Bioanalytik

Inhaltsverzeichnis:

Gebräuchliche Einheiten................................................................................................................................ 5

Substanzquantität, Volumen und Konzentration................................................................................................5Umrechnung von Massenkonzentration in Stoffmengenkonzentration........................................................................................................6

Verdünnen von Lösungen (Konzentration einer Substanz [S])..........................................................................6

Kohlenhydrate................................................................................................................................................ 8

Zucker in Lösung haben vorwiegend zyklische Struktur..............................................................................................................................8Die glycosidische Bindung.................................................................................................................................. 8

Zucker mit freier Aldehyd- oder Ketogruppe sind reduzierend.....................................................................................................................9

Aminosäuren und Proteïne.......................................................................................................................... 11

Primäre Aminogruppen von Aminosäuren und Proteïnen werden mit der Ninhydrin-Reaktion nachgewiesen.........................................11Biuret-Test.......................................................................................................................................................... 11

Peptidbindungen bilden blau-violette Cu2+-Komplexe.................................................................................................................................11Großmolekulare Proteïne werden von kleinen Molekülen durch Dialyse oder Gelchromatographie abgetrennt......................................12

Molekularmasse von Proteïnen.........................................................................................................................12Denaturierung von Proteïnen.............................................................................................................................13

Proteïne sind an ihrem isoelektrischen Punkt am wenigsten löslich..........................................................................................................13Proteïne werden aus wässrigen Lösungen durch Zugabe von Salz, organischen Lösungsmitteln oder bestimmten Säuren ausgefällt..14

Lipide............................................................................................................................................................ 15

Die physikalischen Eigenschaften der Neutralfette werden durch die Struktur der Fettsäuren bestimmt.................................................15Seifen, Detergentiën und Gallensäuren emulgieren wasserunlösliche Lipide............................................................................................15Nur emulgierte Neutralfette können durch Lipase hydrolysiert werden......................................................................................................15

Biologische Membranen.............................................................................................................................. 17

Die 3 häufigsten Phospholipidtypen..................................................................................................................17

Nucleïnsäuren............................................................................................................................................... 19

Die Purine und Pyrimidine haben ein Absorptionsmaximum bei 260 nm...................................................................................................19Das unterschiedliche UV-Spektrum von reduzierten und oxidierten Pyridinnucleotiden wird zur Messung vieler Enzymreaktionen benutzt.........................................................................................................................................................................................................19

pH-Messung und Titration........................................................................................................................... 21

Berechnung des pH-Wertes einer schwachen Säure........................................................................................21Berechnung des pH-Wertes von Wasser...........................................................................................................21Berechnung des pH-Wertes einer Lösung des Salzes einer schwachen Säure mit einer starken Base.........22Berechnung des pH-Wertes einer Pufferlösung................................................................................................22Ampholyte.......................................................................................................................................................... 23

Berechnung des isoelektrischen Punktes einer Aminosäure.....................................................................................................................23Titrationskurven zeigen die Abhängigkeit des pH-Wertes vom Verhältnis Base / Säure...........................................................................24pH-Indikatoren sind schwache Elektrolyte, bei denen die protonierte und die nicht-protonierte Form verschiedenfarbig sind.................24

Elektrophorese............................................................................................................................................. 25

Vereinfachte quantitative Behandlung der Wanderungsgeschwindigkeit geladener Teilchen im elektrischen Feld..................................25

Chromatographie.......................................................................................................................................... 27

Der Rf-Wert ist ein Maß für die Wanderungsgeschwindigkeit einer Substanz in Papier- und Dünnschichtchromatographie...................27Ionenaustauscher-Chromatographie.................................................................................................................27Gelchromatographie.......................................................................................................................................... 28

Photometrie.................................................................................................................................................. 31

Gesetz von Lambert-Beer.................................................................................................................................. 31Konzentrationsbestimmung durch Photometrie...............................................................................................31Photometer und Spektralphotometer................................................................................................................31

Schematische Darstellung eines Spektralphotometers..............................................................................................................................32Praktisches Vorgehen bei der Photometrie................................................................................................................................................32

Enzymreaktionen.......................................................................................................................................... 33

Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Substratkonzentration....................................................................33Bedeutung von Km und Vmax........................................................................................................................................................................34Bestimmung von Km und Vmax......................................................................................................................................................................35Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Enzymkonzentration..................................................................................................................36Abhängigkeit der Enzymaktivität vom pH...................................................................................................................................................36Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Temperatur................................................................................................................................37Wirkung von Inhibitoren und Aktivatoren auf die Enzymaktivität................................................................................................................37

Kompetitive Inhibitoren.........................................................................................................................................................................37Nicht-kompetitive Inhibitoren................................................................................................................................................................37Aktivatoren............................................................................................................................................................................................38

Einheiten der Enzymaktivität.......................................................................................................................................................................38Der optische Test nach Warburg................................................................................................................................................................38Bestimmung von Enzymaktivitäten im optischen Test...............................................................................................................................38

Bestimmung von Substratkonzentrationen durch einen optischen Test..............................................................................................39

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Molekularbiologische Methoden.................................................................................................................41

Plasmide............................................................................................................................................................. 41Restriktionsenzyme............................................................................................................................................ 41Agarose-Gelelektrophorese............................................................................................................................... 42Restriktionskarten.............................................................................................................................................. 42Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus................................................................................................43Polymerase-Kettenreaktion................................................................................................................................ 43

Radioaktive Isotope...................................................................................................................................... 45

In Biochemie und Medizin gebräuchliche Radioisotope:..................................................................................45Bestimmung der Radioaktivität......................................................................................................................... 45Messmethodik.................................................................................................................................................... 45„Background"..................................................................................................................................................... 46Zählstatistik........................................................................................................................................................ 46Einheiten der Radioaktivität............................................................................................................................... 46Spezifische Radioaktivität.................................................................................................................................. 46Wirkung radioaktiver Strahlung auf lebendes Gewebe - Radiodosimetrie......................................................46

Beispiele für innere Bestrahlung.................................................................................................................................................................47Richtlinien zum Arbeiten mit 3H- und 14C-markierten Substanzen....................................................................47

Immunologische Bestimmungsmethoden..................................................................................................49

Verzeichnisse................................................................................................................................................ 51

Abbildungsverzeichnis....................................................................................................................................... 51Formelverzeichnis.............................................................................................................................................. 51Gleichungsverzeichnis....................................................................................................................................... 52Tabellenverzeichnis........................................................................................................................................... 52

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Gebräuchliche Einheiten

Substanzquantität, Volumen und KonzentrationSubstanzquantität wird als Masse oder als Stoffmenge angegeben.

Masse: Basiseinheit ist das Kilogramm. Gebräuchliche Einheiten sind:

Gleichung 1 : Gebräuchliche Masse-Einheiten

Stoffmenge: Basiseinheit ist das mol. Ein mol ist die Stoffmenge, die der Molekularmasse einer Substanz in Gramm entspricht. Gebräuchliche Einheiten sind:

Gleichung 2 : Gebräuchliche Stoffmengen-Einheiten

Beispiel zur Umrechnung von Masse in Stoffmenge und umgekehrt:

Gleichung 3 : Umrechnung: Masse in Stoffmenge und vice versa

Volumen: Basiseinheit ist der Liter. Gebräuchliche Einheiten sind:

Gleichung 4 : Gebräuchliche Volumen-Einheiten

Konzentration wird als Massenkonzentration oder Stoffmengenkonzentration angegeben.

Massenkonzentration: Basiseinheit ist Kilogramm gelöste Substanz pro Liter Lösung. Gebräuchliche Einheiten sind:

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Gleichung 5 : Gebräuchliche Massenkonzentrations-Einheiten

Stoffmengenkonzentration: Basiseinheit ist mol gelöste Substanz pro Liter Lösung.

Beispiel: 1 mol/l Glucose = 180 g Glucose gelöst in H2O und durch weitere Zugabe von H2O auf 1 Liter gebracht. Gebräuchliche Einheiten und Symbole sind:

Gleichung 6 : Gebräuchliche Stoffmengenkonzentrations-Einheiten

Beispiele: Eine 1 M Lösung von Glucose enthält 1 mol/l bzw. 1 mmol/ml oder 1 µmol/µl. Eine 1 mM Lösung von Glucose enthält 1 mmol/l bzw. 1 µmol/ml oder 1 nmol/µl.

Umrechnung von Massenkonzentration in Stoffmengenkonzentration

Eine Lösung von 9 g/l Glucose ist:

Eine 10 nM Lösung von Glucose hat eine Massenkonzentration von:

Beachten Sie die verschiedene Bedeutung

Verdünnen von Lösungen (Konzentration einer Substanz [S])

Beispiele:

Zur Bestimmung einer Enzymaktivität werde 1,9 ml einer Enzymlösung (11 µg/ml) zu 0,5 ml Pufferlösung und 0,1 ml Substratlösung (5 mM) gegeben. Das Substrat wird 25-fach (2,5 ml Ansatz / 0,1 ml Substratlösung) verdünnt. Im Messansatz ist die Substratkonzentration 0,2 mM und die Enzymkonzentration 8,4 µg/ml (Verdünnungsfaktor: 2,5 ml / 1,9 ml = 1,32). Wenn im Messansatz eine Enzymaktivität von 14,4 U/ml bestimmt wird, ist die Aktivität der verwendeten Enzymlösung (14,4 U/ml x 1,32) = 19,0 U/ml.

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Zu 0,5 ml Serum werde eine Substanz durch Zugabe einer bestimmten Menge Fällungsreagens quantitativ ausgefällt, der Überstand nach Zentrifugation verworfen und das Präzipitat in 1,5 ml Puffer aufgelöst. Die gesamte Menge Substanz, die in 0,5 ml Serum enthalten war, ist nun in 1,5 ml enthalten (Volumen des Präzipitats ist vernachlässigbar klein). Verdünnung der Substanz: (1,5 ml/ 0,5 ml) = 3-fach.

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Kohlenhydrate

Kohlenhydrate sind primäre Oxidationsprodukte mehrwertiger Alkohole. Es sind entweder Polyhydroxyaldehyde (Aldosen) oder Polyhydroxyketone (Ketosen). Sie werden eingeteilt in Monosaccharide, Oligosaccharide (Disaccharide, Trisaccharide usw.) und hochmolekulare Polysaccharide.

Monosaccharide sind Aldehyde oder Ketone, die entsprechend der Anzahl ihrer C-Atome in Triosen, Pentosen, Hexosen usw. unterteilt werden. Monosaccharide und Oligosaccharide mit gleicher Anzahl C-Atome werden aufgrund der sterischen Anordnung (Konfiguration) der Substituënten an den C-Atomen unterschieden.

Monosaccharide und Oligosaccharide sind gut wasserlöslich. Gewisse Polysaccharide können in heißem Wasser gelöst werden.

Zucker in Lösung haben vorwiegend zyklische Struktur

Viele Eigenschaften der Monosaccharide sind auf ihre Aldehyd- bzw. Ketogruppe zurückzuführen. Diese Gruppen sind im Unterschied zu gewöhnlichen Aldehyd- und Keto-Funktionen nur zum kleineren Teil in freier Form vorhanden, größtenteils liegen sie als Cyklohalbacetal (-ketal) vor. Die Ringe entstehen durch Kondensation der Aldehyd- oder Ketogruppe mit einer alkoholischen OH-Gruppe desselben Monosaccharids. Zucker mit fünfgliedrigen Ringen werden Furanosen, solche mit sechsgliedrigen Pyranosen genannt wegen ihrer Ähnlichkeit zu Furan und Pyran. Freie Pentosen und Hexosen haben in der Regel Pyranosestruktur.

Dagegen liegt in Saccharose die Fructose und in Nukleïnsäuren die Ribose und Desoxyribose in der Furanoseform vor. Bei der Ringbildung sind am Hemiacetal- (bzw. Hemiketal-) Kohlenstoffatom 2 verschiedene räumliche Konfigurationen möglich, die als α- und β-Formen bezeichnet werden (= anomere Formen). Beide gehen leicht ineinander über (Mutarotation). Der Übergang erfolgt über die offenkettige Form.

Abbildung 1 : Ringbildung der Glucose (α- und β-Form)

Die glycosidische BindungGlycoside sind Zuckerderivate, bei welchen die OH-Gruppe am Hemiacetal- (bzw. Hemiketal-) Kohlenstoffatom mit

einem organischen Rest (R) kondensiert ist. Je nach Konfiguration der dabei entstehenden Acetalgruppe unterscheidet man anomere α- und β-Glycoside, je nach Art der R-Gruppe O- oder N-Glycoside.

Beispiel: Glycoside von Glucose.

Abbildung 2 : Glykoside von Glucose

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Die wichtigsten Glycoside sind die Oligo- und Polysaccharide. Bei den einfachsten Oligosacchariden, den Disacchariden, lassen sich 2 Bindungstypen unterscheiden. Bei der Saccharose erfolgt die glycosidische Bindung zwischen den hemiacetalischen (bzw. hemiketalischen) OH-Gruppen beider Zuckerreste. Solche Zucker tragen deshalb keine freie Halbacetalgruppe. Bei der Maltose erfolgt die Bindung zwischen einer hemiacetalischen und einer alkoholischen OH-Gruppe. Disaccharide des Maltose-Typs besitzen noch eine freie Halbacetalgruppe (Pfeil in untenstehenden Formeln).

Abbildung 3 : Disaccharide

Chemisch können glycosidische Bindungen mit Säure gespalten werden, gegen Basen sind sie stabil. Im Organismus werden Polysaccharide und Oligosaccharide enzymatisch gespalten.

Zucker mit freier Aldehyd- oder Ketogruppe sind reduzierend

Freie Aldehyde und Ketone in Zuckern sowie die entsprechenden Hemiacetale und Hemiketale werden durch milde Oxidationsmittel oxidiert. Weil bei dieser Reaktion das Oxidationsmittel durch den Zucker reduziert wird, spricht man von reduzierenden Zuckern. Alle Monosaccharide sind reduzierend. Disaccharide und Oligosaccharide dagegen sind nur reduzierend, wenn sie noch eine freie Hemiacetal- oder Hemiketalgruppe besitzen. Disaccharide vom Saccharose-Typ sind demgemäss nicht reduzierend. Hochmolekulare Polysaccharide wie Stärke und Glycogen wirken nicht reduzierend, weil in Polysaccharidlösungen die Konzentration der reduzierenden Molekülenden sehr niedrig ist.

In der Benedictschen Probe wird 2-wertiges Kupfer (alkalische Lösung von CuSO4 in Natriumcarbonat und Natriumcitrat) zur Oxidation von Zucker verwendet gemäss

Formel 1 : Benedict-Probe

Während der Reaktion entsteht aus dem blauen 2-wertigen Kupfer zuerst gelbes 1-wertiges Kupferhydroxid (CuOH) und später schwerlösliches Kupfer-(I)-oxid (Cu2O) als roter Niederschlag. Der Benedict-Test ist eine einfache Nachweismethode für reduzierende Zucker. Neben reduzierenden Zuckern geben aber auch andere reduzierende Substanzen eine positive Benedict-Reaktion. Für den spezifischen Nachweis einzelner reduzierender Zucker sind deshalb enzymatische Methoden notwendig. Zum spezifischen Nachweis von Glucose wird Glucoseoxidase aus Schimmelpilz verwendet, die folgende Reaktion katalysiert:

Formel 2 : Enzymatischer Glucosenachweis, Schritt 1

Das entstehende Wasserstoffperoxid wird in einer gekoppelten Reaktion dazu benutzt, eine farblose Verbindung (Chromogen) zu einem Farbstoff zu oxidieren. Die Reaktion wird durch eine Peroxidase katalysiert.

Formel 3 : Enzymatischer Glucosenachweis, Schritt 2

Für den semiquantitativen Glucosenachweis z.B. im Urin dient ein Teststäbchen (Diabur-Test), das mit den beiden Enzymen und dem Chromogen imprägniert ist. Für die quantitative Glucosebestimmung wird aus einer nicht absorbierenden Verbindung eine im UV-Bereich absorbierende Indikatorverbindung gebildet, deren Konzentration photometrisch gemessen wird.

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Aminosäuren und Proteïne

Zwanzig verschiedene Aminosäuren sind die üblichen Bausteine der Proteïne. Man unterscheidet saure, neutrale und basische Aminosäuren oder apolare (aliphatische, aromatische) und polare Aminosäuren. In den Proteïnen sind die Aminosäuren durch Peptidbindungen miteinander verknüpft.

Formel 4 : Peptidbindung in Proteïnen

Die Aminosäurensequenz (Primärstruktur) bestimmt die 3-dimensionale Anordnung der Peptidkette im Raum (Sekundär- und Tertiärstruktur). Häufig sind 2 und mehr Peptidketten mit ausgebildeter Sekundär- und Tertiärstruktur zu stabilen oligomeren Molekülen zusammengelagert (Quartärstruktur).

