Biokatalysatoren für die organische Synthese - die neue Generation

BiokatalyseDOI: 10.1002/ange.201302195

Biokatalysatoren f�r die organische Synthese – die neueGeneration**Bettina M. Nestl, Stephan C. Hammer, Bernd A. Nebel und Bernhard Hauer*

AngewandteChemie

Stichwçrter:Biokatalyse · Bioorganische Chemie ·Enzymkatalyse ·Synthesemethoden

.AngewandteAufs�tze B. Hauer et al.

3132 www.angewandte.de � 2014 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim Angew. Chem. 2014, 126, 3132 – 3158

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1. Einleitung und �berblick

Katalyse, insbesondere jene mit S�uren, Basen und Me-tallen, war und ist wichtig f�r den Erfolg der organischenSynthese. Eine neuartige Gruppe von Katalysatoren sind dieBiokatalysatoren. Enzyme ermçglichen chemo-, regio- undstereoselektive Reaktionen und erleichtern somit die Syn-these von komplexen organischen Molek�len. Die hohenSynthesekapazit�ten, die einige Enzyme von Natur aus auf-weisen, werden bereits f�r die industrielle Produktion vonGrund- und Feinchemikalien sowie Arzneimitteln eingesetzt.Die Herausforderung liegt jedoch vornehmlich darin, dasgesamte Potenzial von Enzymen als alternative Katalysatorenzu ihren chemischen Gegenst�cken zu entdecken und lang-fristig nutzbar zu machen. Somit kçnnen neue und bekannteSyntheserouten in der organischen Chemie erschlossen oderoptimiert werden. Das wachsende Interesse an Enzymen undMikroorganismen sowie ihre Ber�cksichtigung als Katalysa-toren bei der Umsetzung von Synthesestrategien f�hren dazu,dass sich das Forschungsfeld signifikant weiterentwickelt.Dem Ziel der Kommerzialisierung ist man inzwischen einenerheblichen Schritt n�her gekommen. Mittlerweile hat dieBiokatalyse einen Punkt erreicht, an dem ernsthaft �ber dieVerwendung von Enzymen f�r gleichermaßen einfache wiekomplexe chemische Reaktionsschritte nachgedacht wird.Hauptgr�nde f�r die Anwendung von Enzymen f�r spezifi-sche und pr�parative Aufgaben sind die hohe Selektivit�t undSpezifit�t dieser Katalysatoren. Der chirale Aufbau der ak-tiven Tasche ermçglicht oft die gew�nschte enantiomeren-reine Herstellung der Reaktionsintermediate und Produkte.Biokatalysatoren kçnnen nicht nur f�r die Einf�hrung vonchiralen Zentren in einem Molek�l genutzt werden, sondernauch f�r milde Syntheserouten, bei denen Chemo- und Re-gioselektivit�ten eine Schl�sselrolle spielen.[1] Diese charak-teristischen Vorteile enzymatisch katalysierter Reaktionenwurden zahlreich beschrieben.

In der chemischen und pharmazeutischen Industrie wirdbei der Synthese von einigen chiralen Verbindungsklassen dieBiokatalyse mehr und mehr zur Methode der Wahl. Diesbe-

z�glich sind besonders Aminos�uren, Aminoalkohole,Amine, Alkohole und Epoxide zu nennen, die wichtigeBausteine f�r viele biologisch aktive Verbindungen sind.[2] Inden folgenden Abschnitten werden bekannte, bereits eta-blierte Biokatalysatoren benannt und erl�utert. Die am h�u-figsten in der industriellen organischen Synthese eingesetztenEnzyme gehçren zu den Klassen der Hydrolasen und Keto-reduktasen. In den letzten Jahren waren Hydrolysereaktionenwegen der Verf�gbarkeit sowie der einfachen Handhabungvon Esterasen, Lipasen und im geringeren Maße Acylasen eindominierender Bereich der Biokatalyse. Dar�ber hinausmachen die Abwesenheit von Kofaktoren sowie die breiteSubstratspezifit�t und Stabilit�t in Lçsungsmitteln diese En-zymklasse wertvoll f�r die Synthese.[3] Ein neu etabliertesAnwendungsgebiet f�r Lipasen ist die Polymerisation. Diesermçglicht einen Zugang zu einer großen Zahl an Polymeren,die �ber Polykondensation und Ringçffnungspolymerisationausgehend von cyclischen Monomeren hergestellt werden.[4]

Chemische Veresterungen werden �blicherweise mithilfe vonMetall- oder S�urekatalyse bei hçheren Temperaturen oderDr�cken durchgef�hrt. Dies ist allerdings bei der Verwen-dung von Acrylverbindungen nicht zielf�hrend, da dieseunter solchen Bedingungen spontan polymerisieren kçnnen.Anders als chemische Katalysatoren kçnnen Lipasen effizi-ente Veresterungen von Acrylaten unter milden Reaktions-bedingungen[5, 6] katalysieren, was ihren Einsatz im industri-ellen Maßstab interessant macht.[7] In den letzten Jahrenhaben sich ebenfalls Ketoreduktasen[8] etabliert, welche dieasymmetrische Reduktion von Ketonen zu chiralen Alkoho-

Die Verwendung von Enzymen als Katalysatoren zur Syntheseneuartiger Verbindungen ist in den letzten Jahren zunehmend in denFokus ger�ckt. Entsprechend hohe Erwartungen werden an die Ent-deckung und Identifizierung neuer Biokatalysatoren f�r die organi-sche Synthese gestellt. Dies spiegelt sich auch in der Komplexit�t deradressierten Reaktionen wider. Der Anwendungsbereich von Bioka-talysatoren umfasst die Synthese wichtiger Zwischenprodukte f�r diepharmazeutische und chemische Industrie sowie die Entwicklungneuer enzymatischer Techniken und Prozesse. Enzyme sind einwichtiger Teil des Spektrums an Katalysatoren, die der Synthese-chemie zur Verf�gung stehen. Die Vorteile und Anwendungsmçg-lichkeiten der neuesten und hçchst vielversprechenden Generation vonBiokatalysatoren – Reduktasen, Transaminasen, Ammoniak-Lyasen,Epoxidhydrolasen und Dehalogenasen – werden hier vorgestellt undanhand der Synthese von Schl�sselmolek�len beispielhaft diskutiert.

Aus dem Inhalt

1. Einleitung und �berblick 3133

2. Selektive Reduktion aktivierterC=C-Bindungen 3135

3. Enzyme zur Herstellung chiralerAmine und Aminos�uren 3140

4. Biokatalyse als Alternative zurGenerierung chiraler Epoxideund Epoxidringçffnungs-produkte 3149

5. Zusammenfassung und Ausblick 3154

[*] Dr. B. M. Nestl, Dipl.-Chem. S. C. Hammer, Dr. B. A. Nebel,Prof. Dr. B. HauerTechnische Biochemie, Universit�t StuttgartStuttgart (Deutschland)E-Mail : [email protected]

[**] Das Titelbild „Guiding“ stammt von der jungen çsterreichischenK�nstlerin Claudia Nebel. Das Werk illustriert ihre Interpretationdes Begriffs „Biokatalyse“. Das Bild zeigt die Interaktion einesSubstrats im aktiven Zentrum eines Enzyms.

BiokatalysatorenAngewandte

Chemie

3133Angew. Chem. 2014, 126, 3132 – 3158 � 2014 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

len ermçglichen, eine der am weitesten verbreiteten Redox-reaktionen in der organischen Chemie.[9] Die „Merck-Pro-cess-Group“ wies k�rzlich darauf hin, dass Fortschritte in derKetoreduktase-Applikation ein großes Potenzial f�r einenachhaltige chemische Prozesskultur bieten.[10] Außer denKetoreduktasen finden auch Baeyer-Villiger-Monooxygena-sen zunehmende Verwendung, auch wenn sich in beidenF�llen die Methodik wegen der Kofaktorregenerierungkomplexer gestaltet als bei der Gruppe der Hydrolasen.Baeyer-Villiger-Monooxygenasen werden f�r die Oxidationaliphatischer und cyclischer Ketone zur Herstellung enan-tiomerenreiner Zwischenprodukte eingesetzt.[11] Zus�tzlichzu den Oxidoreduktasen im Allgemeinen gehçren neue C-C-,C-N- und C-O-bindungsbildende Biokatalysatoren mit einembreiten Substratspektrum zu der Gruppe von Enzymen, inderen Fall das wissenschaftliche wie auch das industrielleInteresse stetig zunimmt.[12, 13] Unter diesen wurden vor allemAldolasen, Hydroxynitrilasen und Thiamindiphosphat-ab-h�ngige Lyasen, wie die Benzaldehydlyase oder die Pyr-uvatdecarboxylase, als leistungsf�hige Biokatalysatorenidentifiziert und f�r verschiedenste Anwendungen genutzt.So ermçglichen diese Enzyme zus�tzlich zur Herstellungunterschiedlicher Zucker und cyclischer Kohlenstoffver-

bindungen auch die Synthese von Acyloinen und Cyan-hydrinen.[13]

Gegenw�rtig gibt es eine Vielzahl von etablierten bioka-talytischen Strategien, um Chiralit�t in ein Molek�l einzu-f�hren. Diese Katalysatoren kçnnen auch in Kaskadenreak-tionen sequenziell oder kooperativ genutzt werden.[14] Dar-�ber hinaus wurden Beispiele beschrieben, bei denen Bio-katalysatoren zusammen mit konventionellen chemischenKatalysatoren in heterogenen Kaskadenreaktionen in einemReaktionsgef�ß eingesetzt werden. Das Potenzial, verschie-denste Katalysatoren in einem Ansatz parallel zu verwenden,ist bei Enzymen wegen ihres chemisch inerten Verhaltensbesonders ausgepr�gt. Allerdings ist dieses Potenzial wegender begrenzten Reaktionsvielfalt der etablierten Enzymekaum nutzbar.

Viele Enzyme (haupts�chlich Hydrolasen, Lyasen undOxidoreduktasen) werden bereits f�r die Synthese von un-terschiedlichsten organischen Verbindungen verwendet.Wegen der eingeschr�nkten chemischen Reaktionsvielfaltdieser etablierten Enzyme ist ein großes Interesse an neuenBiokatalysatoren f�r weitere Reaktionen vorhanden. Umneuartige Enzyme zu identifizieren und zu entwickeln, sindheutzutage ausgereifte Techniken verf�gbar: 1) das Screening

Bernhard Hauer (2. von links) studierte Biologie an der Universit�t Hohenheim und promovierte 1982 bei Franz Lingens. Nach einem Postdoktorat an derUniversity of Chicago bei James Shapiro wurde er 1983 Laborleiter bei der BASF SE. Dort war er zuletzt f�r den Forschungsbereich Biokatalyse als Wissen-schaftlicher Direktor verantwortlich. 1996 habilitierte er sich an der Universit�t Heidelberg. Nach Jahren in der Industrie folgte er 2009 dem Ruf an dieUniversit�t Stuttgart als Leiter des Instituts f�r Technische Biochemie. Er entwickelt neuartige Enzyme zur Erweiterung biokatalytischer Reaktionen undProzesse.

Bettina M. Nestl (2. von rechts) studierte Chemie an der Universit�t Graz und promovierte 2007 bei Kurt Faber. Im Anschluss wechselte sie f�r einPostdoktorat an das Manchester Institute of Biotechnology der University of Manchester zu Nicholas J. Turner. Seit 2010 ist sie als Gruppenleiterin amInstitut f�r Technische Biochemie t�tig. Dort befasst sie sich mit dem Akquirieren neuer nationaler und internationaler Projekte und widmet ihr wissen-schaftliches Engagement haupts�chlich der Entwicklung und Optimierung von Proteinen mit neuartigen katalytischen Eigenschaften und deren Anwendungin Kaskadenprozessen.

Stephan C. Hammer (rechts) studierte nach einer abgeschlossenen Ausbildung zum Techniker bei der BASF SE Chemie an den Universit�ten Marburg undCambridge. Nach seiner Diplomarbeit wechselte er an das Institut f�r Technische Biochemie der Universit�t Stuttgart. Unter der Leitung von BernhardHauer entwickelt er in seiner Doktorarbeit Biokatalysatoren f�r die chirale Brønsted-S�urekatalyse.

Bernd A. Nebel (links) studierte Umweltsystemwissenschaften mit einer Spezialisierung in organischer Chemie und Chemieingenieurswesen an der Universi-t�t Graz. Er promovierte dort bei Martin Mittelbach im Bereich nachwachsende Rohstoffe. Nach einem Postdoktorat am Forschungszentrum CoEBio3 derUniversity of Manchester bei Nicholas J. Turner wechselte er 2010 an das Institut f�r Technische Biochemie. Dort koordiniert er die Gruppe f�r AngewandteBiokatalyse und erforscht unkonventionelle Reaktionsmedien zur Modifizierung erneuerbarer Rohstoffe sowie deren nachhaltiger industrieller Anwendung.

.AngewandteAufs�tze

B. Hauer et al.



nach neuen St�mmen und neuen Enzymaktivit�ten, 2) ge-richtete Evolution f�r die Optimierung von Enzymen mitgew�nschten Funktionen, 3) die Entwicklung von alternati-ven Reaktionsmedien und unkonventionellen Lçsungsmit-telsystemen sowie 4) die Bioinformatik.[5,15] Zus�tzlich zu denzuvor genannten Mçglichkeiten bieten neuartige Screening-methoden von Mikroorganismen, inklusive der Anreiche-rungsselektion und der Metagenomik, sowie das De-novo-Engineering von Designerproteinen neue Mçglichkeiten, umEnzyme als Katalysatoren zu entwickeln. In diesem Sinned�rfen auch die Untersuchungen der katalytischen Flexibili-t�t von vorhandenen Enzymen f�r eine Vielzahl nichtnat�r-licher Reaktionen nicht unerw�hnt bleiben.

In diesem Aufsatz zeigen wir ausgew�hlte biokatalytischeBeispiele f�r die selektive Synthese interessanter Molek�le,die mit konventionellen chemischen Methoden nur schwer zuerreichen sind. Die j�ngsten Fortschritte in der Biokatalysemit dem Schwerpunkt auf Epoxiden, Aminen, Aminoalko-holen und reduzierten Alkenen werden hier zusammenge-fasst. Dar�ber hinaus werden die breite Anwendbarkeit be-stimmter Katalysatoren und deren Nutzen f�r die organischeSynthese in den Vordergrund gestellt. Die Zusammenfassungrelevanter Informationen gibt Chemikern in der Industrieund an Hochschulen einen Einblick in die neuesten For-schungsfortschritte. Die Biokatalyse bietet mit ihren beson-deren Selektivit�ten neue Mçglichkeiten f�r die Retrosyn-these komplexer Molek�le.

2. Selektive Reduktion aktivierter C=C-Bindungen

Asymmetrische Hydrierungen sind in der organischenChemie von grçßter Bedeutung und sind oft ein Schl�ssel-schritt in einer Gesamtsynthese. Dies gilt besonders f�r diestereoselektive Reduktion von C=C-Bindungen, da in einemSchritt bis zu zwei Stereozentren erzeugt werden kçnnen(Abbildung 1).

