Barrieren der Organe – die intelligenten Grenzen des Körper (Tight Junctions)

12.02.2010

Susanne Krug

Institut für Klinische Physiologie

Campus Benjamin Franklin, Charité Berlin

DFG-Forschergruppe 721

Gliederung

Der transepitheliale Widerstand

Chopstick-Elektroden

Die Ussing-Kammer

Impedanzspektroskopie: Ein-Wege-Impedanzspektroskopie Zwei-Wege-Impedanzspektroskopie

Conductance Scanning (Voltage Scanning)

Zusammenfassung

Der transepitheliale Widerstand

- Transepithelialer Widerstand (Rt, TER) gibt Kehrwert aller Ionenpermeabilitäten an

- Kehrwert = transepitheliale Leitfähigkeit (Gt) Einheit: mS/cm²

- allgemeine Rt-Bestimmung:- Anlegen eines Stromimpulses I Spannungsänderung V Ohm'sches Gesetz: R = V / I

beeinhaltet Widerstände des Epithels, der Bad-lösung, des Subepithels, bzw. Supports

Einheit: cm²

- Gt ist proportional zur Fläche mit Flächenzunahme sinkt Rt

[mmol/l]

Chopstick-Elektroden- Anlegen zweier Elektrodenpaare (I-Amplikation; V-Messung) + einfache und schnelle Messung Screening der Konfluenz

und Widerstandsentwicklung+ beliebig oft wiederholbar- positionsabhängige Werte (Nähe zu Zellen; Rand vs. Mitte)- ungerührte Lösung Konzentrationsgradienten

Beeinflussung von Fluxen und resultierenden Permeabilitäten

- AC-Strom-betrieben Kurzschluss der ohm'schen Zellelemente unterschätzter Rt

(- nicht-temperierte Platten keine Langzeitmessung möglich)

Die Ussing-Kammer

- Vier-Elektrodensystem (I-Amplikation; V-Messung)

- Generation eines fast homogenen Stroms (DC-Strom) wirkt auf gesamten Zelllayer

- V wird nahe der Probe detektiert

- Begasung Badlösung permanent durchmischt Versorgung des Epithels mit O2 und CO2

Langzeitexperimente möglich

- Kurzschluss-Technik (ISC) über Spannungsklemme:

- V wird auf 0 V geklemmt

- Aktiver Transport, z.B. Na+ ISC

Beispiel: Transport am Rindercolon

AMIL (mu) = Amilorid hemmt Aldosteron-abhängige Na+-Aufnahme (ENaC)

Ba++ (mu) hemmt K+-Ausstrom

THEO (bds.) = Theophillin cAMP-Anreicherung Stimulation der Cl–-Sekretion

FURO (se) = Furosemid Inhibition der Cl--Sekretion (Na+K+2Cl–-Symporter)

Hegel et al., 1993, Am. J. Physiol.

Biologisches Modell:6-Parameter

Zusammengefasstes

Modell:3-Parameter

Ein-Wege-Impedanzspektroskopie

Impedanzmessung bei Wechselstrom (AC-Messung; 1 Hz bis 65 kHz):- Frequenz 0: Kondensator Cepi ist nicht

leitfähig Repi + Rsub = "TER" - Frequenz : Kondensator Cepi ist leitfähig,

so dass Widerstand Repi kurzgeschlossen ist nur Rsub

Rsub

ZreZ

im

Z = Rsub Z 0 = Rsub + Repi

C = 1/(|Zim|maxRepi)

ZreZ

im

Z = Rsub Z 0 = Rsub + Repi

C = 1/(|Zim|maxRepi)

Repi

Beispiel: Morbus Crohn

10 20 30 40 50 60

-30

-20

-10

0

f0: 1.0 kHz

65 kHz 1 Hz

Zim

agin

ary (

· cm

2 )

Zreal

( · cm2)

10 20 30 40 50 60

-30

-20

-10

0

f0: 113 Hz

65 kHz 1 Hz

Zim

agin

ary (

· cm

2 )Z

real ( · cm

2)

Ileum, CTRL

Ileum, Crohn

Entzündung Barriere

Rt (TER): -10%Repi : -50%

Claudin-2 : Claudin-5 : Claudin-8 :

Zeissig et al., 2004, GutZeissig et al., 2007, Gut

Ziel: Direkte Messung des para- und transzellulären Widerstands

Zwei-Wege-Impedanzspektroskopie

Biologisches Modell:6-Parameter

Zusammengefasstes

Modell:4-Parameter

Krug et al., 2009, Biophys. J.