Primäre Aminogruppen von Aminosäuren und Proteïnen werden mit der Ninhydrin-Reaktion nachgewiesen

Ninhydrin reagiert mit Ammoniak und primären Aminogruppen zu einem blauen Farbstoff.

Formel 5 : Ninhydrin-Reaktion

α-Aminosäuren werden durch Ninhydrin oxidativ desaminiert und decarboxyliert. Auf analoge Weise reagiert auch die ε-NH2-Gruppe der Lysin-Seitenkette. Deshalb geben auch Proteïne eine positive Ninhydrin-Reaktion. Zur quantitativen Bestimmung von Aminosäuren wird die blaue Ninhydrin-Farbe photometrisch gemessen. Die Trennung verschiedener Aminosäuren durch Ionenaustauscher-Chromatographie und die anschließende photometrische Konzentrationsbestimmung mit Ninhydrin wird im sog. Aminosäurenanalysator vollautomatisch durchgeführt

Biuret-Test

Peptidbindungen bilden blau-violette Cu2+-Komplexe

In stark alkalischer Lösung entstehen aus Proteïnen und Kupfersulfat Koordinationskomplexe zwischen Cu 2+-Ionen und benachbarten Amid-Stickstoffatomen von Peptidbindungen. Biuret (H2N-CO-NH-CO-NH2) ist die einfachste Verbindung, welche einen derartigen blauvioletten Kupferkomplex bildet. Der Biuret-Test dient zur quantitativen photometrischen Proteïnbestimmung. Die Farbe des Komplexes ist in der Regel unabhängig von der Art des Proteïns, so dass eine für Serumalbumin bestimmte photometrische Kalibrierkurve auch für viele andere Proteïne benutzt werden kann.

Tryptophan und Tyrosin geben den Proteïnen ein charakteristisches UV-Spektrum mit Absorptionsmaximum bei 280 nm. Wie die Spektren in Abb. 4 zeigen, trägt Tryptophan am meisten und Phenylalanin kaum zur Absorption der Proteïne im nahen UV-Bereich bei.

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Abbildung 4 : Absorptionsspektren der aromatischen Aminosäuren

In Abb. 4 bedeutet εmM „millimolarer Extinktionskoëffiziënt“. Der millimolare Extinktionskoëffiziënt ist die Absorption einer millimolaren Lösung der entsprechenden Aminosäure. Je nach dem Gehalt an aromatischen Aminosäuren ändert die UV-Absorption von Proteïnen. In Abbildung 5 sind die UV-Spektren von Lösungen gleicher Massenkonzentration (mg/ml) von Lysozym, γ-Globulin und Ribonuclease dargestellt. Alle Peptide und Proteïne absorbieren sehr stark bei 220 nm aufgrund ihrer Peptidbindungen. Die 3 Proteïne enthalten unterschiedlich viel Tyrosin und Tryptophan. Zur Konzentrationsbestimmung kann die UV-Absorption bei 280 nm benutzt werden, wegen des variablen Gehalts an aromatischen Aminosäuren gilt jedoch eine Kalibrierkurve nur für ein bestimmtes Proteïn. Manche Proteïne absorbieren sichtbares Licht. Für das sichtbare Absorptionsspektrum sind prosthetische Gruppen verantwortlich (Häm, Flavin, etc.).

Abbildung 5 : Absorptionsspektren von Proteinen mit verschiedenem Gehaltan aromatischen Aminosäuren

Die Spektren wurden mit Proteïnlösungen gleicher Konzentration (1 mg/ml) aufgenommen.

Proteïn Tryptophangehalt Tyrosingehalt

Lysozym (Hühnereiweiß) 8,6 4,0

Ovalbumin (Hühnereiweiß) 1,3 3,8

Ribonuclease (Rind) 0,0 7,9Tabelle 1 :Tryptophan- und Tyrosingehalt in g Aminosäure pro 100 g Proteïn

Großmolekulare Proteïne werden von kleinen Molekülen durch Dialyse oder Gelchromatographie abgetrennt

Gewisse Cellophanmembranen sind für große Moleküle undurchlässig, für Wasser und andere kleine Moleküle durchlässig. Wird eine Proteïn-Salzlösung in einem Cellophanschlauch für längere Zeit (Stunden) in Wasser eingetaucht, so stellt sich für die frei passierbaren Moleküle durch Diffusion ein Konzentrations-Gleichgewicht über das gesamte Flüssigkeitsvolumen ein. Die großen Proteïnmoleküle werden im Schlauch zurückgehalten. Der Vorgang wird Dialyse genannt. Durch Dialyse können Proteïnlösungen entsalzt werden, oder ein Proteïn in einem Puffer  A kann durch Dialyse in einen neuen Puffer B gebracht werden. Die Hämodialyse (künstliche Niere) arbeitet nach demselben Prinzip. Mit der Gelchromatographie ist eine feinere Trennung von Molekülen unterschiedlicher Größe möglich als mit der Dialyse.

Molekularmasse von ProteïnenDie meisten Proteïne haben eine Molekularmasse (Mr) im Bereich 10.000 bis 100.000.

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Proteïn Molekularmasse

Glucagon (ein Peptid) 4.500

Ribonuclease 13.700

Myoglobin 17.000

Chymotrypsin 25.000

Hämoglobin 64.500

Serumalbumin 69.000

Aldolase 160.000

Phosphorylase a 390.000Tabelle 2 : Molekularmasse einiger Proteïne

Gebräuchliche Methoden zur Molekularmassebestimmung von Proteïnen sind Gelchromatographie, SDS-Gelelektrophorese und Sedimentationsanalyse in der Ultrazentrifuge. Die heute gebräuchlichste Methode ist die SDS-Gelelektrophorese. Bei dieser speziellen Elektrophoresemethode ist die Wanderungsgeschwindigkeit im elektrischen Feld fast ausschließlich eine Funktion der Molekülgröße. Proteïne mit niedriger Molekularmasse wandern schneller als solche mit hoher Molekularmasse. Die SDS-Gelelektrophorese ist nicht zu verwechseln mit der üblichen Proteïnelektrophorese, bei der native Proteïne aufgrund ihrer Ladung getrennt werden.

Die Molekularmassebestimmung in der Ultrazentrifuge ist aufwendig. Sie gibt aber zusätzlich Information über die Form und den Aggregationszustand von Proteïnmolekülen. Im künstlichen Schwerefeld der Ultrazentrifuge ist die Sedimentationsgeschwindigkeit Vs der Partikel von ihrer Größe abhängig gemäss Vs = S@Γ. Die Zentrifugalfeldstärke Γ wird bestimmt durch den Radius der Zentrifuge und die Tourenzahl. S ist die für die untersuchte Partikel charakteristische Sedimentationskonstante, welche experimentell gemäss der obigen Gleichung bestimmt werden kann. S ist unter anderem eine Funktion der Molekülmasse, und daher kann letzteres aus dem experimentell bestimmten S berechnet werden. Die Beziehung lautet:

Gleichung 7 : Berechnung der Sedimentationskonstanten

M = Molekularmasse, D = Diffusionskonstante, ρm und ρp = Dichte von Medium und Partikel, R = Gaskonstante, T = Temperatur (absolut). Die Sedimentationskonstanten werden in Svedberg-Einheiten [S] (1 Svedberg = 10-13 sec) ausgedrückt und auf ρm von Wasser und 20 °C normalisiert (S20,w). Typische Werte sind:

Myoglobin 2

Ribosomen-Untereinheiten

40

60

Viren 200

Zellen (komplett) 1000Tabelle 3 : Typische Werte für S

Denaturierung von ProteïnenDie native Struktur von Proteïnen wird unter dem Einfluss verschiedenster Faktoren zerstört, dazu gehören Wärme,

Schaumbildung, Zusatz von organischen Lösungsmitteln, Säuren, Basen, Schwermetallionen oder hohe Konzentration von Harnstoff. Die für die Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur verantwortlichen, nicht-kovalenten Bindungen werden teilweise oder ganz gelöst, während die für die Primärstruktur verantwortlichen kovalenten Bindungen erhalten bleiben. Man bezeichnet diesen Prozess der partiellen oder vollständigen Entfaltung der Peptidkette als Denaturierung. Ein denaturiertes Proteïn hat die gleiche Primärstruktur wie das native, hat aber keine einheitliche räumliche Struktur und andere physikalisch-chemische Eigenschaften (Beispiel: Hartwerden von Eiern beim Kochen).

Bei der Denaturierung geht die biologische Aktivität verloren. (Beispiele: Hitze-Inaktivierung von Enzymen und Proteïnhormonen). Denaturierung kann, muss aber nicht reversibel sein.

Denaturierung verringert in der Regel die Löslichkeit der Proteïne. Denaturierte Proteïne werden von Proteasen leichter gespalten als native: gekochtes Fleisch ist leichter verdaulich.

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Proteïne sind an ihrem isoelektrischen Punkt am wenigsten löslich

Die Löslichkeit der Proteïne variiert stark. Globuläre Proteïne wie Serumalbumin und Globuline sind im allgemeinen gut, Faserproteïne (Kollagen, Keratin) sehr schlecht löslich. Proteïne sind Polyelektrolyte. Elektrostatische Kräfte zwischen Proteïnmolekülen einerseits und zwischen Proteïnmolekülen und Wasserdipolen andererseits beeinflussen die Löslichkeit. Proteïne mit vielen geladenen Gruppen sind häufig gut wasserlöslich. Die Löslichkeit eines Proteïns ist am geringsten, wenn seine Gesamtladung gleich Null ist. Dies ist der Fall, wenn das Molekül gleich viele positive wie negative Ladungen trägt. Man bezeichnet den pH-Wert der wässrigen Lösung, bei dem dies zutrifft, als isoelektrischen Punkt (IEP) des Proteïns. Manche Proteïne fallen am IEP aus (= werden unlöslich). Bei pH-Werten über und unter dem IEP bewirken negative bzw. positive Überschussladungen gegenseitige Abstoßung der Proteïnmoleküle und damit bessere Löslichkeit.

Abbildung 6 : Löslichkeit von β-Lactoglobulin (IEP 5,2) in Abhängigkeit vom pH-Wert bei 25 °C.

Die Löslichkeit ist bei pH 6,0 mehr als 40 mal größer als bei pH 5,2.

Proteïne werden aus wässrigen Lösungen durch Zugabe von Salz, organischen Lösungsmitteln oder bestimmten Säuren ausgefällt

Zur Isolierung und Reinigung werden Proteïne häufig ausgefällt. Solche Fällungen müssen reversibel sein, soll das Proteïn seine biologische Aktivität behalten: Ein isoliertes Enzym muss nach der Fällung wieder gelöst werden können und unverminderte Aktivität besitzen. Bei manchen Analysemethoden stören anwesende Proteïne; sie werden deshalb irreversibel ausgefällt (z.B. durch ein Fällungsreagens wie Perchlorsäure oder Trichloressigsäure) und durch Zentrifugation abgetrennt. Eine solche "Deproteïnisierung" ist z.B. nötig bei der Bestimmung von Glucose im Serum.

Die meisten Fällungen beruhen auf der Änderung der elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen Proteïnmolekülen. So werden Proteïne aus wässrigen Lösungen durch Zugabe von organischen Lösungsmitteln ausgefällt, weil in organischen Lösungsmitteln die gegenseitige Anziehung der geladenen Proteïnmoleküle größer wird (Proteïne haben ein unregelmäßiges Muster von positiven und negativen Ladungen auf ihrer Oberfläche). Gemäss dem Coulombschen Gesetz über die Anziehung entgegengesetzt geladener Teilchen nimmt die elektrostatische Anziehung mit abnehmender Diëlektrizitätskonstante des Mediums zu. Organische Lösungsmittel haben eine niedrigere Diëlektrizitätskonstante als Wasser. Industriell bedeutungsvoll ist die Fällung von Blutplasmaproteïnen mit Alkohol und Aceton (Cohn-Fraktionierung). Die Fällung geschieht bei tiefen Temperaturen, damit die Plasmaproteïne nicht irreversibel denaturiert werden.

Zusatz eines Salzes in hoher Konzentration zu einer Proteïnlösung bewirkt die Erniedrigung der effektiven Konzentration (Aktivität) des Wassers und dadurch eine Herabsetzung der für die Lösung des Proteïns verfügbaren Wassermenge. Das Proteïn wird ausgefällt. Man bezeichnet die durch Salzzugabe bewirkte Ausfällung als Aussalzung. Sie ist meist reversibel und deshalb zur Isolierung von Enzymen geeignet. Gewöhnlich wird für die Aussalzung Ammoniumsulfat verwendet, weil es besonders gut löslich ist. Zur Ausfällung von verschiedenen Proteïnen werden unterschiedliche Konzentrationen von Ammoniumsulfat benötigt. Ein Proteïngemisch kann deshalb durch schrittweises Zufügen von Ammoniumsulfat aufgetrennt werden.

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Lipide

Die Lipide sind eine heterogene Stoffklasse. Ein hoher Gehalt an hydrophoben Gruppen ist ihnen gemeinsam. Lipide sind daher in organischen Lösungsmitteln gut, in Wasser schlecht löslich. Die Lipide können unterteilt werden in einfache Lipide, komplexe Lipide und Isoprenoidlipide. Zu den einfachen Lipiden gehören die Neutralfette oder Triacylglycerole. Es sind häufige Nahrungsbestandteile und Energiespeicher der Zelle. Zu den komplexen Lipiden werden z.B. die Membranbestandteile Lecithin, Cerebroside und Cardiolipin gezählt. Die Isoprenoidlipide sind Abkömmlinge des Isoprens und umfassen Verbindungen wie Cholesterin, Vitamin A, Steroidhormone und Gallensäuren. Cholesterin ist ein universeller Membranbestandteil, aber auch Ausgangsprodukt für die Biosynthese von Gallensäuren, Steroidhormonen und Vitamin D.

Die physikalischen Eigenschaften der Neutralfette werden durch die Struktur der Fettsäuren bestimmt

Die Fette und Öle der Nahrung sind Gemische verschiedener Triacylglycerole. Triacylglycerole sind Verbindungen, die aus einem Molekül Glycerol, verestert mit 3 Molekülen Fettsäure, bestehen. Sie tragen im Gegensatz zu den komplexen Lipiden keine ionisierbaren Gruppen, daher auch der Name Neutralfette. Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der Neutralfette sind je nach Fettsäurenzusammensetzung verschieden. So ist der Schmelzpunkt von Fetten um so niedriger, je kürzer die Fettsäuren und je größer die Zahl der ungesättigten Bindungen. Öle enthalten vorwiegend Triacylglycerole mit ungesättigten Fettsäuren. Tierische Fette haben einen Schmelzpunkt, der etwas unter der physiologischen Gewebstemperatur liegt. Fett aus dem Unterhautfettgewebe hat einen niedrigeren Schmelzpunkt als Fett aus dem Innern des Körpers.

Fettsäuren und Lipide, die ungesättigte Fettsäuren enthalten, werden leichter oxidiert als gesättigte Fettsäuren. Das Ranzigwerden von Fetten beruht zum Teil auf oxidativer Spaltung an den Doppelbindungen, wobei stark riechende Aldehyde oder Säuren geringerer Kettenlänge entstehen.

Seifen, Detergentiën und Gallensäuren emulgieren wasserunlösliche Lipide

In Haushalt und Labor werden wasserunlösliche Lipide mit Seifen oder Detergentiën emulgiert. Im tierischen Organismus haben die Gallensäuren eine ähnliche Aufgabe. Die 3 Verbindungen sind aus einem hydrophoben, apolaren Kohlenwasserstoffgerüst und einem hydrophilen, polaren „Kopfteil“ aufgebaut. Solche Verbindungen lösen sich in organischen Lösungsmitteln in der protonierten Form, im Wasser als Anionen. Sie sind amphiphil. In Öl-Wasser Gemischen reichern sich amphiphile Verbindungen an der Grenzfläche zwischen Öl und Wasser an. Sie sind oberflächenaktiv, d.h. sie erleichtern die Vergrößerung von Grenzflächen und ermöglichen so die Bildung mikroskopisch kleiner Öltröpfchen im Wasser; das Öl wird emulgiert. Im Unterschied zu einer echten Lösung sind aber die Lipidmoleküle in der Emulsion nicht direkt von Wassermolekülen umgeben, sondern von einer Hülle aus Seife, Detergens- oder Gallensäuremolekülen.