Aktuell werden solche Reaktionen durch �bergangsme-tall-Homogenkatalysatoren[16] oder Organokatalysatoren[17]

katalysiert. Ein neues Instrument f�r die asymmetrische Re-duktion von aktivierten C=C-Bindungen sind Katalysatorender „Old Yellow Enzym“(OYE)-Familie.[18] Die Mitgliederdieser Familie, auch Enreduktasen (EC 1.3.1.31) genannt,sind Flavinmononukleotid (FMN) enthaltende, NAD(P)H-abh�ngige Redoxkatalysatoren. Die Reaktion l�sst sich inzwei Schritte unterteilen: Bei der reduktiven Teilreaktionwird der FMN-Kofaktor durch NAD(P)H reduziert, w�hrendim oxidativen Teilschritt die Reduktion der aktiviertenDoppelbindung bei gleichzeitiger Oxidation des FMN-Ko-faktors erfolgt (Abbildung 2).

Insgesamt �hnelt die Reaktion einer asymmetrischenMichael-Addition an eine a,b-unges�ttigte C=O-Bindung,wobei das Hydrid und das Proton ausschließlich trans-stereo-spezifisch addiert werden. Erste biokatalytische Versuchewurden mit ganzen Zellen durchgef�hrt, um eine externeNAD(P)H-Kofaktor-R�ckgewinnung und aufwendige Pro-teinaufreinigung zu umgehen. Hierbei wurde meistens dieB�ckerhefe als Zellsystem verwendet. W�hrend exzellenteStereoselektivit�ten erreicht wurden, sind Chemoselektivit�-

ten und Gesamtausbeuten mit ganzen Zellen oft gering. Diesist im Wesentlichen auf Nebenreaktionen, wie die Reduktionvon Carbonylverbindungen zu Alkoholen, zur�ckzuf�hren.Diese Nachteile kçnnen nun vermieden werden, indem re-kombinante Enreduktasen zusammen mit passenden Re-doxenzymen zur effizienten Wiedergewinnung des teurenNAD(P)H-Kofaktors verwendet werden.

Die asymmetrische Reduktion von konjugierten C=C-Bindungen mit Enreduktasen fand großes Interesse bei Syn-thesechemikern. Das breite Spektrum von Enreduktase-ka-talysierten stereospezifischen Reduktionen bietet einebrauchbare Alternative zu herkçmmlichen �bergangsmetall-katalysierten Reduktionen. Eine Schwierigkeit bei diesenSystemen ist die Abh�ngigkeit vom reduzierten Nicotin-amidkofaktor NAD(P)H, der die entsprechenden Redukti-ons�quivalente f�r eine Alkenreduktion zur Verf�gung stellt.Wegen des teuren Kofaktors und der Notwendigkeit einesKofaktorregenerationssystems sowie der teilweise nicht zu-friedenstellenden Chemoselektivit�ten bei der Reduktionvon unges�ttigten Aldehyden und Ketonen wurde k�rzlicheine Reihe synthetischer NADH-Mimetika studiert. Beidieser Reduktion wurde Rohextrakt der thermophilen En-reduktase YqjM aus Bacillus subtilis verwendet. Durch den

Abbildung 1. Asymmetrische Reduktion einer aktivierten Doppelbin-dung, katalysiert durch eine Enreduktase der OYE-Familie.

Abbildung 2. Oxidative Halbreaktion, die von OYE katalysiert wird. DieReaktion erfolgt �ber den Transfer eines Hydrids vom reduziertenFMN auf das Cb-Atom des Substrats sowie anschließende Protonie-rung des Ca-Atoms. Die Reduktion von FMN mit NAD(P)H als Reduk-tionsmittel findet in der reduktiven Halbreaktion statt.


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Einsatz dieser artifiziellen Kofaktoren wurden hohe Ums�tzesowie Enantio- und Chemoselektivit�ten erzielt.[19] Enzymeder OYE-Familie sind in vielen Mikroorganismen undPflanzen zu finden. Mehr als 25 Familienmitglieder wurdenbisher biochemisch charakterisiert und auf ihre katalytischenF�higkeiten untersucht. Alles in allem weisen diese Enzymeeinen bemerkenswert umfassenden Substratbereich auf undkatalysieren die Reduktion von acyclischen und cyclischena,b-unges�ttigten Ketonen, Aldehyden, Nitroalkenen, Car-bons�uren und Estern wie auch Nitratestern, Nitroglycerinen,nitroaromatischen Sprengstoffen und cyclischen Triazinen.[20]

Einige Enreduktasen kçnnen außerdem die Disproportio-nierungsreaktion von Cyclohex-2-enon zu �quimolarenMengen Cyclohexanon und Phenol katalysieren. Diese Dis-proportionierung wurde als Nebenreaktion beobachtet unddemonstriert die katalytische Promiskuit�t der OYEs.[21]

Dar�ber hinaus wurde k�rzlich gezeigt, dass Enredukta-sen eine redoxneutrale Isomerisierung von a,b-unges�ttigtemg-Butyrolacton 1 katalysieren.[22] Des Weiteren wurden auchb-Halogenacrylesterderivate 4 unter reduktiver Dehaloge-nierung umgesetzt. Bei dieser Reaktion wird 4 durch eineenzymatische C=C-Bindungsreduktion, gefolgt von einerspontanen b-Eliminierung des instabilen Zwischenprodukts,in das entsprechende Produkt umgewandelt.[23] Die Umset-zung von b,b-disubstituierten Nitroalkenen 6 verl�uft ange-sichts der Reaktion �ber den Nef-Reaktionsweg[24] oder derBildung des 1,2-Oxazetzwischenprodukts etwas �berra-schend.[25] Der jeweilige Reaktionsverlauf ist abh�ngig vomSubstrat und vom gew�hlten Biokatalysator (Abbildung 3).

K�rzlich wurde �ber eine enzymatische Kaskade zurIsomerisierung von Allylalkoholen zu den entsprechendenges�ttigten Carbonylverbindungen berichtet (Schema 1). Indieser Kaskade wurde eine durch eine NAD(P)+-abh�ngigeAlkoholdehydrogenase (ADH) katalysierte Oxidation desAllylalkohols Cyclohexenol 9 mit einer durch eineNAD(P)H-abh�ngige Enreduktase katalysierten Reduktiondes a,b-unges�ttigten Ketons 10 gekoppelt.[26] Als Modell-enzym wurden eine ADH aus Thermus sp. ATN1 (TADH)und eine Enreduktase aus Thermus scotoductus SA-01(TsER) ausgew�hlt. Nach 24 h Reaktionszeit konnte eineGesamtausbeute von 66% unter optimierten Transformati-onsbedingungen erzielt werden.

In den vergangenen f�nf Jahren wurde das katalytischePotenzial von OYEs ausgiebig studiert. Es konnten im pr�-parativen Maßstab hoch stereoselektive C=C-Reduktionenindustriell interessanter Molek�le realisiert werden, die mit

konventionellen Techniken nur schwer zu verwirklichenw�ren. Die nachfolgenden Beispiele verdeutlichen die breiteAnwendbarkeit dieser Enzyme mit unterschiedlichen, hoch-funktionalisierten Michael-Systemen als Substrate. Des Wei-teren haben erste Experimente gezeigt, dass OYEs auch zurKatalyse der Umkehrreaktion, der regioselektiven Synthesevon a,b-unges�ttigten Ketonen aus den entsprechenden ge-s�ttigten Verbindungen, herangezogen werden kçnnen.[27]

Die asymmetrische katalytische Reduktion von C=C-Bindungen geht Hand in Hand mit der Bildung von bis zuzwei Stereozentren und gehçrt somit zu einer h�ufig einge-setzten Strategie zur Herstellung von chiralen Verbindungen.F�r die chemoenzymatische, asymmetrische Synthese derDuftstoffe Lilial (14) und Helional (15) haben St�ckler et al.die biokatalytische Reduktion der entsprechenden Zimtal-dehydderivate mit unterschiedlichen Enreduktasen studiert(Schema 2).[28] Diese Reduktionen erwiesen sich unter Stan-dardbedingungen in w�ssrigem Puffer bei pH 7.5 als sehrlangsam. Um eine effiziente Lçslichkeit der lipophilenZimtaldehydderivate im g L�1-Konzentrationsbereich zu ge-w�hrleisten, wurden 20 % tert-Butylmethylether als Kosol-vens zugef�gt, was zu einer gesteigerten Reaktionsge-schwindigkeit f�hrte. R-Enantiomere mit moderaten Enan-tiomeren�bersch�ssen (maximal 53 % ee a-Methyldihydro-zimtaldehyd) wurden mit den Enreduktasen YqjM aus Ba-cillus subtilis und OPR1 aus Lycopersicon esculentumerreicht. Die entsprechenden S-Enantiomere wurden mitexzellenten Stereoselektivit�ten (bis zu 97% ee) mithilfe von

Abbildung 3. Promiskuitive Aktivit�ten von Enreduktasen. a) Biokataly-tische C=C-Isomerisierung und Bindungsreduktion von a,b-unges�ttig-tem g-Butyrolacton 1. b) Enzymatische Bioreduktion von b-Halogen-a,b-unges�ttigten Carboxyestern 4 �ber eine schrittweise C=C-Bin-dungsreduktion und spontane b-Eliminierung des instabilen, ges�ttig-ten Zwischenprodukts. c) Reduktive Transformation von b,b-disubstitu-ierten Nitroalkenen �ber einen Nef-Reaktionsweg zu 8 oder �ber dieReduktion der Nitrogruppe zum 1,2-Oxazetderivat, das zum Keton 7weiterreagiert.

Schema 1. Enzymatische Kaskade f�r die Redoxisomerisierung von Al-lylalkoholen.


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OYE1–OYE3 aus Saccharomyces sp. und NCR aus Zy-momonas mobilis erhalten. W�hrend die Bioreduktion von 12zu Lilial nur einen moderaten Umsatz von bis zu 32% zeigte,konnte quantitativer Umsatz von 13 zu Helional in Gegen-wart von OYE2 beobachtet werden.

Auf dieser Grundlage konnte eine direkte Synthese von„Roche-Ester“-Verbindungen entwickelt werden. „Roche-Ester“ sind wichtige chirale Bausteine f�r die Synthese vonVitaminen, Antibiotika sowie einigen Duft- und Naturstof-fen. St�ckler et al. studierten elf Enzyme der OYE-Familiezur Reduktion von Methyl-2-hydroxymethacrylaten 16 mitunterschiedlichen Schutzgruppen (Schema 3).[21] OYE1–OYE3 aus Saccharomyces sp. und YqjM aus Bacillus subtilishaben sich als gute Katalysatoren f�r diese Reduktion er-wiesen. Das nicht gesch�tzte Substrat Methyl-2-hydroxy-methacrylat (16a) konnte mit nahezu perfekter Stereoselek-tivit�t (99% ee) mit ganzen Zellen zur entsprechenden R-Propionatverbindung 17 a umgesetzt werden. OYE1 zeigtebei der Nutzung von NADH als redu-zierendem Kofaktor die hçchste Um-satzrate von 37 %. Der Schutz der Hy-droxygruppe mit Allylether 16b undBenzylether 16 c f�hrte indes zu hçhe-ren Umsatzraten, wobei alle elf einge-setzten Enreduktasen Aktivit�ten ge-gen�ber diesen Substraten zeigten.OYE3 sowie XenA aus Pseudomonasputida setzten diese mit ausgezeichne-ter R-Stereopr�ferenz nahezu quanti-

tativ um (97 %). Allein XenA war in der Lage, das sperrigetert-Butyldimethylsilyloxyderivat 16d mit hohem Enantio-meren�berschuss (> 99 % ee) und Umsatz (99 %) zu redu-zieren.

Chirale g-Aminos�uren und ihre Derivate werden f�r dieBehandlung von Stçrungen des zentralen Nervensystemsgetestet. F�r die asymmetrische Synthese von g-Aminobut-ters�ure(GABA)-Derivaten haben Fryszkowska et al. eineneue Methode entwickelt, bei der sie Reduktasen als eineeffiziente Alternative zur klassischen Katalyse nutzen. b-Acryl-b-cyanpropans�urederivate wurden aus den entspre-chenden Arylacetonitrilen und Glyoxals�uren synthetisiertund in Bioreduktionen mit OYEs eingesetzt. Rohextrakte ausClostridium sporogenes DSM795, Ruminococcus productusDSM3507 und Acetobacterium woodii DSM1030 katalysier-ten die Bildung der jeweiligen S-b-Aryl-b-cyanpropans�urenin quantitativen Ausbeuten (> 99%) und mit exzellentenEnantioselektivit�ten (bis zu > 99 % ee). Um eine Racemi-sierung der Produkte unter den vorliegenden w�ssrigen Re-aktionsbedingungen zu minimieren, wurden alle Reaktionenbei pH 7 durchgef�hrt. Diese Strategie wurde in einer che-moenzymatischen, asymmetrischen Synthese genutzt, um (S)-Baclofen [(S)-20] ausgehend vom Kaliumsalz der (Z)-2-(4-Chlorphenyl)-3-cyanpropens�ure (18) �ber das Zwischen-produkt (S)-19 herzustellen (Schema 4).[29]

Enreduktasen wurden dar�ber hinaus auch f�r die Re-duktion von a-Alkoxycycloenonen zu Acyloinen eingesetzt.Hierf�r wurden unterschiedliche O-Schutzgruppen vonMethyl (21a) und 22b) �ber Propyl (21c), Allyl (21b) bis zuBenzyl (21 d und 22 a) verwendet.[30] Chirale Acyloine werdenin diversen Prozessen als Zwischenprodukte eingesetzt. DieKonfiguration der O-gesch�tzten Acyloine kann �ber die

Grçße der Schutzgruppe gesteuert werden. Cyclohexenon-derivate mit Methylschutzgruppen f�hrten zur Bildung vonR-konfigurierten Acyloinen, w�hrend l�ngerkettige Analoga(Propyl, Allyl und Benzyl) mit sehr hohen Enantiomeren-�bersch�ssen (92–97 % ee) zu den spiegelbildlichen S-Pro-dukten umgesetzt wurden. Die Reaktionen wurden mit 20%(v/v) tert-Butylmethylether als Kosolvens durchgef�hrt. In-teressanterweise wurde mit den Cyclopentenonderivatenkein Wechsel der Enantioselektivit�t beobachtet. Es wurdenausnahmslos S-Acyloinprodukte (S)-24 a,b (bis zu > 99% ee ;Schema 5) gebildet.

Chirale Aminos�uren sind wichtige Bausteine und Zwi-schenprodukte f�r die chemische und pharmazeutische In-dustrie. K�rzlich wurden zur asymmetrischen Synthese vonAminos�uren a,b-Dehydroaminos�urederivate als Substrate

Schema 2. Reduktase-katalysierte Synthese von chiralen a-Methyldihy-drozimtaldehydderivaten. MTBE= tert-Butylmethylether.

