Bioprozessanalytik mittels Raman- und MIR-ATR-Spektroskopie · Bioprozessanalytik mittels Raman-...

Bioprozessanalytik mittels Raman- und MIR-ATR-Spektroskopie

vorgelegt von Master of Science (M.Sc.)

Robert Schalk geb. in Suhl

von der Fakultät III – Prozesswissenschaften der Technischen Universität Berlin

zur Erlangung des akademischen Grades

Doktor der Ingenieurwissenschaften — Dr.-Ing. —

genehmigte Dissertation

Promotionsausschuss: Vorsitzender: Prof. Dr. Hajo Haase Gutachter: Prof. Dr.-Ing. Frank-Jürgen Methner Gutachter: Prof. Dr. Thomas Beuermann Gutachter: Prof. Dr. Peter Neubauer

Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 22.11.2018

Berlin 2018

I

Inhaltsverzeichnis

Danksagung ..................................................................................................................... III

Veröffentlichungen .......................................................................................................... IV

Abkürzungen und Nomenklatur ...................................................................................... VII

Zusammenfassung ........................................................................................................... XI

Abstract ......................................................................................................................... XIII

1 Einleitung und Zielsetzung ............................................................................................ 1

2 Stand des Wissens ........................................................................................................ 3

2.1 Optische Spektroskopie .................................................................................................. 3

Physikalische Grundlagen ................................................................................... 3 2.1.1

Spektrometrische Messaufbauten ..................................................................... 7 2.1.2

Prozessverfolgung mittels MIR-, NIR- und Raman-Spektroskopie ................... 13 2.1.3

2.2 Multivariate Datenanalyse ........................................................................................... 16

Multiple Lineare Regression – MLR .................................................................. 17 2.2.1

Partial Least Squares Regression – PLS-R ......................................................... 19 2.2.2

Validierungsmethoden ..................................................................................... 22 2.2.32.3 Kultivierung von Saccharomyces cerevisiae ................................................................. 26

Die Verwendung von Hefe ................................................................................ 26 2.3.1

Der Stoffwechsel von Hefe ............................................................................... 27 2.3.2

3 Material und Methoden ............................................................................................. 29

3.1 Batch-Fermentation von Saccharomyces cerevisiae .................................................... 29

Bioreaktor und Messperipherie ........................................................................ 29 3.1.1

Kultivierungsbedingungen ................................................................................ 30 3.1.2

Referenzanalytik ............................................................................................... 32 3.1.3

3.2 MIR-ATR- und Raman-Analytik ..................................................................................... 34

Simultane MIR-ATR- und Raman-Spektroskopie .............................................. 34 3.2.1

MIR-ATR-Sensor ................................................................................................ 37 3.2.2

Kontaktlose Ramansonde ................................................................................. 40 3.2.3

3.3 MLR-Auswertung .......................................................................................................... 43

Datenkonvertierung.......................................................................................... 43 3.3.1 Erstellung von MLR-Modellen .......................................................................... 47 3.3.2

3.4 PLS-Auswertung ............................................................................................................ 48

Datenkonvertierung.......................................................................................... 48 3.4.1 Erstellung von PLS-Modellen ............................................................................ 49 3.4.2

II

4 Ergebnisse .................................................................................................................. 57

4.1 Prozessverfolgung einer zweiphasigen Hefefermentation mittels MIR-ATR- und

Raman-Spektroskopie .................................................................................................. 57

Referenzanalytik ............................................................................................... 57 4.1.1

Reinstoffspektren von Glucose und Ethanol .................................................... 58 4.1.2

Auswahl der Spektralbereiche für die PLS- und MLR-Auswertung .................. 60 4.1.3

MLR- und PLS-Auswertung ............................................................................... 65 4.1.4 Vergleich von MIR-ATR- und Raman-Spektroskopie ........................................ 71 4.1.5

Eignung der MLR- und PLS-Modelle bei Prozessvariation ................................ 73 4.1.6

Einfluss der Zellkonzentration auf die Raman-Signalintensität von gelösten 4.1.7

Analyten ............................................................................................................ 75

Nachweisgrenzen für Glucose und Ethanol ...................................................... 76 4.1.8

4.2 Prozessverfolgung einer einphasigen Hefefermentation mit einem MIR-ATR-Sensor 79

4.3 Prozessverfolgung einer einphasigen Hefefermentation mit einer kontaktlosen

Ramansonde ................................................................................................................. 82

5 Diskussion .................................................................................................................. 86

5.1 Simultane Prozessverfolgung mittels MIR-ATR- und Raman-Spektroskopie ............... 86

5.2 Prozessverfolgung mit einem MIR-ATR-Sensor ............................................................ 90

5.3 Prozessverfolgung mit einer kontaktlosen Ramansonde ............................................. 92

Verzeichnisse .................................................................................................................. 95

Literaturverzeichnis ............................................................................................................. 95

Abbildungsverzeichnis ....................................................................................................... 105

Tabellenverzeichnis ........................................................................................................... 108

Anhang .......................................................................................................................... 110

A Anhang zur simultanen Prozessverfolgung mittels MIR-ATR- und Raman-

Spektroskopie ............................................................................................................. 110

B Anhang zur Prozessverfolgung mit einem MIR-ATR-Sensor ...................................... 127

C Anhang zur Prozessverfolgung mit einer kontaktlosen Ramansonde ....................... 130

III

Danksagung

Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse wurden am Institut für Prozessmesstechnik und innovative Energiesysteme (PI) der Hochschule Mannheim in Kooperation mit der Technischen Universität Berlin, Institut für Lebensmitteltechnologie und Lebensmittelchemie der Fakultät Prozesswissenschaften erzielt. Allen, die mich während meiner Promotion unterstützt haben, sei an dieser Stelle gedankt. Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Thomas Beuermann und Herrn Prof. Dr.-Ing. Frank-Jürgen Methner für die Ermöglichung dieser Arbeit und vor allem für die hervorragende Betreuung. Das mir von beiden im hohen Maße entgegengebrachte Vertrauen sowie die konstruktiven Gespräche waren ideale Voraussetzungen zur selbstständigen Realisierung dieser Promotion. Dafür möchte ich mich ganz herzlich bedanken!

Für das tolle Arbeitsklima, die entspannten Unterhaltungen aber auch die enorme Hilfsbereitschaft möchte ich mich bei allen Kolleginnen und Kollegen des PI-Instituts bedanken. Hervorheben möchte ich an dieser Stelle den Institutsleiter Herrn Prof. Dr. Matthias Rädle, welcher mich stets fachlich gefördert und mir alle für diese Arbeit notwendigen Materialien zur Verfügung gestellt hat. Zudem danke ich Dr.-Ing. Daniel Geörg für die tolle Aufnahme in die Arbeitsgruppe, die thematische Einarbeitung sowie die Zurverfügungstellung des MIR-ATR-Sensors. Bedanken möchte ich mich auch bei Frank Braun für seinen Ideenreichtum, die messtechnischen Anregungen und sein konstruktives Geschick, welche einige Versuchsaufbauten erst ermöglichten. Ebenfalls danke ich Herrn Prof. Dr. Rudolf Frank für die tatkräftige Unterstützung bei der Verfassung einer Publikation sowie die ermunternden Gespräche bei unseren gemeinsamen Treffen. Ferner gilt mein Dank allen Studentinnen und Studenten, welche durch Ihre Arbeit und unzähligen Experimente wesentlich zum Gelingen dieser Promotion beigetragen haben. An die gemeinsamen Stunden im Labor, die vielen Iterationen beim Schreiben von Veröffentlichungen, sowie die hervorragende Zusammenarbeit und die Diskussion verschiedenster Problemstellungen werde ich mich gerne erinnern.

Außerdem bedanke ich mich bei der Albert- und Anneliese-Konanz-Stiftung für das dreijährige Stipendium, welches durch die finanzielle Entlastung die Durchführung dieser Arbeit in dem entsprechenden Zeitraum erst ermöglichte.

Weiterhin danke ich meinen lieben Eltern für die Ermutigung diesen Bildungsweg zu gehen sowie die wertvolle und umfassende Unterstützung während meines gesamten Studiums.

Abschließend gilt mein tiefer und aufrichtiger Dank meiner Frau Eva Maria und unseren beiden kleinen Jungs. Für das nicht selbstverständliche und dennoch immer vorhandene Verständnis sowie die Rücksichtnahme in allen Lebensbereichen bin ich ihr unbeschreiblich dankbar.

IV

Veröffentlichungen

Artikel (peer-reviewed):

• Schalk, R., Braun, F., Heintz, A., Iacono, G., Rädle, M., Gretz, N., Methner, F.-J., Beuermann, T.: Comparison of Raman and mid-infrared spectroscopy for real-time monitoring of yeast fermentations. Applied Spectroscopy (2018). to be submitted

• Braun, F., Schalk, R., Nachtmann, M., Hien, A., Frank, R., Beuermann, T., Methner, F.-J., Kränzlin, B., Rädle, M., Gretz, N.: Smart, label-free, multispectral in vivo tissue analysis for cancer detection. PLOS ONE (2018). to be submitted

• Braun, F., Heintz, A., Schalk, R., Beuermann, T., Gretz, N., Rädle, M.: NADH-fluorescence absorption correction to determine absolute fluorophore concentrations of a liquid tissue model. Measurement Science and Technology (2018). accepted

• Schalk, R., Braun, F., Frank, R., Rädle, M., Gretz, N., Methner, F.-J., Beuermann, T.: Non-contact Raman spectroscopy for Inline monitoring of glucose and ethanol during yeast fermentations. Bioprocess and Biosystems Engineering (2017). DOI: 10.1007/s00449-017-1808-9

• Braun, F., Schalk, R., Heintz, A., Feike, P., Firmowski, S., Beuermann, T., Methner, F.-J., Kränzlin, B., Gretz, N., Rädle, M.: NADH-fluorescence scattering correction for absolute concentration determination in a liquid tissue phantom using a novel multispectral magnetic-resonance-imaging-compatible needle probe. Measurement Science and Technology (2017). DOI:10.1088/1361-6501/aa743e

• Schalk, R., Geörg, D., Staubach, J., Rädle, M., Methner, F.-J., Beuermann, T.: Evaluation of a newly developed mid-infrared sensor for real-time monitoring of yeast fermentations. Journal of Bioscience and Bioengineering (2016). DOI:10.1016/j.jbiosc.2016.12.005

• Braun, F., Schalk, R., Brunner, J., Eckhardt, H. S., Theuer, M., Veith, U., Henning, S., Ferstl, W., Methner, F.-J., Beuermann, T., Gretz, N., Rädle, M.: Nicht-invasive Prozesssonde zur Inline-Ramananalyse durch optische Schaugläser. tm – Technisches Messen (2016). DOI:10.1515/teme-2016-0011

• Geörg, D., Schalk, R., Methner, F.-J., Beuermann, T.: MIR-ATR sensor for process monitoring. Measurement Science and Technology (2015). DOI:10.1088/0957-0233/26/6/065501

V

Konferenzbeiträge 2018

• Rädle, M., Schalk, R., Teumer, T., Herdt, D., Braun, F., Nachtmann, M., Schäfer, T., Keck, S., Beuermann, T., Methner, F.-J.: Applications of optical process spectroscopy in brewing processes. 13th Trends in Brewing. Gent.


• Schalk, R., Braun, F., Heintz, A., Iacono, G., Frank, R., Rädle, M., Gretz, N., Methner, F.-J., Beuermann, T.: Non-invasive Raman process probe for Inline monitoring of Saccharomyces cerevisiae fermentations. BioRN Annual Conference. Mannheim.

• Braun, F., Schalk, R., Heintz, A., Nachtmann, M., Beuermann, T., Methner, F.-J., Kränzlin, B., Frank, R., Gretz, N., Rädle, M.: Multispectral Needle Probe for Tissue Analysis. BioRN Annual Conference. Mannheim.

• Rädle, M. und Schalk, R.: Angepasste Prozesslösungen zum optisch/spektroskopischen In- und Online-Monitoring von Fermentationsvorgängen. Meet & Match: Bioprozesse – Simulieren | Überwachen | Steuern. Mannheim.

• Schalk, R., Braun, F., Nachtmann, M., Hien, A., Keck, S., Scholl, S., Methner, F.-J., Gretz, N., Rädle, M., Beuermann, T.: Kompakter Mittelinfrarot-Sensor zur Inline-Überwachung von chemischen und biotechnologischen Prozessen. ANAKON. Tübingen.

• Keck, S., Braun, F., Kapoustina, V., Nachtmann, M., Strischakov, J., Schalk, R., Scholl, S., Repke, J.-U., Gretz, N., Rädle, M.: Entwicklung eines mehrkanaligen Raman-Spektrophotometers zur industriellen Prozessüberwachung. ANAKON. Tübingen.

• Nachtmann, M., Braun, F., Hien, A., Herdt, D., Schalk, R., Beuermann, T., Scholl, S., Gretz, N., Rädle, M.: Basisuntersuchungen zur Verwendung eines Raman-Photometers zur Überwachung chemischer Prozesse. ANAKON. Tübingen.

• Hien, A., Braun, F., Nachtmann, M., Schalk, R., Wängler, B., Rädle, M.: Fluoreszenztomographie zur Verstärkung von Weichteilkontrasten als Unterstützung molekularer bildgebender Verfahren. ANAKON. Tübingen.

• Braun, F., Schalk, R., Hien, A., Frank, R., Scholl, S., Beuermann, T., Methner, F.-J., Gretz, N., Rädle, M.: MRT-kompatible multispektrale Analysennadel zur in-vivo Point-of-Care Gewebediagnostik. ANAKON. Tübingen.

VI


• Schalk, R., Geörg, D., Braun, F., Nachtmann, M., Herdt, D., Rädle, M., Gretz, N., Methner, F.-J., Beuermann, T.: Photometrischer 4-Kanal MIR-ATR-Sensor zur Prozessverfolgung in der Biotechnologie. 12. Kolloquium des Arbeitskreises Prozessanalytik der GDCh und DECHEMA. Berlin.

• Braun, F., Schalk, R., Brunner, J., Nachtmann, M., Eckhardt, H. S., Scholl, S., Methner, F.-J., Beuermann, T., Gretz, N., Rädle, M.: Design und Prozessimplementierung einer nicht-invasiven Ramansonde. 12. Kolloquium des Arbeitskreises Prozessanalytik der GDCh und DECHEMA. Berlin.

• Nachtmann, M., Braun, F., Schalk, R., Herdt, D., Brunner, J., Scholl, S., Methner, F.-J., Gretz, N., Beuermann, T., Rädle, M.: Design und Evaluierung eines Raman-Photometers für schnelles Prozessmonitoring. 12. Kolloquium des Arbeitskreises Prozessanalytik der GDCh und DECHEMA. Berlin.

• Braun, F., Schwolow, S., Schalk, R., Theuer, M., Eckhardt, H. S., Methner, F.-J., Beuermann, T., Röder, T., Gretz, N., Rädle, M.: Nicht-invasive Inline-Ramananalyse. ProcessNet-Jahrestagung und 32. DECHEMA-Jahrestagung der Biotechnologen. Aachen.


• Schalk, R., Braun, F., Geörg, D., Brunner, J., Seltenreich, J., Theuer, M., Eckhardt, H. S., Methner, F.-J., Rädle, M., Beuermann, T.: Online Raman-Spektroskopie zur Verfolgung einer aeroben Hefe-Fermentation. 11. Kolloquium Arbeitskreis Prozessanalytik der GDCh und DECHEMA. Wien.

• Schalk, R., Geörg, D., Braun, F., Methner, F.-J., Rädle, M., Beuermann, T.: MIR-ATR-Sensor zur Online-Überwachung von chemischen Reaktionen. 11. Kolloquium Arbeitskreis Prozessanalytik der GDCh und DECHEMA. Wien.

• Braun, F., Schwolow, S., Schalk, R., Seltenreich, J., Nachtmann, M., Geörg, D., Röder, T., Beuermann, T., Gretz, N., Rädle, M.: Prozesstaugliche Raman-Spektroskopie mit hoher optischer Sammeleffizienz für die Inline-Analytik. 11. Kolloquium Arbeitskreis Prozessanalytik der GDCh und DECHEMA. Wien.

• Braun, F., Schalk, R., Geörg, D., Rädle, M., Eckhardt, H. S., Beuermann, T.: Prozess-Raman-Spektroskopie zur Inline Verfolgung einer aeroben Fermentation von Saccharomyces cerevisiae. GDCh-Wissenschaftsforum Chemie. Dresden.

VII

Abkürzungen und Nomenklatur

𝐴𝐴(𝜆𝜆) Absorption Absorption

𝛼𝛼, 𝑏𝑏 y-Achsenabschnitt (Blindwert bzw. Absolutglied) Alphab

ATR Abgeschwächte Totalreflexion ATR

𝑏𝑏 Beliebiger Vektor B

𝐵𝐵 Regressionskoeffizienten-Matrix B

𝛽𝛽 Einfallswinkel des Lichtes an der ATR-Grenzfläche Beta

𝛽𝛽 Regressionskoeffizienten-Vektor Beta

𝛽𝛽1,𝛽𝛽2 … Regressionskoeffizienten eines MLR-Modells Betanull

BFM Biofeuchtmasse BFM

𝑏𝑏𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜 Optimal geschätzter Regressionskoeffizienten-Vektor Bopt

BTM Biotrockenmasse BTM

𝑐𝑐 Konzentration (Stoffmenge pro Volumen) C

𝑐𝑐 Lichtgeschwindigkeit C

CCD Charge-coupled device CCD

CHO Chinese Hamster Ovary CHO

𝑐𝑐𝑁𝑁 Nachweisgrenze Cn

𝑑𝑑 Schichtdicke (optische Weglänge) D

𝑑𝑑ATR Schichtdicke in der untersuchten Probe bei einem ATR-Aufbau Datr

𝑑𝑑eff Effektive Schichtdicke an einer ATR-Reflexionsstelle Deff

∆𝐸𝐸 Energieübertrag auf ein Molekül bei der Raman-Streuung DeltaE

∆𝜈𝜈�𝑅𝑅 Wellenzahlverschiebung des einfallenden Lichts (Stokes- bzw. Raman-Verschiebung)

Deltanüschlanger

Δ𝑥𝑥 Laufwegunterschied in einem FT-Spektrometer Deltax

𝑑𝑑p Eindringtiefe (penetration depth) an einer ATR-Reflexionsstelle Dp

DIN Deutsches Institut für Normung e. V.

