $ $ ROTH$


$ 19$

Salzsäure$ $ $ $ $ $ Merck$

SensiMix™$SYBR$Kit$ $ $ $ $ Bioline$

Sojabohnen$Trypsininhibitor$ $ $ Sigma$

SuperSignal®$West$Dura$ $ $ $ Thermo$Scientific$

T4$DNA$Ligase$ $ $ $ $ Fermentas$

T4$DNA$Ligationspuffer$ $ $ $ Fermentas$

TEMED$ $ $ $ $ $ ROTH,$Gibco$

Thioharnstoff$$ $ $ $ $ ROTH$

Trichloressigsäure$ $ $ $ $ ROTH$

Tris$ $ $ $ $ $ $ ROTH$

Trypsin/EDTA$ $ $ $ $ PAA$Laboratories$

Tween$$ $ $ $ $ $ ROTH;$Fluka$

xEGal$ $ $ $ $ $ $ ROTH$


$ 20$

3.1.2.$Verbrauchsmaterialien$


6EWellEZellkulturschalen$ $ $ $ Greiner$

96EWellEPlatten$ $ $ $ $ Greiner$

96EWellEPlatten,$PCR$$ $ $ $ VWR$

A.$destEAnlage$ $ $ $ $ Christ$(Ministil$P22)$

Bechergläser,$versch.$Größen$ $ $ VWR;$Jenaer$Glas;$Schott$Duran$

Einfrierboxen$ $ $ $ $ Kryosafe,$National$Lab$

Glasflaschen$(100/500/1000/2000$ml)$ $ Schott$Duran$

Handschuhe$ $ $ $ $ $ MicroETouch$(NitraTexEP)$ $

$ $ $ $ $ $ $ Kimberly$Clark$(Sterling$Nitrile)$

Kryoröhrchen,$1,8$ml$$ $ $ $ NUNC$

Messkolben$$ $ $ $ $ $ Labortherm$

Messzylinder$$ $ $ $ $ Duran®;$Scherf®$

Pasteurpipetten$ $ $ $ $ VWR$$

PCREFolien$$ $ $ $ $ $ Applied$Biosystems$

Pipettenspitzen,$gefiltert$ $ $ $ Biozym,$Sorensen$Bioscience$

Pipettenspitzen,$ungefiltert$$ $ $ Sarstedt$

serologische$Pipetten,$steril/unsteril$ $ Sarstedt$

Reaktionsgefäße,$0,2$ml$(PCREtubes)$ $ Biozym$

Reaktionsgefäße,$1,5$ml/2$ml$ $ $ Sarstedt$

Reaktionsgefäße,$15$ml/50$ml$ $ $ BD$FalconTM$

Zellkulturflaschen,$T75$ $ $ $ Sarstedt;$Greiner$

$

3.1.3.$Geräte$


Absorptionsmessgerät$ $ $ $ Tecan$infinite$M200$

AgaroseEGelelektrophorese$$ $ $ BioRad,$Biometra$

Auflichtmikroskop$Telaval$3$ $ $ Zeiss$

Autoklaven$ $ $ $ $ $ 3850$ELV,$Systec$

5075$ELV,$Tuttnauer$

Brutschrank$ $ $ $ $ $ CO2ECell$MMMEGroup$


$ 21$

Drucker$ $ $ $ $ $ HP$Deskjet$890C/950C$

HP$Laserjet$6MP/1005Series$

Eismaschine$ $ $ $ $ $ Enodis$

Feinwaage$ $ $ $ $ $ Sartorius,$BP$160$P$ $

Filmkassette$ $ $ $ $ $ AGFA;$Kodak$

Gefrierschränke$(E20°C)$ $ $ $ AEG;$Foron;$Liebherr;$Miele$

Gefrierschränke$(E80°C)$ $ $ $ Jouan;$Nuaire;$NUNC$

Geldokumentationsgerät$ $ $ $ Intas$

Invertierer$ $ $ $ $ $ Sarstedt$

Kühlschränke$(~4°C)$ $ $ $ Miele;$Foron;$privileg;$dkk$

Laminarbox$ $ $ $ $ $ Biohit;$Microflow$

Magnetrührer$ $ $ $ $ Variomag$Multipoint$HP$

Mikrowelle$ $ $ $ $ $ micromaxx$

PC$ $ $ $ $ $ $ Dell$

pHEMeter$ $ $ $ $ $ Orion$

Photometer$ $ $ $ $ $ Eppendorf$

Pipetten$ $ $ $ $ $ Eppendorf;$Biohit$

Pipettierhilfe$$ $ $ $ $ Pipeo;$AccuJet$

Pumpe$ $ $ $ $ $ PharmaciaLKB$

Reinstwasseranlage$MilliEQ$Synthesis$A$10$ Millipore$

qRTEPCRECycler$ $ $ $ $ BioRad$CFX96$

SDSEPAGEEPlatten$und$Kammersystem$ $ BioRad,$Biometra$

semiEdry$Electroblotting$System$ $ $ BioRad$

Spannungsquellen$ $ $ $ $ BioRad;$Consort$E443$

ThermalCycler$ $ $ $ $ Eppendorf$

Thermogefäß$für$flüssigen$Stickstoff$ $ Isotherm$

Waage$$ $ $ $ $ $ Sartorius$

Wasserbad$ $ $ $ $ $ Grant$

Zählkammer$(Neubauer)$ $ $ $ Optik$Labor$

ZellEpacingEPlatten$ $ $ $ $ Ionoptix$CEPace$EP$

ZellEpacingEStimulator$ $ $ $ Ionoptix$CEPace$EP$

Zentrifugen:$ $ $ $ $ $ Centrifuge$5415$R,$Eppendorf$

$ $ $ $ $ $ $ CR312/CR422/KR22i,$Jouan$

$ $ $ $ $ $ $ Sorvall$RC28S,$DuPont$


$ 22$

3.1.4.$Zelllinie$

Die$ Zelllinie$ HLE1$wurde$ von$ Claycomb$ et$ al.$ 1998$ von$ der$ atrialen$ Tumorlinie$ ATE1$

abgeleitet.$ Sie$ zeichnet$ sich$ durch$ autonome$Kontraktion$ und$ eine$AtriumEspezifische$

Genexpression$aus$(Claycomb$et$al.$1998).$$

$

3.1.5.$Computerprogramme$


BLAST®$ $ $ $ $ $ NCBI$

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)$

CFX$Manager$(Version$2.0.885.0923)$ $ BioRad$

GraphPad$Prism®$5$ $ $ $ $ GraphPad$Software$

MATCH™$public$version$1.0$$ $ $ BIOBASE$

(http://www.geneEregulation.com/cgiEbin/pub/programs/match/bin/match.cgi)$

Mendeley$(Version$1.5.2)$ $ $ $ Mendeley$Ltd.$

Microsoft$Excel$für$Mac$2011$ $ $ Microsoft$

Microsoft$Excel$für$Mac$2011$ $ $ Microsoft$

SPSS$18$ $ $ $ $ $ IBM$


$ 23$

3.2.+Methoden+

3.2.1.$Promotordefinition$

Mithilfe$der$Sondensequenzen$des$für$die$durchgeführte$Transkiptomanalyse$genutzten$

Microarrays$ (GeneChip$Porcine$Genome$Array$ (Affymetrix$ Inc.,$ Santa$Clara,$ CA,$USA))$

wurde$ unter$ Verwendung$ des$ Programms$ BLAST®$ nach$ entsprechenden$ mRNAE

Sequenzen$des$Schweins$gesucht$um$diese$nachfolgend$ im$Genom$zu$ lokalisieren.$Der$

Promotor$wurde$dann$als$die$vom$Startcodon$1000$bp$upstream$gelegene$DNAESequenz$

festgelegt,$ da$ durch$ die$ unzureichende$ Kartierung$ des$ Schweinegenoms$ in$ zu$ vielen$

Fällen$die$Identifizierung$der$5’EUTR$nicht$möglich$gewesen$wäre.$

$

3.2.2.$Identifikation$der$cis8Elemente$und$vergleichende$Promotoranalyse$

Zur$Vorhersage$potenzieller$Transkriptionsfaktorbindungsstellen$wurde$das$Programm$

MATCH™$public$ version$1.0$benutzt,$welches$ als$Referenz$die$TRANSFAC®EDatenbank$

verwendet.$ Als$ Suchmatrix$ diente$ die$ Vertebratengruppe,$ der$ cutEoff$ für$ die$ Auswahl$

der$ Matrix$ wurde$ so$ eingestellt,$ dass$ die$ Summe$ der$ falsch$ positiven$ und$ falsch$

negativen$minimal$war.$

+

3.2.3.$Vektorherstellung$(pTHand18KX)$

$ pTRACERECMV$

$

Primergebrauchslösung$ $ 10$µM$upstreamEPrimer$

$ $ $ $ $ $ 10$µM$downstreamEPrimer$

$

Mastermix$ $ $ $ 10$µl$Sensimix$

$ $ $ $ $ $ 2$µl$Primergebrauchslösung$

$

MiniElute™$Gel$Extraction$Kit$

$

$ Restriktionsansatz$ $ $ 2$µl$FastDigest$Green$Buffer$(10x)$

1$µl$FastDigest$KpnI$

1$µl$FastDigest$XbaI$

1$µg$PlasmidEDNA/0,2$µg$PCREProdukt$

ad$20$µl$dH20$

$ $


$ 24$

QIAquick®$Gel$Extraction$Kit$

$

$ Ligationsansatz$ $ $ 2$µl$T4$DNA$Ligationspuffer$(10x)$

$ $ $ $ $ $ 1$µl$T4$DNA$Ligase$$

$ $ $ $ $ $ 100$ng$PlasmidEDNA$

100$ng$DNAEFragment$

ad$20$µl$dH20$

$

$ kompetente$E.coli$XL1Eblue$

$

LBEMedium$

$

$ LB/AmpEPlatte$ $ $ LBEAgar$

$ $ $ $ $ $ 100$u/ml$Ampicillin$

$ $ $ $ $ $ 20$µl$IPTG$(100mM)$

$ $ $ $ $ $ 90$µl$xEGal$(20$mg/ml)$

$

Nährmedium$$ $ $ LBEMedium$

$ $ $ $ $ $ 100$u/ml$Ampicillin$

$

$ Puffer$1$ $ $ $ 50$mM$Tris/HCl$

$ $ $ $ $ $ 10$mM$EDTA$

$ $ $ $ $ $ 100$µg/ml$RNAse$A$

$ $ $ $ $ $ pH$8,0$

$

$ Puffer$2$ $ $ $ 200$mM$NaOH$

$ $ $ $ $ $ 1%$(w/v)$SDS$

$

$ Puffer$3$ $ $ $ 3$M$Kaliumacetat$

$ $ $ $ $ $ pH$5,2$

$

Isopropanol$

$

70%$(v/v)$Ethanol,$unvergällt$


$ 25$

$

$ TEEPuffer$ $ $ $ 10$mM$Tris/HCl$

$ $ $ $ $ $ 0,1$mM$EDTA$

$ $ $ $ $ $ pH$8,0$

3.2.3.1.$Herstellung$eines$Hand1-Transkripts$mit$passenden$Ligationsstellen$

Das$Ansetzen$des$Mastermixes$erfolgt$unmittelbar$vor$dem$Pipettieren$der$PCR$mit$den$

Restriktionsstellen$ enthaltenden$ Hand1EPrimern$ (siehe$ Anhang).$ In$ ein$ 0,2$ ml$ Tube$

werden$12$µl$Mastermix$vorgelegt,$anschließend$wird$1$µl$eines$cDNAEPools$aus$HL1E

Zellen$ hinzugefügt,$ durch$weiteres$ zugeben$ von$7$ µl$ dH2O$und$mehrmaliges$ aufE$ und$

abpipettieren$ wird$ der$ Ansatz$ gut$ gemischt.$ Anschließend$ wird$ die$ Probe$ kurz$

zentrifugiert$und$nach$dem$Programm$in$Tab.$3E2$zyklisiert:$

Tab.+351:+PCR5Programm+zur+Amplifikation+eines+Hand15

Transkriptes+

Zeit+in+Sekunden+

Temperatur+in+°C+

6000$(10$min)$ 95$10$ 95$15$ 61$60$ 72$

3000$(5$min)$ 72$�$ 4$

3.2.3.2.$Klonieren$des$Hand1-Transkripts$in$den$Vektor$pTRACER-CMV$

Im$ Anschluss$ an$ die$ PCR$ wird$ der$ gesamte$ Ansatz$ auf$ ein$ 1,5%iges$ Agarosegel$

aufgetragen$und$elektrophoretisch$aufgetrennt$(siehe$3.2.6.4.).$Danach$wird$die$669$nt$

große$Bande$ausgeschnitten$und$mithilfe$des$MiniElute™$Gel$Extraction$Kits$von$Qiagen$

nach$Protokoll$aus$dem$Gel$extrahiert.$

Vor$ der$ Ligation$ müssen$ die$ Restriktionsstellen,$ die$ für$ die$ nachfolgende$ Ligation$

vonnöten$sind,$gespalten$werden.$Hierfür$wird$der$Restriktionsansatz$ für$das$Plasmid$

(pTRACERECMV)$mit$1$µg$PlasmidEDNA$und$ für$das$Hand1EFragment$mit$0,2$µg$unter$

Verwendung$ der$ Restriktionsendonukleasen$ KpnI$ und$ XbaI$ angesetzt.$ Der$ Verdau$

erfolgt$für$5$Minuten$bei$37°C,$zur$Erfolgskontrolle$wird$der$Restriktionsansatz$mit$dem$

nunmehr$ linearisierten$ Plasmid$ auf$ ein$ 1%iges$ Agarosegel$ aufgetragen$ und$

elektrophoretisch$ aufgetrennt$ (siehe$ 3.2.6.4.).$ Nachfolgend$ wird$ die$ 5647$ nt$ große$

34x+


$ 26$

Bande$aus$dem$Gel$ausgeschnitten$und$mithilfe$des$QIAquick®$Gel$Extraction$Kits$von$

Qiagen$nach$Protokoll$ aus$dem$Gel$extrahiert.$Der$Verdau$des$Hand1EFragments$wird$

nach$ der$ Restriktion$ mithilfe$ des$ MiniElute™$ Gel$ Extraction$ Kits$ von$ Qiagen$ erneut$

aufgereinigt,$um$die$Schnittfragmente$zu$entfernen.$

Anschließend$ wird$ der$ Ligationsansatz$ mit$ jeweils$ 100$ ng$ PlasmidEDNA$ und$ 100$ ng$

Hand1EFragment$pipettiert$und$für$10$Minuten$bei$Raumtemperatur$inkubiert.$Danach$

kann$ das$ fertige$ Plasmid$ (pTHand1EKX)$ zur$ Transformation$ und$ Aufzucht$ genutzt$

werden.$

3.2.3.3.$Transformation$und$Aufzucht$in$E.coli$XL1-blue$

Zur$ Transformation$ wird$ eine$ 100$ µl$ kompetente$ E.coli$ XL1EblueEKultur$ auf$ Eis$

aufgetaut,$anschließend$unter$sterilen$Bedingungen$10$µl$Ligationsansatz$hinzugegeben$

und$für$30$Minuten$auf$Eis$ inkubiert.$Danach$erfolgt$die$Inkubation$dieser$Suspension$

bei$42°C$im$Wasserbad$für$60$Sekunden,$wonach$diese$mit$800$µl$LBEMedium$versetzt$

wird.$Im$Anschluss$wird$die$Suspension$bei$37°C$und$unter$dauerhaftem$Schütteln$für$

weitere$60$Minuten$inkubiert.$

Die$aufgeschüttelte$Kultur$wird$nun$bei$1.500$g$für$5$Minuten$zentrifugiert.$Etwa$700$µl$

des$ Überstandes$ werden$ unter$ sterilen$ Bedigungen$ abgenommen,$ in$ dem$ restlichen$

Medium$ werden$ die$ sedimentierten$ Bakterien$ wieder$ resuspendiert,$ 50$ µl$ der$

Suspension$ werden$ auf$ eine$ LBEAgarplatte$ ausplattiert$ und$ über$ Nacht$ bei$ 37°C$

inkubiert.$

Von$der$bewachsene$Agarplatte$werden$mehrere$Einzelkolonien$aus$der$Mitte$der$Platte$

gepickt$und$in$je$2$ml$LBEMedium$mit$Ampicillin$gegeben$und$diese$erneut$über$Nacht$

bei$37°C$unter$stetigem$Schütteln$inkubiert.$

3.2.3.4.$Präparation$des$Plasmids$aus$der$E.coli-Kultur$

Die$ über$ Nacht$ hochgeschüttelten$ 2$ mlEKulturen$ werden$ für$ 5$ Minuten$ bei$ 1.500$ g$

sedimentiert,$der$Überstand$verworfen$und$das$Pallet$durch$vorsichtges$abpipettieren$

von$ restlicher$ Flüssigkeit$ befreit.$ Das$ trockene$ Sediment$wird$ nun$ in$ 250$ µl$ Puffer$ 1$

resuspendiert,$ anschließend$ werden$ 250$ µl$ Puffer$ 2$ hinzugefügt$ und$ die$ Suspension$

wird$4E6$Mal$ invertiert.$Unmittelbar$danach$werden$350$µl$Puffer$3$dazugegeben$und$

die$Probe$erneut$kräftig$invertiert.$Anschließend$erfolgt$eine$Zentrifugation$bei$4°C$für$

20$ Minuten$ mit$ 12.000$ g.$ Es$ werden$ sehr$ vorsichtig$ 800$ µl$ des$ entstandenen$

Überstands,$ ohne$ Mitnahme$ von$ Sediment,$ abgenommen$ und$ in$ ein$ neues$

Reaktionsgefäß$überführt.$Dieser$wird$nun$mit$560$µl$ Isopropanol$ versetzt,$ invertiert$


$ 27$

und$bei$4°C$für$20$Minuten$mit$12.000$g$zentrifugiert.$Der$Überstand$wird$abgenommen$

und$ das$ Sediment$ mit$ 1$ ml$ 70%igem$ Ethanol$ gewaschen,$ anschließend$ zentrifugiert$

und$der$Waschschritt$wiederholt.$Danach$wird$das$Sediment$vom$Überstand$befreit$und$

einer$adäquaten$Menge$von$TEEPuffer$gelöst.$

+

3.2.4.$Zellkultur$der$HL818Zellen$

$ Gebrauchsmedium$ $ $ 435$ml$CLAYCOMBEMedium$

$ $ $ $ $ $ 50$ml$FBS$

$ $ $ $ $ $ 5$ml$Penicillin$(10.000$u/ml)/$

$$$$$$$$$Streptomycin$(10.000$µg/ml)$

$ $ $ $ $ $ 5$ml$LEGlutamin$(200$mM)$

$ $ $ $ $ $ 5$ml$Aterenol$(siehe$unten)$

$

$ Transfektionsmedium$ $ 490$ml$CLAYCOMBEMedium$

$ $ $ $ $ $ 5$ml$LEGlutamin$(200$mM)$

$ $ $ $ $ $ 5$ml$Aterenol$(siehe$unten)$

$

$ DNAEMedium$$ $ $ 250$µl$Transfektionsmedium$$

4$µg$Plasmid$

(für$ein$Well$benötigt)$

$

LipofektaminEMedium$ $ 240$µl$Transfektionsmedium$

$ $ $ $ $ 10$µl$Lipofektamin$

$ $ $ $ $ (für$ein$Well$benötigt)$

$

PBS$(nach$GIBCO)$ $ $ 1,06$mM$Kaliumdihydrogenphosphat$

$ $ $ $ $ 155,17$mM$Natriumchlorid$

$ $ $ $ $ $ 2,97$mM$Dinatriumhydrogenphosphat$x$2H2O$

$ $ $ $ $ $ pH$7,4$

$ $ $

Aterenol$ $ $ $ 30$mM$Ascorbinsäure$

$ $ $ $ $ 10$Noradrenalin$

$ $ $ $ $ anschließend$steril$filtrieren$

$ $


$ 28$

$ Fibronektin/GelatineELösung$ 0,02%$(w/v)$Gelatine,$autoklaviert$

$ $ $ $ $ $ 0,5%$(v/v)$Fibronektin$[1mg/ml]$$

$

$ 1x$Trypsin$ $ $ $ $

$

$ SojabohnenETrypsininhibitor$ 25$mg$SojabohnenETrypsininhibitor$

$ $ $ $ $ $ 100$ml$1x$PBS$

$ $ $ $ $ $ anschließend$steril$filtrieren$

$

$ Einfriermedium$ $ $ 95%$FBS$

$ $ $ $ $ $ 5%$DMSO$

3.2.4.1.$Auftauen$der$Zellen$

Eine$ Zellkonserve$wird$ schnellstmöglich$ aufgetaut$ und$ in$ ein$ 15$ml$ FalconERöhrchen$$

mit$ 10$ ml$ 37°C$ warmen$ Gebrauchsmedium$ gegeben,$ anschließend$ erfolgt$ eine$

Zentrifugation$mit$500g$für$5$Minuten$bei$Raumtemperatur.$Das$überstehende$Medium$

wird$abgesaugt$und$verworfen,$die$sedimentierten$Zellen$in$5$ml$Medium$resuspendiert$

und$in$eine$Zellkulturflasche$mit$75$cm2$Fläche$(T75EFlasche)$gegeben.$Diese$wird$mit$

weiteren$ 10$ ml$ Medium$ auf$ 15$ ml$ Endvolumen$ aufgefüllt$ und$ anschließend$ im$

Brutschrank$bei$37°C$und$5%$CO2$inkubiert.$Nachdem$sich$die$Zellen$abgesetzt$haben,$

wird$ das$ Medium$ erneut$ gewechselt.$ Der$ reguläre$ Mediumwechsel$ erfolgt$ alle$ 24$

Stunden.$

3.2.4.2.$Passagieren$der$Zellen$

Eine$ T75EFlasche$ wird$ mit$ 6$ ml$ Fibronektin/GelatineELösung$ beschichtet$ und$ über$

Nacht$im$Brutschrank$inkubiert.$Am$nächsten$Tag$wird$die$Lösung$abgesaugt,$die$T75E

Flasche$mit$14$ml$Gebrauchsmedium$beschickt$und$wieder$in$den$Brutschrank$gebracht.$

Erreichen$ die$ Zellen$ in$ der$ T75EFlasche$ vollständige$ Konfluenz,$ können$ diese$ geteilt$

werden.$ Dazu$wird$ das$ überstehende$Medium$ sorgfältig$ abgesaugt$ und$ der$ Zellrasen$

mit$ 4$ ml$ 1x$ Trypsin$ benetzt.$ Das$ Trypsin$ wird$ nicht$ direkt$ auf$ die$ Zellen$ gegeben,$

sondern$auf$die$der$Flaschenöffnung$gegenüberliegende$Seite$getropft$und$dann$durch$

Kippen$ der$ Flasche$ über$ die$ Zellen$ verteilt.$ Nach$ vollständiger$ Benetzung$ der$ Zellen$

wird$ das$Trypsin$wieder$ abgesaugt$ und$die$ Zellen$ ein$weiteres$Mal$mit$ 4$ml$Trypsin$

benetzt.$Es$erfolgt$eine$Inkubation$von$2$Minuten$im$Brutschrank,$nachfolgend$wird$das$

überstehende$Trypsin$erneut$abgesaugt,$die$Zellen$werden$anschließend$ein$drittes$Mal$


$ 29$

mit$3$ml$Trypsin$versetzt$und$wiederholt$für$2E3$Minuten,$je$nach$Dichte$des$Zellrasens,$

im$ Brutschrank$ inkubiert.$ Anschließend$ erfolgt$ eine$ mikroskopische$ Kontrolle$ der$

Zellen,$ um$ den$ Trypsinierungserfolg$ zu$ beurteilen.$ Die$ Zellen$ werden$ nun$ vorsichtig$

geklopft$um$sie$vollständig$zu$lösen$und$mit$3$ml$SojabohnenETrypsininhibitor$versetzt.$

Der$Inhalt$einer$Zellkulturflasche$wird$in$ein$15$ml$Gefäß$überführt,$die$Flasche$folgend$

mit$ 4$ml$ Gebrauchsmedium$ gespült.$ Nach$ dem$ Spülen$ der$ Flasche$wird$ das$Medium$

wiederum$in$das$gleiche$15$ml$Gefäß$überführt.$Es$ folgt$eine$Zentrifugation$mit$500$g$

für$ 5$Minuten.$ Die$ sedimentierten$ Zellen$werden$ vom$Überstand$ befreit$ und$ in$ 3$ml$

Medium$resuspendiert.$Je$1$ml$dieser$Suspension$wird$in$die$bereits$vorbereiteten$T75E

Flaschen$ (s.o.)$ gegeben,$ diese$ wird$ im$ Anschluß$ geschwenkt$ und$ im$ Brutschrank$

inkubiert.$Das$Teilungsverhältnis$kann$zwischen$1:2$und$1:3$variiert$werden.$

Der$ Mediumwechsel$ erfolgt$ alle$ 24$ Stunden.$ Dabei$ wird$ das$ überstehende$ Medium$

abgesaugt$und$die$Flasche$mit$15$ml$warmen$Gebrauchsmedium$aufgefüllt;$das$Medium$

wird$indirekt$auf$die$Zellen$gegeben.$Dieses$Teilen$der$Zellen$wird$als$Passagenwechsel$

definiert.$

3.2.4.3.$Herstellen$von$Kryokonserven$

Eine$konfluente$T75EFlasche$wird$vom$überstehenden$Medium$befreit$und$mit$4$ml$1x$

Trypsin$benetzt.$Das$Trypsin$wird$nicht$direkt$auf$die$Zellen$gegeben,$sondern$auf$die$

der$ Flaschenöffnung$ gegenüberliegende$ Seite$ getropft$ und$ dann$ durch$ Kippen$ der$

Flasche$ über$ die$ Zellen$ verteilt.$ Nach$ vollständiger$ Benetzung$ der$ Zellen$ wird$ das$

Trypsin$wieder$abgesaugt$und$ein$weiteres$Mal$4$ml$Trypsin$hinzugegeben.$Es$erfolgt$

eine$ Inkubation$ von$ 2$ Minuten$ im$ Brutschrank,$ nachfolgend$ wird$ das$ überstehende$

Trypsin$ erneut$ abgesaugt,$ die$ Zellen$ werden$ anschließend$ ein$ drittes$ Mal$ mit$ 3$ ml$

Trypsin$ versetzt$ und$ wiederholt$ für$ 2E3$ Minuten$ im$ Brutschrank$ inkubiert.$

Anschließend$ erfolgt$ eine$ mikroskopische$ Kontrolle$ der$ Zellen$ um$ den$

Trypsinierungserfolg$zu$beurteilen.$Die$Zellen$werden$dann$vorsichtig$geklopft$um$sie$

vollständig$zu$lösen$und$mit$3$ml$SojabohnenETrypsininhibitor$versetzt.$Der$Inhalt$einer$

Zellkulturflasche$ wird$ in$ ein$ 15$ ml$ Gefäß$ überführt,$ die$ Flasche$ folgend$ mit$ 4$ ml$

Gebrauchsmedium$gespült.$Nach$dem$Spülen$der$Flasche$wird$das$Medium$wiederum$in$

das$gleiche$15$ml$Gefäß$überführt.$Es$folgt$eine$Zentrifugation$mit$500$g$für$5$Minuten.$

Die$ sedimentierten$ Zellen$ werden$ vom$ Überstand$ befreit,$ in$ 1,5$ ml$ Einfriermedium$

resuspendiert$ und$ in$ ein$ Kryoröhrchen$ gegeben,$ dieses$wird$ in$ ein$ Isopropanolgefäß$


$ 30$

gestellt$und$für$24$Stunden$bei$ E80°C$ langsam$heruntergekühlt.$ Im$Anschluß$kann$das$

Kryoröhrchen$im$flüssigen$Stickstoff$gelagert$werden.$

3.2.4.4.$Aussaat$der$Zellen$

Beim$ Aussäen$ der$ Zellen$ wird$ wie$ beim$ Passagieren$ verfahren,$ es$ muss$ jedoch$

zusätzlich$ die$ Mengen$ der$ Zellen$ durch$ Zählen$ in$ der$ Neubauerkammer$ bestimmt$

werden.$Diese$ermittelt$die$Zellzahl$durch$folgende$Gleichung:$

Zellen/ml$=$Mittelwert$der$vier$16erEQuadrate$*$10.000$

Eine$kleine$Menge$der$Zellen$wird$hierfür$ aus$der$ Suspension$ entnommen$und$ in$die$

präparierte$Kammer$gegeben.$Nach$Ermittlung$der$Zellzahl,$werden$1$Million$Zellen$pro$

6EWellESchale$ ausgesät,$ das$ Mediumvolumen$ wird$ auf$ 4$ ml$ aufgefüllt.$ Nach$ einer$

Vorinkubation$ von$ 48$ Stunden$ können$ die$ in$ die$ Platten$ ausgesäten$ Zellen$ weiteren$

Experimenten$zugeführt$werden.$Der$Mediumwechsel$erfolgt$alle$24$Stunden.$

Die$ Zellen$ werden$ für$ alle$ Experimente$ auf$ FibronektinEbeschichteteten$ StandardE6E

WellESchalen$kultiviert.$

3.2.4.5.$rapid-pacing$in$vitro$

Die$ ausgesäten$ Zellen$ werden$ vor$ dem$ akuten$ rapid$ pacing$ in$ vitro$ 48$ Stunden$

inkubiert.$Dabei$erfolgt$eine$Sichtkontrolle,$ob$die$Zellen$vollständige$Konfluenz$erreicht$

haben$und$eine$spontane$Kontraktion$zeigen.$Ist$dies$nicht$der$Fall,$werden$sie$nicht$für$

rapid$ pacing$ Experimente$ genutzt.$ Anschließend$ wird$ das$ Medium$ gewechselt,$ die$

Graphitelektroden$ aufgesetzt$ und$ an$ die$ Stimulationsquelle$ angeschlossen.$ Die$ Zellen$

werden$mit$einer$Frequenz$von$20Hz,$einer$Spannung$von$5V$und$einer$biphasischen$

Impulsdauer$von$4$ms$stimuliert.$

3.2.4.6.$Überexpression$von$Hand1$

Vor$der$Transfektion$müssen$DNAEMedium$und$Lipofektaminmedium$ frisch$angesetzt$

werden,$beide$werden$gut$gemischt$und$bei$Raumtemperatur$für$5$Minuten$inkubiert.$

Dann$werden$diese$in$gleichen$Verhältnissen$miteinander$gut$gemischt$und$für$weitere$

20$Minuten$bei$Raumtemperatur$inkubiert.$

Die$Aussaat$der$Zellen$erfolgt$wie$beim$passagieren,$es$wird$jedoch$nur$eine$Dichte$von$

750.000$Zellen$pro$Well$eingesät.$Anschließend$werden$die$Zellen$ im$Brutschrank$bei$

37°C$und$5%$CO2$ inkubiert.$Nach$24$Stunden$erreichen$die$Zellen$eine$Konfluenz$von$

70E80%.$Das$Medium$wird$abgenommen$und$die$Zellen$werden$drei$Mal$vorsichtig$mit$


$ 31$

warmen$ 2$ ml$ PBS$ gewaschen,$ sodass$ die$ FBSERückstände$ auf$ den$ Zellen$ möglichst$

gering$ sind.$ Anschließend$ wird$ jedes$ Well$ mit$ 2$ ml$ Transfektionsmedium$ beschickt.$

Hierauf$ werden$ pro$ Well$ 500$ µl$ des$ Gemischs$ aus$ DNAEMedium$ und$

Lipofektaminmedium$ langsam$ in$ jedes$ Well$ getropft.$ Durch$ vorsichtiges$ Schwenken$

wird$ eine$ homogene$ Verteilung$ im$ Well$ erreicht.$ Danach$ werden$ die$ Zellen$ für$ 6$

Stunden$ im$ Brutschrank$ inkubiert,$ anschließend$ muss$ das$ Medium$ mit$ 1,5$ ml$

