Bedeutung von Corticotropin-releasing Hormon für die · Der Trophoblast entwickelt sich zur...

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Aus der Kinder- und Jugendklinik der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. med. Dr. h. c. Wolfgang Rascher

Bedeutung von Corticotropin-releasing Hormon für die

Leptinexpression und die Synzytialisierung von primären humanen

Trophoblasten

Inaugural-Dissertation zur Erlangung des medizinischen Doktorgrades

der Medizinischen Fakultät der

Friedrich-Alexander-Universität zu Erlangen-Nürnberg

vorgelegt von

Ramona Offergeld

aus

Erlangen

2012

2

Gedruckt mit Erlaubnis der

Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen--ürnberg

Dekan: ............................................................ Prof. Dr. med. Dr. h.c. Jürgen Schüttler Referent: ...................................................... Prof. Dr. med Dr. h.c. Wolfgang Rascher

Korreferent: ............................................................ Prof. Dr. rer. nat. Andrea Hartner

Tag der mündlichen Prüfung:................................................................... 27.11.2012

3

Meinen Eltern, Jutta und Werner Offergeld

und meiner Schwester Tanja Offergeld.

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Inhaltsverzeichnis

1 Zusammenfassung ................................................................................................... 6

1.1 Hintergrund und Ziele ...................................................................................... 6

1.2 Methoden .......................................................................................................... 6

1.3 Ergebnisse und Beobachtungen ........................................................................ 6

1.4 Praktische Schlussfolgerung ............................................................................ 7

2 Abstract ................................................................................................................... 8

2.1 Objective .......................................................................................................... 8

2.2 Methods ............................................................................................................ 8

2.3 Results .............................................................................................................. 8

2.4 Conclusion ........................................................................................................ 9

3 Einleitung .............................................................................................................. 10

3.1 Plazenta und intrauterine Wachstumsrestriktion ............................................ 10

3.2 Fetale Programmierung .................................................................................. 15

3.3 CRH ................................................................................................................ 16

3.4 Fragestellung .................................................................................................. 19

4 Methoden ............................................................................................................... 19

4.1 Isolierung humaner Trophoblasten ................................................................. 19

4.2 Trophoblastenstimulation ............................................................................... 20

4.3 RNA-Extraktion ............................................................................................. 23

4.4 Photometrie .................................................................................................... 24

4.5 Gelelektrophorese ........................................................................................... 25

4.6 Reverse Transkription .................................................................................... 27

4.7 TaqMan-Real-Time-PCR ............................................................................... 28

4.8 ELISA ............................................................................................................. 32

4.8.1 LDH-ELISA ............................................................................................ 32

4.8.2 ßhCG-ELISA ........................................................................................... 34

4.9 Statistische Datenauswertung ......................................................................... 35

5 Ergebnisse ............................................................................................................. 35

5.1 RNA-Extraktion ............................................................................................. 35

5.1.1 Photometrie ............................................................................................. 35

5.1.2 Gelelektrophorese.................................................................................... 35

5.2 TaqMan-Real-Time-PCR ............................................................................... 36

5.2.1 Stimulation der Trophoblasten mit CRH ................................................. 36

5.2.1.1 Leptin-Expression unter CRH-Stimulation ...................................... 36

5.2.1.2 11ßHSD-2-Expression unter CRH-Stimulation ............................... 38

5.3 ELISA ............................................................................................................. 39

5.3.1 LDH-Assay.............................................................................................. 39

5.3.2 ßhCG-ELISA ........................................................................................... 41

6 Diskussion ............................................................................................................. 42

6.1 Diskussion der Methoden ............................................................................... 42

6.1.1 Trophoblastenisolierung .......................................................................... 42

6.1.2 RNA-Extraktion ...................................................................................... 42

6.1.3 TaqMan-Real-Time PCR ......................................................................... 43

6.2 Ergebnisse ...................................................................................................... 43

6.2.1 Zelldifferenzierung und Zelltod .............................................................. 43

6.2.2 Leptin-Expression unter CRH-Stimulation ............................................. 44

6.2.3 11ßHSD-2-Expression unter CRH-Stimulation ...................................... 46

6.3 Ausblick ......................................................................................................... 46

5

7 Literaturverzeichnis ............................................................................................ 48

8 Abkürzungsverzeichnis ....................................................................................... 56

9 Danksagung ......................................................................................................... 59

10 Lebenslauf .....................................................Fehler! Textmarke nicht definiert.

6

1 Zusammenfassung

1.1 Hintergrund und Ziele

Die hier vorgestellte Arbeit untersucht den Einfluss des plazentaren Corticotropin-

releasing Hormon (CRH) auf villöse humane Zytotrophoblasten. Als trophoblastäres

Hormon steuert CRH den physiologischen Schwangerschaftsablauf. Pathologische

plazentare Veränderungen, wie sie bei intrauteriner Wachstumsrestriktion (IUGR)

beobachtet werden, sind mit erhöhten CRH Spiegeln assoziiert. Ätiopathologisch ist

bekannt, dass CRH einen negativen Einfluss auf die Plazentation ausübt. Ungeklärt

bleibt hingegen die Wirkung von CRH auf die Expression bereits bekannter IUGR-

Markergene Leptin und 11β-Hydroxysteroid Dehydrogenase-2 (11ßHSD-2), sowie

sein Einfluss auf die synzytiale Integrität, welche bei IUGR verringert ist.

1.2 Methoden

Die Gewinnung primärer villöser Zytotrophoblasten aus gesunden Dritt-Trimester-

Plazenten erfolgte via mechanischer Isolation mittels Percoll-Dichtegradienten. Die

in Nährmedium angezüchteten Trophoblasten wurden mit CRH (1µg/ml) für 6h, 12h,

24h, 48h und 72h stimuliert und anschließend die relative Genexpression von Leptin

und 11ßHSD-2 mittels RT-PCR gemessen. Das Stadium der Differenzierung und die

Vitalität der villösen Zytotrophoblasten zu den jeweiligen Zeitpunkten wurde durch

die Messung der Konzentrationen von β-humanem Chorion Gonadotropin (ßhCG),

sowie der Laktatdehydrogenase (LDH) im Kulturüberstand mittels ELISA bzw. In

Vitro Toxicology Assay überprüft.

1.3 Ergebnisse und Beobachtungen

Im Einzelnen ergaben sich folgende Ergebnisse am in vitro Modell des villösen

Zytotrophoblasten:

1) CRH erhöhte die Leptin-Expression signifikant nach 48h Stimulation

(p<0,05).

2) CRH zeigte keinen signifikanten Einfluss auf die 11ßHSD-2-Expression.

3) CRH hatte keinen toxischen Einfluss auf trophoblastäre Zellen.

4) CRH hatte keinen Einfluss auf die ßhCG-Sekretionsrate.

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1.4 Praktische Schlussfolgerung

Die Stimulation primärer humaner Trophoblasten mit CRH induziert direkt die

Expression von Leptin in vitro. Ein indirekter Effekt von CRH auf die

Leptinexpression über die Induktion trophoblastärer Differenzierung zu

sekretorischem Synzytium (gemessen an der ßhCG-Sekretionsrate) war nicht

nachweisbar. Diese Ergebnisse lassen auf eine Interaktion dieser Hormone an der

feto-maternalen Grenzfläche schließen.

Wir entwickelten daher folgende Überlegungen:

1) Neben seinem bekannten maternal endokrinen Einfluss zeigt CRH auch auto-

und parakrine Effekte am plazentaren Synzytiotrophoblasten.

2) Störungen plazentarer Synzytialisierung, wie zum Beispiel bei IUGR, gehen

mit einer erhöhten CRH Sekretion in vivo einher, wobei CRH nach unseren

Befunden in vitro nicht ursächlich für diese Integritätsstörung zu seien

scheint.

3) Sekundäre Effekte durch CRH induziertes Leptin auf die Synzytialisierung,

sowie von CRH auf bereits ausdifferenziertes Synzytium sind zum

derzeitigen Stand unserer Untersuchungen jedoch nicht gänzlich

auszuschließen.

8

2 Abstract

2.1 Objective

The presented study analyzes the influence of the placental corticotropin-releasing

hormone (CRH) on human villous cytotrophoblasts. As a trophoblastic hormone

CRH controls physiologic processes during pregnancy. Pathologic placental changes,

as observed during intra-uterine growth restriction (IUGR), are associated with

increased CRH levels. CRH exerts a negative influence on placentation. The

influence of CRH on the expression of the known IUGR marker-genes leptin and

11β-hydroxysteroid dehydrogenase-2 (11ßHSD-2) remains unknown. Moreover the

role of CRH for the maintenance of syncytial integrity, a process dysregulated IUGR,

remains to be elucidated.

2.2 Methods

Primary human cytotrophoblasts from healthy third term placentas were isolated

using the established dispase/percoll method. After seeding in culture medium,

trophoblasts were stimulated with CRH (1µg/ml) for 6h, 12h, 24h, 48h and 72h.

Subsequently the relative gene expression of leptin and 11ßHSD-2 was determined

by RT-PCR. The state of differentiation and vitality of villous cytotrophoblasts at the

different time points were assessed by measuring the concentrations of β-human

chorion gonadotropin (ßhCG) and of lactate dehydrogenase (LDH) using ELISA or

in vitro toxicology assay techniques, respectively.

2.3 Results

The in vitro model of the villous cytotrophoblast showed following results:

1) CRH significantly increased the leptin expression after 48h of stimulation

(p<0.05).

2) CRH showed no significant influence on 11ßHSD-expression.

3) CRH had no toxic effects on trophoblastic cells.

4) CRH had no influence on the secretion rate of ßhCG.

9

2.4 Conclusion

The stimulation of primary human trophoblasts with CRH in vitro directly induced

the expression of Leptin. An indirect effect of CRH on leptin expression via the

induction of trophoblast differentiation into secretory syncytium (as measured by the

rate of ßhCG secretion) was not observed. This leads to the assumption of an

interaction between these two hormones on the feto-maternal interface.

Therefore the following aspects have to be taken into final consideration:

1) Beside its maternal-endocrine effects, CRH additionally shows auto- and

paracrine effects on the placental syncytiotrophoblast.

2) Dysregulation of placental syncytialisation, as observed for IUGR e.g., is

associated with an increased rate of CRH secretion in vivo. However our in

vitro results are not indicative of CRH as the causative agent of disturbed

syncytialisation.

3) At this point of our studies secondary effects on the syncytialisation process

through CRH induced leptin cannot be completely excluded. The same

applies for possible effects of CRH on already differentiated syncytium.

10

3 Einleitung

3.1 Plazenta und intrauterine Wachstumsrestriktion

Nach der Implantation der Blastozyste kommt es zur Keimblattdifferenzierung

zweier unterschiedlicher Zellpopulationen: Embryoblast und Trophoblast. Aus dem

Embryoblast entwickelt sich der Embryonalkörper, aus welchem der Fetus

hervorgeht. Der Trophoblast entwickelt sich zur Plazenta, wobei vor allem die frühen

trophoblastären Differenzierungsschritte in der Plazentogenese für die spätere

Funktion des Organs entscheidend sind (Senner et al. 2010). In der

Frühschwangerschaft folgt die trophoblastäre Stammzelle zweierlei funktionellen

Differenzierungswegen und entwickelt sich zu Synzytiotrophoblast und

Zytotrophoblast (Huppertz et al. 2008) (siehe Abbildung 1).