DTGS Deuteriertes Triglycinsulfat DTGS

DV Datenvorbehandlung Dv

𝐸𝐸,𝐹𝐹,𝐺𝐺 Fehler-Matrizen (Residuen) Efg

𝑆𝑆0 elektronischer Grundzustand Elektronischer

𝜖𝜖 Fehler (Residuum) bzw. Fehler-Vektor (Residuen) Epsilon

𝜀𝜀(𝜆𝜆) Molarer dekadischer Extinktionskoeffizient Epsilon

F1, F2… Optische Bandpassfilter des MIR-ATR-Sensors Feins

VIII

FFT Schnelle Fourier-Transformation (Fast Fourier Transform) Fft

FT Fourier-Transformation FT

GC Gaschromatographie GC

HeNe Helium-Neon HeNe

HPLC High Performance Liquid Chromatography HPLC

𝑖𝑖 Laufvariable (Analyt-, Proben-, Kanal-, Stoffindex) I

𝐼𝐼(𝜆𝜆) Lichtintensität Ilambda

𝐼𝐼0(𝜆𝜆) Referenzintensität Inulllambda

IR Infraroter Spektralbereich IR

𝐾𝐾 Anzahl an Freiheitsgraden K

LabVIEW Laboratory Virtual Instrumentation Engineering Workbench labview

𝜆𝜆 Wellenlänge des Lichtes Lambda

LC Flüssigchromatographie (Liquid Chormatography) LC

LOOCV Leave-one-out-cross-validation (eine Methode der Kreuzvalidation) Loocv

𝑚𝑚 Steigung M

MCT Mercury cadmium telluride mct

MIR Mittelinfraroter Spektralbereich MIR

MLR Multiple Lineare Regression MLR

𝑁𝑁 Anzahl der Reflexionsstellen bei einem ATR-Aufbau N

𝑛𝑛 Brechungsindex N

NA Numerische Apertur Na

NIPALS Nonlinear Iterative Partial Least Squares Nipals

NIR Nahinfraroter Spektralbereich Nir

𝑛𝑛p Brechungsindex des ATR-Prismas Np

𝑛𝑛,𝑝𝑝,𝑚𝑚,𝑑𝑑

Laufvariablen (Anzahl der Messungen, Anzahl der Regressoren bzw. Regressionskoeffizienten, Anzahl an Analyten bzw. Analytkonzentrationen, Anzahl der zur Kalibration bzw. Validierung verwendeten Proben, Anzahl der Scores bzw. Loadings)

Npm

𝑛𝑛s Brechungsindex der Probe Ns

𝜈𝜈 Frequenz Nü

𝜈𝜈𝐿𝐿 Frequenz eines Lasers NüLaser

𝜈𝜈𝑅𝑅 Frequenz eines unelastisch gestreuten Photons („Raman-Photon“) NüPhoton

𝜈𝜈� Wellenzahl Nüschlange

𝜈𝜈�𝐿𝐿 Wellenzahl eines Lasers NüschlangeL

𝜈𝜈�𝑅𝑅 Wellenzahl eines unelastisch gestreuten Photons („Raman-Photon“) NüschlangeR

IX

oDV Ohne Datenvorbehandlung oDV

PCR Hauptkomponentenanalyse (Principal Component Regression) PCR

𝐸𝐸 Photonenenergie Photonenenergie

PI Prozessmesstechnik und innovative Energiesysteme (PI-Institut) PI

ℎ Planck’sches Wirkungsquantum Planck

PLS, PLS-R Partial Least Squares Regression PLS

PLS 1 Regressions-Algorithmus zur PLS-Modellerstellung zur Vorhersage eines Analyten

Pls1

PLS 2 Regressions-Algorithmus zur PLS-Modellerstellung zur gleichzeitigen Vorhersage mehrerer Analyten

Pls2

PRESS Predicted Residual Sum of Squares Press

𝑃𝑃𝑇𝑇 ,𝑄𝑄𝑇𝑇 Transponierte Loadingmatrizen PtQt

RMSE Wurzel aus dem mittleren quadratischen Fehler, auch als mittlerer Fehler bezeichnet (Root Mean Square Error)

Rmse

RMSEC, SEC

Wurzel aus dem mittleren quadratischen Fehler der Kalibration (Root Mean Square Error of Calibration), auch als Kalibrationsfehler bezeichnet (Standard Error of Calibration)

Rmsec

RMSECV Wurzel aus dem mittleren quadratischen Fehler der Kreuzvalidation (Root Mean Square Error of Cross Validation)

Rmsecv

RMSEP, SEP

Wurzel aus dem mittleren quadratischen Fehler der Vorhersage (Root Mean Square Error of Prediction), auch als Vorhersagefehler bezeichnet (Standard Error of Prediction)

Rmsep

𝑅𝑅2 Bestimmtheitsmaß Rquadrat

𝑆𝑆 Gemessene Signale S

�̂�𝑆 Berechnete Signale Sdach

S1, S2… Für die Simulation von Photometer- bzw. Sensoraufbauten verwendete spektrale Mess- und Referenzbereiche zur MLR-Modellerstellung

Seins

SiC Siliziumcarbid Sic

𝑆𝑆𝑁𝑁 Signal der Nachweisgrenze Sn

𝑆𝑆𝑊𝑊𝑊𝑊𝑊𝑊𝑊𝑊 Wurzel aus der mittleren quadratischen Abweichung zwischen gemessenen Signalen 𝑆𝑆 und berechneten Signalen �̂�𝑆

Swmqa

𝑇𝑇 Scorematrix T

TDMS Technical Data Management Streaming Tdms

𝑡𝑡 Zeit Time

TO Transistor outline (Gehäusebezeichnung) To

𝑇𝑇(𝜆𝜆) Transmission Transmission

UV Ultravioletter Spektralbereich Uv

X

𝑣𝑣 Schwingungsquantenzahl Vau

VBA Visual Basic for Applications Vba

VIS Sichtbarer Spektralbereich Vis

𝑋𝑋 Regressor-Matrix (spektrale Datenmatrix) X

𝑥𝑥1, 𝑥𝑥2 … Regressoren (unabhängige Messgrößen, spektrale Daten) Xeinxzwei

𝑋𝑋𝑇𝑇 Transponierte Regressor-Matrix Xt

𝑦𝑦 Regressand (abhängige Zielgröße, Konzentrationen) bzw. Regressanden-Vektor

Ypsilon

𝑌𝑌 Regressanden-Matrix (Konzentrationsdaten-Matrix) Ypsilon

𝑦𝑦� Vorhergesagter Regressand bzw. Regressanden-Vektor Ypsilondach

𝑦𝑦� Mittelwert aller Referenzwerte der Proben Ypsilonstrich

ZnSe Zinkselenid ZnSe

2D, 4D Zweidimensional, vierdimensional (MLR-Modelle) Zweid

XI

Zusammenfassung

Die Echtzeitüberwachung von Reaktionsprozessen mit Hilfe der optischen Spektroskopie hat in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen. Dabei sind insbesondere die Raman- und Mittelinfrarot- (MIR-) Spektroskopie für die spezifische Detektion von Molekülen geeignet, da beide Methoden auf der Anregung von Grundschwingungen basieren. Diese analytischen Methoden sind nicht-invasiv, schnell und ermöglichen zudem die gleichzeitige Bestimmung mehrerer Analyten ohne Probennahme bzw. -aufbereitung. Typische spektroskopische Messaufbauten für die Prozessüberwachung in der Flüssigphase bestehen dabei aus einem Spektrometer, einer Lichtquelle und einer faseroptischen Immersionssonde (Tauchsonde) welche in direktem Kontakt zum untersuchten Prozess steht. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Raman- und MIR-Systeme für die In- bzw. Online-Überwachung von Analyten (z.B. Glucose) während aerober Batch-Fermentationen von S. cerevisiae angewendet sowie deren Vor- und Nachteile in Bezug auf eine Prozessimplementierung in der chemischen und biotechnologischen Industrie diskutiert.

Das erste Beispiel ist die gleichzeitige Prozessüberwachung mit kommerziellen Raman- und MIR-Spektrometeraufbauten zur Bestimmung der zeitlichen Konzentrationsverläufe von Glucose, Ethanol und Biomasse. Um die gemessenen Raman-Intensitätsspektren und die MIR-Absorptionsspektren den entsprechenden Analytkonzentrationen zuzuordnen, wurden Multiple Lineare Regressions- (MLR) und Partial Least Squares (PLS) Regressionsmodelle erstellt. Zur Kalibration und als Referenzanalytik für die Bestimmung der Ethanol- und Glucosekonzentrationen dienten HPLC-Analysen der aus dem Reaktor entnommenen Proben, wobei die Biomasse gravimetrisch bestimmt wurde. Dabei waren die PLS-Modelle den vergleichsweise einfachen aber analytspezifischen MLR-Modellen, welche jedoch zur Simulation von Photometer- bzw. Sensorsystemen verwendet werden können, überlegen. Für eine bestimmte multivariate Analysenmethode (MLR oder PLS) lagen die Kalibrations- (RMSEC) und Vorhersagefehler (RMSEP) für beide spektroskopische Methoden in der gleichen Größenordnung. Die Fermentationsüberwachung mit Hilfe der MIR-Spektroskopie in Kombination mit PLS-Modellen resultierte in Vorhersagefehlern von 0,68 g L–1 (2 % relativer Fehler), 0,48 g L–1 (5 %) und 0,37 g L–1 (2 %) für Glucose, Ethanol und Biomasse. Für die Raman-Spektroskopie betrugen die entsprechenden RMSEP-Werte 0,92 g L–1 (3 %), 0,39 g L–1 (4 %) und 0,30 g L–1 (2 %).

Das zweite Beispiel demonstriert die Anwendung eines im PI-Institut entwickelten Vierkanal-MIR-Sensors, welcher auf der Methode der abgeschwächten Totalreflexion (ATR) beruht und für die gleichzeitige Verfolgung von Glucose und Ethanol in der Flüssigphase eingesetzt wurde. Der MIR-ATR-Sensor besteht aus einem gepulsten IR-Strahler als Lichtquelle, einem ATR-Prisma aus Zinkselenid und vier Thermopiles, wobei jeder dieser thermischen Detektoren mit einem optischen Bandpassfilter ausgestattet ist. Die Prozesstauglichkeit des Sensors wurde dabei mit einem Fourier-Transformations- (FT-) MIR-Spektrometer verglichen,

XII

wobei die gesamte Messdatenerfassung bei beiden Systemen online in einem Bypass erfolgte. Die Kalibration von Sensor und Spektrometer erfolgte mit Hilfe der MLR. Für den Sensor betrugen die Vorhersagefehler 6,15 g L–1 (6 % relativer Fehler) und 1,36 g L–1 (5 %) für Glucose und Ethanol. Mit dem FT-MIR-Spektrometer wurden RMSEP-Werte von 4,34 g L–1 (4 %) und 0,61 g L–1 (2 %) erzielt. Die Vorteile solcher optischen Mehrkanal-Mittelinfrarot-Sensoren im Vergleich zu FT-MIR-Spektrometeraufbauten sind die Kompaktheit, die einfache Prozessimplementierung sowie der niedrigere Preis.

Das dritte Beispiel zeigt den Einsatz einer ebenfalls im PI-Institut entwickelten Ramansonde welche eine kontaktlose Inline-Messung durch optische Schaugläser oder Glasmäntel von Fermentern und chemischen Reaktoren ermöglicht. Eine solche Sonde wurde konzipiert, um potentielle Probleme bei der Implementierung von Standard-Immersionssonden wie Kontamination, Biofilmbildung an der Sondenspitze und hohe Installationskosten in industriellen Anlagen zu vermeiden. Die praktische Einsatzfähigkeit der Ramansonde wurde bei der gleichzeitigen Überwachung des Glucoseabbaus und der Bildung des Produkts Ethanol getestet. Um zusätzlich Sensor-Aufbauten anstelle von kostenintensiven Spektrometersystemen zu simulieren, wurden zur Auswertung der Raman-Spektren MLR-Modelle verwendet, wodurch die spektralen Informationen auf Intensitäten in wenigen analytspezifischen Bereichen limitiert wurden. Die Vorhersagefehler für Glucose und Ethanol betrugen etwa 5 g L–1 (5 % relativer Fehler) und 1 g L–1 (3 %). Die vorgestellte kontaktlose Ramansonde ermöglicht eine einfache Adaption an eine Vielzahl von Prozessen in der chemischen und biotechnologischen Industrie.

Anhand der drei vorgestellten Beispiele werden die erzielten Resultate mit einem detaillierten Überblick zu aktuellen Analysesystemen ergänzt und neueste Entwicklungen im Bereich der Raman- und MIR-ATR-Spektroskopie für die Echtzeitüberwachung von Fermentationsprozessen beschrieben.

XIII

Abstract

Real-time monitoring of reaction processes using optical spectroscopy has gained importance over the past few years. Thereby, Raman and mid-infrared (MIR) spectroscopy are useful tools for the specific detection of molecules, since both methods are based on the excitation of fundamental vibration modes. These analytical techniques are non-invasive, fast and enable simultaneous determination of multiple analytes without sample preparation. Typical spectroscopic setups for process monitoring in the liquid phase consist of a spectrometer, a light source, and a fiberoptic immersion probe in direct contact to the process. In this work, different Raman and MIR systems were applied for in-line/on-line measurement of analytes (e.g. glucose, ethanol etc.) during aerobic batch-fermentations of S. cerevisiae. Furthermore, their advantages and disadvantages are discussed with regard to process implementation in the chemical and biotechnological industry.

The first example is the simultaneous process monitoring using commercial Raman and MIR spectroscopic setups for recording the temporal concentration courses of glucose, ethanol, and biomass. In order to link the Raman intensity spectra and the MIR absorption spectra to the analyte concentrations multiple linear regression (MLR) and partial-least squares (PLS) regression models were developed. For reference analysis, high performance liquid chromatography (HPLC) and gravimetry was used. PLS models were superior to the simple but analyte specific MLR models, which could also be used to simulate photometer setups. For a given multivariate calibration method (MLR or PLS) the calibration (RMSEC) and prediction (RMSEP) errors for both spectroscopic methods were similar. Process monitoring using MIR spectroscopy in combination with PLS models yielded in RMSEP values of 0.68 g L–1 (2 % relative error), 0.48 g L–1 (5 %) and 0.37 g L–1 (2 %) for glucose, ethanol and biomass. In the case of Raman spectroscopy the corresponding prediction errors were 0.92 g L–1 (3 %), 0.39 g L–1 (4 %) and 0.30 g L–1 (2 %), respectively.

The second example demonstrates the application of a newly low-cost four-channel MIR sensor using the attenuated total reflection (ATR) technique for simultaneous real-time monitoring of glucose and ethanol. The MIR-ATR sensor was developed at the PI-Institute and consists of an IR emitter as light source, a zinc selenide ATR prism as boundary to the process, and four thermopile detectors, each equipped with an optical bandpass filter. The performance of the sensor was compared to a Fourier transform (FT-) MIR spectrometer by on-line measurements in a bypass loop. Sensor and spectrometer were calibrated by MLR. The prediction errors using the sensor were 6.15 g L–1 (6 % relative error) for glucose and 1.36 g L–1 (5 %) for ethanol. In the case of the FT-MIR spectrometer, the corresponding RMSEP values were 4.34 g L–1 (4 %) and 0.61 g L–1 (2 %), respectively. The advantages of optical multi-channel mid-infrared sensors in comparison to FT-MIR spectrometer setups are the compactness, easy process implementation and lower price.

XIV

The third example shows the suitability of a non-contact Raman probe which was developed at the PI-Institute. The design of the probe enables in-line measurements through glass vessels or inspection glasses of bioreactors and chemical reactors. This probe has the advantage to avoid potential problems regarding the implementation of commercially available immersion probes like contamination, biofilm formation on the probe tip and high installation costs in industrial plants. The practical applicability of the probe was tested by monitoring the consumption of the substrate glucose and the formation of the product ethanol. To evaluate Raman spectra MLR models were applied to simulate fictive Raman photometer setups instead of expensive spectrometer systems by limiting the spectral information to intensities in specific regions. The prediction errors for glucose and ethanol were approx. 5 g L–1 (5 % relative error) and 1 g L–1 (3 %), respectively. The presented Raman probe allows simple adaption to a wide range of processes in the chemical and biotechnological industries.

Based on the results of these three examples a detailed overview about state-of-the-art techniques and recent developments in Raman and MIR-ATR-Spectroscopy for real-time monitoring of fermentation processes is given.

1 Einleitung und Zielsetzung 1

1 Einleitung und Zielsetzung

Für eine automatisierte Prozessregelung in der chemischen und biotechnologischen Industrie werden Messtechniken benötigt, welche die relevanten Stoffkonzentrationen (Edukte, Zwischen- und Endprodukte) in Echtzeit direkt im Prozess (inline) bzw. im Bypass (online) erfassen und darüber hinaus in die verfahrenstechnische Umgebung integrierbar sind [1–3]. In den letzten Jahren haben sich für diese Aufgabe zunehmend optische Analysenmethoden durchgesetzt, da die optische Spektroskopie eine schnelle, nicht-invasive und simultane Bestimmung mehrerer Analyten ohne Probenaufbereitung ermöglicht [4, 5]. Von den verschiedenen optischen Spektralbereichen Ultraviolett (UV), Sichtbar (VIS), Nahinfrarot (NIR) und Mittelinfrarot (MIR) besitzt der MIR-Bereich die größte Selektivität, da hier die Molekül-Grundschwingungen angeregt werden [4]. Allerdings gibt es im MIR nur Lichtleiter aus wenig transparenten und mechanisch empfindlichen Materialien. Daher ist eine räumliche Trennung von optischem Sensor (bspw. einer Messsonde) und Spektrometer bzw. Lichtquelle auf Distanzen von weniger als 5 Meter eingeschränkt [6, 7]. Dies ist in der chemischen und biotechnologischen Industrie ein Problem, da aus prozesstechnischen Gründen oftmals die Forderung besteht, das empfindliche Spektrometer außerhalb des Produktionsbereichs unterzubringen. Da es im UV/VIS- und im NIR-Bereich Lichtleiter aus Quarzglas gibt, mit welchen Distanzen bis zu hundert Metern überbrückt werden können, haben sich diese relativ unspezifischen optischen Methoden (breite spektral überlappende Absorptionsbanden) in der Prozessanalytik durchgesetzt [4]. Um dennoch die Vorteile der MIR-Spektroskopie für industrielle Anwendungen nutzen zu können, wurde ein kostengünstiger MIR-ATR-Sensor entwickelt (ATR: abgeschwächte Totalreflexion), welcher so ausgelegt wurde, dass Lichtquelle, Optik und Elektronik kompakt und robust in einem Gehäuse integriert sind und der Sensor damit direkt am Prozess angebracht werden kann [8].

In diesem Zusammenhang stellt die Raman-Spektroskopie eine weitere interessante optische Messmethode dar, da hierbei die eingestrahlte Laserwellenlänge (i.d.R. VIS- bzw. NIR-Licht) um die Anregungsenergie einer Molekülschwingung langwellig verschoben wird (Stokes-Shift) [9]. Dadurch kombiniert die Raman-Spektroskopie die hohe chemische Spezifität des MIR-Bereichs mit dem Einsatz von VIS/NIR-Lichtleitern aus Quarz, was wiederum eine räumliche Trennung von Sonde und Spektrometer gestattet. Jedoch wurde diese Spektroskopiemethode erst in den letzten Jahren, u.a. durch Fortschritte in der Lasertechnologie und hochsensitiver Detektoren [10], verstärkt zur Prozessverfolgung eingesetzt. Ein weiterer Vorteil der Raman-Spektroskopie besteht in der variablen Auslegung der Messsonde. Im Gegensatz zu kommerziellen Tauchsonden wurde daher im PI-Institut eine Ramansonde mit einer Strahlführung über Linsen mit relativ großen Durchmessern zur kontaktlosen Inline-Messung durch vorhandene Schauglasarmaturen industrieller Anlagen bzw. Bioreaktoren entwickelt, welche ein oftmals kostenintensives Nachrüsten einer Messstelle durch den Einbau von Immersionssonden ersparen kann [11].