Gebrauchsmedium$auf$ insgesamt$ 4$ml$ pro$Well$ aufgefüllt$ und$ erneut$ im$Brutschrank$

inkubiert$ werden.$ 48$ Stunden$ nach$ der$ Aussaat$ können$ die$ transfizierten$ Zellen$ für$

rapidEpacingEExperimente$genutzt$werden.$

Die$Transfektionseffizienz$beträgt$geschätzt$etwa$30E40%.$

+

3.2.5.$Protein8$und$RNA8Isolierung$

$ peqlabGOLD$TriFast$$

$

$ Chloroform$

$

95%$(v/v)$Ethanol,$unvergällt$

$

GuanidiniumEHClELösung$ $ 95%$(v/v)$Ethanol,$unvergällt$$

0,3$M$GuanidiniumEHCl$

$ $

$ 2DELysispuffer$ $ $ 8$M$Harnstoff$

$ $ $ $ $ $ 2$M$Thioharnstoff$

$ $ $ $ $ $ 2$mM$Tris$

$ $ $ $ $ $ 2%$(w/v)$CHAPS$$

1%$(w/v)$DTT$$

$

Die$6EWellESchale$wird$vom$überstehenden$Medium$befreit$und$mit$37°C$warmen$PBS$

drei$ Mal$ gewaschen,$ anschließend$werden$ die$ Zellen$mit$ 1$ml$ TriFast$ für$ 5$Minuten$

lysiert.$ Das$ durch$ Abschaben$ homogenisierte$ Lysat$ wird$ in$ ein$ 2$ mlEEppendorfgefäß$

überführt$und$weitere$5$Minuten$stehend$inkubiert.$Im$Anschluß$werden$jeweils$200$µl$

Chloroform$hinzugegeben,$für$10$bis$15$Minuten$behutsam$invertiert$und$hiernach$mit$

12.000g$bei$4°C$für$15$Minuten$zentrifugiert.$Die$Proben$werden$dann$für$3$Minuten$auf$

Eis$gestellt,$um$die$Phasentrennung$zu$verbessern.$Die$obere$wässrige$Phase$wird$nun$


$ 32$

vorsichtig$und$ohne$Kontamination$durch$die$ Interphase$abgenommen,$sie$enthält$die$

RNA.$ Interphase$ und$ organische$ Phase$ werden$ im$ Eppendorfgefäß$ belassen$ und$ der$

Proteinpräparation$zugeführt.$

3.2.5.1.$RNA-Präparation$

Die$ Fällung$ der$ RNA$ aus$ der$ wässrigen$ Phase$ erfolgt$ durch$ Zugabe$ von$ 500$ µl$

Isopropanol,$ die$ Probe$ wird$ gut$ invertiert$ und$ für$ mindestens$ 10$ Minuten$ auf$ Eis$

gestellt.$ Nach$ der$ Inkubation$ erfolgt$ eine$ Zentrifugation$ mit$ 12.000g$ bei$ 4°C$ für$ 12$

Minuten.$Das$dabei$entstehende$Sediment$wird$vom$Überstand$befreit$und$ in$1,25$ml$

75%igen$Ethanol$ für$5$bis$10$Minuten$unter$ständigem$Invertieren$gewaschen.$Dieser$

Schritt$wird$zweimal$wiederholt.$Nach$dem$letzten$Waschschritt$wird$das$überstehende$

Ethanol$möglichst$sauber$abgenommen$und$das$Sediment$unter$dem$Abzug$getrocknet.$

Im$Anschluß$wird$das$ trockene$und$durchsichtige$RNAESediment$entsprechend$seiner$

Größe$ mit$ 50$ bis$ 100$ µl$ RNaseEfreiem$ Wasser$ versetzt$ und$ über$ Nacht$ bei$ 4°C$

rehydriert.$ Vor$ der$ photometrischen$ Konzentrationsbestimmnung$ wird$ die$ RNA$

vorsichtig$durch$AufE$und$Abpipettieren$gemischt.$

3.2.5.2.$Proteinpräparation$

Vor$ der$ Proteinpräparation$ muss$ die$ DNA$ ausgefällt$ werden.$ Dies$ erfolgt$ durch$ die$

Zugabe$ von$ 300$ µl$ 95%igem$ Ethanol$ und$ anschließendes$ Invertieren$ für$ 5$ bis$ 7$

Minuten.$Danach$wird$die$gefällte$DNA$durch$Zentrifugation$mit$12000g$bei$4°C$ für$5$

Minuten$ sedimentiert.$ Der$ proteinenthaltende$ Überstand$ wird$ in$ zwei$ neue$ 2$ mlE

Eppendorfgefäße$ überführt$ (je$ 500$ µl)$ und$ mit$ jeweils$ 750$ µl$ Isopropanol$ versetzt,$

anschließend$ für$mindestens$ 10$Minuten$ bei$ 4°C$ inkubiert.$ Die$ ausgefällten$ Proteine$

werden$mit$12000g$bei$4°C$für$12$Minuten$sedimentiert$und$vom$Überstand$befreit,$das$

Sediment$ mit$ 1,75$ ml$ GuanidiniumEHClELösung$ für$ 20$ Minuten$ gewaschen$ und$ der$

Überstand$nachfolgend$verworfen.$Dieser$Waschschritt$wird$dreimal$wiederholt.$Nach$

Entfernung$des$ letzten$Überstandes$wird$das$ Sediment$mit$1,75$ml$95%igem$Ethanol$

für$ mindestens$ 20$ Minuten$ gewaschen$ und$ der$ Überstand$ anschließend$ verworfen.$

Dieser$Waschschritt$wird$ zweimal$wiederholt.$ Das$ saubere$ Sediment$wird$ unter$ dem$

Abzug$getrocknet$und$der$Größe$entsprechend$in$2DELysispuffer$gelöst,$für$20$Minuten$

auf$dem$Schüttler$inkubiert$und$anschließend$vereinigt.$

+

+

+


$ 33$

3.2.6.+Nukleinsäureanalytik+

3.2.6.1.$Photometrische$RNA-Konzentrationsbestimmung$

$ RNAEMesspuffer$ $ $ 10$mM$TrisEHCl$

$ $ $ $ $ $ pH$7,5$

$

Die$Proben$werden$vorsichtig$gemischt,$2$µl$Probe$zu$50$µl$RNAEMesspuffer$pipettiert,$

erneut$gemischt$und$ in$eine$UVEKüvette$gegeben.$Anschließend$werden$die$Proben$ in$

der$RNAEEinstellung$gemessen.$Wenn$die$Extinktion$der$Messung$nicht$zwischen$0,1E1$

liegt,$wird$die$Probe$entsprechend$verdünnt$bzw.$höher$konzentriert.$Ein$OD260/OD280E

Quotient$außerhalb$des$Bereichs$1,8E2,1$gilt$als$Ausschlußkriterium$für$die$Probe.$

3.2.6.2.$RT-PCR$

$ oligo(dT)18EPrimer$(0,5$µg/µl)$ $

$

Mastermix$ $ $ $ 6$µl$Reaktionspuffer$(5x)$

$ $ $ $ $ $ 3$µl$dNTPEMix$(10$mM)$

$ $ $ $ $ $ 1,5$µl$RNAseEInhibitor$(200$u/µl)$

$ $ $ $ $ $ 1,5$µL$Reverse$Transkriptase$(20$u/µl)$

$

Zur$reversen$Transkription$wird$1$µg$RNA$eingesetzt,$das$entsprechende$Volumen$mit$

1,5$µl$oligo(dT)18EPrimer$versetzt$und$mit$RNAseEfreiem$Wasser$auf$18$µl$Endvolumen$

aufgefüllt.$ Anschließend$ erfolgt$ eine$ Inkubation$ bei$ 65°C$ für$ 5$ Minuten.$ Die$ Proben$

werden$ danach$ auf$ Eis$ gestellt,$ mit$ 12$ µl$ Mastermix$ versetzt$ und$ durch$ AufE$ und$

Abpipettieren$gemischt.$Der$fertige$Ansatz$wird$nach$folgendem$Schema$inkubiert:$

Tab.+352:+PCR5Programm+für+RT5PCR+

Zeit+in+Minuten+

Temperatur+in+°C+

10$ 25$60$ 42$�$ 4$

Nach$ dem$ Ende$ dieses$ Programms,$ werden$ die$ Proben$ auf$ Eis$ inkubiert$ und$ im$

Verhältnis$1:8$mit$RNAseEfreiem$Wasser$verdünnt,$anschließend$bei$E20°C$gelagert.$

$

$


$ 34$

3.2.6.3.$Quantitative$real-time$PCR$

$ Primergebrauchslösung$ $ 10$µM$upstreamEPrimer$

$ $ $ $ $ $ 10$µM$downstreamEPrimer$

$

Mastermix$ $ $ $ 5$µl$Sensimix$

$ $ $ $ $ $ 1$µl$Primergebrauchslösung$

$

Das$Ansetzen$des$Mastermixes$erfolgt$unmittelbar$vor$dem$Pipettieren$der$PCR.$In$jedes$

Well$ werden$ 6$ µl$ Mastermix$ vorgelegt,$ anschließend$ werden$ die$ Proben$ in$ einem$

Volumen$von$4$µl$dazupipettiert,$wobei$sie$durch$mehrmaliges$aufE$und$abpipettieren$

gut$ gemischt$werden.$Die$Messung$ erfolgt$ in$Duplikaten.$Nach$ vollständigem$Beladen$

der$ Platte,$ wird$ diese$ mit$ einer$ floreszensdurchlässigen$ Folie$ verschlossen$ und$ bei$

1000g$für$eine$Minute$zentrifugiert.$Die$Zyklisierung$wird$mit$folgenden$Programmen,$

abhängig$vom$verwendeten$Primerpaar,$durchgeführt:$

1. CTGF;$P0$(mus$musculus)$

$Abb.$3E1:$Programm$für$die$realEtime$PCR$bei$Verwendung$der$Primerpaare$für$CTGF$und$P0$

2. CACNA1C;$E2F8;$PPP2R5B$

$Abb.$3E2:$Programm$für$die$realEtime$PCR$bei$Verwendung$des$Primerpaares$für$CACNA1C,$

E2F8,$PPP2R5B$

$

$

$


$ 35$

3. Hand1$(mus$musculus)$

$Abb.$3E3:$Programm$für$die$realEtime$PCR$bei$Verwendung$des$Primerpaares$für$Hand1$

4. Hand1$(sus$scrofa);$P0$(sus$scrofa)$

$Abb.$3E4:$Programm$für$die$realEtime$PCR$bei$Verwendung$des$Primerpaares$für$Hand1$und$P0$

Die$Auswertung$erfolgt$mithilfe$des$CFXEManagers$(BIORAD),$welcher$eine$modifizierte$

Version$ der$ EffizienzEkorrigierten$ ΔΔC(t)EMethode$ verwendet.$ Die$ dazu$ benötigten$

Standards$bestehen$aus$dem$Pool$der$ jeweils$ verwendeten$Proben,$diese$werden$1:8,$

1:80$und$1:800$in$Duplikaten$eingesetzt.$

3.2.6.4.$Gelelektrophorese$der$cDNA$

$ 50x$TAEEPuffer$ $ $ 2$M$Tris$

$ $ $ $ $ $ 0,95$M$Essigsäure$

$ $ $ $ $ $ 50$mM$EDTA$

$ $ $ $ $ $ pH$~8,0$

1x$TAEEPuffer$

$

RedSafe™$(20.000x)$

$

$ Agarosegel$ $ $ $ 1%$(w/v)$Agarose$

$ $ $ $ $ $ 1x$TAEEPuffer$

$ $ $ $ $ 0,005%$(v/v)$RedSafe™$

$


$ 36$

10x$MOPS$ $ $ $ 0,4$M$MOPS$

$ $ $ $ $ 0,1$M$Natriumacetat$

$ $ $ $ $ 10$mM$EDTA$

$ $ $ $ $ pH$7,0$

$ $ $ $ $ lichtgeschützt$aufbewahrt$

$

5x$Ladepuffer$ $ $ 0,16%$(v/v)$Bromphenolblaulösung,$gesättigt$

$ $ $ $ $ 4$mM$EDTA$

$ $ $ $ $ 2,66%$(v/v)$Formaldehyd$

$ $ $ $ $ 20%$(v/v)$Glycerol$

$ $ $ $ $ 30,8%$(v/v)$Formamid$

$ $ $ $ $ 40%$(v/v)$10x$MOPS$

$

Die$Agarose$wird$in$1x$TAEEPuffer$vorsichtig$aufgekocht$und$auf$etwa$60°C$abgekühlt,$

anschließend$ wird$ das$ RedSafe™$ zugesetzt$ und$ durch$ vorsichtiges$ invertieren$

vermischt.$Danach$kann$das$Gel$direkt$in$die$Kammer$gegossen$werden,$der$Kamm$wird$

nach$ einfüllen$ des$ flüssigen$Gels$ vorsichtig$ eingesetzt,$ folgend$wird$ bis$ zur$ Erkaltung$

des$Geles$gewartet.$

Die$ aufzutragenden$ cDNAEProben$ werden$ mit$ 20%$ 5x$ Ladepuffer$ versetzt,$ gemischt$

und$ in$ die$ Geltaschen$ eingegeben.$ Anschließend$ erfolgt$ die$ elektrophoretische$

Auftrennung$ bei$ 5E7$ V$ pro$ Zentimeter$ Elektrodenabstand.$ Die$ Auftrennungsdauer$

richtet$sich$nach$der$Größe$des$cDNA$Fragments.$

Nach$der$Auftrennung$kann$das$RedSafe™Egefärbte$Gel$mittels$UVELicht$zur$$

+

3.2.7.$Proteinanalyse$

3.2.7.1.$BRADFORD-Assay$

$ BRADFORDEReagenz$ $ 1,8$M$Phosphorsäure$

$ $ $ $ $ $ 0,85$M$Ethanol,$unvergällt$

$ $ $ $ $ $ 0,01%$(w/v)$Coomassie$Brilliantblau$GE250$$

$

$ 2DELysispuffer$ $ $ 8$M$Harnstoff$

$ $ $ $ $ $ 2$M$Thioharnstoff$

$ $ $ $ $ $ 2$mM$Tris$

$ $ $ $ $ $ 2%$(w/v)$CHAPS$$


$ 37$

1%$(w/v)$DTT$$

$

Proteinstandard$(200µg/ml)$ 2$mg$BSA$Fraktion$V$

$ $ $ $ $ $ 10$ml$2DELysispuffer$

$

Der$Standard$zur$Ermittlung$der$Proteinmenge$wird$wie$folgt$pipettiert:$

Tab.+353:+Pipettierschema+des+BRADFORD5Assay5Standards+

Proteinstandard+(200+µg)+in+µl+

2D5Lysispuffer+in+µl+

Proteinkonzentration+in+µg/ml+

0$ 20$ 0$2$ 18$ 0,4$3$ 17$ 0,6$4$ 16$ 0,8$5$ 15$ 1,0$6$ 14$ 1,2$8$ 12$ 1,6$10$ 10$ 2,0$20$ 0$ 4,0$

Die$so$beladenen$Wells$werden$mit$300$µl$BRADFORDEReagenz$beschickt$und$für$10$bis$

15$Minuten$ lichtgeschützt$ inkubiert.$Anschließend$erfolgt$die$Messung$der$Absorption$

bei$595$nm$gegen$eine$Referenz$von$360$nm.$

Von$den$Proben,$deren$Proteingehalt$gemessen$werden$soll,$werden$2$µl$auf$18$µl$2DE

Lysispuffer$ gegeben,$ dann$werden$ 300$ µl$ BRADFORDEReagenz$ hinzugegeben$ und$wie$

oben$für$die$gleiche$Zeit$lichtgeschützt$inkubiert.$

Die$ Bestimmung$ des$ Standards$ als$ auch$ der$ Proben$ erfolgt$ in$ Triplikaten.$ Liegen$ die$

Extinktionen$ der$ Proben$ nicht$ in$ der$ Mitte$ der$ Standardkurve,$ werden$ diese$

entsprechend$verdünnt.$

3.2.7.2.$SDS-Page$

Trenngelpuffer$ $ $ 1,5$M$TrisEHCl$

$ $ $ $ $ pH$8,8$

$

Trenngel$(15%ig)$ $ $ 1,15$ml$dH2O$

$ $ $ $ $ 1,25$ml$Trenngelpuffer$

$ $ $ $ $ 2,5$ml$Acrylamid$Rotiphorese®$Gel$30$

$ $ $ $ $ 50$μl$SDSELösung,$10%ig$(w/v)$


$ 38$

$ $ $ $ $ 50$μl$APSELösung,$10%ig$(w/v)$

$ $ $ $ $ 10$μl$TEMED$

$ $

Sammelgelpuffer$ $ $ 0,5$M$TrisEHCl$

$ $ $ $ $ pH$6,8$

$ $

Sammelgel$(4%ig)$ $ $ 1,4$ml$dH2O$

$ $ $ $ $ 0,25$ml$Trenngelpuffer$

$ $ $ $ $ 0,8$ml$Acrylamid$Rotiphorese®$Gel$30$

$ $ $ $ $ 50$μl$SDSELösung$(10%)$

$ $ $ $ $ 50$μl$APSELösung$(10%)$

$ $ $ $ $ 5$μl$TEMED$

$

1x$SDSELaufpuffer$ $ $ 192$mM$Glycin$

$ $ $ $ $ 24,8$mM$Tris$

$ $ $ $ $ 0,1%$(w/v)$SDS$$

$ $ $ $ $ pH$~8,3$

$

4x$Laemmli$Puffer$ $ $ 2$ml$Sammelgelpuffer$

$ $ $ $ $ 1,8$ml$Glycerol$(98%)$

$ $ $ $ $ 1,6$ml$SDS$(20%)$

$ $ $ $ $ 1,53$ml$dH2O$

$ $ $ $ $ 770$μl$DTT$(1$M)$

$ $ $ $ $ Spatelspitze$Bromphenolblau$

$

APS$(10%)$ $ $ $ 10%$(w/v)$APS$$

$

SDS$(10%)$ $ $ $ 10%$(w/v)$SDS$$

$

$

$

$


$ 39$

Zuerst$wird$das$Trenngel$nach$folgendem$Schema$zusammenpipettiert$und$gegossen:$

Tab.+354:+Pipettierschema+für+ein+Trenngel+(15%ig)+

Volumen+ Reagenz+

1,15$ml$ Aqua$bidest$1,25$ml$ Trenngelpuffer$2,5$ml$ Acrylamid$50$µl$ SDS$(10%)$50$µl$ APS$(10%)$5$µl$ TEMED$

Nach$ einer$ halben$ Stunde$ Polymerisation$ kann$ das$ Sammelgel$ nach$ nachstehendem$

Schema$pipettiert$und$gegossen$werden:$

Tab.+355:+Pipettierschema+für+ein+Sammelgel+(4%ig)+

Volumen+ Reagenz+

1,4$ml$ Aqua$bidest$0,25$ml$ Sammelgelpuffer$0,8$ml$ Acrylamid$25$µl$ SDS$(10%)$25$µl$ APS$(10%)$2,5$µl$ TEMED$

Die$Proben$werden$so$vorbereitet,$dass$eine$Gesamtmenge$von$20E40$µg$Protein$auf$das$

Gel$aufgetragen$werden$kann.$

Die$Gelelektrophorese$erfolgt$bei$einer$Spannung$von$90V$im$Sammelgel$und$120V$im$

Trenngel.$Kurz$bevor$die$Lauffront$aus$dem$Gel$ läuft,$wird$die$Spannung$abgeschaltet$

und$das$Gel$für$den$WesternEBlot$vorbereitet.$

3.2.7.3.$Western-Blot$

Anodenpuffer$ $ $ 300$mM$Tris$

$ $ $ $ $ 20%$(v/v)$Methanol$$

$ $ $ $ $ pH$10,4$

$

Kathodenpuffer$ $ $ 40$mM$εEAminocapronsäure$

$ $ $ $ $ 20%$(v/v)$Methanol$$

$ $ $ $ $ pH$~7,6$

$


$ 40$

Ponçeau$SELösung$ $ $ 0,2%$(w/v)$Ponçeau$S$$

$ $ $ $ $ 3%$(w/v)$Trichloressigsäure$$

$

Blockierungslösung$ $ $ 1x$Roti®EBlock$

$

TBSET$ $ $ $ $ 20$mM$Tris$

$ $ $ $ $ 138$mM$NaCl$

$ $ $ $ $ 0,1%$(v/v)$Tween$20$$

$ $ $ $ $ pH$7,6$

$

Primärantikörperlösung$ $ 20$mM$TrisEHCl$

$ $ $ $ $ 138$mM$NaCl$

5%$(w/v)$BSA$$

1%$(v/v)$Tween$$

0,03%$(w/v)$Natriumazid$$

pH$7,6$

$

Sekundärantikörperlösung$$ 1x$Roti®EBlock$

$

Lumineszenssubstratlösung$ 5$%$(v/v)$LumiGLO®EReagent$A$(20x)$$

$ $ $ $ $ 5$%$(v/v)$LumiGLO®EReagent$B$(20x)$$

$

Entwickler$ $ $ $ nach$Herstellerprotokoll$

$

Fixierer$ $ $ $ nach$Herstellerprotokoll$

$

Jeweils$vier$3$mmEFilterpapiere$von$einem$Abmesser$von$6x9$cm$werden$in$KathodenE$

bzw.$Anodenpuffer$vorinkubiert,$die$Nitrozellulosemembran$(ebenfalls$6x9$cm)$wird$im$

Anodenpuffer,$ das$ aus$ der$ Gelkammer$ gelöste$ Acrylamidgel$ im$ Kathodenpuffer$

vorinkubiert.$Die$Nitrozellulosemembran$wird$ vor$dem$Einlegen$ in$den$Anodenpuffer$

für$ zwei$ Minuten$ in$ Wasser$ eingeweicht.$ Der$ Aufbau$ des$ Blots$ erfolgte$ nach$

nachstehendem$Schema:$

$


$ 41$

Kathode$

4$Filterpapiere$

Acrylamidgel$

Nitrozellulose$

4$Filterpapiere$

Anode$

$

Pro$Quadratzentimeter$Membran$wird$für$den$Transfervorgang$eine$Stromstärke$von$1$

mA$angelegt,$die$Blottingzeit$beträgt$60$Minuten.$

Im$ Anschluss$ wird$ die$ Membran$ zur$ Transfereffizienzkontrolle$ für$ 5$ Minuten$ in$

Ponçeau$ SELösung$ inkubiert,$ mit$ Wasser$ vorsichtig$ gespült$ und$ begutachtet,$ dann$

erfolgt$die$Blockierung$für$eine$Stunde.$Es$folgt$eine$kurze$Waschung$mit$TBSET,$danach$

wird$der$Primärantikörper$unter$ständig$gleichmäßigem$Invertieren$bei$4°C$über$Nacht$

auf$ der$ Membran$ inkubiert.$ Anschließend$ wird$ die$ Membran$ drei$ Mal$ mit$ großem$

Volumen$ für$ etwa$ 5$ Minuten$ mit$ TBSET$ gewaschen$ und$ für$ eine$ Stunde$ bei$

Raumtemperatur$ mit$ dem$ Sekundärantikörper$ unter$ ständig$ gleichmäßigem$

Invertieren$ inkubiert.$ Der$ Sekundärantikörper$ wird$ verworfen,$ die$ Membran$ erneut$

drei$ Mal$ gewaschen$ und$ nachfolgend$ mit$ 5$ ml$ Lumineszenssubstratlösung$ für$ 2E3$

Minuten$inkubiert.$Die$Membran$wird$nun$in$eine$Röntgenkassette$gelegt,$anschließend$

wird$in$der$Dunkelkammer$ein$Röntgenfilm$der$lumineszierenden$Membran$exponiert,$

im$Entwickler$inkubiert$und$bei$ausreichender$Signalintensität$ im$Fixierer$abgestoppt.$

Der$Film$kann$dann$densitometrisch$ausgewertet$werden.$

$

3.2.8.$Datenauswertung$

Die$Datenauswertung$ erfolgt$mithilfe$ von$GraphPad$Prism$5$ und$ SPSS$ 18.$ Alle$Werte$

werden,$ wegen$ der$ geringen$ Endzahlen,$ als$ nichtparametrisch$ betrachtet.$ Die$

Darstellung$erfolgt$als$Scatterblot$und$alle$Werteangaben$entsprechen$dem$Median$mit$

Interquartilbereichen$ (IQR;$ Tukey’s$ Hinges).$ Zur$ Erfassung$ signifikanter$ Ergebnisse$

wurden$ der$ Wilcoxon$ SignedERankETest,$ MannEWhitneyETest,$ KruskalEWallisETest$

benutzt,$zur$Testung$von$Verteilungsunterschieden$der$Fisher’s$Exact$Test,$statistische$

Zusammenhänge$ wurden$ mittels$ linearer$ Regressionsanalyse$ überprüft.$ Das$

Signifikanzniveau$wird$auf$p<0,05$festgelegt.$

4.$Ergebnisse$$

$ 42$

4.+Ergebnisse+

Um$ eine$ Charakterisierung$ der$ Promotorstruktur$ IrbesartanEregulierter$ Gene$

durchführen$ und$ IrbesartanEregulierte$ Transkriptionsfaktorbindungsstellen$

identifizieren$ zu$ können,$musste$ vorerst$ eine$ vergleichende$Analyse$ der$ durch$ rapidE

pacing$differentiell$exprimierten$Genpromotoren$erfolgen.$$

$

4.1.+in+silico+

Den$ersten$Schritt$zu$dieser$vergleichenden$Promotoranalyse$stellte$die$Identifizierung$

IrbesartanEregulierter$ Kandidatengene$ dar.$ Hierfür$ konnte$ auf$ Transkriptomdaten$

zurückgegriffen$ werden,$ die$ in$ einem$ in$ vivoEModell$ (7h$ akutes$ rapidEpacing$ am$

Schwein)$erhalten$wurden$(Goette$et$al.$2009).$

In$diesen$Experimenten$wurde$Schweinen$ein$Katheter$zur$elektrischen$Stimulation$des$

Vorhofs$und$dadurch$Simulation$von$VHF$ implantiert.$Folgende$drei$Gruppen$wurden$

unterschieden:$

1. Kontrollgruppe$(sham)$

2. VHFEGruppe$(pacing)$

3. VHF$+$IrbesartanEGruppe$(pacing+Irbesartan)$

Es$fanden$sich$hierbei$unter$rapidEpacing$auf$mRNAEEbene$insgesamt$548$induziert$und$

453$supprimmiert$Gene.$Der$Einfluss$von$Irbesartan$auf$die$Genexpression$konnte$ für$

etwa$ein$Viertel$der$durch$rapidEpacing$veränderten$Gene$beobachtet$werden.$

$

4.1.1.$Genauswahl$und$Gruppierung$

Um$eine$möglichst$valide$statistische$Aussage$treffen$zu$können,$wurden$im$folgenden$

die$ Gene$ zur$ vergleichenden$ Promotoranalyse$ ausgewählt,$ die$ die$ folgenden$ drei$

Bedingungen$erfüllten:$

1. signifikante$Regulation$durch$rapidEpacing$um$den$Faktor$>4$

2. gleichsinnige$signifikante$Regulation$durch$rapidEpacing$unter$Irbesartan$

3. eine$ Abschwächung$ des$ rapidEpacingEEffektes$ durch$ Irbesartan$ um$ mindestens$

15%.$

Die$sich$daraus$ergebende$Auswahl$von$37$durch$rapidEpacing$differentiell$exprimierten$

Genen$im$Vorhof,$welche$gleichzeitig$einem$Irbesartaneffekt$unterlagen,$ ist$ in$Tab.$4E1$

aufgelistet.$

Die$Gruppierung$der$Gene$erfolgte$nach$der$Richtung$der$Regulation$durch$rapidEpacing$

in$supprimierte$bzw.$induzierte$Gene.$ $

4.$Ergebnisse$$

$ 43$

Tab.+451:+Auswahl+der+durch+rapid5pacing+im+Vorhof+differentiell+exprimierten+Gene++

Name+ sham+vs.+pacing+ sham+vs.+pacing+Irbesartan+

Irbesartan5Effekt+

NR4A3+ 522,87041+ 516,86219+ 0,2627+C5orf13$ E10,4588$ E8,86776$ 0,1521$E2F8+ 57,45052+ 55,85399+ 0,2143+MYOM2+ 57,42692+ 53,79503+ 0,4890+CRABP1+ 56,78494+ 54,69634+ 0,3078+NP_942123$ E6,77353$ E4,58074$ 0,3237$H2AFY2+ 56,17884+ 54,69348+ 0,2404+ADAMTS6+ 55,49272+ 53,59543+ 0,3454+LAMA2$ E5,43682$ E4,14061$ 0,2384$TUBGCP5$ E5,41232$ $ E3,74623$ 0,3078$PER3$ E5,13432$ E2,66825$ 0,4803$NUDT12+ 55,01291+ 52,82584+ 0,4363+STOX1+ 54,83248+ 54,04247+ 0,1635+OIT3$ E4,7586$ E3,36085$ 0,2937$BBS2$ E4,52742$ E1,71602$ 0,6210$RGS2+ 54,29864+ 53,61700+ 0,1586+PPP2R5B+ 54,10263+ 53,14914+ 0,2324+PCYT1A$ E4,09273$ E2,64145$ 0,3546$CENPE+ 54,04483+ 53,41272+ 0,1563+RERG+ 54,01117+ 52,79338+ 0,3036+CXCL9+ 15,40609+ 12,37688+ 0,1966+PTX3+ 8,93820+ 6,23188+ 0,3028+WARS$ 8,89490$ 4,38647$ 0,5069$CTGF+ 8,44647+ 6,84700+ 0,1894+TNFRSF12A+ 8,44420+ 4,93999+ 0,4150+PHLDA2+ 8,04411+ 3,77351+ 0,5309+SH3RF2+ 7,67459+ 5,81077+ 0,2429+MAFF+ 7,62804+ 5,76554+ 0,2442+S100A9+ 7,37601+ 4,88123+ 0,3382+BCAT1$ 6,81683$ 3,44060$ 0,4953$EIF3S3$ 6,01723$ 4,46519$ 0,2579$ABHD5+ 5,17220+ 3,47799+ 0,3276+SLC25A25$ 5,08125$ 3,40153$ 0,3306$IFRD1+ 4,86579+ 3,34618+ 0,3123+Q68DL8$ 4,85582$ 2,38706$ 0,5084$GTPBP1+ 4,55921+ 2,96586+ 0,3495+DISC1$ 4,02833$ 2,77116$ 0,3121$

+

+ +

4.$Ergebnisse$$

$ 44$

4.1.2.$Promotordefinition$

Mithilfe$der$Sondensequenzen$des$für$die$durchgeführte$Transkiptomanalyse$genutzten$

Microarrays$(GeneChip$Porcine$Genome$Arrays$(Affymetrix$Inc.,$Santa$Clara,$CA,$USA))$

wurde$ unter$ Verwendung$ des$ Programms$ BLAST®$ nach$ entsprechenden$ mRNAE

Sequenzen$des$Schweins$gesucht$um$diese$nachfolgend$ im$Genom$zu$ lokalisieren.$Der$

Promotor$wurde$dann$als$die$vom$Startcodon$1000$bp$upstream$gelegene$DNAESequenz$

festgelegt,$ da$ durch$ die$ unzureichende$ Kartierung$ des$ Schweinegenoms$ in$ zu$ vielen$

Fällen$die$Identifizierung$der$5’EUTR$nicht$möglich$gewesen$wäre.$

Bei$diesem$Vorgehen$konnten$insgesamt$23$Promotoren$von$12$supprimierten$und$11$

induzierten$Genen$definiert$und$zur$weiteren$Analyse$herangezogen$werden.$Die$Gene,$

deren$Promotoren$definiert$werden$konnten,$ sind$ in$Tab.$4E1$ fett$hervorgehoben.$Die$

entsprechenden$Promotorsequenzen$finden$sich$im$Anhang$(siehe$7.2.1.$und$7.2.2.).$

$

4.1.3.$Vorhersage$hypothetischer$Transkriptionsfaktorbindungsstellen$

Zur$ Vorhersage$ der$ potenziellen$ Bindungsstellen$ (cisEElemente)$ in$ den$ so$

identifizierten$Promotoren$wurde$das$Programm$MATCH™$public$version$1.0$benutzt,$

welches$ als$ Referenz$ die$ TRANSFAC®EDatenbank$ nutzt.$ Die$ Vertebratengruppe$ diente$

als$ Suchmatrix,$ der$ cutEoff$ für$ die$ Auswahl$ der$Matrix$ wurde$ so$ eingestellt,$ dass$ die$

Summe$der$falsch$positiven$und$falsch$negativen$minimal$war.$

Bei$der$quantitativen$Auswertung$der$so$erhaltenen$Vorhersagen$wurde$ausschließlich$

das$Vorhandensein$einer$Bindungsstelle$dem$entsprechenden$Promotor$zugeordnet,$die$

Häufigkeit$ und$ Orientierung$ blieben$ vorerst$ unberücksichtigt.$ Die$ detaillierten$