Schema 3. Asymmetrische Bioreduktionen von Methyl-2-hydroxy-methacrylatderivaten f�r die Produktion von „Roche-Estern“. Bn= Ben-zyl, TBDMS= tert-Butyldimetylsilyl.

Schema 4. Enantioselektive biokatalytische Reduktion des 3-Cyanpropens�uresalzes bei der Syn-these von (S)-Baclofen.


Chemie



f�r Enreduktasen verwendet (Schema 6).[31] Unter Standard-bedingungen wurde der N-Acylaminofumars�urediester 25 amit OYE1 und OYE3 aus Saccharomyces sp. umgesetzt,wobei f�r (S)-26 a quantitative Ausbeuten und hohe Stereo-selektivit�ten erzielt wurden (99 % ee). Eine Verl�ngerungder Amidkette des Substrats zu Propionyl (25b) f�hrte mitder Reduktase OYE3 zur Umkehrung der Stereopr�ferenzmit einem moderaten Enantiomeren�berschuss [61% ee f�r

(R)-26 b]. Im Unterschied dazu erzeugte das aktivste EnzymYqjM aus Bacillus subtilis das S-Enantiomer von 26b miteinem hohen Umsatz (> 99 %) und einer hohen Stereose-lektivit�t (99% ee). Ein �hnlicher Wechsel der Konfigurationkonnte bei Verwendung der N-Phenylacetylschutzgruppe(25 c) beobachtet werden: W�hrend OYE3 das R-Enantiomererzeugte [92% ee f�r (R)-26c], konnte das S-Enantiomer mit

einem hohen Enantiomeren�berschuss (> 99 % ee) mithilfevon OPR1 erhalten werden.

Die asymmetrische Reduktion von Citral und Ketoiso-phoron mit einer großen Auswahl von Enreduktasen wurdedetailliert beschrieben. Bei allen Untersuchungen wurdenentweder geringe Selektivit�ten oder geringe Ums�tze be-obachtet. Dies konnte mit der Reduktase aus Gluconobacteroxydans,[32] welche die enantioselektive Hydrierung vonCitral (Mischung aus Geranial und Neral) und Ketoisophoronin guten Ausbeuten und Selektivit�ten ermçglicht, behobenwerden.[33] Studien bez�glich der Kofaktorabh�ngigkeit derReduktase zeigten, dass bei der Reduktion NADPH gegen-�ber NADH mit achtfach hçherer Spezifit�t bevorzugt wird.K�rzlich wurde dieses Enzym in einer chemoenzymatischenKaskade zusammen mit einer Wittig-Reaktion eingesetzt(Schema 7).[34]

In dieser Kaskadenreaktion wurden p-Nitro- und p-Chlorbenzaldehyd (27a bzw. 27 b) mit �quimolaren Mengendes Ylids 28 vollst�ndig in das a,b-unges�ttigte Keton um-gesetzt. Die anschließende enzymatische Reduktion mithilfeeiner Enreduktase aus Gluconobacter oxydans f�hrte zurBildung der Ketone 29a bzw. 29 b in hohen Ausbeuten.

Ein weiteres Beispiel der katalytischen Vielfalt von En-reduktasen zeigt die enzymatische Desaturierung einer C-C-Bindung in Nachbarschaft zu einer Carbonylgruppe. Schitt-mayer et al. haben k�rzlich die enzymatische Desaturierunganhand von Studien der thermostabilen OYE aus Geobacilluskaustophilus DSM 7263 (GkOYE) verçffentlicht.[27] GkOYEist in der Lage, typische Substrate wie Cyclopentenon undCyclohexenon in Gegenwart von NADPH bei 70 8C zu re-duzieren. Zus�tzlich zur erwarteten Reduktion des Enonskatalysiert GkOYE auch die R�ckreaktion, die „Ents�tti-gung“ der C-C-Bindung (Schema 8). Diese Reaktion erfolgt,ohne dass irgendein Nicotinamid-oxidierender Kofaktornçtig w�re, wenn auch auf Kosten von molekularem Sauer-stoff. Unterschiedliche Substrate (einschließlich Testosteron)wurden getestet, wobei Ums�tze bis zu 78% erzielt wurden.Um die Regio- und Enantioselektivit�t dieser Dehydrie-rungsreaktionen zu bestimmen, wurden unterschiedlich sub-stituierte cyclische Ketone als Substrate untersucht. Die De-hydrierung von 2-Methylcyclopentanon (30) f�hrte zu 2-Me-thylcyclopentenon (33 ; 56 % in Luftatmosph�re und 78% mit1 bar O2), allerdings mit niedriger Stereopr�ferenz, da beideEnantiomere mit vergleichbaren Raten umgesetzt wurden.

Schema 5. Asymmetrische Synthese von O-gesch�tzten Acyloinen mit-hilfe von Enreduktasen.

Schema 6. Asymmetrische Bioreduktion von a,b-Dehydroaminos�ure-derivaten.

Schema 7. Kombination einer Wittig-Reaktion mit einer enzymatischenC=C-Bindungsreduktion.


B. Hauer et al.



Von den getesteten Substraten konnte nur Dihy-drocarvon (31), innerhalb von 24 h, selektiv umge-wandelt werden (> 99% ee, S-Enantiomer). DieOYE-katalysierte Desaturierung ebnet neue Syn-thesewege zu einer Vielzahl a,b-unges�ttigter Car-bonylverbindungen. Beispiele sind die Synthesenneuer Ketosteroide 35 sowie kleiner a,b-unges�t-tigter Ketone, die oft zu wertvollen Geschmacks-und Aromastoffen gehçren.

Mitglieder der OYE-Familie und ihre Homolo-gen sind f�r die enzymatische Synthese einergroßen Zahl wertvoller Produkte eingesetztworden. Enantiomerenreines (R)-Flurbiprofen sowie Deri-vate davon wurden mithilfe der thermophilen ReduktaseYqjM aus Bacillus subtilis synthetisiert.[35] Dar�ber hinauswurden Enreduktasen f�r die Herstellung von Methyl-(S)-2-brombutanoat verwendet.[36] Brombutanoate sind n�tzlicheZwischenprodukte bei der Synthese von therapeutischenWirkstoffen gegen nicht insulinabh�ngigen Typ2-DiabetesMellitus. Auch die schrittweise Synthese des Duftstoffes Di-hydrocarveol durch Kombination einer En- mit einer Car-bonylreduktase wurde k�rzlich beschrieben.[37]

Die Retrosynthese eines wertvollen Monos�ureinterme-diats f�hrte bei Almac zu einem Verfahren unter Verwendungeiner Enreduktase in Kombination mit einer Hydrolase.Mitarbeiter von Almac entwickelten dabei einen Prozess f�rdie Herstellung monoacider Bausteine in einem Drei-Enzym-Eintopfverfahren im 70-g-Maßstab (Schema 9).[38] 70 g desDiesters 36 wurden mit 70 g der Enreduktase ERED-04(SelectAZyme ESK-1300 Screeningkit) innerhalb von 48 h zu98% umgesetzt. Das Produkt (R)-37 wurde anschließend mit25 g der Hydrolase AH-33 unter stetiger Kontrolle des pH-Werts zur Monos�ure (R)-38 hydrolysiert. 57 g des R-Enan-tiomers der Monos�ure (R)-38 wurden als einziges Produktmit hohem Umsatz und hoher Enantioselektivit�t (99% ee)hergestellt. Dar�ber hinaus wurde der NADH-Kofaktormithilfe einer lçsungsmittelstabilen Carbonylreduktase(A131 aus dem SelectAZyme CRED Enzymkit) regeneriert,wobei 2-Propanol zu Aceton oxidiert wurde. Dieses hochef-

fiziente NADH-Regenerationssystem wurde von Gl�ck et al.entwickelt.[39]

Um einen alternativen Zugang zu beiden Enantiomerenvon Citronellal als chirale Bausteine zu erlangen, studiertedie Gruppe von Stewart eine Bibliothek aus 17 Enzymen.Eine einfache Aufreinigung der Biokatalysatoren wurdedurch die Expression der Enzyme als Glutathion-S-Transfe-rase(GST)-Fusionsproteine ermçglicht. Aus diesem Set vonEnreduktasen wurden OYE2.6 aus Pichia stipites und NemAaus E. coli als aufgereinigte Enzyme in einem Einphasensys-tem eingesetzt, um Citral mit guter R- bzw. S-Selektivit�t zureduzieren (Schema 10).[40] Hierbei wurde Geranial (trans-39), das trans-Isomer von Citral, als Substrat f�r die bioka-talytische Alkenreduktion verwendet. In grçßerem Maßstabwurde ein mit Ammoniumsulfat behandeltes Extrakt vonGST-OYE2.6 eingesetzt, um innerhalb von 5.75 h Geranial(trans-39) zu 1.59 g (R)-Citronellal [(R)-40] umzusetzen

(Ausbeute 67 %, Umsatz 95%). Mit einer �hnlichen Strategiewurde das cis-Isomer Neral (cis-39) durch ein Extrakt vonGST-NemA umgesetzt. Hierzu wurde Neral in drei gleichgroßen Teilen zur Reaktion gegeben, um innerhalb von 3.5 h1.62 g (S)-Citronellal [(S)-40] in einer Ausbeute von 69%(> 98% Umsatz, 99% ee) zu erhalten.

Die Substratselektivit�ten und -promiskuit�ten wie auchStereoselektivit�ten der OYE-Familienmitglieder und ihrerAnaloga sind in zahlreichen Studien untersucht worden. Trotzvieler Erfolge bei der Generierung vielz�hliger chiralerBausteine mit Enreduktasen gibt es bis dato kein effizientes

Schema 8. Selektive OYE-katalysierte Ketondehydrierung.

Schema 9. Reaktionskaskade f�r die Synthese von Monos�uren in großem Maß-stab.

Schema 10. Biokatalytische Produktion von (R)- und (S)-Citronellal imGramm-Maßstab.


Chemie



Enzym aus der Familie der Enreduktasen f�r die Reduktion3-Alkyl-substituierter cyclischer Alkene. Um das Substrat-spektrum der Enreduktase YqjM aus Bacillus subtilis zu er-weitern, wurde gerichtete Evolution mithilfe iterativer S�tti-gungsmutagenese (ISM) angewendet. Durch Rçntgenstruk-turanalyse von YqjM wurden 20 Aminos�urepositionen alspotenzielle Mutationsstellen f�r die S�ttigungsmutageneseausgew�hlt. Im ersten Durchgang der gerichteten Evolutionkonnten neun Mutanten identifiziert werden, die eine ge-steigerte Aktivit�t gegen�ber m-Methylcyclohexenon zeig-ten. Wildtyp-YqjM ergab nur einen geringen Umsatz (3%)und moderate Enantioselektivit�t (77% ee, R-Enantiomer)f�r dieses Modellsubstrat. Außerdem wurden R- und S-se-lektive Varianten identifiziert, die Enantiomeren�bersch�ssevon bis zu 91% (R) bzw. 84% (S) lieferten. Eine Doppel-mutation f�hrte zu einer 130-fachen Steigerung der Reakti-onsgeschwindigkeit (99 % Umsatz) bei gleichbleibenderhoher Enantioselektivit�t (R-Enantiomer bis zu 94% ee). ImFalle des S-selektiven Systems zeigten zwei Doppelmutantenrelativ hohe Enantioselektivit�ten (bis zu 99 % ee), aber ge-ringe Ums�tze (< 20 %). Die Aktivit�ten und Selektivit�tendieser YqjM-Varianten wurden anschließend anhand einerReihe von 3-substituierten Cyclohexenon- und Cyclopen-tenonanaloga getestet. Substrate mit verschiedenen Alkyl-resten wie auch einer zweiten funktionellen Gruppe (Ester-funktion) wurden reduziert und lieferten dabei die Produktemit exzellenten Enantiomeren�bersch�ssen und Ums�tzen(99 % ee bzw. 99%).[41]

3. Enzyme zur Herstellung chiraler Amine und Ami-nos�uren

Chirale Aminos�uren und Amine sind wichtige Verbin-dungen f�r eine Vielzahl von Pharmazeutika, Agrochemika-lien und anderen Spezialchemikalien.[42] Klassische chemi-sche Methoden zur Herstellung von enantiomerenreinenAminen und Aminos�uren umfassen die Trennung durchKristallisation mit chiralen Carbons�uren,[43, 44] die asymme-trische Reduktion von C=N-Bindungen,[45] die „Dutch-Re-solution“,[46] die Bucherer-Bergs-Varianten der Strecker-Synthese[47] und die �bergangsmetall-katalysierte Amido-carbonylierung.[48] Enzymatische Methoden zur Bereitstel-lung von enantiomerenreinen Aminen und Aminos�uren sindindes nicht nur beschr�nkt auf Lipase- oder Acylase-kataly-sierte kinetische Racematspaltungen.[44,49] Eine Alternativezur Synthese von Aminen und nichtnat�rlichen Aminos�urenbietet die enantioselektive Desymmetrisierung von 3,4-sub-stituierten meso-Pyrrolidinen durch die Variante D5 derMonoaminoxidase MAO-N aus Aspergillus niger.[50] Die F�-higkeit, stereospezifische Reaktionen zu katalysieren, hatauch das Forschungsinteresse an Aminos�uredehydrogena-sen angeregt. Mitglieder der Aminos�uredehydrogenase-Su-perfamilie sind wegen ihrer katalytischen Eigenschaften undStereospezifit�ten interessante Enzyme. Sie katalysieren diereversible NAD(P)+-gekoppelte, oxidative Desaminierungvon Aminos�uren.[51] Durch �ndern der Spezifit�t einerLeucindehydrogenase mithilfe von Protein-Engineeringkonnte eine Amindehydrogenase entwickelt werden, die

chirale Amine aus prochiralen Ketonen und Ammoniakherstellt.[52] Dar�ber hinaus haben sich Strategien der Der-acemisierung mit einer enantioselektiven Aminoxidase inKombination mit einem chemischen Reduktionsmittel[53]

sowie die Umsetzung von Ketonen zu Aminen mit Transa-minasen (Aminotransferasen) als erfolgreich erwiesen. DieVerwendung von Ammoniak-Lyasen und Aminomutasen f�rdie asymmetrische Synthese von Aminos�uren und chiralenAminen ist eine weitere Option. In Abschnitt 3 werden Vor-teile und Anwendungsbeispiele von Transaminasen, Ammo-niak-Lyasen und Aminomutasen sowie die Schwierigkeiten,die mit der Anwendung dieser Enzyme verbunden sind, ge-nauer diskutiert. F�r einen detaillierteren �berblick �berTransaminasen[54–56] sowie Ammoniak-Lyasen und Ami-nomutasen[57–59] in der Biokatalyse verweisen wir den Leserauf entsprechende �bersichtsartikel.