1 Einleitung und Zielsetzung 2

Um die hohe chemische Informationsdichte des MIR-Bereichs für die Prozessindustrie verfügbar zu machen, sollen in der vorliegenden Arbeit verschiedene optische/spektroskopische Messsysteme – basierend auf der MIR- bzw. Raman-Messtechnik – anhand einer biotechnologischen Modellreaktion untersucht und bewertet werden:

1. Simultane Prozessverfolgung mittels MIR-ATR- und Raman-Spektroskopie 2. Prozessverfolgung mit einem entwickelten MIR-ATR-Sensor 3. Prozessverfolgung mit einer entwickelten kontaktlosen Ramansonde

2 Stand des Wissens 3

2 Stand des Wissens

2.1 Optische Spektroskopie

Physikalische Grundlagen 2.1.1

Unter optischer Spektroskopie versteht man die Verwendung elektromagnetischer Strahlung im Wellenlängenbereich von ca. 200 nm bis ca. 100 µm zur qualitativen und quantitativen Probenanalyse. Elektromagnetische Wellen, wie z.B. Licht, Radiowellen, Gammastrahlung usw. können mit Materie wechselwirken. Diese Wechselwirkung findet bspw. in Form von Absorption oder Streuung statt. Anhand der Wellenlänge 𝜆𝜆, der Frequenz 𝜈𝜈, der Wellenzahl 𝜈𝜈� oder der Photonenenergie 𝐸𝐸 können elektromagnetische Wellen unterschieden werden. Gemäß folgender Formeln lassen sich die genannten Größen ineinander umrechnen [12, 13]:

𝜈𝜈 =

𝑐𝑐𝜆𝜆

2-1

𝐸𝐸 = ℎ · 𝜈𝜈 2-2

ν� =1𝜆𝜆

, 2-3

mit 𝑐𝑐 = 2,998·108 m s–1 (Lichtgeschwindigkeit), ℎ = 6,626·10-34 Js (Planck’sches Wirkungsquantum). Daraus folgt, dass die Energie eines Lichtquants (Photon) 𝐸𝐸 mit ansteigender Frequenz bzw. Wellenzahl zu- und mit der Wellenlänge abnimmt. Die Strahlungsenergie 𝐸𝐸 kann verwendet werden, um Schwingungen von Molekülen anzuregen [14]. Für die Analyse von Mehrkomponentengemischen in der Flüssigphase sind insbesondere die Mittelinfrarot- (MIR), Raman-, und Nahinfrarot- (NIR) Spektroskopie prädestiniert, da Moleküle anhand ihrer Schwingungsbanden unterschieden werden können.

Bei der Anregung einer Grundschwingung durch MIR-Licht ändert sich innerhalb des elektronischen Grundzustandes 𝑆𝑆0 die Schwingungsquantenzahl 𝑣𝑣 von Null auf Eins. Die Energie bzw. Wellenzahl, bei welcher der Übergang 𝑣𝑣 = 0 → 𝑣𝑣 = 1 stattfindet, hängt dabei von den jeweiligen Schwingungspartnern, der Stärke der chemischen Bindung und der Art der Schwingung (Streckschwingung, Deformationsschwingung, etc.) ab [15]. Im NIR-Bereich beobachtet man überwiegend Ober- und Kombinationsschwingungen. Bei Oberschwingungen ändert sich die Schwingungsquantenzahl 𝑣𝑣 von Null auf Zwei, Drei, Vier usw. (s. Abbildung 1) [12, 13]. Dagegen liegt die Wellenzahl einer Kombinationsschwingung bei der Linearkombination der Wellenzahlen der einzelnen Grundschwingungen. Auf der Grundlage, dass ein Molekül Schwingungs- oder Rotationsenergie aufnehmen kann, indem der Energiezustand der betreffenden Atomgruppe in einen anderen Energiezustand mit


höherer Schwingungsquantenzahl übergeht, ergibt sich eine Energiedifferenz, welches auch als spektrale Absorption des Lichtes (kurz: Absorption) bezeichnet wird [16].

Im Gegensatz zur reinen Absorption eines Photons, bei welcher stets eine Molekülanregung vom elektronischen Grundzustand 𝑆𝑆0,𝑣𝑣 = 0 in einen höheren Schwingungszustand 𝑆𝑆0, 𝑣𝑣 = 1, 2, … (Absorption eines IR-Photons) oder gar in ein höheres elektronisches Niveau wie 𝑆𝑆1,𝑆𝑆2, … (Absorption eines UV/VIS-Photons) erfolgt, beruht der Raman-Effekt auf einer unelastischen Lichtstreuung an einem Molekül. Dabei wird ein Teil der einfallenden Photonenenergie auf das Molekül (oder Kristall) übertragen und die restliche Energie verbleibt im Photon und kann als langwellig verschobenes Streulicht detektiert werden. Zur Beschreibung des Raman-Effektes bedient man sich sogenannter virtueller Energieniveaus, welche keine definierten elektronischen oder vibronischen Niveaus des Moleküls beschreiben. Da der Raman-Effekt im Gegensatz zur Rayleigh-Streuung (auch elastische Lichtstreuung genannt) relativ unwahrscheinlich ist, setzt man in der Raman-Spektroskopie intensive monochromatische Lichtquellen (Laser) ein. Das vom Laser emittierte Photon der Energie 𝐸𝐸 und Frequenz 𝜈𝜈𝐿𝐿 fällt auf die Probe und führt zunächst zu einer Anregung in ein virtuelles Niveau. Bei der elastischen Rayleigh-Streuung wird dieses Photon sogleich wieder in eine beliebige Raumrichtung abgegeben bzw. gestreut (𝐸𝐸 = ℎ · 𝜈𝜈𝐿𝐿) [11]. Dagegen erfolgt bei der Raman-Streuung ein teilweiser Energieübertrag ∆𝐸𝐸 auf das Molekül, welcher zur Anregung einer Grundschwingung führt (s. Abbildung 1) [16]. Daher besitzt das gestreute Photon 𝜈𝜈𝑅𝑅 („Raman-Photon“) lediglich die Energie:

𝐸𝐸𝑅𝑅 = ℎ · 𝜈𝜈𝑅𝑅 = ℎ · 𝜈𝜈𝐿𝐿 − ∆𝐸𝐸 2-4

Da für die Photonenenergie gilt: 𝐸𝐸 = ℎ ⋅ 𝜈𝜈 = ℎ ⋅ 𝑐𝑐 ⋅ 𝜈𝜈� , folgt aus Gleichung 2-4 für die Wellenzahl 𝜈𝜈�𝑅𝑅 des unelastisch gestreuten Lichts:

𝜈𝜈�𝑅𝑅 = 𝜈𝜈�𝐿𝐿 − ∆𝜈𝜈�𝑅𝑅 2-5

Dabei ist ∆𝜈𝜈�𝑅𝑅 die Wellenzahlverschiebung des einfallenden Lichts und wird auch als Stokes- bzw. Raman-Verschiebung (engl. Raman shift) bezeichnet [11]. Diese hat für die Anregung einer bestimmten Grundschwingung stets einen festen Wert, so dass, egal mit welcher Laserwellenlänge angeregt wird, die charakteristischen Intensitätsbanden einer Substanz immer an derselben Stelle im Raman-Spektrum liegen. Daher wird in der Raman-Spektroskopie üblicherweise die gemessene unelastische Streulichtintensität nicht gegen die Wellenlänge bzw. Wellenzahl aufgetragen, bei welcher diese detektiert wird, sondern gegen die Wellenzahl-Verschiebung ∆𝜈𝜈�𝑅𝑅, wobei diese meist nur als Wellenzahl bezeichnet wird. In der Praxis werden meistens Laser im Wellenlängenbereich von ca. 500 nm bis 1100 nm verwendet (vgl. Kapitel 2.1.2, Abschnitt Raman-Prozessmesssystem). Da durch den Raman-Effekt Grundschwingungen in der Probe angeregt werden, liegen die Wellenzahlverschiebungen ∆𝜈𝜈�𝑅𝑅 überwiegend im Bereich von ca. 200 cm–1 bis 4000 cm–1 [15].


Abbildung 1: Schematische Darstellung zur Veranschaulichung von Grundschwingungen (𝑣𝑣 = 0 𝑣𝑣 = 1) im

MIR-Bereich, Oberschwingungen (𝑣𝑣 = 0 𝑣𝑣 = 2,3,4, … ) i.d.R. im NIR-Bereich sowie der elastischen Rayleigh-Streuung und der unelastischen Raman-Streuung mit Hilfe des Jablonski-Schemas. Die beiden rot markierten Pfeile verdeutlichen dabei die Anregung von Grundschwingungen sowohl bei der MIR-Spektroskopie als auch bei der Raman-Spektroskopie.

Bei der Absorptionsspektroskopie, wie bspw. der NIR- und MIR-Spektroskopie, wird die wellenlängenabhängige Intensitätsabnahme eines Lichtstrahls beim Durchgang durch die zu analysierende Probe gemessen. Dabei fällt das von der Lichtquelle emittierte Licht zunächst auf die Probe, wo es mehr oder weniger stark absorbiert wird. Die Basislinie 𝐼𝐼0, auch Hintergrund (engl. Background) genannt, wird vor der Probenmessung meist mithilfe einer Referenzmessung (sogenannter Nullbezug) festgelegt. Bei der MIR-ATR-Technik wird dafür häufig Umgebungsluft als Hintergrund verwendet (s. Kapitel 2.1.2, Abschnitt ATR-Messtechnik). Die von der Probe transmittierte Intensität 𝐼𝐼 gelangt schließlich zum Nachweis auf einen Detektor. Dabei ist zu beachten, dass sowohl 𝐼𝐼0 als auch 𝐼𝐼 aufgrund des Lampenspektrums, des Spektrometeraufbaus und der Probenbeschaffenheit von der Lichtwellenlänge 𝜆𝜆 abhängen [12, 13]. Das Verhältnis von transmittierter zu einfallender Lichtintensität wird dabei als Transmission 𝑇𝑇 bezeichnet:

𝑇𝑇(𝜆𝜆) = 𝐼𝐼(𝜆𝜆)𝐼𝐼0(𝜆𝜆)

2-6

Die Absorption 𝐴𝐴, auch Extinktion oder optische Dichte genannt, ist der negative dekadische Logarithmus der Transmission:

𝐴𝐴(𝜆𝜆) = −𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙10(𝑇𝑇(𝜆𝜆)) = −𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙10 �𝐼𝐼(𝜆𝜆)𝐼𝐼0(𝜆𝜆)

� 2-7


Die Grundlage für die quantitative Probenanalyse bildet dabei das Lambert-Beer-Gesetz, welches einen linearen Zusammenhang zwischen Absorption 𝐴𝐴 und Analytkonzentration 𝑐𝑐 beschreibt [16]:

𝐴𝐴(𝜆𝜆) = �𝜀𝜀(𝜆𝜆)𝑗𝑗 · 𝑐𝑐𝑗𝑗 · 𝑑𝑑𝑊𝑊

𝑗𝑗=1

, 2-8

wobei 𝑚𝑚 die Anzahl der absorbierenden Analyten, 𝜀𝜀(𝜆𝜆)𝑗𝑗 den molaren dekadischen Extinktionskoeffizient des Analyten 𝑗𝑗 in der Einheit L mol–1 cm–1, 𝑐𝑐𝑗𝑗 die Analytkonzentration des Analyten 𝑗𝑗 in mol L–1 und 𝑑𝑑 die Schichtdicke (optische Weglänge) in der Probe in cm beschreibt.

Im Gegensatz zur Absorptionsspektroskopie ist bei der Raman-Spektroskopie die Intensität des unelastisch gestreuten Lichts proportional zur Analytkonzentration. Für die Intensität 𝐼𝐼 von Raman-Signalen gilt folgender mathematischer Zusammenhang [17]:

𝐼𝐼 ∝ 𝜈𝜈4𝐿𝐿 · 𝐼𝐼0 · 𝑐𝑐 · �𝜕𝜕𝛼𝛼𝜕𝜕𝜕𝜕�2

2-9

Die Intensität der Raman-Banden 𝐼𝐼 ist damit abhängig von der Frequenz 𝜈𝜈𝐿𝐿 und Intensität des eingestrahlten Lasers 𝐼𝐼0, der Polarisierbarkeitsänderung 𝜕𝜕𝛼𝛼/𝜕𝜕𝜕𝜕 sowie der Konzentration 𝑐𝑐 der unelastisch streuenden Moleküle. Den größten Einfluss auf die Intensität des Raman-Signals hat dabei die Frequenz der anregenden Laserstrahlung, welche in der vierten Potenz in die Signalstärke der Raman-Banden eingeht [18]. Für eine quantitative Probenanalyse gilt somit beim Einsatz eines Lasers mit gleichbleibender Frequenz und Intensität ein proportionaler Zusammenhang zwischen der Anzahl unelastisch streuender Moleküle (Analytkonzentration) und der Intensität der Raman-Banden [19].

Da sowohl bei der MIR- als auch bei der Raman-Spektroskopie überwiegend Grundschwingungen im Spektralbereich von 4000 cm–1 bis 200 cm–1 angeregt werden [16], besitzen diese beiden Methoden einen ähnlichen Informationsgehalt. Die charakteristischen Bandenlagen der unterschiedlichen funktionellen Gruppen und Molekülgerüstschwingungen begünstigen eine Identifizierung von Molekülen. In der MIR-Spektroskopie treten starke Absorptionsbanden auf, wenn sich während einer Grundschwingung das Dipolmoment µ deutlich ändert. Beispiele für funktionelle Gruppen mit intensiven MIR-Banden sind die Streckschwingungen von Carbonylgruppen (C=O) und Hydroxylgruppen (O-H). Im Vergleich dazu ist beim Raman-Effekt die Polarisierbarkeit 𝑎𝑎 eines chemischen Bindungsorbitals entscheidend für eine unelastische Lichtstreuung und somit Anregung der Grundschwingung in einem Molekül bzw. Molekülgerüst. Da chemische Bindungen mit hohem Dipolmoment in der Regel eine schlechte Polarisierbarkeit aufweisen und andererseits unpolare Bindungen


(z.B. C-C) gut polarisierbar sind, sind MIR- und Raman-Spektroskopie gewissermaßen komplementär zueinander [15, 16]. Dagegen basieren die NIR-Absorptionsbanden im Spektralbereich von 12500 cm–1 bis 4000 cm–1 auf der Anregung von Ober- und Kombinationsschwingungen (vgl. Abbildung 1) von Molekülgruppen welche C-H, N-H und O-H Gruppen enthalten [16, 20]. Diese Ober- und Kombinationsschwingungen resultieren in breiten und stark überlappenden Absorptionsbanden [16, 21]. Dadurch besitzt die NIR-Spektroskopie einen geringeren chemischen Informationsgehalt als die MIR- und Raman-Spektroskopie.

Spektrometrische Messaufbauten 2.1.2

Im Hinblick auf eine erfolgreiche Prozessimplementierung spektroskopischer Messmethoden spielt neben den spektralen Informationen vor allem die optomechanische Stabilität der sensiblen Aufbauten in industriellen Umgebungen eine entscheidende Rolle. Ein typischer Messaufbau für die Prozessüberwachung in der Flüssigphase mit Hilfe der NIR-, MIR- oder Raman-Spektroskopie besteht aus einem Spektrometer, einer Lichtquelle und einer faseroptischen Immersionssonde (Tauchsonde) welche in direkten Kontakt zum untersuchten Prozess steht [22]. Die elektromagnetische Strahlung der Lichtquelle wird dabei über Lichtwellenleiter (Anregungsfaser(n)) in die Sonde und somit in die Probe geleitet, wo eine entsprechende Wechselwirkung (Absorption bei MIR- bzw. NIR-Spektroskopie und unelastische Lichtstreuung bei Raman-Spektroskopie) stattfindet. Zur Detektion wird das Licht anschließend über Lichtwellenleiter (Empfangsfaser(n)) von der Immersionssonde zu einem Spektrometer geleitet [23, 24]. Im Folgenden werden daher die optischen Komponenten (Lichtquellen, Sonden und Spektrometer) von typischen NIR-, MIR- und Raman-spektroskopischen Messaufbauten für die Reaktionsüberwachung in der Flüssigphase kurz erläutert (s. Tabelle 1).

Tabelle 1: Übersicht über typische Lichtquellen, Sonden und Spektrometer für NIR-, MIR- und Raman-spektroskopische Prozessaufbauten zur Echtzeitmessung in der Flüssigphase.

Spektroskopiemethode Lichtquelle Sonde Spektrometer

NIR Wolfram- Halogenlampe

Transmissions- Immersionssonde

Gitter (Diodenarray) oder FT-NIR

MIR Globar, Nernst-Stift

ATR- Immersionssonde FT-MIR

Raman Laser Raman- Immersionssonde

Gitter (CCD-Array) oder FT-NIR

NIR-Prozessmesssystem

Ein NIR-Prozessmesssystem besteht aus einer Wolfram-Halogenlampe als Lichtquelle, einer Transmissions-Immersionssonde mit Lichtwellenleitern aus Quarz sowie bspw. einem InGaAs-Diodenarray-Spektrometer oder einem FT-NIR-Spektrometer welches mit einem InGaAs-Detektor ausgestattet ist. Die kleinen molaren dekadischen Extinktionskoeffizienten im NIR-Bereich erfordern den Einsatz von Transmissions-Immersionssonden mit optischen


Schichtdicken von mehreren Millimetern oder Zentimetern, um ausreichend hohe Absorptionssignale zu erzielen. Falls sich Partikel und/oder Luftbläschen in dem optischen Messspalt der Transmissionssonde befinden, können Streueffekte zu erheblichen Störungen in den NIR-Spektren führen.

MIR-Prozessmesssystem

Im MIR-Bereich werden häufig Schwarzkörperstrahler aus Siliziumcarbid (SiC, welche auch als Globar bezeichnet werden) als Lichtquellen eingesetzt. Aufgrund der schwachen Lichtintensität dieser thermischen Strahler und der geringen Lichtempfindlichkeit der überwiegend eingesetzten pyroelektrischen DTGS-Detektoren aus deuteriertem Triglycinsulfat (DTGS) bzw. der mit flüssigem Stickstoff zu kühlenden mercury cadmium telluride (MCT-) Halbleiterdetektoren müssen Fourier-Transformationsspektrometer (FT-Spektrometer) verwendet werden, um ein hinreichendes Signal-/Rauschverhältnis in den MIR-Spektren zu erzielen. Die molaren dekadischen Extinktionskoeffizienten sind im MIR-Spektralbereich deutlich höher als im NIR-Bereich. Damit für die quantitative Analyse das Lambert-Beer-Gesetz angewendet werden kann, sind daher optische Schichtdicken im Bereich von Mikrometern nötig, um Absorptionen kleiner zwei zu erreichen (A < 2). Solche kleinen Schichtdicken können mit Hilfe der Methode der abgeschwächten Totalreflexion (ATR) realisiert werden (vgl. Kapitel 2.1.2, Abschnitt ATR-Messtechnik) [25]. ATR-Immersionssonden werden über optische Fasern mit der Lichtquelle und dem Spektrometer verbunden. Das ATR-Prisma an der Sondenspitze besteht meistens aus Si, Ge, ZnSe oder Diamant, wobei letzteres die höchste chemische Beständigkeit aufweist. Die schlechten Transmissionseigenschaften der MIR-Fasern, welche hauptsächlich aus Silberhalogenid oder Chalcogenid bestehen [26], erfordern eine Kühlung der MCT-Detektoren mit flüssigem Stickstoff, um Absorptionsspektren mit ausreichendem Signal-zu-Rauschverhältnis zu erhalten. Weiterhin werden diese fragilen Lichtleitermaterialien mit der Zeit opak. Um die Nachteile von MIR-Lichtwellenleitern zu vermeiden, kann an Stelle einer faseroptischen ATR-Sonde auch ein direkt ins FT-Spektrometer integriertes ATR-Modul eingesetzt werden. Bei einem solchen Aufbau erfolgt die Messung häufig in einem Bypass, wobei die zu analysierende Probe zum ATR-Modul befördert werden muss. Im Gegensatz zu einer faseroptischen Immersionssonde liegt dann zwar keine Inline-Messung mehr vor, dennoch handelt es sich hierbei um eine Echtzeitanalyse der Originalprobe. Diese Lösung ist wesentlich kostengünstiger (ca. 25.000 € für Spektrometer plus ATR-Modul) und langzeitstabiler als der faseroptische Aufbau (ab 50.000 € für FT-Spektrometer mit MCT-Detektor und faseroptischer ATR-Immersionssonde).