Formel 6 : Unterschiede bei Seife, Detergens- und Gallensäuremolekülen

Nur emulgierte Neutralfette können durch Lipase hydrolysiert werden

Im Dünndarm werden Neutralfette durch die Pankreaslipase in Monoacylglycerole und freie Fettsäuren gespalten. Die Lipase, ein Proteïnmolekül, ist nur in wässriger Phase löslich und aktiv. Die physiologische Funktion der Gallensäuren besteht darin, die Neutralfette zu kleinen Tröpfchen zu emulgieren, so dass eine große Grenzfläche für den Angriff der Lipase zur Verfügung steht.

Im Blut werden wasserunlösliche Lipide an Proteïne gebunden transportiert. Fettsäuren werden an Serumalbumin gebunden, Neutralfette, Cholesterin und Phospholipide an spezielle Lipoproteïne. Low Density Lipoproteïne (LDL) als hauptsächliche Träger von Cholesterin und Cholesterinestern sind besonders bedeutsam. Erhöhte Blutcholesterin-Werte sind ein Risikofaktor für die Entstehung von Arteriosklerose. Die Chylomikronen sind lichtmikroskopisch sichtbare Aggregate von Neutralfetten, umgeben von weniger hydrophoben Phospholipiden und hydrophilen Proteïnen. Es sind Transportvehikel für schwerlösliche Lipide aus der Dünndarmmucosa via Lymphe in die Blutbahn.

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Biologische Membranen

Biologische Membranen verschiedener Herkunft (Plasmamembran, ER1, Mitochondriënmembran, Golgi-Apparat, u.a.) können sich nicht nur in ihrer Proteïnzusammensetzung, sondern auch in ihrer Lipidzusammensetzung stark unterscheiden. Ebenso können sich je nach Zelltyp die Gesamtmenge und die Anteile der verschiedenen biologischen Membranen unterscheiden. Die Erythrozytenmembran besteht wie andere biologische Membranen hauptsächlich aus Lipiden und Proteïnen. Die Lipid-Doppelschicht ist 6-7 nm dick und enthält in einem Feld von 1 µm2 etwa 5 x 106

Lipidmoleküle. Die speziellen Eigenschaften der Membranlipide ermöglichen, dass sich die Lipidmoleküle spontan aneinander lagern und durch nicht-kovalente Wechselwirkungen zusammengehalten werden. Die Lipidfraktion umfasst polare Lipide, vor allem Glycerolphosphatide, aber auch Sphingolipide sowie Cholesterin. Die Grundstruktur der Glycerolphosphatide ist die mit einem Alkohol (R-OH) veresterte Phosphatidsäure.

Formel 7 : Grundstruktur der Glycerolphosphatide

R1 und R2 sind langkettige Fettsäuren. R2 ist meist eine ungesättigte Fettsäure, häufig die hochungesättigte Arachidonsäure (20:4), die nach Abspaltung aus Phospholipiden als unmittelbare Vorstufe zur Synthese hormonähnlicher Lipidsubstanzen dient (Prostaglandine, Thromboxane einerseits und Leukotriëne andererseits). Die polare Kopfgruppe X bestimmt den Typ des Phospholipids.

Die 3 häufigsten PhospholipidtypenPhospholipidtyp „Kopfgruppe“ (-X)

Phosphatidylcholin PC

Phosphatidylethanolamin PE

Phosphatidylserin PS

Phosphatidsäure

Tabelle 4 : Phospholipidtypen

Die Kohlenwasserstoffketten (Acylgruppen) der Membranlipide können entweder in starrem, geordnetem Verband oder in relativ ungeordnetem, „flüssigem“ Zustand existieren. Der starre Zustand wird begünstigt durch gesättigte Fettsäuren, während ungesättigte Fettsäuren infolge der cis-Doppelbindung(en) die geordnete Packung der Acylketten stören. Biologische Membranen sind asymmetrisch aufgebaut. Während PC vorwiegend und Glycolipide fast ausschließlich auf der extrazellulären Seite der Lipidmembran gefunden werden, befinden sich PE und PS hauptsächlich auf der cytoplasmatischen Seite. Einige der neutralen Glycolipide sind für die Blutgruppenspezifität von roten Blutzellen verantwortlich.

Abbildung 7 : Schnitt durch eine Lipid-Doppelschicht

Schnitt durch eine Lipid-Doppelschicht, die in der Darstellung eine flüssigkeitsähnliche Packungsdichte der Kohlenwasserstoffketten aufweist. Im dargestellten 30x30  Å großen Schnitt befinden sich sechs Cholesterinmoleküle, fünf Glycerophospholipidmoleküle (3 Typen) und vier Sphingolipidmoleküle (2 Typen). Die OH-Gruppe des Cholesterinmoleküls sitzt an der Oberfläche der Lipid-Doppelschicht, während das Steroid-Ringsystem sich im äußeren Anteil der Lipid-Doppelschicht befindet und mitverantwortlich ist für eine Versteifung der Doppelschicht in diesem Bereich.

1 Endoplasmatisches Retikulum

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Abbildung 8 : Diffusion von Phospholipidmolekülen in einer Lipid-Doppelschicht

Die spontane “Flip-Flop-Bewegung” ist ein äußerst seltenes Ereignis.

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Nucleïnsäuren

Zur Reinigung und Trennung großmolekularer Nucleïnsäuren, deren Aufbau und Struktur hier nicht behandelt werden soll, dienen ähnliche Methoden wie für Proteïne; die Gelchromatographie zur Trennung nach Molekülgröße und die SDS-Gelelektrophorese zur Molekularmassebestimmung. Oligonucleotide können aufgrund ihres Gehalts an negativ geladenen Phosphatgruppen durch Ionenaustauschchromatographie getrennt werden. Nucleïnsäuren sind gut wasserlöslich, fallen aber in saurem Milieu aus. Gegen Wärme oder organische Lösungsmittel sind Nucleïnsäuren wesentlich stabiler als Proteïne. Chemisch können Nucleïnsäuren durch Kochen in Säure in die Bausteine Phosphat, Pentose und Nucleïnbasen zerlegt werden. Im Organismus werden sie durch Nucleasen verschiedener Spezifität zu Oligo- und Mononucleotiden hydrolysiert. Pankreatische Ribonuclease spaltet die Esterbindung zwischen der Phosphatgruppe eines Pyrimidinnucleotids und dem C5 der Ribose des nächsten Nucleotids. Es entstehen freie Pyrimidin-3'-phosphate und Oligonucleotide mit einem Pyrimidin-3'-phosphat am einen Ende.

Die Purine und Pyrimidine haben ein Absorptionsmaximum bei 260 nm

Das Absorptionsmaximum ist um rund 20 nm im kurzwelligeren Bereich des Spektrums als dasjenige der Proteïne. Die Extinktionskoëffiziënten der Purine und Pyrimidine sind wesentlich höher als diejenigen von Tryptophan und Tyrosin. Im allgemeinen sind die Spektren aller Nucleïnsäuren gleich, allerdings gibt es gewisse von Struktur und Konformation abhängige Unterschiede. Zum Beispiel ändert sich das Spektrum von DNA bei der Denaturierung von doppelsträngiger zu einsträngiger DNA.

Das unterschiedliche UV-Spektrum von reduzierten und oxidierten Pyridinnucleotiden wird zur Messung vieler Enzymreaktionen benutzt

Pyridinnucleotide (NAD+↔NADP+) absorbieren ebenfalls maximal bei 260 nm, der Nicotinamidrest zeigt zusätzlich eine vom Redoxzustand (NAD+↔NADH) abhängige Absorption im längerwelligen UV. Enzymreaktionen, die mit den Reaktionen NAD+↔NADH oder NADP↔+NADPH gekoppelt sind, können daher bequem photometrisch verfolgt werden. Die Methode, historisch als „Optischer Test nach Warburg" bekannt, wird im klinisch-chemischen Labor außerordentlich häufig angewandt.

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pH-Messung und Titration

Eine Säure kann nach Brönsted definiert werden als eine Substanz, die in Lösung in ein Wasserstoffion und die konjugierte Base A- dissoziiert. Eine Base ist eine Substanz, die ein Wasserstoffion aufnehmen kann und dadurch zur konjugierten Säure wird. Diese Beziehungen sind gegeben durch die folgenden Gleichgewichte:

Formel 8 : Brönstedsche Säure-Base-Definition

Je nach Lage des Gleichgewichts kann eine Säure in wässriger Lösung in der undissoziierten, der dissoziierten Form oder einer Mischung der beiden vorliegen. Wasserstoffionen existieren in wässriger Lösung nur in hydratisierter Form als H3O+. Aus Gründen der Vereinfachung wird aber im folgenden auf diese Schreibweise verzichtet.

Bei der acidimetrischen Titration von Säuren werden sowohl die freien wie auch alle potentiell dissoziierbaren Wasserstoffionen (undissoziierte saure Äquivalenzen) erfasst. Bei der pH-Messung (pH = -log (H+)) wird nur die freie H+-Konzentration (bzw. Aktivität) gemessen.

Starke Säuren sind in wässriger Lösung vollständig dissoziiert. Eine 0,1 M HCl-Lösung liegt beispielsweise vollständig in Form von H+ und Cl--Ionen vor und ergibt daher eine H+-Konzentration von 0,1 M = 10-1 M, also einen pH-Wert von 1. Acidimetrische Titration und pH-Messung liefern in diesem Fall das gleiche Resultat.

Bei einer schwachen Säure ist die Dissoziation unvollständig. Das Gleichgewicht zwischen der dissoziierten und undissoziierten Form ist gegeben durch die Säuredissoziationskonstante Ka:

Gleichung 8 : Definition der Säuredissoziationskonstante

Je schwächer eine Säure, desto kleiner ist Ka. Acidimetrische Titration und pH-Messung liefern ungleiche Resultate. Eine 0,1 M Essigsäurelösung ist z.B. nur zu 1,5 % dissoziiert. Ihr pH-Wert ist etwa 2,85. Gl. 8 gestattet die Berechnung des pH-Wertes von wässrigen Lösungen schwacher Säuren, von Wasser, von wässrigen Lösungen von Salzen einer schwachen Säure und einer starken Base und von Mischungen der Lösungen solcher Salze und der zugehörigen schwachen Säure (Pufferlösungen).

Berechnung des pH-Wertes einer schwachen SäureWenn eine schwache Säure der Hauptlieferant von H+ ist, dann ist [H+] = [A-]. Gl. 8 wird somit umgeformt in:

Gleichung 9 : Säuredissoziationskonstante einer schwachen Säure

Bei einer schwachen Säure in einer Konzentration > 10 * Ka entspricht [AH] fast der ursprünglichen Gesamtkonzentration c [mol/l], somit

Gleichung 10 : pH-Wert einer schwachen Säure

wobei pKa = -log Ka. Damit lässt sich der pH-Wert einer schwachen Säure angenähert berechnen. Für 0,01 M Essigsäure (pKa 4,7) ist der berechnete pH-Wert 3,35.

Berechnung des pH-Wertes von WasserWasser ist eine sehr schwache Säure und die Konzentration der undissoziierten Form (H 2O) ist praktisch in allen

wässrigen Lösungen konstant (55 M). Das Dissoziationsgleichgewicht ist somit

Gleichung 11 : Dissoziationsgleichgewicht von Wasser

Daraus ergibt sich das Ionenprodukt, Kw, des Wassers

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Gleichung 12 : Ionenprodukt des Wassers

In Abwesenheit anderer H+-Donatoren ist [H+] = [OH-], und daher [H+]2 = l0-14, bzw. pH = 7. Dies ist der pH-Wert von reinem Wasser. Wegen der Aufnahme von Kohlensäure aus der Luft ist der pH-Wert von destilliertem Wasser jedoch meist niedriger (≈ pH 5).

Berechnung des pH-Wertes einer Lösung des Salzes einer schwachen Säure mit einer starken Base

Salze starker Säuren mit starken Basen sind in wässriger Lösung annähernd neutral; hingegen sind Salze schwacher Säuren mit starken Basen leicht alkalisch. Ein solches Salz ist in wässriger Lösung vollständig dissoziiert: XA = X+ + A-. A- reagiert mit H2O gemäss A- + HOH = AH + OH-. Da die Menge von AH gleich der Menge des gebildeten OH- ist, und da [A-] praktisch gleich der Salz-Konzentration [Salz] ist, folgt aus Gl. 8

Gleichung 13 : pH-Wertes einer Lösung des Salzes einer schwachen Säure mit einer starken Base

Nach Gl. 13 ist der pH-Wert von 0,1 M Na-Acetat 8,85.

Berechnung des pH-Wertes einer PufferlösungLösungen, die eine schwache Säure (AH) und deren Salz (X+, A-) enthalten, werden Pufferlösungen genannt. Sie

können dank dem gleichzeitigen Vorhandensein der konjugierten Säure (AH) und Base (A-) Wasserstoffionen binden oder abgeben. Sie vermögen deshalb Änderungen der H+-Konzentration bei Zugabe von Säuren oder Basen innerhalb enger Grenzen abzudämpfen. Dieses als Pufferwirkung bezeichnete Verhalten spielt eine grundlegende Rolle bei der Aufrechterhaltung des pH-Wertes in physiologischen Systemen und auch bei der Kontrolle des pH-Wertes in Experimenten.

Pufferlösungen können durch partielle Neutralisierung einer schwachen Säure mit einer starken Base (z.B. NaOH), oder praktischer durch Vermischen einer Lösung der Säure und der Lösung eines ihrer Alkalisalze hergestellt werden.

Der pH-Wert einer Pufferlösung bekannter Zusammensetzung lässt sich nach Gl.  8 berechnen. Unter der Annahme, dass [AH] der zugegebenen totalen Säurekonzentration und [A-] der zugegebenen totalen Salzkonzentration entspricht (diese Annahme ist nur gültig im Bereich, wo der Anteil von Säure oder Salz mehr als 5  % oder weniger als 95 % ihrer Summe ausmacht), ergibt sich:

Gleichung 14 : Henderson-Hasselbalch-Gleichung

Aus Gl. 14 folgt, dass pH = pKa, wenn [A-] = [AH]; d.h. der pH-Wert einer zur Hälfte neutralisierten schwachen Säurelösung entspricht ihrem pKa-Wert.

Beispiele:

Zu 10 ml 0,1 M Essigsäure werden 5 ml 0,1 M NaOH zugefügt. Damit wird die Hälfte der Essigsäure in die Salzform übergeführt, so dass [Salz]/[Säure] = 5/5 wird.

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Zu 10 ml 0,1 M Essigsäure werden 0,2 ml 1 M NaOH zugefügt. Das entspricht der Addition von 2 ml 0,1 N NaOH. Damit wird 1/5 der Essigsäure in die Salzform übergeführt, so dass [Salz]/[Säure] = 1/4 wird.

Zu 10 ml 0,15 M Na2HPO4 werden 5 ml 0,15 M NaH2PO4 zugefügt (pKa2 = 7,2)

Aus je 0,3 M Na2HPO4 und NaH2PO4 soll eine 0,15 M Phosphatpufferlösung mit pH = 7,4 hergestellt werden.

Also müssen 1,58 Teile 0,3 M Na2HP04, 1 Teil 0,3 M NaH2P04 und 2,58 Teile H20 gemischt werden.

AmpholyteSubstanzen, welche sowohl saure wie basische Gruppen enthalten, nennt man Ampholyte, z.B. Aminosäuren sind

Ampholyte. Bei Säurezusatz verhalten sich Aminosäuren wie Basen, bei Basenzusatz wie Säuren (Zwitterionen):

Formel 9 : Ampholyt

Am isoelektrischen Punkt (IEP) liegen sie als Zwitterionen vor. Der isoelektrische Punkt ist derjenige pH-Wert, bei welchem die Nettoladung der Aminosäure gleich Null ist. Bei diesem pH-Wert wandert die Aminosäure in einem elektrischen Feld nicht. Da Proteïne aus Aminosäuren zusammengesetzt sind, sind Proteïne auch amphoter und weisen auch einen IEP auf. Der IEP eines Proteïns wird durch Elektrophorese bestimmt: Der pH-Wert der Proteïnlösung wird so lange variiert, bis keine Wanderung im elektrischen Feld mehr feststellbar ist.