Ergebnisse$dieser$Analyse$finden$sich$im$Anhang$(siehe$7.2.3$und$7.2.4.).$

$

4.1.4.$Promotorvergleich$

4.1.4.1.$Vergleich$der$Bindungsstellen$von$supprimierten$und$induzierten$Promotoren$

Die$ so$ in$ einem$ Promotor$ vorhergesagten$ Bindungsstellen$ wurden$ innerhalb$ der$

Gruppe$der$ supprimierten$bzw.$ induzierten$Genpromotoren$subsummiert,$ sodass$ sich$

diese$ in$ Hinblick$ auf$ die$ Häufigkeit$ der$ die$ Bindungsstelle$ enthaltenden$ Promotoren$

miteinander$vergleichen$ließen$(Abb.$4E1).$ $

4.$Ergebnisse$$

$ 45$$ $

4.#Ergebnisse# #

#40#

# # # #

#Abb.#4.1:#Darstellung#der#relativen#H

äufigkeit#vorhergesagter#Transkriptionsfaktorbindungsstellen#in#durch#rapid.pacing#supprimierten#oder#

induzierten#Prom

otor.#

0#

0,1#

0,2#

0,3#

0,4#

0,5#

0,6#0,7#

0,8#0,9#1#

relativer#Anteil#der#Binsungsstelle#im#regulierten#Promotor#

vorhergesagte#Transkriptionsfaktorbindungsstelle#

supprimiert#

induziert#

4.$Ergebnisse$$

$ 46$

Der$einzig$signifikante$Unterschied$zwischen$diesen$beiden$Gruppen$zeigte$sich$für$die$

Häufigkeit$ der$ hypothetische$ Bindungsstelle$ V$HAND1E47_01$ (Fisher’s$ Exact$ Test:$

p=0,003),$mit$der$coreESequenze:$TCTGG$(Abb.$4E2).$

$

$$Abb.$ 4E2:$Darstellung$ der$Häufigkeit$ der$ Bindungsstelle$ V$HAND1E47_01$ in$ den$ durch$ rapidEpacing$supprimierten$bzw.$induzierten$Promotorgruppen.$$Relative$ Häufigkeit$ der$ Bindungsstelle$ V$HAND1E47_01:$ supprimierte$ Promotorgruppe$ (75%$(9/12));$induzierte$Promotorgruppe$(9%$(1/11));$Fischer’s$Excat$Test:$p=0,003.$

4.1.4.2.$Verteilung$der$differentiellen$Bindungsstellen$über$den$rapid-pacing-Effekt$

Um$ zu$ untersuchen$ ob$ die$ Häufigkeit$ der$ signifikant$ differentiellen$ cisEElemente$ in$

einem$Zusammenhang$mit$dem$rapidEpacingEEffekt$stehen,$wurden$die$Genpromotoren$

entsprechend$ der$ Effektstärke$ klassiert.$ Dabei$ umfasst$ eine$ Effektklasse$ (EK)$ Werte$

nach$folgendem$Zusammenhang:$$

(EKE0,5)$=$EK$<$(EK+0,5)$;$EK$∈$ℤ"

Die$Anzahl$der$in$den$einzelnen$Effektklassen$enthaltenen$Genpromotoren$ist$in$Abb.$4E

3$graphisch$dargestellt.$

0%$

20%$

40%$

60%$

80%$

100%$

supprimiert$(n=12)$

induziert$(n=11)$

Hand1/E47*(n=23;*Fisher's*Exact*Test:*p=0,003)*

negativ$

positiv$

4.$Ergebnisse$$

$ 47$

$Abb.$4E3:$Darstellung$der$absoluten$Anzahl$der$in$einer$Effektklasse$enthaltener$Promotoren.$$Anzahl$ der$ Promotoren$ in$ einer$ Effektklasse:$ E23[E23,5=x<E22,5]=1;$ E7[E7,5=x<E6,5]=3;$ E6[E6,5=x<E5,5]=1;$ E5[E5,5=x<E4,5]=3;$ E4[E4,5=x<E3,5]=4;$ 5[4,5=x<5,5]=3;$ 7[6,5=x<7,5]=1;$8[7,5=x<8,5]=5;$9[8,5=x<9,5]=1;$15[14,5=x<15,5]=1.$

Anschließend$ wurde$ die$ relative$ Häufigkeit$ der$ Bindungsstelle$ V$HAND1E47_01$

innerhalb$einer$Effektklasse$ermittelt$und$graphisch$dargestellt$(Abb.$4E4).$

$Abb.$4E4:$Darstellung$der$relativen$V$HAND1E47_01EHäufigkeit$in$einer$Effektklasse.$Relative$Häufigkeit$ für$V$HAND1E47_01$ in$einer$Effektklasse:$ E7[E7,5=x<E6,5]=0,66$ (2/3);$ E6[E6,5=x<E5,5]=1$ (1/1);$ E5[E5,5=x<E4,5]=0,66$ (2/3);$ E4[E4,5=x<E3,5]=1$ (4/4);$ 5[4,5=x<5,5]=0,25$(1/4).$

In$ dieser$ Darstellung$ erkennt$ man$ für$ das$ cisEElement$ V$HAND1E47_01$ den$

Häufigkeitsunterschied$ zwischen$ supprimierten$ und$ induzierten$ Promotoren.$ Ein$

signifikanter$ Unterschied$ zwischen$ den$ Effektklassen$ der$ supprimierten$ Promotoren$

lässt$ sich$ jedoch$ nicht$ nachweisen,$ sodass$ die$ Verteilung$ der$ Bindungsstelle$ in$ den$

supprimierten$Genpromotoren$als$gleichmäßig$angenommen$werden$muss;$eine$valide$

0"

1"

2"

3"

4"

5"

(23"(22"(21"(20"(19"(18"(17"(16"(15"(14"(13"(12"(11"(10" (9" (8" (7" (6" (5" (4" (3" (2" (1" 0" 1" 2" 3" 4" 5" 6" 7" 8" 9" 10" 11" 12" 13" 14" 15"

absolute)Anzah

l)der)Promotoren

)

Effekt)des)rapid7pacing)auf)die)Genexpression)des)zum)Promotor)gehörigen)Gens)(rela?ves)Vielfaches,)klassiert))

4.$Ergebnisse$$

$ 48$

statistische$Aussage$ lässt$ sich$ hierzu$ jedoch$ aufgrund$ der$ geringen$ Endzahl$ nicht$mit$

letzter$Sicherheit$treffen.$

4.1.4.3.$ Verteilung$ der$ differentiellen$ Bindungsstellen$ über$ den$ Irbesartan-Effekt$ der$

supprimierten$Gene$

Fortfolgend$sollte$geprüft$werden,$ob$der$Effekt$des$Irbesartans$(siehe$Tab.$4E1)$auf$die$

Abschwächung$ des$ reinen$ rapidEpacingEEffekts$ in$ seiner$ Stärke$ von$ der$

V$HAND1E47_01EAnwesenheit$ im$ Promotor$ der$ supprimierten$ Gene$ abhing.$ Dazu$

wurde$als$erstes$der$ Irbesartaneffekt$der$supprimierten$Gene$klassiert,$ in$Abb.$4E5$ ist$

die$ Häufigkeit$ der$ enthaltenen$ Promotoren$ in$ einer$ Effektklasse$ dargestellt.$ Die$

Effektklassen$wurden$automatisch$klassiert$(SPSS)$und$umfassen$folgendende$Bereiche:$

0,18[0,145=x<0,215];$0,25[0,215=x<0,285];$0,32[0,285=x<0,355];$0,46[0,425=x<0,495].$

$Abb.$4E5:$Darstellung$der$absoluten$Anzahl$der$in$einer$Effektklasse$enthaltener$Promotoren.$Anzahl$der$Promotoren$ in$ einer$Effektklasse:$0,18[0,145=x<0,215]=3;$0,25[0,215=x<0,285]=4;$0,32[0,285=x<0,355]=3;$0,46[0,425=x<0,495]=2.$

Anschließend$ wurde$ die$ relative$ Häufigkeit$ der$ cisEElemente$ in$ einer$ Effektklasse$

berechnet$und$graphisch$in$Abb.$4E6$zusammengefasst.$

0"

1"

2"

3"

4"

5"

0,04" 0,11" 0,18" 0,25" 0,32" 0,39" 0,46"

absolute)Anzah

l)der)Promotoren

)

Effekt)des)rapid7pacing)auf)die)Genexpression)des)zum)Promotor)gehörigen)Gens)

(rela?ves)Vielfaches,)klassiert))

4.$Ergebnisse$$

$ 49$

$Abb.$4E6:$Darstellung$der$relativen$V$HAND1E47_01EHäufigkeit$in$einer$Effektklasse.$Relative$ Häufigkeit$ für$ V$HAND1E47_01$ in$ einer$ Effektklasse:$ 0,18[0,145=x<0,215]=1$ (3/3);$0,25[0,215=x<0,285]=0,75$ (3/4);$ 0,32[0,285=x<0,355]=0,66$ (2/3);$ 0,46[0,425=x<0,495]=0,5$(1/2).$$

Der$ graphisch$ gewonnene$ Eindruck,$ dass$ die$ Stärke$ des$ Irbesartaneffektes$ mit$

abnehmender$ Häufigkeit$ der$ Bindungsstelle$ V$HAND1E47_01$ zunimmt,$ konnte$ hier$

auch$statistisch$mittels$ linearer$Regressionsanalyse$nachgewiesen$werden$(R2=0,9116;$

p=0,0452),$sodass$ein$inverser$Zusammenhang$zwischen$Bindungsstellenhäufigkeit$und$

Stärke$des$Irbesartaneffekts$angenommen$werden$muss.$

+ +

slope='1,669,0,3676,R²,=,0,9116,p=0,0452,

0,

0,2,

0,4,

0,6,

0,8,

1,

0,04, 0,11, 0,18, 0,25, 0,32, 0,39, 0,46,

rela%v

e'Hä

ufigkeit'd

er'Bindu

ngsstelle'

V$HA

ND1

E47_01'

Effekt'des'rapidApacing'auf'die'Genexpression'des'zum'Promotor'gehörigen'Gens'

(rela%ves'Vielfaches,'klassiert)'

4.$Ergebnisse$$

$ 50$

4.2.+ex+vivo+

4.2.1.$Hand18Expression$im$Schwein$

Abgeleitet$aus$den$statistischen$Analysen$wurde$die$Hand1EExpression$mittels$realEtime$

PCR$in$den$Schweinevorhöfen$untersucht.$$Die$Ergebnisse$sind$in$Abb.$4E7$dargestellt.$

$Abb.$ 4E7:$ Darstellung$ der$ relativen$ Hand1EExpression$ im$ Vorhof$ des$ Schweins$ in$ den$experimentellen$Gruppen:$Kontrolle$(K),$rapidEpacing$(RP),$rapidEpacing$+$Irbesartan$(0.3$mgkgE1hE1)$(RP+Irb).$Median$mit$IQR:$K$(0,53$[0,42;$1,17]);$RP$(0,40$[0,34;$1,00]);$RP+Irb$(0,64$[0,61;$0,70]).$

Statistisch$ ließ$ sich$ kein$ signifikanter$ Unterschied$ (KruskalEWallisETest)$ zeigen,$ weil$

zum$einen$sowohl$die$KontrollE,$als$auch$die$rapidEpacingEGruppe$deutlich$inhomogene$

Messwerte$aufwiesen,$zum$anderen$die$Endzahl$sehr$gering$war.$Dennoch$lässt$sich$ein$

Unterschied$ zwischen$ dem$ alleinigen$ rapidEpacing$ und$ rapidEpacing$ mit$ Irbesartan$

erahnen.$

$

+ +

K RP RP+Irb0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

experimentelle Gruppe

rela

tive

Han

d1-E

xpre

ssio

n(H

and1

/P0)

4.$Ergebnisse$$

$ 51$

4.3.+in+vitro+

Um$ dem$ Verdacht$ des$ Einflusses$ von$ Irbesartan$während$ rapidEpacing$ nachgehen$ zu$

können,$ musste$ ein$ experimentelles$ Modell$ gefunden$ werden,$ in$ dem$ eine$ höhere$

Endzahl$ erreicht,$ gleichzeitig$ aber$ auch$ eine$ geringere$ Streuung$ der$ Ergebnisse$

gewährleistet$ werden$ konnte.$ Zu$ diesem$ Zweck$ diente$ die$ atriale$ murine$

Kardiomyozytenlinie$HLE1$(siehe$3.2.4.).$

$

4.3.1.$Hand18Expression$in$HL818Kardiomyozyten$

4.3.1.1.$zeitabhängige$Hand1-Expression$während$rapid-pacing$

Als$ erstes$wurde$ die$ zeitabhängige$ Beeinflussung$ der$Hand1EExpression$ durch$ rapidE

pacing$ in$ vitro$ untersucht.$ Dafür$ wurden$ drei$ Stimulationszeiten$ festgelegt:$

orientierend$an$den$in$vivo$Schweineexperimenten$wurden$7h$gewählt,$um$jedoch$eine$

Beeinflussung$ nach$ kürzerer$ und$ deutlich$ längerer$ Zeit$ ebenfalls$ erfassen$ zu$ können,$

wurden$ diese$ Experimente$ auch$ mit$ einer$ Stimulationszeit$ von$ 3,5h$ und$ 24h$

durchgeführt.$Die$Ergebnisse$wurden$als$Hand1EExpressionsänderung$in$Bezug$auf$die$

Kontrolle$in$Abb.$4E8$dargestellt.$

$Abb.$4E8:$Darstellung$der$relativen$Hand1EExpressionsänderung$durch$rapidEpacing$nach$3,5h,$7h$und$24h.$Median$mit$IQR:$3,5h$(E0,21$[E0,21;$E0,16]);$7h$(0,38$[E0,18;$1,26]);$24h$(E0,09$[E0,43;$0,32]).$

In$der$Auswertung$zeigte$sich$wiederum$eine$deutliche$Varianz$der$Ergebnisse.$Obgleich$

mit$ zunehmender$ Stimulationsdauer$ ein$Teil$ der$Proben$mit$deutlicher$ Induktion$der$

Hand1EExpression$ reagierte,$ sind$ andere$ Proben$ praktisch$ „nonEresponder“.$ Die$

3,5h 7h 24h-1

0

1

2

3

Stimualtionsdauer

rela

tive

Han

d1-

Expr

essi

onsä

nder

ung

4.$Ergebnisse$$

$ 52$

Ursache$für$die$große$Varianz$bleibt$unklar,$folglich$ist$jedoch$zu$keinem$Zeitpunkt$die$

Hand1EExpression$zur$Kontrolle$signifikant$unterschiedlich.$$

4.3.1.2.$Hand1-Expression$unter$rapid-pacing$und$Irbesartan$

Da$ sich$ kein$ zeitabhängiger$ Effekt$ des$ rapidEpacing$ auf$ die$ Hand1EExpression$ zeigen$

ließ,$ wurde$ im$ Folgenden$ überprüft,$ ob$ unterschiedliche$ Stimulationsbedingungen$

einen$ Einfluss$ auf$ diese$ haben,$ namentlich$ die$ Anwesenheit$ von$ Irbesartan.$ Vier$

experimentelle$Bedingungen$wurden$miteinander$verglichen:$

1. Kontrolle$(K):$kein$Irbesartan,$kein$rapidEpacing$

2. Kontrolle$+$Irbesartan$(K+Irb):$1$µM$Irbesartan,$kein$rapidEpacing$

3. rapidEpacing$(RP):$kein$Irbesartan,$rapidEpacing$(20$Hz)$

4. rapidEpacing$+$Irbesartan$(RP+Irb):$1$µM$Irbesartan,$rapidEpacing$(20$Hz).$

Die$Ergebnisse$der$Hand1EExpressionsänderung$in$Bezug$auf$die$Kontrolle$sind$in$Abb.$

4E9$dargestellt.$

$Abb.$4E9:$Darstellung$des$Einflusses$von$Irbesartan$(K+Irb),$rapidEpacing$(RP)$und$rapidEpacing$mit$1$µM$Irbesartan$(RP+Irb)$auf$die$relative$Expression$von$Hand1$als$relatives$Vielfaches$der$Kontrolle.$Median$mit$IQR:$K+Irb$(0,91$[0,78;$1,69]);$RP$(0,88$[0,74;$1,10]);$RP+Irb$(1,59$[0,77;$2,46]).$

Auch$hier$zeigte$sich$keine$signifikante$Beeinflussung$der$Hand1EExpression$durch$die$

unterschiedlichen$Stimulationsbedingungen$(Wilcoxon$SignedERankETest),$dennoch$fällt$

auf,$dass$die$Hand1EExpression$unter$der$Bedingung$ rapidEpacing$mit$1µM$ Irbesartan$

(RP+Irb)$eine$veränderte$Verteilung$zu$zeigen$scheint,$die$genauer$untersucht$werden$

sollte.$

K+Irb RP RP+Irb0

2

4

6

Stimulationsbedingungen

rela

tive

Han

d1-E

xpre

ssio

n

4.$Ergebnisse$$

$ 53$

4.3.1.2.1.$pacing-abhängige$Hand1-Expression$unter$Irbesartaneinfluss$

Um$ den$ Effekt$ des$ rapidEpacing$ in$ Anwesenheit$ von$ Irbesartan$ zu$ ermitteln,$ musste$

vorher$der$alleinige$Effekt$des$Irbesartans$sowohl$in$der$Kontrollgruppe,$als$auch$in$der$

rapidEpacingEGruppe$ ermittelt$ werden.$ Diese$ mathematische$ Auswertung$ war$ nur$

möglich,$da$es$sich$bei$den$unterschiedlichen$experimentellen$Gruppen$um$verbundene$

Proben$handelte,$ sie$ stammten$aus$der$ gleichen$Kulturflasche$und$wurden$ zur$ selben$

Zeit$für$das$Experiment$ausgesät$und$stimuliert.$

Die$ entsprechenden$ Effekte$ des$ Irbesartans$ errechneten$ sich$ nach$ den$ folgenden$

Gleichungen:$

IE$=$([K+Irb]$–$K)/K$

IE[RP]$=$([RP+Irb]$–$RP)/RP.$

{K$[Kontrolle];$K+Irb$[Kontrolle$+$1$µM$Irbesartan];$RP$[rapidEpacing];$RP+Irb$[rapidEpacing$+$1$µM$Irbesartan];$IE$[Irbesartaneffekt];$IE[RP]$[Irbesartaneffekt$bei$rapidEpacing]}$

Die$Ergebnisse$finden$sich$in$Abb.$4E10$in$graphischer$Darstellung.$

$Abb.$4E10:$Darstellung$des$Effekts$von$Irbesartan$(IE)$und$Irbesartan$bei$rapidEpacing$(IE[RP])$auf$die$relative$Expressionsänderung$von$Hand1.$Median$mit$IQR:$IE$(E0,09$[E0,22;$0,69]);$IE[RP]$(0,81$[0,42;$1,24]).$

Es$ zeigt$ sich,$ dass$ das$ Irbesartan$ ohne$ rapidEpacing$ keinen$ Einfluss$ auf$ die$ Hand1E

Expression$ ausübt,$ gleichwohl$ scheint$ es$ einen$ signifikanten$Effekt$ (0,81$ [0,42;$ 1,24];$

Wilcoxon$ SignedERankETest:$ p=0,043)$ zu$ geben,$ wenn$ die$ HLE1EZellen$ gleichzeitig$

IE IE[RP]-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

beeinflussende Faktoren

rela

tive

Han

d1-

Expr

essi

onsä

nder

ung

4.$Ergebnisse$$

$ 54$

mittels$ rapidEpacing$ behandelt$ werden.$ Unter$ diesen$ Bedingungen$ zeigte$ sich$ eine$

Steigerung$der$Hand1EExpression$um$81%.$

Die$ reine$ pacingEabhängige$ Beeinflussung$ der$ Hand1EExpression$ unter$

Irbesartaneinfluss$ergibt$sich$aus$der$Differenz$der$oben$ermittelten$IrbesartanEEffekte$

nach$folgender$Gleichung:$

PEIRB$=$IE[RP]$–$IE.$

{IE$ [Irbesartaneffekt];$ IE[RP]$ [Irbesartaneffekt$ bei$ rapidEpacing];$ PEIRB$ [pacingEEffekt$ unter$Irbesartaneinfluss]}$

Die$Ergebnisse$sind$in$Abb.$4E11$dargestellt.$

$Abb.$ 4E11:$ Darstellung$ des$ reinen$ pacingEabhängigen$ Effektes$ auf$ die$ Hand1EExpressionsänderung$unter$Irbesartaneinfluss$(PEIRB).$Median$mit$IQR:$PEIRB$(0,78$[0,54;$0,78]).$

Hier$zeigt$sich$ebenfalls,$dass$es$einen$signifikanten$Effekt$(0,78$[0,54;$0,78];$Wilcoxon$

SignedERankETest:$ p=0,043)$ des$ rapidEpacing$ in$ Anwesenheit$ von$ Irbesartan$ auf$ die$

Hand1EExpression$ gibt.$ Betrachtet$ man$ diese$ Ergebnisse,$ ergibt$ sich$ daraus$ die$

Schlussfolgerung,$ dass$ beide$ Faktoren$ zusammentreffen$ müssen,$ um$ die$ Hand1E

Expression$im$Vergleich$zur$Kontrolle$um$78%$zu$steigern.$

4.3.1.2.2.$Irbesartan-abhängige$Hand1-Expression$während$rapid-pacing$

Nachfolgend$sollte$nun$der$reine$IrbesartanEEffekt$während$des$rapidEpacings$ermittelt$

werden.$ Hierzu$ wurde$ in$ Analogie$ zu$ Abschnitt$ 4.3.1.2.1.$ der$ pacingEEffekt$ unter$

Bedingungen$ohne$Irbesartan$und$mit$Irbesartan$nach$folgenden$Gleichungen$ermittelt:$$

PEIRB0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

beeinflussender Faktor

rela

tive

Han

d1-

Expr

essi

onsä

nder

ung

4.$Ergebnisse$$

$ 55$

PE$=$(RP$–$K)/K$

PE[Irb]$=$([RP+Irb]$–$[K+Irb])/[K+Irb].$

{K$[Kontrolle];$K+Irb$[Kontrolle$+$1$µM$Irbesartan];$RP$[rapidEpacing];$RP+Irb$[rapidEpacing$+$1$µM$Irbesartan];$PE$[pacingEEffekt];$PE[Irb]$[pacingEEffekt$bei$Irbesartan]}$

Die$Ergebnisse$sind$in$Abb.$4E12$dargestellt.$

$Abb.$4E12:$Darstellung$des$Effekts$von$rapidEpacing$(PE)$und$rapidEpacing$bei$1µM$Irbesartan$(PE[Irb])$auf$die$relative$Expressionsänderung$von$Hand1.$Median$mit$IQR:$PE$(E0,12$[E0,26;$0,10]);$PE[Irb]$(0,45$[0,09;$1,03]).$

Ähnlich$ der$ im$ vorigen$ Abschnitt$ beschriebenen$ Situation$ lässt$ sich$ durch$ alleiniges$

rapidEpacing$ kein$ Effekt$ auf$ die$Hand1EExpression$ zeigen.$ Betrachtet$man$ jedoch$ den$

Einfluss$ des$ rapidEpacing$ unter$ Anwesenheit$ von$ Irbesartan,$ zeigt$ sich$ ein$ deutlicher$

Effekt$ auf$ die$ Hand1EExpression$ von$ zusätzlichen$ 45%,$ der$ jedoch$ statistisch$ nicht$

signifikant$ist$(0,45$[0,09;$1,03];$Wilcoxon$SignedERankETest:$p=0,138).$

Der$isolierte$Effekt$des$Irbesartans$während$rapidEpacing$errechnet$sich$nach$folgender$

Gleichung:$

IERP$=$PE[Irb]$–$PE.$

{PE$[pacingEEffekt];$PE[Irb]$[pacingEEffekt$bei$Irbesartan];$PEIRB$[Irbesartaneffekt$unter$pacingEEinfluss]}$

Die$Ergebnisse$sind$in$Abb.$4E13$zur$Darstellung$gebracht.$

PE PE[Irb]-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0


rela

tive

Han

d1-

Expr

essi

onsä

nder

ung

4.$Ergebnisse$$

$ 56$

$Abb.$ 4E13:$ Darstellung$ des$ reinen$ IrbesartanEabhängigen$ Effektes$ auf$ die$ Hand1EExpressionsänderung$unter$rapidEpacing$(IERP).$Median$mit$IQR:$(0,60$[0,35;$1,15]).$

Auch$ hier$ ist$ ein$ signifikanter$ Effekt$ durch$ Irbesartan$ während$ rapidEpacing$ auf$ die$

Hand1EExpression$ von$ 60%$ (0,60$ [0,35;$ 1,15];$ Wilcoxon$ SignedERankETest:$ p=0,043)$

nachweisbar.$

Hieraus$ ergibt$ sich$wiederum$ folgende$ Schlussfolgerung:$ Irbesartan$ und$ rapidEpacing$

müssen$ als$ beeinflussende$ Faktoren$ zusammenwirken,$ um$ einen$

expressionssteigernden$Einfluss$auf$Hand1$auszuüben.$

4.3.1.2.3.$Hand1-Expression$in$Abhängigkeit$von$der$elektrophysiologischen$Alteration$

Da$ nicht$ bekannt$ war,$ ob$ es$ einen$ Zusammenhang$ zwischen$ elektrophysiologischer$

Alteration$der$HL1EZellen$durch$rapidEpacing$und$der$Hand1EExpressionsänderung$gab,$

wurde$ dies$ in$ einem$ nächsten$ Schritt$ untersucht.$ Hierfür$ wurde$ die$ Änderung$ der$

Hand1EExpression$ der$ gleichzeitigen$ Änderung$ der$ CACNA1CEExpression$ nach$ 24h$

rapidEpacing$zugeordnet$und$graphisch$dargestellt.$Ebenso$wurde$für$den$Effekt$auf$die$

Änderung$beider$Genexpressionen$in$Anwesenheit$von$Irbesartan$verfahren$(siehe$Abb.$

4E14).$

IERP0.0

0.5

1.0

1.5

2.0


rela

tive

Han

d1-

Expr

essi

onsä

nder

ung

4.$Ergebnisse$$

$ 57$

$Abb.$ 4E14:$ Darstellung$ des$ Zusammenhangs$ zwischen$ elektrophysiologischer$ Alteration$(CACNA1CEExpressionsänderung)$und$Hand1EExpressionsänderung$ohne$Irbesartan$(schwarze$Regressionsgerade)$und$in$Anwesenheit$von$1$µM$Irbesartan$(graue$Regressionsgerade).$

Es$ bestätigt$ sich,$was$ schon$ aus$ den$ vorherigen$ Experimenten$ ersichtlich$war:$ rapidE

pacing$ hat$ ohne$ die$ Anwesenheit$ von$ Irbesartan$ keinen$ Einfluss$ auf$ die$ Hand1E

Expression.$ Folglich$ lässt$ sich$ auch$ kein$ Zusammenhang$ zwischen$ Hand1E

Expressionsänderung$ und$ CACNA1CEExpressionsänderung$ nachweisen$ (schwarze$

Regressionsgerade).$ Anders$ verhält$ es$ sich$ in$ Anwesenheit$ von$ Irbesartan,$ hier$ zeigt$

sich$ein$ tendenziell$ inverser$Zusammenhang$ zwischen$beiden$Expressionsänderungen$

(graue$ Korrelationsgrade;$ R2=0,6751;$ p=0,088):$ je$ stärker$ die$ CACNA1CEExpression$

supprimiert$wird,$desto$intensiver$wird$die$Hand1EExpression$erhöht.$

$

4.3.2.$Untersuchung$potentieller$Hand18Targetgene$

Da$ ein$ Nachweis$ von$ Hand1$ auf$ Proteinebene$ mangels$ funktionierender$ Antikörper$

(getestet$wurden:$HAND1$antibody,$rabbit,$polyclonal,$GeneTex,$GTX$11846;$eHAND$(CE

19)$ antibody,$ goat,$ polyclonal,$ Santa$ Cruz,$ scE9413)$ nicht$ möglich$ war,$ musste$ der$

Beweis$ eines$ regulativen$ Hand1EEinflusses$ bei$ unterschiedlichen$

Stimulationsbedingungen$ indirekt$ über$ den$ Nachweis$ der$ Expressionsänderungen$

potenzieller$ Hand1EZielgene$ erbracht$ werden.$ Da$ fast$ alle$ durch$ in$ vivo$ rapidEpacing$

supprimierten$Gene$ eine$Bindungsstelle$ für$Hand1/E47$ besitzen,$wurden$ zwei$ dieser$

Gen$ ausgewählt,$ um$ die$ für$ die$ Hand1EExpression$ in$ vitro$ beobachteten$ Effekte$

unterschiedlicher$Stimulationsbedingungen$vergleichend$zu$untersuchen.$

-0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4-1

0

1

2

3

-Irbesartan+Irbesartan

slope=-4,171 ± 1,671R2=0.6751p=0.0880

slope=-0,7971 ± 1,083R2=0.04696p=0.4770

relative CACNA1C-Expressionsänderungdurch rapid-pacing

rela

tive

Han

d1-E

xpre

ssio

nsän

deru

ngdu

rch

rapi

d-pa

cing

4.$Ergebnisse$$

$ 58$

4.3.2.1.$E2F8-Expression$in$HL-1-Kardiomyozyten$

4.3.2.1.1.$zeitabhängige$Expression$während$rapid-pacing$

Da$die$deutlichsten$und$ stabilsten$Effekte$ in$der$Hand1ERegulation$nach$24Estündiger$

Stimulation$ zu$ sehen$ waren,$ wurde$ für$ die$ Untersuchung$ dessen$ potentieller$

Targetgene$ ebenfalls$ eine$ Stimulationsdauer$ von$ 24h$ gewählt.$ Die$ resultierende$

Änderung$der$E2F8EExpression$in$Bezug$zur$Kontrolle$ist$in$Abb.$4E15$dargestellt.$

$Abb.$4E15:$Darstellung$der$relativen$E2F8EExpressionsänderung$durch$rapidEpacing$nach$24h.$Median$mit$IQR:$24h$(E0,09$[E0,21;$0,03]).$

Es$zeigte$sich$eine$sehr$schwache$Reduktion$der$Expression,$die$jedoch$nicht$signifikant$

war$ (E0,09$ [E0,21;$ 0,03];$ Wilcoxon$ SignedERankETest:$ p=0,131).$ $ Hieraus$ muss$

geschlussfolgert$ werden,$ dass$ alleiniges$ rapidEpacing$ keinen$ Einfluss$ auf$ E2F8E

Expression$ausübt.$

4.3.2.1.2.$E2F8-Expression$unter$rapid-pacing$und$Irbesartan$

Anschließend$ wurden$ die$ bereits$ unter$ Abschnitt$ 4.3.1.2.$ erläuterten$

Stimulationsbedingungen$für$die$Untersuchung$der$E2F8EExpression$herangezogen.$Die$

Ergebnisse$sind$in$Bezug$auf$die$Kontrolle$in$Abb.$4E16$dargestellt.$

24h-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

Stimulationsdauer

rela

tive

E2F8

-Ex

pres

sion

sänd

erun

g

4.$Ergebnisse$$

$ 59$

$Abb.$ 4E16:$ Darstellung$ des$ Einflusses$ von$ Irbesartan$ (K+Irb),$ rapidEpacing$ (RP)$ und$ rapidEpacing$ mit$ 1$ µM$ Irbesartan$ (RP+Irb)$ auf$ die$ relative$ Expression$ von$ E2F8$ als$ relatives$Vielfaches$der$Kontrolle.$Median$mit$IQR:$K+Irb$(1,08$[1,05;$1,31]);$RP$(1,03$[0,82;$1,09]);$RP+Irb$(0,77$[0,76;$1,03]).$

Bei$ dieser$ Untersuchung$ zeigte$ sich$ zum$ einen$ eine$ geringe,$ dennoch$ signifikante$

Steigerung$ der$ E2F8EExpression$ um$ den$ Faktor$ 1,08$ (1,08$ [1,05;$ 1,31];$ Wilcoxon$

SignedERankETest:$ p=0,043)$ durch$ alleinige$ Zugabe$ von$ Irbesartan,$ gleichzeitig$ war$

auch$ eine$ tendenzielle$ Reduktion$ der$ E2F8EExpression$ unter$ rapidEpacing$ und$