Eine weitere Möglichkeit, die MIR-Technik für eine Echtzeitmessung in der Flüssigphase einzusetzen, besteht aus einem optischen Aufbau, welcher direkt im Prozess implementiert wird, so dass auf Lichtleiter verzichtet werden kann. Der prinzipielle Aufbau ist dabei ähnlich einem IR-Gassensor, welcher sowohl in der chemischen als auch in der biotechnologischen


Industrie zur Überwachung der chemischen Zusammensetzung in Abgasleitungen eingesetzt wird [27]. IR-Gasanalysatoren bestehen aus einem thermischen IR-Strahler als Lichtquelle, einer Transmissionsküvette (welches mit dem zu analysierenden Gas durchströmt wird) sowie einem Thermopile- oder pyroelektrischen Detektor, welcher mit optischen Bandpassfiltern ausgestattet ist. Um einen bestimmten Analyten spezifisch zu detektieren, weist ein solcher Bandpassfilter eine hohe Transmission in einem Spektralbereich auf, in welchem der Analyt absorbiert, wobei gleichzeitig alle Wellenlängen außerhalb der definierten Bandbreite des Filters geblockt werden [28]. Auf dem Markt sind verschiedene Standard-Bandpassfilter zur Detektion der wichtigsten gasförmigen Analyten erhältlich wie z.B. Kohlenstoffdioxid, Kohlenstoffmonoxid, Stickoxide, Ammoniak und flüchtige Kohlenwasserstoffe wie z.B. Methan [27]. Um solche IR-Sensoren in der Flüssigphase einsetzen zu können, muss die Transmissionsküvette durch einen ATR-Aufbau ersetzt werden, um die hierbei erforderlichen Schichtdicken im Mikrometerbereich zu realisieren. Ein solcher Ansatz könnte zu kompakten, robusten und kostengünstigen Mittelinfrarot-Sensoren zur direkten Prozessimplementierung ohne den Einsatz von Lichtwellenleitern oder beweglicher Teile führen (vgl. Kapitel 3.2.2 und 4.2) [23].

Raman-Prozessmesssystem

Bei der Raman-Spektroskopie besteht ein Messaufbau für Prozessanwendungen aus den Komponenten Anregungslaser, faseroptische Raman-Immersionssonde mit Quarzlichtleitern und einem Spektrometer. Die am häufigsten verwendeten Raman-Laser sind Nd:YAG-Laser (Anregungswellenlänge 1064 nm), GaAlAs-Laserdiode (785 nm), Kr+-Laser (647 nm), HeNe-Laser (633 nm), frequenzverdoppelter Nd:YAG-Laser (532 nm) und Ar+-Laser (488 nm oder 514 nm) [29]. Zur Aufnahme der Raman-Spektren werden üblicherweise Gitterspektrometer mit einem CCD-Array (engl. charge-coupled device) als Detektor oder FT-NIR-Spektrometer mit Ge-Detektor eingesetzt. Die Wahl des Spektrometers richtet sich nach der Wellenlänge des Lasers und dem zu erfassenden Spektralbereich.

Da die Raman-Intensität mit der vierten Potenz der Lichtfrequenz ansteigt (vgl. Formel 2-9), bieten kurzwellige Laser wie der bei 532 nm emittierende frequenzverdoppelte Nd:YAG-Laser den Vorteil von hohen Raman-Signalen. Enthält die zu untersuchende Probe jedoch fluoreszierende Bestandteile, so führt die Bestrahlung mit kurzwelligem Licht zu einem mitunter starken Fluoreszenz-Untergrund in den Raman-Spektren. Da die Fluoreszenzemission genauso wie das Raman-Streulicht langwellig gegenüber der Laserwellenlänge verschoben ist, kann diese nicht mit optischen Filtern geblockt werden. Dagegen ist beim Einsatz eines Nd:YAG-Lasers bei 1064 nm mit deutlich weniger Fluoreszenzuntergrund zu rechnen. Allerdings sind in diesem Fall die Signal-Intensitäten sehr gering und die absorbierende Wirkung von Wasser als Lösungsmittel kommt in geringem Maße störend zum Tragen. Weiterhin erschwerend kommen hier für den optoelektronischen Nachweis ungünstige Emissionswellenlängen hinzu, die mit siliziumbasierter Technologie


nicht mehr detektiert werden können [4]. Für viele Anwendungen stellt daher die Verwendung eines Lasers mittlerer Wellenlänge, wie z. B. eines 785 nm Diodenlasers, einen guten Kompromiss zur Erzielung einer ausreichenden Raman-Signalintensität bei gleichzeitig geringem Fluoreszenz-Untergrund dar [30]. In Raman-Messsystemen wird dieser Laser häufig mit einem CCD-Spektrometer für die Lichtdetektion kombiniert. Da die in der Praxis verwendeten Laserwellenlängen und das daraus resultierende unelastisch gestreute Licht (Raman-Signal) überwiegend im sichtbaren bzw. nahinfraroten Spektralbereich liegen, können – anders als in der MIR-Spektroskopie – bei der Raman-Spektroskopie Lichtleiter aus Quarzglas eingesetzt werden [11, 16]

Gitterspektrometer

Sowohl in der NIR- als auch in der Raman-Spektroskopie werden als Prozessspektrometer häufig Gitterspektrometer eingesetzt (s. Abbildung 2). Bei einem CCD-Array- bzw. einem Diodenzeilen- (Diodenarray-) Spektrometer fällt zunächst die gesamte von der Lichtquelle ausgesendete elektromagnetische Strahlung über eine Messvorrichtung (bspw. eine Messsonde oder eine Küvette) auf die Probe. Anschließend tritt das Messsignal über einen Eintrittsspalt in das Spektrometer ein. Für einen optimalen Lichtdurchsatz werden am Eintrittsspalt häufig Querschnittswandler oder Blenden verwendet [31]. Im weiteren Verlauf breitet sich die Strahlung kegelförmig im Spektrometer aus. Über einen ersten Kollimatorspiegel wird das Licht parallelisiert und auf ein fest montiertes Gitter geleitet, wo es in seine spektralen Anteile aufgespalten wird. Die vom Gitter reflektierte Strahlung fällt auf einen zweiten Kollimatorspiegel und wird von da aus auf eine Detektorzeile (Diodenzeile) geworfen. Diese Zeile besteht aus einer bestimmten Anzahl an Photodetektoren (z.B. 1024, auch Pixel genannt) welche nebeneinander angeordnet sind und so ein lineares Diodenarray bilden. Da auf jedes dieser Pixel elektromagnetische Strahlung mit einer bestimmten Wellenlänge geleitet wird, kann gleichzeitig ein komplettes Intensitätsspektrum aufgenommen werden [12, 13].

Aufgrund der vergleichsweise geringen Raman-Intensitäten wird in Raman-Spektrometern für ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis häufig ein zweidimensionales Diodenarray (mehrere Diodenzeilen übereinander), auch bekannt als CCD-Array, eingesetzt. Diese gekühlten CCD-Detektoren basieren auf Siliziumhalbleiterbasis und sind extrem empfindlich für den Wellenlängenbereich zwischen 300 – 1100 nm [32]. Das Lichtspektrum wird hierbei häufig auf eine Dimension (bzw. eine Zeile) des CCD-Detektors projiziert. Die Pixel der anderen Dimension (bzw. der anderen Zeilen) werden entsprechend zu einzelnen Pixel-Spalten zusammengefasst (auch Binning genannt), sodass im Prinzip jede Pixel-Spalte einer spezifischen Wellenlänge entspricht und die gesamte Lichtintensität erfasst werden kann [29].


Abbildung 2: Schematischer Aufbau eines Gitterspektrometers mit einem InGaAs-Diodenarray für die NIR-

Spektroskopie bzw. einem CCD-Array für die Raman-Spektroskopie (abgeändert nach [15, 16]).

FT-Spektrometer

In der MIR-Spektroskopie werden hauptsächlich Fourier-Transformations-Spektrometer (FT-Spektrometer) eingesetzt. Aufgrund der intensitätsschwachen MIR-Lichtquellen und der relativ lichtunempfindlichen MIR-Detektoren liefern Gitterspektrometer in diesem Spektralbereich ein relativ schlechtes Signal-Rausch-Verhältnis. Bei einem FT-Spektrometer wird das gesamte von der Probe durchgelassene IR-Licht auf den Detektor geleitet, wodurch höhere Signalintensitäten erreicht werden. Hierbei wird das auf den Detektor fallende Licht bei jeder einzelnen Wellenlänge bzw. Wellenzahl anhand eines beweglichen Spiegels unterschiedlich zeitlich moduliert. Da die Modulation bekannt ist, kann aus dem zeitlichen Detektorsignal mit Hilfe der mathematischen Fourier-Transformation ein Intensitätsspektrum 𝐼𝐼(𝜈𝜈�) und somit auch ein Absorptionsspektrum 𝐴𝐴(𝜈𝜈�) berechnet werden. Sowohl die beiden Spiegel als auch der Strahlteiler sind bei einem FT-Spektrometer genauso angeordnet wie bei einem Michelson-Interferometer. In dem rosa markierten Bereich des Strahlteilers (Abbildung 3) interferieren die vom festen Spiegel und die vom beweglichen Spiegel reflektierten Teilstrahlen je nach Gangunterschied. Zur exakten Positionsbestimmung des beweglichen Spiegels wird ein He-Ne-Laser als Wellenlängenstandard eingesetzt. Als Messvorrichtung für die Probe können bspw. Küvetten oder ATR-Zellen verwendet werden [12, 13].

D1Detektor:InGaAs-Diodenarray mit n Pixel (NIR) bzw. CCD-Array (Raman)

Blende

Lichtquelle: Wolfram-Halogenlampe (NIR) bzw. Laser (Raman)

Probe: Sonde, Küvette, …

Beugungsgitter

Kollimatorspiegel

Dn

Kollimatorspiegel


Abbildung 3: Schematischer Aufbau eines Fourier-Transformations-Spektrometers für die MIR-Spektroskopie

(übernommen aus [8, 15]).

ATR-Messtechnik

Die Methode der abgeschwächten Totalreflexion (ATR) realisiert optische Schichtdicken im Mikrometerbereich. Damit ist es möglich, auch im MIR-Bereich (aufgrund der hohen molaren dekadischen Extinktionskoeffizienten) einen linearen Zusammenhang zwischen gemessener Absorption und Analytkonzentration gemäß dem Lambert-Beer-Gesetz (vgl. Formel 2-8) zu erreichen. Die ATR-Methode ist heutzutage eine der am meisten verwendeten Analysentechniken zur Vermessung von flüssigen Proben mit Hilfe der MIR-Spektroskopie [2, 33–36].

Die Schichtdicke 𝑑𝑑𝑊𝑊𝑇𝑇𝑅𝑅 in der untersuchten Probe ist, im Gegensatz zu Transmissionsaufbauten, von der Wellenlänge 𝜆𝜆 abhängig und kann entsprechend berechnet werden (vgl. Formel 2-10). In der MIR-ATR-Spektroskopie wird ein Lichtstrahl mit einem Einfallswinkel 𝛽𝛽 an der Grenzfläche zwischen ATR-Prisma und Probe totalreflektiert, wenn das Produkt aus sin𝛽𝛽 und dem Brechungsindex des ATR-Prismas 𝑛𝑛𝑜𝑜 größer ist als der Brechungsindex der Probe 𝑛𝑛𝑠𝑠 (Abbildung 4). Während der Totalreflexion dringt der Lichtstrahl jedoch weniger als eine Wellenlänge in die Probe ein, wo er teilweise absorbiert werden kann. Diese Eindringtiefe (bzw. Schichtdicke) 𝑑𝑑𝑜𝑜 ist von der Wellenlänge, dem Einfallswinkel, sowie dem Brechungsindex des ATR-Prismas und der Probe anhängig [25, 28]:


𝑑𝑑𝑜𝑜 =λ

2 · 𝜋𝜋 · 𝑛𝑛𝑜𝑜 · �𝑠𝑠𝑖𝑖𝑛𝑛2𝛽𝛽 − �𝑛𝑛𝑠𝑠𝑛𝑛𝑜𝑜�2

2-10

Abbildung 4: Schematischer Aufbau des optischen Strahlengangs in einer ATR-Messzelle mit drei

Reflexionsstellen zwischen Probe und Prisma (abgeändert nach [8, 15]).

Für ATR-Messaufbauten aus Diamant oder ZnSe entspricht die effektive Schichtdicke 𝑑𝑑𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒 ungefähr der doppelten Eindringtiefe, wenn unpolarisiertes Licht verwendet wird [37]. Bei der Verwendung von ATR-Aufbauten mit Mehrfachreflexion muss die effektive Schichtdicke mit der Anzahl der Reflexionen 𝑁𝑁 an der Grenzfläche zwischen ATR-Prisma und Probe multipliziert werden, um die Schichtdicke 𝑑𝑑𝑊𝑊𝑇𝑇𝑅𝑅 in der untersuchten Probe zu berechnen:

𝑑𝑑𝑊𝑊𝑇𝑇𝑅𝑅 = 𝑁𝑁 · 𝑑𝑑𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒 = 𝑁𝑁 · 2 · 𝑑𝑑𝑜𝑜 =N · λ

𝜋𝜋 · 𝑛𝑛𝑜𝑜 · �𝑠𝑠𝑖𝑖𝑛𝑛2𝛽𝛽 − �𝑛𝑛𝑠𝑠𝑛𝑛𝑜𝑜�2

2-11

Aus Formel 2-8 und 2-11 ergibt sich, dass in der MIR-ATR-Spektroskopie die Eindringtiefe 𝑑𝑑𝑊𝑊𝑇𝑇𝑅𝑅 proportional zur Wellenlänge des eingestrahlten Lichtes ist. Daher werden die Absorptionsbanden im langwelligeren Spektralbereich, im Vergleich zu Transmissionsaufbauten, höher gewichtet [28].

Prozessverfolgung mittels MIR-, NIR- und Raman-Spektroskopie 2.1.3

Für eine optimale Prozessführung und Qualitätssicherung bei chemischen und biotechnologischen Prozessen ist die Kenntnis der aktuellen Zusammensetzung des Reaktionsgemisches von großem Nutzen [3]. Wichtige Schlüsselparameter sind dabei die Edukt- und Produktkonzentrationen. Aufgrund der rasanten technologischen Fortschritte in der Optoelektronik hat sich in den letzten Jahren die optische Spektroskopie bei der Echtzeitmessung von chemischen Spezies etabliert. Die wesentlichen Vorteile dieser


Analysenmethode sind, dass sie nicht-invasiv und schnell ist. Darüber hinaus können die Proben häufig ohne Aufarbeitung inline bzw. online vermessen werden [4, 7]

Im NIR-Bereich werden aufgrund der kleinen molaren dekadischen Extinktionskoeffizienten sowie der breiten überlappenden Absorptionsbanden [21, 38] lediglich Nachweisgrenzen von ca. 1000 ppm (0,1 Gew.-% bzw. 1 g L–1) erreicht [1]. Dagegen liegen die Nachweisgrenzen in der MIR-Spektroskopie bei etwa 100 ppm [1]. Allerdings können im NIR-Bereich Lichtleiter aus Quarz für Distanzen bis ca. 100 m eingesetzt werden [39], während im MIR-Bereich nur Strecken von weniger als 5 m zwischen Sonde und Spektrometer überbrückt werden können [6, 7].

Sowohl die MIR- [5, 7, 21, 40–49] als auch die NIR-Spektroskopie [21, 41, 50–60] wurden bereits erfolgreich zur Verfolgung von Bioprozessen in der Flüssigphase eingesetzt. Beispielsweise analysierten Grassi et al. [42] Proben aus Bier-Fermentationen, welche mit zwei verschiedenen Saccharomyces cerevisiae Stämmen durchgeführt wurden, offline mit Hilfe der FT-MIR Spektroskopie. Hierbei wurden mit einer chemometrischen Methode (multivariate curve resolution-alternating least squares (MCR-ALS)) Modelle gebildet, um die Umwandlung von Maltose zu Ethanol spektroskopisch zu verfolgen [42]. Doak und Phillips [44] verwendeten eine ATR-Immersionssonde mit Diamant-Prisma um inline IR-Spektren während der Fermentation von Escherichia coli zu generieren. Durch die Verwendung von Prozessproben wurden auf der Regressionsmethode Partial Least Squares (PLS, vgl. Kapitel 2.2.2) basierende Kalibrations- und Vorhersagemodelle für die Analyten Glucose und Essigsäure erstellt. Die Vorhersagefehler der Modelle entsprachen dabei statistisch den abgeschätzten experimentellen Fehlern, welche durch die Offline-Referenzmessungen erzeugt wurden. In einem Blasensäulenreaktor bestimmten Mueller et al. [5] durch in situ MIR-Spektroskopie die Konzentrationen von Laurinsäure sowie der Produkte Mono-, Di-, und Trilaurin. In einem Anwendungsbeispiel zur NIR-Spektroskopie nutzten Tamburini et al. [54] diese Technik bei aeroben und anaeroben bakteriellen Fermentationsprozessen zur On- und Inline-Überwachung der Zell-, Substrat- und Produktkonzentrationen unter Verwendung von multivariater Datenanalyse. Alves-Rausch et al. [55] beschrieben den Einsatz von in situ NIR-Spektroskopie in Kombination mit chemometrischen Modellen zur Verfolgung von Schlüsselparametern wie Zucker oder Acetoin bei der Fermentation von Bacillus subtilis unter industriellen Bedingungen [23].

Bei vielen industriellen Anwendungen ist es notwendig, dass Spektrometer und Lichtquelle in einem explosions- und spritzwassergeschützten Bereich untergebracht werden müssen. Zur Überbrückung des daraus resultierenden Abstands sind Lichtwellenleiter nötig. Allerdings macht das Fehlen geeigneter faseroptischer Materialien im MIR-Bereich die Implementierung dieser Spektroskopiemethode in einer industriellen Prozessumgebung schwierig [21]. Die Verwendung von Lichtwellenleitern aus Quarz ist daher ein Grund warum die NIR-Spektroskopie, im Vergleich zur MIR-Spektroskopie, zu einer etablierten analytischen


Methode in der chemischen, pharmazeutischen und biotechnologischen Industrie wurde [7, 23, 61]. Auch bei der Raman-Spektroskopie können Quarzlichtleiter verwendet werden, da das detektierte Streulicht je nach Anregungslaser im sichtbaren oder nahinfraroten Spektralbereich liegt. Daher kombiniert die Raman-Spektroskopie den Vorteil, Quarzlichtleiter einsetzen zu können mit dem hohen Informationsgehalt der MIR-Spektroskopie. Erst die in den letzten Jahrzehnten erzielten Fortschritte in der Lasertechnologie sowie die Entwicklung effizienter optischer Filter und hochsensitiver Detektoren führten zu einem vermehrten Einsatz der Raman-Spektroskopie bei der Reaktionsverfolgung [10] mit Nachweisgrenzen, welche sich überwiegend zwischen NIR (1000 ppm) und MIR (100 ppm) bewegen [11, 62, 63].