3.1. Transaminasen als Biokatalysatoren

In den letzten Jahren wurden viele Fortschritte bei derEntwicklung von Transaminasen hin zu effektiven Biokata-lysatoren zur Bereitstellung von enantiomerenangereichertenund -reinen Aminen erzielt.[55,60–62] Transaminasen(EC 2.6.1.x) sind Pyridoxol-5’-phosphat(PLP)-abh�ngigeEnzyme, welche die direkte Aminierung von Ketonen zuAminen in hohen Ausbeuten und Enantioselektivit�ten ka-talysieren; daf�r bençtigen sie die NH2-Gruppe eines Do-normolek�ls (Abbildung 4).[56,60]

Mehr als 20 w-Transaminasen mit �hnlichen Substrat-spezifit�ten, jedoch unterschiedlicher mikrobieller Herkunftwurden bis dato charakterisiert. Diese werden zur Produktionvon chiralen Aminen und Aminos�uren wie folgt eingesetzt:die kinetische Racematspaltung racemischer Amine zu einemenantiomerenreinen Produkt und Keton mit einer theoreti-schen Ausbeute von � 50% (Abbildung 5 a); die asymme-trische Synthese von enantiomerenreinen Aminen und Ami-nos�uren aus prochiralen Ketonvorstufen in einer Ausbeutevon � 100% (Abbildung 5b); die Deracemisierung einesRacemats mit 100 % theoretischer Ausbeute (Abbil-dung 5c).[63]

Bei der Synthese enantiomerenreiner Amine und Ami-nos�uren wird der asymmetrische Syntheseansatz bevorzugt,da im Unterschied zur kinetischen Racematspaltung einetheoretische Ausbeute von 100% erzielt werden kann. Eineebenso hohe Ausbeute kann durch eine Deracemisierungerreicht werden. Die Synthese von enantiomerenreinen

Abbildung 4. Synthese von Aminen mit w-Transaminasen. PMP =Pyri-doxamin-5’-phosphat.


B. Hauer et al.



Aminen durch Deracemisierung wurde bisher �ber dyna-misch-kinetische Racematspaltung (DKR) oder durch Ein-satz zweier enantiokomplement�rer w-Transaminasen ineinem zweistufigen Eintopfverfahren realisiert.[64, 65] Demvorgeschlagenen Mechanismus zufolge bildet das Amindo-norsubstrat eine Schiff-Base mit dem PLP-Kofaktor, gefolgtvom Auftreten eines Chinoidmolek�ls infolge einer voraus-gegangenen Deprotonierung. Eine darauffolgende Protonie-rung und Hydrolysereaktion f�hren zu Pyridoxamin-5’-phosphat (PMP) sowie zum entsprechenden Keton. DieEnantiospezifit�t resultiert vermutlich aus einer nicht bevor-zugten Koordination eines der Enantiomere (Abbildung 6).Diese Enzyme zeigen hohe Selektivit�ten, und durch ihreAnwendung in organischen Lçsungsmitteln mit Isopropyl-amin als Amindonor l�sst sich ihr Einsatzgebiet noch erwei-tern. Die hçchste Aktivit�t (99 % Umsatz) wurde bei derSynthese von enantiomerenreinen Aminen in tert-Butylme-thylether als organischem Lçsungsmittel beobachtet. Dar-�ber hinaus f�hrt die Verwendung von organischem Lç-sungsmittel zu einer besseren Zug�nglichkeit von Isopropyl-amin, was bei der Bioaminierung f�r eine Reihe von Ketonenfestgestellt wurde.[66]

Eine große H�rde bei der asymmetrischen Synthese vonchiralen Aminen aus achiralen Ketonen ist das ung�nstige

Reaktionsgleichgewicht. Um die Reaktion in Richtung derProdukte zu verschieben, ist die Entfernung des Koprodukts,das bei der Desaminierung des Amindonors gebildet wird,entscheidend. Es gibt mehrere enzymatische Strategien f�rdie Entfernung des Koprodukts Pyruvat (Alanin als Amin-donor) und die Ver�nderung des thermodynamisch ung�ns-tigen Gleichgewichtes.

Die Decarboxylierung von Pyruvat zu Acetaldehyd undCO2 mit der Pyruvatdecarboxylase (PDC) ist ein einfacherProzess der Pyruvatentfernung. Dar�ber hinaus wird auchgerne die Acetolactatsynthase eingesetzt, um zwei Molek�lePyruvat in Acetolactat umzuwandeln, das anschließend zuAcetoin und CO2 zerf�llt. F�r diese beiden Methoden wirdein erheblicher �berschuss von Alanin als Amindonor be-nçtigt, jedoch ist im Unterschied zu anderen Methoden keinweiteres Kofaktorregenerationssystem nçtig. Ein weitererVorteil dieser Systeme ist die Bildung von CO2 und die damitverbundene, irreversible Verschiebung des Reaktionsgleich-gewichtes zugunsten der Produkte.[67] Die Reduktion vonPyruvat durch die Lactatdehydrogenase ist eine ebenfallsh�ufig angewendete Methode. Da die Lactatdehydrogenaseden Kofaktor NADH bençtigt, werden zur Regenerationentweder die Formiatdehydrogenase und Formiat oder dieGlucosedehydrogenase und Glucose sowie ein �berschuss anAlanin eingesetzt.[69] Außerdem ist es auch mçglich, Alaninals Amindonor wiederzugewinnen, indem das gebildetePyruvat regeneriert wird. Daf�r werden Aminos�uredehy-drogenasen (oftmals Alanindehydrogenase) verwendet, diedas a-Ketos�urenebenprodukt reduktiv aminieren. Das dabeiverbrauchte NAD(P)H wird durch Standardregenerations-systeme wie Formiat und Formiatdehydrogenase (FDH) oderGlucose und Glucosedehydrogenase (GDH) wiedergewon-nen.[68]

Bei der kinetischen Racematspaltung von racemischenAminen wird Pyruvat als Aminakzeptor in stçchiometrischenMengen bençtigt. Hierbei erfordert der Prozess zur Pyruvat-regenerierung den Einsatz einer Aminos�ureoxidase, die dieIn-situ-Oxidation des Alaninamindonors in Gegenwart vonmolekularem Sauerstoff katalysiert. Dar�ber hinaus habenWang et al. eine asymmetrische Synthese von Aminen ohne

Abbildung 5. w-Transaminase-katalysierte Reaktionen.

Abbildung 6. Die Transaminasereaktion ist in zwei Schritte unterteilt: 1) eine oxidative Desaminierung eines Amindonors und 2) eine reduktiveAminierung eines Aminakzeptors. Im ersten Schritt wird PLP als Tr�germolek�l verwendet, um die Amingruppe und Elektronen f�r den zweitenSchritt zur Verf�gung zu stellen. Eine Protonenumlagerung mit anschließender Hydrolyse wandelt PLP reversibel in PMP um. Die Amingruppewird nachfolgend auf den Aminakzeptor �bertragen, wodurch das PLP regeneriert wird.


Chemie



zus�tzliche Regeneration des Amindonors f�r unterschiedli-che w-Transaminasen vorgestellt. Dabei wurde die kommer-ziell verf�gbare 3-Aminocyclohexa-1,5-diencarbons�ure (42)als Amindonor eingesetzt (Schema 11). Das erzeugte Keton43 wird durch die nachfolgende Tautomerisierung zu 3-Hy-droxybenzoes�ure (45) aus der Reaktion entfernt. So konnte(S)-44 selektiv hergestellt werden (99 % Umsatz,> 99% ee).[70]

3.2. Synthese chiraler Amine

Bislang wurden mehr als 20 S-selektive w-Transaminasenbeschrieben und charakterisiert.[60] Wegen der Tatsache, dassbisher nur ein Transaminaseenzym mit R-Selektivit�t (ausArthrobacter sp.)[71] identifiziert und charakterisiert wordenist, haben Hçhne et al. einen computergest�tzten Ansatzentwickelt, um R-selektive Transaminasen zu identifizieren.Dies ermçglicht es, arbeits- und screeningintensive, gerichteteEvolutionsmethoden zu umgehen (Schema 12).[72] DieseHerangehensweise basiert auf der Identifizierung vonSchl�sselkriterien des studierten Enzyms durch Struktur-analysen und anschließender Entwicklung und Anwendungeines sequenzbasierten Algorithmus. Auf diese Weise konn-ten 21 Gensequenzen f�r mutmaßlich R-selektive Transami-nasen identifiziert werden, von denen 17 Enzyme tats�chlichdie gew�nschte R-Selektivit�t aufwiesen. Aus einer Plattformvon vier Ketonen 46 a–d erwies sich 2-Hexanon (46a) mit dreineu identifizierten Transaminasen aus Aspergillus terreus,Mycobacterium vanbaalenii und Mesorhirobium loti als dasbeste Substrat. (R)-2-Aminohexan [(R)-47 a] konnte in mo-deraten Ausbeuten (32–41 %) und mitsehr hohen Enantiomeren�bersch�ssen(> 99%) synthetisiert werden.

Erst k�rzlich wurde die Deracemisie-rung von a-chiralen, prim�ren Aminenmit w-Transaminasen beschrieben.[65,73]

Abh�ngig von der Reihenfolge dereingesetzten enantiokomplement�renEnzyme konnte ein Zugang sowohl zuden S- als auch zu den R-Produkten er-mçglicht werden. Als Konsequenz darauswurde die Deracemisierung von 1-(2,6-Dimethylphenoxy)-2-propanamin (Mexi-letin, rac-48), einem oral einsetzbaren

Antiarrhythmikum, genauer analysiert (Schema 13). DieVorschrift f�r diese Deracemisierung basiert auf einemzweistufigen Eintopfprozess und umfasst eine kinetischeRacematspaltung gepaart mit einem stereoselektiven Ami-nierungsschritt, die durch stereokomplement�re Transami-nasen katalysiert wird. Die Synthese von enantiomerenrei-nem (R)-Mexiletin [(R)-48 ; > 99 % ee] �ber 49 wurde durchden Einsatz der Transaminasen aus Chromobacterium viola-ceum (CV-wTA) wie auch ATA-117 mit hohen Ums�tzen(> 99%) ermçglicht. Parallel dazu konnte nach 24 h Reakti-onszeit durch die Kombination der beiden kommerziellenTransaminasen ATA-117 und ATA-113 das S-Produkt (S)-48(> 99% ee) mit einem ausgezeichnetem Umsatz (98%) er-halten werden.[74]

�berdies ermçglichen w-Transaminasen ohne die Ver-wendung von Schutzgruppen die regio- und stereoselektiveasymmetrische Monoaminierung von aliphatischen 2,6-Di-ketonen (Schema 14). Simon et al. haben in diesem Zusam-menhang die Synthese des nat�rlichen Alkaloids (+)-Dihy-dropinidin [(2S,6R)-53], eines potenziellen Fraßschutzmittels(Ern�hrungsblocker) gegen den Fichtenr�sselk�fer Hylobiusabietis, beschrieben. Von Dihydropyran-2-on (50) ausgehendwurde in drei Stufen (2S,6R)-53 in einer Ausbeute von 72%und mit einem Enantiomeren�berschuss von> 99 % erhalten.Die Synthese des Dehydropiperidin-Zwischenprodukts 52wurde �ber das entsprechende 2,6-Diketon 51 mithilfe der w-Transaminase aus Chromobacterium violaceum mit einemsehr hohen Umsatz (> 99%) und einer ausgezeichneten Se-lektivit�t (> 99 % ee) ermçglicht.[75]

Schema 11. Asymmetrische Synthese chiraler Amine mit einem artifizi-ellen Amindonor.

Schema 12. Asymmetrische Synthese von R-Aminen mithilfe neu iden-tifizierter, R-selektiver Transaminasen. Boc= tert-Butyloxycarbonyl.

Schema 13. w-Transaminasen-katalysierter Deracemisierungsprozess von Mexiletin zur Her-stellung des S-Isomers.


B. Hauer et al.



Amine sind eine vielseitige Gruppe von Verbindungen,die in der organischen Synthese h�ufig eingesetzt werden.Aus diesem Grund ist die Transformation von einfach zu-g�nglichen Alkoholen zu Aminen eine wichtige Reaktion f�rdie Synthese einer Vielzahl organischer Stoffe. Die g�ngigs-ten Methoden zur Synthese von Aminen aus Alkoholen sindreduktive Aminierungen sowie die Umwandlung von Alko-holen in die entsprechenden Azide und deren anschließendenReduktion. Alternativ dazu kçnnen Amine auch �ber eineartifizielle zweistufige Multienzymkaskade erhalten werden.

F�r die asymmetrische Aminierung von sekund�ren Al-koholen zu den entsprechenden a-chiralen prim�ren Aminenwurde ein artifizielles Multienzymnetzwerk entwickelt undoptimiert. Die Kombination einer Alkoholdehydrogenase miteiner Transaminase f�hrte unter optimierten Reaktionsbe-dingungen zu hoher Umsetzung (bis zu 91 %) des Alkohols.[76]

Ein �hnliches System wurde f�r die Herstellung von Diami-nen vorgestellt (Schema 15).[77] Dabei wurde die thermosta-bile Alkoholdehydrogenase aus Bacillus stearothermophilus(ADH-hT) mit der w-Transaminase aus Chromobacteriumviolaceum kombiniert, und Diamine wurden mit exzellentenUms�tzen erhalten. Hierf�r wurden die Diole 54 a,b zu denentsprechenden Aldehyd-funktionalisierten Zwischenpro-dukten 55a,b oxidiert, die wiederum mithilfe von Transami-nasen zu den Aminen 56 a,b umgesetzt wurden, aus denen�ber die Intermediate 57 a,b die Diamine 58 a,b erhaltenwurden. Eine Alanindehydrogenase wurde zur Kofaktorre-generierung eingesetzt. Im Falle von 1,8-Octandiol (54 a)wurden 98 % des Ausgangsmaterials umgewandelt (46%Diamin 58a und 52 % Aminoalkohol 56a). Im Unterschieddazu resultierte die Transformation von 1,10-Decandiol (54b)in der vollst�ndigen Bildung des Diaminprodukts (99%Diamin 58b, < 1% 56 b). Um die Lçslichkeit der Diole 54a,b

zu steigern, wurde das wassermischbare Lçsungsmittel 1,2-Dimethoxyethan [10% (v/v)] eingesetzt. Die Diaminierungvon 54 b wurde zus�tzlich dazu im pr�parativen Maßstab(174 mg Substrat) durchgef�hrt. Nach 20 h Reaktionszeitkonnte ein Umsatz von 94% bei einer Ausbeute an isoliertemDiaminprodukt 58b von 74% erreicht werden.