Irbesartan$um$den$Faktor$0,77$(0,77$[0,76;$1,03];$Wilcoxon$SignedERankETest:$p=0,225)$

zu$erkennen.$Alleiniges$ rapidEpacing$scheint$dagegen$keinen$signifikanten$Einfluss$auf$

die$E2F8EExpression$zu$haben.$

4.3.2.1.2-1.$pacing-abhängige$E2F8-Expression$unter$Irbesartaneinfluss$

Um$den$Effekt$des$rapidEpacing$auf$die$E2F8EExpressionsänderung$in$Anwesenheit$von$

Irbesartan$zu$untersuchen,$wurden$zuerst$wieder$die$entsprechenden$Irbesartaneffekte$

nach$folgenden$Gleichungen$berechnet:$

IE$=$([K+Irb]$–$K)/K$



Die$Ergebnisse$sind$in$Abb.$4E17$abgebildet.$

K+Irb RP RP+Irb0.0

0.5

1.0

1.5


rela

tive

E2F8

-Exp

ress

ion

4.$Ergebnisse$$

$ 60$

$Abb.$4E17:$Darstellung$des$Effekts$von$Irbesartan$(IE)$und$Irbesartan$bei$rapidEpacing$(IE[RP])$auf$die$relative$Expressionsänderung$von$E2F8.$Median$mit$IQR:$IE$(0,08$[0,05;$0,31]);$IE[RP]$(E0,01$[E0,30;$0,01]).$

Hier$ zeigte$ sich$nochmals$ ein$ schwacher,$ aber$ signifikanter$Effekt$des$ Irbesartans$ auf$

die$ E2F8EExpression$ als$ Steigerung$ um$8%$ (0,08$ [0,05;$ 0,31];$WilcoxonESignedERankE

Test:$ p=0,43).$ Dagegen$ hat$ Irbesartan$ keinen$ Einfluss$ mehr$ auf$ die$ Expression$ von$

E2F8,$ wenn$ die$ Kulturen$ gleichzeitig$ einem$ rapidEpacing$ unterworfen$ werden.$ Die$

Expressionsänderungen$ unterscheiden$ sich$ signifikant$ zwischen$ den$ beeinflussenden$

Faktoren$ IE$ und$ IE[RP]$ (0,08$ [0,05;$ 0,31]$ vs.$ E0,01$ [E0,30;$ 0,01];$MannEWhitneyETest:$

p=0,016).$

Durch$ nachfolgende$ Gleichung$ wurde$ der$ singuläre$ Effekt$ des$ rapidEpacings$ in$ der$

Anwesenheit$von$Irbesartan$errechnet:$



Die$Ergebnisse$finden$sich$in$Abb.$4E18$abgebildet.$

IE IE[RP]-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4


rela

tive

E2F8

-Ex

pres

sion

sänd

erun

g

4.$Ergebnisse$$

$ 61$

$Abb.$ 4E18:$ Darstellung$ des$ reinen$ pacingEabhängigen$ Effektes$ auf$ die$ E2F8EExpressionsänderung$unter$Irbesartaneinfluss$(PEIRB).$Median$mit$IQR:$PEIRB$(E0,32$[E0,32;$E0,32]).$

Deutlich$ ist$ zu$ erkennen,$ dass$ rapidEpacing$ in$ Anwesenheit$ von$ Irbesartan$ eine$

signifikante$Verringerung$der$E2F8EExpression$um$32%$(E0,32$[E0,32;$E0,32];$WilcoxonE

SignedERankETest:$p=0,043)$zur$Folge$hat.$

4.3.2.1.2-2.$Irbesartan-abhängige$E2F8-Expression$während$rapid-pacing$

Für$ die$ Bestimmung$ des$ Irbesartaneffektes$ $ während$ rapidEpacing$ wurde$ analog$

verfahren.$$Die$Effekte$des$rapidEpacing$wurden$wie$folgt$berechnet:$

PE$=$(RP$–$K)/K$



Die$Ergebnisse$finden$sich$in$Abb.$4E19$dargestellt.$

PEIRB-0.4

-0.3

-0.2

-0.1

0.0


rela

tive

E2F8

-Ex

pres

sion

sänd

erun

g

4.$Ergebnisse$$

$ 62$

$Abb.$4E19:$Darstellung$des$Effekts$von$rapidEpacing$(PE)$und$rapidEpacing$bei$1µM$Irbesartan$(PE[Irb])$auf$die$relative$Expressionsänderung$von$E2F8.$Median$mit$IQR:$PE$(0,03$[E0,18;$0,09]);$PE[Irb]$(E0,25$[E0,44;$E0,09]).$

RapidEpacing$ zeigt$ keinerlei$ Effekt$ auf$ die$ Expression$ von$ E2F8.$ Die$ Expression$

reduziert$ sich$ jedoch$ signifikant$um$25%$(E0,25$ [E0,44;$ E0,09];$WilcoxonESignedERankE

Test:$p=0,043),$wenn$die$Zellkultur$gleichzeitig$mit$1µM$Irbesartan$behandelt$wird.$

Anschließend$ wurde$ der$ Effekt$ des$ Irbesartans$ bei$ gleichzeitiger$ Behandlung$ durch$

rapidEpacing$wie$folgt$errechnet:$



Die$Ergebnisse$sind$in$Abb.$4E20$abgebildet.$

PE PE[Irb]-0.6

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4


rela

tive

E2F8

-Ex

pres

sion

sänd

erun

g

4.$Ergebnisse$$

$ 63$

$Abb.$ 4E20:$ Darstellung$ des$ reinen$ IrbesartanEabhängigen$ Effektes$ auf$ die$ E2F8EExpressionsänderung$unter$rapidEpacing$(IERP).$Median$mit$IQR:$(E0,28$[E0,30;$E0,17]).$

Gut$ ersichtlich$ ist,$ dass$ durch$ Irbesartan$ bei$ gleichzeitiger$ Behandlung$ durch$ rapidE

pacing$die$Expression$von$E2F8$um$28%$(E0,28$ [E0,30;$ E0,17];$WilcoxonESignedERankE

Test:$ p=0,043)$ reduziert$ wird.$ Auch$ hier$ lässt$ sich$ schließlich$ folgern,$ dass$ das$

Zusammenspiel$ beider$ Faktoren,$ rapidEpacing$ und$ Irbesartan$ für$ die$

Expressionsreduktion$notwendig$sind.$

4.3.2.1.2-3.$E2F8-Expression$in$Abhängigkeit$von$der$elektrophysiologischen$Alteration$

Auch$ für$ E2F8$ wurde$ der$ Zusammenhang$ zwischen$ Expression$ und$

elektrophysiologischer$ Alteration$ untersucht.$ Abb.$ 4E21$ zeigt$ die$ E2F8E

Expressionsänderung,$ dargestellt$ gegen$ die$ entsprechende$ Expressionsänderung$ von$

CACNA1C.$

IERP-0.4

-0.3

-0.2

-0.1

0.0


rela

tive

E2F8

-Ex

pres

sion

sänd

erun

g

4.$Ergebnisse$$

$ 64$

$Abb.$ 4E21:$ Darstellung$ des$ Zusammenhangs$ zwischen$ elektrophysiologischer$ Alteration$(CACNA1CEExpressionsänderung)$ und$ E2F8EExpressionsänderung$ ohne$ Irbesartan$ (schwarze$Regressionsgerade)$und$in$Anwesenheit$von$1$µM$Irbesartan$(graue$Regressionsgerade).$

Es$ ist$deutlich$zu$erkennen,$dass$sowohl$mit$ Irbesartan$(schwarze$Regressionsgerade)$

als$ auch$ohne$ Irbesartan$ (graue$Regressionsgerade)$die$Expression$ von$E2F8$mit$ der$

von$ CACNA1C$ signifikant$ positiv$ korreliert$ (ohne$ Irbesartan$ (schwarz):$ R2=0,8507;$

p<0,0001;$mit$Irbesartan$(grau):$R2=0,8319;$p=0,0309).$In$Anwesenheit$von$Irbesartan$

scheint$ die$ Steigung$ der$ Geraden$ noch$ steiler$ zu$ werden,$ jedoch$ ist$ dieser$ Eindruck$

nicht$statistisch$signifikant$(0,7413±0,1035$vs.$1,096±0,2845;$p=0,1911)$

Daraus$ kann$ Folgendes$ abgeleitet$ werden:$ je$ stärker$ die$ HLE1EZellen$

elektrophysiologisch$ beeinträchtigt$ werden$ (Reduktion$ der$ CACNA1CEExpression),$

desto$stärker$wird$die$E2F8EExpression$heruntergefahren.$Dass$Irbesartan$diesen$Effekt$

verstärkt,$ließ$sich$in$diesen$Experimenten$nicht$nachweisen.$

4.3.2.2.$PPP2R5B-Expression$in$HL-1-Kardiomyozyten$

4.3.2.2.1.$zeitabhängige$Expression$während$rapid-pacing$

Wie$ für$ E2F8$ im$ vorherigen$ Abschnitt$ beschrieben,$ wurde$ auch$ für$ PPP2R5B$ die$

Expressionsbeeinflussung$ nach$ 24h$ rapidEpacing$ untersucht.$ Die$ Ergebnisse$ in$ Bezug$

zur$Kontrolle$sind$in$Abb.$4E22$dargestellt.$

-0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4-0.6

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4


slope=1,096 ± 0,2845R2=0.8319p=0.0309

slope=0,7413 ± 0,1035R2=0.8507p<0.0001


rela

tive

E2F8

-Exp

ress

ions

ände

rung

durc

h ra

pid-

paci

ng

4.$Ergebnisse$$

$ 65$

$Abb.$ 4E22:$ Darstellung$ der$ relativen$ PPP2R5BEExpressionsänderung$ durch$ rapidEpacing$ nach$24h.$Median$mit$IQR:$24h$(0,27$[0,17;$0,32]).$

Für$ dieses$ Zielgen$ zeigt$ sich,$ anders$ als$ für$ Hand1$ und$ E2F8,$ eine$ signifikante$

Expressionssteigerung$durch$rapidEpacing$um$27%$(0,27$[0,17;$0,32];$Wilcoxon$SignedE

RankETest:$p=0,004)$nach$24$Stunden.$

4.3.2.2.2.$PPP2R5B-Expression$unter$rapid-pacing$und$Irbesartan$

Im$Anschluss$wurden$die$schon$bekannten$Stimulationsbedingungen$mit$ihrem$Einfluss$

auf$die$Expression$von$PPP2R5B$untersucht$(siehe$Abb.$4E23).$

$

24h-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

Stimulationsdauer

rela

tive

PPP2

R5B

-Ex

pres

sion

sänd

erun

g

4.$Ergebnisse$$

$ 66$

$Abb.$ 4E23:$ Darstellung$ des$ Einflusses$ von$ Irbesartan$ (K+Irb),$ rapidEpacing$ (RP)$ und$ rapidEpacing$ mit$ 1$ µM$ Irbesartan$ (RP+Irb)$ auf$ die$ relative$ Expression$ von$ PPP2R5B$ als$ relatives$Vielfaches$der$Kontrolle.$Median$mit$IQR:$K+Irb$(1,02$[1,02;$1,18]);$RP$(1,29$[1,13;$1,33]);$RP+Irb$(1,01$[0,96;$1,33])$

Hier$ ließ$sich$erkennen,$dass$die$alleinige$Anwesenheit$von$Irbesartan$keinen$Einfluss$

auf$ die$ PPP2R5BEExpression$ zu$ haben$ scheint.$ RapidEpacing$ hingegen$ erhöhte$

tendenziell$ die$ PPP2R5BEExpression$ um$ den$ Faktor$ 1,29$ (1,29$ [1,13;$ 1,33];$Wilcoxon$

SignedERankETest:$p=0,08).$Jedoch$gibt$es$den$expressionserhöhenden$Effekt$unter$der$

Bedingung$ RP+Irb$ nicht,$ es$ zeigt$ sich$ in$ Bezug$ zur$ Kontrolle$ keine$ Änderung$ der$

Expression.$

4.3.2.2.2-1.$rapid-pacing-abhängige$PPP2R5B-Expression$unter$Irbesartaneinfluss$

Um$den$pacingEbedingten$Effekt$auf$die$Expression$von$PPP2R5B$ in$Anwesenheit$von$

Irbesartan$ genau$ zu$ erfassen,$ wurden$ vorerst$ erneut$ die$ einzelnen$ Irbesartaneffekte$

nach$folgenden$Gleichungen$errechnet:$

IE$=$([K+Irb]$–$K)/K$



Die$Ergebnisse$finden$sich$als$Darstellung$in$Abb.$4E24.$

$

K+Irb RP RP+Irb0.0

0.5

1.0

1.5

2.0


rela

tive

PPP2

R5B

-Exp

ress

ion

4.$Ergebnisse$$

$ 67$

$Abb.$4E24:$Darstellung$des$Effekts$von$Irbesartan$(IE)$und$Irbesartan$bei$rapidEpacing$(IE[RP])$auf$die$relative$Expressionsänderung$von$PPP2R5B.$Median$mit$IQR:$IE$(0,02$[0,02;$0,18]);$IE[RP]$(E0,02$[E0,22;$E0,01]).$

Zwar$hat$weder$das$Irbesartan$ohne$rapidEpacing$noch$mit$rapidEpacing$einen$Einfluss$

auf$ die$ Expressionsänderung,$ dennoch$ sind$ die$ Verteilungen$ der$ relativen$

Expressionsänderungen$von$PPP2R5B$ zwischen$den$beeinflussenden$Faktoren$ IE$und$

IE[RP]$ signifikant$ unterschiedlich$ (0,02$ [0,02;$ 0,18]$ vs.$ E0,02$ [E0,22;$ E0,01];$ MannE

WhitneyETest:$p=0,047)$

Ausgehend$ von$ diesen$ Effekten,$ wurde$ nach$ unten$ stehender$ Gleichung$ der$ alleinige$

Effekt$des$rapidEpacing$auf$die$Genexpression$kalkuliert:$



Abb.$4E25$gibt$die$Ergebnisse$graphisch$wieder.$

$

IE IE[RP]-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4


rela

tive

PPP2

R5B

-Ex

pres

sion

sänd

erun

g

4.$Ergebnisse$$

$ 68$

$Abb.$ 4E25:$ Darstellung$ des$ reinen$ pacingEabhängigen$ Effektes$ auf$ die$ PPP2R5BEExpressionsänderung$unter$Irbesartaneinfluss$(PEIRB).$Median$mit$IQR:$PEIRB$(E0,19$[E0,30;$E0,19]).$

Es$ zeigt$ sich,$ dass$ unter$ Anwesenheit$ von$ Irbesartan$ durch$ rapidEpacing$ eine$

signifikante$Senkung$der$PPP2R5BEExpression$um$19%$(E0,19$[E0,30;$ E0,19];$Wilcoxon$

SignedERankETest:$p=0,043)$herbeigeführt$wird.$Es$lässt$sich$daraus$Folgendes$ableiten:$

durch$die$Kombination$von$rapidEpacing$und$die$Anwesenheit$von$Irbesartan$kommt$es$

zu$einer$Reduktion$der$PPP2R5BEExpression.$

4.3.2.2.2-2.$Irbesartan-abhängige$PPP2R5B-Expression$während$rapid-pacing$

Fortführend$ sollte$ der$ Effekt$ des$ Irbesartans$ auf$ die$ PPP2R5BEExpression$ während$

rapidEpacing$erfasst$werden,$wozu$wiederum$die$entsprechenden$rapidEpacingEEffekte$

nach$ folgenden$ Gleichungen$ errechnet$ werden$ mussten,$ um$ in$ Abb.$ 4E26$ zur$

Darstellung$zu$kommen:$

PE$=$(RP$–$K)/K$



PEIRB-0.4

-0.3

-0.2

-0.1

0.0


rela

tive

PPP2

R5B

-Ex

pres

sion

sänd

erun

g

4.$Ergebnisse$$

$ 69$

$Abb.$4E26:$Darstellung$des$Effekts$von$rapidEpacing$(PE)$und$rapidEpacing$bei$1µM$Irbesartan$(PE[Irb])$auf$die$relative$Expressionsänderung$von$PPP2R5B.$Median$mit$IQR:$PE$(0,29$[0,13;$0,33]);$PE[Irb]$(0,04$[E0,18;$E0,13]).$

Der$bereits$oben$erfasste$signifikante$expressionssteigernde$Effekt$durch$rapidEpacing$

zeigt$ sich$hier$ tendenziell$ebenfalls$ein$Zuwachs$um$29%$(0,29$ [0,13;$0,33];$Wilcoxon$

SignedERankETest:$ p=0,08).$ RapidEpacing$ scheint$ diesen$ Effekt$ jedoch$ nicht$ mehr$

verursachen$zu$können,$wenn$sich$Irbesartan$in$der$Zellkultur$befindet.$

Um$den$Effekt$des$Irbesartans$während$des$rapidEpacing$darzustellen,$folgte$erneut$die$

Berechnung$nach$bekannter$Gleichung:$



Die$Ergebnisse$dieser$Berechnung$sind$in$Abb.$4E27$aufgetragen.$

PE PE[Irb]-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6


rela

tive

PPP2

R5B

-Ex

pres

sion

sänd

erun

g

4.$Ergebnisse$$

$ 70$

$Abb.$ 4E27:$ Darstellung$ des$ reinen$ IrbesartanEabhängigen$ Effektes$ auf$ die$ PPP2R5BEExpressionsänderung$unter$rapidEpacing$(IERP).$Median$mit$IQR:$(E0,25$[E0,33;$E0,16]).$

Es$zeigt$sich,$dass$Irbesartan$eine$signifikante$Expressionsminderung$um$25%$(E0,25$[E

0,33;$ E0,16];$ Wilcoxon$ SignedERankETest:$ p=0,043)$ während$ des$ rapidEpacings$

verursacht.$

4.3.2.2.2-3.$ PPP2R5B-Expression$ in$ Abhängigkeit$ von$ der$ elektrophysiologischen$

Alteration$

Auch$ für$ PPP2R5B$ sollte$ der$ Zusammenhang$ mit$ markanten$ elektrophysiologischen$

Alterationen$erfasst$werden.$ $Die$Expressionsänderungen$von$PPP2R5B$ finden$sich$ in$

Relation$ zu$ den$ entsprechenden$ CACNA1CEExpressionsänderungen$ in$ Abb.$ 4E28$

dargestellt.$

IERP-0.5

-0.4

-0.3

-0.2

-0.1

0.0


rela

tive

PPP2

R5B

-Ex

pres

sion

sänd

erun

g

4.$Ergebnisse$$

$ 71$

$Abb.$ 4E28:$ Darstellung$ des$ Zusammenhangs$ zwischen$ elektrophysiologischer$ Alteration$(CACNA1CEExpressionsänderung)$ und$ PPP2R5BEExpressionsänderung$ ohne$ Irbesartan$(schwarze$ Regressionsgerade)$ und$ in$ Anwesenheit$ von$ 1$ µM$ Irbesartan$ (graue$Regressionsgerade).$

Die$ Darstellung$ zeigt$ den$ signifikant$ schwachen,$ positiven$ Zusammenhang$ zwischen$

CACNA1CE$ und$ PPP2R5BEExpressionänderung$ (schwarze$ Regressionsgerade;$

R2=0,4531;$ p=0,0232).$ Dieser$ Zusammenhang$ scheint$ in$ Anwesenheit$ von$ Irbesartan$

ebenso$zu$bestehen$und$sogar$stärker$zu$werden$(graue$Regressionsgerade;$R2=0,7053;$

p=0,0751),$wenngleich$nicht$signifikant.$Die$Steigung$der$Geraden$in$Anwesenheit$von$

Irbesartan$ scheint$ deutlich$ steiler,$ jedoch$ unterscheiden$ sich$ diese$ statistisch$ nicht$

signifikant$(0,4727±0,1731$vs.$1,112±0,4152;$p=0,1429).$

Folgendes$ muss$ geschlussfolgert$ werden:$ rapidEpacing$ bedingt$ eine$ Steigerung$ der$

Expression$ von$PPP2R5B,$ je$ stärker$ jedoch$das$ elektrische$Remodeling$ ausfällt,$ desto$

geringer$ ist$ diese$ Expressionssteigerung.$ Eine$ Verstärkung$ dieses$ Zusammenhangs$

konnte$statistisch$nicht$bewiesen$werden.$

$

4.3.3.$Expressionszusammenhang$zwischen$Hand1$und$E2F8$

4.3.3.1.$E2F8-Regulation$in$Abhängigkeit$der$Hand1-Expressionsänderung$

Aufgrund$ der$ Tatsache,$ dass$ es$ sich$ bei$ Hand1$ und$ E2F8$ um$ Transkriptionsfaktoren$

handelt,$deren$Expressionsänderungen$ in$Zusammenhang$stehen$könnten,$ sollte$diese$

Möglichkeit$ebenfalls$untersucht$werden.$Dafür$wurden$die$Expressionsänderungen$von$

Hand1$ durch$ rapidEpacing$ in$ positive$ und$ negative$ Änderung$ gruppiert$ und$ die$

-0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6


slope=0,4727 ± 0,1731R2=0,4531p=0,0232

slope=1,112 ± 0,4152R2=0,7053p=0,0751


rela

tive

PPP2

R5B

-Exp

ress

ions

ände

rung

durc

h ra

pid-

paci

ng

4.$Ergebnisse$$

$ 72$

zugehörigen$ relativen$ Expressionsänderungen$ von$ E2F8$ wurden$ entsprechend$

aufgetragen$(siehe$Abb.$4E29).$

$Abb.$4E29:$Darstellung$der$ relativen$E2F8EExpressionsänderung$durch$ rapidEpacing,$ gruppiert$nach$positiver$und$negativer$Hand1EExpressionsänderung.$Median$mit$IQR:$positiv$(E0,25$[E0,32;$E0,18]);$negativ$(0,03$[E0,05;$0,09]).$

Hier$ist$eine$eindeutig$unterschiedliche$Expressionsänderung$zu$erkennen:$fand$sich$die$

Hand1EExpression$ gesteigert,$ so$ wurde$ die$ Expression$ von$ E2F8$ in$ allen$ Fällen$

reduziert,$ signifikant$ um$ 25%$ (E0,25$ [E0,32;$ E0,18];$ Wilcoxon$ SignedERankETest:$

p=0,003).$ Bei$ einer$ Reduktion$ der$ Hand1EExpression$ zeigte$ sich$ jedoch$ keine$

signifikante$ Änderung$ der$ E2F8EExpression.$ Die$ gruppierten$ relativen$

Expressionsänderungen$von$E2F8$unterscheiden$sich$signifikant$voneinander$ (E0,25$[E

0,32;$E0,18]$vs.$0,03$[E0,05;$0,09];$MannEWhitneyETest:$p=0,003).$

4.3.3.2.$Hand1-Regulation$in$Abhängigkeit$der$E2F8-Expressionsänderung$

Anschließend$ wurde$ die$ E2F8EExpressionsänderung$ entsprechend$ ihrer$ Änderung$

durch$ rapidEpacing$ in$ eine$ positive$ und$ eine$ negative$ Gruppe$ zugeordnet$ und$ die$

zugehörigen$relativen$Hand1EExpressionsänderungen$nach$der$entsprechenden$Gruppe$

aufgetragen$(Abb.$4E30).$

positiv negativ-0.6

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

Hand1-Expressionsänderungdurch rapid-pacing

rela

tive

E2F8

-Exp

ress

ions

ände

rung

durc

h ra

pid-

paci

ng

4.$Ergebnisse$$

$ 73$

+Abb.$4E30:$Darstellung$der$relativen$Hand1EExpressionsänderung$durch$rapidEpacing,$gruppiert$nach$positiver$und$negativer$E2F8EExpressionsänderung.$Median$mit$IQR:$positiv$(E0,35$[E0,47;$E0,19]);$negativ$(0,21$[0,10;$1,13]).$

Aus$ der$ Abbildung$ kann$ ersehen$ werden,$ dass$ sich$ bei$ einer$ positiven$ E2F8E

Expressionsänderung$ immer$eine$negative$Änderung$der$Hand1EExpression$ergibt,$ im$

Median$um$E35%$(E0,35$[E0,47;$E0,19];$Wilcoxon$SignedERankETest:$p=0,068).$Ebenso$ist$

in$ fast$ allen$ Fällen$ einer$ negativen$ Expressionsänderung$ von$ E2F8$ eine$ positive$

Änderung$der$Hand1EExpression$festzustellen$und$damit$eine$signifikante$Erhöhung$der$

Hand1$ Expression$ um$ 21%$ (0,21$ [0,21;$ 1,13];$ Wilcoxon$ SignedERankETest:$ p=0,013)$

statistisch$ signifikant$ nachweisbar.$ Auch$ hier$ unterscheiden$ sich$ die$ gruppierten$

relativen$ E2F8EExpressionsänderung$ signifikant$ voneinander$ (E0,35$ [E0,47;$ E0,19]$ vs.$

0,21$[0,10;$1,13];$MannEWhitneyETest:$p=0,013).$

+

4.3.4.$Expressionszusammenhang$zwischen$Hand1$und$PPP2R5B$

4.3.4.1.$PPP2R5B-Regulation$in$Abhängigkeit$der$Hand1-Expressionsänderung$

Wie$ bereits$ für$ E2F8$ beschrieben,$ sollte$ auch$ für$ PPP2R5B$ überprüft$ werden,$ ob$ es$

einen$Zusammenhang$mit$der$Expressionsänderung$von$Hand1$gab.$Hierfür$wurden$die$

relativen$PPP2R5BEExpressionsänderungen$den$Gruppen$positive$und$negative$Hand1E

Expressionsänderung$$zugeordnet$(Abb.$4E31).$

positiv negativ-1

0

1

2

3

E2F8-Expressionsänderungdurch rapid-pacing

rela

tive

Han

d1-E

xpre

ssio

nsän

deru

ngdu

rch

rapi

d-pa

cing

4.$Ergebnisse$$

$ 74$

$Abb.$ 4E31:$ Darstellung$ der$ relativen$ PPP2R5BEExpressionsänderung$ durch$ rapidEpacing,$gruppiert$nach$positiver$und$negativer$Hand1EExpressionsänderung.$Median$mit$IQR:$positiv$(0,22$[0,13;$0,27]);$negativ$(0,30$[0,29;$0,33]).$

Aus$ der$ Abbildung$ geht$ hervor,$ dass$ sich$ in$ beiden$ Gruppen$ der$ Hand1E

Expressionsänderung$ im$ Median$ eine$ positive$ PPP2R5BEExpressionsänderung$ ergibt,$

diese$ ist$ jedoch$nur$ in$der$negativen$Regulationsgruppe$ signifikant$ (0,30$ [0,29;$0,33];$

Wilcoxon$ SignedERankETest:$ p=0,043).$ Es$ findet$ sich$ ein$ signifikanter$ Unterschied$

zwischen$beiden$Gruppen$ (0,22$ [0,13;$0,27]$vs.$0,30$ [0,29;$0,33];$MannEWhitneyETest:$

p=0,02).$

4.3.4.2.$Hand1-Regulation$in$Abhängigkeit$der$PPP2R5B-Expressionsänderung$

Anschließend$wurde$ die$ PPP2R5BEExpression$ nach$ positiver$ und$ negativer$Änderung$

gruppiert$ und$ die$ entsprechenden$ Hand1EExpressionsänderungen$ durch$ rapidEpacing$

in$ ihren$ Werten$ erfasst.$ Im$ Anschluss$ daran$ erfolgte$ die$ graphische$ Darstellung$ der$

Ergebnisse$(Abb.$4E32).$

positiv negativ-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

Hand1-Expressionsveränderungdurch rapid-pacing

rela

tive

PPP2

R5B

-Exp

ress

ions

ände

rung

durc

h ra

pid-

paci

ng

4.$Ergebnisse$$

$ 75$

$Abb.$4E32:$Darstellung$der$relativen$Hand1EExpressionsänderung$durch$rapidEpacing,$gruppiert$nach$positiver$und$negativer$PPP2R5BEExpressionsänderung.$Median$mit$IQR:$positiv$(0,09$[E0,26;$1,03]);$negativ$(0,28$[E0,20;$1,17]).$

Hier$ zeigte$ sich$ kein$ signifikanter$ Unterschied$ zwischen$ den$ Gruppen$ der$ PPP2R5BE

Expressionsänderung,$ auch$ gab$ es$ keinen$ Unterschied$ zwischen$ den$ beiden$

Regulationsgruppen.$

$

4.3.5.$Hand18Überexpression$

In$ einem$nächsten$ Schritt$ sollte$überprüft$werden,$ ob$der$Einfluss$ von$Hand1$auf$die$

Expression$von$E2F8$und$PPP2R5B$durch$eine$Überexpression$von$Hand1$zu$erzeugen$

war.$ Dafür$ wurde$ den$ HL1EZellen$ das$ Plasmid$ mit$ der$ mRNAESequenz$ von$ Hand1$

transfiziert$ (siehe$ Abschnitt$ 3.2.4.6.).$ Der$ Erfolg$ der$ Transfektion$ wurde$ mittels$

quantitativer$ realEtime$ PCR$ (qRTEPCR)$ zur$ Bestimmung$ der$ Transkriptionssteigerung$

von$Hand1$kontrolliert$(Abb.$4E33).$

positiv negativ-1

0

1

2

3

PPP2R5B-Expressionsveränderungdurch rapid-pacing

rela

tive

Han

d1-E

xpre

ssio

nsän

deru

ngdu

rch

rapi

d-pa

cing

4.$Ergebnisse$$

$ 76$

$Abb.$4E33:$Darstellung$der$gesteigerten$Hand1EExpression$bei$Überexpression$von$Hand1.$Median$mit$IQR:$(1894,68$[1741,55;$2894,93])$

Im$ Ergebnis$ der$ Hand1ETransfktion$ in$ HLE1EZellen$ ließ$ sich$ eine$ signifikante$

Transkriptionssteigerung$ um$ den$ medianen$ Faktor$ 1894,68$ (1894,68$ [1741,55;$

2894,93];$ Wilcoxon$ SignedERankETest:$ p=0,005)$ nachweisen.$ Damit$ kann$ die$

Überexpression$als$erfolgreich$angesehen$werden.$

Im$Folgenden$sollte$nun$überprüft$werden,$ob$sich$ein$Effekt$der$Hand1EÜberexpression$

auf$ die$ Expression$ von$ E2F8$ und$ PPP2R5B$ zeigt,$ da$ zusätzlich$ nicht$ ausgeschlossen$

werden$konnte,$dass$Hand1$eventuell$die$Expression$von$CACNA1C$beeinflusst,$wurde$

dessen$ Expression$ ebenso$ bestimmt.$ Zusätzlich$ zu$ diesen$ drei$ Genen$wurde$ noch$ die$

Expression$von$βEcatenin$quantifiziert,$da$es$in$der$Literatur$Hinweise$darauf$gibt,$dass$

es$ sich$ hierbei$ um$ ein$ direktes$ Hand1EZielgen$ handelt.$ Die$ Ergebnisse$ dieser$

Untersuchung$finden$sich$in$Abb.$4E34$zur$Darstellung$gebracht.$

$

Hand10

2000

4000

6000

8000

untersuchtes Gen

rela

tive

Expr

essi

on

4.$Ergebnisse$$

$ 77$

$Abb.$4E34:$Darstellung$der$ relativen$Expressionsänderung$der$entsprechenden$Zielgene$durch$Hand1EÜberexpression$im$Verhältnis$zur$Kontrolle$(leerer$Vektor).$Median$mit$IQR:$βEcatenin$(0,04$[E0,04;$0,08]);$CACNA1C$(0,08$[E0,06;$0,22]);$E2F8$(0,04$[0,00;$0,13]);$PPP2R5B$(0,07$[0,04;$0,13]).$

Durch$ die$ Überexpression$ von$ Hand1$ zeigten$ sich$ die$ untersuchten$ Gene$ nur$ sehr$

gering$ verändert,$ einzig$ die$ Expression$ von$ PPP2R5B$ fand$ sich$ signifikant$ um$ 7%$

erhöht$ (0,07$ [0,04;$ 0,13];$Wilcoxon$ SignedERankETest:$ p=0,04).$ Die$ Expression$ von$ βE

catenin$ fand$ sich$ in$ diesen$ Experimenten$ nicht$ signifikant$ erhöht$ (0,04$ [E0,04;$ 0,08];$

Wilcoxon$SignedERankETest:$p=0,306).$

Da$für$βEcatenin$jedoch$eine$Erhöhung$der$Expression$durch$Überexpression$von$Hand1$

erwartet$wurde,$wurden$ im$Nachfolgenden$nur$die$Experimente$betrachtet,$bei$denen$

jene$Expression$erhöht$fand$(Abb.$4E35).$

$

!!