Dieser technologische Fortschritt im Bereich der Raman-Spektroskopie kann am Beispiel der Überwachung von Hefe-Fermentationen über die letzten 30 Jahre aufgezeigt werden: Bereits in den späten 1980er Jahren gelangen es Shope et al. [64], den Reaktionsprozess einer Hefefermentation zu verfolgen, wobei die Arbeitsgruppe auch gleichzeitig auf die damaligen Limitierungen der Messtechnik hinwies. Shaw et al. [65] konnten im Jahre 1999 durch den Einsatz der Raman-Spektroskopie während einer Fermentation die Konzentrationen von Glucose und Ethanol bestimmen, nachdem die partikulären Bestandteile durch Filtration in einem Bypass abgetrennt wurden. Die gleichzeitige Verfolgung von Ethanol, Glucose und optischer Zelldichte veröffentlichten Sivakesava et al. [45] unter Anwendung von FT-MIR- und FT-Raman-Spektroskopie, wobei die Raman-Spektroskopie bei niedrigen Analytkonzentrationen größere Ungenauigkeiten gegenüber der MIR-Spektroskopie aufwies. Da die Raman-Spektroskopie auf einer unelastischen Streuung von Molekülen beruht (vgl. Kapitel 2.1.1), können Partikel (z.B. ungelöste Mediumskomponenten, Zellen, Gasblasen) die aufgenommenen Spektren bzw. Intensitäten beeinflussen, welches mitunter eine große Herausforderung an die Datenauswertung stellt. Generell kann man sagen, dass sich die Raman-Intensitäten ändern, wenn sich die Trübung bzw. Partikelkonzentration der zu vermessenden Probe ändert. Um diesen Effekt zu kompensieren, haben Aarnoutse und Westerhuis [66] im Jahre 2005 eine Lösungsmittelbande während einer homogenen Katalyse als internen Standard verwendet. Diese Idee wurde von Picard et al. [67] weiterentwickelt, wobei hier eine Sulfatbande (S-O Streckschwingung bei 980 cm–1) als interner Standard zur quantitativen Analyse der Ethanolproduktion durch Saccharomyces cerevisiae diente. Um alle multiplikativen Verfälschungen des Raman-Signals (wie z.B. Variationen in der Laserintensität oder Absorption des Laserlichts) zu korrigieren, bestimmte die Forschungsgruppe dafür jeweils das Verhältnis aus der Intensität der Ethanolbande zur Intensität des internen Standards. Mit der Entwicklung einer Raman-Immersionssonde, welche eine sphärische Linse an der Sondenspitze verwendet [68], wurde eine neue Art von Immersionssonde verfügbar. Durch die Verwendung einer solchen Frontlinse kann einerseits das Anregungssignal mit einer sehr kleinen Brennweite (und damit eine geringe Eindringtiefe in das Medium) – bei gleichzeitig hoher Sammeleffizienz – fokussiert werden, andererseits aber auch das von der Probe


gestreute Licht kollimiert werden. Im Jahre 2014 demonstrierten Iversen et al. [69] den Vorteil dieser Sonde zur Echtzeitverfolgung einer Hefefermentation, da aufgrund der kurzen Brennweite die unerwünschten Störeffekte durch Partikel nur einen minimalen Einfluss auf die aufgenommenen Raman-Intensitäten aufwiesen. Dennoch scheint auch in diesem Fall die Datenanalyse eine Herausforderung dargestellt zu haben, da verschiedene mathematische Methoden zur Generierung von statistisch aussagekräftigen Ergebnissen vorgestellt wurden. Dabei wurde u.a. ein zweistufiger Algorithmus zur quantitativen Bestimmung von Glucose und Ethanol erläutert, da Streueffekte durch Hefezellen die Anwendbarkeit von einfachen linearen Regressionsmethoden verhindert haben [69, 70].

2.2 Multivariate Datenanalyse

Bei der Aufnahme von Spektren entstehen sehr schnell große Datensätze, da je nach Auflösung des verwendeten Spektrometers für ein Spektrum von bspw. 1000 – 3000 cm–1 mehrere hundert bis tausend Messwerte generiert werden. Hinzu kommt, dass für eine Reaktionsverfolgung i.d.R. mehrere hundert Spektren aufgenommen werden, um zum einen eine gute Zeitauflösung zu generieren und zum anderen ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen, sodass diese riesigen Datensätze mathematisch analysiert werden müssen [71]. Eine Möglichkeit zur Bearbeitung von Datensätzen ist dabei die multivariate Datenanalyse, welche im Vergleich zur univariaten Analyse die Abhängigkeiten mehrerer Variablen gleichzeitig untersucht. Die Anwendung von multivariaten Modellen auf experimentelle Analysendaten wird oftmals auch als Chemometrie bezeichnet [72]. Als multivariate Verfahren in der Spektroskopie werden dazu meist Regressionsmethoden eingesetzt. Das am häufigsten angewendete Verfahren ist dabei die sogenannte Partial Least Squares (PLS) Regression. Weitere multivariate Regressionsanalysen sind die Multiple Lineare Regression (MLR) sowie die Hauptkomponentenregression (Principal Component Regression, PCR) [73]. Für diese Regressionsmethoden finden sich in der Literatur zahlreiche einführende Artikel, bspw. von Dunn et al. [74], Carey et al. [75] sowie die Übersichtsarbeiten von Haaland und Thomas [76, 77]. Ein wesentliches Ziel der multivariaten Datenanalyse stellt dabei die Reduzierung der Originaldaten auf relevante Informationen dar. Möchte man eine bestimmte Zielgröße anhand der aufgenommenen Spektren analysieren, verwendet man eine Kalibrierfunktion. Diese Kalibrierfunktion ist in einem vorhergehenden Kalibrationsprozess aufgestellt worden und beschreibt den Zusammenhang zwischen Messgröße (Absorption bei der MIR-Spektroskopie bzw. Intensität bei der Raman-Spektroskopie) und Zielgröße (z.B. Analytkonzentration) [78]. Auf Grundlage verschiedener Kalibrierfunktionen (bzw. Kalibrationsmodelle) ist es somit möglich, anhand der spektralen Informationen eine quantitative Vorhersage mehrerer unbekannter Zielgrößen in Echtzeit zu erhalten.


Multiple Lineare Regression – MLR 2.2.1

Bei der multiplen linearen Regression (MLR) wird der funktionale Zusammenhang zwischen einer abhängigen Zielgröße 𝑦𝑦 (Regressand) durch ein Modell mit 𝑝𝑝 unabhängigen Messgrößen 𝑥𝑥1, 𝑥𝑥2, … , 𝑥𝑥𝑜𝑜 (Regressoren) bestimmt. Für die abhängige Zielgröße 𝑦𝑦 gilt folgendes MLR-Modell [73]:

𝑦𝑦 = 𝛽𝛽0 + 𝛽𝛽1 ⋅ 𝑥𝑥1 + 𝛽𝛽2 ⋅ 𝑥𝑥2 + ⋯+ 𝛽𝛽𝑜𝑜 ⋅ 𝑥𝑥𝑜𝑜 + 𝜖𝜖 2-12

Dabei setzt sich der Wert die Zielgröße 𝑦𝑦 zusammen aus einem Absolutglied 𝛽𝛽0 (Blindwert des Signals bei 𝑥𝑥𝑖𝑖 = 0), einem linearen Beitrag der unabhängigen Messgrößen 𝑥𝑥1, 𝑥𝑥2, … , 𝑥𝑥𝑜𝑜 sowie einem Fehler (Residuum) 𝜖𝜖, welcher üblicherweise bei der Messung der Zielgröße 𝑦𝑦 entsteht [78]. Die abhängigen Zielgrößen stellen in dieser Arbeit die Analytkonzentrationen dar und die unabhängigen Messgrößen bestehen aus Absorptions-Werten bei verschiedenen Wellenzahlen im Fall der MIR-Spektroskopie bzw. Intensitäts-Werten bei der Raman-Spektroskopie. Das Ziel der MLR ist es, die unbekannten Parameter 𝛽𝛽0 bis 𝛽𝛽𝑖𝑖, welche auch als Regressionskoeffizienten bezeichnet werden, zu bestimmen und damit den funktionalen Zusammenhang zwischen 𝑦𝑦 und den 𝑥𝑥𝑖𝑖 herzustellen. Für 𝑝𝑝 = 1 reduziert sich das Modell (Gleichung 2-12) auf eine Geradengleichung [73, 78].

Bei 𝑛𝑛 Messungen und 𝑝𝑝 Regressoren ergibt sich ein Regressanden-Vektor 𝐲𝐲 sowie eine Regressor-Matrix 𝑿𝑿.

𝒚𝒚 = �

𝑦𝑦1𝑦𝑦2⋮𝑦𝑦𝑛𝑛

� ; 𝑿𝑿 =

⎝

⎛

1 𝑥𝑥11 𝑥𝑥12 ⋯ 𝑥𝑥1𝑜𝑜1 𝑥𝑥21 𝑥𝑥22 ⋯ 𝑥𝑥2𝑜𝑜⋮ ⋮ ⋮ ⋱ ⋮1 𝑥𝑥𝑛𝑛1 𝑥𝑥𝑛𝑛2 ⋯ 𝑥𝑥𝑛𝑛𝑜𝑜⎠

⎞ 2-13

Dabei ist 𝑥𝑥𝑖𝑖𝑗𝑗 der Intensitäts- bzw. Absorptions-Wert des 𝑗𝑗 -ten Regressors in der 𝑖𝑖 -ten Messung und 𝑦𝑦𝑖𝑖 die Analytkonzentration in der 𝑖𝑖-ten Messung. Die Einsen in der Regressor-Matrix 𝑿𝑿 dienen dabei lediglich zur Einbeziehung des Absolutglieds 𝛽𝛽0. Der in Gleichung 2-12 gezeigte Zusammenhang muss nun für jede einzelne Messung 𝑖𝑖 aus Gleichung 2-13 gelten:

𝑦𝑦𝑖𝑖 = 𝛽𝛽0 + 𝛽𝛽1 ⋅ 𝑥𝑥𝑖𝑖1 + 𝛽𝛽2 ⋅ 𝑥𝑥𝑖𝑖2 + ⋯+ 𝛽𝛽𝑜𝑜 ⋅ 𝑥𝑥𝑖𝑖𝑜𝑜 + 𝜖𝜖𝑖𝑖

(𝑖𝑖 = 1, … ,𝑛𝑛) 2-14

Durch Zusammenfassung der Regressionskoeffizienten 𝛽𝛽𝑖𝑖 als Koeffizienten-Vektor 𝛽𝛽 und der Fehler 𝜖𝜖𝑖𝑖 als Fehler-Vektor (bzw. Residuen) 𝜖𝜖


𝛽𝛽 =

⎝

⎜⎛

𝛽𝛽0𝛽𝛽1𝛽𝛽2⋮𝛽𝛽𝑜𝑜⎠

⎟⎞

; 𝜖𝜖 = �

𝜖𝜖1𝜖𝜖2⋮𝜖𝜖𝑛𝑛

� 2-15

lassen sich die 𝑛𝑛 Gleichungen in Kombination mit dem Regressanden-Vektor 𝒚𝒚, sowie dem Koeffizienten-Vektor 𝛽𝛽 (Gleichung 2-15) in Matrixschreibweise darstellen [73].

𝒚𝒚 = 𝑿𝑿 ⋅ 𝛽𝛽 + 𝜖𝜖 2-16

Wenn anstelle des unbekannten Koeffizienten-Vektors 𝛽𝛽 ein beliebiger Vektor 𝒃𝒃 als Schätzung eingesetzt wird, entsteht der vorhergesagte Regressanden-Vektor 𝒚𝒚� [73].

𝒚𝒚� = 𝑿𝑿 ⋅ 𝒃𝒃 2-17

Durch Bildung der Differenz zwischen dem tatsächlich gemessenen Regressanden-Vektor 𝒚𝒚 und dem vorhergesagten Regressanden-Vektor 𝒚𝒚� entsteht der Fehler-Vektor 𝜖𝜖 [73].

𝒚𝒚 − 𝒚𝒚� = 𝜖𝜖 2-18

Je besser die Schätzung des beliebigen Vektors 𝒃𝒃 mit dem Koeffizienten-Vektors 𝛽𝛽 übereinstimmt, umso kleiner ist damit der Fehler-Vektor (Residuen) 𝜖𝜖. Wenn die Schätzung perfekt gewählt wäre, würde die Differenz dem Nullvektor entsprechen. Die Ermittlung einer optimalen Schätzung von 𝒃𝒃 erfolgt hierbei durch Minimierung der Fehlerquadratsumme [73].

Der optimal geschätzte Regressionskoeffizienten-Vektor 𝒃𝒃𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜 ergibt sich mit Hilfe von Matrizenumformungen nach Gleichung 2-19. Die Berechnung erfolgt durch die Bildung der transponierten Regressor-Matrix 𝑿𝑿𝑇𝑇, welche die unabhängigen Messgrößen enthält. Nach der Matrixmultiplikation von 𝑿𝑿𝑇𝑇 mit 𝑿𝑿 wird die inverse Matrix gebildet. Abschließend wird die transponierte Regressor-Matrix 𝑿𝑿𝑇𝑇mit dem Regressanden-Vektor 𝒚𝒚 der abhängigen Zielgröße multipliziert und das Produkt zwischen der sich dabei ergebenden Matrix und der vorher berechneten inversen Matrix gebildet [78–80].

𝒃𝒃𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜 = (𝑿𝑿𝑇𝑇 ⋅ 𝑿𝑿)−1 ⋅ 𝑿𝑿𝑇𝑇 ⋅ 𝒚𝒚 2-19

Betrachtet man nun anstelle eines einzelnen Regressanden 𝑦𝑦 eine realistische Datenstruktur mit 𝑚𝑚 Regressanden (mehrere Analytkonzentrationen), wird der gemessene Regressanden-Vektor 𝒚𝒚 durch eine Regressanden-Matrix 𝒀𝒀 mit 𝑛𝑛 Zeilen und 𝑚𝑚 Spalten ersetzt. Damit wird


Gleichung 2-16 zu Gleichung 2-20 mit 𝑩𝑩 als Regressionskoeffizienten-Matrix der Ordnung (p, m) und 𝑬𝑬 als Fehler-Matrix der Ordnung (n, m) [72, 73].

�

𝑦𝑦11 ⋯ 𝑦𝑦1𝑊𝑊𝑦𝑦21 ⋯ 𝑦𝑦2𝑊𝑊⋮ ⋱ ⋮𝑦𝑦𝑛𝑛1 ⋯ 𝑦𝑦𝑛𝑛𝑊𝑊

� = �

𝑥𝑥11 ⋯ 𝑥𝑥1𝑜𝑜𝑥𝑥21 ⋯ 𝑥𝑥2𝑜𝑜⋮ ⋱ ⋮𝑥𝑥𝑛𝑛1 ⋯ 𝑥𝑥𝑛𝑛𝑜𝑜

� ⋅ �

𝑏𝑏11 ⋯ 𝑏𝑏1𝑊𝑊𝑏𝑏21 ⋯ 𝑏𝑏2𝑊𝑊⋮ ⋱ ⋮𝑏𝑏𝑜𝑜1 ⋯ 𝑏𝑏𝑜𝑜𝑊𝑊

� + �

𝜖𝜖11 ⋯ 𝜖𝜖1𝑊𝑊𝜖𝜖21 ⋯ 𝜖𝜖2𝑊𝑊⋮ ⋱ ⋮𝜖𝜖𝑛𝑛1 ⋯ 𝜖𝜖𝑛𝑛𝑊𝑊

� 2-20

In Kurzschreibweise lautet die Gleichung:

𝒀𝒀 = 𝑿𝑿 ⋅ 𝑩𝑩 + 𝑬𝑬 2-21

Dabei erfasst die Fehler-Matrix 𝑬𝑬 die Differenz zwischen der vorhergesagten Regressanden-Matrix 𝒀𝒀� und der tatsächlich gemessenen Regressanden-Matrix 𝒀𝒀 . Die Ermittlung der optimalen Schätzung der Regressionskoeffizienten-Matrix 𝑩𝑩 erfolgt wiederum durch die Minimierung der Fehlerquadratsumme über alle 𝑛𝑛 ⋅ 𝑚𝑚 Komponenten der Differenz 𝒀𝒀 − 𝒀𝒀� und man erhält [72, 73]:

𝑩𝑩𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜 = (𝑿𝑿𝑇𝑇 ⋅ 𝑿𝑿)−1 ⋅ 𝑿𝑿𝑇𝑇 ⋅ 𝒀𝒀 2-22

Jedoch bleibt auch hierbei der wahre Fehler 𝑬𝑬 unbekannt und kann nur geschätzt werden. Dieser Fehler wird im Allgemeinen über den RMSEC (s. Kapitel 2.2.3, Gleichung 2-29) bestimmt [78].

Die Berechnung der MLR kann bspw. mit den Programmen MATLAB (The MathWorks Inc.) oder Excel (Microsoft Corporation) erfolgen. Die MLR-Auswertungen wurden in dieser Arbeit in Excel mit Hilfe der RGP-Funktion durchgeführt.

Partial Least Squares Regression – PLS-R 2.2.2

Eine weitere Möglichkeit zur Erstellung von Kalibrationsmodellen bieten sogenannte Faktorenanalysemethoden. In der optischen Spektroskopie werden dazu meist die Regressionsmethoden Partial Least Squares (PLS) und Principle Component Regression (PCR) eingesetzt. Bei diesen Methoden wird im Allgemeinen die Kalibrationsmatrix zerlegt und auf einer bestimmten Anzahl von Faktoren eine Matrixinversion zur Schätzung von geeigneten Regressionskoeffizienten-Vektoren durchgeführt [16]. Bei einer PCR wird zur Matrixfaktorisierung allein die Matrix der Kalibrationsspektren verwendet, während bei der PLS-Methode die Korrelation von spektralen Informationen mit den Analytkonzentrationen durchgeführt wird [81]. Damit stellt die PLS, im Vergleich zur MLR bzw. PCR, eine multivariate Methode dar, welche die gesamten Informationen der Regressor-Matrix 𝑿𝑿 in einem Schritt mit den entsprechenden Konzentrationen in Beziehung setzt [72]. Prinzipiell kann man zwischen zwei verschiedenen PLS-Ansätzen unterscheiden, die PLS1-Methode und


die PLS2-Methode. Bei einem PLS1-Algorithmus wird ein Zusammenhang zwischen der Konzentration eines Analyten 𝑦𝑦 und mehreren Messgrößen 𝑥𝑥 aufgestellt. Wird dieser Zusammenhang für mehrere Komponenten gleichzeitig bestimmt, spricht man von einem PLS2-Algorithmus [78] auf welchen im Folgenden näher eingegangen wird.

Zur mathematischen Darstellung der Veränderungen von spektralen Informationen und Analytkonzentrationen werden diese zunächst als Regressor-Matrix 𝑿𝑿 und Regressanden-Matrix 𝒀𝒀 (Konzentrationsdaten-Matrix) niedergeschrieben (vgl. Abschnitt 2.2.1) [16, 82]. Anschließend werden diese beiden Matrizen faktorisiert, d. h. sie werden jeweils in zwei Matrizen zerlegt: die Matrix der Faktoren (Loadings) und die Matrix der Faktorgewichte (Scores) [83]. Da die Faktorenanalyse eine Varianzanalyse darstellt, werden hierbei die Unterschiede zwischen den einzelnen Spektren in den Loadings wiedergegeben. Dabei beschreibt das erste Loading einen möglichst großen Teil der spektralen Gesamtvarianz, während im zweiten Loading der größtmögliche Teil der verbliebenen Varianz beschrieben wird. In den nachfolgenden Loadings werden nun immer kleinere Teile der Gesamtvarianz repräsentiert, bis diese am Ende nur noch spektrales Rauschen enthalten. Die Scores enthalten dagegen Informationen, wie die Ausgangsspektren durch die Loadings erklärt werden. Für jedes Spektrum gibt es daher eine bestimmte Anzahl an Scores, welche das Spektrum auf Grundlage der berechneten Loadings beschreibt. Durch Multiplikation der zu einem Spektrum gehörenden Scores mit den entsprechenden Loadings sowie durch anschließendes Aufaddieren der Produkte kann ein Spektrum rekonstruiert werden [83]. Diese Scores können bei der späteren Vorhersage der Analytkonzentrationen anstelle der ursprünglichen Spektren eingesetzt werden, da sie die spektrale Information der Ausgangsspektren auf Basis der Loadings repräsentieren. Der Vorteil einer solchen Faktorenanalyse ist daher, dass die wichtigen Informationen aus großen Datenmengen in Form solcher Scores und Loadings komprimiert und für die Kalibration verwendet werden können. Wird jedoch für die Erstellung eines PLS-Kalibrationsmodells eine zu geringe Anzahl an Loadings gewählt, können die spektralen Strukturen bzw. Veränderungen nur ungenügend erkannt werden, weshalb man in diesem Fall von „Underfitting“ spricht. Dagegen kann eine zu große Anzahl an Loadings („Overfitting“) zu einer Verschlechterung des Modells führen, da hier die spektralen Rauschanteile mit in die PLS-Regression aufgenommen werden [16].