Die Funktion des frühen Synzytiotrophoblasten (SZT) besteht in Invasion und

Arrosion der Dezidua, wodurch es zur Ausbildung von Lakunen kommt, worüber

sich die Frucht initial histiotroph unter hypoxischen Bedingungen ernährt. Bei

zunehmendem embryonalem Wachstum im weiteren Schwangerschaftsverlauf nimmt

der SZT durch Fusion von mononukleären Zytotrophoblasten kontinuierlich an

Austauschfläche zu (Huppertz et al. 1999).

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Der Zytotrophoblast differenziert zu extravillösen und villösen Trophoblasten.

Villöse Trophoblasten bilden die Plazentazotten, welche den Synzytiotrophoblast bis

zu dessen mütterlicher Seite durchwandern und den ersten Kontakt mit mütterlicher

Dezidua herstellen (Huppertz et al. 2008). Durch Interaktion mit maternaler Matrix

und unter dezidualen Hormoneinflüssen kommt es mit der Ausbildung eines feto-

maternalen Sauerstoffgradienten ab dem zweiten Trimenon zur kontinuierlichen

Differenzierung extravillöser Trophoblasten (epitheliale-mesenchymale

Transformation). Der extravillöse Trophoblast durchsetzt die Dezidua basalis bis zum

Myometrium. Dies ist ein entscheidender Prozess für die Verankerung der Zotten in

uterinem Gewebe (Guibourdenche et al. 2010), sowie für die mütterliche

Immunakzeptanz des fetalen Fremdkörpers. Weiterhin sind extravillöse

Trophoblasten (EVT) entscheidend an der zeitlichen Konzertierung der plazentaren

Sauerstoffversorgung beteiligt: Sie verschließen in der Frühschwangerschaft aktiv

mütterliche Spiralarterien, wodurch ein hypoxisches Milieu für den noch unreifen

SZT hergestellt wird. Dieser Mechanismus schützt den im ersten Trimenon sehr

empfindlichen Synzytiotrophoblast vor zu hohen Sauerstoffkonzentrationen des

maternalen Blutes und der damit verbundene Bildung von toxischen reaktiven

Sauerstoffradikalen (Reactive Oxygen Species (ROS)) (Jauniaux et al. 2000, Watson

et al. 1998).

Bei zunehmendem fetalem Wachstum und adaptierter SZT-Kapazität kommt es im

weiteren Schwangerschaftsverlauf zur bedarfsangepassten Eröffnung mütterlicher

Spiralarterien mit einer konsekutiven Erhöhung des Blutflusses in den intervillösen

Raum. Zudem werden die zu diesem Zeitpunkt englumigen Spiralarterien durch

invasive EVTs in großlumige Gefäße umgebaut. Ab der 12. Schwangerschaftswoche

wird der gesamte intervillöse Raum von mütterlichem Blut umspült (Burton et al.

1999), was eine adäquate Sauerstoff- und Nährstoff-versorgung des

heranwachsenden Fetus gewährleistet (Caniggia et al. 1999, Pijnenborg et al. 2005).

Als Interface zwischen mütterlichem und fetalem Gewebe hat das Synzytium neben

seiner Rolle als Barriere und Gas-/Nährstoffaustauscher eine entscheidende

endokrine Funktion. Der SZT sezerniert für den Erhalt der Schwangerschaft wichtige

Enzyme und Hormone (Benirschke 1998, Muyan et al. 1996).

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Als wichtiger Marker synzytialer Funktion hat sich humanes Choriongonadotropin

(hCG) etabliert. Es wird aktiv vom Synzytiotrophoblasten sezerniert und maternale

Serumspiegel korrelieren positiv mit dem Grad der SZT-Ausdifferenzierung, weshalb

ßhCG in der Schwangerschaftsfrüherkennung via Schnelltest zum Einsatz kommt

(Guibourdenche et al. 2010). Entkopplung trophoblastärer Reifung von

embryoblastärem Wachstum kann zu fehlerhaften Ausdifferenzierungsprozessen

während der Plazentogenese führen und so fetalen Reifungsprozessen

entgegenwirken.

Es ist bekannt, dass eine mangelhafte Plazentation zu feto-maternalen Pathologien

wie intrauteriner Wachstumsrestriktion (intrauterine growth restriction, IUGR) und

Präeklampsie (PE) führen kann (Langbein et al. 2008) (siehe Abbildung 2).

Als gesonderte Entität des Überbegriffs small-for-gestational-age bezeichnet IUGR

ein dynamisches fetales Wachstumsverhalten mit einem Geburtsgewicht kleiner der

10.Perzentile.

Die IUGR erhöht peripartal Mortalität und Morbidität von Mutter und Kind

(Langbein et al. 2008). Ursächlich gelten maternale, fetale und Umwelteinflüsse.

Diskutiert werden dabei SZT und EVT-Differenzierungsstörungen.

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SZT-Differenzierungsstörungen führen über eine verminderte Nähr- und

Sauerstoffversorgung zur Wachstumsrestriktion des Fetus (Dupressoir et al. 2009,

Kuzmina et al. 2005, Scifres et al. 2009). Dabei lassen sich direkte SZT-

Differenzierungsstörungen von solchen abgrenzen, bei denen die plazentare

Insuffizienz durch Maldifferenzierung villöser Zytotrophoblasten zum SZT bedingt

ist (Hung et al. 2001, Kuzmina et al. 2005).

Extravillöse Differenzierungsstörungen äußern sich vor allem im zweiten Trimenon

der Schwangerschaft bei der funktionellen Konzertierung fetalen Alimen-

tierungsbedarfs mit der Regulation der Durchblutung des intervillösen Raums. Dabei

kann die unvollständige bzw. fehlende Invasion des extravillösen Trophoblasten in

mütterliche Gefäße zu einer bleibend hohen Resistenz und Kontraktilität der

Spiralarterien führen (Moffett-King et al. 2002) (siehe Abbildung 3).

Abbildung 3: Spiralarteriendifferenzierung in normaler und pathologischer Schwangerschaft

1 Spiralarterie, 2 Myometrium, 3 + 4 extra-villöser Trophoblast,, 5 Dezidua, 6 mangelhaft differenzierte Spiralarterie, 7 erweitertes utero-plazentares Gefäß. Nach Moffett-King 2002

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Endstrecke einer EVT Maldifferenzierung ist eine Inkonstanz des plazentaren

Blutflusses in Phasen der Vasokonstriktion mit temporärer Gewebehypoxie, wobei

der absolute Blutfluss ggf. unverändert ist (Kuzmina et al. 2005, Scifres et al. 2009).

Der Wechsel von Hypoxie und Reperfusion führt zu oxidativem Stress und einer

Freisetzung von reaktiven Sauerstoffradikalen (Reactive Oxygen Species (ROS)).

ROS wirken toxisch auf den Synzytiotrophoblast im ersten Trimenon. Folglich zeigt

sich eine erhöhte Apoptoserate, ein erhöhtes Risiko für Infarkte und synzytiale

Nekrosen in plazentarem Gewebe (Hung et al. 2001, Kuzmina 2005, Cindrova-

Davies et al. 2007). Die inadäquate Blutversorgung des Fetus bedingt ein erhöhtes

Risiko für IUGR (Kuzmina et al. 2005, Scifres et al. 2009) (siehe Abbildung 4).

Abbildung 4: Pathogenese IUGR

Reaktive Sauerstoffradikale, eine verminderte Fusionsrate der Zytotrophoblasten und eine erhöhte Apoptoserate in der Plazenta führen zu einem Ungleichgewicht zwischen Schädigung und Reparatur des Synzytiotrophoblasten und damit zu einem gestörten Gas- und Nährstoffaustausch an der feto-maternalen Grenzfläche, was eine IUGR nach sich zieht

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Neben den erwähnten, unmittelbar perinatalen Risiken für Mutter und Kind bewirkt

IUGR beim Kind negative Langzeitfolgen welche mechanistisch unter dem Begriff

der fetalen Programmierung subsumiert werden und von starkem gesundheits-

ökonomischem Interesse sind (Flanagan et al. 1999).

3.2 Fetale Programmierung

„Fetale Programmierung“ oder die „developmental origins of health and disease“-

Hypothese beschreibt den Zusammenhang von strukturellen und funktionellen

Veränderungen in kritischen Phasen der fetalen Entwicklung mit daraus

resultierenden Langzeitschäden und Erkrankungen im Erwachsenenalter (Warner et

al. 2010). Der Begriff der fetalen Programmierung wurde initial vor allem von Hales

und Barker geprägt, welche in retrospektiven Studien im humanen Kollektiv einen

inversen Zusammenhang zwischen dem Geburtsgewicht und der Entwicklung von

kardiovaskulären und metabolischen Erkrankungen aufzeigen konnten (Hales et al.

1991, Hales et al. 2001, Barker 2004). Im Einzelnen werden heute folgende

Erkrankungen ätiopathologisch im Zusammenhang mit fetalen Programmierungs-

vorgängen beim Menschen diskutiert: Diabetes mellitus Typ 2 und verminderte

Glukosetoleranz (Hales et al. 1991), Adipositas (Ong et al. 2000), koronare

Herzkrankheit (Eriksson et al. 2001) sowie Hypertonie und renale

Funktionsstörungen mit konsekutiver Niereninsuffizienz (Dötsch et al. 2009).

Als funktionelles Erklärungsmodell wurde im Verlauf die „thrifty phenotype“

Hypothese von Barker postuliert (Barker et al. 2001). Diese besagt, dass fetale

Mangelernährung physiologische und metabolische Adaptationsvorgänge (sog.

„Programmierung“) bedingt, welche neben dem akuten Überleben des Feten im

Mutterleib, auch seine Überlebenschancen bei postnatal fortbestehender

Mangelernährung erhöhen. Dabei sind die Mechanismen, welche ein Einsparen

fetaler Ressourcen („thrifty“, engl. geizig) während Phasen der Restriktion

ermöglichen, durch ihr postnatales Fortbestehen (Programmierung des phenotype)

ursächlich für das Auftreten von Erkrankungen in diesem Kollektiv.

So werden zugunsten der Entwicklung und Versorgung lebenswichtiger Organe (z.B.

Gehirn) Ressourcen „eingespart“, wodurch sich bei Geburt eine Unreife vor allem

von Nieren, Leber und dem Endokrinum (Pankreas, hypothalamo-hypophysär-

adrenale Achse) (Hales et al. 1999, Barker et al. 2004, Ward et al 2004) zeigt.

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Da der „thrifty phenotype“ hypothetisch auch nach der Geburt bei ausreichender

Nahrungsversorgung sein intra-uterin festgelegtes Sparprogramm nicht ablegen

kann, wird der unreife Organismus durch die relative Hyperalimentation darüber

hinaus belastet.

Aufgrund ihrer gesundheitlichen Folgen für das Neugeborene ist die fetale

Programmierung aktueller neonataler Forschungsschwerpunkt bei IUGR. Dabei gilt

es, prädiktive Biomarker für das Vorliegen des thrifty phenotype unmittelbar

postnatal zu identifizieren, um ggf. individuell präventiv behandeln zu können.