Ein biokatalytischer Prozess in Gegenwart von w-Trans-aminasen wurde zur Herstellung von (S)-Rivastigmin, einemAlzheimermedikament, entwickelt (Schema 16). DerSchl�sselbaustein f�r die Rivastigminsynthese, das Meth-oxymethylether-gesch�tzte a-Methylbenzylamin 60, wurdeaus dem entsprechenden Acetophenonsubstrat 59 durch eineenzymkatalysierte, asymmetrische Transaminierung mit ste-reokomplement�ren w-Transaminasen erhalten. Um dieLçslichkeit des Substrats und somit die Reaktionsgeschwin-digkeit zu steigern, wurden DMSO oder CH2Cl2 als Kosol-ventien [10 % (v/v)] verwendet. Mit der w-Transaminase ausVibrio fluvialis konnte (S)-60 in 80 % Ausbeute (99%Umsatz) und mit ausgezeichneter Enantiomerenreinheit(> 99% ee) hergestellt werden. Das entsprechende R-Enan-tiomer (R)-60 wurde mithilfe des stereokomplement�renEnzyms ATA-117 in einer moderaten Ausbeute von 56%(76 % Umsatz), jedoch mit hohem Enantiomeren�berschussvon 98 % hergestellt. Zudem wurde die MOM-gesch�tzteAminvorstufe 59 in einem chemoenzymatischen, vierstufigenSyntheseverfahren eingesetzt. (S)-Rivastigmin [(S)-64]konnte in diesem Prozess in einer Gesamtausbeute von 71%und mit einem Enantiomeren�berschuss von 99 % erhaltenwerden.[78]

In einer Kooperation ist es Merck und Codexis vorkurzem gelungen, molekulare Modellierung mit gerichteterEvolution zu kombinieren, um die Spezifit�t und Stabilit�teiner Transaminase deutlich zu verbessern. So konnte ein

etablierter, Rhodium-basierter, chiraler Ka-talysator in einem industriellen Prozessdurch eine Transaminase ersetzt werden.Das Maßschneidern der R-selektiven, kom-merziell verf�gbaren Transaminase ATA-117 durch Protein-Engineering lieferte einEnzym mit gesteigerter Aktivit�t f�r dieSynthese von Sitagliptin [(R)-66], einemDiabeteswirkstoff (Schema 17). Docking-Studien mit dem Prositagliptinketon-Sub-strat 65 legten nahe, dass das Enzym nicht inder Lage sein w�rde, das sterisch an-spruchsvolle Keton im aktiven Zentrum zubinden.

Nach elf Runden der Evolution wurdeein finales Enzym mit insgesamt 27 Muta-Schema 15. Aminierung von Diolen mithilfe einer artifiziellen Multienzymkaskade.

Schema 14. Synthese von (2S,6R)-53 durch Einsatz einer w-Transaminase.


Chemie



tionen erhalten, das eine um vier Grçßenordnungen hçhereAktivit�t als das Wildtypenzym zeigte. Gleichzeitig wurdeeine chemische Prozessentwicklung hinsichtlich der Stabilit�tdes Enzyms gegen�ber hohen Konzentrationen an Substrat,DMSO (Kosolvens) und dem Amindonor Isopropylaminsowie erhçhter Prozesstemperatur durchgef�hrt. Im opti-mierten finalen Prozess waren 6 gL�1 der entwickeltenTransaminasevariante ausreichend, um innerhalb von 15 hReaktionszeit (45 8C, 50 % DMSO) 200 gL�1 Prositagliptin-keton (65) in das enantiomerenreine Sitagliptinprodukt [(R)-66 ; Ausbeute 92%, > 99% ee] umzusetzen.[79]

Unter all den Biokatalysatoren zur Synthese von nicht-nat�rlichen a- und b-Aminos�uren sind w-Transaminasen diebedeutendsten. Enantiomerenreine nichtnat�rliche Amino-s�uren sind sehr wertvolle Wirkstoffe f�r die pharmazeutischeund kosmetische sowie Lebensmittel-, Chemie- und Agrar-industrie.[62,80] Zur Herstellung verschiedener Aminos�urenwurden Transaminasen f�r den Transfer von Aminogruppen

mit anderen Reaktionen gekop-pelt. Park et al. kombinierten ineinem Eintopfverfahren dieThreonindesaminase (TD) undw-Transaminase (w-TA) mitein-ander (Schema 18). In dieserEnzymkaskade wurde aus l-Threonin (l-67) �ber das 2-Oxobutyratintermediat 68 einZugang zu l-Homoalanin (l-69)generiert. Bei der Umwandlungvon l-67 zu 68 wurde eine S-spezifische Threonindesaminaseaus E. coli (ilvA) verwendet.Daraufhin wurde eine neuartigew-Transaminase aus Paracoccusdenitrificans (PD1222) f�r dieasymmetrische Synthese von 68mithilfe von Benzylamin als

Amindonor eingesetzt. Durch diese gekoppelteEnzymreaktion konnte nach 5 h Reaktionszeitl-69 mit 91% Umsatz und > 99 % ee erhaltenwerden.[81]

Ein �hnliches System wurde zur simultanenHerstellung von l-Aminos�uren und R-Aminen aus den entsprechenden a-Ketos�urenund racemischen Aminen durch die Verwen-dung einer Tyrosin-Aminotransferase undeiner w-Transaminase beschrieben.[82] Wegender breiten Substratspezifit�ten von Transami-

nasen kçnnen diese in der Synthese von anderen industriellenSynthesebausteinen, wie Aminoalkoholen, eingesetztwerden. Der stereospezifische Transfer der Amingruppemithilfe von Transaminasen kann auch an andere enzymka-talysierte C-C-Bindungsbildungen gekoppelt werden. Indiesem Zusammenhang wurde eine zweistufige Synthese vonchiralen Aminoalkoholen aus achiralen Ausgangsverbindun-gen durch Kombination einer Transketolase und einerTransaminase entwickelt. Mit dieser Eintopfsynthese wurdender Zugang zu 2-Amino-1,3,4-butantriol und 2-Aminopen-tan-1,3-diol �ber eine biokatalytische asymmetrische C-C-Bindungskn�pfung sowie der stereospezifische Transfer einerAminogruppe auf ein l-Erythrulose- oder ein (3S)-Dihydro-xypentanon-Zwischenprodukt untersucht.[83] Aminoalkoholesind eine wichtige Stoffklasse und werden als chirale Auxi-liare und Liganden in der organischen und medizinischenChemie verwendet. Zus�tzlich dazu haben fluorierte a-Aminos�uren aufgrund ihrer pharmakologischen Wirkunggroßes Interesse geweckt. In diesem Sinne haben Bea et al.die asymmetrische Synthese von (R)-Fluoralanin aus 3-Flu-orpyruvat und (S)-a-Methylbenzylamin als Amindonor mitder rekombinanten w-Transaminase aus Vibrio fluvialis JS17untersucht. Um einer etwaigen Produktinhibierung entge-genzuwirken, wurde bei diesem Ansatz ein extraktives,zweiphasiges Reaktionssystem zur Synthese von (R)-Fluor-alanin verwendet. (R)-Fluoralanin wurde mit 70 % Umsatzund einem Enantiomeren�berschuss von > 99 % gewon-nen.[84]

Schema 16. Chemoenzymatische asymmetrische Synthese von (S)-Rivastigmin. MOM= Methoxymethyl-Schutzgruppe.

Schema 17. Evolvierter Transaminasekatalysator zur Synthese von Sitagliptin.

Schema 18. Eintopfverfahren f�r die Umwandlung von l-Threonin zu l-Homoalanin. Reaktionsbedingungen: 10 mm Substrat, 20 mm Benzyl-amin, 1 mm PLP, Puffer pH 7.0, 37 8C, 300 min.


B. Hauer et al.



3.3. Aminos�ure-Ammoniak-Lyasen

Anders als Transaminasen bewirken Aminos�ure-Am-moniak-Lyasen eine elektrophile Katalyse ohne Einsatz einesMetalls oder sonstigen Kofaktors. Ammoniak-Lyasen sind inder Lage, Kohlenstoff-Stickstoff-Bindungen ohne Hydrolyse-oder Oxidationsmechanismen zu spalten. Es gibt eine Reihevon Ammoniak-Lyasen, welche die reversible Bildung vona,b-unges�ttigten Bindungen durch Eliminierung von Am-moniak aus ihren Aminos�uresubstraten katalysieren. Aro-matische-Aminos�ure-Ammoniak-Lyasen katalysieren diereversible Desaminierung aromatischer Aminos�uren, wiePhenylalanin, Tyrosin und Histidin, zu ihren achiralen, a,b-unges�ttigten Carbons�uren.[57, 59, 85] Außerdem konnten zweiweitere Familienmitglieder, und zwar Aspartat-Ammoniak-Lyase und 3-Methylaspartat-Ammoniak-Lyase, identifiziertund charakterisiert werden.[86] Ammoniak-Lyase-katalysierteReaktionen kçnnen f�r die Synthese von nat�rlichen undnichtnat�rlichen Aminos�uren verwendet werden. Dies ge-lingt entweder durch die Aminierung von a,b-unges�ttigtenCarbons�uren oder durch die kinetische Racematspaltungvon Aminos�ureracematen (Abbildung 7).

Aromatische-Aminos�ure-Ammoniak-Lyasen enthalteneine elektrophile 4-Methylidenimidazol-5-on(MIO)-Gruppezur Substrataktivierung.[87, 88] MIO wird durch einen sponta-nen Ringschluss innerhalb einer konservierten Alanin-Serin-Glycin-Sequenz unter Wasserabspaltung gebildet.[87, 89] Dergenaue Mechanismus der Ammoniakeliminierung ist seit fast50 Jahren umstritten. Zuerst wurde ein E1cb-Mechanismus

postuliert, der Jahre sp�ter von der Annahme eines Friedel-Crafts-Mechanismus abgelçst wurde. Hierbei wurde einFriedel-Crafts-Angriff der MIO-Gruppe auf die Phenyl-gruppe der aromatischen Aminos�ure l-Phenylalanin postu-liert (Abbildung 8).[90]

Eine aktuelle Arbeit von Bartsch und Bornscheuer �berdie Phenylalanin-Ammoniak-Lyase aus Petroselinum crispumliefert auf der Grundlage von Docking-Studien und Mole-

Abbildung 7. Ammoniak-Lyase-katalysierte stereoselektive Synthesevon Aminos�uren durch zwei unterschiedliche Strategien.

Abbildung 8. Die beiden postulierten Mechanismen f�r MIO-abh�ngige Ammoniak-Lyasen: a) E1cb-Mechanismus, mit einem elektrophilen Angriffder MIO-Gruppe auf die Aminogruppe des Substrats; b) Friedel-Crafts-Mechanismus, eingeleitet durch einen elektrophilen Angriff von MIO aufden aromatischen Ring. Insgesamt f�hren beide Mechanismen zur Aktivierung und einer darauffolgenden Abstraktion des b-Protons, gefolgt voneiner Ammoniakeliminierung und der Regeneration der MIO-Gruppe. Histidin (E1cb-Mechanismus) oder Tyrosin (Friedel-Crafts-Mechanismus)fungieren als katalytische Basen, um das Proton von C3 zu abstrahieren.


Chemie



k�ldynamiksimulationen neue Erkenntnisse zumMechanismus dieses Enzyms: Anscheinend kçnnenbeide Mechanismen – der Friedel-Crafts- ebenso wieder E1cb-Mechanismus – bei der Desaminierungaromatischer Aminos�uren auftreten.[91]

Die Phenylalanin-Ammoniak-Lyase (PAL,EC 4.3.1.5) ist ein wichtiges Pflanzenenzym, das dieUmwandlung von l-Phenylalanin in trans-Zimts�urekatalysiert. trans-Zimts�ure ist eine Vorstufe f�rverschiedene Phenylpropanoide wie Lignine, Flavo-noide und Cumarine. Zahlreiche PALs wurden ausMikroorganismen isoliert, besonders aus Hefen, mitvielen Beispielen aus den rot pigmentierten Hefender Rhodotorula-Spezies.[92] PAL ist f�r l-Phenyl-alanin spezifisch, jedoch wird auch l-Tyrosin in ge-ringerem Maße als Substrat akzeptiert.[59] PAL-Enzyme wurden genutzt, um unterschiedliche Phe-nylring-substituierte, polycyclisch-aromatische sowieheterocyclische l-Arylalanine sowie den l-Phenyl-alaninmethylester durch Addition von Ammoniak andie entsprechende Doppelbindung umzusetzen.[93]

Ein weiteres Mitglied der Ammoniak-Lyasefa-milie, die Aspartat-Ammoniak-Lyase (EC 4.3.1.1), auch alsAspartase bezeichnet, spielt eine wichtige Rolle beim bak-teriellen Stickstoffmetabolismus. Dieses Enzym katalysiertunter Freisetzung von Ammoniak die reversible Umwand-lung von l-Aspartat zu Fumarat. Die Aspartat-Ammoniak-Lyase ist eines der spezifischsten Enzyme, die bis dato be-schrieben worden sind. Dies wird daran deutlich, dass bei derDesaminierungsreaktion l-Aspartat durch kein anderesSubstrat ersetzt werden kann. Die hohe Selektivit�t der As-partat-Ammoniak-Lyase gegen�ber dem nat�rlichen Substratlimitiert die praktischen Anwendungsmçglichkeiten diesesEnzyms. Trotzdem wird die Aspartase-katalysierte Umkehr-reaktion – die Aminierung von Fumarat – kommerziell beider industriellen Produktion des k�nstlichen S�ßstoffes As-partam (N-l-a-Aspartyl-l-phenylalanin-1-methylester) ein-gesetzt.[94] Ein �berschuss an Ammoniak ist nçtig, um dasGleichgewicht von Fumarat zu l-Aspartat zu verschieben.Dar�ber hinaus ist die 3-Methylaspartat-Ammoniak-Lyase(MAL, EC 4.3.1.2) zu erw�hnen, da sie eine breitere Sub-stratspezifit�t als Aspartase aufweist. MALs wurden inmehreren anaeroben Enterobakterien identifiziert. Die na-t�rliche Funktion der MAL ist die reversible Ammoniakeli-minierung von l-threo-3-Methylaspartat und l-erythro-3-Methylaspartat zu trans-Methylfumarat. F�r die Umkehrre-aktion wurde eine Vielzahl an substituierten Aminen undFumaraten eingesetzt, wobei substituierte Methylasparte er-halten wurden.[58] F�r beide Ammoniak-Lyasen wurde einallgemeiner S�ure-Base-Reaktionsmechanismus mit einemEnolatintermediat vorgeschlagen (Abbildung 9). Im Fall derAspartase sind die Carboxylat-Sauerstoffatome an Wasser-stoffbr�cken-Netzwerken mit Serin- und Threonin- (C1-Carboxylatgruppe) oder Threonin-, Lysin- und Asparagin-Aminos�ureresten (C4-Carboxylatgruppe) beteiligt. Bei derMAL unterst�tzen Glutamin und Histidin ein Mg2+-Ion beider Koordination durch die C1-Carboxylatgruppe, w�hrendein Threonin, das Cystein und Glutamin an die C4-Carboxylatgruppe koordinieren.[86]

Ammoniak-Lyasen werden als Biokatalysatoren zurHerstellung von enantiomerenreinen Aminos�uren einge-setzt. Obwohl die Aspartat-Ammoniak-Lyase eine sehr hoheSpezifit�t gegen�ber Aspartat als Substrat zeigt, konntenWeiner et al. zeigen, dass Ammoniak als Nukleophil durchverschiedene Amine 71 a–d substituiert werden kann(Schema 19). Hierbei wurden die stereoselektiven Aminie-

rungen von Fumarat mit kleinen Aminnukleophilen wieHydroxylamin (71a), Hydrazin (71 c), Methoxylamin (71b)und Methylamin (71d) per 1H-NMR-Spektroskopie in Phos-phatpuffer/D2O nachgewiesen. Somit konnte gezeigt werden,dass die thermostabile Ammoniak-Lyase aus Bacillus sp.YM55-1 in der Lage ist, die Nukleophile 71a wie auch 71 c zuakzeptieren. Fumarat (200 mm) wurde in Puffer innerhalbvon 30 min bzw. 24 h Inkubationszeit vollst�ndig umgesetzt.Im Unterschied dazu wurden 71b und 71 d nach sieben TagenInkubationszeit in Ausbeuten von 11 bzw. 95 % zu den ent-sprechenden N-substituierten Aspartaten umgesetzt.[95]

Abbildung 9. Vorgeschlagener Reaktionsmechanismus der a) Aspartat- undb) Methylaspartat-Ammoniak-Lyasen. Eine Base (Serin oder Lysin) im aktivenZentrum deprotoniert das Substrat an der C3-Position. Es bildet sich ein Enolat-intermediat, das durch Aminos�urereste oder im Fall von MAL durch ein Mg2+-Ion stabilisiert wird. Im n�chsten Schritt f�hrt die Abspaltung von Ammoniak zuBildung des (Methyl-)Fumaratintermediats.