Mathematisch werden die ursprünglichen Matrizen (spektrale Datenmatrix 𝑿𝑿 bzw. Konzentrationsdaten-Matrix 𝒀𝒀 ) entsprechend dem folgenden Schema in zwei kleinere Matrizen zerlegt und als Produkt einer Scorematrix 𝑻𝑻 und einer transponierten Loadingmatrix 𝑷𝑷𝑻𝑻 bzw. 𝑸𝑸𝑻𝑻 dargestellt [16, 72]:


�

𝑥𝑥11 ⋯ 𝑥𝑥1𝑜𝑜𝑥𝑥21 ⋯ 𝑥𝑥2𝑜𝑜⋮ ⋱ ⋮𝑥𝑥𝑛𝑛1 ⋯ 𝑥𝑥𝑛𝑛𝑜𝑜

� = �

𝑡𝑡11 ⋯ 𝑡𝑡1𝑑𝑑𝑡𝑡21 ⋯ 𝑡𝑡2𝑑𝑑⋮ ⋱ ⋮𝑡𝑡𝑛𝑛1 ⋯ 𝑡𝑡𝑛𝑛𝑑𝑑

� ⋅

⎝

⎜⎛𝑝𝑝𝑇𝑇11 ⋯ 𝑝𝑝𝑇𝑇1𝑜𝑜𝑝𝑝𝑇𝑇21 ⋯ 𝑝𝑝𝑇𝑇2𝑜𝑜⋮ ⋱ ⋮

𝑝𝑝𝑇𝑇𝑑𝑑1 ⋯ 𝑝𝑝𝑇𝑇𝑑𝑑𝑜𝑜⎠

⎟⎞

+

⎝

⎛

𝑓𝑓11 ⋯ 𝑓𝑓1𝑜𝑜𝑓𝑓21 ⋯ 𝑓𝑓2𝑜𝑜⋮ ⋱ ⋮𝑓𝑓𝑛𝑛1 ⋯ 𝑓𝑓𝑛𝑛𝑜𝑜⎠

⎞ 2-23

�

𝑦𝑦11 ⋯ 𝑦𝑦1𝑊𝑊𝑦𝑦21 ⋯ 𝑦𝑦2𝑊𝑊⋮ ⋱ ⋮𝑦𝑦𝑛𝑛1 ⋯ 𝑦𝑦𝑛𝑛𝑊𝑊

� = �

𝑡𝑡11 ⋯ 𝑡𝑡1𝑑𝑑𝑡𝑡21 ⋯ 𝑡𝑡2𝑑𝑑⋮ ⋱ ⋮𝑡𝑡𝑛𝑛1 ⋯ 𝑡𝑡𝑛𝑛𝑑𝑑

� ⋅

⎝

⎜⎛𝜕𝜕𝑇𝑇11 ⋯ 𝜕𝜕𝑇𝑇1𝑊𝑊𝜕𝜕𝑇𝑇21 ⋯ 𝜕𝜕𝑇𝑇2𝑊𝑊⋮ ⋱ ⋮

𝜕𝜕𝑇𝑇𝑑𝑑1 ⋯ 𝜕𝜕𝑇𝑇𝑑𝑑𝑊𝑊⎠

⎟⎞

+ �

𝑙𝑙11 ⋯ 𝑙𝑙1𝑊𝑊𝑙𝑙21 ⋯ 𝑙𝑙2𝑊𝑊⋮ ⋱ ⋮𝑙𝑙𝑛𝑛1 ⋯ 𝑙𝑙𝑛𝑛𝑊𝑊

� 2-24

In abgekürzter Schreibweise lauten die Gleichungen:

𝑿𝑿 = 𝑻𝑻 ⋅ 𝑷𝑷𝑻𝑻 + 𝑭𝑭 2-25

𝒀𝒀 = 𝑻𝑻 ⋅ 𝑸𝑸𝑻𝑻 + 𝑮𝑮 2-26

Dabei haben 𝑛𝑛, 𝑝𝑝 und 𝑚𝑚 die gleiche Bedeutung wie in Kapitel 2.2.1, 𝑑𝑑 entspricht hierbei der Anzahl der Scores bzw. Loadings und 𝑭𝑭 bzw. 𝑮𝑮 den Fehlermatrizen (Residuen) der Regressor-Matrix 𝑿𝑿 bzw. der Regressanden-Matrix 𝒀𝒀. Bei der PLS-Regression werden nun die Residuen 𝑭𝑭 und 𝑮𝑮 minimiert und gleichzeitig eine Korrelation zwischen den Matrizen 𝑿𝑿 und 𝒀𝒀 vorgenommen. Die Fehlermatrizen 𝑭𝑭 und 𝑮𝑮 repräsentieren dabei Veränderungen in den Datenstrukturen, welche nicht durch die vorherige Faktorisierung erklärt werden können.

Die Besonderheit der PLS-R besteht, bspw. im Gegensatz zur PCR, in der gleichzeitigen und voneinander unabhängigen Faktorisierung der Regressor-Matrix 𝑿𝑿 und der Regressanden-Matrix 𝒀𝒀. Bei der Auswertung von Absorptions- (MIR-Spektroskopie) bzw. Intensitäts-spektren (Raman-Spektroskopie) sollten spektrale Änderungen prinzipiell durch die jeweiligen unterschiedlichen Analytkonzentrationen hervorgerufen werden. Dies würde bedeuten, dass Konzentrationsänderungen zu entsprechenden Veränderungen der spektralen Informationen führen und somit die Scorematrix 𝑻𝑻 von der Konzentrationsdaten-Matrix 𝒀𝒀 und der spektralen Datenmatrix 𝑿𝑿 identisch sein müsste. Jedoch müssen bei einem solchen Zusammenhang eine Reihe von Störeffekten, wie bspw. Drifteffekte der verwendeten Geräte, (zeitlich) unterschiedliche spektrale Rauschanteile, Fehler bei der Probenpräparation sowie Fehler bei der Referenzanalytik berücksichtigt werden, wodurch sich prinzipiell unterschiedliche Scorematrizen für die 𝑿𝑿- und 𝒀𝒀-Datensätze ergeben. Für eine PLS-Kalibration werden nun identische Scorematrizen 𝑻𝑻 verwendet, welche lediglich eine geringe Abweichung von den ursprünglich unterschiedlichen Werten aufweisen. Dies stellt dabei einen Kompromiss zwischen dem Zusammenhang von spektralen Informationen und Konzentrationen sowie der Erhöhung der Korrelation der Datensätze dar [16, 72, 84].


Zur Durchführung einer PLS-Regression sind verschiedene Softwareroutinen, wie bspw. OPUS Quant 2 (Bruker Optik GmbH), MATLAB (The MathWorks Inc.), The Unscrambler® X (CAMO Software) oder SAS (SAS Institute Inc.) verfügbar. Als iterative Berechnungsvorschrift wird beispielsweise der NIPALS (Nonlinear Iterative Partial Least Squares) Algorithmus verwendet, mit welchem auch nichtlineare Zusammenhänge dargestellt werden können [85]. Die in dieser Arbeit durchgeführten PLS-Regressionen wurden mit der Software OPUS Quant 2 vorgenommen, welche ausschließlich den PLS1-Algorithmus verwendet.

Validierungsmethoden 2.2.3

Um die mittels PLS oder MLR erstellten Kalibrationsmodelle interpretieren und bewerten zu können, haben sich in der Spektroskopie und der chemometrischen Auswertung bestimmte Validierungs- bzw. Qualitätsparameter etabliert. Dies geschieht vorwiegend durch die Berechnung bestimmter Fehler zwischen dem auf den spektroskopischen Daten basierenden multivariaten Modell und einer Referenz. Die am häufigsten verwendeten Qualitätsparameter basieren dabei alle auf dem Standardfehler RMSE (Root Mean Square Error = Wurzel aus dem mittleren quadratischen Fehler, auch mittlerer Fehler genannt) [4, 78].

Um den RMSE für ein Kalibrationsmodell zu bestimmen, wird zuerst die Differenz aus den durch die MLR oder PLS vorhergesagten Werten 𝑦𝑦�𝑖𝑖 der Probe 𝑖𝑖 zu einem bestimmten Messzeitpunkt und den entsprechenden Referenzwerten 𝑦𝑦𝑖𝑖 (bspw. durch Bestimmung per HPLC) berechnet. Anschließend wird diese Differenz quadriert und die Summe über alle Werte gebildet [82]. Diese Differenz wird als PRESS (Predicted Residual Sum of Squares) bezeichnet und ist in Gleichung 2-27 dargestellt [78, 86].

PRESS = �(𝑦𝑦𝑖𝑖 − 𝑦𝑦�𝑖𝑖)2𝑛𝑛

𝑖𝑖=1

2-27

Um den RMSE zu berechnen, wird nun der PRESS durch die Anzahl der Proben dividiert und anschließend die Wurzel aus dem Ergebnis gebildet:

𝑅𝑅𝑅𝑅𝑆𝑆𝐸𝐸 = �1𝑛𝑛⋅ PRESS = �

1𝑛𝑛⋅�(𝑦𝑦𝑖𝑖 − 𝑦𝑦�𝑖𝑖)2

𝑛𝑛

𝑖𝑖=1

2-28

Root Mean Square Error of Calibration – RMSEC

Den mittleren Fehler der Kalibration nennt man Root Mean Square Error of Calibration (RMSEC, auch Kalibrationsfehler genannt). Hierbei wird, im Vergleich zum RMSE, von der


Anzahl der Kalibrationsproben 𝑛𝑛𝐶𝐶 die Anzahl an Freiheitsgraden 𝐾𝐾 sowie eine Eins abgezogen. Die Berechnung erfolgt dabei nach Gleichung 2-29 [82, 86].

𝑅𝑅𝑅𝑅𝑆𝑆𝐸𝐸𝑅𝑅 = �1

𝑛𝑛𝐶𝐶 − 𝐾𝐾 − 1⋅ PRESS = �

1𝑛𝑛𝐶𝐶 − 𝐾𝐾 − 1

⋅�(𝑦𝑦𝑖𝑖 − 𝑦𝑦�𝑖𝑖)2𝑛𝑛𝐶𝐶

𝑖𝑖=1

2-29

Die Freiheitsgrade 𝐾𝐾 entsprechen bei der MLR der Anzahl an Regressionskoeffizienten und bei der PLS den Faktoren, welche die Anzahl der Hauptkomponenten (Loadings) beschreibt (vgl. Abschnitt 2.2.1 und 2.2.2). Der RMSEC sagt aus, wie gut die Übereinstimmung zwischen den vorhergesagten Werten 𝑦𝑦�𝑖𝑖 mittels Kalibrationsmodell und den zur Kalibration herangezogenen Referenzwerten 𝑦𝑦𝑖𝑖 (bspw. HPLC) ist. Der RMSEC ist jedoch meist nicht ausreichend, um die Güte eines Modells zu beurteilen, da er sich lediglich auf die Vorhersage von Daten bezieht, welche bereits im Modell vorhanden sind. Um die Qualität eines Modells zu beurteilen, sollten noch weitere Qualitätsparameter betrachtet werden [82, 86].

Root Mean Square Error of Prediction – RMSEP

Der Root Mean Square Error of Prediction (RMSEP, im Folgenden auch als Vorhersagefehler bezeichnet) beschreibt die Wurzel aus der mittleren quadratischen Abweichung der durch die Regressionsgleichung vorhergesagten Werten 𝑦𝑦�𝑖𝑖 von den entsprechenden Referenzwerten 𝑦𝑦𝑖𝑖 [4].

𝑅𝑅𝑅𝑅𝑆𝑆𝐸𝐸𝑃𝑃 = �1𝑛𝑛𝑃𝑃

⋅ PRESS = � 1𝑛𝑛𝑃𝑃

⋅�(𝑦𝑦𝑖𝑖 − 𝑦𝑦�𝑖𝑖)2𝑛𝑛𝑃𝑃

𝑖𝑖=1

2-30

Dabei steht 𝑛𝑛𝑃𝑃 für die Anzahl der vorhergesagten Proben. Ein wichtiger Unterschied zur Berechnung des RMSEC besteht darin, dass die Daten, die zur Vorhersage genutzt werden, nicht im Datensatz des Kalibrationsmodells enthalten sein dürfen. Dadurch sind die vorhergesagten Daten unabhängig von den Kalibrationsdaten. Der RMSEP hat eine deutlich höhere Aussagekraft bezüglich der Qualität eines Modells in Hinblick auf die Analyse unbekannter Proben und eignet sich daher besser für einen Modellvergleich hinsichtlich einer externen Validierung [82, 86].

Root Mean Square Error of Cross Validation – RMSECV

Den mittleren Fehler aus einer Kreuzvalidation nenn man Root Mean Square Error of Cross Validation (RMSECV). Dabei wird die Wurzel aus der Summe der quadrierten Residuen aller vorhergesagten Werte gebildet, welche während einer Kreuzvalidation ermittelt werden. Die Berechnung erfolgt nach Gleichung 2-31 [82, 86].


𝑅𝑅𝑅𝑅𝑆𝑆𝐸𝐸𝑅𝑅𝑅𝑅 = �1𝑛𝑛𝐶𝐶𝐶𝐶

⋅ PRESS = � 1𝑛𝑛𝐶𝐶𝐶𝐶

⋅�(𝑦𝑦𝑖𝑖 − 𝑦𝑦�𝑖𝑖)2𝑛𝑛𝐶𝐶𝐶𝐶

𝑖𝑖=1

2-31

Im Gegensatz zur externen Validierung über den RMSEP wird bei der Kreuzvalidation ein zugrunde liegender Datensatz intern validiert und dafür in ein sogenanntes Trainings-Set und ein Test-Set aufgeteilt. Das Trainings-Set dient dabei zur Erstellung eines Kalibrationsmodells. Das daraus gewonnene Modell wird dann zur Vorhersage anhand der Daten aus dem Test-Set genutzt. Für die Aufteilung der Daten in Trainings- und Test-Sets gibt es verschiedene Möglichkeiten. Eine häufig genutzte Methode ist die LOOCV (leave-one-out-cross-validation). Hierbei werden für die Erstellung eines Trainings-Sets 𝑛𝑛𝐶𝐶𝐶𝐶 − 1 Proben verwendet und die nicht im Trainings-Set enthaltene Probe vorhergesagt. Anschließend wird diese Probe aus dem Test-Set in das Trainings-Set übernommen, eine andere Probe aus dem Trainings-Set als Test-Set genutzt und das Kalibrationsmodell sowie der RMSEP neu bestimmt. Dieser Vorgang wird so lange wiederholt, bis jede Probe einmal im Test-Set vorhergesagt wurde. Daraus ergeben sich bei 𝑛𝑛 Proben genau 𝑛𝑛 Residuen, welche in Summe den PRESS-Wert ergeben. Über diesen Wert wird letztendlich der RMSECV berechnet. Ein Vorteil der Kreuzvalidation stellt die vergleichsweise geringe Anzahl an benötigten Messwerten dar, um eine gute Aussage über das Modell treffen zu können. Als Nachteil der Kreuzvalidation ist die relativ große Varianz in den Residuen der einzelnen Vorhersagen aufzuführen. Eine externe Validierung des Modells unter praxisnahen Bedingungen kann die Kreuzvalidation zwar nicht ersetzen, jedoch ermöglicht diese eine Vorauswahl von geeigneten Modellen [80, 86].

Bestimmtheitsmaß 𝑅𝑅2

Ein weiterer häufig genutzter Qualitätsparameter zur Beurteilung von multivariaten Modellen ist das Bestimmtheitsmaß 𝑅𝑅2. Das Bestimmtheitsmaß drückt den Anteil der durch die unabhängige Variable 𝑥𝑥 erklärten Varianz an der gesamten Varianz der abhängigen Variable 𝑦𝑦 aus [78]. Damit gibt das Bestimmtheitsmaß an, wie gut die ursprünglichen Referenzwerte bspw. durch ein multivariates Regressionsmodell abgebildet werden können. 𝑅𝑅2 kann dabei Werte zwischen Null und Eins annehmen. Bei einem 𝑅𝑅2 von Eins wären alle Residuen null und somit alle vorhergesagten Werte identisch mit den Referenzwerten, welche daher exakt auf der Regressionsgeraden liegen würden. Das Bestimmtheitsmaß 𝑅𝑅2 wird im Fall eines linearen Regressionsmodells mit Gleichung 2-32 bestimmt. Es berechnet sich dabei als Subtraktion des Verhältnisses der nicht erklärten Streuung (Residuen) zur Gesamtstreuung vom Maximalwert Eins [78, 86]. Dabei steht 𝑦𝑦𝑖𝑖 für die Referenzwerte der Probe 𝑖𝑖 zu einem bestimmten Messzeitpunkt, 𝑦𝑦�𝑖𝑖 für die Werte welche für die Probe 𝑖𝑖 durch die Regressionsgleichung vorhergesagt wurden und 𝑦𝑦� für den Mittelwert aller Referenzwerte der Proben.


𝑅𝑅2 = 1 − �∑ (𝑦𝑦𝑖𝑖 − 𝑦𝑦�𝑖𝑖)2𝑛𝑛𝑖𝑖=1∑ (𝑦𝑦𝑖𝑖 − 𝑦𝑦�)2𝑛𝑛𝑖𝑖=1

� 2-32

Nachweisgrenze 𝑐𝑐𝑁𝑁

Zur Beurteilung von Messverfahren werden oftmals Nachweisgrenzen ermittelt. Dabei stellt die Nachweisgrenze 𝑐𝑐𝑁𝑁 eines analytischen Verfahrens die kleinste Konzentration des zu untersuchenden Analyten dar, welche sich mit einer vorgegebenen Sicherheit vom Untergrund (Bezugsspektrum ohne Analyt bzw. Blindwert) unterscheiden lässt [87]. Einen international einheitlichen Standard oder eine verbindliche Richtlinie zur Ermittlung der Nachweisgrenze gibt es dabei nicht [88]. In Deutschland wird hierfür oftmals nach DIN 32645 vorgegangen [11]. Allerdings bietet diese Norm mehrere Methoden zur Ermittlung dieser Kenngröße an, welches eine allgemeine Vergleichbarkeit bzw. Beurteilung erschwert [88].