Abb.!4&33:!Darstellung!der! relativen!Expressionsänderung!der!entsprechenden!Zielgene!durch!Hand1&Überexpression!im!Verhältnis!zur!Kontrolle!(leerer!Vektor).!Median!mit!IQR:!β&catenin!(0,04![&0,04;!0,08]);!CACNA1C!(0,08![&0,06;!0,22]);!E2F8!(0,04![0,00;!0,13]);!PPP2R5B!(0,07![0,04;!0,13]).!

Durch! die! Überexpression! von! Hand1! zeigten! sich! die! untersuchten! Gene! nur! sehr!gering! verändert,! einzig! die! Expression! von! PPP2R5B! fand! sich! signifikant! um! 7%!erhöht! (0,07! [0,04;! 0,13];!Wilcoxon! Signed&Rank&Test:! p=0,04).! Die! Expression! von! β&catenin! fand! sich! in! diesen! Experimenten! nicht! signifikant! erhöht! (0,04! [&0,04;! 0,08];!Wilcoxon!Signed&Rank&Test:!p=0,306).!Da!für!β&catenin!jedoch!eine!Erhöhung!der!Expression!durch!Überexpression!von!Hand1!erwartet!wurde,!wurden! im!Nachfolgenden!nur!die!Experimente!betrachtet,!bei!denen!jene!Expression!erhöht!fand!(Abb.!4&34).!

?-catenin CACNA1C E2F8 PPP2R5B-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

untersuchtes Gen

rela

tive

Expr

essi

onsä

nder

ung

β

4.$Ergebnisse$$

$ 78$

$Abb.$4E35:$Darstellung$der$ relativen$Expressionsänderung$der$entsprechenden$Zielgene$durch$Hand1EÜberexpression$ im$ Verhältnis$ zur$ Kontrolle$ (leerer$ Vektor)$ unter$ ausschließlicher$Berücksichtigung$positiver$βEcateninEExpressionen.$Median$mit$ IQR:$βEcatenin$ (0,08$ [0,04;$0,10]);$CACNA1C$ (0,14$ [0,04;$0,27]);$E2F8$ (0,04$ [0,01;$0,12]);$PPP2R5B$(0,06$[0,03;$0,07]).$

Nun$fand$sich$konsequenterweise$eine$recht$geringe,$aber$signifikante$Steigerung$der$βE

cateninEExpression$ um$ 8%$ (0,08$ [0,04;$ 0,10];$ Wilcoxon$ SignedERankETest:$ p=0,027).$

Ebenso$war$die$Expression$von$PPP2R5B$um$6%$(0,06$ [0,03;$0,07];$Wilcoxon$SignedE

RankETest:$ p=0,046)$ signifikant$ erhöht.$ In$ der$ Auswertung$ der$ Expressionsänderung$

von$CACNA1C$zeigte$sich$ebenfalls$in$der$Tendenz$eine$Erhöhung$um$14%$(0,14$[0,04;$

0,27];$ Wilcoxon$ SignedERankETest:$ p=0,093),$ eine$ Beeinflussung$ von$ E2F8$ ließ$ sich$

nicht$nachweisen.$

$

!Abb.!4&34:!Darstellung!der! relativen!Expressionsänderung!der!entsprechenden!Zielgene!durch!Hand1&Überexpression! im! Verhältnis! zur! Kontrolle! (leerer! Vektor)! unter! ausschließlicher!Berücksichtigung!positiver!β&catenin&Expressionen.!Median!mit! IQR:!β&catenin! (0,08! [0,04;!0,10]);!CACNA1C! (0,14! [0,04;!0,27]);!E2F8! (0,04! [0,01;!0,12]);!PPP2R5B!(0,06![0,03;!0,07]).!

Nun!fand!sich!konsequenterweise!eine!recht!geringe,!aber!signifikante!Steigerung!der!β&

catenin&Expression! um! 8%! (0,08! [0,04;! 0,10];! Wilcoxon! Signed&Rank&Test:! p=0,027).!

Ebenso!war!die!Expression!von!PPP2R5B!um!6%!(0,06! [0,03;!0,07];!Wilcoxon!Signed&

Rank&Test:! p=0,046)! signifikant! erhöht.! In! der! Auswertung! der! Expressionsänderung!

von!CACNA1C!zeigte!sich!ebenfalls!in!der!Tendenz!eine!Erhöhung!um!14%!(0,14![0,04;!

0,27];! Wilcoxon! Signed&Rank&Test:! p=0,093),! eine! Beeinflussung! von! E2F8! ließ! sich!

nicht!nachweisen.!

!

?-catenin CACNA1C E2F8 PPP2R5B-0.1

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

untersuchtes Gen

rela

tive

Expr

essi

onsä

nder

ung

β

5.$Diskussion$$

$ 79$

5.+Diskussion+

5.1.+ V$HAND1E47_01+ als+ differentielle+ Transkriptionsfaktorbindungsstelle+

Irbesartan5regulierter+Gene+bei+simuliertem+VHF+in+vivo+im+Schwein+

In$der$durchgeführten$vergleichenden$Promotoranalyse$IrbesartanEregulierter$Gene$bei$

induziertem$ VHF$ in$ vivo$ im$ Schwein,$ konnte$ die$ Transkriptionsfaktorbindungsstelle$

V$HAND1E47_01,$erstmals$von$Hollenberg$und$Kollegen$beschrieben$(Hollenberg$et$al.$

1995),$ als$ einzig$ signifikant$ differentielle$ Bindungsstelle$ identifiziert$ werden.$ Die$

relative$ Häufigkeit$ der$ Bindungsstelle$ V$HAND1E47_01$ war$ in$ den$ Promotoren$ der$

durch$Irbesartan$supprimierten$Gene$signifikant$höher.$

Es$ handelt$ sich$ hierbei$ um$ eine$ degenerierte$ EEBox$ mit$ der$ Konsensussequenz$

ggNRTCTGGMWtt,$ die$ der$ Bindung$ eines$ Heterodimers$ aus$ Hand1$ und$ Tcf3$ dient$

(Hollenberg$ et$ al.$ 1995).$ Im$ Unterschied$ zur$ konventionellen$ EEBox$mit$ der$ Sequenz$

CANNTG$(Murre$et$al.$1989;$van$Doren$et$al.$1991),$ist$Hand1$in$der$Lage,$eine$Vielzahl$

von$ Sequenzen$ anstelle$ der$ Nukleotidfolge$ CA$ an$ erster$ und$ zweiter$ Stelle$ zu$

akzeptieren.$Allein$Thymin$an$dritter$Stelle$wird$stark$bevorzugt,$sodass$sich$die$obige$

Form$der$EEBox$(NRTCTG)$ergibt$(Hollenberg$et$al.$1995).$Klassischerweise$dient$die$EE

Box$(CANNTG)$der$Bindung$von$bHLHEProteinen$der$Gruppe$A$und$B$(Murre$et$al.$1989;$

van$Doren$ et$ al.$ 1991;$Atchley$ et$ al.$ 1997;$ Lendent$ et$ al.$ 2001).$Neben$diesen$beiden$

Gruppen$ werden$ in$ der$ bHLHEProteinsuperfamilie$ die$ weiteren$ Gruppen$ CEF$

unterschieden$(Massari$et$al.$2000;$Lendent$et$al.$2001;$Simionato$et$al.$2007).$Außer$

Gruppe$D$ sind$ alle$Mitglieder$ in$ der$ Lage,$ an$DNA$ zu$ binden,$ benötigen$ dafür$ jedoch$

alternative$Konsensussequenzen$(Lendent$et$al.$2001;$Simionato$et$al$2007).$Gruppe$D$

bHLHEProteine$ verfügen$ über$ kein$ DNAEbindendes$ Potenzial,$ sondern$ fungieren$ als$

Antagonisten$zu$Gruppe$A$Proteinen,$in$dem$sie$diese$dimerisieren,$so$die$DNAEBindung$

verhindern$ und$ dadurch$ bedeutendes$ Regulationspotenzial$ aufweisen$ (Benezra$ et$ al.$

1990;$Massari$et$al.$2000;$$Simionato$et$al.$2007;$Yokota$2001;$Zebedee$et$al.$2001;$Ishii$

et$al.$2012).$

Die$bHLHEProteine$der$Gruppe$A$sind$ in$ ihrer$Expression$weit$verbreitet$und$können$

sowohl$HomoE$als$auch$Heterodimere$mit$anderen$bHLHEKlassen$bilden$(Lendent$et$al.$

2001;$Semionato$et$al.$2007),$Beispiele$für$diese$Gruppe$sind$die$Proteine$E12$und$Tcf3$

(Atchley$et$al.$1997;$Massari$et$al.$2000).$Im$Gegensatz$dazu$werden$die$bHLHEProteine$

der$Gruppe$B$(wie$z.B.$Hand1)$in$spezifischen$Organen$exprimiert,$häufig$sind$diese$bei$

EntwicklungsE$ und$ zellulären$ Regulationsprozessen$ involviert$ (Hollenberg$ et$ al$ 1995;$

Ledent$et$al$2001;$Firulli$2003).$

5.$Diskussion$$

$ 80$

5.2.+ V$HAND1E47_015Häufigkeit+ steht+ im+ Zusammenhang+ mit+ der+ Größe+ des+

Irbesartaneffektes+

In$ der$ vorliegenden$ Arbeit$ konnte$ gezeigt$ werden,$ dass$ in$ der$ Promotorgruppe$ der$

IrbesartanEsupprimierten$ Gene$ die$ Häufigkeit$ der$ Bindungsstelle$ V$HAND1E47_01$ in$

den$entsprechenden$Effektklassen$mit$steigendem$Irbesartaneffekt$signifikant$abnimmt.$

Es$scheint$ folglich$einen$Zusammenhang$zwischen$Irbesartaneffekt$und$der$Häufigkeit$

dieser$ Bindungsstelle$ zu$ geben,$ der$ in$ seiner$ Funktionalität$ für$ das$ Verständnis$ der$

Wirkung$von$Irbesartan$bei$VHF$von$Bedeutung$sein$könnte.$

Hier$ wären$ hypothetisch$ mehrere$ Mechanismen$ denkbar,$ die$ ein$ alternatives$

DimerisierungsE$ und$ Bindungsverhalten$ der$ Transkriptionsfaktoren$ Hand1$ und$ Tcf3$

mit$ unterschiedlichem$ AktivierungsE$ oder$ Repressionspotenzial$ auf$ die$ die$

Bindungsstelle$enthaltenden$Promotoren$zur$Folge$haben$könnten:$$

1. transkriptionelle$ Regulation$ der$ Transkriptionsfaktoren$ durch$ Blockade$ des$ AT1E

Rezeptors$

2. funktionelle$Modifikation$der$Transkriptionsfaktoren$durch$veränderte,$ dem$AT1E

Rezeptor$nachgeschaltete$Signalkaskaden$

3. funktionelle$ Modifikation$ der$ Transkriptionsfaktoren$ durch$ Veränderung$ des$

Gleichgewichts$zwischen$unterschiedlichen,$gleichzeitig$eigehenden$Signalkaskaden$

4. subzelluläre$Separierung$der$Transkriptionsfaktoren.$

Gleichzeitig$ sind$ für$ die$ EEBox$ eine$ Vielfalt$ potenziell$ bindender$ Faktoren$ (z.B.$ cMyc,$

TcfE4,$ Twist)$ beschrieben$ (Semov$ et$ al.$ 2002),$ die$ das$ Spektrum$ der$ hypothetisch$

einflussnehmenden$Transkriptionsfaktoren$deutlich$ erweitern$können,$ jedoch$müssen$

weitere$ Experimente$ klären,$ inwiefern$ diese$ an$ die$ degenerierte$ EEBox$mit$ der$ oben$

spezifizierten$Sequenz$noch$binden$und$transkriptionelle$Aktivität$ausüben.$

$

5.3.+Hand1+als+bedeutender+kardialer+Transkriptionsfaktor+

Die$ in$der$Arbeit$gefundene$differentielle$Promotororganisation$ IrbesartanEregulierter$

Gene$ hinsichtlich$ einer$ Bindungsstelle$ für$ das$ Heterodimer$ Hand1/Tcf3,$ legt$ eine$

funktionelle$Bedeutung$des$Transkriptionsfaktors$Hand1$nahe.$Diese$Vermutung$wird$

zusätzlich$dadurch$bestärkt,$dass$sich$ein$inverser$Zusammenhang$zwischen$der$Stärke$

des$Irbesartaneffekts$und$der$relativen$Häufigkeit$der$Bindungsstelle$V$HAND1E47_01$

in$den$Promotoren$der$entsprechenden$Irbesartaneffektklassen$der$durch$rapidEpacing$

supprimierten$Gene$zeigen$ließ.$

5.$Diskussion$$

$ 81$

Aus$ der$ Literatur$ ist$ bekannt,$ dass$ Hand1$ einen$ für$ die$ embryonale$ Entwicklung,$

Differenzierung,$ Morphologie$ und$ die$ Aufrechterhaltung$ der$ elektrophysiologischen$

Eigenschaften$der$Kardiomyozyten$wesentlichen$Transkriptionsfaktor$darstellt$ (Firulli$

et$al.$1998;$Firulli$2003;$Conway$et$al.$2009;$Vincentz$et$al.$2011).$Seine$Expression$ist$

im$ adulten$ Herzen$ unter$ physiologisch$ normalen$ Bedingungen$ hauptsächlich$ auf$ den$

linken$ Ventrikel$ und$ Ausflusstrakt$ beschränkt$ (Firulli$ 2003;$ Conway$ et$ al.$ 2009).$

Außerhalb$ des$ Herzens$ konnte$ Hand1$ bei$ adulten$ Menschen$ und$ Mäusen$ in$ der$

Plazenta$nachgewiesen$werden$(Knöfler$et$al.$1998,$Knöfler$et$al.$2002;$Firulli$2003).$Im$

Gegensatz$dazu$findet$sich$Hand1$während$der$Embryonalentwicklung$jedoch$in$einer$

deutlich$größeren$Zahl$von$Geweben$wieder$(Conway$et$al.$2009).$Bereits$bekannt$ist,$

dass$ Hand1$ mit$ pathologischen$ Zuständen$ wie$ kardialer$ Hypertrophie,$ Fallot’scher$

Tetralogie$und$anderen$kongenitalen$Herzfehlbildungen$in$Zusammenhang$steht$(Ritter$

et$ al.$ 1999;$ Natarajan$ et$ al.$ 2001;$ Thattaliyath$ et$ al.$ 2002;$ Vincentz$ et$ al.$ 2011).$

Außerdem$konnte$durch$Breckenridge$und$Kollegen$anhand$eines$in$vivo$Mausmodells$

gezeigt$ werden,$ dass$ eine$ Hand1EÜberexpression$ eine$ Störung$ der$ kardialen$

Erregungsausbreitung$ verursacht,$ welche$ sich$ in$ einem$ prolongierten$ PQE$ und$ RRE

Intervall,$ sowie$ einem$ verbreitertem$ QRSEKomplex$ widerspiegelte$ und$ zu$ einer$

erhöhten$Mortalität$aufgrund$von$ventrikulären$Arrhythmien$führte$(Breckenridge$et$al.$

2009).$Diese$proarrhythmogene$Wirkung$einer$Hand1EÜberexpression,$die$im$Ventrikel$

eine$ Reduktion$ der$ Cx43EExpression$ und$ ein$ Expressionssteigerung$ von$ βEcatenin$

bedingte,$konnte$jedoch$in$jener$Arbeit$im$Vorhof$nicht$nachgewiesen$werden,$was$mit$

dem$Fehlen$eines$Dimerisierungspartners$erklärt$wurde$(Breckenridge$et$al.$2009).$

Sowohl$das$DimerisierungsE$als$auch$das$DNAEBindungsverhalten$und$die$subzelluläre$

Lokalisation$ von$ Hand1$ wird$ wesentlich$ durch$ das$ Phosphorylierungsmuster$ der$

konservierten$ SerinE$ und$ Threoninreste$ (S98,$ T107,$ S109)$ beeinflusst$ (Firulli$ et$ al.$

2003b;$ Lu$ et$ al.$ 2011;$ Vincentz$ et$ al.$ 2011).$ So$ konnte$ gezeigt$ werden,$ dass$ die$

Phosphorylierung$ durch$ PKA$ und$ PKC$ (Firulli$ et$ al.$ 2003b),$ sowie$ durch$ Plk4$

(Martindill$et$al.$2007)$und$PKB$(Lu$et$al.$20011)$möglich$ist.$Die$Dephosphorylierung$

der$Reste$T107$und$S109$wird$spezifisch$über$die$regulatorische$Untereinheit$B56δ$der$

Proteinphosphatase$2A$(PP2A)$realisiert$(Firulli$et$al.$2003b).$

$

5.4.+Funktionelle+Verbindung+zwischen+HAND1,+rapid5pacing+und+Irbesartan+

Bei$den$ in$der$vorgelegten$Arbeit$durchgeführten$ in$vitro$Experimente$an$der$atrialen$

Kardiomyozytenzelllinie$ HL1$ konnte,$ wie$ in$ den$ in$ vivo$ Experimenten$ im$ Schwein,$

5.$Diskussion$$

$ 82$

keine$ zeitabhängige$ HAND1EExpressionänderung$ durch$ alleiniges$ rapidEpacing$

gefunden$werden,$jedoch$zeigte$sich$eine$Induktion$der$HAND1EExpression$unter$rapidE

pacing$bei$gleichzeitiger$Irbesartaninkubation.$

Damit$ließ$sich$in$vitro$ein$deutlicher$Hinweis$dafür$gewinnen,$dass$Hand1$unter$rapidE

pacing$bei$der$Regulation$IrbesartanEabhängiger$Gene$eine$funktionelle$Rolle$spielt$und$

mit$ dem$ ReninEAngiotensinESignalnetzwerk,$ namentlich$ mit$ der$ Wirkung$ von$

Irbesartan,$verknüpft$ sein$muss.$ Interessanterweise$scheint$diese$Verknüpfung$ jedoch$

nur$dann$von$ funktioneller$Relevanz$ für$die$Expressionssteigerung$von$HAND1,$wenn$

die$Stimulationsbedingungen$rapidEpacing$und$Irbesartan$gleichzeitig$einwirken.$

Denkbar$wäre$hier$das$Zusammenspiel$mehrerer$Faktoren:$durch$VHF$und$rapidEpacing$

wird$die$Synthese$von$Angiotensin$II$(AngII)$hochreguliert$(siehe$1.3.1.1.),$sodass$eine$

vermehrte$ Stimulation$ des$ RAAS$ daraus$ resultieren$ kann.$ Gleichzeitig$ kommt$ es$ zu$

einer$ Umgestaltung$ des$ Verhältnisses$ der$ Angiotensinrezeptoren$ zugunsten$ des$

Angiotensin$ IIETyp$ 2$ (AT2)ERezeptors,$ der$ sich$ bei$ VHF$ stärker$ exprimiert$ findet,$

wohingegen$ der$ Angiotensin$ IIETyp$ 1$ (AT1)ERezeptor$ reduziert$ wird$ (Goette$ et$ al.$

2000).$ Die$ Anwesenheit$ von$ Angiotensinrezeptorblockern$ (ARB)$ wie$ Irbesartan$

beeinflusst$synchron$das$Stimulationsgleichgewicht$zwischen$den$drei$bisher$bekannten$

Angiotensinrezeptoren$ (AT1E,$ AT2E,$ MasERezeptor)$ zugunsten$ des$ AT2E$ und$ MasE

Rezeptors$ (Iwai$ et$ al.$ 2009)$ und$ führt$ zudem$ zu$ einer$ Konzentrationssteigerung$ des$

angiotensin$I$converting$enzyme$2$(ACE2)$(Ishiyama$et$al.$2004;$Agata$et$al.$2006),$was$

folgerichtig$ eine$Zunahme$der$Ang(1E7)EKonzentration$bedingt$ (Ishiyama$et$ al.$ 2004),$

welche$wiederum$eine$verstärkte$Stimulation$des$MasERezeptors$nach$sich$zieht$(Iwai$

et$ al.$ 2009;$ Santos$ et$ al.$ 2013).$ Da$ Ang(1E7)$ neben$ antifibrotischen$ und$

antiproliferativen$ Effekten$ auch$ antiapoptotisches$ Potenzial$ (Santos$ et$ al.$ 2013)$

aufweist$und$antiarrhythmogen$wirkt$(Ferreira$et$al.$2010;$Ferreira$et$al.$2012),$scheint$

sich$ hier$ eine$ Stimulationssituation$ einzustellen,$ die$ in$ ihrer$ Wirkung$ der$

hauptsächlichen$ Stimulation$ des$ AT1ERezeptors,$ der$ sowohl$ apoptotisch$ als$ auch$

proliferativ$und$arrhythmogen$wirken$kann$ (Santos$ et$ al.$ 2013),$ entgegenwirkt.$ Zwar$

ist$auch$für$Ang(1E7)$ein$arrhythmogenes$Potenzial$beschrieben$worden$(Donoghue$et$

al.$ 2003),$ es$ muss$ sich$ dabei$ jedoch$ um$ überphysiologisch$ hohe$ Konzentrationen$

handeln$(Santos$et$al.$2013).$Zudem$bewirkt$die$Stimulation$von$AT2ERezeptoren$durch$

AngII$eine$gesteigerte$Aktivität$der$PP2A$(Huang$et$al.$1995;$Huang$et$al.$1996;$Kilian$et$

al.$ 2008),$ welche$ die$ Dephosphorylierung$ von$ MEK1/2$ realisiert$ und$ somit$ die$ dem$

AT1ERezeptor$ nachgeschaltete$Ras/Raf1/MEK1/2ESignalachse$ abschaltet$ (Huang$ et$ al.$

5.$Diskussion$$

$ 83$

1996;$ Ruchon$ et$ al.$ 2012).$ Folglich$ resultiert$ ein$ deutlich$ antiproliferatives,$

antiapoptotisches$und$antiarrhythmogenes$Signal$aus$dem$ReninEAngiotensinESystem.$

Gleichzeitig$scheint$jedoch$auch$das$Calciumsignalnetzwerk$in$dieser$Situation$beteiligt$

zu$ sein,$ da$ sich$ unter$ Irbesartaneinfluss$ ein$ inverser$ Zusammenhang$ zwischen$ der$

Änderung$der$CACNA1CE$und$der$HAND1EExpressionsänderung$zu$offenbaren$scheint,$

welcher$ ohne$ Irbesartan$ nicht$ zu$ erkennen$ war.$ Allerdings$ lässt$ dieser$ keine$

Rückschlüsse$auf$Kausalität$zu,$sodass$es$sich$hierbei$auch$um$unabhängig$voneinander,$

der$ Situation$ entsprechende$ Prozesse$ handeln$ kann.$ Gleichwohl$ führt$ die$ durch$ VHF$

verursachte$ Calciumüberladung$ der$ Zellen$ (Greiser$ et$ al.$ 2013)$ zur$ gesteigerten$

Sättigung$von$Calmodulin$und$zur$nachfolgenden$Aktivierung$von$Calcineurin$(Crabtree$

et$ al.$ 2002).$ Die$ wiederum$ daraus$ resultierende$ Dephosphorylierung$ und$ nukleäre$

Translokation$der$Transkriptionsfaktoren$NFATc3$und$NFATc4$stellt$ einen$bekannten$

hypertrophen$ Kontrollmechanismus$ dar$ (Lin$ et$ al.$ 2004;$ Bukowska$ et$ al.$ 2006).$

Zusätzlich$ löst$ die$ auch$ intranukleär$ ansteigende$ Calciumkonzentration$ eine$

Aktivierung$ der$ nukleären$ Calcium/calmodulinEdependent$ protein$ kinase$ II$ (CaMKII)$

aus,$welche$anschließend$die$Phosphorylierung$von$Histondeacetylasen$(HDAC)$bedingt$

und$so$deren$nukleären$Export$verursacht$(Greiser$et$al.$2013).$Hieraus$ergibt$sich$ein$

hypertropher$und$proarrhythmogener$Signalmechanismus$(Liu$et$al.$2008).$

Eine$ Verbindung$ zwischen$ diesen$ beiden$ Signalwegen$ könnte$ eine$weitere$ Erklärung$

für$ die$ Wirkung$ von$ Irbesartan$ sein$ und$ eine$ Modifikation$ der$ Calciumsignale$

darstellen.$ Wesentlich$ für$ die$ Kontrolle$ des$ Calciumeinstroms$ sind$ die$ LETyp$

Calciumkanäle$der$TETubuli$(Trafford$et$al.$2012),$dessen$genereller$Einstrom$(ICaL)$sich$

bei$VHF$vermindert$ findet$ (Greiser$et$al.$2013).$Erstaunlicherweise$scheint$ jedoch$die$

Offenwahrscheinlichkeit$des$Einzelkanals$erhöht$(Klein$et$al.$2003).$Das$Verhalten$und$

die$Funktionalität$dieser$Kanäle$kann$über$Phosphorylierung$und$Desphosphorylierung,$

sowie$ über$ Degradierung,$ differentiellen$ Aufbau$ und$ Separierung$modifiziert$ werden$

(Schotten$et$al.$2011;$Shaw$et$al.$2013;$Trafford$et$al.$2013).$So$erniedrigt$die$bei$VHF$in$

Expression$ und$ Aktivität$ erhöht$ gefundene$ PP2A$ die$ Phosphorylierung$ der$

porenbildenden$ LETyp$ Calciumkanaluntereinheit$ α1c$ (CACNA1C),$ was$ eine$ reduzierte$

Offenwahrscheinlichkeit$ des$ Kanals$ zur$ Folge$ hat$ (Christ$ et$ al.$ 2004).$ Gleichzeitig$ ist$

eine$ verminderte$ Aktivität$ der$ PP2A$ beschrieben,$ die$ mit$ einer$ erhöhten$

Offenwahrscheinlichkeit$und$Phosphorylierung$der$Untereinheit$α1c$assoziiert$ist$(Klein$

et$ al.$ 2003).$ Da$ sich$ bei$ VHF$ eine$ vermehrte$ Aktivität$ der$ AT1ERezeptorEabhängigen$

Proteinkinase$C$(PKC)$(Voigt$et$al.$2007;$Bukowska$et$al.$2012)$sowie$der$Proteinkinase$

5.$Diskussion$$

$ 84$

A$ (PKA)$ (Vest$ et$ al.$ 2005;$Nattel$ et$ al.$ 2008,$Bartos$et$ al.$ 2013)$ findet$und$diese$eine$

Phosphorylierung$ der$ Kanaluntereinheit$ α1c$ realisieren$ können$ (Hell$ et$ al.$ 1995;$ de$

Jongh$et$al.$1996;$Mitterdorfer$et$al.$1996;$Yang$et$al.$2005b),$scheint$während$VHF$das$

Gleichgewicht$ zwischen$ Phosphorylierung$ und$ Dephosphorylierung$ im$ Vergleich$ zur$

physiologischen$ Situation$ verändert$ zu$ sein.$ Die$ Blockade$ der$ Signale$ des$ AT1E

Rezeptors$müsste$folglich$die$Aktivität$der$PKC$reduzieren.$Gleichzeitig$bleibt$die$über$

die$ Stimulation$ des$ AT2ERezeptors$ realisierte$ Aktivierung$ der$ PP2A$ (siehe$ oben)$

erhalten.$ Die$ daraus$ resultierende$ Verschiebung$ des$ Gleichgewichts$ der$

Phosphorylierung$ könnte$ die$ Funktionalität$ der$ LETypECalciumkanäle$

antiarrhythmogen$beeinflussen$und$den$Calciumeinstrom$modulieren.$Der$für$den$AT1E

Rezeptor$beschriebene$Effekt$des$erhöhten$Einstroms$von$Calcium$in$die$Zelle$und$die$

verstärkte$ intrazelluläre$ Mobilisierung$ (Iwai$ et$ al.$ 2009)$ dürfte$ durch$ Irbesartan$

zusätzlich$abnehmen$und$die$Calciumsignale$abschwächen.$

Zusammengenommen$ könnte$ diese$ Modifikation$ der$ Signalwege$ durch$ Irbesartan$

während$ rapidEpacing$ eine$ für$ die$ Induktion$ von$ HAND1$ hinreichende$ Bereitstellung$

und$ Kombination$ von$ Transkriptionsfaktoren$ ergeben,$ die$ letztlich$ die$ bei$ VHF$

auftretende$Schädigung$der$Kardiomyozyten$(Chimenti$et$al.$2010;$Schotten$et$al.$2011)$

verhindern$oder$abschwächen$kann$und$ein$verstärkt$embryonales$Expressionsmuster$

im$ Sinne$ einer$ Regeneration$ begünstigen$ könnte.$ Einen$wesentlichen$ Schaltpunkt$ für$

die$Realisation$eines$HAND1Eaktivierenden$Transkriptionfaktormilieus$könnte$die$PP2A$

einnehmen,$ die$ durch$ Modifikation$ sowohl$ der$ CalciumE,$ als$ auch$ Unterbindung$ der$

AT1ESignale$ inhibitorische$ Effektoren$ entweder$ in$ ihrer$ Transkription$ hemmen$ oder$

funktionell$modifizieren$könnte.$Dies$ ließe$sich$ in$Einklang$mit$Befunden$von$Risebro$

und$Kollegen$bringen,$die$zeigen$konnten,$dass$Hand1$einen$entscheidenden$Faktor$für$

die$Regulation$zwischen$Proliferation$und$Differenzierung$darzustellen$scheint$(Risebro$

et$al.$2006).$Unter$Berücksichtigung$der$Befunde$von$Breckenridge$und$Kollegen$(siehe$

5.3.),$ könnte$ eine$ Steigerung$ der$ Hand1EExpression$ im$ Vorhof,$ bei$ ähnlichen$

Modifikationen$der$ gap$ junction$wie$ im$Ventrikel,$ ebenfalls$ zu$ einer$Verzögerung$der$

Erregungsausbreitung$ führen$ und$ so$ einen$ IrbesartanEbedingten$ Menchanismus$ mit$

konsekutiver$ Unterbindung$ der$ chaotischen$ Erregungsausbreitung$ vermitteln.$ Dies$

wäre$auch$vereinbar$mit$den$Befunden$aus$klinischen$Studien,$die$einen$positiven$Effekt$

von$ACEE$und$AT1EAntagonisten$in$der$Sekundär$und$Primärprävention$von$VHF$zeigen$

konnten$(siehe$1.3.1.1.).$Die$Frage$nach$dem$Dimerisierungspartner$und$–verhalten$von$

Hand1$während$der$unterschiedlichen$experimentellen$Bedingungen$konnte$an$dieser$

5.$Diskussion$$

$ 85$

Stelle$ auf$ transkriptioneller$ Ebene$ nicht$ geklärt$ werden$ und$muss$ vorerst$ spekulativ$

bleiben.$

Der$ Vollständigkeit$ halber$ sei$ erwähnt,$ dass$ Irbesartan$ auch$ Wirkung$ auf$ die$

Fibroblasten$ ausübt$ und$ über$ die$ Blockade$ des$ AT1ERezeptors$ die$ TGFEProduktion$

hemmt$ (Shimano$ et$ al.$ 2008),$ wodurch$ die$ übermäßige$ Produktion$ von$

Extrazellulärmatrix$ verhindert$ und$ so$die$Bildung$weiteren$ fibrotischen$Korrelats$ zur$

Aufrechterhaltung$der$microEreentry$Kreise$vermindert$wird.$

$

5.5.+Der+Transkriptionsfaktor+E2F8+

Bei$ der$ Untersuchung$ potenzieller$ Hand1EZielgene,$ die$ aus$ der$ Gruppe$ der$

runterregulierten$Gene$ausgewählt$wurden,$stellte$E2F8$einen$besonders$interessanten$

Kandidaten$dar.$

E2F8$gehört$in$die$Proteinfamilie$der$E2FETranskriptionsfaktoren,$in$der$bis$heute$acht$

Mitglieder$unterschieden$werden$(Lammens$et$al.$2009),$welche$wiederum$in$typische$

(E2F1E6),$nochmals$unterteilt$ in$Transkriptionsaktivatoren$(E2F1,$E2F2,$E2F3a)$und$–

suppressoren$ (E2F3b,$ E2F4,$ E2F5,$ E2F6),$ und$ atypische$ (E2F7$ und$ E2F8)$ unterteilt$

werden$ (Dimova$ et$ al.$ 2005;$ Maiti$ et$ al.$ 2005;$ Lammens$ et$ al.$ 2009).$ Über$ die$

organspezifische$ Expression$ der$ atypischen$ E2FETranskriptionsfaktoren$ ist$ bisher$

wenig$ bekannt,$ bei$ der$ Maus$ findet$ sich$ eine$ hohe$ Expression$ in$ der$ Haut,$ Leber,$