Hierbei kommt der Plazenta als kindlichem Organ in der Prädiktiv-Diagnostik fetaler

Programmierungsvorgänge beim Neugeborenen nicht zuletzt auf Grund ihrer

direkten Verfügbarkeit eine entscheidende Bedeutung zu.

Plazentare in vitro Studien konnten bereits die ätiopathologische Rolle von

Sauerstoff und plazentaren Hormonen wie Leptin, CRH und Dexamethason bei

IUGR zeigen, welche als plazentare Biomarker diskutiert werden (Hung et al. 2001,

Tzschoppe et al. 2011, Ain et al. 2005). Die Interaktion dieser endokrinen Faktoren

an der feto-maternalen Grenzfläche und ihr Einfluss auf IUGR sind jedoch bislang

nur unzureichend geklärt.

3.3 CRH

Das CRH ist ein aus 41 Aminosäuren bestehendes Polypeptid welches 1981 erstmals

aus Schafshypothalami isoliert und als Neuropeptid charakterisiert wurde. Bereits

1983 erfolgte die Sequenzaufklärung des humanen CRH, welches sich vom Schafs-

CRH durch sieben Aminosäuren unterscheidet. Die Bildung des CRH im

menschlichen Organismus erfolgt im Nucleus paraventricularis des Hypothalamus

aus einem 191 Aminosäuren langen Pro-Hormon. Über das hypothalamo-

hypophysäre Portalsystem gelangt es in den Hypophysenvorderlappen, wo es die

Ausschüttung des Adrenocorticotropen Hormons (ACTH) und Proopiomelanocortin

induziert. ACTH induziert seinerseits die Freisetzung von Glukokortikoiden aus den

Nebennierenrinden. Eine negative Rückkopplung erfolgt durch die Menge an, im

Blutkreislauf vorhandenen, Glukokortikoiden. Sie hemmt sowohl die CRH-Sekretion

im Hypothalamus als auch die ACTH-Biosynthese im Hypophysenvorderlappen.

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Die Sekretion von CRH unterliegt einer circadianen Rhythmik mit einem Maximum

um 8 Uhr. Zusätzlich wird die Sekretionsrate durch physischen und psychischen

Stress induziert. CRH reguliert indirekt das Immunsystem und die Immunantwort

(Kiapekou et al. 2010). Neben der hypothalamo-hypophysär-adrenalen Achse (HHA-

Achse) wurden CRH und seine Rezeptoren auch in den weiblichen

Reproduktionsorganen wie dem Ovar (Mastorakos et al. 1994), dem Endometrium

(Di Blasio et al. 1997), dem Myometrium (Clifton et al. 1998) und der Plazenta

nachgewiesen. In der Plazenta ist CRH im Synzytiotrophoblasten, nicht jedoch in

den Zytotrophoblasten zu finden (Riley et al. 1991). Es wurden bisher zwei

Unterformen von plazentaren CRH-Rezeptoren (CRH-R) beschrieben: CRH-R1 und

CRH-R2. Studien haben gezeigt, dass CRH-Rezeptoren vom Typ 1 in der Plazenta

und CRH-Rezeptoren vom Typ 2 im Myometrium von schwangeren Frauen

exprimiert werden (Karteris et al. 1998). Entsprechend der Rezeptorlokalisation übt

CRH in verschiedenen Schwangerschaftsstadien unterschiedliche Funktionen aus.

Präkonzeptionell reguliert CRH verschiedene ovarielle Reifungsprozesse (Luteolyse,

Follikelreifung, Ovulation, Steroidbiosynthese) (Kalantaridou et al. 2003). Einen

auto- bzw. parakrinen Effekt hat, lokal in der Plazenta synthetisiertes CRH auf die

Prostaglandinsynthese und somit auf den Dezidualisierungsprozess (Gao et al. 2008).

Hinzu kommt die regulierende Wirkung von CRH, zusammen mit anderen lokalen

Faktoren, auf die Immunantwort bei der Implantation der Blastozyste in mütterliches

Gewebe (Gravanis et al. 2002). Ein Zusammenhang zwischen der Konzentration an

in der Plazenta gebildetem CRH und dem Geburtstermin ist beschrieben (Ellis et al.

2002). In Schwangerschaften mit vorzeitiger Geburt zeigen sich höhere plazentare

Konzentrationen an CRH als in Schwangerschaften mit Geburt zum errechneten

Termin. Umgekehrt resultieren niedrige CRH-Werte in einer längeren

Schwangerschaftsdauer (> 41 Schwangerschaftswochen).

Diese Forschungsergebnisse erlauben die Vermutung, dass CRH die Funktion einer

„plazentaren Uhr“ hat, welche Einfluss auf die Dauer der Schwangerschaft nimmt

(Wadhwa et al. 2004). Die Dauer der Schwangerschaft und der Geburt ist abhängig

von einem empfindlichen Gleichgewicht zwischen inhibitorischen bzw.

stimulierenden Faktoren und systemischen bzw. lokalen Hormoneinflüssen (Gibb et

al. 2002). Hierzu gehören z.B. Uterotonika wie ACTH, Prostaglandine (PG) und

Oxytocin (OT), welche die Kontraktilität des Myometriums positiv beeinflussen.

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Bekannt ist der stimulierende Einfluss von plazentarem CRH auf die Synthese von

PG, ACTH und OT (Petraglia et al. 1995, Ochedalski et al. 2001). Während der

Schwangerschaft wird CRH trophoblastär gebildet und in den mütterlichen sowie

fetalen Blutkreislauf freigesetzt. Maternale CRH-Spiegel steigen exponentiell mit

dem Fortschreiten der Schwangerschaft an und haben ihren maximalen Anstieg zwei

Wochen vor der Geburt (Goland et al. 1992). Beeinflusst wird die CRH-Synthese

zum einen durch Cortisol, zum anderen durch Progesteron und Stickstoffmonoxid.

Inhibierend auf die Ausschüttung wirken Progesteron und Stickstoffmonoxid,

stimulatorisch wirken Katecholamine, OT, Zytokine und Glukokortikoide (Challis et

al. 2000).

Neben der Regulation durch diese systemischen Hormone erfolgt die lokale

Regulierung von CRH durch intrauterin synthetisiertes CRH-Bindeprotein (CRH-

BP) (Potter et al. 1991), welches mit hoher Affinität freies CRH bindet und dessen

Interaktion mit den CRH-Rezeptoren verhindert (Huising et al. 2008). Gegen Ende

der Schwangerschaft fällt die Konzentration an CRH-BP ab, weshalb die

Bioverfügbarkeit von CRH ansteigt (Petraglia et al. 1993). CRH wirkt über die

Induktion von endothelialem Stickstoffmonoxid vasodilatatorisch auf die

endometrialen Gefäße (Clifton et al. 1994). In der normalen Schwangerschaft wird

über die geringe Gefäßresistenz eine adäquate fetale Versorgung mit Sauerstoff und

Nährstoffen gewährleistet. Es wird postuliert, dass ein in der Schwangerschaft

erhöhtes CRH mit einer Mangelperfusion der Plazenta einhergeht (Donoghue et al.

2000). Interessanterweise ist der vasodilatatorische Effekt von CRH in Plazenten mit

erhöhter Gefäßresistenz, wie z.B. bei IUGR, erniedrigt (Clifton et al. 1995). Dieser

Effekt ist möglicherweise dem Verlust von CRH-Rezeptoren in IUGR-Plazenten

zuzuschreiben (Karteris et al. 2003). Ungeklärt bleibt der aktivierende Einfluss von

Hypoxie auf die fetale HHA-Achse und die dadurch sekundäre Erhöhung von CRH.

Das auf diese Weise fetal gebildete Kortison könnte über plazentare und membranöse

Glukokortikoidrezeptoren die CRH-Expression induzieren (Challis et al. 2000).

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3.4 Fragestellung

Ziel dieser Arbeit ist die Erforschung der Wirkung von CRH auf die Expression der

IUGR-Markergene Leptin und 11ßHSD-2 am Modell des villösen Zytotrophoblasten

in vitro. Weiterhin gilt es, die Wirkung von CRH auf die synzytiale Integrität in

diesem in vitro Modell zu untersuchen. Wir vermuten, dass die Behandlung von

primären villösen Trophoblasten mit CRH deren Synzytialisierungsrate abschwächt,

sowie zur Induktion der Leptinexpression und zur Reduktion der 11βHSD-2

Expression in diesen Zellen führt – Vorgänge welche man bei der IUGR unter

erhöhtem CRH in vivo beobachtet.

4 Methoden

4.1 Isolierung humaner Trophoblasten

Die Zellgewinnung erfolgte durch die Isolierung der Trophoblasten aus gesunden

Plazenten direkt post partum nach Sectio caesarea (Materialien siehe Tabelle 1).

Unter sterilen Bedingungen wurden die Nabelschnur, Amnionmembran und Dezidua

basalis der Plazenta entfernt und die Plazenta anschließend in 8-10 gleich große

Stücke zerteilt. Das trophoblastäre Gewebe wurde mit einem Metallschaber aus der

bindegewebigen Struktur der Zotten herausgelöst und mit 0,9%iger Natrium-

Chloridlösung gesäubert. Anschließend wurde das Zellmaterial auf zwei

Erlenmeyerkolben verteilt.

Zum weiteren Auftrennen der Zellen wurde das Gewebe durch mehrere Lagen

Mullgaze filtriert. Anschließend wurde das Plazentagewebe zu je 50g auf

Erlenmeyerkolben verteilt und je 250ml Enzymverdau I hinzugegeben. Nach 30-

minütiger Inkubation bei 37°C im Schüttelwasserbad wurde der Enzymverdau II je

zu gleichen Teilen hinzugegeben. Nach 15-minütiger Inkubation bei 37°C wurde zur

Beendigung des Enzymverdaus 50ml NKS (neonatales Kälberserum) hinzugefügt.

Durch 20-minütiges zentrifugieren bei 1250 U/min setzte sich der flüssige Überstand

von den festen Zellbestandteilen ab. Der Überstand wurde abgesaugt und die Pellets

in je 5ml Nährmedium resuspendiert um sie anschließend in einem Gefäß zu poolen.

Anschließend wurde die Suspension für weitere 20min bei 1250 U/min zentrifugiert.

Nach dem Absaugen des Überstandes wurde das Pellet mit Nährmedium

resuspendiert sodass 10ml Endvolumen enstanden.

20

Der, zum Auftrennen der verschiedenen Zelltypen notwendige Percoll-Gradient

wurde bei 4550U/min für 4h 10min ohne Bremse zentrifugiert. Auf den Percoll-

Gradienten wurden je 2,5ml der gelösten Pellets geschichtet und 30min bei

1400U/min ohne Bremse zentrifugiert. Mit einer sterilen Pasteurpipette wurde der,

nun als weißer Flocken sichtbare, Trophoblastenring abgesaugt, mit dem vierfachen

Volumen an Nährmedium aufgefüllt und bei 1250U/min für 15min zentrifugiert. Der

Überstand wurde abgesaugt und die restlichen Zellen mit 10ml Nährmedium

resuspendiert.