Schema 19. Biokatalytische Synthese von N-substituierten Aspartatenmit Aspartat-Ammoniak-Lyase.


B. Hauer et al.



Methylaspartat-Ammoniak-Lyase (MAL) aus Clostridi-um tetanomorphum ist in der Lage, die stereo- und regiose-lektive Addition von Ammoniak an Derivate von 2-Methyl-fumarat zu katalysieren, was zur Bildung von verschiedenen3-Alkyl- und 3-Halogen-substituierten Aspartaten f�hrt.[96]

Dar�ber hinaus konnten auch geringe Aktivit�ten mit klei-nen, substituierten Aminen und Fumaratsubstraten beob-achtet werden.[97] Unl�ngst wurde ein strukturbasiertes En-gineering dieser Lyase beschrieben. Somit konnten unter-schiedliche Aspartatderivate aus substituierten Amin- undFumaratsubstraten synthetisiert werden.[98]

Strukturelle Determinanten in Bezug auf Aktivit�t undStereospezifit�t der MAL aus Clostridium tetanomorphumwurden durch ortsgerichtete Mutagenese studiert. Hierf�rwurde die Struktur der verwandten MAL aus Clostridiumamalonaticus dazu herangezogen, drei Aminos�uren der ak-tiven Tasche aus diesem Enzym f�r diesen Mutageneseansatzzu identifizieren. Diese drei Aminos�uren sind wichtig f�r dieAktivit�t und Stereoselektivit�t von MAL-katalysierten Re-aktionen. Dies hat Raj et al. dazu angeregt, durch struktur-basierte Mutagenese die Diastereoselektivit�t der 3-Me-thylaspartat-Ammoniak-Lyase zu modifizieren (Schema 20).

MAL katalysiert reversibel die schnelle anti- und die viellangsamere syn-Addition von Ammoniak an 2-Methylfuma-rat (73) zu den Produkten (2S,3S)-3-Methylaspartat [(2S,3S)-74] und (2S,3R)-3-Methylaspartat [(2S,3S)-74]. Hierbeikonnte gezeigt werden, dass die generierten Mutanten bei derAminierung von Methylfumarat alleinig (2S,3S)-74 produ-zieren. Das andere Diastereomer konnte nicht detektiertwerden.[99]

K�rzlich haben Lange et al. einen Syntheseweg be-schrieben, der Biokatalyse mit Ammoniak-Lyasen und ho-mogene Katalyse zur Bildung der enantiomerenreinen (S)-2-Indolincarbons�ure [(S)-77] , eines Schl�sselintermediats f�rACE-Inhibitoren, vereinigt (Schema 21; ACE = Angiotensin-konvertierendes Enzym). Herkçmmlicherweise erfolgt dieHerstellung dieser Verbindung durch Synthese der racemi-schen Vorstufe �ber Fischer-Indolsynthese, gefolgt von einerklassischen oder enzymatischen Racematspaltung. In diesem

neuen Syntheseweg wurde eine enantioselektive, PAL-kata-lysierte (DSMPAL01, Rhodotorula glutinis) Addition vonAmmoniak an die o-substituierten Zimts�urederivate 75a,bmit einer Kupfer-katalysierten Ringschlussreaktion der l-o-Halogenphenylalanine l-76a,b gekoppelt. Ammoniak wurdeals w�ssrige Lçsung [13 % (v/v)] im �berschuss eingesetzt. Inden Cyclisierungsreaktionen konnte das Produkt (S)-77 inexzellenter Ausbeute (95 %) und Enantioselektivit�t(99 % ee) hergestellt werden. Optimierte Bedingungen zumRingschluss beider halogenierter Phenylalanine l-76a,b, in-klusive eines weiteren Kristallisationsschrittes, ermçglichtenes letztlich, (S)-2-Indolincarbons�ure [(S)-77] nach einemzus�tzlich Kristallisationsschritt in einer Gesamtausbeute von60% und mit einem Enantiomeren�berschuss von 99 % eeherzustellen.[100]

3.4. Aminomutasen

Aminomutasen sind eine Unterfamilie der MIO-enthal-tenden Enzyme, deren katalytische Eigenschaften in denletzten Jahren großes Interesse geweckt haben. Sie sind Be-standteil der Biosynthese von b-Aminos�uren in strukturellunterschiedlichsten Naturstoffen und dar�ber hinaus wichtigeBausteine in der pharmazeutischen Industrie.[101] Die Phe-nylalanin-Aminomutase ist in der Lage, aromatische b-Ami-nos�uren durch eine stereospezifische Isomerisierung von a-Aminos�uren oder a-Phenylalanine herzustellen.

Die große Sequenzhomologie zwischen Aminomutasenund Ammoniak-Lyasen l�sst darauf schließen, dass sich beideEnzyme mechanistisch �hneln und dass sich erstgenannteeventuell aus den letztgenannten entwickelt haben.[102] DieseAnnahme wird von der Tatsache gest�tzt, dass Aminomuta-sen die 1,4-konjugierte Readdition des Amins an das Zimt-s�ureintermediat katalysieren kçnnen. Diese Reaktion istreversibel.[103]

K�rzlich wurde ein Mechanismus f�r Aminomutasenvorgeschlagen. Die schrittweise Isomerisierung des Substratserfolgt im ersten Schritt durch eine heterolytische Abspaltungdes migrierenden Protons und der Aminogruppe (Abbil-dung 10). Durch die Rotation des Zimts�ureintermediats imaktiven Zentrum wird die Anlagerung der Aminogruppe aufder gegen�berliegenden Seite ermçglicht. Die Carboxylat-Sauerstoffatome bilden im aktiven Zentrum der Phenylala-nin-Aminomutase zahlreiche Wasserstoffbr�cken mit Ami-nos�uren.[104]

Enantiomerenreine b-Aminos�uren, die im Unterschiedzu a-Aminos�uren nicht sehr h�ufig in der Natur zu finden

sind, stellen wertvolle Bausteine f�r die Synthesevon Peptidmimetika und bioaktiven Molek�len dar.In diesem Zusammenhang haben Wu et al. dieenantiomerenreine Synthese von nichtnat�rlichena- und b-Aminos�uren mithilfe der Phenylalanin-Aminomutase (PAM) erforscht. PAM hat ein brei-tes Substratspektrum und katalysiert die Umwand-lung von a-Phenylalanin in b-Phenylalanin mit ex-zellenten Enantiomeren�bersch�ssen (> 99 %). DieAddition von Ammoniak an das Zimts�ureinter-mediat resultiert normalerweise in einem 1:1-Ver-

Schema 20. Von Methylaspartat-Ammoniak-Lyase katalysierte Aminie-rung von Methylfumarat.

Schema 21. Chemoenzymatische asymmetrische Synthese von (S)-2-Indolincar-bons�ure.


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h�ltnis von a- zu b-Phenylalanin mit ausgezeichneter Enan-tioselektivit�t f�r beide Isomere (> 99% ee). Die besten Er-gebnisse f�r die Synthese von b-Aminos�uren wurden erzielt,wenn Zimts�urederivate mit einem Methyl- oder Methoxy-substituenten an der p-Position verwendet wurden (nur 4–14% des a-Produkts konnten beobachtet werden). Dagegenf�hrten Zimts�uresubstrate mit einer Nitrosubstitution amaromatischen Ring zur Addition der Aminogruppe an der a-Position (98-proz. Bildung des a-Produkts). Die Absolut-konfiguration des Produkts konnte mit l f�r a-Phenylalaninund R f�r b-Phenylalanin bestimmt werden.[101]

Wie erw�hnt, ist die Bildung eines Produktgemisches ausa- und b-Aminos�uren bei der asymmetrischen Addition vonAmmoniak ein großer Nachteil beim Einsatz von Ami-nomutasen. F�r die Trennung von Gemischen aus a- und b-Phenylalaninen wurde eine Isomeren-selektive Fl�ssig-fl�s-sig-Extraktion (ILLE) mit [PdCl2(PPh3)2] beschrieben.Dieser Fl�ssigextraktionsschritt ist eine Verfeinerung derEnantiomeren-selektiven Fl�ssig-fl�ssig-Extraktion (ELLE).Bei dieser Extraktion wird der enantiomerenreine Wirt (host)als Extraktionsmittel genutzt, sodass eine enantiospezifischeund reversible Reaktion mit dem racemischen Substrat er-mçglicht wird.[105] Durch denEinsatz dieser Methodenkonnte ein optimiertes Ex-traktionssystem f�r die Auf-reinigung von b-Phenylalaninaus einem Reaktionsgemischder PAM-katalysierten, enan-tioselektiven Addition vonAmmoniak an trans-Zimts�u-re erhalten werden.[106] DesWeiteren haben Wu et al. diePhenylalanin-Aminomutaseaus Taxus chinensis durchStruktur- und Mechanismus-basiertes Protein-Engineeringin eine selektive b-Lyase um-gewandelt. Damit wurde die

Synthese von beinahe reinem (R)-b-Phenylalaninund seinen Derivaten durch die asymmetrischeAminierung von Zimts�ure erreicht.[107]

Zur Herstellung von S-b-Phenylalaninen wurdek�rzlich eine PAM-PAL-basierte Kaskade ausge-hend von aromatischen b-Aminos�ureracematenbeschrieben. Wu et al. haben einen solchenbiokatalytischen Prozess entwickelt, um enan-tiomerenreines (S)-b-Phenylalanin herzustellen(Schema 22). Hierbei katalysierte im ersten SchrittPAM aus Taxus chinensis die stereoselektive Iso-merisierung von (R)-b-Phenylalaninen (R)-78a,b zuden jeweiligen l-Phenylalaninprodukten l-79 a,b.Die Isomerisierung wurde mit der Abspaltung derAminogruppe von den a-Aminos�uren verkn�pft.Diese von PAL (Rhodosporidium toruloides) kata-lysierte Umsetzung f�hrte zur Bildung der Zimt-s�uren 80a,b. Unter Anwendung dieser biokataly-tischen Tandemreaktion konnten nach einer Reak-tionszeit von 48 h die (S)-b-Phenylalanine (S)-78a,b

mit exzellenten Enantiomeren�bersch�ssen (> 99 % ee) inquantitativen Ausbeuten produziert werden.[108]

Dar�ber hinaus konnte PAM in dynamisch-kinetischenRacematspaltungen mit einer Vielfalt von substituierten a-Arylalaninen 81 a–e zur Synthese von (R)-b-Arylalaninen(R)-82 a–e eingesetzt werden (Schema 23). Hierf�r wurde dieAminomutase-katalysierte Isomerisierung an einen Alanin-Racemase-katalysierten Epimerisierungsschritt gekoppelt.Eine PAM aus Pflanzen der Familie der Eibengew�chse(Taxus) wurde hierbei f�r die stereospezifische Isomerisie-rung von l-Arylalaninen l-81a–e zu (R)-b-Arylalaninen (R)-82a–e genutzt. Um dem unvorteilhaften Gleichgewicht derAminomutasereaktion sowie der damit verbundenen Anrei-cherung der d-Arylalaninisomere d-81 a–e entgegenzuwir-ken, wurde der Katalyseschritt der Aminomutase an eineRacemisierung der a-Phenylalanine gekoppelt. Hierf�rwurde eine Pyridoxal-5’-phosphat-abh�ngige Alanin-Race-mase aus Pseudomonas putida KT2440 genutzt. Durch dieKombination dieser beiden Enzyme konnten enantiomeren-reine (R)-b-Arylalanine aus den entsprechenden a-Arylala-ninracematen d,l-81 a–e mit hohen Enantiomeren�ber-sch�ssen (> 99% ee) generiert werden. Eine Reihe von

Abbildung 10. Reaktionsmechanismus der Aminomutase. Das Substrat bindetpassend f�r die Abspaltung des Protons und des Amins in das aktive Zentrum.Nach der Deprotonierung des Substrats durch eine Tyrosinbase sowie dem nu-kleophilen Angriff des Amins auf die MIO-Gruppe erfolgen die Abspaltung vonMIO-NH2 und die Bildung der Zimts�ure. Nach Rotation des Zimts�ureintermedi-ats wird die Aminogruppe in b-Position angelagert und das Substrat in a-Positionprotoniert, wodurch durch die b-Aminos�ure in R-Konfiguration gebildet wird.

Schema 22. Biokatalytischer Prozess f�r die Bereitstellung von enantiomerenreinen b-Phenylalaninderiva-ten. Konditionen f�r die biokatalytische Tandemreaktion: Puffer pH 8.8, 3% Glycerin, 27 8C, 48 h.


B. Hauer et al.



nichtnat�rlichen o- und m-substituierten a-Arylalaninen l-81a–c und b-heterocyclischen a-Alaninen l-81 d–81 e wurdein dieser gekoppelten Racemase-Aminomutase-Reaktioneingesetzt.[109] Hierbei konnten hçhere Ums�tze (4–19 Mol-%) als bei der herkçmmlichen kinetischen Racematspaltungfestgestellt werden.