Berechnung des isoelektrischen Punktes einer Aminosäure

Der pKa-Wert der Carboxylgruppe wird pK1 genannt, derjenige der Aminogruppe pK2. Am isoelektrischen Punkt ist

Gleichung 15 : IEP einer Aminosäure

Saure und basische Aminosäuren haben 3 pKa-Werte:

Formel 10 : Dissoziation von sauren und basischen Aminosäuren (Aspartat)

pK1 = 1,88, pK2 = 3,65, pK3 = 9,60, IEP = 2,77

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Aminosäure Carboxylgruppe Α-Aminogruppe Seitenkettengr.2

(protonierte Form)IEP

Glycin 2,30 9,60 5,95

Asparaginsäure 1,90 9,60 3,70 (β-COOH) 2,80

Glutaminsäure 2,20 9,70 4,30 (α-COOH) 3,50

Tyrosin 2,20 9,10 10,10 (-OH) 5,65

Cysteïn 1,90 10,70 8,40 (-SH) 5,15

Histidin 1,80 9,20 6,0 (Imidazolium) 7,60

Lysin 2,20 9,00 10,5 (ε-NH3+) 9,75

Arginin 2,20 9,00 12,5 (Guanidinium) 10,75

Tabelle 5 : pKa- und IEP-Werte einiger Aminosäuren

Titrationskurven zeigen die Abhängigkeit des pH-Wertes vom Verhältnis Base / Säure

Der Verlauf der Titrationskurve einer einzelnen protonierbaren Gruppe wird von der Henderson-Hasselbalchschen Gleichung vorausgesagt. Die Titrationskurve eines Gemisches von Aminosäuren oder einer Proteïnlösung ist die Summe der Titrationskurven der einzelnen ionisierbaren Gruppen. In der Praxis wird statt des Verhältnisses Base  / Säure die Menge der zugegebenen Base gegen den pH-Wert aufgetragen. Titrationskurven zeigen anschaulich, dass bei Zugabe einer gleich großen Menge Base oder Säure die pH-Änderung im Bereich der pK-Werte gering, im Bereich der Äquivalenzpunkte groß ist. Als Faustregel gilt: Aminosäuren (aber auch andere Säuren und Basen) puffern gut im pH-Bereich von pK ±0,5.

pH-Indikatoren sind schwache Elektrolyte, bei denen die protonierte und die nicht-protonierte Form verschiedenfarbig sind

Sie wechseln deshalb im Bereich ihres pKa über ein Intervall von 1-2 pH-Einheiten die Farbe. Statt eine Titration am pH-Meter zu verfolgen, kann durch Zusatz eines geeigneten Indikators der Endpunkt der Titration am Farbwechsel des Indikators erkannt werden.

2 In Proteïnen gelten oft andere pK-Werte, weil im Proteïnverband räumlich benachbarte Seitenketten sich gegenseitig beeinflussen können. Beispiel: -COO-, NH3+-, pKNH

2 steigt, pKCOO- sinkt.

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Elektrophorese

Unter Elektrophorese versteht man die Wanderung von geladenen Partikeln in einem elektrischen Feld. Je nachdem, ob die Nettoladung dieser Substanzen positiv oder negativ ist, wandern sie zur Kathode (negativer Pol) oder zur Anode (positiver Pol). Unterschiede in der Nettoladung äußern sich in Unterschieden der Wanderungsgeschwindigkeit und können so zur Trennung von Substanzgemischen verwendet werden. Die Elektrophorese ist eine wichtige Methode zur Trennung von Aminosäuren, Peptiden und Proteïnen. Wegen ihres Ampholytcharakters wandern diese Verbindungen je nach ihrem isoelektrischen Punkt (IEP) und je nach dem pH-Wert des Milieus zur Kathode oder zur Anode. Wenn der pH-Wert dem IEP des Ampholyts entspricht, erfolgt keine Wanderung.

Die gebräuchlichste Methode zur Auftrennung von Gemischen ist die Zonenelektrophorese. Eine kleine Menge des zu trennenden Gemisches wird als schmale Zone auf einem mit Puffer getränkten Träger aufgetragen. Übliche Trägermaterialien sind Agarose-Gel und Polyacrylamid-Gel. An den Elektrophorese-Träger wird eine Gleichspannung angelegt. Unter dem Einfluss des im Streifen wirksamen elektrischen Feldes kommt es zur räumlichen Auftrennung der Komponenten, die durch geeignete Anfärbemethoden lokalisiert und auch quantitativ bestimmt werden können.

Abbildung 9 : Elektropherogramm von Serum eines Menschen

a) angefärbter Elektrophoresestreifen

b) die bei der photometrischen Auswertung der Farbbänder entstandene Extinktionskurve; die Zahlen geben die Anteile der Fraktionen in Prozenten an, die durch Integration der Flächen unter den einzelnen Peaks der Extinktionskurve ermittelt werden.

Das Auflösungsvermögen der Polyacrylamid-Gelelektrophorese ist besonders hoch, weil im Gel Moleküle aufgrund ihrer Ladung und ihrer Größe aufgetrennt werden. Während auf Agarose die Serumproteïne nur in die größeren Gruppen Albumin, α1- und α2-, β1- und β2-, und γ-Globuline aufgetrennt werden, vermag die Polyacrylamid-Gelelektrophorese Dutzende verschiedener Serumproteïne zu unterscheiden. Ausschließlich nach der Größe aufgetrennt werden Proteïne in der SDS-Gelelektrophorese.

Vereinfachte quantitative Behandlung der Wanderungsgeschwindigkeit geladener Teilchen im elektrischen Feld

Auf ein Teilchen mit der Ladung Q wirkt im elektrischen Feld E (V/cm) die Kraft Q*E, so dass die Wanderungsgeschwindigkeit des Teilchens v = Q*E/f beträgt. Für den Idealfall einer Kugel ist der Reibungskoëffiziënt f = 6*πηr (r = Stokes'scher Radius, η = Viskosität des Mediums). Gl.  8 zeigt, dass die Wanderungsgeschwindigkeit proportional zum Spannungsabfall (= Feldstärke = Spannung pro Längeneinheit des Elektrophoresestreifens, V/cm) und proportional zur Ladung des wandernden Teilchens ist. Die Ladung ist bei Aminosäuren und Proteïnen vom pH-Wert abhängig. Der Reibungskoeffizient f ist abhängig von Form und Größe der Teilchen und von der Viskosität des Mediums.

Bei der Elektrophorese entsteht Wärme. Die pro Zeiteinheit gebildete Wärme H beträgt R*I2 (R = elektrischer Widerstand, I = Stromstärke). Bei der Hochspannungselektrophorese (Feldstärken bis einige 100 V/cm und Stromstärken von gegen 1 Ampère) wird die entstehende Wärme mit einem Kühlsystem abgeführt.

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Chromatographie

Chromatographische Trennmethoden beruhen im wesentlichen darauf, dass sich die zu trennenden Substanzen je nach ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften zwischen einer stationären und einer mobilen Phase ungleich verteilen. Die verschiedenen Verfahren können grob klassifiziert werden in Verteilungschromatographie (Papier-, Dünnschicht-, Gaschromatographie), Adsorptionschromatographie (Ionenaustauscher-, Affinitätschromatographie) und Gelchromatographie (Gelfiltration). Die Verteilungschromatographie beruht auf der verschiedenen Löslichkeit der zu trennenden Substanzen in den Phasen. Bei der Adsorptionschromatographie wirken verschieden starke nicht-kovalente Bindungskräfte zwischen den zu trennenden Substanzen und den Molekülen der einzelnen Phasen. In der Gelchromatographie beruht die Trennung auf der räumlich begrenzten Zugänglichkeit der verschiedenen Phasen für unterschiedlich große Moleküle. Während der chromatographischen Trennung werden die stationäre und die mobile Phase gegeneinander verschoben. Verschiedene Kombinationen von festen, flüssigen und gasförmigen Phasen sind je nach Chromatographietyp möglich. Eine Übersicht gibt die folgende Tabelle.

Typ Phase 1(stationär)

Phase 2(mobil)

Papierchromatographie H2O in Cellulosematrix des Papiers organisches Lösungsmittel

Dünnschichtchromatographie (TLC, HPTLC) Aluminiumoxid, Kieselgel etc. organische Lösungsmittel (im Gemisch

mit Säuren oder Laugen)

Gaschromatographie (GC) Silikone auf inertem Träger H2, He, N2

Flüssigkeitschromatographie (HPLC) Modifizierte Kieselgele, etc. organische Lösungsmittel (im Gemisch

mit Säuren oder Laugen)

Ionenaustauschchromatographie (IC) Ladungen auf inertem Träger Elektrolyt (Puffer)

Affinitätschromatographie Spezifischer Ligand auf inertem Träger Puffer, Lösungsmittel

Gelchromatographie Puffer im Raum innerhalb der Partikel Puffer außerhalb der Partikel

Tabelle 6 : Chromatographietypen

Die einzelnen Chromatographietypen können nicht immer eindeutig der Verteilungs-, Adsorptions- oder Gelchromatographie zugeordnet werden. Beispielsweise beobachtet man bei der Papierchromatographie gelegentlich auch Adsorption an das Papier. Oder im Falle der Gelchromatographie werden aromatische Verbindungen wegen Adsorption an die Gelpartikel besonders langsam aus den Gelpartikeln eluiert.

Der Rf-Wert ist ein Maß für die Wanderungsgeschwindigkeit einer Substanz in Papier- und Dünnschichtchromatographie

Der Rf-Wert ist der Quotient aus der Wanderungsdistanz der Substanz und der Lösungsmittelfront.

Gleichung 16 : Allgemeine Definition des Rf-Wertes

Der Rf-Wert ist für eine Substanz in einem bestimmten Lösungsmittelsystem und bei konstanter Temperatur charakteristisch. Zur Identifikation ist aber der direkte Vergleich von unbekannter Substanz und Referenzsubstanz im gleichen Chromatogramm zuverlässiger. In der Gelchromatographie ist der Verteilungskoeffizient K d eine dem Rf-Wert entsprechende Größe.

Ionenaustauscher-ChromatographieBei dieser Art von Chromatographie werden gelöste Ionen gegen Ionen gleichen Vorzeichens, die an ein unlösliches

Gegenion auf einem festen Träger gebunden sind, ausgetauscht. Auf diesem Prinzip beruht die Enthärtung von Wasser, bei der Ca2+ des „harten" Wassers gegen Na+ von unlöslichem Zeolith (= Natrium-Aluminiumsilikat) ausgetauscht wird. Der entstehende Ca-Zeolith kann durch Waschen mit einer konzentrierten NaCl-Lösung wieder zum Na-Zeolith regeneriert werden.

Die meisten Ionenaustauscher sind synthetische Polymere (Kunstharze), welche saure oder basische Gruppen enthalten. Austauscher-Harze kann man nach dem pK-Wert ihrer ionischen Gruppen einteilen. Ein stark saurer Kationenaustauscher kann z.B. -S03 - Gruppen enthalten, ein schwach saurer z.B. -COO - Gruppen. Den Austausch kann man sich folgendermaßen vorstellen:

Formel 11 : Ionen-Austausch am Austauscherharz

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Abbildung 10 : Trennung von zwei Aminosäuren (A1 und A2) auf Kationenaustauscherharz

Bei pH 1 liegen A1 und A2 als Kationen vor. Beide werden am Kationenaustauscher adsorbiert und wandern nur sehr langsam. Bei pH 6 liegt A1 als Kation vor. A2 wird als ungeladenes Zwitterion nicht adsorbiert und wandert deshalb schneller als A1.

Statt einen Puffer konstanter Zusammensetzung zur Elution zu verwenden, können z.B. bei einem Kationenaustauscher der pH-Wert oder die Ionenstärke oder beide schrittweise (schrittweise Elution) oder kontinuierlich (Gradientenelution) erhöht werden. Dadurch kann die Elution der aufgetrennten Komponenten beschleunigt werden. Die Aminosäuren eines Proteïnhydrolysats werden im automatischen Aminosäuren-Analysator durch Ionenaustauschchromatographie quantitativ aufgetrennt (s. Abb. 11).

Abbildung 11 : Analyse von Aminosäuren mit Hilfe einer HPLC an einem Kationenaustausscher-Harz

Die Fläche unter jedem Signal des Chromatograms ist der Menge jeder in der Mischung vorhandenen Aminosäure proportional.

GelchromatographieVernetztes Dextran („Sephadex“) bildet in gequollenem Zustand ein poröses Gel. Das Flüssigkeitsvolumen innerhalb

der Gelpartikel ist bei einem gegebenen Grad der Vernetzung nur für gelöste Moleküle unterhalb einer bestimmten Größe zugänglich. Die Verteilung von gelösten Molekülen innerhalb und außerhalb der Gelpartikel ist somit abhängig vom zugänglichen Volumen innerhalb der Gelpartikel. Das Totalvolumen (Vt) einer Sephadex-Säule ist die Summe des Volumens außerhalb der Gelpartikel (Vo), des Volumens innerhalb der Gelpartikel (Vi) und des Volumens der Gelsubstanz selbst (Vg):

Gleichung 17 : Volumenverteilung in einer "Sephadex"-Säule

Das Elutionsvolumen (Ve) einer Substanz ist abhängig von Vo und vom „Verteilungskoëffiziënten“ Kd, der den Bruchteil des Vi angibt, der für die Substanz zugänglich ist.

Gleichung 18 : Abhängigkeit des Elutionsvolumens einer Substanz

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Für große Moleküle, die nicht in das Gel eindringen können, ist Kd = 0, somit Ve = Vo. Für kleine Moleküle, die vollständig in das Gel eindringen können, ist Kd = 1, somit Ve = Vo+Vi. Für Moleküle mit einem Kd zwischen 0 und 1 gilt:

Je nach der Größe der Moleküle, die voneinander getrennt werden sollen, wird verschieden stark vernetztes Sephadex verwendet. Die gebräuchlichsten Typen sind:

Sephadex Ausschluss-Molekularmasse

G- 25 >  5.000

G- 50 > 25.000

G- 75 > 50.000

G-200 >200.000Tabelle 7 : Ausschluss-Molekularmassen einiger "Sephadex"-Gele

Sephadex G-25 eignet sich wie die Dialyse besonders zur Entsalzung von Makromolekülen. Sephadex G-50, G-75 und G-200 werden zur Trennung verschieden großer Proteïne verwendet. Sie dienen auch zur Schätzung der molekularen Größe und damit der Molekülmasse eines Proteïns. Als Referenzen braucht man die Elutionsvolumina von Proteïnen mit bekannter Molekularmasse. Für globuläre Proteïne ist das Verhältnis Ve/Vo über einen weiten Bereich umgekehrt proportional zum Logarithmus der Molekularmasse.

Abbildung 12 : log Molekularmasse gegen Elutionsvolumen

Die Abb. 12 zeigt solche Kurven für Sephadex G-50 und G-200. Die gesuchte Molekülmasse eines Proteïns erhält man anhand der Kurven aus dem gemessenen Elutionsvolumen.

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Photometrie

Gesetz von Lambert-BeerWird Licht durch eine Farbstofflösung gestrahlt und dabei absorbiert, so ist die Intensität des austretenden Lichts (I)

kleiner als diejenige des eintretenden Lichts (I0). Der Quotient I/I0 wird als Durchlässigkeit D oder Transmission T bezeichnet und ist abhängig von der Konzentration c des Farbstoffs und der Schichtdicke d: D = I/I0 = l0-k@c@d. D wird oft in % angegeben. %D = 100*I/I0.

Ein für photometrische Messungen gebräuchlicheres Maß ist die Extinktion E oder optische Dichte OD. Sie ist direkt proportional zu c und d:

Gleichung 19 : Definition der Extinktion E (optischen Dichte OD)

Der Extinktionskoëffiziënt k ist charakteristisch für die absorbierende Substanz und ist abhängig von der Wellenlänge. Der numerische Wert von k ist ferner abhängig von den Einheiten von c und d. Wird der molare Extinktionskoëffiziënt ε verwendet, wird d in cm und c in mol/Liter (M) angegeben. Die Dimension ist dann M-1*cm-1. Der molare Extinktionskoëffiziënt entspricht also der Extinktion einer 1 M Lösung der betreffenden Substanz bei einer Schichtdicke von 1 cm. Bei stark absorbierenden Substanzen ist der millimolare Extinktionskoëffiziënt gebräuchlicher (εmM = ε/1000). Für Tryptophan beträgt εmM = 6 [mM-1*cm-1] bei 280 nm, für ATP 15 mM-1*cm-1 bei 260 nm.

Zwischen % Durchlässigkeit und Extinktion besteht die Beziehung:

Gleichung 20 : Bezeihung zwischen %D und E

Durchlässigkeiten von 100 %, 10 %, 1 % entsprechen die Extinktionen 0, 1,0 und 2,0. Die meisten Photometer sind mit einer %D-Skala (linear) und einer E-Skala (logarithmisch) ausgerüstet.

Konzentrationsbestimmung durch PhotometrieNach dem Gesetz von Lambert-Beer kann eine unbekannte Konzentration graphisch bestimmt werden. Zuerst werden

die Extinktionen (E1, E2, E3, E4) von Standardlösungen bekannter Konzentrationen (c1, c2, c3, c4) als Kalibrierkurve aufgezeichnet. Die Werte sollen auf einer Geraden liegen, die durch den Nullpunkt geht. Abweichungen von der Linearität können bei höheren Konzentrationen auftreten. Die unbekannte Konzentration cx kann aus der gemessenen Extinktion Ex auf der Kalibriergeraden abgelesen werden.