Um weitere Versuche durchzuführen bzw. um die Zellen einzufrieren, wurde deren

Anzahl bestimmt. Hierzu wurden 20µl der Zellsuspension mit 180µl Trypan Blue

Stain versetzt und 10µl dieser Mischung in allen vier Quadranten einer

Neubauerzählkammer gezählt. Anschließend wurden je 8x106 Zellen in Eppendorf

Cups eingefroren. Hierzu wurden die Zellen 10min bei 1500U/min zentrifugiert und

zusammen mit 500µl Nährmedium und 500µl Einfriermedium in Eppendorf Cups

pipettiert. Bis zur Weiterverwendung wurden die Zellen bei -80°C gelagert.

4.2 Trophoblastenstimulation

Die eingefrorenen Trophoblasten wurden in 37°C warmen Wasser aufgetaut, in 10ml

Nährmedium resuspendiert und anschließend 5min bei 1500U/min zentrifugiert. In

eine 6-Wellplatte wurden jeweils 3ml Nährmedium in jede Vertiefung vorgelegt. Der

abzentrifugierte Überstand wurde verworfen, das verbleibende Pellet mit

Nährmedium resuspensiert und 1ml der Zellsuspension in jede Vertiefung gegeben.

Pro 6-Wellplatte wurden 12x106 Zellen ausgesät und im Brutschrank bei 37°C

inkubiert. Nach 2-3h, 4-5h, 24h und kurz vor der Stimulation wurde jeweils ein

Mediumwechsel durchgeführt. Hierzu wurde das Nährmedium abgesaugt, die Platte

mit PBS (Phosphate Buffered Saline) mehrmals gespült und anschließend wieder

3ml Nährmedium hinzugegeben. Die Vitalität und das Wachstum der Zellen wurden

vor und nach jedem Mediumwechsel unter dem Mikroskop kontrolliert.

Zur Stimulation der Zellen wurde CRH 1µg/ml verwendet. In die oberen 3 Wells der

6-Well-Platte wurde kein CRH gegeben, sie dienten als Kontrolle. In die unteren 3

Wells wurde jeweils 1µg/ml CRH gegeben und die Platte für 6h, 12h, 24h, 48h und

72h bei 37°C inkubiert (siehe Abbildung 5).

21

Tabelle 1

Materialien Trophoblastenisolierung und –stimulation

Trophoblastennährmedium

500ml Medium M199 PAA Laboratories, Linz, Österreich

1ml 1M Hepes Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

München

3,4ml L-Glutamin Gibco, Invitrogen GmbH, Karlsruhe

5ml Antibiotika-Antimykotika-Mix:

Pen-Strep (Penicillin, Streptomycin) Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

München

Fungizone Gibco, Invitrogen GmbH, Karlsruhe

Enzymverdau I

200mg Trypsin Typ I Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

München

22

120mg DNase I (Desoxyribonuklease) Roche Diagnostics GmbH, Mannheim

20ml Dispase BD (Becton Dickinson) Biosciences,

Heidelberg

500ml HBSS (Hanks’ Balanced Salt

Solution) Gibco, Invitrogen GmbH, Karlsruhe

Enzymverdau II

20mg Trypsin Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

München

30mg DNase Roche Diagnostics GmbH, Mannheim

Jeweils in HBSS gelöst Gibco, Invitrogen GmbH, Karlsruhe

Percoll-Gradient

13ml HBSS 10x Gibco, Invitrogen GmbH, Karlsruhe

49,5ml Percoll Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

München

67,5ml Aqua destillata B.Braun AG, Melsungen

Einfriermedium (10ml)

2ml DMSO (Dimethylsulfoxide) Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

München

1ml FKS (fetales Kälberserum) PAA Laboratories, Linz, Österreich

7ml Trophoblastennährmedium s.o.

NKS PAA Laboratories, Linz, Österreich

Trypan Blue Stain Gibco, Invitrogen GmbH, Karlsruhe

PBS, pH 7,4 Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

München

Kochsalzlösung Carl Roth GmbH, München

Zentrifuge Universal 30RF Hettrich, Tuttlingen

Zentrifuge Rotanta96R Hettrich, Tuttlingen

23

4.3 R-A-Extraktion

Die RNA-Extraktion erfolgte mit Hilfe einer vierphasigen Methode:

Homogenisierung, Phasentrennung, RNA-Präzipitation und Waschen der RNA

(Materialien siehe Tabelle 2).

Zur Homogenisierung der Zellen wurden 500µl TRIzol (Total RNA Isolation)®

Reagent, einer monophasischen Lösung aus Phenol und Guanidin-Isothyocyanat

nach den Vorgaben des Herstellers in die Wells gegeben. Nach 5-minütiger

Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Zellen mit Hilfe einer Pipettenspitze

vorsichtig von dem Plattenboden gelöst. Durch das TRIzol Reagent erfolgt die

Zelllyse und Denaturierung der Proteine, ohne die enthaltene RNA zu beschädigen.

Das Zelllysat jedes Wells wurde in je ein Eppendorf Cup pipettiert und jedem Cup

100µl Chloroform zur Phasentrennung hinzugefügt. Nach 15sek mischen gefolgt von

2-3min Inkubation bei Raumtemperatur, wurden die Cups 15min bei 1200U/min und

4ºC zentrifugiert. Hierbei entstehen zwei Phasen: die obere wässrig-klare Phase

enthält die RNA, die untere zähe, milchig-rosafarbene Phase enthält die DNA und

Proteine. Die wässrige Phase wurde abpipettiert und mit 250µl Isopropanol versetzt.

Das Isopropanol sorgt für die Präzipitation der RNA. Nach 45-minütiger Inkubation

bei 4ºC wurde das Gemisch 15min bei 1500U/min und 4ºC zentrifugiert, wodurch

sich ein leicht milchiges Pellet aus RNA am Boden des Eppendorf-Cups absetzt. Das

Isopropanol wurde abgesaugt das Pellet an der Luft getrocknet. Anschließend wurde

es mit 500µl 75%-igem Ethanol gewaschen und 5min bei 15000U/min bei 4ºC

zentrifugiert. Der Ethanolüberstand wurde abgesaugt und die Pellets an der Luft

getrocknet. Anschließend wurden die RNA-Pellets jeweils in 50µl DEPC-Wasser

(Diethylpyrocarbonat in Aqua destillata) gelöst und nach Kontrolle der

Konzentration und Qualität der extrahierten RNA wurde diese bei -80ºC gelagert.

Tabelle 2

Materialien R-A-Extraktion

TRIzol®Reagent Invitrogen GmbH, Karlsruhe

Chloroform Amresco inc, Cochran, OH, USA

Ethanol Merck KG, Darmstadt

Isopropanol Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

München

24


Zentrifuge Rotanta96R Hettrich Tuttlingen

4.4 Photometrie

Die Photometrie diente der Konzentrationsbestimmung der RNA, um die nötige

Menge an RNA-Lösung für die reverse Transkription berechnen zu können

(Materialien siehe Tabelle 3). Die Absorption einer Flüssigkeit hängt von der

stofflichen Zusammensetzung und der Konzentration der Bestandteile ab. Um die

Konzentration eines Moleküls in einer Lösung zu ermitteln, wird der

Wellenlängenbereich gewählt, der von den zu bestimmenden Molekülen absorbiert

wird. Nukleinsäuren absorbieren ultraviolettes Licht bei einer Wellenlänge von

260nm. Bei 260nm und einer Absorption von 1,0 liegen die RNA in einer

Konzentration von 40µg/ml und die doppelsträngige DNA in einer Konzentration

von 50µg/ml vor. Proteine hingegen absorbieren ultraviolettes Licht bei einer

Wellenlänge von 280nm, Aromaten, Phenole und Salze bei einer Wellenlänge von

230nm. Um Kontaminationen herauszufiltern, wurde der Quotient zwischen der

Extinktion bei 260nm und 230nm bzw. 280nm erstellt. Im Idealfall liegt der Quotient

zwischen 1,8 und 2,2. Liegt der Quotient unter 1,8, ist eine Kontamination

wahrscheinlich.

Zur Messung wurde das Photometer zunächst mit destilliertem Wasser geeicht,

anschließend erfolgte die photometrische Messung der Proben. Hierfür wurden diese

mit Aqua ad iniectabilia auf 1:40 verdünnt und die Konzentration gemessen.

Tabelle 3

Materialien Photometrie

Aqua ad iniectabilia DeltaSelect GmbH, Pfullingen

BioPhotometer Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH,

Hamburg


Zentrifuge Rotanta96R Hettrich, Tuttlingen

25

4.5 Gelelektrophorese

Die Agarose-Gelelektrophorese ist ein Verfahren bei dem die RNA unter

Verwendung eines Gels als Trägermedium aufgetrennt wird (Materialien siehe

Tabelle 4). Hierdurch kann die Qualität der Proben kontrolliert werden.

Die Nukleinsäure-Stränge werden nach ihrer Größe getrennt und mit Strängen

bekannter Größe verglichen. Das verwendete Agarose-Gel besteht aus

Agarosepolymer-Fäden, welche sich in dem Gel zu einem Netz verbinden. Je höher

die Agarose konzentriert ist, desto kleiner sind die Poren des Gels. Bei angelgeter

Gleichstromspannung wandern negativ geladene Nukleinsäure-Moleküle durch das

Gel Richtung Anode. Kleinere Moleküle gelangen schneller durch das Gel, wodurch

die Auftrennung entsprechend der Größe erfolgt.

Zur Herstellung des 1%igen Agarose-Gels wurden 500mg Agarose-Pulver in 50ml

1x TAE-Laufpuffer (Tris-Acetat-EDTA-Laufpuffer, EDTA=Ethylendiamintetra-

acetat) gelöst und zum Kochen gebracht. Anschließend wurden 5µl Ethidiumbromid

hinzugegeben um die RNA-Fragmente, welche nativ nicht sichtbar sind, anzufärben

und unter fluoreszierendem Licht sichtbar zu machen. Das flüssige Gel wurde in eine

Kunststoffschale in die Gelelektrophoresekammer gegossen. Mit einem

Kunststoffkamm wurden Einfülltaschen nahe der Kathode geschaffen. Während dem

20-30-minütigen Aushärten des Gels, wurden 2µl RNA mit 3µl HPLC-Wasser

(Wasser für Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) und 1,5µl mit

Bromphenolblau angefärbten 5x TAE-Puffer versetzt. Nach dem Aushärten des Gels

wurde die Gelelektrophoresekammer vollständig mit 1x TAE-Laufpuffer bedeckt und

in jede Tasche eine der vorbehandelten RNA-Proben pipettiert. Die Auftrennung der

RNA-Fragmente erfolgte durch das Anlegen von 80V für 25-30min. Unter

ultraviolettem Licht der Wellenlänge 254nm werden die Banden der RNA bei 18 S

(Svedberg-Einheit) und bei 28 S sichtbar. Die Dokumentation der Banden erfolgte

durch Fotographie (siehe Abbildung 6).

26

Tabelle 4

Materialien Gelelektrophorese

Agarose (Biozym LE) Biozym Scientific GmbH, Hess,

Oldendorf

Ethidiumbromid Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

München

1x TAE-Puffer Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

München

5x TAE-Puffer Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

München

Bromphenolblau Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

München

HPLC-Wasser

28 S 18 S Abbildung 6: RNA-Banden bei 18 S und 28 S nach gelelektrophoretischer Auftrennung

27

4.6 Reverse Transkription

Die RNA lässt sich mittels des Enzyms reverse Transkriptase in die zugehörige

cDNA (complementary DNA) synthetisieren (Materialien siehe Tabelle 5).