Messung von zwei zusätzlichen Parametern:1. Rpara-Perturbation EGTA Ca2+-Switch

2. Quotient der Permeabilitäten für einen parazellulären Marker vor und nach Rpara-Perturbation, z.B. für Fluorescein

Rsub

Repivor EGTA

Repinach EGTA

EGTA

Zwei-Wege-Impedanzspektroskopie

Biologisches Modell:6-Parameter

Zusammengefasstes

Modell:4-Parameter

Messung von zwei zusätzlichen Parametern:1. Rpara-Perturbation EGTA Ca2+-Switch

2. Quotient der Permeabilitäten für einen parazellulären Marker vor und nach Rpara-Perturbation, z.B. für Fluorescein

Ziel: Direkte Messung des para- und transzellulären Widerstands

Zwei-Wege-ImpedanzspektroskopieVoraussetzung: Linearer Zusammenhang zwischen Flux des Markers und Leitfähigkeit Muss für jede Zellart zuvor validiert werden

JkGGGG transparatransepi

- Änderungen von Rtrans Verschiebung entlang der y-Achse - Änderungen von Rpara Steigungsänderung

nach

epivor

epinachvor

nachvornachepi

vorepi

para

RRJJ

JJRRR

1

transepipara GGG

Beispiel: Claudin-10b

Günzel et al., 2009, J. Cell Sci.Krug et al., 2009, Biophys. J.

IV IX X

0

1

2

3

4

5

6

7

0

5

10

15

20

25

30

35

40

wt vector 1 #21 #23 YFP #1 #4

MDCK-C7 control cldn-10-1 cldn-10-1 cldn-10-2 cldn-10-2 cldn-10-2

Human Human Human Human Human

Px

[1

0-3 c

m/h

]

Li

Na

K

Rb

Cs

Px (1

0-6cm

/s)

Kontrolle CLDN2 Cldn10b

Eisenman-Seq.

IV IX X

0

1

2

3

4

5

6

7

0

5

10

15

20

25

30

35

40

wt vector 1 #21 #23 YFP #1 #4

MDCK-C7 control cldn-10-1 cldn-10-1 cldn-10-2 cldn-10-2 cldn-10-2

Human Human Human Human Human

Px

[1

0-3 c

m/h

]

Li

Na

K

Rb

Cs

Px (1

0-6cm

/s)

Kontrolle CLDN2 Cldn10b

IV IX X

0

1

2

3

4

5

6

7

0

5

10

15

20

25

30

35

40

wt vector 1 #21 #23 YFP #1 #4

MDCK-C7 control cldn-10-1 cldn-10-1 cldn-10-2 cldn-10-2 cldn-10-2

Human Human Human Human Human

Px

[1

0-3 c

m/h

]

Li

Na

K

Rb

Cs

Px (1

0-6cm

/s)

Kontrolle CLDN2 Cldn10b

Eisenman-Seq.

- Cld10b in MDCK C7 transfiziert Kationenpore

- linearer Zusammenhang von Gepi zu PX

sowohl für Na+ als auch Cl- und Fluorescein mit gleichem Gtrans

- PNa > PCl > PFluorescein

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 10 20 30 40

PX (10-3 cm/h)

Ge

pi (

mS

/cm

2)

Fluorescein Chloride Sodium

PFluo PCl PNaG

ep

i

Beispiel: Forskolin

- apikale Gabe von Forskolin Änderung der apikalen Membran (Doppelbogen)

Rtrans verändert

- zusätzliche EGTA-Gabe Rpara verändert

-500

-400

-300

-200

-100

0

0 200 400 600

Zre [ cm2]

Zim

[

cm

2]

control forskolin

Conductance-Scanning (Voltage Scanning)

Köckerling & Fromm, 1992, Am. J. Physiol.Gitter et al., 1997, Pflügers Arch.

Variable Auflösung: gering: Ulcus-Bereiche

Single-cell wound repairColonoberfläche / Krypten Focal leaks (durch Bakterien)

ApoptosenHoch: trans- / parazellulär

- Messung lokaler Unterschiede der Strom- dichte über der apikalen Membran

- AC-Clamp (200 µA/cm², 24 Hz)

- detektierte Signale im µV-Bereich

- Berechnung des Leitfähigkeitsverteilung über best-fit-Algorithmen

Beispiel: MDCK C11-Zellen

TJ

Gitter et al., 1997, Pflügers Arch.

MDCK-C11 cellsGc 2.6 mS/cm2 = Rtrans 385 cm2 Gpara 10.5 mS/cm2 = Rpara 95 cm2

Gepi 13.1 mS/cm2 = Repi 76 cm2

genauere Rt-Bestimmung: Ussing-Kammer

Bestimmung Repi und Rsub: Ein-Wege-Impedanzspektroskopie

Rt = Repi + Rsub

Bestimmung Rtrans und Rpara: Zwei-Wege-Impedanzspektroskopie

Gepi = Gtrans + Gpara = Gtrans + k JFluorescein

1/Repi = 1/Rtrans + 1/Rpara

Räumliche Lokalisation: Conductance-Scanning

Zusammenfassung

grobe Rt-Bestimmung: Chopstick-Elektroden

Hans UssingKopenhagen1911 - 2000

Dorothee Günzel

Detlef Sorgenfrei

Michael Fromm

Salah Amasheh

Institut für Klinische Physiologie