Eine einfache und in der industriellen Praxis häufig angewandte Methode zur Bestimmung der Nachweisgrenze 𝑐𝑐𝑁𝑁 beruht dabei auf der Durchführung mehrerer Messungen bei verschiedenen Analytkonzentrationen, welche u.a. in direkter Nähe der vermutlichen Nachweisgrenze liegen sollten. Hierbei kann durch Auftragung der gemessenen Signale 𝑆𝑆 gegen die Konzentrationen 𝑐𝑐 mithilfe einer linearen Regressionsgeraden die Steigung 𝑚𝑚 und der Achsenabschnitt 𝑏𝑏 bestimmt werden:

𝑆𝑆 = 𝑚𝑚 · 𝑐𝑐 + 𝑏𝑏 2-33

Anschließend werden mit dieser Regressionsfunktion sowie den verschiedenen Analytkonzentrationen 𝑐𝑐𝑖𝑖 die dazugehörigen Signale �̂�𝑆𝑖𝑖 der Messung 𝑖𝑖 berechnet:

�̂�𝑆𝑖𝑖 = 𝑚𝑚 · 𝑐𝑐𝑖𝑖 + 𝑏𝑏 2-34

Im Folgenden wird die Wurzel aus der mittleren quadratischen Abweichung zwischen den berechneten Signalen �̂�𝑆𝑖𝑖 und den gemessenen Signalen 𝑆𝑆𝑖𝑖 gebildet, wobei 𝑛𝑛 für die Anzahl der Messungen steht:

𝑆𝑆𝑊𝑊𝑊𝑊𝑊𝑊𝑊𝑊 = � 1𝑛𝑛⋅�(�̂�𝑆𝑖𝑖 − 𝑆𝑆𝑖𝑖)2

𝑛𝑛

𝑖𝑖=1

2-35

Das Signal der Nachweisgrenze 𝑆𝑆𝑁𝑁 entspricht nun dem Dreifachen von 𝑆𝑆𝑊𝑊𝑊𝑊𝑊𝑊𝑊𝑊 (als Sicherheit bzw. Signifikanz) welches zum Achsenabschnitt 𝑏𝑏 (Blindwert) addiert wird:


𝑆𝑆𝑁𝑁 = 3 · 𝑆𝑆𝑊𝑊𝑊𝑊𝑊𝑊𝑊𝑊 + 𝑏𝑏 2-36

Durch anschließende Umformung der linearen Regressionsfunktion kann die Nachweisgrenze 𝑐𝑐𝑁𝑁 bestimmt werden [87]:

𝑐𝑐𝑁𝑁 =𝑆𝑆𝑁𝑁 − 𝑏𝑏𝑚𝑚

2-37

2.3 Kultivierung von Saccharomyces cerevisiae

Die Verwendung von Hefe 2.3.1

Bis zur Mitte des 16. Jahrhunderts gab es noch keine Klarheit über die genaue Ursache von Gärungsvorgängen. Für diese Prozesse wurden bis in das 14. Jahrhundert vor allem Begriffe wie „fermentum“ oder „fermentatio“ verwendet [89]. Dabei leitet sich der Begriff „fermentatio“ wahrscheinlich von dem Wort „fervimento“ (Erwärmung) ab, da man eine Ähnlichkeit zwischen dem während einer Gärung entstehenden Schäumen bzw. Aufwallen und der Erwärmung von Materie, bei der es ebenfalls zu einem Aufwallen kommt, sah [90]. Im Jahre 1680 beschrieb Antonio van Leewenhoek erstmals kleine runde kugelige Gebilde in gärenden Flüssigkeiten, welche er mit einem selbst gefertigten Mikroskop nachwies [89]. Dennoch sollten noch etwa 200 Jahre vergehen, bis Hefezellen und andere Mikroorganismen entsprechend beobachtet und über verschiedene Kultivierungsverfahren selektiv gezüchtet werden konnten. Man kann davon ausgehen, dass die heutigen Bierhefen, welche zur Art Saccharomyces cerevisiae gehören, aus Weinhefen hervorgegangen sind. Bereits in der vorchristlichen Zeit wurden bis in das Mittelalter hinein Wein und Bier oftmals in den gleichen Gefäßen vergoren [89]. Beispiele wie die aus Tonscherben eines steinzeitlichen Dorfes (2800 v. Chr.) isolierten Hefen oder Bilder von ägyptischen Bierkrügen [91] lassen vermuten, dass die heutigen Bierhefen aus einem über mehrere Jahrtausende andauernden Prozess der Bierherstellung hervorgegangen sind. Der Name Saccharomyces cerevisiae geht dabei auf J. Meyen zurück [92], wobei Saccharomyces für „Zuckerpilz“ steht. Weiterhin unterschied Meyen hierbei zwischen Bierhefe (S. cerevisiae) und Weinhefe (S. vini) [89].

Auch heutzutage wird die Kultivierung von Hefe zur Herstellung von Lebensmitteln (Bier, Wein, Backwaren) und anderen Produkten (Medikamente, Kraftstoffe) genutzt [93]. Weiterhin werden Hefezellen als Modellorganismen in der Forschung und Lehre eingesetzt, da diese sich – im Vergleich zu anderen Mikroorganismen, wie bspw. Säugerzellen – unter relativ einfachen Bedingungen kultivieren lassen [94]. Heutige Hefezellen besitzen eine runde bis ovale Form und haben einen Durchmesser von ca. sechs bis zehn Mikrometern [89, 95], wobei Backhefen in der Regel etwas kleiner als Bierhefen sind [96]. Saccharomyces cerevisiae sind einzellige sporenbildende Pilze und pflanzen sich vorwiegend vegetativ (ungeschlechtlich) durch Sprossung fort [96]. Frische Backpresshefen besitzen einen


Wassergehalt zwischen ca. 65 % und 75 %. Der restliche Anteil entspricht der Hefetrockensubstanz (HTS) und besteht aus 45 – 60 % Proteinen, 15 – 39 % Kohlenhydraten, 2 – 12 % Fetten und 6 – 12 % Mineralien [89].

Der Stoffwechsel von Hefe 2.3.2

Hefezellen gelten als fakultativ anaerob, da eine Energiegewinnung sowohl unter Anwesenheit von Sauerstoff (aerob) als auch unter dessen Ausschluss (anaerob) erfolgen kann [8, 97]. Als heterotrophe Mikroorganismen nutzen Hefen hierbei vorwiegend die Bindungsenergie von assimilierbaren organischen Kohlenstoffverbindungen wie bspw. Glucose oder Fructose als Energiequelle. Dabei wird der anaerobe Abbau dieser Kohlenstoffquellen als alkoholische Gärung bezeichnet und der aerobe (oxidative) Abbau als Atmung.

Der Abbau (Katabolismus) dieser Kohlenstoffverbindungen erfolgt sowohl unter aeroben als auch unter anaeroben Bedingungen bis zur zentralen Zwischenstufe Pyruvat über die Glycolyse (Emden-Meyerhof-Parnas-Weg) [89, 98]. Unter aeroben Bedingungen erfolgt anschließend die vollständige Umwandlung des Pyruvats zu CO2 und Wasser. Die Zellatmung läuft dabei prinzipiell über die oxidative Decarboxylierung, den darauf folgenden Citratzyklus (Citronensäurezyklus, Tricarbonsäurezyklus) und die Endoxidation in der Atmungskette [89]. Unter anaeroben Bedingungen wird von dem aus der Glycolyse gebildeten Pyruvat durch das Enzym Pyruvatdecarboxylase CO2 abgespalten. Der dabei entstehende Acetaldehyd wird anschließend mittels Alkoholdehydrogenase zu Ethanol reduziert [13, 97]. Unter anaeroben Bedingungen ist das Wachstum der Hefezellen stark eingeschränkt, da zur Synthese von Steroiden und ungesättigten Fettsäuren Sauerstoff benötigt wird [99]. Nach dem Verbrauch aller assimilierten Kohlenhydrate können die Hefezellen nach einer Adaptionsphase auch das gebildete Ethanol unter oxidativen Bedingungen zu CO2 und Wasser mit Hilfe der Zellatmung abbauen. Ein solches zweiphasiges Wachstumsverhalten wird auch als diauxisches Wachstum (Diauxie) bezeichnet und beruht auf dem Mechanismus der Katabolitrepression. Dabei wird nach dem Kohlenhydratabbau die für die Glykolyse und Proteinbiosynthese transkribierten Gene gehemmt und gleichzeitig für den Ethanolabbau die vorher reprimierten Enzyme, welche u.a. im Citratzyklus und der Atmungskette wirken, exprimiert [100, 101]. Für eine detaillierte Beschreibung der Stoffwechselprozesse von Atmung und Gärung und der daran beteiligten Enzyme sei an dieser Stelle auf die biochemische Fachliteratur verwiesen [102–104].

Am Ende der jeweiligen Stoffwechselwege entsteht für die Hefezellen die energiereiche Verbindung Adenosintriphosphat (ATP), welche als universelle Energiequelle für den Stoffwechsel erforderlich ist. In Tabelle 2 sind zusammenfassend mögliche Stoffwechselwege von Hefen sowie deren theoretische Energieausbeute in Form von ATP dargestellt. Hierbei erweist sich die reine Zellatmung gegenüber der alkoholischen Gärung als energetisch


vorteilhafter, da bis zu 38 Moleküle ATP mit Glucose als Kohlenstoffquelle gewonnen werden können [89].

Tabelle 2: Übersicht der möglichen Stoffwechselwege von Hefen sowie deren theoretische Energiegewinne unter Einsatz von Glucose bzw. Ethanol als Kohlenstoffquelle (modifiziert nach [89]).

Stoffwechselweg Reaktion ATP-Gewinn für die Hefezelle pro Mol Kohlenstoffquelle

Atmung (Glucose) C6H12O6 + 6 O2 6 CO2 + 6 H20 38 Mol Gärung (Glucose) C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2 2 Mol Atmung (Ethanol) C2H5OH + 3 O2 2 CO2 + 3 H2O 17 Mol

In diesem Zusammenhang ist jedoch noch zu erwähnen, dass ab einer bestimmten Glucosekonzentration im Medium (> 0,1 g L–1) der Atmungsstoffwechsel zugunsten einer aeroben Gärung gehemmt wird (Crabtree-Effekt). Das bedeutet, dass trotz der Anwesenheit von Sauerstoff ein Teil des Substrates zu CO2 und Ethanol vergoren wird [89, 93]. Der Grund hierfür ist eine besondere Form der Katabolitrepression [105, 106]. Hierbei reprimiert die Glucose die Transkription der Gene, welche für die Enzyme des Atmungsstoffwechsels kodieren [107]. Dabei wird, ähnlich wie bei der Gärung, aus dem durch die Glycolyse gebildeten Pyruvat unter Abspaltung von CO2 Acetaldehyd hergestellt und zu Ethanol reduziert.

3 Material und Methoden 29

3 Material und Methoden

3.1 Batch-Fermentation von Saccharomyces cerevisiae

Bioreaktor und Messperipherie 3.1.1

Die Fermentationen wurden in einem 6 L-Laborfermenter vom Typ BIOSTAT E der Firma Sartorius AG (Göttingen, Deutschland) durchgeführt. In Abbildung 5 ist der befüllte Bioreaktor mit Steuereinheit und Messsonden dargestellt. Durch die Steuereinheit wurden Temperatur, pH-Wert, Rührerdrehzahl und Begasungsrate eingestellt und geregelt. Die Durchmischung der Fermentationsbrühe erfolgte mit einem dreistufigen Scheibenblattrührer. Über einen Begasungsring am Boden des Reaktors wurde während der Fermentation Druckluft zugeführt. Der Reaktordeckel ist mit neun Anschlüssen versehen. Eine detaillierte Belegung dieser Anschlüsse zeigt das Foto in Abbildung 6.

Abbildung 5: Foto des 6 L-Laborfermenters (rechts) mit Steuereinheit (links) und Messsonden während einer

Batch-Fermentation von Saccharomyces cerevisiae.

Abbildung 6: Foto des Fermenterdeckels mit Belegung der Anschlüsse.

Manometer zur Regelung der

Begasungsrate

Schlauchpumpe für Laugezufuhr

6 L-Fermenter (befüllt)

pH-, Temperatur- und Drehzahlregelung

Fermenterdeckelmit verschiedenen Anschlüssen

Pt100 Temperatur-fühler, pO2- und pH-Elektrode

Überdruckventil

Begasung

Raman-Immersionssonde

Probenschleife (Bypass) für online MIR-ATR-Messungen

Blindstopfen für Probennahme

Abluftkühler mit Kaltwasserzufuhr

und -abfuhr

Laugenzufuhr

Streulichtsonde

Fluoreszenzsonde


Kultivierungsbedingungen 3.1.2

Zusammensetzung des Fermentationsmediums

Für die Batch-Kultivierungen wurde Backhefe (Saccharomyces cerevisiae, 30 % Trockenmasseanteil) der Firma Franz Xaver Wieninger GmbH (Passau, Deutschland) verwendet. Das vollsynthetische Fermentationsmedium, mit Glucose als primäre Kohlenstoffquelle, entspricht dabei dem Medium nach Schatzmann [108] und ist in Tabelle 3 dargestellt. Durch frühere Arbeiten (Klug, K. [97], Egly, D. [13] und Geörg, D. [8]) wurden zwei Modifikationen an diesem Medium vorgenommen: Zum einen erfolgte kein Einsatz der Spurenelemente Vitamin B1 und B6. Dies wurde aus vorhergehenden Versuchen zur Charakterisierung des Zellmetabolismus bei Fermentationen von Saccharomyces cerevisiae übernommen [97]. Hierbei wurde kein negativer Einfluss der fehlenden B-Vitamine auf das Wachstum der Hefe beobachtet. Zum anderen wurde die Stickstoffquelle Ammoniumchlorid anstelle von Di-Ammoniumsulfat eingesetzt, da das gelöste Sulfat im MIR-Spektrum eine Absorptionsbande bei ca. 1100 cm–1 verursacht und somit eine Auswertung von Glucose und Ethanol, welche ebenfalls in diesem Spektralbereich absorbieren, erschwert [13]. Die auf Basis dieser Mediumsveränderungen durchgeführten Fermentationen zeigten keine Beeinträchtigung auf das Hefewachstum [8].

Tabelle 3: Vollsynthetisches Medium zur Batch-Fermentation von S. cerevisiae, abgeändert nach [108].

Chemikalie Summenformel CAS-Nummer Konzentration mg g–1 Glucose

Glucose C12H12O6 50-99-7 1000 Ammoniumchlorid NH4Cl 12125-02-9 161,92

Ammoniumdihydrogenphosphat (NH4)H2PO4 7722-76-1 111,49 Kaliumchlorid KCl 7447-40-7 30

Magnesiumsulfat-Heptahydrat MgSO4 · 7H2O 10034-99-8 15 Calciumchlorid-Dihydrat CaCl · 2H2O 10035-04-8 8,03

Eisen(III)-chlorid-Hexahydrat FeCl3 · 6H2O 10025-77-1 0,5 Zinksulfat-Heptahydrat ZnSO4 · 7H2O 7446-20-0 0,3

Mangan(II)-sulfat-Monohydrat MnSO4 · H2O 10034-96-5 0,54 Kupfer(II)-sulfat-Pentahydrat CuSO4 · 5H2O 7758-99-8 0,08

m-Inosit C12H12O6 87-89-8 2 Calciumpantothenat-Monohydrat C18H32CaN2O10 · H2O 137-08-6 1,04

Biotin C10H16N2O3S 58-85-5 0,001

Kultivierungsbedingungen und Fermentationsablauf

Es wurden einphasige und zweiphasige Batch-Fermentationen durchgeführt. Die eingesetzten Konzentrationen an Glucose, Inokulum in Biofeuchtmasse (BFM) bzw. -trockenmasse (BTM) sowie Antischaummittel sind in Tabelle 4 aufgeführt. Bei den einphasigen Fermentationen wurde die eingesetzte Hefe so lange kultiviert, bis die vorgelegte Glucose komplett aufgebraucht ist. Dies war nach ca. 5,5 Stunden der Fall, sodass die Fermentationen mit einem Nachlauf von ca. 60 Minuten nach 6,5 Stunden beendet


wurden. Bei den zweiphasigen Fermentationen erfolgte so lange eine Kultivierung, bis nach dem anfänglichen Glucoseab- und Ethanolaufbau die gesamte Ethanolmenge verstoffwechselt ist. Dies war nach ca. 9 Stunden der Fall, sodass die Fermentationen nach 10 Stunden beendet wurden.

Tabelle 4: Konzentration von Glucose, Hefe und Antischaummittel in Abhängigkeit der durchgeführten Batch-Fermentationen.

Das Fermentationsvolumen betrug 5 L. Mit Ausnahme von Glucose wurden alle eingewogenen Mediumsbestandteile in Weichwasser gelöst und auf ein Volumen von 4 L aufgefüllt. Anschließend wurde die Suspension im Fermenter auf 32 °C temperiert. Die Glucose und das Inokulum wurden jeweils separat in 500 mL Weichwasser angesetzt. Der pH-Wert wurde im Reaktor auf 5,2 eingestellt und über die automatisierte Zugabe von 5 mol L–L Natronlauge über eine Schlauchpumpe geregelt. Der Rührer wurde bei einer Drehzahl von 700 min–1 betrieben und die Druckluftzufuhr manuell auf eine Begasungsrate von 1 vvm eingestellt. Nachdem das Medium im Fermenter eine Temperatur von 32 °C erreicht hat, wurde das Inokulum und anschließend direkt Antischaummittel (Antifoam RD Emulsion von Dow Corning Inc., Midland, USA) zugegeben. Zuletzt wurde die Glucose hinzugefügt. Während der Fermentationen wurde zu Beginn und anschließend alle 30 Minuten jeweils eine Probe mit einem Volumen von 10 mL entnommen, in ein 15 mL Falcon überführt und für die Referenzanalytik (s. Kapitel 3.1.3) verwendet. Dies ergab für jede einphasige Fermentation (6,5 Stunden) 14 Proben und für jede zweiphasige Fermentation (10 Stunden) 21 Proben.

Simulation einer Prozessvariation

Um eine Prozessabweichung von der oben beschriebenen Standardfahrweise zu simulieren, wurde am Ende einer zweiphasigen Batch-Fermentation durch manuelle Zugabe die Glucosekonzentration auf 30 g L–1 und die Ethanolkonzentration auf 10 g L–1 eingestellt. Diese Werte stellten dabei die maximalen Konzentrationen dieser Analyten bei einer zweiphasigen Batch-Fermentation unter den gegebenen Bedingungen dar (vgl. Kapitel 4.1.1). Da während einer solchen Fermentation Glucose zu Ethanol umgewandelt und anschließend auch das Ethanol verstoffwechselt wird, konnte durch eine gleichzeitig hohe Konzentration von Glucose und Ethanol eine Analyt-Zusammensetzung erstellt werden, welche nicht in einem normalen Prozess vorkommt. Im Anschluss an die Analytzugaben wurde nach ausreichender Homogenisierung eine weitere Probe (Probe Nr. 22) für die Referenzanalytik gezogen. Die Simulation einer solchen Prozessvariation hatte das Ziel, die in Kapitel 3.3.2

Startkonzentration Einphasige Batch-Fermentationen (6,5 h)

Zweiphasige Batch-Fermentationen (10 h)

Glucose in g L–1 100 30 Hefe, BFM in g L–1 33,4 16,7 Hefe, BTM in g L–1 10 5

Antischaummittel in mL L–1 0,2 0,04


bzw. 3.4.2 erstellten MLR- bzw. PLS-Modelle dahingehend zu testen, inwieweit nicht im Kalibrationsdatensatz enthaltene Analyt-Zusammensetzungen vorhergesagt werden können.

Referenzanalytik 3.1.3

Gravimetrie

Die Biomassekonzentration wurde mit Hilfe der Gravimetrie bestimmt. Dabei wurden die aus dem Reaktor entnommenen und in ein Falcon überführten Proben mit einer Präzisionswaage (ABT 220-5DM der Fa. Kern & Sohn GmbH, Balingen, Deutschland) gewogen und das Gewicht als 𝑚𝑚𝐺𝐺𝑒𝑒𝑠𝑠𝐺𝐺𝑊𝑊𝑜𝑜 notiert. Zuvor wurden die leeren Falcons gewogen und das Gewicht als 𝑚𝑚𝐹𝐹𝐺𝐺𝐹𝐹𝐹𝐹𝑜𝑜𝑛𝑛_𝐹𝐹𝑒𝑒𝑒𝑒𝑙𝑙 vermerkt. Zur Abtrennung der Biomasse von der flüssigen Phase wurde die Probe für zehn Minuten (einphasige Fermentationen) bzw. vier Minuten (zweiphasige Fermentationen) mit 4500 min–1 bei Raumtemperatur zentrifugiert (Universal 320 der Fa. Hettich Lab Technology, Tuttlingen, Deutschland). Der abzentrifugierte Überstand wurde mit einer Spritze aufgezogen und durch ein Sterilfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm (Minisart RC der Fa. Sartorius Stedim Biotech GmbH, Göttingen, Deutschland) in ein Eppendorf-Tube überführt. Das Filtrat wurde anschließend bei –18 °C tiefgefroren, um später mit den Proben die HPLC-Analysen durchführen zu können. Der restliche Überstand im Falcon wurde abgegossen, sodass nur noch das Zellpellet darin verblieb. Daraufhin wurde die Probe für drei Tage bei 100 °C in einem Trockenschrank (VT 5042 EK der Fa. Heraeus Holding GmbH, Hanau, Deutschland) platziert, um die restliche Feuchtigkeit im Pellet zu verdampfen. Nach der Trocknung wurde die Probe erneut gewogen und das Gewicht als 𝑚𝑚𝐹𝐹𝐺𝐺𝐹𝐹𝐹𝐹𝑜𝑜𝑛𝑛+𝑃𝑃𝑒𝑒𝐹𝐹𝐹𝐹𝑒𝑒𝑜𝑜_𝑜𝑜𝑙𝑙𝑜𝑜𝐹𝐹𝑡𝑡𝑒𝑒𝑛𝑛 notiert.