Eingesetzt wurde hierfür die reverse Transkriptase aus dem „Moloney Murine

Leukemia Virus“. Mit Hilfe der Genexpressionsanalyse durch Polymeraseketten-

reaktion (PCR) kann anschließend die Expressionsrate der jeweils zugrunde

liegenden RNA bestimmt werden.

Die RNA wurde langsam bei Raumtemperatur aufgetaut, gemischt und kurz

zentrifugiert. Nach dem Auftauen musste die RNA gemäß der vorher photometrisch

bestimmten RNA-Werte auf eine Konzentration von 1µg RNA/ 8µl Probe mit

DEPC-Wasser verdünnt werden. Zunächst erfolgten die Zugabe von 4µl des DNase-

Verdaus und die anschließende 15-minütige Inkubation bei Raumtemperatur. Der

Verdauungsprozess wurde durch Zugabe von 1µl 25mM EDTA (Stop-Solution) und

die 15-minütige Inkubation im Heizblock bei 65° C beendet. Anschließend wurden

die Proben kurz zentrifugiert und 10µl des Mastermix A hinzugegeben. Nach 5-

minütiger Inkubation im Heizblock bei 70°C wurden die Proben für eine Minute auf

Eis abgekühlt. Nach Zugabe von 20µl des Mastermix B wurden die Proben für eine

Stunde bei 37°C inkubiert. Die Umwandlung der RNA in cDNA wurde durch 1-

minütige Abkühlung beendet. Die Proben wurden bis zur Weiterverarbeitung bei

-20°C gelagert.

Tabelle 5

Materialien Reverse Transkription

Dnase-Verdau

1µl 10x Reaction Buffer RQ1 Dnase Promega Madison, WI, USA

1µl DNase/ RNase (Ribonuklease) free Promega Madison, WI, USA

Stop Solution

25mM DNase Stop Solution Promega Madison, WI, USA

Mastermix A

0,6µl Random Primer 1:4, 0,5 µg/ µl Roche Diagnostics GmbH, Mannheim

0,4µl Oligo dt-Primer (0,5 µg/ µl) MWG-Biotech AG, Ebersberg

28

4µl DEPC-Wasser

Mastermix B

5µl MMLV-RT 5x Buffer Promega Madison, WI, USA

1,25µl dNTP-Mix

(Desoxyribonukleosid-triphosphat-Mix)

(10mM each 500µl)

Finnzymes, Espoo, Finnland

0,5µl RNase-Inhibitor 40U/µl Promega Madison, WI, USA

1µl MMLV Reverse Transkriptase

200U/µl

Promega Madison, WI, USA

2,25µl DEPC-Wasser

Zentrifuge Universal 30 RF Hettrich, Tuttlingen

Zentrifuge Rotanta 96R Hettrich, Tuttlingen

4.7 TaqMan-Real-Time-PCR

Die TaqMan-Real-Time-PCR dient der Vervielfältigung von Nukleinsäuren und

ermöglicht gleichzeitig die Quantifizierung der amplifizierten DNA mittels

fluoreszierenden Sonden. Der PCR-Prozess ist ein polyzyklisches Verfahren welches

in drei Schritten abläuft. Im ersten Schritt, dem Melting, erfolgt die Denaturierung

der doppelsträngigen DNA zu Einzelsträngen. Durch das Erhitzen auf über 90°C

lösen sich die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den komplementären Basen

und es liegen Einzelstränge vor. Im zweiten Schritt, dem Annealing, wird das

Reaktionsgemisch auf 60°C heruntergekühlt, sodass sich die spezifischen

Oligonukleotidprimer an das Startsegment anlagern können. Voraussetzung hierfür

ist die Kenntnis der Nukleotidsequenz, welche die zu amplifizierende Sequenz

umgibt. Komplementär zu diesen Sequenzen werden 16 bis 30 Basen lange

Oligonukleotide als Startermoleküle (Primer) für die DNA-Polymerase verwendet.

Diese Enzyme sind in der Lage die einzelnen DNA-Bausteine zu langen

Molekülsträngen zu verbinden. Im dritten Schritt, der Elongation, ergänzt die DNA-

Polymerase die einzelsträngige DNA durch das Anbauen von Nukleotiden in 3‘-5‘-

Richtung zu einem Doppelstrang.

29

Geht man von optimalen Bedingungen aus, verdoppelt sich bei jedem Zyklus die

Anzahl an kopierten DNA-Molekülen und es erfolgt eine exponentielle Vermehrung

des gewünschten DNA-Segments. Zur Messung der amplifizierten DNA werden

spezielle TaqMan-Sonden verwendet. Für die vorliegende Arbeit wurde die

AmpliTaq Gold™ DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus verwendet, eine

hitzestabile DNA-Polymerase, welche mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen markiert ist.

Am 5‘-Ende dient FAM (6-Carboxy-Fluorescein) als Reporter-Farbstoff und am 3‘-

Ende TAMRA (6-Carboxy-tetramethyl-rhodamin) als Quencher, welcher als

Farblöscher fungiert. Das Messverfahren funktioniert nach dem Prinzip des TaqMan

PCR Assay. Die Sonde bindet an die Zielsequenz, wodurch die Verbindung der

Farbstoffe durch die 5’Exonukleaseaktivität der Polymerase getrennt wird und die

Auslöschung der Fluoreszenz von FAM durch TAMRA unterbleibt. Die Zunahme der

FAM-Fluoreszenz ist hierbei proportional zur Anzahl neu synthetisierter Kopien und

wird in jedem Zyklus mittels eines automatischen Sequenzdetektors gemessen.

Aufgrund der spezifischen Hybridisierung zwischen Sonde und Matrize, welche

benötigt wird, um Fluoreszenzsignale zu generieren, werden unspezifische DNA-

Amplifikationen nicht detektiert. Die ursprüngliche Menge eingesetzter DNA wird

durch die Analyse der Fluoreszenzintensität bestimmt. Hierbei normalisiert zunächst

ein Algorithmus das Fluoreszenz-Signal der Reporter-Sonde auf eine passive

Referenz. Hierfür wurde der Farbstoff ROX (6-Carboxy-X-rhodamin) verwendet,

welcher weder seine Konzentration noch seine Fluoreszenz während der Analyse

verändert. Der ermittelte Algorithmus multipliziert die Standardabweichung der

Hintergrundfluoreszenzen während der ersten Zyklen (in den meisten PCR-Systemen

Zyklus 3-15) mit einem Fehlerfaktor von 10, um einen Schwellenwert zu bestimmen

und anschließend den CT-Wert abzuleiten. Dieser Wert entspricht der Anzahl an

Zyklen, bei der das gemessene Fluoreszenz-Signal erstmals einen vorgegebenen

Schwellenwert übersteigt. Hierbei hängt der Maximalwert von der Effizienz der

DNA-Amplifikation und des Abspaltens der Sonde ab. Zwischen CT und dem

Logarithmus der anfangs eingesetzten Menge an DNA besteht ein linearer

Zusammenhang über fünf Zehnerpotenzen hinweg. Die CT-Werte der Proben werden

dabei auf eine externe Standardkurve interpoliert, welche mittels Verdünnungsreihen

einer definierten cDNA-Probe erstellt wurde.

Die Durchführung der PCR erfolgte anhand des Protokolls von Applied Biosystems

(Materialien siehe Tabelle 6). Zunächst erfolgte die Herstellung des Mastermix.

30

Dieser besteht aus qPCR Core Kit- No ROX, ROX Passive reference, Sonde,

reverse- und forward-Primer. Zusätzlich wurde eine spezifische Menge an HPLC-

Wasser („H2O“) und die für das nachzuweisende Gen spezifische Menge an

Magnesiumchlorid (MgCl2) hinzugegeben. Das MgCl2 dient der AmpliTaq Gold-

Polymerase als Cofaktor und stabilisiert die Bindung der Sonde. Es wurde eine 96-

Well-Platte verwendet und in jeweils eine Vertiefung 22,5µl Mastermix und 2,5µl

cDNA pipettiert. Zusätzlich wurde für jedes Gen eine Negativkontrolle mit HPLC-

Wasser und zwei Standardreihen angelegt. Es handelt sich hierbei um geometrische

Verdünnungsreihen mit Konzentrationen von cDNA (2,5µl) zu HPLC-Wasser von

1:1 bis 1:128 und 22,5µl Mastermix. Vor dem Starten der PCR wurde eine

Backgroundmessung am Real Time PCR Gerät (Modell 7500 Applied Biosystems)

durchgeführt um Verunreinigungen zu detektieren und zu beseitigen. Anschließend

erfolgte die Messung mit Hilfe einer gerätespezifischen Computersoftware

(Sequence Detection Software für 7500 Real Time PCR, Applied Biosystems).

Tabelle 6

Materialien TaqMan-Real-Time-PCR

Mastermix (Mengenangaben pro Well)

qPCR Core Kit-No ROX

2,5µl 10x Taq-Buffer II Eurogentec, Seraing, Belgien

1µl dNTP-Mix (Uridintriphosphat), 5mM Eurogentec, Seraing, Belgien

MgCl, 50mM Eurogentec, Seraing, Belgien

0,13µl AmpliTaq Gold DNA-Polymerase Eurogentec, Seraing, Belgien

0,25µl AmpERase UNG Eurogentec, Seraing, Belgien

1,75µl ROX Passive reference RT-PARE-03 Eurogentec, Seraing, Belgien

Primer

2,5µl forward Primer (3 oder 6 µM) MWG-Biotech AG, Ebersberg

2,5µl reverse Primer (3 oder 6 µM) MWG-Biotech AG, Ebersberg

Sonde

2,5µl TaqMan-Sonde (2µM) MWG-Biotech AG, Ebersberg

31

Aqua destillata B.Braun AG, Melsungen

7500 Real Time PCR System Applied Biosystems, Darmstadt

Konzentrationen MgCl2 und H2O

HPRT

MgCl2-Konzentration (mM) 4,50

MgCl2-Volumen (µl) 2,25

H2O-Volumen (µl) 7,12

ß2-MG




Leptin




11ßHSD-2




Sequenzen der verwendeten Primer und Sonden

HPRT

Forward 5‘-CCG GCT CCG TTA TGG C-3´

Reverse 5‘-GGT CAT AAC CTG GTT CAT CAT CA-3´

Sonde 5‘(FAM)-CGC AGC CCT GGC GTC GTG ATT A-

(TAMRA)3‘

ß2-MG

Forward 5‘-TGA CTT TGT CAC AGC CCA AGA TA-3´

Reverse 5‘-CCA AAT GCG GCA TCT TC-3´

Sonde 5‘(FAM)-TGA TGC TGC TTA CAT GTC TCG ATC CCA-

32

(TAMRA)3‘

Leptin

Forward 5‘-ACA ATT GTC ACC AGG ATC AAT GAC-3´

Reverse 5‘-GGG CTG TTC AAC TCC AAT ACG-3´

Sonde 5‘(FAM)-CAA GGA GAC GGC CAA GAA ACT GGA CTC-

(TAMRA)3‘

11ßHSD-2

Forward 5‘-CAT CAC CGG CTG TGA CTC TG-3´

Reverse 5‘-CGG CAG CCG CAT GTT AG-3´

Sonde 5‘(FAM)-AAA GGA GAC AAT TTG GCT CTG C-

(TAMRA)3‘

4.8 ELISA

Der ELISA (Enzyme Linked Immunabsorbent Assay) bezeichnet ein

immunologisches Nachweisverfahren für einzelne Proteine. Man nutzt hierbei

spezifische Antikörper, die an den nachzuweisenden Stoff (Antigen) binden. Ein

zuvor angehängtes Enzym katalysiert eine Reaktion, welche das Vorhandensein des

Antigens bestätigt.