Thymus$ und$Hoden,$wohingegen$ diese$ in$ Gehirn,$Muskel$ und$Magen$ gering$ oder$ gar$

nicht$vorhanden$sind$(de$Bruin$et$al.$2003;$Maiti$et$al.$2005).$Weiterhin$konnte$gezeigt$

werden,$ dass$ E2F7$ und$ E2f8$ ein$ sehr$ ähnliches$ Expressionsprofil$ aufweisen$ (Li$ et$ al.$

2008;$Lammens$et$al.$2009)$und$eine$vom$Zellzyklus$abhängige$Expressionsregulation$

zeigen,$ wobei$ deren$ Induktion$ am$ G1EPrüfpunkt$ beginnt$ und$ sein$ Maximum$ am$

Übergang$zur$G2EPhase$erreicht$wird$(Christensen$et$al.$2005;$Lammens$et$al.$2009).$Die$

Funktionen$ dieser$ beiden$ Faktoren$ scheinen$ Regulationsprozesse$ der$

Embryonalentwicklung,$ bei$ der$ Kontrolle$ der$ Zellgröße,$ des$ Endozyklus,$ der$

Proliferation,$der$Reaktion$auf$DNAESchäden$und$der$Apoptose$zu$umfassen$(Logan$et$

al.$2005;$Li$et$al.$2008;$Lammens$et$al.$2009;$Pandit$et$al.$2012).$

$

5.6.+Funktioneller+Zusammenhang+zwischen+E2F8,+rapid5pacing+und+Irbesartan+

Die$ vorliegenden$ Experimente$ konnten$ zeigen,$ dass$ das$ gleichzeitige$ Einwirken$ der$

experimentellen$Bedingungen$rapidEpacing$und$Irbesartan$einen$inhibierenden$Einfluss$

auf$die$E2F8ETranskription$ausüben.$Da$von$mehreren$Arbeitsgruppen$gezeigt$werden$

5.$Diskussion$$

$ 86$

konnte,$ dass$ eine$ Überexpression$ der$ atypischen$ E2FETranskriptionsfaktoren$ (E2F7$

und$E2F8)$zu$einer$Unterdrückung$der$Zellproliferation$führte$(Logan$et$al.$2004;$Logan$

et$ al.$ 2005),$ bei$ knockEout$ dieser$ beiden$ Faktoren$ in$ Trophoblasten$ sich$ jedoch$ eine$

unvollständige$Mitose$mit$der$Konsequenz$polyploider$Zellen$einstellte$(Lammens$et$al.$

2009),$ könnte$ hier$ geschlussfolgert$werden,$ dass$ dieser$ proliferationsunterdrückende$

Effekt$von$E2F8$ebenso$wegfällt$oder$reduziert$wird.$Dies$scheint$insofern$interessant,$

als$durch$Hand1$die$Überwindung$des$G1EPrüfpunktes$ermöglicht$werden$kann$(Risebro$

et$ al.$ 2006).$ So$ konnte$ durch$ Risebro$ und$ Kollegen$ in$ einer$ Untersuchung$ an$ aus$

Mausembryonen$ gewonnenen$ Kardiomyozyten$ gezeigt$ werden,$ dass$ sich$ bei$ einer$

Überexpression$ von$ Hand1$ eine$ deutliche$ Erhöhung$ der$ für$ die$ Beendigung$ der$ G1E

Phase$ wichtigen$ Proteine$ Cdk4$ und$ cyclin$ D2$ zeigte,$ was$ konsequenterweise$ eine$

verminderte$ Differenzierung$ und$ eine$ erhöhte$ Proliferationsrate$ zur$ Folge$ hatte$

(Risebro$et$ al.$ 2006).$Vor$dem$Hintergrund$protektiver$Effekte$ von$AT1EAntagonisten$

bei$VHF$(siehe$1.3.1.1.),$könnte$die$Reaktivierung$eines$Hand1Etypischen$embryonalen$

Genexpressionsprofils$ und$ die$ Zellzyklusprogredienz$ durch$Hand1$ und$ die$ Reduktion$

des$ proliferationshemmenden$ Einflusses$ durch$ E2F8$ als$ Reparaturmechanismus$

interpretiert$ werden$ und$ eine$ molekulare$ Erklärung$ darstellen.$ Da$ gezeigt$ werden$

konnte,$ dass$ eine$ Regeneration$ von$ Herzgewebe$ durch$ Teilung$ bereits$ existierender$

Kardiomyozyten$ möglich$ ist$ und$ kontinuierlich$ stattzufinden$ scheint$ (Senyo$ et$ al.$

2013),$ kann$ vorsichtig$ spekuliert$werden,$ dass$ dies$während$VHF$ und$ unter$ Einfluss$

von$ Irbesartan$ verstärkt$ geschieht$ und$ eine$ damit$ einhergehende$ potenzielle$

Regeneration$möglich$wird.$

Auch$hier$ist$die$Kombination$der$Stimulationsbedingungen$und$die$damit$verbundene$

Modulation$ der$ Signalwege$ (siehe$ 5.4.)$ die$ Voraussetzung$ zur$ Schaffung$ eines$

suffizienten$ Milieus$ für$ die$ transkriptionelle$ Inhibition$ von$ E2F8.$ Die$ alleinige$

Stimulation$ von$ HL1EZellen$ mit$ Irbesartan$ verursacht$ sogar$ einen$ leichten$ aber$

signifikanten$Anstieg$der$E2F8EExpression,$was$im$Kontext$der$funktionellen$Bedeutung$

von$ E2F8$ (siehe$ oben)$ mit$ einer$ gebremsten$ Proliferation$ einhergehen$ könnte.$ Dies$

würde$ mit$ bisherigen$ Untersuchungen$ übereinstimmen,$ die$ zeigen$ konnten,$ dass$ die$

Inhibition$des$AT1ERezeptors$zu$einem$Übergewicht$der$Signalwege$des$AT2E$und$MasE

Rezeptors$ führen,$ die$ wiederum$ antagonistisch,$ also$ antiproliferativ$ zu$ ersterem$

Wirken$(Iwai$et$al.$2009;$Santos$et$al.$2013).$Wenn$ein$Anstieg$der$Expression$von$E2F8$

also$eine$für$Irbesartan$erwartete$Proliferationshemmung$bedeutet,$dann$scheint$rapidE

5.$Diskussion$$

$ 87$

pacing$ in$Anwesenheit$von$ Irbesartan$ in$HL1EZellen$das$antiproliferative$Signal$ in$ein$

wieder$proliferatives$Umzuwandeln.$

Des$Weiteren$ zeigte$ sich$ ein$positiv$ signifikanter$ Zusammenhang$ zwischen$der$E2F8E$

und$ CACNA1CEExpressionsänderung,$ was$ einen$ Einfluss$ des$ Calciumsignalnetzwerks$

für$die$ Inhibition$der$E2F8EExpression$wahrscheinlich$macht.$Da$sich$hier$ jedoch$kein$

Unterschied$ der$ Regressionsgeraden$ zwischen$ den$ Ergebnissen$ mit$ und$ ohne$

Irbesartan$finden$ließ,$könnte$die$Inhibition$allein$vom$Calciumeinstrom$über$die$LETyp$

Calciumkanäle$ (ICaL)$ in$die$Zelle$abhängen.$ Jedoch$muss$auch$hier$darauf$hingewiesen$

werden,$ dass$der$ alleinige$Nachweis$ eines$Expressionszusammenhangs$keine$Aussage$

über$ die$ Kausalität$ zulässt,$ gleichwohl$ kann$ es$ sich$ um$ simultan$ aber$ unabhängig$

voneinander$ablaufende$Prozesse$handeln.$

Es$ soll$ an$dieser$Stelle$nicht$unerwähnt$bleiben,$dass$ sich$unter$der$Berücksichtigung$

einer$Arbeit$von$Li$und$Kollegen$noch$eine$weitere$Möglichkeit$der$ Interpretation$der$

hier$vorgelegten$Ergebnisse$eröffnet:$in$jener$konnte$den$Transkriptionsfaktoren$E2F7$

und$E2F8$eine$kritische$Rolle$ in$der$Regulation$der$Apoptose$zugeordnet$werden,$ ein$

Defizit$dieser$Faktoren$ führte$ zu$einer$Zunahme$der$Proteine$E2F1$und$p53$und$ging$

gleichzeitig$mit$ einer$ erhöhten$ Apoptoserate$ einher$ (Li$ et$ al.$ 2008).$ Jedoch$ lässt$ sich$

dies$nicht$mit$der$gleichzeitigen$hier$vorgefundenen$HAND1EExpressionssteigerung$und$

der$ bisher$ bekannten$ Hand1EFunktion$ in$ Zusammenhang$ bringen.$ Dennoch$ wäre$ es$

denkbar,$dass$es$sich$hier$um$zwei$unterschiedliche$Prozesse$zweier$Zellpopulationen$

handelt:$so$könnte$die$Reduktion$von$E2F8$auf$die$Population$zurückzuführen$sein,$die$

durch$ die$ Stimuli$ apoptotisch$wird,$ die$HAND1EExpressionssteigerung$ folglich$ auf$ die$

Population,$ die$ kompensatorisch$ auf$ die$ Stimuli,$ respektive$ den$ Zelltod$ der$ anderen$

Population$reagiert.$

+

5.7.+Gegensinnige+Regulation+von+HAND1+und+E2F8++

In$ Anbetracht$ der$ hier$ gezeigten$ gegensinnigen$ transkriptionellen$ Regulation$ von$

HAND1$ und$ E2F8$ könnte$ eine$ gegenseitige$ regulative$ Beeinflussung$ angenommen$

werden.$ So$ ist$ für$ E2F8$ ein$ DNAEbindendes$ Potenzial$ gezeigt$ worden,$ welches$ einen$

inhibitorischen$Effekt$auf$E2FEZielgene$ausübt$(Christensen$et$al.$2005).$Da$unter$rapidE

pacing$ bei$ positiver$ E2F8EExpressionsänderung$ immer$ eine$ Reduktion$ der$ HAND1E

Expression$ festzustellen$war,$bei$negativer$ jedoch$eine$signifikante$Steigerung,$könnte$

HAND1$folglich$ein$direktes$E2F8EZielgen$darstellen,$dessen$Expression$inhibiert$wird.$

Eine$ inhibitorische$ Beeinflussung$ der$ E2F8EExpression$ durch$ Hand1$ wäre$ ebenso$

5.$Diskussion$$

$ 88$

denkbar,$ jedoch$ findet$ sich$ in$ der$ Literatur$ bisher$ keine$ nachgewiesene$

Repressorfunktion$für$Hand1.$Dennoch$stellt$Hand1$aufgrund$seines$Potenzials,$HomoE$

und$ Heterodimere$ in$ Abhängigkeit$ seines$ Phosphorylierungsstatus$ zu$ bilden,$ einen$

vielseitig$ modulierbaren$ Faktor$ dar,$ sodass$ eine$ Repressorfunktion$ nicht$

ausgeschlossen$werden$kann.$Zusätzlich$ist$denkbar,$dass$der$zur$Aktivierung$der$E2F8E

Expression$ notwendige$ Dimerisierungspartner$ unter$ den$ beobachteten$ Bedingungen$

eine$anderweitige$Modifikation$erfährt$oder$Hand1$in$solcher$Art$modifiziert$wird,$dass$

keine$Dimerisierung$zustande$kommt$und$eine$Aktivierung$entfällt.$Durch$Separierung$

potenzieller$ Partner$ bietet$ sich$ subzellulär$ eine$ weitere$ Möglichkeit$ aktivierenden$

Einfluss$ durch$ Hand1$ zu$ unterbinden.$ Ebenso$ wäre$ eine$ durch$ Hand1$ induzierte$

Expression$ eines$ E2F8ERepressors$ vorstellbar,$ genauso$ wie$ eine$ transkriptionelle$

Regulation$unabhängig$voneinander$denkbar$ist$und$hier$nicht$ausgeschlossen$werden$

kann.$ Zur$ genaueren$ Klärung$ dieses$ Zusammenhangs$ sind$ weitere$ Experimente$

notwendig.$

$

5.8.+Die+regulatorische+Untereinheit+B56β+(PPP2R5B)+der+PP2A++

Die$ Proteinphosphatase$ 2A$ (PP2A)$ stellt$ eine$ weitverbreitete$ Serin/ThreoninE

Phosphatase$ dar$ (Cohen$ 1997).$ Der$ PP2AEHoloenzymkomplex$ besteht$ aus$ folgenden$

drei$Untereinheiten$(Perrotti$et$al.$2013;$Seshacharyulu$et$al.$2013):$$

1. strukturelle$Untereinheit$(PP2AA)$

2. katalytische$Untereinheit$(PP2AC)$

3. regulatorische$Untereinheit$(PP2AB,$PP2AB’,$PP2AB’’,$PP2AB’’’).$

Sowohl$die$strukturelle$als$auch$die$katalytische$Untereinheit$finden$sich$weitverbreitet$

exprimiert$ (Seshacharyulu$ et$ al.$ 2013).$ Im$Gegensatz$ dazu$ zeigen$ die$ regulatorischen$

Untereinheiten$ein$deutlich$differenzierteres$Expressionsmuster$und$bestimmen$so$als$

entscheidendes$ Regulationsglied$ die$ Substratspezifität,$ subzelluläre$ Lokalisation$ und$

katalytische$Aktivität$ der$PP2A$ (Janssens$ et$ al.$ 2001).$ Es$ sind$mindestens$26$Formen$

der$ regulatorischen$ Untereinheit$ bekannt,$ die$ in$ vier$ Familien$ unterteilt$ werden$

(Eichhorn$et$al.$2009;$Perrotti$et$al.$2013;$Seshacharyulu$et$al.$2013).$Die$regulatorische$

Untereinheit$B56β$wird$der$PP2AB’EFamilie$zugeordnet$(Perrotti$et$al.$2013)$und$findet$

sich$ ausschließlich$ im$Cytoplasma$ (McCright$ et$ al.$ 1996;$ Janssens$ et$ al.$ 2001).$ In$ der$

humanen$ Neuroblastomzelllinie$ IMRE32$ konnte$ gezeigt$ werden,$ dass$ eine$ durch$

Retinsäure$ provozierte$ Differenzierung$ der$ Zellen$ mit$ einem$ deutlichen$ Anstieg$ der$

regulatorischen$Untereinheit$B56β$einherging$(McCright$et$al.$1996),$weshalb$für$diese$

5.$Diskussion$$

$ 89$

eine$ entscheidende$ Funktion$ in$ der$ Entwicklung$ angenommen$ wird$ (McCright$ et$ al.$

1996;$ Eichhorn$ et$ al.$ 2009).$ So$ konnte$ eine$ Assoziation$ dieser$ Untereinheit$mit$ dem$

cyclin$G1/2$gezeigt$werden$(Okamoto$et$al.$1996;$van$Lookeren$Campagne$et$al.$1999;$

Bennin$ et$ al.$ 2002).$ Diese$ Bindung$ des$ PP2AEHoloenzymkomplexes$ mit$ der$

regulatorischen$ B56βEUntereinheit$ an$ das$ cyclin$ G2$ induzierte$ in$ HEKEZellen$ einen$

Zellzyklusarrest,$der$mit$einer$aktiven$Cdk4$aber$inaktiven$Cdk2$einherging$(Bennin$et$

al.$2002).$Auch$konnte$eine$inhibitorische$Wirkung$auf$die$extracellular$signalEregulated$

kinase$1/2$(Erk1/2)$nachgewiesen$werden:$B56β$reduzierte$die$Menge$der$pTpYEERK$

und$pTEERK,$hatte$jedoch$keinen$Einfluss$auf$die$pYEERK$oder$die$phosphorylierte$Form$

der$mitogenEactivated$ protein$ kinase$ (pMEK)$ (Letourneux$ et$ al.$ 2006).$ Des$Weiteren$

beeinflusst$diese$Untereinheit$die$Stabilität$der$Serin/ThreoninEKinase$PimE1,$indem$sie$

durch$ Dephosphorylierung$ eine$ vermehrte$ Ubiquitinylierung$ und$ konsekutiv$ einen$

gesteigerten$Abbau$von$PimE1$realisiert$(Ma$et$al.$2007).$Dadurch$greift$die$Untereinheit$

B56β$ direkt$ in$ die$ Regulation$ apoptotischer$ Signalwege$ ein,$ da$ für$ PimE1$ eine$

inhibitorische$ Wirkung$ auf$ die$ Apoptose$ beschrieben$ wurde,$ welche$ durch$

deaktivierende$ Phosphorylierung$ des$ proapoptotischen$ Proteins$ Bad$ und$ damit$

einhergehende$Stabilisierung$von$BclE2$vermittelt$wird$(Aho$et$al.$2004;$Kim$et$al.$2006;$

Macdonald$et$al.$2006).$

$

5.9.+ Funktioneller+ Zusammenhang+ zwischen+ PPP2R5B,+ rapid5pacing+ und+

Irbesartan+

Vor$ dem$ Hintergrund$ der$ oben$ geschilderten$ Eigenschaften$ der$ regulatorischen$

Untereinheit$ B56β$ (siehe$ 5.8.)$ muss$ für$ die$ hier$ vorliegenden$ Experimente$

angenommen$werden,$dass$die$alleinige$Stimulation$der$HL1EZellen$durch$rapidEpacing$

eine$ vermehrt$ apoptotische$ und$ antiproliferative$ Situation$ zufolge$ hat.$ Die$

Expressionssteigerung$ von$ PPP2R5B$ unter$ rapidEpacing$ könnte$ PimE1$ destabilisieren$

und$ folglich$ zu$ einer$ verminderten$Wirksamkeit$ des$ antiapoptotischen$ Proteins$ BclE2$

führen$(siehe$5.8.).$Dieser$Effekt$scheint$durch$die$Anwesenheit$von$Irbesartan$wieder$

neutralisiert$ zu$ werden.$ Deshalb$ kann$ wiederum$ geschlussfolgert$ werden,$ dass$ die$

PPP2R5BEInduktion$ während$ rapidEpacing$ eine$ direkte$ Folge$ der$ AT1E

Rezeptorstimulation$ darstellt.$ Die$ Reduktion$ der$ Expression$ dieser$ Untereinheit$ bei$

rapidEpacing$unter$Zugabe$von$Irbesartan$im$Vergleich$zum$alleinigen$rapidEpacing$und$

der$daraus$resultierende$Wegfall$dieses$apoptotischen$Einflusses$lässt$sich$auch$mit$der$

proliferativen$ Regulation$ von$HAND1$ und$ E2F8$ in$ Einklang$ bringen.$ Somit$ stellt$ dies$

5.$Diskussion$$

$ 90$

einen$weiteren$Hinweis$für$den$regenerativen$und$protektiven$Einfluss$von$Irbesartan$

auf$die$Kardiomyozyten$bei$VHF$dar$(siehe$5.4.$&$5.6.).$

Da$ für$die$PP2A$bei$VHF$eine$gesteigerte$Aktivität$zeigt$werden$konnte,$welche$durch$

die$ Stimulation$ des$ AT2ERezeptors$ vermittelt$ zu$werden$ scheint$ (siehe$ 5.4.),$ bewirkt$

Irbesartan$ durch$ die$ differentielle$ Expression$ der$ regulatorischen$ Untereinheit$

wahrscheinlich$eine$Veränderung$der$ funktionellen$Eigenschaften$dieser$Phosphatase,$

was$ sich$ nicht$ nur$ auf$ die$ Modifikation$ der$ oben$ erwähnten$ Signalmediatoren$

auswirken$dürfte$(siehe$5.4.$&$5.8.),$sondern$auch$auf$die$Calciumkanäle$und$damit$die$

Calciumsignalwege.$So$$konnte$gezeigt$werden,$dass$für$die$Assoziation$der$PP2A$an$die$

LETypECalciumkanäle$ die$ α1cEUntereinheit$ wesentliche$ Funktion$ erfüllt$ (Davare$ et$ al.$

2000),$gleichzeitig$sind$aber$auch$die$regulatorischen$Untereinheiten$der$PP2A$für$die$

Substratassoziation$verantwortlich$und$notwendig$(Rodgers$et$al.$2011;$siehe$5.8.).$Ein$

verändertes$ Assoziationsverhalten$ zwischen$ diesen$ beiden$ Proteinen$ könnte$

demzufolge$Einfluss$auf$die$Phosphorylierung$der$α1cEUntereinheit$haben$und$dadurch$

den$Calciumeinstrom$ (ICaL)$modifizieren,$was$wiederum$das$Calciumgleichgewicht$der$

Kardiomyozyten$beeinflussen$dürfte$(siehe$5.4.).$Für$diese$Überlegung$scheint$sich$auch$

insofern$ ein$ Hinweis$ zu$ finden,$ als$ dass$ sich$ der$ schwache,$ dennoch$ signifikante$

Zusammenhang$ zwischen$ elektrophysiologischer$ Alteration$ (CACNA1CE

Expressionsänderung)$ und$ PPP2R5BEExpressionsänderung$ unter$ Einwirkung$ von$

Irbesartan$ deutlich$ verstärkt.$ Somit$ stellt$ die$ PP2A$ nicht$ nur$ ein$ reguliertes,$ sondern$

auch$ ein$ regulierendes$ Signalglied$ dar,$ was$ eine$ Schlüsselrolle$ für$ diese$ Phosphatase$$

bei$der$Wirkung$von$Irbesartan$unter$rapidEpacing$sehr$nahe$legt.$

$

5.10.+Einfluss+der+HAND15Expression+auf+die+PPP2R5B5Expression+

Da$ sich$ eine$ niedrigere$ Expressionsänderung$ von$ PPP2R5B$ bei$ positiver$ HAND1E

Expressionsänderung$unter$rapidEpacing$ im$Vergleich$zu$einer$negativen$zeigt,$könnte$

hier$angenommen$werden,$dass$diese$beiden$transkriptionellen$Ereignisse$miteinander$

in$ Zusammenhang$ stehen.$ Wenn$ Hand1$ einen$ direkten$ Einfluss$ auf$ die$ PPP2R5BE

Expression$ ausübt,$ müsste$ dieser$ in$ Anbetracht$ der$ geringeren$ positiven$ PPP2R5BE

Expressionsänderung$ inhibitorischer$ Natur$ sein.$ Dennoch$ sind$ auch$ alle$ alternativen$

Regulationsmöglichkeiten,$ die$ unter$ 5.7.$ bereits$ beschrieben$ wurden,$ denkbar.$

Gleichwohl$könnte$die$ Induktion$von$PPP2R5B$umgekehrt$ inhibitorischen$Einfluss$auf$

die$HAND1EExpression$ausüben,$indem$die$zur$Induktion$führenden$Signale$durch$diese$

5.$Diskussion$$

$ 91$

unterbunden$ werden.$ Auch$ hier$ bedarf$ es$ weiterer$ Untersuchungen,$ um$ diesen$

Zusammenhang$aufklären$zu$können.$

$

5.11.+Hand15Überexpression+

Die$in$dieser$Arbeit$durchgeführte$Überexpression$von$HAND1$konnte$keine$deutlichen$

Effekte$ auf$ die$ untersuchten$ Gene$ offenbaren.$ Zwar$ fand$ sich$ auf$ transkriptioneller$

Ebene$eine$sehr$deutliche$Expressionssteigerung$von$HAND1,$dennoch$konnte$hier$für$

das$im$Ventrikel$bekannte$Zielgen$βEcatenin$(Breckenridge$et$al.$2009)$keine$Erhöhung$

der$Expression$nachgewiesen$werden.$Dies$stimmt$mit$Befunden$von$Breckenridge$und$

Kollegen$ überein,$ die$ bei$ Hand1EÜberexpression$ im$ Vorhof$ ebenfalls$ keine$

Expressionssteigerung$ von$ βEcatenin$ nachweisen$ konnten$ und$ dies$ mit$ dem$ Fehlen$

eines$ Dimerisierungspartners$ in$ Verbindung$ brachten$ (Breckenridge$ et$ al.$ 2009).$

Dennoch$wären$mehrere$Ursachen$denkbar:$$

1. fehlender$oder$modifizierter$Dimerisierungspartner$

2. situationsbedingte$ differentielle$ Modifikation$ mit$ alternativer$ Dimerbildung$ und$

unterschiedlicher$transkriptioneller$Aktivität$

3. subzelluläre$Separierung$potenzieller$Dimerisierungspartner$

4. situationsbedingte$extranukleäre$Lokalisation$von$Hand1$

5. Übergewicht$ artifizieller$ Hand1EDimere$ aufgrund$ unphysiologisch$ hoher$ Hand1E

Konzentration$

6. Blockade$der$Translation.$

Auch$ nach$ Berücksichtigung$ nur$ derjenigen$ Experimente,$ die$ eine$ positive$ βEcatenin$

Expression$zeigten,$konnten$weder$weitere$noch$größere$Effekte$auf$die$untersuchten$

Gene$ nachgewiesen$ werden.$ So$ muss$ auch$ angenommen$ werden,$ dass$ βEcatenin$ in$

atrialen$Kardiomyozyten$unter$diesen$Bedingungen$kein$Hand1EZielgen$darstellt.$

Unabhängig$ von$ der$ βEcateninEExpression$ fand$ sich$ bei$ HAND1EÜberexpression$ die$

PPP2R5B$ signifikant$ schwach$ erhöht.$ Dies$ entspricht$ genau$ der$ entgegengesetzten$

Regulation,$ die$ bei$ rapidEpacing$ und$ gleichzeitiger$ Irbesartanstimulation$ beobachtet$

werden$ konnte.$ Somit$ kann$ geschlussfolgert$ werden,$ dass$ diese$ gleichzeitig$

einwirkenden$ Stimuli$ nicht$ nur$ die$ Expression$ von$ HAND1$ verursachen,$ sondern$

zusätzlich$ das$ transkriptionelle$ Verhalten$ durch$ situationsspezifische$ Modifikationen$

beeinflussen,$wodurch$die$alleinige$Überexpression$von$HAND1$als$ungeeignetes$Modell$

für$dessen$funktionelles$Verständnis$bei$VHF$erscheint.$

Für$die$vorliegenden$Experimente$gilt$folglich$zu$klären:$

5.$Diskussion$$

$ 92$

1. welche$Stimuli$und$Signalwege$zu$einer$gesteigerten$HAND1EExpression$führen,$$

2. wie$Hand1$in$seinem$Aktivitätsspektrum$beeinflusst$und$gesteuert$wird,$$

3. ob$es$aktivierend$oder$inhibitorisch$wirkt$und$$

4. welche$ Gene$ unter$ den$ entsprechenden$ Stimulationsbedingungen$ durch$ Hand1$

transkriptionell$reguliert$werden.$

$

5.12.+Unterschied+zwischen+in+vivo+und+in+vitro5Befunden+

Bei$ Vergleich$ der$ in$ vivo$ und$ in$ vitro$ Untersuchungen$ zeigt$ sich$ ein$ deutlich$

unterschiedliches$ Expressionsmuster$ der$ beiden$ untersuchten$ potenziellen$ Hand1E

Zielgene$(E2F8,$PPP2R5B).$Dies$ist$besonders$deutlich$für$die$Expression$von$PPP2R5B$

zu$erkennen,$welches$in$vivo$eine$Expressionsreduktion$durch$simuliertes$VHF$erfährt,$

in$ vitro$ jedoch$ eine$Expressionssteigerung.$ Ebenso$ findet$ sich$die$E2F8EExpression$ in$

vivo$durch$simuliertes$VHF$vermindert,$in$vitro$unter$rapidEpacing$jedoch$unverändert.$

Für$diese$Expressionsunterschiede$sind$folgende$Erklärungen$denkbar:$

Bei$den$in$vivo$Experimenten$handelt$es$sich$um$vollständiges$Vorhofmyokard,$welches$

sich$ aus$Kardiomyozyten,$ Fibroblasten,$Myofibroblasten,$ Endothelzellen$ und$weiteren$

Zelltypen$ zusammensetzt.$ Die$ Erfassung$ der$ Expression$ mittels$ Microarrays$

ermöglichte$ in$ diesem$ Modell$ keine$ Unterscheidung$ zwischen$ diesen$ Zellarten,$

demzufolge$ auch$ keine$ Zuordnung$ einzelner$ Expressionsänderungen$ zu$ spezifischen$

Zelltypen.$Somit$handelt$es$sich$bei$der$Erfassung$der$transkriptionellen$Aktivität$im$in$

vivo$ Schweinemodell$ folglich$ nicht$ um$ eine$ reine$ kardiomyozytäre$ Charakterisierung.$

Im$ in$ vitro$ HL1EModell$ wurden$ hingegen$ nur$ atriale$ Kardiomyozyten$ untersucht,$ so$

sind$die$dort$erfassten$Expressionsänderungen$spezifisch.$Jedoch$handelt$es$sich$bei$der$

HL1EZellinie$um$immortalisierte$Kardiomyozyten,$die$aus$der$atrialen$Tumorlinie$ATE1$

abgeleitet$wurden$(siehe$3.1.4.),$sodass$ein$teilweise$unphysiologisches$Verhalten$nicht$

vollends$ausgeschlossen$werden$kann.$Zwei$weitere$Nachteile$der$HL1EKultur$ergeben$

sich$aus$dem$Fehlen$(I)$der$zellulären$Interaktion$mit$anderen$Zelltypen,$vor$allem$mit$

Fibroblasten,$und$(II)$einer$physiologischen$Extrazellulärmatrix$(ECM).$Letztere$ ist$ für$

die$ Differenzierung$ und$ Ausbildung$ eines$ funktionsfähigen$ Gewebes$ von$ besonders$

bedeutender$ Rolle,$ das$ Fehlen$ könnte$ folglich$ Signalwege$ der$ Differenzierung$

beeinflussen,$ die$ auch$ die$ oben$ untersuchten$ Faktoren$ betreffen$ und$ so$ von$ der$

physiologischen$Reaktion$abweichende$Ergebnisse$verursachen.$Selbiges$muss$auch$für$

die$ in$ vivo$ Experimente$ gelten,$ da$ eine$ Zuordnung$ einzelner$ Expressionen$ zu$ dem$

entsprechenden$ Zelltyp$ nicht$ möglich$ ist,$ lassen$ diese$ zwar$ eine$ Beurteilung$ der$

5.$Diskussion$$

$ 93$

Gesamtsituation$zu,$erlauben$ jedoch$keine$zellspezifische$Aussage$und$damit$auch$nur$

eine$eingeschränkt$differenzierte$Aussage$über$kardiomyozytäre$Signalwege$und$deren$

Regulation.$So$scheint$es$ebenfalls$plausibel,$dass$ein$Komplexgewebe$im$gesamten$eine$

von$ einer$ Monokultur$ unterschiedliche$ transkriptionelle$ Reaktion$ auf$ den$ gleichen$

Stimulus$ zeigt.$ Denkbar$ wäre$ in$ diesem$ Zusammenhang$ allerdings$ auch,$ dass$ es$

speziesspezifische$Unterschiede$ in$der$Reaktion$auf$ simuliertes$VHF$respektive$ rapidE

pacing$gibt$und$sich$daher$die$Expressionen$unterscheiden.$

Es$ müssen$ folglich$ die$ Ergebnisse$ aus$ beiden$ experimentellen$ Modellen$ vor$ dem$

Hintergrund$ihrer$VorE$und$Nachteile$betrachtet$werden$und$können$nicht$unmittelbar$

miteinander$ verglichen$ werden.$ Weitere$ Experimente$ zu$ oben$ genannten$

Fragestellungen$ sind$ nötig,$ um$ die$ regulative$ Vernetzung$ der$ IrbesartanEabhängigen$

Signalwege$ und$ deren$ Auswirkung$ auf$ die$ transkriptionelle$ Aktivität$ bei$ VHF$ weiter$

aufklären$ zu$ können$und$ so$ ein$ besseres$Verständnis$ für$ die$ protektive$Wirkung$ von$

Irbesartan$zu$gewinnen.$

$

Zusammenfassend$ zeigen$ die$ Ergebnisse$ der$ vorliegenden$ Arbeit,$ dass$ die$ aus$

Vorarbeiten$ bekannten$ Effekte$ von$ Irbesartan$ auf$ die$ atriale$ Genexpression$

(Transkriptom)$ bei$ simuliertem$ VHF$ in$ vivo,$ zumindest$ teilweise$ durch$ das$

Vorhandensein$ von$ V$HAND1E47_01$ Bindungsstellen$ in$ den$ Promotoren$ IrbesartanE

regulierter$Gene$ erklärbar$ ist.$ In$nachfolgenden$ rapidEpacing$Experimenten$mit$HLE1E