Abbildung 13 : Gültigkeitsbereich des Lambert-Beer Gesetzes

Photometer und SpektralphotometerDas Lambert-Beer Gesetz gilt nur für monochromatisches Licht. Um eine möglichst große Extinktion zu erhalten,

wird monochromatisches Licht gewählt, das zur Farbe der absorbierenden Substanz komplementär ist. Monochromatisches Licht wird beim Photometer durch die Verwendung eines Filters erzeugt, beim Spektralphotometer durch ein Prisma oder ein Diffraktionsgitter.

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Bereich, in dem das Lambert-Beer Gesetz nicht mehr erfüllt ist

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Schematische Darstellung eines Spektralphotometers

Abbildung 14 : Schematische Darstellung eines Spektralphotometers

1   Lichtquelle 2   Eintrittsspalt 3   Prisma oder Diffraktionsgitter 4   Drehmechanismus für Prisma5   Skala mit Angabe der Wellenlänge 6   Austrittsspalt 7   Küvette mit Lösung 8   Photozelle, wandelt Lichtimpulse in Strom um9   Elektronischer Verstärker 10  Regulier-Potentiometer 11   Ampèremeter mit %D- und E-Skala

Praktisches Vorgehen bei der Photometrie

Extinktionswerte sind keine absoluten Größen, sondern Relativwerte bezogen auf eine Blindprobe. Als Blindwert dient gewöhnlich der verwendete Puffer. Vor der Messung der Extinktion E muss das Photometer mit dem Blindwert wie folgt kalibriert werden:

1. Lichtweg schließen, Photometeranzeige auf %D = 0 einstellen durch Kompensation des sogenannten Dunkelstroms (geschieht bei neueren Geräten automatisch).

2. Lichtweg öffnen, Blindprobe in den Lichtweg bringen, auf Photometeranzeige E = 0 einstellen durch Veränderung der Verstärkung des Photostroms (Nullpunkt-Abgleichung, "zero adjustment").

3. Probe in den Lichtweg bringen und E ablesen.

Wird die Wellenlänge verändert, so muss das Photometer wieder neu kalibriert werden, weil sich die Intensität der Lichtquelle und die Empfindlichkeit der Photozelle mit der Wellenlänge ändert.

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Lichtquelle Monochromator Probenraum Photoelektrischer Empfängermit Anzeigegerät

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Enzymreaktionen

An fast allen chemischen Umsetzungen im Organismus sind Enzyme beteiligt. Enzyme sind Katalysatoren, welche die Stoffwechselprozesse unter den milden Bedingungen in der Zelle (niedrige Metabolitkonzentrationen, niedrige Temperatur, neutraler pH-Wert) ermöglichen.

Die wesentliche Eigenschaft eines Enzyms ist sein Vermögen, eine spezifische Reaktion ganz enorm zu beschleunigen (= katalysieren). Dabei werden die Geschwindigkeiten der Vorwärts- und der Rückwärts-Reaktion proportional erhöht, d.h. das chemische Gleichgewicht der Reaktion wird nicht verändert . Die im Reaktionsablauf verbrauchte Verbindung bezeichnet man als Substrat, die neugebildete als Produkt. Bei der Rückwärtsreaktion sind die Begriffe vertauscht (z.B. Acetaldehyd und Ethylalkohol sind je nach Reaktionsablauf entweder Substrat oder Produkt der Alkohol-Dehydrogenase). Enzymreaktionen lassen sich durch Bestimmung der Menge des in der Zeiteinheit gebildeten Produkts oder des verbrauchten Substrats messen. Die reaktionsbeschleunigende Wirkung von Enzymen wird als Enzymaktivität bezeichnet.

Enzyme sind Proteïne und als solche empfindlich gegen denaturierende Einflüsse (Wärme, Säuren, Basen etc.). Die Aminosäurensequenz und die räumliche Struktur verschiedener Enzyme sind heute bekannt. Die Molekularmassen Mr

liegen zwischen 104 und 106 (Beispiele: Lysozym 14.400, Phosphorylase a 390.000). Viele, aber nicht alle Enzyme bestehen aus mehreren Peptidketten (Quartärstruktur). Denjenigen Teil eines Enzymmoleküls, an den das Substrat (bzw. Produkt) bindet und wo die katalytische Umsetzung stattfindet, bezeichnet man als aktive Stelle. Sie umfasst u.a. die an diesen Prozessen direkt beteiligten Aminosäurereste. Bei gewissen Enzymen enthält die aktive Stelle auch nicht-proteïnartige Bestandteile (prosthetische Gruppen).

Die Geschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion hängt von folgenden Reaktionsbedingungen ab.

1. Substratkonzentration

2. Enzymkonzentration und Enzymaktivität

3. pH-Wert

4. Temperatur

5. Konzentration von Inhibitoren und Aktivatoren

Die Untersuchung der Abhängigkeit der Enzymaktivität von diesen Faktoren ist das Gebiet der Enzymkinetik.

Abhängigkeit der Enzymaktivität von der SubstratkonzentrationIm Laufe einer durch ein Enzym E katalysierten Umwandlung von Substrat S in Produkt P entstehen ein Enzym-

Substrat-Komplex ES und ein Enzym-Produkt-Komplex EP als Zwischenformen. Die Reaktionssequenz ist entsprechend:

Formel 12 : Formaler Ablauf einer enzymatischen Reaktion

Es ist schwierig, aus diesem allgemein gültigen Schema (6 Teilreaktionen) eine experimentell leicht nachprüfbare Beziehung zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit und der Substratkonzentration abzuleiten. Zur Vereinfachung beschränkt man sich deshalb auf Bedingungen, unter denen die Reaktion nur in einer Richtung abläuft, d.h. die Rückwärts-Reaktion vernachlässigt werden kann. Dies ist der Fall am Anfang der Reaktion, solange die Konzentration von P verschwindend klein ist im Vergleich zur Konzentration von S, oder unter Bedingungen, unter denen das Produkt laufend abgefangen wird. Das Reaktionsschema ist dann:

Formel 13 : Reaktionsschema einer "normalen" enzymatischen Reaktion

Wenn man weiter darauf verzichtet, den ES- und EP-Komplex gesondert zu betrachten (nur die Geschwindigkeit der ersten Teilreaktion, der Bildung des ES-Komplexes, ist abhängig von der Substratkonzentration), ergibt sich als einfachste Formulierung:

Formel 14 : Einfachste Formulierung einer enzymatischen Reaktion

wobei k1, k-1 und k2 die Geschwindigkeitskonstanten der Teilreaktionen sind. Aus diesem Schema lässt sich eine quantitative Beziehung zwischen der Anfangsgeschwindigkeit v einer enzymatischen Reaktion und der Substratkonzentration ableiten (Henry, 1903; Michaelis und Menten, 1913; Briggs und Haldane, 1925).

Die Herleitung ist wie folgt: Die Geschwindigkeit, mit der die Konzentration des Produkts P zunimmt, ist

Gleichung 21 : Geschwindigkeit der Produktentstehung

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Bioanalytik

Da v am Anfang der Reaktion, (d.h. solange die Substratkonzentration sich nicht merkbar verändert hat) konstant bleibt, folgt aus Gl. 21, dass ES ebenfalls konstant ist. Dies bedeutet, dass die Bildungs- und Zerfallsgeschwindigkeiten von ES gleich groß sind (= Fliessgleichgewichtszustand). Daraus folgt:

Gleichung 22 : Fliessgleichgewicht einer enzymatischen Reaktion

Wir setzen für [E] = [Et]-[ES] ein, wobei [Et] die messbare Gesamtkonzentration des Enzyms darstellt. Eingesetzt in Gl. 22 erhalten wir für [ES]

Gleichung 23 : Umformung der Gl. 22

Gl. 23 können wir jetzt in Gl. 21 einsetzen, d.h. wir drücken die Anfangsgeschwindigkeit der Enzymreaktion als Funktion der gesamten Enzymkonzentration und der Konzentration des freien Substrats aus:

Gleichung 24 : Anfangsgeschwindigkeit der enzymatischen Reaktion

Gl. 24 ist bereits die gesuchte Geschwindigkeitsgleichung für unsere Enzymreaktion, wenn auch noch nicht in der üblichen Form. Diese erhalten wir, indem wir Zähler und Nenner durch k1 teilen:

Gleichung 25 : Michaelis-Menten-Gleichung

Dieses ist die Michaelis-Menten-Gleichung. Sie beschreibt die Anfangsgeschwindigkeit einer Enzymreaktion unter der Annahme des Fliessgleichgewichts. Die Konstanten Km und Vmax sind definiert als

Gleichung 26 : Definition der Konstanten der Michaelis-Menten-Gleichung

Km wird Michaeliskonstante genannt. Vmax ist die maximale Geschwindigkeit, die bei der Konzentration [Et] erreicht werden kann. Sie entspricht dem Zustand, wo alle Enzymmoleküle als ES vorliegen, also [ES] = [Et]. Weil bei Enzymreaktionen [Et] << [St], kann man in Gl. 25 für [S] die Gesamtkonzentration des Substrats einsetzen.

Nach Gl. 25 ist v eine hyperbolische Funktion von [S].

Abbildung 15 : Abhängigkeit der Aktivität von der Substratkonzentration (v gegen [S]-Darstellung)

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Bioanalytik

Bedeutung von Km und Vmax

Die Michaelis-Menten-Gleichung liefert eine Arbeitsdefinition von Km. Km hat die Dimension einer Konzentration und entspricht numerisch derjenigen Substratkonzentration, bei welcher bei gegebener Enzymkonzentration die halbmaximale Reaktionsgeschwindigkeit erreicht wird (Substitution von v = Vmax/2 in Gl. 25 ergibt Km = [S]). Km kann als reziprokes Maß der „Affinität" von S zu E aufgefasst werden. Je größer die Affinität eines Substrats zum Enzym ist, desto kleiner ist die zum Erreichen der halbmaximalen Umsatzgeschwindigkeit benötigte Substratkonzentration, d.h. ein kleines Km entspricht einer großen „Affinität" und umgekehrt. Es muss allerdings betont werden, dass Km nicht die Dissoziationskonstante Kd = k-1/k1 des Enzym-Substrat-Komplexes darstellt. Wie der obere Teil der Gl.  26 zeigt, ist Km

durch drei Geschwindigkeitskonstanten bestimmt. Lediglich im Spezialfall k2 << k-1 wird der numerische Wert von Km

etwa gleich demjenigen von Kd der Reaktion E + S → ES. In allen andern Fällen ist Km > Kd.

Bei Substratkonzentrationen, die viel kleiner oder größer sind als Km, ergeben sich folgende Vereinfachungen der Michaelis-Menten-Beziehung:

Gleichung 27 : Michaelis-Menten-Gleichung bei Substratkonzentrationen weit unterhalb Km

Da Vmax und Km Konstanten sind, wird v proportional [S], d.h. der enzymatische Prozess verläuft als Reaktion Erster. Ordnung. Gl. 27 entspricht dem anfänglich linear ansteigenden Abschnitt der Michaelis-Menten-Hyperbel.

Gleichung 28 : Michaelis-Menten-Gleichung bei Substratkonzentrationen weit oberhalb Km

Die Reaktionsgeschwindigkeit wird konstant und unabhängig von [S], d.h. die Umsetzung verläuft als Reaktion Nullter Ordnung. Gl. 28 entspricht der von der Michaelis-Menten-Hyperbel angestrebten horizontalen Asymptote.

Bestimmung von Km und Vmax

Der numerische Wert von Vmax ist bei Anwendung der hyperbolischen v gegen [S]-Darstellung manuell schwierig zu bestimmen. Die für eine Messung von v in der asymptotisch auslaufenden Region der Kurve benötigten hohen Substratkonzentrationen sind oft praktisch nicht realisierbar und Extrapolationen sind unsicher. Die sich daraus ergebende Ungenauigkeit von Vmax erschwert auch die Bestimmung des Km. Diese Schwierigkeiten werden beseitigt durch Verwendung von Computerprogrammen, die den Messwerten am besten angepasste Michaelis-Menten-Kurve berechnen (Hyperbolische Anpassung). Damit erhält man die Werte für Vmax und Km.

Falls keine Rechner zur Verfügung stehen, kann die Michaelis-Menten-Beziehung durch einfache Umformung von Gl. 25 in eine linearen Darstellungsform von der Art y = ax+b übergeführt werden (Darstellung nach Lineweaver-Burk):

Gleichung 29 : Lineweaver-Burk 1

Wenn anstelle der gemessenen Werte v und [S] der reziproke Wert 1/v (y-Achse) als Funktion von 1/[S] (x-Achse) graphisch aufgetragen wird, ergibt sich eine Gerade mit der Steigung Km/Vmax. Die Schnittpunkte mit den Achsen ergeben aufgrund von Gl. 29:

Gleichung 30 : Lineweaver-Burk 2

Diese Darstellungsform liefert so durch lineare Extrapolation eindeutige Werte für 1/Vmax und -1/Km (1/v gegen 1[S]-Darstellung.

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Abbildung 16 : Abhängigkeit der Aktivität von der Substratkonzentration

Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Enzymkonzentration

Substitution von Vmax = k2 [Et] in Gl. 25 führt zu

Gleichung 31 : Substituierte Michaelis-Menten-Gleichung

d.h. bei gegebener Substratkonzentration ist die Aktivität proportional der Enzymkonzentration (doppelt soviel Enzymmoleküle können pro Zeiteinheit doppelt soviel Substratmoleküle umsetzen). Im Gegensatz zu Vmax ist Km

unabhängig von der Enzymkonzentration.

Abbildung 17 : Abhängigkeit der Geschwindigkeit von der Enzymkonzentration

Abhängigkeit der Enzymaktivität vom pH

Im allgemeinen ist ein Enzym nur in einem relativ engen pH-Bereich aktiv. Aktivitätsmessungen müssen deshalb immer unter definierten pH-Bedingungen ausgeführt werden, am einfachsten durch Verwendung von Pufferlösungen. Als pH-Optimum bezeichnet man den pH-Bereich, an dem die Aktivität am höchsten ist (z.B. pH 1.5 - 2.5 für Pepsin oder pH 7 - 9 für Trypsin).

Abbildung 18 : Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Enzymkonzentration

Die Lage des pH-Optimums ist durch das Vorhandensein bestimmter ionisierbarer Gruppen am Enzym oder Substrat erklärbar. In gewissen Fällen können daraus Schlüsse über den Mechanismus der Katalyse gezogen werden

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Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Temperatur

Wie andere chemische Reaktionen werden Enzymreaktionen durch Temperaturanstieg beschleunigt. Aktivitätsmessungen müssen deshalb bei definierter Temperatur ausgeführt werden. Im allgemeinen findet man bei einer Erhöhung der Temperatur um 10 °C eine Aktivitätssteigerung auf etwa das Doppelte (RGT-Regel). Bei höheren Temperaturen fällt aber die Aktivität wegen der während der Messung fortschreitenden Hitzedenaturierung des Enzyms wieder ab. Die Temperatur, bei der die höchste Aktivität gemessen wird, liegt bei den meisten Enzymen zwischen 40 °C und 50 °C.

Abbildung 19 : Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Temperatur

Wirkung von Inhibitoren und Aktivatoren auf die Enzymaktivität

Für viele Enzyme kennt man spezifische Verbindungen, welche die Aktivität entweder herabsetzen (Inhibitoren) oder steigern (Aktivatoren). Bei den Inhibitoren unterscheidet man dabei solche, die mit dem Enzym eine irreversible Verbindung eingehen (Beispiel: Hemmung von Chymotrypsin durch DFP3) und solche, die einen reversiblen, d.h. leicht dissoziierbaren Komplex bilden. Bei den reversiblen Hemmstoffen können als Haupttypen die kompetitiven und nicht-kompetitiven Inhibitoren unterschieden werden.

Kompetitive Inhibitoren

Diese hemmen die Bindung des Substrats an das Enzym. Das Ausmaß der Hemmung hängt dabei von den relativen Konzentrationen von Substrat und Inhibitor ab und von ihren relativen Affinitäten für das Enzym. Wenn Substrat in großem Überschuss zugegeben wird, verschwindet die Hemmung. Vmax ist deshalb bei diesem Hemmungstyp nicht verändert. Die Affinität des Substrats zum Enzym ist aber scheinbar erniedrigt. Der in Gegenwart von Inhibitor gemessene Km-Wert (= K’m) ist größer als das Km des nicht gehemmten Enzyms. Spezifische kompetitive Inhibitoren nennt man Inhibitoren, die dem natürlichen Substrat eines Enzyms strukturell ähnlich sind. So ist z.B. Malonat ein spezifischer, kompetitiver Inhibitor der Succinat-Dehydrogenase. Diese Inhibitoren besetzen am Enzym die gleiche Bindungsstelle wie das Substrat und verhindern so kompetitiv dessen Bindung ans Enzym.