4.8.1 LDH-ELISA

In der vorliegenden Arbeit wurde das Prinzip des ELISA mittels Toxicology Assay

Kit Lactate Dehydrogenase based (Sigma Aldrich) angewandt, um eine eventuelle

Toxizität des verwendeten Materials herauszufinden. Im Kulturüberstand der

stimulierten Trophoblasten wurde die Laktatdehydrogenase (LDH) gemessen, da

LDH beim Zelltod freigesetzt wird und somit ein Indikator für die Zellschädigung

ist. Dieser Assay basiert auf dem Prinzip, dass LDH zu einer Reduktion von NAD

(Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid) zu NADH führt. NADH wiederum führt zur

Umwandlung des hinzugegebenen Farbstoffes Tetrazolium. Dieser Farbausschlag

kann spektralphotometrisch gemessen werden (Materialien siehe Tabelle 7). Zur

LDH-Messung wurde ein LDH-Mix verwendet, welcher sich zu gleichen Teilen aus

der LDH-Assay Substrate Solution, dem Cofactor und der Dye-Solution (Farbstoff)

zusammensetzt.

33

In ein Well wurden 200µl des LDH-Mix und 100µl des Kulturüberstands der

Trophoblasten pipettiert. Zusätzlich wurden zwei Negativkontrollen mit 100µl

Trophoblastennährmedium angelegt. Hierdurch kann unterschieden werden ob das

gemessene LDH durch die Trophoblasten oder durch das im Nährmedium enthaltene

FKS freigesetzt wurde. Nach 20-30-minütiger lichtgeschützter Inkubation wurde die

Reaktion durch die Zugabe von 30µl HCl (Chlorwasserstoff) beendet. Anschließend

erfolgte die photometrische Messung der LDH-Konzentration bei einer Wellenlänge

von 490nm. Die Ergebnisse wurden mit Hilfe der Computersoftware Ascent

Software for Multiscan Vers. 2.6. (©1996-2002 Thermo Labsystems Oy) ermittelt.

Tabelle 7

Materialien LDH-ELISA

LDH-Mix

1/3 LDH Assay Substrate Solution Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

München

1/3 LDH Assay Cofactor Preparation Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

München

1/3 LDH Assay Substrate Dye Solution Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

München

Trophoblastennährmedium

Siehe Tabelle 1

1 N HCl Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

München

Photometer Multiscan Termo Fischer Scientific Germany Ltd.

& Co. KG, Braunschweig

34

4.8.2 ßhCG-ELISA

Zur quantitativen Bestimmung des Gesamt-ßhCG im Serum wurde der ßhCG-ELISA

durchgeführt. Verwendet wurde der DRG ßhCG-ELISA Kit (DRG® Diagnostics)

(Materialien siehe Tabelle 8) nach Angaben des Herstellers. Die verwendete 96-Well-

Platte ist mit einem monoklonalen Antikörper beschichtet, welcher gegen eine

definierte Antikörper-Bindungsstelle des ßhCG-Moleküls gerichtet ist. Es wurden

25µl des Kulturüberstandes, zwei Standardreihen mit den Konzentrationen 0; 5; 25;

50; 100; 200 U/ml und zwei Negativkontrollen mit Trophoblastennährmedium in ein

Well pipettiert. Hinzu kamen 100µl eines anti-ßhCG-Antikörpers, konjugiert mit

Meerrettichperoxidase. Nach kurzem Schütteln des Wells erfolgte die 60-minütige

Inkubation bei Raumtemperatur. Es bildet sich ein Sandwichkomplex zwischen den

beiden Antikörpern und dem ßhCG-Molekül. Nach der Inkubation wurden die nicht

gebundenen Konjugate durch mehrmaliges Waschen des Wells mit destilliertem

Wasser, entfernt. Anschließend erfolgte die Zugabe von 100µl Substrate Solution.

Durch die enzymatische Reaktion kommt es zu einer Farbentwicklung, welche nach

einer definierten Zeit von 15 Minuten durch den Zusatz von 50µl Stop Solution

beendet wurde. Die hierbei gemessene Farbintensität ist proportional der ßhCG-

Konzentration in der Probe. Mit Hilfe eines Mikrotiterplattenlesers erfolgte die

Messung bei 450nm innerhalb von 10 Minuten nach Zugabe der Stop Solution.

Tabelle 8

Materialien ßHCG-ELISA

Mikrotiterwell mit anti-ßhCG-Antikörper

beschichtet

DRG Instruments GmbH, Marburg

Enzyme Conjugate DRG Instruments GmbH, Marburg

Substrate Solution DRG Instruments GmbH, Marburg

Stop Solution DRG Instruments GmbH, Marburg

Standard 0-5 DRG Instruments GmbH, Marburg

Sample Diluent

(Probenverdünnungsmedium)

DRG Instruments GmbH, Marburg

Photometer Multiscan EX Thermo Fischer Scientific Germany

Ltd. & Co. KG, Braunschweig

35

4.9 Statistische Datenauswertung

Die statistische Auswertung und die graphische Darstellung der erhobenen Daten

erfolgte mittels Two-Way-ANOVA mit Bonferroni post-Test (PRISM 4.0, Graph

PAD Software, San Diego, USA). Die mRNA-Expression der Housekeeping-Gene

HPRT und ß2-MG fungierte als Referenzwert zur Normalisierung der Daten. Zur

Auswertung der erhobenen Daten aus der TaqMan-PCR wurde der Quotient aus der

Leptin-mRNA bzw. der 11ßHSD-2-mRNA und der Housekeeping-Gen-mRNA

gebildet. Alle Werte wurden als Mittelwert ± SEM (Standarderror of the mean)

dargestellt. Ein p-Wert von <0,05 wurde als signifikant betrachtet. Im folgenden

Ergebnisteil sind die Signifikanzniveaus mit *=p<0,05, **=p<0,01, ***=p<0,001

gekennzeichnet.

5 Ergebnisse

5.1 R-A-Extraktion

5.1.1 Photometrie

Die Photometrie diente in der vorliegenden Arbeit zur Konzentrationsbestimmung

der zuvor extrahierten RNA. Gemessen wurden die Kontrollen, ebenso wie die mit

CRH stimulierten Proben bei einer Wellenlänge von 260nm. Die Verunreinigung der

Proben durch Proteine wurde durch den Quotienten aus der Extinktion bei

260nm/280nm errechnet. Er betrug maximal 2,42 und minimal 1,18 (Mittelwert

1,62). Die Verunreinigung der Proben durch Phenole, Salze und Aromaten wurde

durch den Quotienten aus der Extinktion bei 260nm/230nm errechnet. Er betrug

maximal 2,24 und minimal 0,57 (Mittelwert 1,07).

5.1.2 Gelelektrophorese

Die Qualitätsprüfung der Proben erfolgte durch die Gelelektrophorese. Beispielhaft

für die Ergebnisse der gelelektrophoretischen Auftrennung der RNA-Banden ist das

Foto in Abbildung 7. Zu sehen sind zwei Banden bei 18 S und 28 S als Nachweis für

intakte RNA.

36

5.2 TaqMan-Real-Time-PCR

Zur Auswertung der Ergebnisse der mRNA-Expression von Leptin und 11ßHSD-2

durch die TaqMan-Real-Time-PCR fungierten die Housekeeping-Gene HPRT und

ß2-MG als Referenzwert zur Normalisierung der Daten. In unseren Versuchen

wurden HPRT und ß2-MG in konstanter Menge exprimiert und daher als quantitative

Standards für die Expressionskontrolle verwendet. In unseren Auswertungen wurden

mRNA-Expressionsdaten bewusst in Relation zur HPRT Expression dargestellt, da

sich dieses Houskeeping-Gen in Metaanalysen plazentarer Studien stabil unter

hormoneller Stimulation zeigte (Meller et al. 2005). Eine Verifikation der Ergebnisse

erfolgte durch Bestimmung von ß2-MG, ohne Divergenz der Messergebnisse.

5.2.1 Stimulation der Trophoblasten mit CRH

5.2.1.1 Leptin-Expression unter CRH-Stimulation

Die Expression von Leptin ist in den Abbildungen 8 und 9 dargestellt. Die

Kontrollzellen zeigten einen Peak der Expressionsrate bei 24 Stunden. Es konnte ein

signifikanter Anstieg der Leptin-Expression in der Kontrollgruppe von 6 Stunden auf

24 Stunden (p<0,05) festgestellt werden. Die Leptin-Expression unter CRH-

Stimulation zeigte einen Peak bei 48 Stunden.

37

Zwei signifikante Anstiege von 6 Stunden bzw. 12 Stunden auf 48 Stunden (p<0,01)

und ein signifikanter Abfall von 48 Stunden auf 72 Stunden (p<0,01) waren

festzustellen.

Abbildung 10 und Tabelle 9 zeigen einen signifikanten Unterschied der Leptin-

Expression zwischen den stimulierten Zellen und den Kontrollzellen bei 48 Stunden

(p<0,05). Zu allen weiteren gemessen Zeitpunkten konnte kein signifikanter

Unterschied zwischen den stimulierten und nicht stimulierten Zellen festgestellt

werden.

38

Tabelle 9

Mittelwert Leptin/HPRT für CRH ± SEM

Zeit Kontrolle Stimuliert Signifikanz

6h 0,28 ± 0,00 0,49 ± 0,11 ns 12h 1,32 ± 0,52 1,12 ± 0,59 ns 24h 3,41 ± 1,20 2,57 ± 0,48 ns 48h 1,65 ± 0,18 5,35 ± 1,65 p < 0,05

72h 1,03 ± 0,12 0,92 ± 0,17 ns

5.2.1.2 11ßHSD-2-Expression unter CRH-Stimulation

Die Expression von 11ßHSD-2 ist in den Abbildungen 11 und 12 dargestellt. Es

konnte weder bei den Kontrollzellen noch bei den stimulierten Zellen ein

signifikanter Anstieg bzw. Abfall der Expressionsrate nachgewiesen werden. Wie in

Abbildung 13 und Tabelle 10 zu sehen, konnte kein signifikanter Unterschied der

11ßHSD-2-Expression zwischen den Kontrollzellen und den stimulierten Zellen

nachgewiesen werden.