Kardiomyozyten$in$vitro$zeigte$sich,$dass$dieser$IrbesartanEEffekt$nicht$unabhängig$ist,$

sondern$erst$unter$den$Bedingungen$des$VHF$(rapidEpacing)$zum$Tragen$kommt.$Diese$

Beobachtung$wurde$ an$ den$ beiden$ potentiellen$ Hand1EZielgenen$ E2F8$ und$ PPP2R5B$

gemacht.$ Die$ Tatsache,$ dass$ die$ erhöhte$ Hand1EExpression$ sowohl$ mit$ einer$

Suppression$als$auch$Induktion$von$potentiellen$Zielgenen$assoziiert$ist,$deutet$auf$die$

Beteiligung$ und$ Vernetzung$ mehrerer$ Signalwege$ bei$ der$ Regulation$ IrbesartanE

abhängiger$Genexpression$hin.+

6.$Zusammenfassung$$

$ 94$

6.+Zusammenfassung+

Tachyarrhythmie$ in$ vivo$ und$ in$ vitro$ verursacht$ eine$ massive$ Alteration$ des$

Transkriptoms$ des$ Vorhofs$ bzw.$ der$ Kardiomyozyten,$ welche$ durch$ Irbesartan$

teilweise$ reversibel$ sind.$ Mögliche$ Mechanismen$ der$ differentiellen$ Beeinflussung$

dieses$Expressionsverhaltens$ sollten$ sowohl$ in$ einer$vergleichenden$Promotoranalyse$

als$auch$in$in$vivo$und$in$vitro$Experimenten$untersucht$werden.$

Die$ vergleichende$ Promotoranalyse$ IrbesartanEregulierter$ Genen$ bei$ simuliertem$

Vorhofflimmern$in$vivo$im$Schwein$zeigte$das$signifikant$häufigere$Vorhandensein$der$

Transkriptionsfaktorbindungsstelle$ V$HAND1E47_01$ in$ Promotoren$ der$ durch$

Irbesartan$ supprimierten$Gene.$Mit$ steigendem$ Irbesartaneffekt$ nimmt$die$Häufigkeit$

dieser$Bindungsstelle$signifikant$ab.$

In$ vitro$ konnte$ an$ murinen$ HL1EKardiomyozyten$ unter$ rapidEpacing$ und$ bei$

gleichzeitiger$ Irbesartaninkubation$ eine$ Induktion$ der$ Hand1EExpression$ gezeigt$

werden,$ simuliertes$ Vorhofflimmern$ in$ vivo$ respektive$ rapidEpacing$ in$ vitro$ allein$

zeigen$keinen$signifikanten$Effekt$auf$die$Expression.$

Für$die$aus$der$Promotoranalyse$abgeleiteten$hypothetischen$Hand1ETargetgene$E2F8$

und$ PPP2R5B$ wurde$ in$ vitro$ ein$ zu$ den$ in$ vivo$ Daten$ deutlich$ unterschiedliches$

Expressionsverhalten$beobachtet.$Aus$den$ in$vitro$Daten$ lässt$ sich$die$Vermutung$der$

gegenseitigen$ Beeinflussung$ dieser$ Faktoren$ und$ Verschränkung$ des$ ReninE

AngiotensinENetzwerks$ und$ Calciumsignalings$ ableiten.$ Es$ scheint$ unter$ rapidEpacing$

und$ gleichzeitiger$ Irbesartaninkubation$ in$ vitro$ ein$ proliferationsE$ und$

regenerationsförderndes$ Milieu$ zu$ entstehen,$ welches$ die$ protektiven$ Eigenschaften$

der$ Angiotensin$ IIEAntagonisten$ bei$ Vorhofflimmern$ erklären$ könnte.$ Hierbei$ könnte$

Hand1$auf$transkriptionsregulierender$Ebene$eine$Schlüsselrolle$spielen.$

Überexpressionen$von$Hand1$lieferten$keine$eindeutigen$und$sicheren$Ergebnisse.$

+

7.$Anhang$$

$ 95$

7.+Anhang+

7.1.+Anhang+für+Material+und+Methoden+

Tab.+751:+Primerpaare+für+real5time+PCR+(mus+musculus)+

Gen+(Länge)+

Primersequenz+ annaeling5+Temperatur+

CACNA1C$(157$nt)$

US:$5’ECCA$ACA$TGA$ATG$CCA$ATG$CAG$CE3’$DS:$5’ETGT$GTG$GAA$CTG$ACG$GTA$GAG$AE3’$

63,5°C$

βEcatenin$(140$nt)$

US:$5’EGCT$GCT$GTC$CTA$TTC$CGA$ATG$TE3’$DS:$5’EGCA$CCA$ATG$TCC$AGT$CCA$AGA$TE3’$$

63,5°C$

E2F8$(188$nt)$

US:$5’EGTCTGTGGCCGTCTTCTCAGCAE3’$DS:$5’ECTGCAGTGCCTGTGATCCTACCE3’$

63,5°C$

Hand1$(286$nt)$

US:$5’ECCA$TCA$TCA$CCA$CTC$ACA$CCE3’$DS:$5’ETGC$GTC$TCC$TCT$CCT$TCT$TGE3’$

62,3°C$

P0$(344$nt)$

US:$5’EGCA$CTT$TCG$CTT$TCT$GGA$GGG$TGTE3’$DS:$5’ETGA$CTT$GGT$TGC$TTT$GGC$GGG$ATTE3’$

62°C$

PPP2R5B$(160$nt)$

US:$5’ECTT$GTA$GGA$GGC$TGT$GAG$CTC$GE3’$DS:$5’EGGA$CAA$CTG$CCA$CAC$TGT$GCT$GE3’$

63,5°C$

$$$$$$$$+1+++++++++++++++2+++++++++++++++3++++++++++++++++4+++++++++++++++5+++++++++++++++6++++++++++++++++7+

+Abb.+751:+1,5%iges$Agarosegel$gefärbt$mit$RedSafeTM$zum$Nachweis$reiner$PCREProduktbanden$(mus$musculus).$Spur$1:$ βEcatenin$ (140$nt);$ Spur$2:$ CACNA1C$ (157$nt);$ Spur$3:$ E2F8$ (188$nt);$ Spur$4:$Hand1$(286$nt);$Spur$5:$$P0$(344$nt);$Spur$6:$PPP2R5B$(160$nt);$Spur$7:$GeneRulerTM$DNA$Ladder$Mix$

+

+

100$nt$

200$nt$

300$nt$

400$nt$

500$nt$

7.$Anhang$$

$ 96$

Tab.+752:+Primerpaar+für+die+Herstellung+eines+Hand15Transkripts+mit+Restriktionsstellen+für+KpnI+und+XbaI+

Gen+(Länge)+


Hand1$(669$nt)$

$

KpnIEUS:$$5’ECAT$GGT$AC|C$ATG$AAC$CTC$GTG$GGC$AGC$TAC$GCA$CE3’$XbaIEDS:$$5’ECTG$TCT$AG|A$TCA$CTG$GTT$TAG$CTC$CAG$CGC$CCA$GE3’$

61°C$

+

Tab.+753:+Primerpaare+für+real5time+PCR+(sus+scrofa)+

Gen+(Länge)+


Hand1$(129$nt)$

US:$5’EGAG$GCG$CAC$AGA$GAG$CAT$TAA$CE3’$DS:$5’EATC$AGG$TAG$GCG$ATG$TAG$CTG$GE3’$

63°C$

P0$(255$nt)$

$

US:$5’ECAG$CAG$ATC$CGC$ATG$TCT$CTCE3’$DS:$5’EGGC$AGG$TAC$AGT$GAC$TTC$GCAE3’$

63°C$

+$+1+++++++++++++2++++++++++++++3+

+Abb.+752:+1,5%iges$Agarosegel$gefärbt$mit$RedSafeTM$zum$Nachweis$reiner$PCREProduktbanden$(sus$scrofa).$$Spur$1:$GeneRulerTM$DNA$Ladder$Mix;$Spur$2:$P0$(255$nt);$Spur$3:$Hand1$(129$nt)$

+

100$nt$

200$nt$

300$nt$400$nt$500$nt$

7.$Anhang$$

$ 97$

7.2.+Anhang+für+Ergebnisse+

7.2.1.+Promotoren+der+supprimierten+Gene+>NR4A3'Swine:'''Sus'Scrofa'(NR4A3)'1000'bp'sequence'5''to'Start'of'Coding'region''AGAGTGCTAA'TTATTCTATC'ATAGGAAAAT'ATGTAGATAA'CTCATCTCTT'ATGAGAACTG'TAAACTATTG'TCATCAAGTA'GCCACTGATA'TATTTTATTT'CTCAGAATTG'GTGGGAATAT'ATATATATGC'ATACATATAT'ATGTATATAT'ATTATATGAC'AGAGAGCAGG'TTTGGTGGGT'GTTTTGTTGC'AGCTGATCTT'TTTCTTTGCA'GATGGCTCAA'ACTCCCCCGA'GTCCATTTCC'TAGGCCTATA'TTCCCACCTC'ACCACCTAGT'TGGCTGAAAT'CATCAACAGG'GGTCCAGTTT'GAGCAGGCTG'CTAGCCCTGT'TTGGAGGAGT'AGAGAGGGGG'TGGGAGAAAG'CAACCACAAC'CATGTGTGGG'TAGCCTCAGC'TGGCACTCAT'AAAATGCTAA'AATGTCACTA'GGCCAGTAAG'TCCCATGTAG'GACACCTTTT'TTTTTTTTTC'TTTTTTCTTT'TTTCTTTTTC'TTTTACTAAC'TTATAGGTTT'ATAAATCAAA'GAGTGACTTG'GAGGACCAGT'GGCCTCTTTC'CCCCAAATAA'ACCAACAAGG'CATTCACTGG'CATCCTCTTT'GTCCTCCCAA'TTTATGGTGG'AGGTCACTCC'ATTTAAGCTA'TGGGGCTAAA'AACCACTTTT'AAAAGCACAA'CTGGGTTTAT'GAGGAAAGAC'ATCAAATTTC'TCAGGTCTGG'TGGAGGACAG'GGCAAGGGAA'GGAAGGTGGG'CACAGAGGTC'CCCAGGAGGC'CAGGTTTTGG'CCACCTGCGG'CCTCTTTGAC'AGTTTGTCAG'GGATTTAGCT'TTCTTTGGAT'GGAAGGAAGG'AAGACAGGAA'GGAAGGAAGG'CAGGCAGGCA'GGCAAGGCAG'GCAAGCAGGT'AGGCTTTAAA'TCTATGCTAC'TAGAGGGAGG'AAAGAATGTC'ACTTCCTCTC'TATTTCCCAT'TTTATTAAAC'AGCAATTAAT'CCATTGCTAC'CTATTAGCTA'GGAGGAGTAT'ATACTTGCTT'TGAGAGATCC'TTTTCCCTCT'CCCTGCAGAT''>E2F8'Swine:'''Sus'scrofa'(E2F8)'1000'bp'sequence'5''to'Start'of'Coding'region''GCCCCTGGGG'CCGCCAACCA'ATCGCAGGCC'CGCAGCTGGC'ACTCTCATTG'GCCGAGAATC'GTTGCCCTAG'AAACCGCGAA'GATGCGGTCC'GGGAACTGCC'CCGCTGGCGG'CGCGCGGACT'GGGCCCGGCG'GGGGAGGGGC'AGTTGGCCTG'GCGCAAGGGG'AAGTGCGCGG'GGCGCGGAGC'CGGTGGCGGC'GGGGAGACTG'TACCTGGTTG'CCTTACTGAG'CAAGTGCAGC'CTTCCATGGT'GGGCTCCAAC'ACTGTGGCCG'GAACTGGCCA'CCTGAATAGC'GAGTATACAG'CGCTTTAAGG'AAGCCGCATC'TTTAAAGTCT'TAAAAAAAAA'AAAAGTAGTT'GATCATAAGG'CACTCTTTAA'ATGTCCAGAG'TACGTTTGGA'GCTTAAGGAC'TGAATTTGGA'AGTTACCTAT'CAAGCTATTT'CCCAAGACTT'TACTGCTGAG'CCTATGCACG'TGCGTGTCAA'GGGAGAAATT'CCGGTAGCTA'GAAGCAGTCT'TTTATCCAGA'TACTTGGGGT'CCTATCTGTT'TAGCTGGAAC'CTGGGCTCGT'GCGCAGAGTC'CTGAGCTCTG'ATCTGTGAAC'AGGTGGGTGC'TTGTGCGTGC'TACAGTCCAC'TCAGTGGGGT'CTAGAAAATG'GTTTGCCTTC'TCTAAAGGTG'GAAGAGGGCT'GTCACTAAAA'ATTCTGTGGG'TTGCGTGAAG'TCTCACGACA'GCGGATCGGT'TTGCTGAAGG'AATTTACAAG'CATTTGATGG'CGATCTCTGC'CCCGTGGGGG'CTATCTGTGG'TCGGGAATAA'GATGTAAATG'TAGGCTGTCA'GTTTTCTTCA'GCCTTTGTTT'CAGAAGCCTG'CGGTGTCCAT'GAAGGTATTT'TCAACGGATC'TCCTGCTTTC'ATTTTTCTCT'AACTTTTTCT'ATTTCCTTCT'TCTTTAAGGA'TATTAAACTT'TTTAATTGGA'CTACTTGAAC'CACCAGGATT'TTAGGAAGAA'CTGCAGATTT'TTCATTTTTA'AAGAAACTAA'ATGTACGAGA'AATTTACAGA''>MYOM2'Swine:'''Sus'Scrofa'(MYOM2)'1000'bp'sequence'5''to'Start'of'Coding'region''TGCGCCTTTG'TAGAGAGCAA'GGGGCCCGGT'AAGGCTCCTT'TGTAGAGAGC'AAGTCGGTGT'GAACGTGTGT'ACTGTGACCA'TCTAAATGGC'CATCTAACGC'CTGCGCCGCC'TCAGATCCCC'ATGTCCCCAC'TGCAGGATGG'GTCTCAACCA'CTTCTTGTTT'GGGGGGAATT'TAACCAAAAT'GTGCTCACTT'CCCCACAGCC'CCAAGTCTCT'CCTGCTGGGC'TCAGTCCCCA'CCCCCACCCC'TCCCAGCCAA'GCAAGTGGGC'AAGTCGCCTA'TGAGGCGTGA'TTCTCCAAGT'GGGGCTGGAA'GGCCTCCTGG'GCATACATCC'TTTTCCAGGT'CCCCCTTCCA'GGCAGAAAGC'TGGCACATCT'TCTCCCTACA'AGGCTGCTAT'TTTCCAGAGC'CACTTGTCCC'GTCTCCTCCT'TCAAACCCTG'GGCTCCTGTA'CTTCCCTGCC'TCCTGCTGTA'CTCCTGGGAT'GCCCTCTGCC'ACCCCTGTGC'CCACCTGTCA'CCTCCCGTCT'CTCAGGACTC'TTCTCAAACG'CCACCTGCTG'CAGGGCTGCT'GGCTGCTATG'GGCTCCCCTC'TCACCCCCAG'TGTGTTTTGT'GTCTCTGTGC'CCTTATCTCC'TCTTCGCTTG'GATTCTAAGT'GTTTGTTTAC'TTCTCTGAGC'TCTGTTTTCA'TTATTTTTAT'CCTTATCACT'CACACTGCTC'TTGGAGTTGC'CTCAAACAAA'CTATTCCACG'GATAGCGGTT'GAGTTTAGAG'TTAAGTGAAA'CGTGTAACCC'AGTGTTGTAA'TTGTTACGGA'AGCAAACAAG'AAATCAGGTC'CCAGGGAACT'TACTAGGTGT'CCAAGATGAC'TTCTTCTGAT'AGAATCTTTC'TTTAACCCCC'TCCCCCCCAG'AAGGGTTTTA'TTAATTGGAG'TTGATTTGCC'CTTGGGAACC'ATGCAGCATG'TTGGTGTGGA'AATTGCAGGG'ACCTGAGTAA'TTTTGAAGTG'TCAGGGTCTC'AGCTCCATTT'GTCACACTTT'ACTGGTAGGT'GTACACAAAG''>CRABP1'Swine:'''Sus'scrofa'(CRABP1)'1000'bp'sequence'5''to'Start'of'Coding'region''AAGTCAACCC'ACATGATTAT'GTCATCTCCT'TGCTGGCAAA'GACAGAAATT'TTAAAGCACG'ATGACATACC'CGCCAGGTGG'GAAATGAGAT'GTGCTCCAAG'GTCTTCACTG'CGGTACTGTT'TCTAACAGTC'AAAGATCGGA'AACGACATCA'ATGTCCATCA'GGGGCCAGGC'TGGATAGACA'ATGGAATATC'CTGCAAAAGA'ATGAGGGTGC'TTTCTATGTA'TGGGTATGGA'AAGGGCTCCA'GAAGAGAGTA'AGTGGAAAAA'GAAAATCACA'GAACACTGCA'CAGTACTGTG'CTGCTAGTAG'GTAAGAGGGG'AGGAAAAATC'AACAGTAATT'GCTTGCATTT'GCATAAAGCA'GTGGATCTCA'AATTTCGCTC'TTCATCAGAA'CCACCCAGAG'GACTTTTATA'GCCATACTTA'CTTCAGGCAA'CATCAACCGT'GATTTTATTT'AGGGGAGGGA'TGTGGGGAGG'CCCCCACTTT'TCTCTCCCGG'AGTTGCATGG'CCCAGCTTTC'CACACCTCAC'AGATCTGGCT'GCCCACGTGG'AGTTTAAGAT'AAAAGCCTCT'AAAAGGCCTC'TTTCCCTAAT'GACTCCAGCA'AACCCAGGAG'ACTGTTTCCC'AACCTTCAAG'TGGCCGCCGA'ATGTGCATTC'AAGGCGTTTG'AAGGAATCCC'GTGGAAACCG'AAGAGTTGGG'GCAAGTAAAG'CACTTCCCGC'CCACCCCCGC'CCCTGCCCCC'GGCACCCGTC'TCCTCTTCCT'CAGTAAGGAA'GCGAACTGAA'GGTCTGAACC'CGGCTGAGGA'CAACCTGGCC'CGGCAACATC'CAGCCCCCGC'CCCACTGAGG'GGGGTGGAGC'GACGACTACG'GTGGATCCTC'CCGCCGGCTT'TGTGAGCCCT'CGGAATCCAG'CTGTCGCCGC'CCCACGAGCC'CCCTGCCCGG'AGGGCGCACA'TTTCCGGGCC'GCCCACCACC'CGGATCGCAC'CGCCAGCCGA'GAGCTGCTCC'TGCTTGCTCA'GTCCCCATCC'GGCCCCGGTT'GCCCCCAGAA''>H2AFY2'Swine:'''Sus'scrofa'(H2AFY2)'1000'bp'sequence'5''to'Start'of'Coding'region''

7.$Anhang$$

$ 98$

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TTCTGTGGGT'TACCTAATCT'AACAAGTGTC'GCCGTCCCCG'TTTTATAAAA'GAGCAAACCG'AAGCTCACAC'CACCTGCTCT'CCTGGTTGGC'CGGCTCCCAG'GGAAGAGGGG'AGATCCTTCC'AGGGGTAGCT'GGCGGGTGTC'AAGGTGGGAG'AGAAGGCCGC'CTGGGGCAGG'GGCCCCGGAG'GGTCCCCTTG'GGAAGAGCCG'AGAGGACGGC'TTCTTCCCCA'CGAACACCCA'GATCAGAGCG'GCAGGGCTGG'GGCACTGGCG'GGTGGTGGTC'TGGGCCCCGC'TGACTCCCCG'CCCCGGGCCG'GCCCCGGCCG'CGGGCGCTTC'CCGGTGCTCC'GGGGCAGTGA'GTCACCGCGG'GCAGGGCCGG'CCGCAGCGCA'TTCCTCCGTG'GGGCCGGCGT'CCGGGGCGGG'GTGGGGACCA'TGAGTCGCTC'CACGGGGCTG'GGGGGCTGGG'GCGCCGGGGG'AGAGGGGGAG'GGGGCCGCGG'GCTGCACACA'AGGGGGAGGG'GGTGACCTCG'GGGCGGGGGG'GGCGGTCCCC'GGCGAGGATG'CGGAGCGCAA'CCCGGGGGTG'GCCAGCCTGG'AGGGACCCGG'GCGGGTTGGG'CCCGGGAGTG'GGGCGCGGGC'GGAAGGGCCG'GGGGCGTGGC'CGAGAGGGGC'GTGCCCTGGA'GGGGCGGGGC'GGAGCGCGCG'GGGCGGGGCC'GCTATAAAGG'CTGCGTCCCG'GCGGCAGGAG'CGCACTGCCC'GCGCCGCCAC'CCTCCGAGCG'CGCCCGACCG'CGCCCGCAGC'ACCGGCCGAC''>SH3RF2'Swine:'''Sus'scrofa'(SH3RF2)'1000'bp'sequence'5''to'Start'of'Coding'region''TCTTATGGGA'GGAATAGTGT'CTCTGAGGCT'AAGATAATCG'AGGTGAGAAG'GCGGAAAAAA'AGAAATACAG'AAGGAAAGGA'AAGGAAGGCA'AGAAAGAAAA'ACCTTCCAAA'CTGCATGGCC'TGTAATTGAG'ACAAAACAAT'GTTTGAAAAT'CAGTTTCTAG'TAGAAATGTT'TCTGGGACAT'TGGTAGAAGG'AAATAACAGG'GGAAGATGTG'GAAGAAATAG'TTCGGAGAGT'TACTGTTGTG'GCTCAGCGGT'AATGAACCTG'ACTAGGATCC'ATGAGGTTGT'GGGCTTGATC'CCTGGCCTCT'CTCAGTGGGT'TAAGGATCCA'GCATTGCCAT'GAGCTGTGGT'GTGGGTCGCA'GATGAGGCTC'AGATCCAGCT'TTGCTGTGGC'TGTGGTGTAG'GCCGGCAGCT'GTAGCTCTGA'TTCAACCCCT'GACCTGGTAA'CTTCCATATG'CCATGGGTGC'AGCCCTAAAA'AAGCAAAAAG'CAACCCCTAC'CTTCCACCAC'CTCCCAAAAA'AAAGAGTCAG'TAGCTTCACA'GAAATGGTGT'CCTGAGGAGC'CTGTCATTTG'AGAACCAGGA'GGACTGGTTG'AAGGCTTTAC'CCCTCAGAGC'CCTGGCTGGG'AACAGGGGCT'GGCTCTGCCC'CCTAAAGAGG'CCAGCCTTGC'CCCCCCCTCA'CCCCACTCCC'ACCTTGCACA'TGGAGAGGCA'GGGCATGAGT'AGGCAGGGGC'TGTGTCACTG'CCCCCTCCAT'CCTGCAGCAG'GCAGGAGCCG'AGGTGTATAC'CCGCTCGTAC'CGAATCAGAA'TGAGTCATCT'GAAACGGGTG'CTGGAACAAA'GTCCTTGCAA'ACTGCCTTAT'GAGACACTGC'CTCCGTGTAG'GTGGGTACAC'CTTCTCAGAG'CAGTCACAAG'TCTTCTGTCT'CTTCTTCCTC'CCCCTTCAAA'CAGGCAGGCC'TCCCGACACT'CTCGGGACTG'CGCCTGTGGC'TCAGCCAGGC'CGCCATGCAG'ACTCTGCCCC'CCCAGGTCAA'GACTGGCGTT'TTAAAATAAA''>MAFF'Swine:'''Sus'scrofa'(MAFF)'1000'bp'sequence'5''to'Start'of'Coding'region''GTTCCTGCTG'TGGTGCAGTA'GGTTCATGAT'CCAGCCTGTT'TCTGTGGAGG'CACCAGTTTG'ATCCCCAGCC'CAGTGCAGCG'TTGCTGCAGC'TGTGGTGCAG'GCTGAAGCTC'CGGCTCAAAT'TTGATTCCTG'GCCTGGGAAC'TTCCATATGC'CATGGGTACG'ACCAAAAAAA'GAAAAAAGAA'AAAAATAAAT'AAAATTCCCA'GGTGGAAGAA'TGGATGGGGG'AGGGAGGGGT'GCACTGGTGC'ATATATATTT'GTGAGCACCT'ACTATGTGCC'AGCACTTACT'TAGGCAGTGG'TAGGACAGGC'AGGTCCTTGA'CCCTCATGGA'CTCACATTTT'GGAGGAGAAG'GGGTGAAAGC'AAGAGACAGA'CCACAAACAA'GCCATCGCAA'TGACTACAGA'GACCCTCATG'TGGGCTAGTA'AATGGGGCTC'TGTGACATGG'CACAAAGGGT'TTTCTCACCA'GATAGTCAGA'CCTCTTTGAA'GAGGTGGCAT'TGAGCAAAGA'CCCAAATGTT'GAAGAGTCTA'TGGGGAGATA'AAAGGGAAGA'GAACAGTGGA'GTTCCTGCTG'TGGTGCAAGG'GGATCCATGG'TGGCCGTGCA'GCCGCAGGGA'CACATGTTCA'ACCCCTGGCC'TGGCACAGTG'GGTTAAGGAT'CCAGCGTTGC'CACAGCTGTG'GTATAAGTTG'CAAGTGAGGC'TCATATTCAA'TCCCTGGCCC'GGAAACTCCA'TGTGCCTCGG'GGCAGCCAAA'GAGGAAAAAA'AGAAAAAAGG'AAAAAAAGGA'AAAAGGACGG'GAAGGAGAAC'AGCAAGTGCA'AAGGCCCTGA'GGCTGGAATG'AACCATTTAA'TGAGGCCAAT'GTGCCCGGAC'CACTGGGACA'GAGGAAAGTG'GTATGAGATG'AGTTCTGAGA'GAGCAGGGGC'CTTGAATACC'AAGATAGTGA'GTTTGGATTT'TGTTCTAAGT'GAAAAAAACA'AAACAAAACA'AAACTGACCT'TGGCCTCTTC'TCTCTCCTAG'GTCTCAGCCG'GGAGGGCACC'TTTTGCAAAC''>S100A9'Swine:'''Sus'scrofa'(S100A9)'1000'bp'sequence'5''to'Start'of'Coding'region''AGGGCAGGGG'ATGGTTGCAG'GCTGCAGGCT'GTGCTTCCTC'CATTAGCCAA'ACAACGGAGG'GCAGCCGCCC'ACCCACGCCC'CCGCCCTCCT'AAGAGCACTA'GTCACAGGGA'TGGGCGGGAA'CAGGAAGGCT'CAGCCATCCA'GCGCCTCCTT'CCCGCCCCCC'CCGCCCCCAT'GTGGGGCTGC'CCCCAAGGGG'GAGGCAGAGT'GGGTCCGGCC'CCCAGCCCCT'GGCTAGCACA'GGTGGGAAGG'TGCAACCTCA'ACGTTGGCAG'GGGGACAGAG'GGGACATGGG'GGAGAGGCAG'CTTGCAGATT'TGTTCAGAGA'GGGCAGGGGT'GTGGGATGGA'GGGGAAGTGG'ACTAAGCAAC'CAGCTTCCTC'CCAAACCAGC'TCCAGGCCAG'GGCTGGGAAT'TTCACAAAAA'GGCAAAAAGA'CTTATGTGAA'CATTTCCTGT'CTTGGCCCAG'CCCCCTTCCT'GGCAGCGACA'GCCCCACTGG'GGGTTACCAC'ATGGCTCACC'TGTGAAGCAA'TCTTCCCGCG'AGAGGGCTGA'GTGTCTCAGC'CAGAGCCCTA'TAAATGCTGG'GCCCGCTCCT'TGCTGTCCAA'CCCCTCTGTG'TGGCTCCTGG'GCTTGGGTAA'GTGAGCCACC'AGCTACCCTG'CCTGCTGAAC'AAGAGCCCGC'CTGCTGCCTC'TCTGCTCCCT'TCACCCATCT'TGCTTTCACA'CCCCCCCCCC'CCCATCCTGG'AAGCCCTCCT'TGATTGACTG'CCCACTCTAA'AAGCCTCCTT'CCCACTTTCT'TCGATTGCGT'TCTGCTGCAG'CCTCCTGTCC'TCAAAGGCTC'TGCTCTTTGG'CATTCTCTAG'ACATCCTGTA'AACCCTTCAT'TCCTCCCCTG'GGTGGAGTAG'AGTCGTCTCC'CAGTTCAGTT'GCAGCCCCTG'CTTTCATTTT'ATTCTCTTTC'CCCCTTCATT'CCTGCGTGCA'GTGATAGGAG'GTGTCGGGGA'AGCTCTCCTT'CTGAACGTGC'AAACCCTTGC'TTCTCCATTG'CTCAGACAGA'GTGCAGGAAG''>ABHD5'Swine:'''Sus'scrofa'(ABHD5)'1000'bp'sequence'5''to'Start'of'Coding'region''GAGTACCAGA'TAAGTGACAT'ATAGTTTGGA'TTATTGGGAC'TCGGAGGAGA'GAAAAAGGGG'CTGCAGTGAC'AGAGAAGAGT'TAGGAAGAGT'GATGAACTGT'GTCTAAAACA'AAGCATAATA'TATTAGCGTA'GGTTCCTTTA'AGGCACAAGC'CCTATTTCAA'TTCACTGTTT'CTCAGTGCCT'AGAACAGAGC'GGGCACTTAG'CAGGCGAAAG'GTAAATACAA'ATTAATGACT'AGTAGAGAGT'GATGCAACTA'CAAAAGCAGG'TAGAAGCTGA'TGAGGAAGAC'TCGAAAACAG'GTCAAGCGTT'GTTGCTATTT'ACATTAGCGA'TCCCCTTCAA'GAACTCTAAG'TACCGAAATG'CTGACTCTTT'ACCTTCTCCT'AGGTGCATAG'AGCGTGGGGT'GGACGGAAAT'TGCTGGCTTT'GGTCATCATT'GTAACCCCAG'CGCCTGGAGC'AGTGTCCCGC'ACATTGGTGA'ATATCGAATG'ACTGAGTCCT'AGGAGTCGCC'CTCTCCCCTT'AGCCACCCAC'CTGTAGGAAA'GGGCCGGCCG'CAGGCCACAG'CTCCTTCATC'AAAGCTTTTC'CGTTCGCTAT'TGCAGCAACT'ATCGAATACT'ACCTTGGCTC'TTCAGCGGAA'GGTAGCGCCT'CAGTCCCGAG'GGAAATGCTA'GGTACCCGTC'CAGTGTCCAG'CACGTGACAA'TAAGTATCAG'AGAATGAGGC'ATTAATACAG'TCATTATGGA'AATTAGTTAC'CACCTAACTC'AACCAGGGAG'TCTCACCGGT'TCCTCCAGGC'TGACAGTCTT'GCGCAGCGAC'CGCACCAGAG'CGCGTCAGAC'