Abbildung 20 : Kompetitive Hemmung

Nicht-kompetitive Inhibitoren

Diese hemmen das Enzym, ohne die Bindung des Substrats zu beeinträchtigen. Umgekehrt hat eine Steigerung der Substratkonzentration auch keine Wirkung auf die Hemmung. Das Ausmaß der Hemmung hängt nur von der Konzentration des Inhibitors ab. Die mit Inhibitor besetzten Enzym-Moleküle sind weniger oder nicht aktiv. Vmax ist deshalb erniedrigt, verglichen mit dem nichtgehemmten Enzym. Der Km-Wert bleibt unverändert.

Abbildung 21 : Nicht-kompetitive Hemmung

3 Diisopropylfluorophosphat

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Aktivatoren

Gewisse Enzyme sind nur aktiv in Gegenwart eines Aktivators oder werden dadurch in ihrer Wirkung gesteigert. Aktivatoren sind oft bestimmte Ionen, die leicht dissoziierbare Komplexe mit dem Enzym eingehen, z.B. Mg 2+ mit Enolase oder alkalischer Phosphatase, Cl- mit Amylasen. Aktivitätsbestimmungen solcher Enzyme müssen immer in Gegenwart definierter Konzentrationen des Aktivators ausgeführt werden. H+-Ionen können als Spezialfall sowohl eines Aktivators wie eines Inhibitors betrachtet werden. Die pH-Abhängigkeit der Enzymwirkung lässt sich in vielen Fällen auf die Aufnahme oder Abgabe von Protonen durch das Enzym zurückführen. Je nach Enzym ist dabei die protonierte oder die nicht-protonierte Form die aktive (bzw. aktivere) Spezies.

Einheiten der Enzymaktivität

Aufgrund von Gl. 31 ist die Geschwindigkeit einer enzymkatalysierten Reaktion proportional zur Menge des vorhandenen Enzyms. Die Enzymaktivität wird in Internationalen Einheiten (U) gemessen. Ein U ist die Enzymaktivität, welche 1 µmol Substrat/min in Produkt umsetzt. Die Messung soll bei definierter Temperatur, in der Regel bei 25 °C, und optimalen Bedingungen (Puffer, pH-Wert, Substratkonzentration) ausgeführt werden. Man beachte, dass U die Dimension einer Geschwindigkeit hat und somit nichts angibt über die Proteïnmenge, in der die Enzymaktivität U enthalten ist.

Die spezifische Aktivität ist die Anzahl Aktivitätseinheiten eines Enzyms pro Menge Proteïn. Gewöhnlich wird sie als Anzahl U/mg Proteïn angegeben. Sie ist ein Maß für den Reinheitsgrad eines Enzympräparates. Die spezifische Aktivität steigt im Laufe der Reindarstellung eines Enzyms durch sukzessive Entfernung aller Fremdproteïne bis zu dem für das reine Enzym typischen maximalen Wert an. Wenn das Enzym rein und seine Molekularmasse bekannt ist, lässt sich die molekulare Aktivität berechnen. Sie wird angegeben als Anzahl U/µmol Enzym. Die molekulare Aktivität (oder Wechselzahl) des Enzyms gibt die Anzahl Substratmoleküle an, welche bei optimaler Substratkonzentration durch 1 Enzymmolekül/min umgesetzt wird. Die Wechselzahl vieler Enzyme liegt zwischen 103 und 104 min-1.

Der optische Test nach Warburg

Die reduzierten Pyridinnucleotide NADH bzw. NADPH zeigen bei 340 nm eine Absorptionsbande, die den oxidierten Formen fehlt. Die Umwandlung der reduzierten in die oxidierten Formen und umgekehrt lässt sich deshalb durch Extinktionsmessungen verfolgen. Diese Eigenschaft erlaubt die Messung von enzymkatalysierten Reaktionen, an denen Pyridinnucleotid-Coënzyme beteiligt sind. Alle Reaktionen dieser Art verlaufen nach dem Schema:

Formel 15 : Enzymatische Reaktion

wobei RH2 und R je nach Reaktionsrichtung das Substrat bzw. das Produkt darstellen. Die Mengen von umgesetztem Substrat und Coënzym sind gleich. Die optisch messbare Konzentrationsänderung (Zunahme oder Abnahme) des reduzierten Coënzyms ist deshalb ein direktes Maß für das verbrauchte Substrat oder gebildete Produkt. Die Konzentration von NADH bzw. NADPH lässt sich aufgrund des Lambert-Beer-Gesetzes aus Extinktionsmessungen im Bereich der Dihydronicotinamid-Absorptionsbande des Coënzyms ermitteln. Bei Verwendung eines Spektralphotometers erfolgt die Messung am Absorptionsmaximum (340 nm) unter Anwendung des millimolaren Extinktionskoëffiziënten, ε340 = 6,22. Bei Photometern, die mit einer Hg-Dampflampe (diskontinuierliches Linienspektrum) ausgerüstet sind, steht nur die Emissionslinie von Hg bei 365 nm zur Verfügung. Da diese Wellenlänge nicht dem Absorptionsmaximum entspricht, muss der niedrigere Extinktionskoëffiziënt ε365 = 3,3 verwendet werden. Je nach Wahl der Versuchsbedingungen kann der optische Test zur Messung von Enzymaktivitäten oder zur enzymatischen Bestimmung von Substratkonzentrationen verwendet werden.

Bestimmung von Enzymaktivitäten im optischen Test

Die gesuchte Größe ist die Anzahl Enzymaktivitätseinheiten pro ml der verwendeten Enzymlösung ( Anzahl U/ml) oder die spezifische Aktivität (Anzahl U/mg) des Enzyms. Es ist vorteilhaft, zuerst die Anzahl U/ml im Reaktionsansatz (in der Küvette) zu ermitteln und dann den gefundenen Wert, unter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors, auf die Anzahl U/ml in der verwendeten Enzymlösung umzurechnen. Aus dieser Größe und der Proteïnkonzentration der Enzymlösung (mg/ml) erhält man die spezifische Aktivität des Enzyms in U/mg. Die Enzymaktivität/ml im Ansatz ist die pro ml und pro min umgesetzte Anzahl µmol NADH.

Gleichung 32 : Enzymaktivität 1

Die Konzentrationsänderung von NADH/min ist bei Messung in einer Küvette von 1 cm Schichtdicke die in der Minute erfolgte Änderung der Extinktion (∆E340/min) dividiert durch den millimolaren Extinktionskoëffiziënten ε340 = 6,22. Die Enzymaktivität ist somit:

Gleichung 33 : Enzymaktivität 2

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Die Anzahl U/ml in der zum Ansatz zugegebenen Enzymlösung erhält man durch Multiplikation der aus Gl.  33 erhaltenen Aktivitätskonzentration mit dem Verdünnungsfaktor:

Gleichung 34 : Enzymaktivität 3

Die spezifische Aktivität U/mg ist die Aktivitätskonzentration der Enzymlösung (U/ml) dividiert durch die Proteïnkonzentration der Enzymlösung (mg/ml):

Gleichung 35 : Spezifische Aktivität

Beispiel:

Eine Lösung von Isocitrat-Dehydrogenase (5 mg/ml) wird 1:200 mit H2O verdünnt und 50 µl davon werden zum optischen Test verwendet, der in einem Totalvolumen von 3,00 ml ausgeführt wird (Verdünnungsfaktor = 12.000). Es wird eine Extinktionsabnahme bei 340 nm von 0,53 /min gemessen. Aufgrund von ε340 = 6,22 mM-1cm-1 ist die Aktivitätskonzentration im Ansatz

Gleichung 36 : Aktivitätskonzentrtion im Ansatz

In der verwendeten Enzymlösung ist die Aktivitätskonzentration

Gleichung 37 : Aktivitätskonzentration in der Enzymlösung

und die spezifische Aktivität

Gleichung 38 : Spezifische Aktivität

Bestimmung von Substratkonzentrationen durch einen optischen Test

Unter Reaktionsbedingungen, bei denen im Gleichgewichtszustand das Verhältnis von Produkt zu Substrat sehr groß ist, oder wenn das gebildete Produkt durch eine weitere Reaktion laufend aus dem Gleichgewicht entfernt wird, wird zum Ansatz zugegebenes Substrat praktisch quantitativ in Produkt umgesetzt. Die Menge des gebildeten Produkts und des in der Reaktion ebenfalls umgesetzten Coënzyms ist dann ein Maß für die ursprünglich zugegebene Menge von Substrat. Die umgesetzte Menge Coënzym lässt sich im optischen Test aus der maximal erzielten Extinktionsänderung, ∆E340, ermitteln gemäss:

Gleichung 39 : Substratkonzentration im Ansatz

Die gesuchte millimolare Konzentration der zum Ansatz zugegebenen Substratlösung [S0] erhält man durch Multiplikation der aus Gl. 39 erhaltenen Konzentration mit dem Verdünnungsfaktor

Gleichung 40 : Konzentration der zugesetzten Substratlösung

Beispiel:

In einem Ansatz vom Volumen 3,0 ml, der 0,15 ml einer Pyruvatlösung unbekannter Konzentration und einen Überschuss an NADH enthält, wird nach Zugabe von Lactat-Dehydrogenase eine maximale Extinktionsabnahme ∆E340 = 0,59 gemessen. Die anfängliche Substratkonzentration im Ansatz beträgt

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Gleichung 41 : Anfängliche Substratkonzentration im Ansatz

Die gesuchte Konzentration der Pyruvatlösung beträgt

Gleichung 42 : Konzentration der Pyruvatlösung

Bei einer Molekularmasse von 88 Da4 für Pyruvat beträgt die Massenkonzentration der Pyruvatlösung

Gleichung 43 : Massenkonzentration der Pyruvatlösung

4 Dalton

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Molekularbiologische Methoden

Die Technik der DNA-Rekombination, auch als Gentechnik bezeichnet, erlaubt die Isolierung von DNA-Abschnitten (genomische oder cDNA), deren Sequenzbestimmung, Modifikation und Expression. Zu diesem Zweck gelangen einige grundlegende Schritte immer wieder zur Anwendung, nämlich gezielte Verdauung von DNA mit Restriktions-Endonucleasen, Verknüpfen von DNA-Molekülen durch Ligase, Einfügen von DNA in Plasmide (oder andere geeignete Träger-DNA-Moleküle, sog. Vektoren), Einschleusen und Expression rekombinierter DNA in Bakterien oder eukaryotische Zellen, Selektion transfizierter Zellen und Isolierung klonierter Plasmid-DNA.

PlasmideBakterien verfügen häufig über sogenannte Plasmide. In Wildtypbakterien tragen Plasmide die Gene für die

Konjugation von Bakterienzellen und gelegentlich auch für Antibiotikaresistenz (Resistenzplasmide). Plasmide, die Gene für die Inaktivierung von Antibiotika tragen, vermitteln dem Wirtsbakterium die Fähigkeit der Antibiotikaresistenz. Durch den als Konjugation bezeichneten Vorgang, bei dem eine kurzfristige Zell-Zell  Verbindung geschaffen wird, können Plasmide unter Bakterienzellen verbreitet werden. Plasmide sind ringförmige doppelsträngige DNA-Moleküle, die aus einigen tausend Basenpaaren bestehen. Unter Nutzung der Wirtsmaschinerie replizieren sich Plasmide unabhängig von chromosomaler DNA und exprimieren ihre Gene. Eine Bakterienzelle kann bis zu einigen hundert Kopien eines Plasmids enthalten, die nach Lyse der Bakterien relativ einfach isoliert werden können (Ausfällung von Proteïnen und chromosomaler DNA, Fällung von Plasmid-DNA mit Alkohol). Andererseits können intakte Bakterien DNA aufnehmen, wenn sie durch geeignete Vorbehandlung (Erhöhung der extrazellulären Calcium-Konzentration, Erhöhung der Temperatur) „kompetent" gemacht werden. Dieser Vorgang wird als Transfektion bezeichnet (gelegentlich auch als Transformation von Bakterien).

Abbildung 22 : Elektronenmikroskopische Aufnahme von Plasmiden (unterschiedliche Überspiralisierung).

RestriktionsenzymeRestriktionsenzyme sind bakterielle Endonucleasen mit hoher Spaltungsspezifität, die bestimmte Stellen in einem

DNA-Doppelstrang erkennen und durchtrennen. Die Enzyme erkennen Sequenzen von 4 - 8 Basen, die meist ein Palindrom darstellen, d.h. beide Stränge vom 5'-Ende gelesen haben die gleiche Sequenz (= punktsymmetrisch). An den Spaltstellen entstehen je nach Restriktionsenzym stumpfe oder versetzte DNA-Enden. Durch ein bestimmtes Restriktionsenzym gebildete DNA-Enden können durch DNA-Ligase verknüpft werden. Überlappend komplementäre DNA-Enden, sog. „sticky ends", eignen sich dazu besonders gut, weil sie Basenpaarungen bilden können. Definiertes Durchtrennen und Zusammenfügen von DNA bildet die Grundlage zur Klonierung von DNA.

Restriktionsenzym Erkennungssequenz5 (|=Spaltstelle)

EcoR I 5’ G|AATTC 3’

Bgl I 5’ GCCNNNN|NGGC 3’

BamH I 5’ G|GATCC 3’

Sma I6 5’ CCC|GGG 3’

Xma I6 5’ C|CCGGG 3’

Pst I 5’ CTGCA|G 3’Tabelle 8 : Erkennungssequenz einiger Restriktionsendonucleasen

Es sind heute über 2.000 Restriktionsenzyme mit nahezu 200 verschiedenen Sequenzspezifitäten bekannt (verschiedene Restriktionsenzyme, aber gleiche Erkennungssequenz!). Die Bezeichnung der Restriktionsenzyme setzt sich aus dem ersten Buchstaben der Bakteriengattung und den zwei Buchstaben der Spezies, gefolgt vom Serotyp oder Stamm und ev. einer römischen Zahl (falls ein Bakterium mehr als ein Restriktionsenzym bildet) zusammen. So wird z.B. EcoR I von Escherichia coli des Stammes RY13 gebildet (dieser E. coli Stamm bildet 4 weitere Restriktionsenzyme). Bacillus globigii bildet Bgl I und Bgl II.

5 Üblicherweise wird nur einer der DNA-Stränge angegeben6 Beispiel für Enzyme, welche die gleiche Sequenz erkennen aber nicht notwendigerweise am gleichen Ort spalten

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Bioanalytik

Agarose-GelelektrophoreseBei neutralem pH-Wert wandert die durch die Phosphatgruppen negativ geladene DNA im elektrischen Feld gegen

die Anode. Im Gelzustand bildet Agarose (aus Algen isoliertes, unter Erwärmung lösliches Polysaccharid) ein räumliches Netzwerk. Im Agarose-Gel wird DNA unterschiedlicher Länge und Form getrennt. Kurze DNA wandert schnell, lange DNA langsam. Zirkuläre DNA (Plasmid, Abb. 22) wandert anders als lineare DNA gleicher Länge. Die zirkuläre Plasmid-DNA ist u.a. überspiralisiert (Superhelix, engl. supercoiled) und dadurch sehr kompakt. Durch unterschiedliche Superspiralisierung der Plasmid-DNA entstehen bei der Elektrophorese verschiedene Banden. Ethidiumionen, die im Agarose-Gel enthalten sind, lagern sich zwischen benachbarten Basenpaaren in DNA ein. DNA mit gebundenem Ethidium fluoresziert unter UV-Licht (Abb. 23) und kann dadurch im Agarose-Gel sichtbar gemacht werden.

Abbildung 23 : Agarose-Gelelektrophorese

Es besteht eine lineare Beziehung zwischen der Wanderungsdistanz und dem Logarithmus der Anzahl DNA-Basenpaare. Wird die Wanderungsdistanz von DNA bekannter Länge gegen log(DNA-Länge) graphisch als Kalibrierkurve aufgezeichnet, kann daran die Länge von DNA-Proben abgelesen werden

RestriktionskartenBei der Verdauung von DNA mit einem Restriktionsenzym entstehen genau definierte Fragmente, die in einem

Agarose-Gel entsprechend der Größe getrennt werden können und ein bestimmtes Muster bilden. Verschiedene Restriktionsenzyme führen aus derselben DNA zu unterschiedlichen Mustern von Fragmenten. Aus der relativen Anordnung von Restriktionsfragmenten können sogenannte Restriktionskarten gezeichnet werden. Restriktionsstellen bilden dabei „Landmarken" und die lineare Folge von Restriktionsstellen bildet eine „Landkarte von DNA". Solche „Landkarten" werden u.a. häufig benutzt, um nach der Sequenzierung von größeren Restriktionsfragmenten die komplette Sequenz anhand überlappender Teilsequenzen zu ermitteln (Abb. 24).