39

Tabelle 10

Mittelwert 11ßHSD-2/HPRT für CRH ± SEM


6h 0,20 ± 0,01 0,46 ± 0,04 ns 12h 0,77 ± 0,35 0,38 ± 0,15 ns 24h 0,48 ± 0,20 0,45 ± 0,13 ns 48h 0,35 ± 0,04 0,88 ± 0,67 ns 72h 0,34 ± 0,04 0,34 ± 0,00 ns

5.3 ELISA

5.3.1 LDH-Assay

Die Abbildungen 14 und 15 zeigen die Ergebnisse der LDH-Messung im Überstand

der mit CRH stimulierten Trophoblasten und der nicht stimulierten Kontrollzellen. Es

konnte weder ein signifikanter Anstieg der LDH-Absorbance noch ein Unterschied

zwischen den mit CRH stimulierten und den nicht stimulierten Zellen nachgewiesen

werden (siehe Tabelle 11 und Abbildung 16).

40

Tabelle 11

Mittelwert LDH-Absorbance für CRH ± SEM


6h 0,021 ± 0,006 0,022 ± 0,013 ns 12h 0,036 ± 0,005 0,032 ± 0,001 ns 24h 0,255 ± 0,017 -0,004 ± 0,003 ns 48h 0,325 ± 0,004 0,019 ± 0,001 ns 72h 0,025 ± 0,005 0,029 ± 0,006 ns

41

5.3.2 ßhCG-ELISA

Abbildung 17 und Tabelle 12 zeigt die Ergebnisse der ßhCG-Messung im Überstand

der mit CRH stimulierten Trophoblasten und der nicht stimulierten Kontrollzellen. Es

zeigt sich ein Peak der ßhCG-Konzentration bei den stimulierten Trophoblasten und

den Kontrollzellen bei 72 Stunden. Es ergab sich bei den Kontrollzellen ein

signifikanter Konzentrations-Anstieg von 6/12/24 und 48 Stunden auf 72 Stunden

(p<0,001) und von 6 bzw. 12 Stunden auf 48 Stunden (p<0,01). Bei den mit CRH

stimulierten Zellen zeigte sich ein signifikanter Anstieg von 6/12/24 und 48 Stunden

auf 72 Stunden (p<0,001) und von 6/12 und 24 Stunden auf 48 Stunden (p<0,01/

p<0,05). Zu keinem Zeitpunkt ist ein signifikanter Unterschied zwischen der ßhCG-

Konzentration in den stimulierten und nicht stimulierten Zellen nachzuweisen.

Tabelle 12

Mittelwert ßHCG-Konzentration für CRH ± SEM


6h 0 ± 0 0 ± 0 ns 12h 0,23 ± 0,23 0 ± 0 ns 24h 14,02 ± 3,01 10,36 ± 1,54 ns 48h 29,93 ± 0,68 30,14 ± 3,89 ns 72h 185,50 ± 13,30 140,2 ± 4,82 ns

42

6 Diskussion

6.1 Diskussion der Methoden

6.1.1 Trophoblastenisolierung

Die Isolierung der Trophoblasten aus der Plazenta erfolgte nach der, im Labor

etablierten Methode des Trypsin-DNase-Dispase/Percoll-Gradienten. Mit dem hier

angewendeten Verfahren wurde ein zytotrophoblastärer Reinheitsgrad von 95%

erzielt. Dieser wurde via FACS Analyse (FACSCalibur, BD Biosciences) durch das

zellzytometrische Routinelabor der Kinder- und Jugendklinik Erlangen, wie in

Rübner et al. (Ruebner et al. 2010) beschrieben, ermittelt. Die restlichen 5% der

gewonnen Zellen enthalten neben synzytialen Fragmenten (Guilbert et al. 2007) auch

andere Gewebebestandteile der Plazenta, wie z.B. deziduale Zellen, Fibroblasten,

Makrophagen und Endothelzellen (Ruebner et al. 2010).

Die Verunreinigung durch synzytiale Fragmente beträgt nach

Ethidiumbromidanalyse (50µg/ml, Sigma-Aldrich) 8,5%. Diesem Grad an

Verunreinigung wurde mit Hilfe mehrerer Mediumwechsel nach 2h, 4h und 24h nach

Aussaat entgegengewirkt. Der Einfluss von Verunreinigungen der zytotropho-

blastären Zellpräparationen durch obige plazentare Zellen auf die hier präsentierten

Ergebnisse kann nicht vollständig ausgeschlossen werden. Zum Erhalt

zellspezifischerer Aussagen zu Prozessen des Zytotrophoblasten kann je nach

Fragestellung die hier verwendete Percoll-Methode um weitere, oberflächenantigen-

selektive Separationsschritte ergänzt werden (Ruebner et al. 2010, Stenqvist et al.

2008).

6.1.2 R-A-Extraktion

Die Isolierung der Ribonukleinsäuren aus Trophoblasten erfolgte mit Hilfe einer

vierphasigen Methode (Homogenisierung, Phasentrennung, RNA-Präzipitation und

Waschen der RNA), welche im Labor etabliert wurde. Verwendet wurde das TRIzol-

(Total RNA Isolation)® Reagent nach Angaben des Herstellers. Verunreinigungen

der Proben durch eingesetzte Chemikalien und das Lufttrocknen der Proben können

nicht ausgeschlossen werden. Verbesserungen konnten hierbei durch das Verwenden

einer Vakuumpumpe zum Absaugen von Lösungsresten erzielt werden. Hierdurch

verkürzt sich die Trockenzeit der Pellets. Messungenauigkeiten durch

Verunreinigungen wurden in der photometrischen Konzentrationsbestimmung der

43

RNA und der gelelektrophoretischen Auftrennung detektiert. Verunreinigte Proben

wurden verworfen. Verunreinigungsquellen waren verwendete Phenole, Salze und

Aromate. Eine RNA-Verunreinigung durch Proteine war bei unseren Experimenten

stets vernachlässigbar. Generell wurde versucht, den Einfluss der hier beschriebenen

Verunreinigungen auf die endgültigen Messergebnisse zu minimieren, ein gewisser

Resteinfluss ist jedoch nicht absolut auszuschließen.

6.1.3 TaqMan-Real-Time PCR

Die TaqMan-Real-Time PCR wurde zur quantitativen Darstellung der RNA-

Expression von 11ßHSD-2 und Leptin durchgeführt. Geringe Unterschiede der

Genexpression können mit hoher Sensitivität und Spezifität nachgewiesen werden.

Wie bereits bei Tzschoppe beschrieben, wurden die Ergebnisse der RNA-

Expressionsmessung auf die beiden Housekeeping-Gene Hypoxanthin-

Phosphoribosyl-Transferase (HPRT) und ß2-Mikroglobulin (ß2-MG) normalisiert

(Tzschoppe et al. 2011). In unseren Experimenten wurden HPRT und ß2-MG in

konstanter Menge exprimiert und daher als quantitative Standards für die

Expressionskontrolle verwendet. In unseren Auswertungen wurden mRNA-

Expressionsdaten bewusst in Relation zur HPRT Expression dargestellt, da dieses

Houskeeping-Gen, wie Metaanalysen in plazentaren Studien zeigen, stabil unter

hormoneller Stimulation ist (Meller et al. 2005). Eine Verifikation der Ergebnisse

erfolgte durch Bestimmung von ß2-MG, ohne Divergenz der Messergebnisse.

Generell sollte bei der Wahl der Housekeeping-Gene zur Optimierung der

Messgenauigkeit die Stabilität verwendeter Gene bezüglich der jeweiligen

Extraktionsmethode und Stimulation überprüft werden. Während sich in unseren

Experimenten HPRT und ß2-MG als konstant erwiesen, konnte eine komparative

Studie die Gene Ubiquitin C (UBC), Topoisomerase (DNA) 1 (TOP1) und

Phospholipase A2 (YWHAZ) als potentielle plazentare Housekeeper identifizieren

(Cleal et al. 2009).

6.2 Ergebnisse

6.2.1 Zelldifferenzierung und Zelltod

Die Messung von ßhCG im Überstand ergab einen signifikanten Anstieg nach 48

Stunden sowohl bei den mit 1µg/ml CRH stimulierten Trophoblasten, als auch den

44

nicht stimulierten Kontrollzellen. Ein signifikanter Unterschied in der Expression

konnte nicht nachgewiesen werden. Es zeigt sich daher, dass CRH keinen direkten

Einfluss auf die Synzytialisierung der Zytotrophoblasten hat. Desweiteren lässt der

späte Anstieg darauf schließen, dass ßhCG erst vom Synzytiotrophoblast und nicht

von den Zytotrophoblasten gebildet wird.

Die LDH-Konzentration im Überstand zeigte zu keinem Zeitpunkt, weder bei den

mit 1µg/ml CRH stimulierten Zellen noch bei den nicht stimulierten Kontrollzellen,

einen signifikanten Anstieg. Hierdurch wird eine konstante Vitalität der

Trophoblasten bewiesen. Zu keinem Stimulationszeitpunkt nimmt CRH Einfluss auf

die Reifung der Trophoblasten.

Der gemessene ßhCG-Anstieg ist somit nicht auf eine Zellschädigung oder Zelltod

zurückzuführen sondern ein valider indirekter Marker für die Synzytialisierungsrate

der Zytotrophoblasten. Bei nicht aussagekräftigen ßhCG-Messungen könnte man den

Prozess der Synzytialisierung auch direkt über eine zusätzliche Messung der

Genexpression von Syncytin-1 monitoren (Ruebener et al. 2010).

6.2.2 Leptin-Expression unter CRH-Stimulation

Leptin ist ein, vor allem von differenzierten Fettzellen, sezerniertes Proteohormon,

welches systemisch endokrine Steuerungsvorgänge des Stoffwechsel, der

Energiehomöostase und des Wachstums reguliert (Wauters et al. 2000). Neben diesen

Funktionen kommt Leptin auch eine entscheidende Rolle während der

Schwangerschaft zu. Hier findet sich eine Expression in fetalem sowie plazentarem

Gewebe (Hoggard et al. 1997). Die ausgedehnte Verteilung von Leptinrezeptoren

sowohl in der Plazenta als auch in dem Fetus lässt neben einer para-/autokrinen

Wirkung auch systemische Effekte Leptins in utero auf die Energiehomöostase und

das Wachstum vermuten (Forhead et al. 2009, Bodner et al. 1999). Wie bei

Klaffenbach et al. beschrieben, kommt es während der Schwangerschaft zu einer

erhöhten plazentaren Leptinproduktion (Klaffenbach et al. 2000).

Parallel zu Leptin erfolgt ein physiologischer, kontinuierlicher Anstieg der

synzytialen CRH-Expression bis zum Ende der Schwangerschaft (Ochedalski et al.

2001), wobei CRH entscheidend auf den dezidualen Gefäßtonus Einfluss nimmt

(Clifton et al. 1994). Beide Hormone stehen unter dem regulativen Einfluss von

Glukokortikoiden (Challis et al. 2000). Sowohl für Leptin als auch für CRH werden

45

para-/autokrine Wirkweisen diskutiert. Bislang existieren jedoch nur unzureichende

Daten zur gegenseitigen Einflussnahme dieser Hormone aufeinander.