4. Biokatalyse als Alternative zur Generierung chira-ler Epoxide und Epoxidringçffnungsprodukte

Die chirale Herstellung von Epoxiden durch chemischeSynthese erfordert teure Katalysatoren und resultiert oftmalsin Produkten mit moderaten Enantiomeren�bersch�ssen. Inder letzten Dekade wurden Biokatalysatoren zu interessantenSynthesehilfsmitteln f�r die kinetische Racematspaltung vonEpoxiden sowie f�r die stereoselektive Ringçffnungsreaktionvon Epoxidverbindungen entwickelt.[110, 111] Dies f�hrte zuzahlreichen Patentanmeldungen bei BASF, DSM und Co-dexis.[112] Epoxidhydrolasen (EHs) katalysieren die enantio-selektive Hydrolyse von Epoxiden und kçnnen daher in derSynthese von chiralen Epoxiden und 1,2-Diolen eingesetztwerden. Halohydrin-Dehalogenasen (HHDH) katalysierendie Transformation vicinaler Halohydrine in die jeweiligenEpoxide. Zus�tzlich dazu kçnnen HDHH-Enzyme auch f�rdie stereoselektive Ringçffnung von Epoxiden mit unter-schiedlichsten Nukleophilen genutzt werden. Hierbei nutzenEH und HHDH verschiedene Reaktionsmechanismen. Diemeisten EHs enthalten das Strukturmotiv der a/b-Hydrolasenmit ihrer katalytischen Triade. Teil dieser Triade ist ein nu-kleophiles Aspartat, das den regioselektiven Angriff auf einesder beiden Kohlenstoffatome des Oxiranrings durchf�hrt.Dabei bildet sich eine kovalente Zwischenstufe, deren Es-terbindung hydrolysiert wird (Abbildung 11 a). Im Unter-schied zu den Reaktionen der klassischen Epoxidhydrolasen,die �ber einen zweistufigen Mechanismus unter Bildung eineskovalenten Enzym-Substrat-Komplexes ablaufen, hydroly-siert Limonen-1,2-Epoxidhydrolase (LEH) ihre Substrate ineinem einzigen Schritt.[113] Hierbei katalysiert die LEH ausRhodococcus erythropolis die direkte Hydrolyse des Epoxidsdurch die Aktivierung eines Wassermolek�ls im aktivenZentrum des Enzyms (Abbildung 11 b). Dem gegen�berumfasst der f�r HHDH vorgeschlagene Mechanismus dieAktivierung des Epoxids durch Wasserstoffbr�cken sowie

den darauffolgenden Angriff eines Nukleophils,das in einer Halogenidbindetasche gebundenvorliegt (Abbildung 11 c).

4.1. Epoxidhydrolasen

Epoxidhydrolasen sind ubiquit�r und kçnnendementsprechend in einer Vielzahl von Orga-nismen gefunden werden.[114] W�hrend anf�ng-lich haupts�chlich Enzyme aus S�ugetieren un-tersucht wurden, r�ckten in den 1990er Jahrenmikrobielle Epoxidhydrolasen in den Fokus.Obwohl EHs auf Wasser als Nukleophil be-schr�nkt sind, haben sie in der organischen

Synthese dennoch großes Interesse auf sich gezogen. Mithilfedieser Enzyme kçnnen chirale Epoxide durch kinetischeRacematspaltungen der racemischen Substrate hergestelltund 1,2-Diole in enantiokonvergenten Prozessen aus race-mischen Epoxiden synthetisiert werden. Zun�chst be-schr�nkten sich biokatalytische Studien oft auf monosubsti-tuierte Epoxide, wie Derivate von Styroloxid sowie ver-schiedene Arylglycidolether. Studien zur Transformation vondisubstituierten Epoxiden haben in den letzten Jahren zueiner deutlichen Verbreiterung des Anwendungsspektrumsdieser Enzyme gef�hrt. Die Prozesse mit diesen Kofaktor-unabh�ngigen Enzymen zeichnen sich durch kurze Reakti-onszeiten, hohe Enantiomerenreinheiten und Substratkon-zentrationen aus.

Faber et al. haben kinetische Racematspaltungen einerVielzahl von 2,2-disubstituierten Epoxiden mit Epoxidhy-drolasen aus verschiedenen Mikroorganismen untersucht.[115]

Viele dieser 2,2-disubstituierten Substrate tragen eine Me-thylgruppe. Nach diesen ersten Erfolgen haben weitere Stu-dien gezeigt, dass auch sterisch anspruchsvollere Substrate f�rdie kinetischen Racematspaltungen verwendet werdenkçnnen. Zusammen mit den gut etablierten monosubstitu-ierten Verbindungen ermçglichen diese die enantioselektiveSynthese verschiedener endst�ndiger Epoxide, der wohln�tzlichsten Untergruppe dieser Verbindungsklasse. Dastrans-Spiroepoxid rac-83 ist ein wichtiger Baustein f�r dieSynthese von pharmakologisch interessanten 11-Heteroste-roiden. Die kinetische Racematspaltung des Epoxidsubstratsgelang durch Verwendung zweier enantiokomplement�rerEnzyme, und zwar der Epoxidhydrolase aus Aspergillus niger(AnEH) und der Limonen-1,2-Epoxidhydrolase (LEH).[116]

AnEH ermçglicht den Zugang zum Epoxid (R,R)-83 mithoher Enantioselektivit�t (99% ee), w�hrend LEH mit ver-gleichbarer Selektivit�t (98 % ee) das Epoxid (S,S)-83 auflçst.Pr�parative Umsetzungen (1-g-Maßstab) mit hohen Sub-stratkonzentrationen (100 gL�1 AnEH oder 8 gL�1 LEH)zeigten gute Ausbeuten (Schema 24).

Des Weiteren haben Monfort et al. einen effizientenProzess zur Herstellung des enantiomerenreinen Antimyko-tikum-Schl�sselbausteins D0870 der Azolklasse beschrie-ben.[117] Die kommerziell verf�gbare AnEH wurde in diesemProzess f�r die kinetische Racematspaltung des 2,2-disubsti-tuierten Epoxids rac-86 mit einer Substratkonzentration von500 gL�1 in einem Wasser/DMSO-Zweiphasensystem einge-

Schema 23. Dynamisch-kinetische Racematspaltung von a-Arylalaninen zur Bildungvon enantiomerenreinen b-Arylalaninen. Reaktionsbedingungen: Puffer pH 8.0, 5%Glycerin, 31 8C, 20 h.


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setzt (Schema 25). Nach etwas weniger als f�nf Stunden Re-aktionszeit konnten unter diesen pr�parativen Bedingungendie Produkte erhalten werden. Sowohl das nichtreagierendeEpoxid (S)-86 (41.5% Ausbeute, 99.9% ee) als auch das Diol(R)-87 (43.5 % Ausbeute, 94.5 % ee) wurden in nahezuenantiomerenreiner Form und moderaten Ausbeuten isoliert.Als Erg�nzung wurde dar�ber hinaus noch die chemischeCyclisierung des Diols (R)-87 zum Epoxid (S)-86 beschrie-ben, womit die Gesamtsynthese einen enantiokonvergentenProzess darstellt.

Die asymmetrische biokatalytische Hydrolyse von 1,2-disubstituierten Epoxiden ist ein h�ufiger Syntheseschritt zurGenerierung der entsprechenden 1,2-Diole (Schema 26).Auch wenn meso-Epoxide nur eine sehr kleine Untergruppecis-disubstituierter Epoxide darstellen, ist ihre Desymmetri-

sierung ein interessanter Weg zur Generierung von trans-Diolen in hohen Ausbeuten (100% theoretische Ausbeute).Ein bedeutender Schritt bei der enzymatischen Hydrolyse dermeso-Epoxide meso-88 a–i wurde 2004 von Forschern derFirma Diversa gemacht.[118] Ein auf Sequenzen und Aktivi-t�ten basierendes Screening von DNA-Datenbanken ver-schiedener Umweltproben f�hrte zur Identifizierung vonmehr als 50 neuen mikrobiellen Epoxidhydrolasen. F�r dreidieser Epoxidhydrolasen (BD10721, BD9883, BD8877)konnte nachgewiesen werden, dass sie die Bildung der R,R-Diole (R,R)-89a–i aus unterschiedlichsten heterocyclischen,acyclischen sowie sperrigen meso-Epoxiden 88a–i katalysie-ren. (R,R)-89 a–i wurden mit hohen Enantiomeren�ber-sch�ssen und Umsatzraten gebildet. Außerdem konnten dasSynthesepotenzial und die einfache Durchf�hrbarkeit anhand

Abbildung 11. a) Der vorgeschlagene Reaktionsmechanismus f�r Epoxidhydrolasen umfasst die Polarisierung des Epoxids durch zwei Tyrosinreste(Bildung von Wasserstoffbr�cken mit dem Epoxidsauerstoffatom), den nukleophilen Angriff des Aspartats gewçhnlich am sterisch weniger gehin-derten Kohlenstoffatom sowie die Hydrolyse des Enzym-Substrat-Esterintermediats. b) Im Unterschied dazu l�uft der Mechanismus der Limonen-1,2-Epoxidhydrolasen ohne die Bildung eines kovalenten Enzym-Substrat-Intermediats ab. Bei diesem Mechanismus positionieren Tyrosin undAsparagin ein Wassermolek�l in einer f�r den Epoxidangriff g�nstigen Position. Es wird angenommen, dass eine Aspartat-Arginin-Aspartat-Triadean der Protonierung und Deprotonierung w�hrend der Reaktion beteiligt ist. Ein Aspartat der Triade gibt ein Proton an den Oxiranring des Sub-strats ab, w�hrend das andere Aspartat das Wasser deprotoniert und so den nukleophilen Angriff ermçglicht. Das Arginin der Triade positioniertdie beiden Aspartat-Carboxylate und unterst�tzt dar�ber hinaus die Stabilisierung der Ladung. c) In der Katalyse der Halohydrin-Dehalogenasensind die Aminos�uren Serin, Tyrosin sowie Arginin involviert, die an der Aktivierung des Epoxids beteiligt sind. Dies ermçglicht die Ringçffnung�ber ein Halogenid. Das konservierte Serin ermçglicht die korrekte Positionierung des Substrats. Das Arginin hingegen spielt eine bedeutendeRolle bei der Absenkung des pKa-Wertes des katalytisch aktiven Tyrosins.


B. Hauer et al.



der Umsetzung von 1 g cis-Stilben (!meso-88 a) mit 109 mgZelllysat demonstriert werden. (R,R)-Diphenyl-1,2-ethandiol[(R,R)-89a] konnte in einer Ausbeute von 83% und mit99% ee isoliert werden. Diese Studien beschreiben erste S,S-Diol-produzierende Epoxidhydrolasen f�r die Desymmetri-sierung von meso-Epoxiden. Die spezifischen Aktivit�tendieser Enzyme waren jedoch deutlich geringer als die derR,R-Diol-produzierenden Epoxidhydrolasen.

J�ngst haben Zheng et al. iterative S�ttigungsmutagenese(ISM) zur Optimierung der Stereoselektivit�t der LEH an-gewendet.[119] Die Enantioselektivit�t dieses Enzyms gegen-�ber nichtnat�rlichen Substraten ist sehr gering, was sichnachteilig auf die Anwendung als Synthesekatalysator aus-wirkt. Durch Gruppierung von Aminos�uren der aktivenTasche sowie iterative Durchf�hrung der S�ttigungsmutage-nese mithilfe eines reduzierten Aminos�urealphabets muss-ten weniger als 5000 Mutanten analysiert werden. Hierbeiwurde f�r das Screening die Desymmetrisierung von Cyclo-pentenoxid 90a als Modellsubstrat angewendet (Schema 27).

W�hrend Wildtyp-LEH einen Enantiomeren�berschussvon nur 14% R,R zeigte, wurden Mutanten identifiziert, dieeine verbesserte R,R-Selektivit�t und eine invertierte S,S-Selektivit�t aufwiesen. Die Mutante H178 setzte das Test-substrat 90a in das S,S-Diol (S,S)-91a (93% ee) mit inver-tierter Stereoselektivit�t um, w�hrend die Mutante H173(R,R)-90a mit verbesserter Enantioselektivit�t (80 % ee) bil-dete. Das Substratspektrum der besten Mutanten wurdeweiter untersucht, wobei sich die Varianten als exzellenteKatalysatoren f�r die Desymmetrisierung weiterer meso-Epoxide, und zwar meso-90b und meso-A, erwiesen. Zu-s�tzlich wurden drei meso-Epoxide f�r eine Aufskalierung(Substratkonzentration von bis zu 30 gL�1) ausgew�hlt. HoheEnantioselektivit�ten (97–99 % ee) und Ausbeuten (86–91%)konnten so erreicht werden, wobei das Substrat A die hçchsteAusbeute ergab (Schema 27). Dies demonstriert die Effekti-vit�t der ISM als Protein-Engineering-Methode zur Gene-rierung enantioselektiver Katalysatoren. Zusammenfassendwurden LEH-Varianten f�r die Desymmetrisierung vonmeso-Epoxiden identifiziert, wobei die S,S-Diol-produzie-

Schema 24. Kinetische Racematspaltung des trans-Spiroepoxids rac-83mit der Epoxidhydrolase AnEH und der Limonen-1,2-Epoxidhydrolase.

Schema 25. Kinetische Racematspaltung von rac-86 mit der k�uflichenEpoxidhydrolase aus Aspergillus niger.

Schema 26. Epoxidhydrolase-katalysierte Desymmetrisierung vonmeso-Epoxiden.

Schema 27. Aufskalierung der Desymmetrisierung ausgew�hlter meso-Epoxide mit Limonen-1,2-Epoxidhydrolasemutanten.


Chemie



renden Mutanten wegen ihres seltenen Auftretens in derNatur von besonderem Interesse sind.

Dar�ber hinaus wurden auch 1,2-trans-disubstituierteEpoxide als Substrate verwendet. K�rzlich haben Kotik undMitarbeiter eine interessante Epoxidhydrolase (Kau2) auseiner metagenomischen DNA-Bibliothek isoliert.[111] Außerder Stereoselektivit�t gegen�ber verschiedenen monosubsti-tuierten Epoxiden zeigt Kau2 auch eine hohe Enantioselek-tivit�t und Aktivit�t bei der kinetischen Racematspaltung vontrans-1-Phenyl-1,2-epoxypropan (rac-92). Bei einem Aufska-lierungsexperiment mit einer Substratkonzentration von80 gL�1 konnten das 1R,2R-Epoxid (1R,2R)-92 (48% Aus-beute, 99.3 % ee) und das entsprechende 1R,2S-Diol (1R,2S)-93 (46% Ausbeute, 99.5 % ee) in hohen Ausbeuten undEnantioselektivit�ten isoliert werden (Schema 28 a).