Abbildung 24 : Elektrophoretische Trennung von DNA-Fragmenten

a) Muster der elektrophoretischen Trennung von DNA-Fragmenten nach der Verdauung eines DNAMoleküls mit den Restriktionsenzymen Hind III, BamH I oder mit beiden Enzymen.

b) Die Restriktionskarte aufgrund des elektrophoretischen Fragmentmusters aus obiger Abbildung (bis auf die rechts/links Seitenorientierung ist die gewonnene Information ausreichend, um eine eindeutige Abfolge der Restriktionsstellen festzulegen).

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Bioanalytik

Restriktionsfragment-LängenpolymorphismusIn der medizinischen Diagnostik und Grundlagenforschung haben Restriktionsmuster eine wichtige Bedeutung. Auf

Grund von größtenteils stummen Mutationen in kodierenden und nicht-kodierenden Regionen unterscheidet sich das menschliche Genom von zwei nicht nahe verwandten Individuen in etwa 0,2% aller Basen (=1:500). Durch solche Variationen kann eine Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym so verändert werden, dass die DNA dort nicht mehr geschnitten wird. Wenn die Restriktionserkennungsstelle im DNA-Molekül des einen Chromosoms vorhanden ist, während sie auf dem anderen Chromosom fehlt, entsteht aus dem Chromosom mit der Schnittstelle ein kürzeres Fragment und aus dem anderen Chromosom ein längeres. Damit kann man die beiden Chromosomen einer Person aufgrund dieses RFLP7 unterscheiden. Die betreffende Person ist heterozygot für diesen RFLP. Ein weiterer Längen-Polymorphismus beruht auf repetitiven DNA-Sequenzen, die im Genom verstreut und in variabler Anzahl von Tandem-Wiederholungen vorkommen. Restriktionsfragmente, die solche Tandem-Wiederholungen enthalten, können sich deshalb in ihrer Länge unterscheiden. Da der RFLP wie ein Gen vererbt wird, kann man die einzelnen Chromosomen von Generation zu Generation verfolgen, indem man die Vererbung des Markerfragments nachweist. Für die praktische Durchführung benötigt man allerdings sogenannte DNA-Sonden, welche die gewünschten Markerfragmente aus den tausenden von Restriktionsfragmenten durch ein als Hybridisierung bezeichnetes Verfahren gezielt sichtbar machen können. Zu diesem Zweck werden die Restriktionsfragmente nach der Elektrophorese denaturiert (=Trennung der beiden Stränge der DNA-Doppelhelix) und auf eine Membran transferiert (=Southern Blot). Unter geeigneten Bedingungen lagert sich die DNA-Sonde an die Stelle mit komplementärer Basensequenz. Am häufigsten werden Sonden verwendet, die repetitive DNA-Abschnitte erkennen. RFLP und weitere DNA-Polymorphismen gelangen u.a. in der Rechtsmedizin zur Anwendung. Mit solchen auch als „DNA-Fingerabdruck" (Fingerprint) bezeichneten Verfahren kann die genetische Verwandtschaft von Menschen untersucht werden (Abb. 25).

Abbildung 25 : Entlastende DNA-Fingerprint-Analyse bei einem Vaterschaftsprozess

Die Pfeile zeigen Restriktionsbanden beim Kind, die nicht bei der Mutter X, aber auch nicht beim Probanden Y vorkommen

Wenn man vermutet oder durch genetische Analysen nachweisen kann, dass ein RFLP relativ nahe beim postulierten Gen einer Erbkrankheit lokalisiert ist, kann man ihn als Marker benützen. Je kürzer ein RFLP vom gesuchten Gen entfernt ist, desto geringer ist die Chance, dass bei der Meïose eine Rekombination zwischen Gen und RFLP stattfindet. Bei einer sog. Kopplungsanalyse verfolgt man die gemeinsame Vererbung eines Markers und eines Gens in einer Familie. Mit aufwendigen Untersuchungen an vielen Stammbäumen und mit einer großen Zahl von RFLP-Markern kann es manchmal gelingen, Gene für eine bestimmte Erbkrankheit zu isolieren, deren Ursache bisher unbekannt war. Diese Art der Genisolierung wird auch als positionelle Klonierung bezeichnet. Beispiele und Meilensteine für dieses Verfahren sind die Entdeckung der Gene für Mukoviszidose und schwerwiegende neurologische Erkrankungen wie die Duchenne-Muskeldystrophie (vom Neurologen Duchenne beschrieben) oder die sog. Chorea-Huntington oder Huntington'sche Krankheit (schwere Bewegungsstörung; im deutschsprachigen Raum auch als Veitstanz bezeichnet wegen Muskelzuckungen und unwillkürlichen, fahrigen Bewegungen). Dieser Untersuchungsablauf direkt von der Gensequenz zur Genfunktion wird auch als reverse Genetik bezeichnet.

Polymerase-KettenreaktionMit PCR (engl. polymerase chain reaction) können spezifische DNA-Abschnitte in einigen Stunden millionenfach

vervielfältigt werden (Abb. 26). Voraussetzung ist, dass ein Teil der Nucleotidsequenz bekannt ist, um synthetische Oligonucleotid-Primer herstellen zu können. Ebenso wird die Tatsache ausgenützt, dass die DNA-Stränge gegenläufig sind und die Synthese durch DNA-Polymerase nur am 3'-DNA-Ende stattfindet (Abb.  26 B, Pfeile). Die Proben-DNA wird durch Erhöhung der Temperatur auf 94 °C denaturiert (Abb. 26 A). Bei Abkühlung auf 55-60 °C binden die im Überschuss zugesetzten Oligonucleotide (=Primer) durch Basenpaarung an die DNA-Stränge, nämlich an der Stelle, zu welcher sie komplementär zur DNA sind (B). Die zugesetzte DNA-Polymerase ergänzt beide Stränge zum jeweiligen DNA-Doppelstrang (C). Bei Verwendung einer hitzestabilen DNA-Polymerase aus thermophilen Bakterien (z.B. aus Geysiren) kann der Reaktionszyklus von Denaturierung, Anhaften der Oligonucleotide und Extension zu den Doppelsträngen wiederholt werden (D-F). Ab dem 3. Zyklus (F) werden DNA-Moleküle der gewünschten Länge gebildet und exponentiell amplifiziert (F-G). Die Synthesereaktion der thermostabilen DNA-Polymerase läuft bei 72 °C optimal ab.

7 Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus

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Bioanalytik

Abbildung 26 : Schematischer Ablauf einer PCR

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Bioanalytik

Radioaktive Isotope

Isotope sind Nuclide (=Kernarten) gleicher Ordnungszahl aber verschiedener Massenzahl, z.B. 12C, 13C, 14C. Wenn ein Kern zu viele Neutronen enthält, ist er im allgemeinen unstabil, d.h. er zerfällt unter Bildung eines andern, stabilen Nuclids und unter Abgabe von Strahlung (Radioaktivität). Die hauptsächlichsten Strahlenarten sind Heliumkerne (α-Strahlen), Elektronen (ß-Strahlen) und elektromagnetische Quanten (γ-Strahlen). Alle drei Strahlenarten sind ionisierend, d.h. sie können beim Durchgang durch Materie Ionisationen hervorrufen. Radioaktivität kann durch diese Eigenschaft nachgewiesen werden.

Das Gesetz des radioaktiven Zerfalls lautet:

Gleichung 44 : Gesetz des radioaktiven Zerfalls 1

wobei N die Gesamtzahl der unstabilen Kerne, k die Zerfallskonstante, -dN/dt die Zerfallsgeschwindigkeit = Anzahl der Zerfallsakte pro Zeiteinheit = Abnahme von N pro Zeiteinheit. Die integrierte Form des Zerfallsgesetzes ist:

Gleichung 45 : Gesetz des radioaktiven Zerfalls 2

wobei N0 bzw. N die Gesamtzahl der zur Zeit t0 bzw. t noch nicht zerfallenen Kerne. Das Zeitintervall, in dem N auf genau die Hälfte von N0 gesunken ist, wird als Halbwertszeit, t1/2, bezeichnet. Sie ist umgekehrt proportional zur Zerfallskonstante:

Gleichung 46 : Halbwertszeit

Die Halbwertszeit, bzw. Zerfallskonstante, ist demnach unabhängig von der Menge des vorhandenen radioaktiven Materials (Reaktion 1. Ordnung). Sie ist charakteristisch für eine bestimmte Kernart.

Neben dem Zerfallstyp (Strahlungsart) und der Zerfallszeit (Halbwertszeit) ist jedes radioaktive Isotop durch die bei der Umwandlung freiwerdende Zerfallsenergie gekennzeichnet. Man versteht darunter die Energie der emittierten Strahlung. Sie wird angegeben in Megaelektronenvolt (MeV). Diese Energie hat nichts zu tun mit der Aktivitätsangabe eines radioaktiven Präparates! Sie ist aber ausschlaggebend für das Ionisationsvermögen der Strahlung. Zusammen mit dem Strahlungstyp und der Natur des Mediums bestimmt sie die maximale Reichweite der Strahlung.

In Biochemie und Medizin gebräuchliche Radioisotope:

Isotop Strahlungs-art Halbwertszeit

Mittlere Energie [MeV]

Max. Reich-weite in

Wasser [mm]

3H β- 12,3 Jahre 0,006 0,00314C β-    5.760 Jahre 0,05 0,332P β- 14,2 Tage 0,68 8,035S β- 87,0 Tage 0,05 0,359Fe β-/γ 45,0 Tage ≈ 1,30 ≈ 2125I γ 60,0 Tage 0,035 ≈ 2

Tabelle 9 : In Biochemie und Medizin gebräuchliche Radioisotope

Bestimmung der RadioaktivitätDie für die Isotopenanwendung in der Biochemie wichtigste Messgröße ist die Anzahl radioaktiver (=  unstabiler)

Atome (N) in einer Probe. Nach Gl. 44 ist sie proportional zur Anzahl von Zerfallsakten pro Zeiteinheit (= Radioaktivität) und lässt sich durch deren Messung quantitativ erfassen.

MessmethodikDie am häufigsten benützten Isotope sind β-Strahler von geringer Reichweite. Ihre Radioaktivität wird im

Flüssigkeits-Szintillationszähler gemessen. Bei diesem Verfahren wird die zu messende radioaktive Probe in einem Lösungsmittel gelöst, das eine fluoreszierende Substanz (= Szintillator) enthält, die durch die Strahlung zur Fluoreszenz angeregt wird. Der entstehende Lichtblitz wird durch einen Photonenvervielfacher in einen elektrischen Stromstoss umgewandelt und in einer Zähleinrichtung als Impuls („count") registriert. Die Impulsfrequenz wird in „count’s per minute" (= cpm) angegeben.

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„Background"Auch ohne radioaktive Probe werden in einem Messgerät Impulse registriert. Diese stammen von Verunreinigungen

des Zählgerätes und seiner Umgebung mit radioaktivem Material, von kosmischer Strahlung und von elektronischem Rauschen des Apparates. Solche Impulse werden „background count’s" genannt. Sie variieren je nach Versuchsbedingung und nach Instrument. Es ist daher nötig, die „background count’s" bei jeder Messung radioaktiver Proben separat zu bestimmen und sie von den „counts" der Proben abzuziehen. Der resultierende korrigierte Wert ist somit:

Gleichung 47 : Hintergrundkorrektur für radioaktive Messungen

ZählstatistikDer Zerfall eines unstabilen Kerns ist ein statistisches Ereignis. Die Wahrscheinlichkeit für das Eintreten eines

Zerfalls ist durch das Poissonsche Verteilungsgesetz gegeben. Nach diesem Gesetz entspricht die Standardabweichung oder Streuung eines Einzelmesswertes m seiner Quadratwurzel (= √m). Ergibt eine Einzelmessung m Impulse, so liegt der wahre Wert mit 68 % Wahrscheinlichkeit im Bereich m ± √m. Die Standardabweichung, ausgedrückt in Prozenten des Messwertes, ist 100 √m/m oder 100/√m. Bei Messungen von Proben mit 100 bzw. 10.000 Impulsen ergeben sich so Streubreiten von 10 % und 1 %. Die prozentuale Streuung nimmt also mit steigender Anzahl der gemessenen „ counts" ab. Sie ist unabhängig von der Zeit, während welcher gemessen wird. Bei wenig aktiven Proben kann sie durch Verlängerung der Zähldauer herabgesetzt werden.

Einheiten der RadioaktivitätFür viele Anwendungen reicht es, die in einer Probe vorhandene Aktivitätsmenge als gemessene und für

„background" korrigierte Impulse pro min (cpm) anzugeben. Das absolute Maß für die Radioaktivität einer Probe ist die Zahl der Zerfallsakte pro Zeiteinheit (dpm = decays per minute). Diese Zerfallsgeschwindigkeit (dpm) ist immer größer als die gemessene Impulsfrequenz (cpm). Das prozentuale Verhältnis der beiden, 100 x cpmProbe,korr/dpm, wird als Zählausbeute bezeichnet. Ihre Größe ist durch verschiedene Variablen bedingt, wie die Geometrie des Messapparates und die Fluoreszenzausbeute des Szintillators. Die Zählausbeute kann erniedrigt werden durch die Deaktivierung angeregter Zustände (chemisches Quenching z.B. durch Carbonylverbindungen wie Ketone und Carbonsäuren) oder durch Absorption des Fluoreszenzlichts durch die Probe selbst (Farbquenching). Die Herabsetzung der Zählausbeute einer Messeinrichtung kann mit Hilfe von Standardproben bestimmt werden, für welche die Menge des radioaktiven Isotops genau bekannt ist.

Die fundamentale Einheit für die Menge eines radioaktiven Isotops ist das Becquerel: 1 Bq = 1 Zerfall/Sekunde (1 dps). Die ältere, noch gebräuchlichere Einheit ist das Curie: 1 Ci = 3,67 x 1010 Bq. Gebräuchlicher sind die Einheiten Kilobecquerel (kBq) und Megabecquerel (MBq), respektive Millicurie (mCi) und Mikrocurie (µCi).

Spezifische RadioaktivitätFür die meisten quantitativen Anwendungen von Isotopen in der Biochemie muss die spezifische Radioaktivität

bekannt sein. Man versteht darunter die in der Gewichtseinheit (g) oder in einem Mol einer reinen Substanz enthaltene Aktivitätsmenge. Die spezifische Radioaktivität pro g-Atom eines reinen radioaktiven Isotops lässt sich nach Gl.  44 aus der Halbwertszeit und der Avogadroschen Zahl ableiten. Für 3H und 14C ergeben sich so Werte von 1,07 x 1015 Bq/g-Atom bzw. 2,3 x 1012 Bq/g-Atom.

Gewöhnlich werden radioaktive Isotope nicht in reiner Form, sondern in Mischung mit einem hohen Überschuss stabiler Isotope des gleichen Elements verwendet. Zur Ermittlung der spezifischen Radioaktivität solcher Proben muss die Radioaktivität und die chemisch messbare Gesamtmenge von radioaktiver und nicht-radioaktiver Substanz bestimmt werden. Kenntnis der spezifischen Radioaktivität gestattet dann die Umrechnung von gemessenen Radioaktivitätsmengen in Gramm oder Mol der markierten Substanz. Bei kurzlebigen Isotopen müssen Korrekturen gemacht werden für die Änderung der spezifischen Radioaktivität während des Experiments.

Wirkung radioaktiver Strahlung auf lebendes Gewebe - RadiodosimetrieAlle Strahlungsarten von radioaktiven Isotopen können lebendes Gewebe schädigen. Maßgebend für die schädigende

Wirkung ist das Ionisationsvermögen der radioaktiven Strahlung bzw. die im Gewebe absorbierte Strahlungsenergiemenge. Die quantitative Messung ionisierender Strahlung wird als Radiodosimetrie bezeichnet.

Die auf tote oder lebende Materie übertragene Energie wird Energiedosis genannt und in Joule/kg Materie angegeben. Die Einheit der Energiedosis ist das Gray (Gy), wobei 1 Gy = 1 J/kg. Die immer noch gebräuchliche ältere Einheit ist das rad (rd); 1 rd = 0,01 Gy = 0,01 J/kg. Noch älter ist die Einheit Röntgen (r), die streng genommen nur für Ionisierung durch γ- oder Röntgenstrahlen gilt und materialunabhängig ist. Ein r ist diejenige Menge an γ- oder Röntgenstrahlung, die in Luft zur Absorption von 8,3 x 10-6 J/g führt, was etwa 2 x 109 Ionenpaare/cm3 Luft erzeugt. In Luft und Körpergewebe ist 1 r ≈ 1 Gy.