Unsere Versuche zeigten einen signifikanten Anstieg der trophoblastären

Leptinexpression nach 48h. Während sich dies sowohl in Kontrollzellen, als auch

CRH(1µg/ml)-stimulierten Trophoblasten nachweisen ließ, war die Induktion der

Leptinexpression in CRH stimulierten Trophoblasten ausgeprägter. Basierend auf

den in dieser Arbeit präsentierten Ergebnissen lassen sich daher folgende

Hypothesen formulieren:

Der hier beobachtete spontane Anstieg der Leptinexpression in der Kontrollgruppe in

vitro entspricht plazentaren in vivo Ergebnissen, wonach Leptin im dritten Trimenon

vor allem von ausdifferenzierten Synzytiotrophoblasten gebildet wird, und

vermindert von undifferenzierten Zytotrophoblasten (Ashworth et al. 2000). Ein

Anstieg der Leptinkonzentration im zeitlichen Verlauf könnte daher möglicherweise

mit dem Fortschreiten des trophoblastären Reifungsprozesses zu funktionellem

Synzytium zu erklären sein. Trophoblastäre ßhCG-Produktion im Zellüberstand ist

bei gleichzeitigem Ausschluss erhöhter Zelllyse ein Marker für den

Synzytialisierungsgrad dieser Zellen. Wir konnten keinen Unterschied in der ßhCG-

Konzentration zwischen CRH-stimulierten und Kontrolltrophoblasten zeigen.

Schlussfolgernd könnte man annehmen, dass die gesteigerte Leptinexpression in der

CRH-Gruppe nicht sekundäre Folge einer CRH-induzierten Synzytialisierung war,

sondern die direkte Wirkung von CRH. Der Mechanismus und die funktionelle Rolle

einer solchen Stimulation bleiben unklar. Hypothetisch könnte eine parakrin CRH-

induzierte Leptinexpression des Synzytiums der geburtsinitiierenden Wirkung von

CRH auf das deziduale Gefäßbett und des Myometriums durch seine anti-

apoptotischen Eigenschaften entgegenwirken. Interessant in diesem Zusammenhang

ist die Tatsache, dass bei einer IUGR, welche unter anderem durch eine

Dysregulation im dezidualen Gefäßbett charakterisiert ist, niedrige Leptinspiegel

trotz hoher CRH-Spiegel zu finden sind (Jaquet et al. 1998). Dies könnte ggf. auf

eine Störung in der Kommunikation dieser beiden hormonellen Systeme (wie hier

gezeigt) begründet liegen, wobei der genaue Mechanismus Gegenstand weiterer

Untersuchungen sein wird.

46

6.2.3 11ßHSD-2-Expression unter CRH-Stimulation

11ßHSD-2 ist ein Schlüsselenzym in der Inaktivierung von aktivem Cortisol zu

seiner inaktiven Form Cortison und damit essentieller Bestandteil der plazentaren

Schranke zum Schutz des Fetus vor maternalem Glukokortikoidexzess (Benediktsson

et al 1997). In diesem Zusammenhang wird seine Funktion bei Cortisol-gesteuerten

Prozessen der fetalen Programmierung diskutiert, insbesondere in der Genese eines

metabolischen Phänotyps post-IUGR. In IUGR-Plazenten findet sich eine erhöhte

11ßHSD-2-Expression. Tzschoppe et al. zeigte einen positiven Zusammenhang

zwischen plazentarer 11ßHSD-2-Expression und postnatalem Wachstum bei IUGR

(Tzschoppe et al. 2009).

Unser in vitro Ergebnis an CRH-stimulierten Trophoblasten zeigte keinen

signifikanten Unterschied in Bezug auf die Genexpression von 11ßHSD-2 zu den

Kontrollzellen. Die plazentare CRH-Expression ist von Glukokortikoiden abhängig

und wird vor allem gegen Ende der Schwangerschaft durch diese induziert (Riley et

al. 1991). Die fehlende Wirkung von CRH auf die Expression von 11ßHSD-2 lässt

vermuten dass diese direkt über Glukokortikoidrezeptoren reguliert wird. Trotzdem

ist eine regulierende Rolle von plazentarem CRH nicht ausgeschlossen. Friedberg et

al. zeigte eine CRH-induzierte Reduktion der 11ßHSD-2-Expression in Adipozyten

in vitro (Friedberg et al. 2003). Ein solcher Effekt konnte bisher in der Plazenta noch

nicht nachgewiesen werden. Jedoch ist ein negativer Feedback-Mechanismus von

CRH auf die trophoblastäre 11ßHSD-2 Expression bei fehlender in vitro Stimulation

mit Glukokortikoiden hier nicht gänzlich auszuschließen.

6.3 Ausblick

Wir konnten zeigen, dass die Stimulation primärer humaner Trophoblasten mit CRH

keinen Einfluss auf deren Synzytialisierungsrate in vitro hat. CRH induzierte jedoch

die Leptinexpression in synzytialisierten Trophoblasten, was auf eine Interaktion

dieser Hormone an der feto-maternalen Grenzfläche schließen lässt. Der genaue

Wirkmechanismus des CRH auf die synzytiale Leptinexpression wurde in dieser

Arbeit nicht untersucht und bleibt Gegenstand weiterführender Forschungsprojekte.

Denkbar wäre eine Wirkung von CRH über seine synzytialen Rezeptoren CRH-R1

und -R2 und deren Splicevarianten (Karteris et al. 1998, Gao et al. 2007). Die

Tatsache, dass CRH keinen Einfluss auf den Vorgang der Synzytialisierung unserer

47

Trophoblasten in vitro zeigte, schließt Effekte des Hormons auf bereits

ausdifferenzierte Trophoblasten nicht gänzlich aus.

Einen solchen potentiellen Effekt gilt es in Folgeexperimenten zu überprüfen, wobei

man sich der Bestimmung von trophoblastären Fusionsindices und der

Expressionsrate des trophoblastären Fusionsproteins Syncytin-1 bedienen könnte,

wie bereits durch unsere Arbeitsgruppe beschrieben (Ruebner et al 2010). Weiterhin

kämen als alternative Methode auch in vitro Stimulationsversuche an villösen

Explantkulturen in Frage (siehe methodische Review Orendi et al. 2011).

Es wurden neue Mitglieder der CRH-Familie entdeckt: Urocortin I-III (Gu et al.

2001, Petraglia et al. 1996, Imperatore et al. 2006), welche ähnlich dem CRH an

CRH-R1 und –R2 binden (Richard et al. 2002, Grammatopoulos et al. 2002,

Slominski et al. 2001). Bekannt ist, dass maternale und fetale Plasma-

Urocortinspiegel bei Präeklampsie/IUGR erhöht sind (Florio et al. 2006). Aufgrund

ihrer Analogie zu CRH wären weiterführende Untersuchungen zum Einfluss dieser

Faktoren auf die hier dargestellten plazentaren Zielgene und Prozesse interessant,

insbesondere hinsichtlich einer möglichen lokalen Synergie dieser Hormone mit

CRH auf den Prozess der Synzytialisierung.

48

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8 Abkürzungsverzeichnis

11βHSD-2 11β-Hydroxysteroid Dehydrogenase-2

ß Beta

β2-MG β2-Mikroglobulin

βhCG β-humanes Chorion Gonadotropin

µ Mikro

ACTH Adrenocorticotropes Hormon

A Adenin

bzw. beziehungsweise

C Celsius

C Cytosin

ca. circa

cDNA complementary DNA

COX-2 Cyclooxygenase 2

CRH Corticotropin-Releasing Hormon

CRH-BP Corticotropin-Releasing Hormon-Bindeprotein

CRH-R Corticotropin-Releasing Hormon-Rezeptor

d day, Tag

DEPC Diethylpyrocarbonat

DMSO Dimethylsulfoxide

DNA Desoxyribonukleinsäure

DNase Desoxyribonuklease

dNTP-Mix Desoxyribonukleosidtriphosphat-Mix

EDTA Ethylendiamintetraacetat

e.g. exemplum gratiae

ELISA Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay

EVT extravillöser Trophoblast

FAM 6-Carboxy-Fluorescein

FKS fetales Kälberserum

ggf. Gegebenenfalls

G Guanosin

h hour, Stunde

H2O Wasser

57

HBSS Hanks’ Balanced Salt Solution

HCl Chlorwasserstoff, Salzsäure

HHA-Achse hypothalamo-hypophysär-adrenale-Achse

HPRT Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase

HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

IUGR intrauterine growth restriction, intrauterine

Wachstumsrestriktion

l liter, Liter

LDH Laktatdehydrogenase

M Mol

MgCl2 Magnesiumchlorid

min minute, Minute

ml milliliter

MMLV dem Moloney Murine Leukemia Virus

mRNA messenger RNA

NAD/NADH Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid

NKS neonatales Kälberserum

nm nanometer

NO Stickstoffmonoxid

ns nicht signifikant

OT Oxytocin

PAF Platelet activating Factor

PBS Phosphate Buffered Saline

p.c. post conceptionem

PCR Polymerase-Kettenreaktion

PE Präeklampsie

Pen-Strep Penicillin-Streptomycin

PG Prostaglandin

rel relative, relativ

RNA Ribonukleinsäure

RNase Ribonuklease

ROS Reactive Oxygen Species, reaktive Sauerstoffradikale

ROX passive reference dye (6-Carboxy-X-rhodamin)

RT-PCR Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion

58

S Svedberg-Einheiten

sek second, Sekunde

SEM Standarderror of the mean

sog. sogenannt

SZT Synzytiotrophoblast

T Thymin

TAE-Puffer Tris-Acetat-EDTA-Puffer

TAMRA 6-Carboxy-tetramethyl-rhodamin

TOP1 Topoisomerase 1

TRIzol® Reagent Total RNA Isolation Reagent

U Umdrehung

UBC Ubiquitin C

UTP Uridintriphosphat

UV ultraviolet

V Volt

YWHAZ Phospholipase A2

z.B. zum Beispiel

59

9 Danksagung

Zunächst gilt mein besonderer Dank Prof. Dr. med. Jörg Dötsch und Prof. Dr. med

Dr. h.c. Wolfgang Rascher für die außerordentliche gute Betreuung sowie für die

Bereitstellung des Themas.

Weiterhin möchte ich mich bei meinem Betreuer Dr. med. Fabian Fahlbusch für die

unermüdliche und außerordentlich engagierte, sowie kompetente Betreuung und

Beratung bedanken.

Desweiteren möchte ich Prof. Dr. rer. nat. Andrea Hartner für die hervorragende

Betreuung und Hilfestellung danken.

Mein besonderer Dank gilt meiner Mitdoktorandin Karoline Schulz-Harder für die

unermüdliche Unterstützung, Hilfestellung und hervorragende Zusammenarbeit.

Außerdem möchte ich mich bei Julia Seidel und Jens Bode für die tolle

Zusammenarbeit bedanken. Weiterhin gilt mein Dank Dr. med. Anja Tzschoppe,

Kathrin Bitterer und dem gesamten Laborteam der Kinderklinik Erlangen.

Desweiteren möchte ich mich bei Prof. Dr. med. Schild und dem Team der

Geburtshilfe der Universitäts-Frauenklinik Erlangen für die Bereitstellung der

Proben danken.

Zuletzt gilt mein besonderer Dank meinen Eltern Jutta und Werner Offergeld, meiner

Schwester Tanja Offergeld und meinem Freund Michael Tuchscherer für die

unermüdliche moralische Unterstützung und Geduld, ohne den Rückhalt und die

Unterstützung meiner Familie wäre dieser berufliche Werdegang nicht möglich

gewesen.

Bedeutung von Corticotropin-releasing Hormon für die · Der Trophoblast entwickelt sich zur...

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