Ausgehend von zahlreichen erfolgreichen Studien zurMutagenese von Biokatalystoren haben Reetz und Mitar-beiter Methoden der Laborevolution auf AnEH angewen-det.[120] Hierbei wurde trans-2-Benzyl-3-methyloxiran (94) alsSubstrat eingesetzt, das durch Wildtyp-AnEH sehr langsamumgesetzt wird. Zwei Varianten zeigten hohe Enantioselek-tivit�ten (E> 200) bei der kinetischen Racematspaltung desTestsubstrats. Mit dem gleichen Racemat wurde zu einemsp�teren Zeitpunkt mit einer der Mutanten Enantiokonver-genz demonstriert, was die Bildung eines einzelnen enantio-merenreinen Diols (2R,3S)-95 aus dem racemischen Substrat94 ermçglichte. Dieser enantiokonvergente Prozess basiertauf der regioselektiven Hydrolyse von (2S,3S)-94 an der 2-Position bei gleichzeitiger Hydrolyse des enantiomeren(2R,3R)-94 an der 3-Position (Schema 28b). Eine zus�tzlicheiterative S�ttigungsmutagenese dieser Mutante generierteVarianten mit hçheren Reaktionsgeschwindigkeiten beigleichbleibender Enantiokonvergenz (92% Umwandlung,> 99% ee).[121] In diesem Zusammenhang sollte auch erw�hntwerden, dass der Jacobsen-Katalysator nicht in der Lage ist,solche racemischen trans-disubstituierten Epoxide 94 umzu-wandeln.[122]

4.2. Halohydrin-Dehalogenasen

Halohydrin-Dehalogenasen (HHDH) sind bakterielleEnzyme, die am biologischen Abbau halogenierter organi-scher Verbindungen beteiligt und in vielen Mikroorganismenenthalten sind. Die HHDH aus dem Epichlorhydrin-abbau-enden Bakterium Agrobacterium radiobacter AD1 (HheC)ist bis dato das am meisten erforschte Enzym aus dieser Fa-milie. HheC katalysiert außer der Dehalogenierung von 1,3-Dichlorpropanol sowie 1-Chlorpropan-2,3-diol auch derenR�ckreaktion. Die Rçntgenkristallstruktur von HheC imKomplex mit verschiedenen Liganden zeigte eine großr�u-mige Halogenidbindetasche und trug damit zu einem besse-ren Verst�ndnis des katalytischen Mechanismus und derEnantioselektivit�t dieses Enzyms bei.[123] HHDHs zeigen

eine hohe Regio- und Enantioselektivit�tgegen�ber aliphatischen und aromatischenSubstraten. Dadurch sind sie ein geeignetesHilfsmittel zur Herstellung von enantiome-renreinen Epoxiden sowie ihrer Ringçff-nungsprodukte.[124] Zus�tzlich zu Halogeni-den kçnnen noch weitere Nukleophile f�r dieEpoxidçffnung verwendet werden, wodurchdas Einsatzspektrum f�r zuk�nftige Anwen-dungen erheblich gesteigert wird. Dies istdarauf zur�ckzuf�hren, dass b-funktionali-sierte Alkohole h�ufig als reine Enantiomerein der Synthese pharmazeutischer oder bio-logisch aktiver Verbindungen bençtigtwerden.

Diesbez�glich haben Janssen und Mitar-beiter nachgewiesen, dass HheC die Epoxi-dringçffnung mit verschiedenen anionischenNukleophilen in guten Ausbeuten und mithohen Enantiomeren�bersch�ssen kataly-siert (Schema 29).[125] Ferner konnten in pr�-

parativen Ans�tzen ausreichende Aktivit�ten (kcat = 2–100 s�1) mit Nukleophilen wie Aziden, Cyaniden, Nitriten,Cyanaten sowie Thiocyanaten bei der Ringçffnung von 1,2-Epoxybutan (96) als Testsubstrat gezeigt werden. All diesenReaktionen ist gemein, dass das weniger substituierte Koh-lenstoffatom des Epoxids vom Nukleophil mit einer starkenEnantiopr�ferenz f�r das R-Epoxid 97 angegriffen wird.Außer dem Testsubstrat 96 wurden auch weitere, sterischanspruchsvolle aromatische Substrate und disubstituierteEpoxide mit unterschiedlichen Nukleophilen geçffnet.

Die Kombination von mehreren Katalysatoren in einerEintopfkaskade ist eine n�tzliche Methode zur Transforma-tion von einfachen, prochiralen Substraten in enantiomeren-reine, hochfunktionalisierte Produkte. Angesichts diesesVorteils wurden Designerzellen, die einen oder mehrereBiokatalysatoren �berexprimieren, in Eintopfreaktionen mitder Huisgen-Cycloadditon kombiniert. So konnten R- und S-Enantiomere von verschiedenen b-Hydroxytriazolen 100a–d mit hohen Enantioselektivit�ten aus a-Halogenketonen98a–d �ber die zugehçrigen Azidintermediate 99a–d synthe-tisiert werden (Schema 30).[126] b-Hydroxytriazole sind blo-ckierende Reagentien f�r b-Adrenorezeptoren und daherwichtige Arzneimittel.

Schema 28. Umwandlung von trans-disubstituierten Epoxiden mit Epoxidhydrolase.


B. Hauer et al.



F�r die Synthese der b-Hydroxytriazole wurden Zellsys-teme konstruiert, die Alkoholdehydrogenasen und HHDHsmit gegens�tzlichen Stereoselektivit�ten kombinieren. Diezuerst konstruierten Zellen (CT-Zellen) bestanden aus einer�berexprimierten R-selektiven Alkoholdehydrogenase AdhTaus Thermoanaerobacter sp. und der Halohydrin-Dehaloge-nase HheC aus Agrobacterium radiobacter AD1. Die kon-struierten S-selektiven Zellen (BL-Zellen) setzten sich aus

der Alkoholdehydrogenase AdhL aus Lactobacillus brevisund HheBGP1, der Halohydrin-Dehalogenase aus Myco-bacterium sp. GP1, zusammen. Durch die Verkn�pfung derCT-Zellen mit der Huisgen-Cycloaddition konnten gute Re-sultate mit unterschiedlichen a-Bromketonen erzielt werden.F�r Substrate mit elektronenziehenden Gruppen in der p-Position des Phenylrings [p-NO2 (98 a) und p-CN (98b)]wurden R-Produktenantiomere (R)-100a,b in akzeptablenAusbeuten (41 bzw. 36 %) und mit hohen Enantiomeren-�bersch�ssen (> 99%) generiert.

Auf �hnliche Weise wurden zwei weitere aliphatischeSubstrate, 98c und 98d, in Ausbeuten von 18 bzw. 65 % undmit Enantiomeren�bersch�ssen von 99% ee umgesetzt. ZurGewinnung der S-Enantiomere des b-Hydroxytriazolswurden BL-Zellen mit umgekehrter Enantiopr�ferenz ange-wendet. Da die Halohydrin-Dehalogenase HheB aliphatischeVerbindungen bevorzugt umsetzt, wurde f�r diese Kaskade98d als Substrat verwendet. Das S-Produkt (S)-100d konntein 53% Ausbeute und mit einem hohen Enantiomeren�ber-schuss von 97 % isoliert werden.

HHDHs wurden auch dazu genutzt, Epoxide enantiose-lektiv mithilfe kinetischerRacematspaltung zu generie-ren. In diesem Zusammenhangsind Berichte von Haak et al.zur direkten chemoenzymati-schen, dynamisch-kinetischenRacematspaltung auf Interessegestoßen. Hierbei wurden race-mische b-Halogenalkohole101 a–h zu den R-Epoxidenan-tiomeren (R)-102 a–h umge-setzt.[127] W�hrend bei der klas-sischen kinetischen Racemat-spaltung theoretisch nur einemaximale Ausbeute von 50%erzielt werden kann, wurde hierdieses Ausbeutelimit durch einedynamische Racemisierung desverbleibenden Substratenantio-mers �berwunden. Hierf�rwurde ein Iridiumkatalysatoreingesetzt. Die dynamisch-ki-netische Racematspaltungwurde in einem zweiphasigenWasser-Toluol-System mit 5%DMSO als Kosolvens durchge-f�hrt. Als HHDH wurde eineMutante von HheC verwendet,die durch Zugabe von Rinder-serumalbumin (BSA) stabili-

siert wurde. Somit konnten aromatische R-Epoxide (R)-102 a–h mit guten Ums�tzen und Enantioselektivit�ten her-gestellt werden (Schema 31).

HHDHs wurden des Weiteren bei Epoxidringçffnungenmit nichtnat�rlichen Nukleophilen bei der kommerziellenHerstellung des cholesterinsenkenden Mittels Atorvastatin(105) eingesetzt. Atorvastatin ist ein aktiver Inhaltsstoff vonLipitor, dessen j�hrlicher Umsatz �ber 10 Mrd. Dollar be-

Schema 29. Durch Halohydrin-Dehalogenase katalysierte, vielseitigeRingçffnungsreaktionen. n.b.= nicht bestimmt.

Schema 30. Enantioselektive Synthese von b-Hydroxytriazolen in einer mehrstufigen Kaskadenreaktionmit Designerzellen.


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tr�gt. Hierf�r wurde eine enzymatische Synthese des chiralenSchl�sselbausteins Ethyl-(R)-4-cyan-3-hydroxybutyrat [(R)-104] in einem biokatalytischen, zweistufigen Verfahren ent-wickelt (Schema 32).[128]

Der erste (hier nicht gezeigte) Schritt umfasst die Keto-reduktase-katalysierte Reduktion von Ethyl-4-chloraceto-acetat zu (S)-103. Die enantioselektive Reduktion wurde aneine Kofaktorregeneration gekoppelt, die Glucose als Re-duktionsmittel und die NADP+-abh�ngige GDH als Enzymverwendet. Um die Stabilit�t und Aktivit�t der Enzyme desReduktionsschritts bei gleichbleibender Enantioselektivit�tzu erhçhen, wurde DNA-Shuffling als Enzymtechnik ver-wendet. Dies f�hrte zu einer 13-fachen Erhçhung der Akti-vit�t von GDH sowie zu einer 7-fachen Erhçhung der Akti-

vit�t bei der Ketoreduktase. Das enantiomerenreine Produkt(S)-103 wurde in einer Ausbeute von 96% und mit einemEnantiomeren�berschuss von 99% gewonnen.

In einem zweiten Schritt wurde die rekombinante HHDHzur irreversiblen Bildung des Hydroxynitrils (R)-104 ver-wendet. Das Epoxidintermediat wurde unter neutralen pH-Bedingungen mit Cyanid als nichtnat�rlichem Nukleophilgeçffnet. Um die geringe Aktivit�t sowie Stabilit�t derWildtyp-HHDH bei der Epoxidçffung mit dem Cyanid zu�berwinden, wurde in iterativen Runden DNA-Shuffling an-gewendet. In der Gegenwart von hohen Konzentrationen desProdukts konnte die Aktivit�t der HHDH gegen�ber der desWildtyps um das 2500-Fache erhçht werden. Dies f�hrte zueiner hohen Ausbeute an (R)-104 (92 %) mit einem exzel-lenten Enantiomeren�berschuss von > 99 %.

5. Zusammenfassung und Ausblick

Die Entwicklungen der letzten zehn Jahre zeigen eineneindeutigen Trend hin zu einem grçßeren Interesse an en-zymbasierten Katalysatoren, wodurch sich die Sichtweise derBiokatalyse in der klassischen organischen Synthesechemiever�ndert hat. Zur�ckzuf�hren ist dies auf die gesteigertenForschungs- und Entwicklungsaktivit�ten, die das Repertoirean Biokatalysatoren um neue Enzyme f�r gew�nschte che-mische Reaktionen erweitert haben. Zus�tzlich zur Bereit-stellung von neuen selektiven Enzymen und Enzymvariantenf�r individuelle biokatalytische Prozesse ist ein weitererwichtiger Aspekt die Optimierung von vorhandenen Enzy-men in Bezug auf Stabilit�t unter gegebenen Prozessbedin-gungen sowie Konzentrationen und Produktionsraten. DieBereitstellung von Enzym-Toolkits aus einer großen Diver-sit�t an Enzymen und Mutanten wird dazu beitragen, denchemischen Raum schneller zu erarbeiten, was einen be-schleunigten Technologietransfer zur Industrie ermçglicht.W�hrend mittlerweile Enzyme und ihre Varianten f�r unter-schiedlichste nichtnat�rliche Reaktionen eingesetzt werden,besteht weiterhin Verbesserungspotenzial bei der Ber�ck-sichtigung von Enzymen in der Retrosynthese. Die Erweite-rung der Palette an Enzymen f�r die organische Synthesewird dazu beitragen, dass die Biokatalyse einen ebenb�rtigenPlatz neben der Chemokatalyse einnimmt. Dies gilt beson-ders im Hinblick auf Multi-Enzym-Kaskadenreaktionen, dieeine Vielzahl chemischer Eintopftransformationen ermçgli-chen und so Reaktions- und Aufreinigungsschritte minimie-ren.

Der Beitrag, den die neue Generation an C=C-reduzie-renden sowie C-C-, C-O- und C-N-kn�pfenden Biokatalysa-toren leistet, wurde hier beschrieben. Die j�ngsten Entwick-lungen demonstrieren, dass bereits mit einer neuen Genera-tion an Biokatalysatoren, wie Cyclasen, Berberin-Br�cken-enzymen, Pictet-Spenglerasen oder auch Iminreduktasen in-klusive einer von N. J. Turner gew�nschten Iminase,gerechnet werden kann. Fortschritte beim Enzym-Enginee-ring, beim De-novo-Protein-Design sowie bei der Suche undIsolierung neuer Enzymfunktionen werden in den kommen-den Jahren die Plattform an neuen Biokatalysatoren erwei-tern. Dar�ber hinaus pr�sentieren sich Enzyme mit ihren

Schema 31. Dynamisch-kinetische Racematspaltung von b-Halogenal-koholen.

Schema 32. Biokatalytische Synthese eines Zwischenprodukts bei derProduktion von Atorvastatin. Reaktionsbedingungen f�r die enzymati-sche Cyanbildung: 70 g Substrat, Puffer pH 7.3, 25-proz. NaCN-Lçsung, 40 8C, 18 h.


B. Hauer et al.



spezialisierten Katalysemechanismen als viel breiter einsetz-bar, als man noch vor vielen Jahren angenommen hatte.Zahlreiche Studien belegen, dass die vorhandenen katalyti-schen Zentren analog zur klassischen Katalyse f�r mecha-nistisch �hnliche Reaktionen genutzt werden kçnnen. Diesbedeutet, dass schon vorhandene und beschriebene Enzymef�r die Katalyse von pr�parativ wertvollen Reaktionen, diebis dato in der Natur nicht beobachtet worden sind, adaptiertwerden kçnnen. Die Ideen und Fortschritte auf diesemGebiet („Chemie-basiertes Enzym-Engineering“) sind be-sonders geeignet f�r die Bereitstellung von neuen Katalysa-toren.

Wir danken Dr. Rainer St�rmer von St�rmer Scientific und Dr.Michael Breuer von der BASF AG f�r ihre konstruktivenKommentare zu diesem Aufsatz.

Eingegangen am 15. M�rz 2013Online verçffentlicht am 12. Februar 2014

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Biokatalysatoren für die organische Synthese - die neue Generation

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