Die Energiedosis (Gy) ist unabhängig von der Art der Strahlung und sagt deshalb vorerst nichts aus über deren schädigende Wirkung. Vielmehr ist es so, dass verschiedene radioaktive Strahlung bei gleicher Energiedosis verschieden stark schädigt. Beispielsweise ist die Übertragung von 1 Gy als α-Strahlung (z.B. 219Radon) viel stärker schädigend als 1 Gy als β-Strahlung (z.B. 14C). Als Maß für die biologische Wirkung von radioaktiver Strahlung gilt die Äquivalentdosis. Ihre Einheit ist das Sievert (Sv). Die Äquivalentdosis berechnet man aus der Energiedosis gemäss:

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Gleichung 48 : Berechnung der Äquivalentdosis

Für β- und γ-Strahlen ist der Qualitätsfaktor 1, für α-Strahlen bis 20. Bei 14C oder 3H, beides relativ schwache β-Strahler, gilt also Energiedosis = Äquivalentdosis, resp. 1 Gy = 1 Sv. Die ältere Einheit der Äquivalentdosis ist das rem (Röntgen equivalent for man); 1 rem = 0,01 Sv.

Die Äquivalentdosis/Zeit (Äquivalenzdosisleistung) kann man aus der Radioaktivitätsmenge (Bq) abschätzen. Die Abschätzung ist verschieden für äußere und innere Bestrahlung.

Gleichung 49 : Äquivalentdosisleistung für äußere Bestrahlung

Bei äußerer Bestrahlung nimmt demnach die Gefährdung mit dem Quadrat des Abstands zwischen der Strahlungsquelle und dem bestrahlten Objekt ab. Die Dosiskonstante ist abhängig vom Radioisotop. Die Bestrahlung mit einer Menge von 107 Bq 32P (10 MBq, 0,27 mCi) in einem Abstand von 1 m erzeugt eine Äquivalentdosisleistung von 9,2 x 10-5 Sv/h (0,092 mSv/h = 9,2 mrem/h). Die gleiche Menge an 14C erzeugt keinerlei Strahlenbelastung in 1 m Abstand, da bereits wenige mm Luftschicht die Energie aus dem Zerfall von 14C vollständig absorbiert.

Gleichung 50 : Äquivalentdosisleistung für innere Bestrahlung

Der Wert DECO (Dosis equivalent for critical organ) ist eine für ein Radioisotop typische Konstante. Die DECO-Werte variieren sehr stark und dienen zur Klassifizierung der Radioisotope in Toxizitätsklassen.

Die Radiotoxizität von intern aufgenommenen Isotopen hängt außer von der Aktivitätsmenge, der Halbwertszeit und den besonderen Strahlungseigenschaften auch von der Verweildauer im Organismus ab. Aufgrund dieser Gesichtspunkte lassen sich Isotope in verschiedene Toxizitätsklassen einteilen. Einige Beispiele sind:

1. Sehr hohe Radiotoxizität: 90Sr, 239Pu, 235U

2. Hohe Radiotoxizität: 131I, 125I

3. Mäßige Radiotoxizität: 32P, 59Fe

4. Niedrige Radiotoxizität: 3H, 14C, 35S

Beispiele für innere Bestrahlung

Inkorporation von 5,5 x 104 Bq (1,5 µCi) 32P erzeugt eine Strahlenbelastung von etwa 0,003  Sv (0,3 rem). Uranhaltiges Quellwasser (z.B. in gewissen Gebieten des Wallis) enthält etwa 37 Bq/m3 238U. Bei ausschließlichem Konsum dieses Wassers (1,5 l/Tag) wird in einem Jahr eine Äquivalentdosis von 1,6 x 10-5 Sv (16 µSv) akkumuliert. Die jährliche Strahlenbelastung für den Durchschnitt der Bevölkerung beträgt 2-3 x 10-3 Sv (2-3 mSv), davon stammen etwa die Hälfte aus künstlichen Quellen, v.a. medizinische Untersuchungen.

Richtlinien zum Arbeiten mit 3H- und 14C-markierten Substanzen3H und 14C sind schwache β-Strahler. Bei den Mengen, die in biologischen Versuchen zur Anwendung kommen,

besteht keinerlei Gefahr einer Strahlenschädigung von außen. Dagegen besteht das Risiko einer inneren Kontamination durch Verschlucken von radioaktiven Lösungen, Einatmen flüchtiger Verbindungen oder Hautkontakt mit fettlöslichen Verbindungen.

Zur Vermeidung solcher Zwischenfälle dürfen radioaktive Lösungen nie mit dem Mund direkt pipettiert werden, sondern nur mit Hilfe von mechanischen Pipettiervorrichtungen. Bei Kontamination der Haut muss sofort gründlich mit Wasser gewaschen werden.

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Immunologische Bestimmungsmethoden

Die Immunologie umfasst sämtliche Phänomene und Wechselwirkungen, die mit der spezifischen Abwehrreaktion eines Organismus auf eindringende Fremdsubstanzen - sogenannte Antigene - zusammenhängen. Immunologische Methoden werden zur Diagnose von Infektionskrankheiten verwendet. Es lassen sich damit aber auch Hormone, Vitamine, Medikamente und andere Stoffe in sehr geringen Konzentrationen bestimmen, sofern spezifische Antikörper gegen sie erzeugt werden können.

Folgende Eigenschaften zeichnen die Antigen-Antikörperreaktion aus:

1. Die Reaktion ist spezifisch

2. Die Bindung zwischen Antigen und Antikörper ist stark (Kd bis 10-10 m)

3. Für die Bindung zwischen Antigen und Antikörper sind die gleichen Kräfte verantwortlich wie für die Bindung von Substrat ans Enzym oder von Hormon an den Rezeptor (Wasserstoffbrücken, hydrophobe Wechselwirkungen sowie elektrostatische Kräfte).

Es sind heute eine ganze Reihe von qualitativen und quantitativen immunologischen Bestimmungsmethoden in Gebrauch, so z.B. der Agglutinationstest zur Blutgruppenbestimmung, der Radioimmunoassay (RIA) und der Enzymimmunoassay (EIA). Der EIA ist eine Weiterentwicklung des RIA. Bei beiden Tests ist die grundlegende Reaktion gleich. Die Bindung einer bekannten Menge radioaktiven (RIA) resp. enzymmarkierten (EIA) Antigens an Antikörper wird durch die Zugabe von nichtmarkiertem Antigen inhibiert. Das Ausmaß dieser Hemmung kann als Maß für die zugegebene Menge nichtmarkierten Antigens verwendet werden. Die Menge des gebundenen radioaktiven resp. enzymmarkierten Antigens wird beim RIA durch Messung von dessen Radioaktivität, beim EIA durch Messung von dessen Enzymaktivität bestimmt. Beide Bestimmungsmethoden (RIA und EIA) sind spezifisch und außerordentlich empfindlich. Es können noch zuverlässig Stoffmengen im ng- und pg-Bereich bestimmt werden.

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Anhang

AbbildungsverzeichnisAbbildung 1 : Ringbildung der Glucose (α- und β-Form)..............................................................................................................................8Abbildung 2 : Glykoside von Glucose...........................................................................................................................................................8Abbildung 3 : Disaccharide............................................................................................................................................................................9Abbildung 4 : Absorptionsspektren der aromatischen Aminosäuren..........................................................................................................11Abbildung 5 : Absorptionsspektren von Proteinen mit verschiedenem Gehaltan aromatischen Aminosäuren.........................................12Abbildung 6 : Löslichkeit von β-Lactoglobulin (IEP 5,2) in Abhängigkeit vom pH-Wert bei 25 °C..............................................................13Abbildung 7 : Schnitt durch eine Lipid-Doppelschicht.................................................................................................................................17Abbildung 8 : Diffusion von Phospholipidmolekülen in einer Lipid-Doppelschicht......................................................................................18Abbildung 9 : Elektropherogramm von Serum eines Menschen.................................................................................................................25Abbildung 10 : Trennung von zwei Aminosäuren (A1 und A2) auf Kationenaustauscherharz...................................................................28Abbildung 11 : Analyse von Aminosäuren mit Hilfe einer HPLC an einem Kationenaustausscher-Harz..................................................28Abbildung 12 : log Molekularmasse gegen Elutionsvolumen......................................................................................................................29Abbildung 13 : Gültigkeitsbereich des Lambert-Beer Gesetzes.................................................................................................................31Abbildung 14 : Schematische Darstellung eines Spektralphotometers......................................................................................................32Abbildung 15 : Abhängigkeit der Aktivität von der Substratkonzentration (v gegen [S]-Darstellung).........................................................34Abbildung 16 : Abhängigkeit der Aktivität von der Substratkonzentration..................................................................................................35Abbildung 17 : Abhängigkeit der Geschwindigkeit von der Enzymkonzentration.......................................................................................36Abbildung 18 : Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Enzymkonzentration..........................................................................................36Abbildung 19 : Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Temperatur........................................................................................................37Abbildung 20 : Kompetitive Hemmung........................................................................................................................................................37Abbildung 21 : Nicht-kompetitive Hemmung...............................................................................................................................................37Abbildung 22 : Elektronenmikroskopische Aufnahme von Plasmiden (unterschiedliche Überspiralisierung)............................................41Abbildung 23 : Agarose-Gelelektrophorese................................................................................................................................................42Abbildung 24 : Elektrophoretische Trennung von DNA-Fragmenten..........................................................................................................42Abbildung 25 : Entlastende DNA-Fingerprint-Analyse bei einem Vaterschaftsprozess.............................................................................43Abbildung 26 : Schematischer Ablauf einer PCR........................................................................................................................................44

FormelverzeichnisFormel 1 : Benedict-Probe.............................................................................................................................................................................9Formel 2 : Enzymatischer Glucosenachweis, Schritt 1................................................................................................................................9Formel 3 : Enzymatischer Glucosenachweis, Schritt 2................................................................................................................................9Formel 4 : Peptidbindung in Proteïnen........................................................................................................................................................11Formel 5 : Ninhydrin-Reaktion.....................................................................................................................................................................11Formel 6 : Unterschiede bei Seife, Detergens- und Gallensäuremolekülen...............................................................................................15Formel 7 : Grundstruktur der Glycerolphosphatide.....................................................................................................................................17Formel 8 : Brönstedsche Säure-Base-Definition.........................................................................................................................................21Formel 9 : Ampholyt.....................................................................................................................................................................................23Formel 10 : Dissoziation von sauren und basischen Aminosäuren (Aspartat)...........................................................................................23Formel 11 : Ionen-Austausch am Austauscherharz....................................................................................................................................27Formel 12 : Formaler Ablauf einer enzymatischen Reaktion......................................................................................................................33Formel 13 : Reaktionsschema einer "normalen" enzymatischen Reaktion................................................................................................33Formel 14 : Einfachste Formulierung einer enzymatischen Reaktion........................................................................................................33Formel 15 : Enzymatische Reaktion...........................................................................................................................................................38

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GleichungsverzeichnisGleichung 1 : Gebräuchliche Masse-Einheiten.............................................................................................................................................5Gleichung 2 : Gebräuchliche Stoffmengen-Einheiten...................................................................................................................................5Gleichung 3 : Umrechnung: Masse in Stoffmenge und vice versa...............................................................................................................5Gleichung 4 : Gebräuchliche Volumen-Einheiten.........................................................................................................................................5Gleichung 5 : Gebräuchliche Massenkonzentrations-Einheiten...................................................................................................................6Gleichung 6 : Gebräuchliche Stoffmengenkonzentrations-Einheiten...........................................................................................................6Gleichung 7 : Berechnung der Sedimentationskonstanten.........................................................................................................................13Gleichung 8 : Definition der Säuredissoziationskonstante..........................................................................................................................21Gleichung 9 : Säuredissoziationskonstante einer schwachen Säure.........................................................................................................21Gleichung 10 : pH-Wert einer schwachen Säure........................................................................................................................................21Gleichung 11 : Dissoziationsgleichgewicht von Wasser.............................................................................................................................21Gleichung 12 : Ionenprodukt des Wassers.................................................................................................................................................21Gleichung 13 : pH-Wertes einer Lösung des Salzes einer schwachen Säure mit einer starken Base......................................................22Gleichung 14 : Henderson-Hasselbalch-Gleichung....................................................................................................................................22Gleichung 15 : IEP einer Aminosäure.........................................................................................................................................................23Gleichung 16 : Allgemeine Definition des Rf-Wertes...................................................................................................................................27Gleichung 17 : Volumenverteilung in einer "Sephadex"-Säule...................................................................................................................28Gleichung 18 : Abhängigkeit des Elutionsvolumens einer Substanz..........................................................................................................28Gleichung 19 : Definition der Extinktion E (optischen Dichte OD)..............................................................................................................31Gleichung 20 : Bezeihung zwischen %D und E.........................................................................................................................................31Gleichung 21 : Geschwindigkeit der Produktentstehung............................................................................................................................33Gleichung 22 : Fliessgleichgewicht einer enzymatischen Reaktion...........................................................................................................34Gleichung 23 : Umformung der Gleichung 22.............................................................................................................................................34Gleichung 24 : Anfangsgeschwindigkeit der enzymatischen Reaktion......................................................................................................34Gleichung 25 : Michaelis-Menten-Gleichung..............................................................................................................................................34Gleichung 26 : Definition der Konstanten der Michaelis-Menten-Gleichung..............................................................................................34Gleichung 27 : Michaelis-Menten-Gleichung bei Substratkonzentrationen weit unterhalb Km...................................................................35Gleichung 28 : Michaelis-Menten-Gleichung bei Substratkonzentrationen weit oberhalb Km...................................................................35Gleichung 29 : Lineweaver-Burk 1..............................................................................................................................................................35Gleichung 30 : Lineweaver-Burk 2..............................................................................................................................................................35Gleichung 31 : Substituierte Michaelis-Menten-Gleichung.........................................................................................................................36Gleichung 32 : Enzymaktivität 1..................................................................................................................................................................38Gleichung 33 : Enzymaktivität 2..................................................................................................................................................................38Gleichung 34 : Enzymaktivität 3..................................................................................................................................................................39Gleichung 35 : Spezifische Aktivität............................................................................................................................................................39Gleichung 36 : Aktivitätskonzentrtion im Ansatz.........................................................................................................................................39Gleichung 37 : Aktivitätskonzentration in der Enzymlösung.......................................................................................................................39Gleichung 38 : Spezifische Aktivität............................................................................................................................................................39Gleichung 39 : Substratkonzentration im Ansatz........................................................................................................................................39Gleichung 40 : Konzentration der zugesetzten Substratlösung..................................................................................................................39Gleichung 41 : Anfängliche Substratkonzentration im Ansatz....................................................................................................................39Gleichung 42 : Konzentration der Pyruvatlösung........................................................................................................................................40Gleichung 43 : Massenkonzentration der Pyruvatlösung...........................................................................................................................40Gleichung 44 : Gesetz des radioaktiven Zerfalls 1.....................................................................................................................................45Gleichung 45 : Gesetz des radioaktiven Zerfalls 2.....................................................................................................................................45Gleichung 46 : Halbwertszeit.......................................................................................................................................................................45Gleichung 47 : Hintergrundkorrektur für radioaktive Messungen...............................................................................................................46Gleichung 48 : Berechnung der Äquivalentdosis........................................................................................................................................47Gleichung 49 : Äquivalentdosisleistung für äußere Bestrahlung................................................................................................................47Gleichung 50 : Äquivalentdosisleistung für innere Bestrahlung..................................................................................................................47

TabellenverzeichnisTabelle 1 :Tryptophan- und Tyrosingehalt in g Aminosäure pro 100 g Proteïn..........................................................................................12Tabelle 2 : Molekularmasse einiger Proteïne..............................................................................................................................................12Tabelle 3 : Typische Werte für S.................................................................................................................................................................13Tabelle 4 : Phospholipidtypen.....................................................................................................................................................................17Tabelle 5 : pKa- und IEP-Werte einiger Aminosäuren.................................................................................................................................24Tabelle 6 : Chromatographietypen..............................................................................................................................................................27Tabelle 7 : Ausschluss-Molekularmassen einiger "Sephadex"-Gele..........................................................................................................29Tabelle 8 : Erkennungssequenz einiger Restriktionsendonucleasen.........................................................................................................41Tabelle 9 : In Biochemie und Medizin gebräuchliche Radioisotope............................................................................................................45

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