7.$Anhang$$

$ 102$

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7.$Anhang$$

$ 103$

7.2.3.+Bindungsstellenvorhersage+für+die+Promotoren+der+supprimierten+Gene+

7.2.3.1.+NR4A3+The'name'of'your'search'is:' ''' ' Promoter'Search'for'sites'by'WeightMatrix'library:' matrixTFP60.lib'Sequence'file:'''' ' ' ' NR4A3.seq'Matrix'groups:'''' ' ' ' vertebrates'Cut]offs:' ''' ' ' ' to'minimize'the'sum'of'both'error'rates'Scanning'sequence'ID:'NR4A3_0'View'a'of'the'following'search'results''matrix''''''''''''''''''''position''core'''matrix'sequence'(always'the'''''''''''''''factor'name'identifier''''''''''''''''(strand)''match''match''(+)]strand'is'shown)''V$HNF1_C'''''''''''''''''''''5'(+)''0.942''0.849''tGCTAAttattctatca''''''''''''''''''HNF]1'V$EVI1_04'''''''''''''''''''12'(])''0.772''0.770''tATTCTatcatagga''''''''''''''''''''Evi]1'V$GATA1_03''''''''''''''''''31'(+)''1.000''0.972''atgtaGATAActca'''''''''''''''''''''GATA]1'V$FOXJ2_02''''''''''''''''''61'(])''0.948''0.894''taaactATTGTcat'''''''''''''''''''''FOXJ2'V$SOX9_B1'''''''''''''''''''63'(])''1.000''0.927''aactATTGTcatca'''''''''''''''''''''SOX]9'V$OCT1_Q6'''''''''''''''''''64'(])''0.776''0.801''actaTTGTCatcaag''''''''''''''''''''Oct]1'V$CAAT_01'''''''''''''''''''77'(+)''0.944''0.944''agtagCCACTga'''''''''''''''''''''''CCAAT'box'V$HNF3B_01''''''''''''''''''86'(+)''1.000''0.931''tgataTATTTtattt''''''''''''''''''''HNF]3beta'V$FOXD3_01''''''''''''''''''88'(+)''0.944''0.881''atATATTttatt'''''''''''''''''''''''FOXD3'V$IK1_01'''''''''''''''''''109'(+)''1.000''0.954''tggtGGGAAtata''''''''''''''''''''''Ik]1'V$OCT1_02''''''''''''''''''121'(+)''1.000''0.911''atataTATGCataca''''''''''''''''''''Oct]1'V$OCT1_Q6''''''''''''''''''201'(])''1.000''0.843''tttcTTTGCagatgg''''''''''''''''''''Oct]1'V$ZID_01'''''''''''''''''''213'(+)''1.000''0.892''tGGCTCaaactcc''''''''''''''''''''''ZID'V$PAX4_01''''''''''''''''''246'(])''0.881''0.782''ctatattcccaCCTCAccacc''''''''''''''Pax]4'V$IK1_01'''''''''''''''''''247'(])''1.000''0.954''tataTTCCCacct''''''''''''''''''''''Ik]1'V$OCT1_Q6''''''''''''''''''390'(+)''0.883''0.805''taaaatGCTAAaatg''''''''''''''''''''Oct]1'V$OCT1_06''''''''''''''''''399'(])''1.000''0.923''aaaaTGTCActagg'''''''''''''''''''''Oct]1'V$USF_Q6'''''''''''''''''''404'(+)''0.945''0.931''gTCACTaggc'''''''''''''''''''''''''USF'V$FOXD3_01'''''''''''''''''436'(+)''0.906''0.884''ctTTTTTttttt'''''''''''''''''''''''FOXD3'V$FOXD3_01'''''''''''''''''437'(+)''0.906''0.886''ttTTTTTttttt'''''''''''''''''''''''FOXD3'V$FOXD3_01'''''''''''''''''438'(+)''0.906''0.886''ttTTTTTttttt'''''''''''''''''''''''FOXD3'V$FOXD3_01'''''''''''''''''442'(+)''0.906''0.875''ttTTTTTtcttt'''''''''''''''''''''''FOXD3'V$EVI1_04''''''''''''''''''461'(])''0.842''0.750''tTTCTTtttctttta''''''''''''''''''''Evi]1'V$EVI1_04''''''''''''''''''467'(])''0.842''0.784''tTTCTTttactaact''''''''''''''''''''Evi]1'V$GFI1_01''''''''''''''''''486'(+)''1.000''0.957''ggtttataAATCAaagagtgactt'''''''''''Gfi]1'V$AP1_Q2'''''''''''''''''''502'(+)''1.000''0.962''agTGACTtgga''''''''''''''''''''''''AP]1'V$AP1_Q4'''''''''''''''''''502'(+)''1.000''0.931''agTGACTtgga''''''''''''''''''''''''AP]1'V$USF_Q6'''''''''''''''''''514'(])''0.931''0.925''gaccAGTGGc'''''''''''''''''''''''''USF'V$RREB1_01'''''''''''''''''531'(+)''1.000''0.894''cCCCAAataaacca'''''''''''''''''''''RREB]1'V$FOXD3_01'''''''''''''''''539'(])''1.000''0.893''aaaccAACAAgg'''''''''''''''''''''''FOXD3'V$HNF4_01''''''''''''''''''560'(])''1.000''0.857''gcatcctCTTTGtcctccc''''''''''''''''HNF]4'V$OCT1_06''''''''''''''''''658'(])''0.964''0.920''gacaTCAAAtttct'''''''''''''''''''''Oct]1'V$E47_01'''''''''''''''''''737'(])''1.000''0.967''ttggccACCTGcggc''''''''''''''''''''E47'V$MYOD_01''''''''''''''''''739'(])''1.000''0.922''ggccACCTGcgg'''''''''''''''''''''''MyoD'V$TGIF_01''''''''''''''''''754'(])''1.000''0.959''cttTGACAgtt''''''''''''''''''''''''TGIF'V$OCT1_Q6''''''''''''''''''780'(])''0.824''0.819''tttcTTTGGatggaa''''''''''''''''''''Oct]1'V$ELK1_02''''''''''''''''''801'(+)''0.938''0.923''aagacAGGAAggaa'''''''''''''''''''''Elk]1'V$GFI1_01''''''''''''''''''851'(+)''0.960''0.944''aggctttaAATCTatgctactaga'''''''''''Gfi]1'V$GATA3_03'''''''''''''''''856'(])''0.968''0.961''ttAAATCtat'''''''''''''''''''''''''GATA]3'V$ELK1_01''''''''''''''''''887'(])''1.000''0.888''tgtcaCTTCCtctcta'''''''''''''''''''Elk]1'V$CDPCR1_01''''''''''''''''922'(])''0.794''0.836''gcaaTTAATc'''''''''''''''''''''''''CDP'CR1'V$CDPCR1_01''''''''''''''''926'(])''0.910''0.836''ttaaTCCATt'''''''''''''''''''''''''CDP'CR1'V$CDPCR1_01''''''''''''''''928'(+)''0.847''0.873''aATCCAttgc'''''''''''''''''''''''''CDP'CR1'V$HNF4_01''''''''''''''''''973'(])''0.883''0.787''agagatcCTTTTccctctc''''''''''''''''HNF]4'''Total'sequences'length=1000''Total'number'of'sites'found=44''Frequency'of'sites'per'nucleotide=0.044000

7.$Anhang$$

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7.2.3.2.+E2F8+The'name'of'your'search'is:' '' ' Promoter'Search'for'sites'by'WeightMatrix'library:' matrixTFP60.lib'Sequence'file:'''' ' ' ' E2F8.seq'Matrix'groups:'''' ' ' ' vertebrates'Cut]offs:' ''' ' ' ' 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7.$Anhang$$

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7.$Anhang$$

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'

7.$Anhang$$

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7.$Anhang$$

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7.$Anhang$$

$ 110$

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7.$Anhang$$

$ 111$

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7.$Anhang$$

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7.$Anhang$$

$ 113$

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7.$Anhang$$

$ 114$

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7.$Anhang$$

$ 115$

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7.$Anhang$$

$ 116$

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7.$Anhang$$

$ 117$

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7.$Anhang$$

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7.$Anhang$$

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7.$Anhang$$

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7.$Anhang$$

$ 121$

7.2.4.+Bindungsstellenvorhersage+für+die+Promotoren+der+induzierten+Gene+

7.2.4.1.+CXCL9+The'name'of'your'search'is:' ''' ' Promotor'Search'for'sites'by'WeightMatrix'library:' matrixTFP60.lib'Sequence'file:'''' ' ' ' CXCL9.seq'Matrix'groups:'''' ' ' ' vertebrates'Cut]offs:' ''' ' ' ' to'minimize'the'sum'of'both'error'rates'Scanning'sequence'ID:'CXCL9_0'View'a'of'the'following'search'results''matrix''''''''''''''''''''position''core'''matrix'sequence'(always'the'''''''''''''''factor'name'identifier''''''''''''''''(strand)''match''match''(+)]strand'is'shown)''V$CETS1P54_01''''''''''''''''7'(])''0.974''0.948''ggcaTCCTGg'''''''''''''''''''''''''c]Ets]''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''1(p54)'V$OCT1_02'''''''''''''''''''13'(])''1.000''0.913''ctggtGCATAtgagg''''''''''''''''''''Oct]1'V$OCT1_Q6'''''''''''''''''''47'(])''0.838''0.806''ttgaTTTGTacttcc''''''''''''''''''''Oct]1'V$ELK1_01'''''''''''''''''''52'(])''1.000''0.900''ttgtaCTTCCtgaatg'''''''''''''''''''Elk]1'V$ELK1_02'''''''''''''''''''54'(])''0.938''0.935''gtacTTCCTgaatg'''''''''''''''''''''Elk]1'V$CETS1P54_01'''''''''''''''55'(])''0.974''0.973''tactTCCTGa'''''''''''''''''''''''''c]Ets]''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''1(p54)'V$FOXD3_01''''''''''''''''''63'(+)''0.996''0.885''gaATGTTtagtg'''''''''''''''''''''''FOXD3'V$HNF4_01'''''''''''''''''''76'(])''0.883''0.868''ggctgagCTTTTctcatgt''''''''''''''''HNF]4'V$MYCMAX_02'''''''''''''''''87'(])''0.941''0.949''tctcATGTGctt'''''''''''''''''''''''c]Myc/Max'V$NFY_01''''''''''''''''''''93'(])''1.000''0.971''gtgcttATTGGccatt'''''''''''''''''''NF]Y'V$NFY_Q6''''''''''''''''''''96'(])''1.000''0.962''cttATTGGcca''''''''''''''''''''''''NF]Y'V$CAAT_01'''''''''''''''''''97'(])''1.000''0.960''ttATTGGccatt'''''''''''''''''''''''CCAAT'box'V$OCT1_Q6''''''''''''''''''103'(])''0.838''0.855''gccaTTTGTatgtat''''''''''''''''''''Oct]1'V$OCT1_Q6''''''''''''''''''193'(])''0.838''0.847''gttcTTTGTatatgt''''''''''''''''''''Oct]1'V$HNF1_C'''''''''''''''''''198'(])''1.000''0.855''ttgtatatgtaTTAACt''''''''''''''''''HNF]1'V$GATA2_03'''''''''''''''''222'(+)''0.954''0.967''agaGATATga'''''''''''''''''''''''''GATA]2'V$GATA3_03'''''''''''''''''222'(+)''0.981''0.964''agaGATATga'''''''''''''''''''''''''GATA]3'V$OCT1_Q6''''''''''''''''''228'(])''0.909''0.850''atgaTTTACaattat''''''''''''''''''''Oct]1'V$FOXD3_01'''''''''''''''''237'(+)''0.948''0.883''aaTTATTttctc'''''''''''''''''''''''FOXD3'V$OCT1_Q6''''''''''''''''''262'(])''0.893''0.819''tgctTTTTCattctg''''''''''''''''''''Oct]1'V$HNF1_C'''''''''''''''''''275'(+)''0.784''0.814''tGTTGAttattttcttc''''''''''''''''''HNF]1'V$HNF3B_01'''''''''''''''''277'(+)''1.000''0.938''ttgatTATTTtcttc''''''''''''''''''''HNF]3beta'V$FOXD3_01'''''''''''''''''279'(+)''0.948''0.921''gaTTATTttctt'''''''''''''''''''''''FOXD3'V$HNF4_01''''''''''''''''''341'(])''0.915''0.786''actaatcCTTTAttctaac''''''''''''''''HNF]4'V$HNF3B_01'''''''''''''''''373'(])''1.000''0.956''aaaaaAAATAataaa''''''''''''''''''''HNF]3beta'V$FOXD3_01'''''''''''''''''374'(])''0.948''0.949''aaaaaAATAAta'''''''''''''''''''''''FOXD3'V$FOXD3_01'''''''''''''''''377'(])''0.948''0.874''aaaatAATAAac'''''''''''''''''''''''FOXD3'V$AP1_Q2'''''''''''''''''''398'(+)''0.967''0.951''agTGACAtaaa''''''''''''''''''''''''AP]1'V$AP1_Q4'''''''''''''''''''398'(+)''0.935''0.926''agTGACAtaaa''''''''''''''''''''''''AP]1'V$FOXD3_01'''''''''''''''''404'(])''1.000''0.872''ataaaAACAAaa'''''''''''''''''''''''FOXD3'V$SOX9_B1''''''''''''''''''458'(])''1.000''0.931''tttgATTGTttaag'''''''''''''''''''''SOX]9'V$SOX5_01''''''''''''''''''460'(])''1.000''0.995''tgATTGTtta'''''''''''''''''''''''''Sox]5'V$SOX5_01''''''''''''''''''470'(])''1.000''0.992''agATTGTtgg'''''''''''''''''''''''''Sox]5'V$EVI1_04''''''''''''''''''487'(+)''0.842''0.845''atataagaaAAAATa''''''''''''''''''''Evi]1'V$FOXD3_01'''''''''''''''''493'(])''0.948''0.882''gaaaaAATAAat'''''''''''''''''''''''FOXD3'V$FOXJ2_01'''''''''''''''''493'(+)''0.960''0.948''gaaaaaatAAATAtggcc'''''''''''''''''FOXJ2'V$FREAC7_01''''''''''''''''494'(+)''1.000''0.965''aaaaaATAAAtatggc'''''''''''''''''''Freac]7'V$HNF3B_01'''''''''''''''''496'(])''1.000''0.964''aaaatAAATAtggcc''''''''''''''''''''HNF]3beta'V$XFD1_01''''''''''''''''''496'(+)''0.959''0.934''aaaATAAAtatggc'''''''''''''''''''''XFD]1'V$HFH3_01''''''''''''''''''496'(])''0.981''0.959''aaaatAAATAtgg''''''''''''''''''''''HFH]3'V$FOXD3_01'''''''''''''''''497'(])''0.944''0.896''aaataAATATgg'''''''''''''''''''''''FOXD3'V$HNF1_C'''''''''''''''''''526'(+)''0.796''0.823''gGCTATtcaataagcag''''''''''''''''''HNF]1'V$FOXD3_01'''''''''''''''''544'(])''0.906''0.886''aaaaaAAAAAaa'''''''''''''''''''''''FOXD3'V$FOXD3_01'''''''''''''''''545'(])''0.906''0.886''aaaaaAAAAAaa'''''''''''''''''''''''FOXD3'V$FOXD3_01'''''''''''''''''546'(])''0.906''0.886''aaaaaAAAAAaa'''''''''''''''''''''''FOXD3'V$FOXD3_01'''''''''''''''''547'(])''0.906''0.888''aaaaaAAAAAat'''''''''''''''''''''''FOXD3'V$FOXD3_01'''''''''''''''''548'(])''0.906''0.923''aaaaaAAAAAtt'''''''''''''''''''''''FOXD3'V$FOXD3_01'''''''''''''''''549'(])''0.901''0.920''aaaaaAAAATtt'''''''''''''''''''''''FOXD3'V$FOXJ2_02'''''''''''''''''560'(+)''0.897''0.888''tgaAGAATattttg'''''''''''''''''''''FOXJ2'V$GATA_C'''''''''''''''''''570'(])''1.000''0.992''tttgcTTATCt''''''''''''''''''''''''GATA]X'V$LMO2COM_02'''''''''''''''573'(])''1.000''0.976''gctTATCTg''''''''''''''''''''''''''Lmo2''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''complex'V$GATA2_02'''''''''''''''''573'(])''1.000''0.978''gcTTATCtgg'''''''''''''''''''''''''GATA]2'V$FOXJ2_02'''''''''''''''''583'(+)''0.871''0.851''actTTAATatttcc'''''''''''''''''''''FOXJ2'

7.$Anhang$$

$ 122$

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7.$Anhang$$

$ 123$

7.2.4.2.+PTX3+The'name'of'your'search'is:' ''' ' Promotor'Search'for'sites'by'WeightMatrix'library:' matrixTFP60.lib'Sequence'file:'''' ' ' ' PTX3.seq'Matrix'groups:'''' ' ' ' vertebrates'Cut]offs:' ''' ' ' ' to'minimize'the'sum'of'both'error'rates'Scanning'sequence'ID:'PTX3_0'View'a'of'the'following'search'results''matrix''''''''''''''''''''position''core'''matrix'sequence'(always'the'''''''''''''''factor'name'identifier''''''''''''''''(strand)''match''match''(+)]strand'is'shown)''V$OCT1_Q6'''''''''''''''''''10'(])''0.781''0.805''ctccTTCTCatttta''''''''''''''''''''Oct]1'V$FOXJ2_01''''''''''''''''''50'(+)''0.917''0.934''caaaaaatAAAAAataaa'''''''''''''''''FOXJ2'V$HNF3B_01''''''''''''''''''53'(])''0.930''0.918''aaaatAAAAAataaa''''''''''''''''''''HNF]3beta'V$FOXD3_01''''''''''''''''''54'(])''0.906''0.927''aaataAAAAAta'''''''''''''''''''''''FOXD3'V$FOXD3_01''''''''''''''''''61'(])''0.906''0.871''aaataAAAAAgg'''''''''''''''''''''''FOXD3'V$AREB6_02''''''''''''''''''66'(])''1.000''0.982''aaaaAGGTGttt'''''''''''''''''''''''AREB6'V$RFX1_02'''''''''''''''''''80'(])''0.982''0.927''gaGTTCCcttcgtggctc'''''''''''''''''RFX1'V$PAX4_01''''''''''''''''''112'(])''1.000''0.772''caactagtatcCATGAggacg''''''''''''''Pax]4'V$CDPCR1_01''''''''''''''''117'(])''0.910''0.842''agtaTCCATg'''''''''''''''''''''''''CDP'CR1'V$HNF4_01''''''''''''''''''157'(+)''0.763''0.788''agtgggtTAAGGatcgagg''''''''''''''''HNF]4'V$RFX1_01''''''''''''''''''270'(+)''0.982''0.938''ccctagcctgGGAACtt''''''''''''''''''RFX1'V$IK1_01'''''''''''''''''''275'(+)''1.000''0.953''gcctGGGAActtc''''''''''''''''''''''Ik]1'V$MYOD_01''''''''''''''''''294'(+)''1.000''0.933''ccaCAGGTgcag'''''''''''''''''''''''MyoD'V$AREB6_03'''''''''''''''''294'(])''1.000''0.993''ccaCAGGTgcag'''''''''''''''''''''''AREB6'V$XFD2_01''''''''''''''''''324'(])''1.000''0.979''aaaatgTTTATaaa'''''''''''''''''''''XFD]2'V$FREAC7_01''''''''''''''''324'(])''1.000''0.961''aaaatgTTTATaaaag'''''''''''''''''''Freac]7'V$HFH8_01''''''''''''''''''325'(+)''1.000''0.972''aaaTGTTTataaa''''''''''''''''''''''HFH]8'V$TATA_C'''''''''''''''''''360'(])''1.000''0.953''tTTTTAaaga'''''''''''''''''''''''''TATA'V$OCT1_Q6''''''''''''''''''399'(+)''0.838''0.860''agccatACAAAtcct''''''''''''''''''''Oct]1'V$GATA_C'''''''''''''''''''421'(])''1.000''0.967''ttggtTTATCt''''''''''''''''''''''''GATA]X'V$EVI1_04''''''''''''''''''432'(+)''0.842''0.772''tgaaatcagAAAATa''''''''''''''''''''Evi]1'V$HNF4_01''''''''''''''''''450'(])''0.815''0.806''ctcagagCTTAGacctgtt''''''''''''''''HNF]4'V$HNF4_01''''''''''''''''''471'(+)''1.000''0.829''atgtgtaCAAAGaaaatgt''''''''''''''''HNF]4'V$HNF3B_01'''''''''''''''''584'(+)''1.000''0.906''tgaatTATTTctctc''''''''''''''''''''HNF]3beta'V$CDPCR1_01''''''''''''''''716'(])''0.794''0.832''ccaaTTAATc'''''''''''''''''''''''''CDP'CR1'V$OCT1_Q6''''''''''''''''''730'(+)''0.909''0.806''ggcagtGTAAAtctt''''''''''''''''''''Oct]1'V$SOX9_B1''''''''''''''''''752'(])''1.000''0.928''tactATTGTgcaac'''''''''''''''''''''SOX]9'V$HLF_01'''''''''''''''''''756'(])''0.892''0.895''attgtGCAAC'''''''''''''''''''''''''HLF'V$GFI1_01''''''''''''''''''795'(+)''1.000''0.952''ccccccaaAATCAggggaactccc'''''''''''Gfi]1'V$NFKB_Q6''''''''''''''''''807'(+)''1.000''0.935''agGGGAActcccgt'''''''''''''''''''''NF]kappaB'V$NFKB_Q6''''''''''''''''''807'(])''0.955''0.909''aggggaaCTCCCgt'''''''''''''''''''''NF]kappaB'V$NFKAPPAB_01''''''''''''''809'(+)''1.000''0.953''GGGAActccc'''''''''''''''''''''''''NF]kappaB'V$NFKAPPAB_01''''''''''''''809'(])''0.965''0.976''gggaaCTCCC'''''''''''''''''''''''''NF]kappaB'V$CREL_01''''''''''''''''''810'(])''0.952''0.959''GGAACtcccg'''''''''''''''''''''''''c]Rel'V$VMYB_01''''''''''''''''''815'(])''1.000''0.955''tcCCGTTaac'''''''''''''''''''''''''v]Myb'V$CEBP_C'''''''''''''''''''944'(])''0.996''0.917''agcctCTTGCctcacacc'''''''''''''''''C/EBP'V$MYOD_01''''''''''''''''''966'(])''0.905''0.911''cgccAGCTGtgg'''''''''''''''''''''''MyoD'V$IK1_01'''''''''''''''''''972'(+)''1.000''0.957''ctgtGGGAAgaac''''''''''''''''''''''Ik]1'V$HNF4_01''''''''''''''''''977'(])''0.883''0.849''ggaagaaCTTTTgtctctt''''''''''''''''HNF]4'''Total'sequences'length=1000''Total'number'of'sites'found=39''Frequency'of'sites'per'nucleotide=0.039000' '

7.$Anhang$$

$ 124$

7.2.4.3.+CTGF+The'name'of'your'search'is:' ''' ' Promotor'Search'for'sites'by'WeightMatrix'library:' matrixTFP60.lib'Sequence'file:'''' ' ' ' CTGF.seq'Matrix'groups:'''' ' ' ' vertebrates'Cut]offs:' ''' ' ' ' 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7.$Anhang$$

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7.$Anhang$$

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7.$Anhang$$

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$ 128$

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$ 135$

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945''cgTGACGtctca'''''''''''''''''''''''CRE]BP1'V$CREB_01''''''''''''''''''746'(+)''1.000''0.985''TGACGtct'''''''''''''''''''''''''''CREB'V$HNF4_01''''''''''''''''''765'(])''0.767''0.788''tgttgggGTTTGggcctca''''''''''''''''HNF]4'V$CDPCR1_01''''''''''''''''815'(+)''0.852''0.873''cAGCGAttgg'''''''''''''''''''''''''CDP'CR1'V$NFY_Q6'''''''''''''''''''817'(])''1.000''0.951''gcgATTGGtgg''''''''''''''''''''''''NF]Y'V$CAAT_01''''''''''''''''''829'(])''0.944''0.929''tgAGTGGcccgg'''''''''''''''''''''''CCAAT'box'V$SOX9_B1''''''''''''''''''840'(])''1.000''0.959''gtcgATTGTttctt'''''''''''''''''''''SOX]9'

7.$Anhang$$

$ 136$

V$SOX5_01''''''''''''''''''842'(])''1.000''0.992''cgATTGTttc'''''''''''''''''''''''''Sox]5'V$FOXD3_01'''''''''''''''''843'(+)''1.000''0.915''gaTTGTTtctta'''''''''''''''''''''''FOXD3'V$RFX1_01''''''''''''''''''845'(])''0.982''0.924''ttGTTTCttagctagag''''''''''''''''''RFX1'V$PAX6_01''''''''''''''''''887'(+)''0.772''0.787''agaagTTTCGcataaattatt''''''''''''''Pax]6'V$OCT1_Q6''''''''''''''''''889'(])''0.888''0.810''aagtTTCGCataaat''''''''''''''''''''Oct]1'V$FOXJ2_02'''''''''''''''''899'(])''0.897''0.895''taaattATTCTgat'''''''''''''''''''''FOXJ2'V$GATA1_02'''''''''''''''''905'(+)''0.993''0.973''attcTGATAaggtt'''''''''''''''''''''GATA]1'V$LMO2COM_02'''''''''''''''908'(+)''0.985''0.985''cTGATAagg''''''''''''''''''''''''''Lmo2''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''complex'V$GATA_C'''''''''''''''''''909'(+)''1.000''0.979''tGATAAggtta''''''''''''''''''''''''GATA]X'V$OCT1_Q6''''''''''''''''''938'(+)''1.000''0.838''tattagGCAAAtgag''''''''''''''''''''Oct]1'''Total'sequences'length=1000''Total'number'of'sites'found=64''Frequency'of'sites'per'nucleotide=0.064000''

+

8.$Abkürzungsverzeichnis$$

$ 137$

8.+Abkürzungsverzeichnis+

Abb.$ $ $ Abbildung$

ACE$ $ $ angiotensin$I$converting$enzyme$

ACE2$ $ $ angiotensin$I$converting$enzyme$2$

Ang(1E7)$ $ AngiotensinE(1E7)$

AngII$ $ $ Angiotensin$II$

AT1$ $ $ Angiotensin$IIETyp$1ERezeptor$

AT2$ $ $ Angiotensin$IIETyp$2ERezeptor$

bp$ $ $ Basenpaare$

bpm$ $ $ beats$per$minute$

BSA$ $ $ bovines$Serumalbumin$

bzw.$ $ $ beziehungweise$

CACNA1C$ calcium$channel,$voltageEdependent,$L$type,$alpha$1C$subunit$

CaMKII$ Calcium/calmodulinEdependent$protein$kinase$II$

CCN$ $Akronym:$cysteineErichEproteinE61,$connectiveEtissueEgrowthE

factor,$nephroblastomaEoverexpressedEprotein$

CDK4$ $ $ cyclinEdependent$kinase$4$

CHAPS$$ $ 3E[(3ECholamidopropyl)EdimethylEammonio]E1Epropansulfonat$

$ $ $ [C32H58N2SO7]$

CTGF$ $ $ connetive$tissue$growth$factor$(auch:$CCN2)$

d.h.$ $ $ dass$heißt$

dH2O$ $ $ deionisiertes$Wasser$

DMSO$ $ $ Dimethylsulfoxid$

DNA$ $ $ Desoxyribonukleinsäure$

DTT$ $ $ 1,4EDithiothreit$

E2F8$ $ $ E2F$transcription$factor$8$

ECM$ $ $ Extrazellulärmatrix$

EDTA$ $ $ Ethylendiamintetraessigsäure$

EK$ $ $ Effektklasse$

EtOH$ $ $ Ethanol$

EZM$ $ $ Extrazellulärmatrix$

FBS$ $ $ fetales$Rinderserum$

GAPDH$ $ GlycerinaldehydE3Ephosphatdehydrogenase$

h$ $ $ Stunde$


$ 138$

Hand1$$ $ heart$and$neural$crest$derivatives$expressed$1$

HCl$ $ $ Salzsäure$

HDAC$ $ $ Histonedeacetylase$

Hz$ $ $ Herz$

IQR$ $ $ Interquartilbereich$

LB$ $ $ Luria$Bertani$

LP$ $ $ LaemmliEPuffer$

min$ $ $ Minute$

MOPS$ $ $ 3E(NEMorpholino)EPropansulfonsäure$[C7H14NaNO4S]$

NFATc3$ $ nuclear$factor$of$activated$TEcells$,$cytoplasmic,$calcineurinE$

$ $ $ dependent$3$

NOAC$ $ $ neue$orale$Antikoagulantien$

nt$ $ $ Nukleotide$

PBS$ $ $ PhosphatEgepufferte$Salzlösung$

PCR$ $ $ Polymerasekettenraktion$

Pen$ $ $ Penicillin$

PKA$ $ $ Proteinkinase$A$

PKB$ $ $ Proteinkinase$B$

PKC$ $ $ Proteinkinase$C$

Plk4$ $ $ poloElike$kinase$4$

PP2A$ $ $ protein$phosphatase$2A$

RAAS$ $ $ ReninEAngiotensinEAldosteronESystem$

RAP$ $ $ rapid$atrial$pacing$

RNA$ $ $ Ribonukleinsäure$

RTEPCR$ $ reverseETranskriptions$Polymerasekettenraktion$

SDS$ $ $ Natriumdodecylsulfat$[C12H25NaO4S]$

SDSEPAGE$ $ Natriumdodecylsulfat$Polyacrylamidgelelektrophorese$

sec$ $ $ Sekunde$

Strep$ $ $ Streptomycin$

Tab.$ $ $ Tabelle$

TAE$ $ $ TrisEAcetatEEDTA$

TBS$ $ $ TrisEgepufferte$Salzlösung$

TBSET$ $ $ TrisEgepufferte$Salzlösung$mit$Tween$

TCF3$ $ $ transcription$factor$3$


$ 139$

TEMED$ $ N,N,N',N'ETetramethylethylendiamin,$1,2EBis(dimethylamino)E

$ $ $ ethan$[C6H16N2]$

TF$ $ $ Transkriptionsfaktor$

TFBS$ $ $ Transkriptionsfaktorbindungsstelle$

Tris$ $ $ Tris(hydroxymethyl)Eaminomethan$[C4H11NO3]$

u$ $ $ units$

u.a.$ $ $ und$andere$

UTR$ $ $ untranslated$region$

VHF$ $ $ Vorhofflimmern$

vs.$ $ $ versus$

v/v$ $ $ volume$of$volume$

w/v$ $ $ weight$of$volume$

xEGal$ $ $ 5EBromE4EchlorE3EindoxylEβEDEgalactopyranosid$[C14H15BrClN]$$

9.$Literaturverzeichnis$$

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Yokota,$Y$(2001):$Id$and$development.$Oncogene$20:8290E8298.$

Yuh,$CH;$Bolouri,$H;$Davidson,$EH$(1998):$Genomic$cis-regulatory$logic:$experimental$and$

$ computational$analysis$of$a$sea$urchin$gene.$Science$279:1896E1902.$

Zebedee,$ Z;$ Hara,$ E$ (2001):$ Id$ proteins$ in$ cell$ cycle$ control$ and$ cellular$ senescence.$

$ Oncogene$20:8317E8325.$

Zografos,$T;$Katritsis,$DG$(2010):$Inhibition$of$the$renin-angiotensin$system$for$prevention$

$ of$atrial$fibrillation.$Pacing$Clin$Electrophysiol$33:1270E1285.$

10.$Wissenschaftliche$Veröffentlichungen$$

$ 159$

10.+Wissenschaftliche+Veröffentlichungen+

Bukowska,$A;$Hammwöhner,$M;$Sixdorf,$A;$ Schild,$L;$Wiswedel,$ I;$Röhl,$FW;$Wolke,$C;$

$ Lendeckel,$U;$Aderkast,$C;$Bochmann,$S;$Chilukoti,$RK;$Mostertz,$ J;$Bramlage,$P;$

$ Goette,$A$(2012):$Dronedarone$prevents$microcirculatory$abnormalities$in$the$left$

$ ventricle$during$atrial$tachypacing$in$pigs.$Br$J$Pharmacol$166:964E980.$

Chilukoti,$ RK;$ Mostertz,$ J;$ Bukowska,$ A;$ Aderkast,$ C;$ Felix,$ SB;$ Busch,$ M;$ Völker,$ U;$

$ Goette,$A;$Wolke,$C;$Homuth,$G;$Lendeckel,$U$(2013):$Effects$of$irbesartan$on$gene$

$ expression$revealed$by$transcriptome$analysis$of$left$atrial$tissue$in$a$porcine$model$

$ of$acute$rapid$pacing$in$vivo.$Int$J$Cardiol$168:2100E2108.$

$

11.$Eidesstattlich$Erklärung$$

$ 160$

11.+Eidesstattliche+Erklärung+

Hiermit$ erkläre$ ich,$ dass$ ich$ die$ vorliegende$ Dissertation$ mit$ dem$ Thema$

„Vergleichende$Promotoranalyse$IrbesartanEregulierter$Gene$unter$rapidEpacing$in$vivo$

im$Schwein$und$Identifizierung$potentiell$regulierender$TranskriptionsfaktorbindungsE

stellen“$selbständig$verfasst$und$keine$anderen$als$die$angegebenen$Hilfsmittel$benutzt$

habe.$$

Die$Dissertation$ ist$bisher$keiner$anderen$Fakultät$vorgelegt$worden.$ Ich$erkläre,$dass$

ich$ bisher$ kein$ Promotionsverfahren$ erfolglos$ beendet$ habe$ und$ dass$ keine$

Aberkennung$eines$bereits$erworbenen$Doktorgrades$vorliegt.$

$

$

Greifswald,$am$11.04.2014$ __________________________________$

$$$Christoph$Aderkast$

Aus$dem$Institut$für$Medizinische$Biochemie$und ...

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