Um nun den Biotrockenmasse-Gehalt in g L–1 (g BTM pro L Fermentationsbrühe) zu berechnen, wurde zunächst die Masse in g g–1 (g BTM pro g Probe) durch Gleichung 3-1 bestimmt. Anschließend wurde dieser Wert mit der Dichte der Fermentationsbrühe (988,1 g L–1) multipliziert, um den BTM-Gehalt in g L–1 zu erhalten (vgl. Gleichung 3-2). Die Dichte der Fermentationsbrühe wurde anhand sämtlicher Proben aus vier Fermentationen bestimmt, indem der Inhalt des Falcons in g durch das Volumen des Inhalts in mL dividiert und anschließend mit 1000 multipliziert wurde, um von g mL–1 auf g L–1 umzurechnen [109]. Eine Tabelle dieser Berechnung ist beispielhaft für eine Fermentation in Anhang A zu finden.

𝐵𝐵𝑇𝑇𝑅𝑅 (𝑙𝑙 𝑙𝑙–1) =𝑚𝑚𝐹𝐹𝐺𝐺𝐹𝐹𝐹𝐹𝑜𝑜𝑛𝑛+𝑃𝑃𝑒𝑒𝐹𝐹𝐹𝐹𝑒𝑒𝑜𝑜_𝑜𝑜𝑙𝑙𝑜𝑜𝐹𝐹𝑡𝑡𝑒𝑒𝑛𝑛 − 𝑚𝑚𝐹𝐹𝐺𝐺𝐹𝐹𝐹𝐹𝑜𝑜𝑛𝑛_𝐹𝐹𝑒𝑒𝑒𝑒𝑙𝑙

𝑚𝑚𝐺𝐺𝑒𝑒𝑠𝑠𝐺𝐺𝑊𝑊𝑜𝑜 − 𝑚𝑚𝐹𝐹𝐺𝐺𝐹𝐹𝐹𝐹𝑜𝑜𝑛𝑛_𝐹𝐹𝑒𝑒𝑒𝑒𝑙𝑙 3-1

𝐵𝐵𝑇𝑇𝑅𝑅 (𝑙𝑙 𝐿𝐿−1) = 𝐵𝐵𝑇𝑇𝑅𝑅 (𝑙𝑙 𝑙𝑙–1) ∙ 988,1 𝑙𝑙 𝐿𝐿−1 3-2


High Performance Liquid Chromatography – HPLC

Die Konzentrationen von Glucose und Ethanol wurden offline per HPLC bestimmt. Hierzu wurden die Proben mit Hilfe einer Ionenaustauschersäule (Polyspher OA HY der Fa. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) bei Raumtemperatur zeitlich aufgetrennt. Als mobile Phase wurde 0,005 mol L–1 Schwefelsäure verwendet. Die Ionenaustauschersäule wurde 30 Minuten vor der ersten Messung mit Laufmittel durchströmt, bis sich eine konstante Basislinie eingestellt hat. Für eine exakte und reproduzierbare Auswertung mussten die Proben zudem vollständig aufgetaut und homogenisiert sein sowie Raumtemperatur angenommen haben. Vor der Injektion wurden die aufgetauten Proben im Verhältnis 1:7 (einphasige Fermentationen) bzw. 1:3 (zweiphasige Fermentationen) mit dem Laufmittel verdünnt. Anschließend wurden jeweils 100 µL Probe injiziert, wobei 20 µL auf die Säule und 80 µL in einen Abfallbecher geleitet wurden. Der Volumenstrom der mobilen Phase betrug 0,5 mL min–1 (880-PU der Fa. Jasco GmbH, Pfungstadt, Deutschland) bei einem Druck von 70 kg cm–2. Als Detektor diente ein Differentialrefraktometer (Smartline RI Detektor 2300 der Fa. Knauer GmbH, Berlin, Deutschland). Dieses Messsystem wurde bereits in früheren Arbeiten verwendet [8, 13, 97]. Ein Probendurchlauf dauerte ca. 19 Minuten. Die Datenaufzeichnung erfolgte durch eine Messdatenerfassungskarte (USB-6009 der Fa. National Instruments, Austin, USA) und einer unter LabVIEW (Fa. National Instruments) entwickelten Software auf einem extern angeschlossenen Laptop [8]. Die aufgezeichneten Daten wurden mit einer Chromatographie-Software (ChemStation der Fa. Agilent Technologies Inc., Santa Clara, USA) ausgewertet. Abbildung 7 zeigt beispielhaft ein ausgewertetes Chromatogramm einer Fermentationsprobe mit den Peaks von Glucose (grünes Rechteck) und Ethanol (rotes Oval) bei einer Retentionszeit von 8,66 Minuten bzw. 17,127 Minuten. Sämtliche Daten, wie z.B. Retentionszeit, Fläche unter dem Peak etc., wurden in der Tabelle unter dem Chromatogramm dargestellt (blaues Parallelogramm).

Abbildung 7: Chromatogramm einer vermessenen Fermentationsprobe in der Chromatographie-Software

ChemStation mit Glucose- (grünes Rechteck) und Ethanolpeak (rotes Oval) sowie den dazu tabellarisch dargestellten Informationen (blaues Parallelogramm), übernommen aus [110].

Zur Quantifizierung der Messwerte wurden Kalibrationsgeraden für reine Glucose und reines Ethanol ermittelt. Dafür wurden 100 mL einer Stammlösung für Glucose (CAS-Nummer: 50-99-7, VWR International GmbH, Darmstadt, Deutschland) bzw. Ethanol (96 Vol.-%, CAS-Nummer: 64-17-5, VWR International GmbH) erstellt. Durch eine Verdünnungsreihe wurden


anschließend vier Proben bekannter Konzentration hergestellt und vermessen. Die Kalibrationsgeraden der Analyten Glucose und Ethanol sind beispielhaft für die zweiphasigen Fermentationsauswertungen in Abbildung 8 dargestellt. Die Analytkonzentrationen wurden durch Auflösung der aufgeführten Gleichungen nach der Variable x bestimmt.

Abbildung 8: HPLC-Kalibrationsgeraden von jeweils einer Verdünnungsreihe zur Bestimmung der Glucose-

und Ethanolkonzentration in den Proben der zweiphasigen Batch-Fermentationen.

3.2 MIR-ATR- und Raman-Analytik

Simultane MIR-ATR- und Raman-Spektroskopie 3.2.1

In Abbildung 9 ist der Messaufbau für die simultane Prozessanalytik einer Hefefermentation mittels Raman- und MIR-Spektroskopie dargestellt.

Abbildung 9: Messaufbau für die simultane Prozessanalytik einer Hefefermentation mittels Raman- und MIR-

ATR-Spektroskopie.

y = 3,0733x - 0,0764R² = 0,9997

02468

101214

0 1 2 3 4

Glu

cose

konz

entra

tion

(g L

−1)

Peakfläche bei 8,66 min

y = 7,058x - 0,0463R² = 0,9996

0

1

2

3

4

5

0 0,2 0,4 0,6

Eth

anol

konz

entra

tion

(g L

−1)

Peakfläche bei 17,13 min

Inline-Ramansonde

6 L-Bioreaktor

peltiergekühltesCCD-Raman-Spektrometer

mit 785nm-Diodenlaser

MIR-ATR-Spektrometer

mit Durchflusszelle

Bypass mit

Pumpe


Das Raman-Messsystem bestand dabei aus einer Raman-Immersionssonde (RamanProbeTM der Fa. InPhotonics Inc., Norwood, USA), Quarzlichtleitern sowie einem Raman-Spektrometer (MultiSpec® Raman der Fa. tec5 AG, Oberursel, Deutschland). Das MIR-Messsystem bestand aus einem ALPHA FT-MIR-Spektrometer mit einer ATR-Durchflusszelle (Bruker Optik GmbH, Ettlingen, Deutschland). Im Gegensatz zu den Raman-Messungen, welche inline durchgeführt wurden, erfolgten die MIR-Messungen online in einem Bypass.

Raman-Messsystem

Die Ramansonde (RamanProbeTM, InPhotonics Inc.) besaß eine Brennweite von 7,5 mm und verfügte über ein verschiebbares Hüllrohr mit Saphirfenster, welches über der eigentlichen Sonde angebracht war. Dieses Hüllrohr ermöglichte zum einen das Eintauchen der Sonde in flüssige Medien und zum anderen, durch Verschiebung des Hüllrohrs, die Einstellung einer variablen „effektiven Brennweite“. Ist das Hüllrohr mit dem Saphirfenster plan am Sondenende fixiert, ergibt sich aufgrund der Saphirscheibe eine effektive Brennweite von 6 mm. Durch verschiedene Arbeiten wurde für die Fermentationsüberwachung im Hinblick auf die Nachweisempfindlichkeit eine optimale effektive Brennweite von 2,7 mm ermittelt [111, 112] und für die Versuche eingestellt. Spektrometer und Sonde wurden über NIR-Lichtwellenleiter aus Quarz verbunden, wobei die Anregungsfaser einen Durchmesser von 100 µm und einen FC/APC-Anschluss besaß und die Sammelfaser einen Durchmesser von 600 µm und einen SMA-Anschluss (InPhotonics Inc.).

Das MultiSpec® Raman-Spektrometer der Fa. tec5 AG verfügte über einen 785 nm Diodenlaser mit einer variablen Ausgangsleistung zwischen 50 und 500 mW und einen peltiergekühlten CCD-Array-Detektor (1024 × 58 Pixel, Pixelgröße 24 × 24 μm [11]). Für die durchgeführten Versuche wurde die maximale Leistung von 500 mW verwendet, wobei 230 mW innerhalb des Bioreaktors an der Messstelle ankamen (Bestimmung über Laserleistungsmessgerät PowerMax/FieldMaxII der Fa. Coherent Inc., Santa Clara, USA). Die Messdatenerfassung erfolgte mit der Software MultiSpec® Pro II (tec5 AG). Es wurde jede Minute ein Spektrum mit einem Spektralbereich von 300 bis 3200 cm–1, einer Integrationszeit von 30 s und einer Auflösung von 7 cm–1 aufgenommen. Um Schwankungen der Laserintensität bzw. der Detektorempfindlichkeit während der Messung zu vermeiden, wurde das Spektrometer mit dem Laser etwa 30 min vor Beginn einer Fermentation eingeschaltet [113]. Nachdem das Medium ohne Glucose und Inokulum in den Fermenter gefüllt war, wurde eine Dunkelstrommessung durchgeführt und diese als sog. Hintergrund- bzw. Bezugsspektrum für die eigentlichen Messungen verwendet, wobei der Laser ausgeschaltet war und dadurch das Detektorrauschen bei den Messungen berücksichtigt wurde. Anschließend wurde der Laser wieder eingeschaltet und die zyklische Aufnahme für die Fermentationsanalyse gestartet.


MIR-Messsystem

Das verwendete ALPHA FT-MIR-Spektrometer der Fa. Bruker Optik GmbH besaß eine ATR-Durchflusszelle. Der ATR-Kristall der Durchflusszelle bestand aus Diamant. Der Einfallswinkel des Lichtes betrug 45° und es fand eine Einfach-Reflektion an der Grenzfläche Diamant/Probe statt. In dem Spektrometer war ein RockSolidTM Interferometer mit permanent justiertem Goldspiegel und ein DTGS-Detektor integriert. Als Lichtquelle diente ein Siliziumcarbid-Stab (Globar). Die zu vermessende Probe wurde mit Hilfe einer Schlauchpumpe (Typ Ismatec der Fa. Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Deutschland) über den Bypass durch die Durchflusszelle bei einem konstanten Volumenstrom von 2,4 mL min–1 gepumpt. Die Datenerfassung erfolgte mit der Software OPUS (Version 7.0, Bruker Optik GmbH). Es wurde jede Minute eine Messung mit 32 Scans (entspricht etwa 30 s Messzeit), einem Spektralbereich von 500 bis 4000 cm–1 und einer Auflösung von 4 cm–1 aufgenommen. Als Hintergrundspektrum diente ein Spektrum gegen Luft, welches vor Beginn der Fermentationsanalyse aufgenommen wurde.

Einfluss der Zellkonzentration auf die Raman-Signalintensität von gelösten Analyten

Da Partikel das Laserlicht streuen und somit zu einer Abschwächung der Raman-Signale führen, wurden Messungen bei unterschiedlichen Zellkonzentrationen in einem 6 L-Laborfermenter (vgl. Kapitel 3.1.1) durchgeführt. Dabei wurde die BTM-Konzentration in Weichwasser von 0 – 15 g L−1 schrittweise um 1 g L−1 erhöht, während die Konzentration des Analyten Ethanol konstant bei 10 g L−1 gehalten wurde. Die Berechnung der Volumenanteile der einzelnen Zugaben von Hefe und Ethanol (96 Vol.-%) erfolgte dabei iterativ über ein Makro [114], welches in Excel mit der Skriptsprache VBA (Visual Basic for Applications) erstellt wurde, um die Volumenänderung durch die schrittweise Erhöhung der BTM-Konzentration zu berücksichtigen. Als Startvolumen wurden 5 L Weichwasser in den Reaktor vorgelegt. Eine tabellarische Auflistung der einzelnen Zugaben befindet sich in Anhang A. Für eine ausreichende Homogenisierung der Probe wurde nach jeder Konzentrationserhöhung eine Minute gewartet bis die Messung erfolgte. Der Messaufbau sowie die Aufnahme der Spektren sind im Abschnitt Raman-Messsystem beschrieben, wobei die Dunkelstrom-messung (Hintergrundspektrum) im Reaktor mit Weichwasser ohne Hefe und Ethanol durchgeführt wurde. Um ein schnelle Verstoffwechselung der Kohlenstoffquelle und damit Verfälschung der gemessenen Raman-Intensitäten zu verhindern, wurde absichtlich keine Glucose zugegeben. Zudem hätte ein Glucoseabbau eine gleichzeitige Ethanolproduktion bewirkt (vgl. Kapitel 2.3.2), welches die Auswertung ebenfalls hätte verfälschen können.

Bestimmung der Nachweisgrenzen von Glucose und Ethanol

Um die Nachweisgrenzen der Analyten Glucose und Ethanol sowohl für das Raman- als auch für das MIR-ATR-Spektrometersystem zu bestimmen, wurde die Methode des Standard-Additionsverfahrens verwendet. Hierbei wurde für eine Messreihe die Konzentration eines


Analyten in VE-Wasser von 0 g L–1 schrittweise um 0,1 g L–1 erhöht. Sobald davon ausgegangen werden konnte, dass die Nachweisgrenze erreicht war, wurde die Schrittweite erhöht und bei einer Konzentration von 30 g L–1 für Glucose bzw. 10 g L–1 für Ethanol die jeweilige Messreihe beendet. Die Berechnung der Volumenanteile der einzelnen Zugaben von Ethanol (96 Vol.-%) und Glucose (25 Gew.-% in VE-Wasser) wurden dabei iterativ über ein VBA-Makro bestimmt [114], um die Volumenänderung durch die schrittweise Erhöhung der Analytkonzentration zu berücksichtigen. Die einzelnen Konzentrationsschritte sind in Tabelle 18 in Anhang A dargestellt. Die Messungen wurden jeweils in einem 600 mL Becherglas mit einem Startvolumen von 500 mL VE-Wasser durchgeführt. Für eine ausreichende Homogenisierung der Probe wurde nach jeder Konzentrationserhöhung eine Minute gewartet bis die Messung erfolgte. Für die Messreihen mit dem Raman-Spektrometersystem wurde die Immersionssonde in das Becherglas getaucht, wobei die Flüssigkeit über einen Magnetrührer (RCT basic, IKA-Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Deutschland) mit einem Rührfisch durchmischt wurde. Die Aufnahme der Spektren erfolgte wie in Abschnitt Raman-Messsystem beschrieben, wobei die Dunkelstrommessung im Becherglas mit VE-Wasser ohne Analyt durchgeführt wurde. Für die Messreihen mit dem MIR-ATR-Spektrometersystem wurde das Bypass-System verwendet, wobei mit Hilfe der Schlauchpumpe die Probe kontinuierlich aus dem Becherglas durch die ATR-Durchflusszelle befördert wurde. Die Aufnahme der Spektren erfolgte wie in Abschnitt MIR-Messsystem beschrieben. Als Hintergrundspektrum wurde eine Messung gegen Luft durchgeführt.

MIR-ATR-Sensor 3.2.2

Am Institut für Prozessmesstechnik und Innovative Energiesysteme der Hochschule Mannheim wurde ein MIR-ATR-Sensor entwickelt [8, 13] und bereits erfolgreich zur Prozessverfolgung einer Veresterung mit anschließender Destillation eingesetzt [28]. Die technische CAD-Zeichnung des MIR-Sensors ist in Abbildung 10 (A) dargestellt.

Abbildung 10: CAD-Zeichnung des MIR-ATR-Sensors (A) sowie Messprinzip und Strahlengang (B) [8, 13].

Flansche

Lichtquelle

HauptplatineMehrkanaldetektor mit optischen Bandpassfiltern

innen vergoldete Kupferrohre

Diamantplättchen (optional)

Gehäuse

ZnSe ATR-Prisma

(A) (B)


Der optische Aufbau des Vierkanal-Sensors bestand dabei aus einem gepulsten IR-Strahler als Lichtquelle, einem ATR-Prisma aus Zinkselenid (ZnSe) und vier Thermopiles, wobei jeder dieser thermischen Detektoren mit einem optischen Bandpassfilter ausgestattet war. Als IR-Lichtquelle (MIRL 17 900 CAF, 850 mW Eingangsleistung, Laser Components GmbH, Olching, Deutschland) wurde ein Schwarzkörperstrahler mit einer Temperatur von etwa 750 °C und einem Emissionsmaximum bei ca. 3500 cm–1 verwendet. Als ATR-Material wurde ZnSe verwendet, da es relativ kostengünstig ist und über einen hohen Brechungsindex (𝑛𝑛𝑜𝑜 = 2,4) sowie einen breiten Transmissionsbereich (18500 – 620 cm–1) verfügt. Für Anwendungen in chemisch aggressiven Umgebungen konnte das Zinkselenid-Prisma optional mit einem 0,5 mm dicken Diamantplättchen geschützt werden. Da beide optischen Materialen den gleichen Brechungsindex besitzen, würde der Einfallswinkel des Lichtes unverändert bleiben. Um die Lichtstrahlen von der Emissionsquelle zum ATR-Prisma und das total reflektierte Licht vom ATR-Prisma zu den vier Detektoren zu leiten, wurden stark reflektierende goldbeschichtete Kupferrohre verwendet. Die Infrarotstrahlung, welche die Detektoroberfläche erreicht, wurde in ein elektrisches Signal umgewandelt. Jedes Detektorelement des Vierkanal-Thermopile-Detektors (Quad Sensor, HTS Q21, TO39 Gehäuse, Heimann Sensor GmbH, Eltville, Deutschland) war dabei mit einem vorgeschalteten optischen Standard-Bandpassfilter ausgestattet. Für einen direkten Prozesszugang war der MIR-ATR-Sensor in ein Varivent-Gehäuse integriert und konnte damit inline an eine Anlage angeflanscht werden [28].

Die optische Absorptionsmessung fand durch Totalreflexion an der Grenzfläche ATR-Prisma/Probe statt (Abbildung 10 (B)). Die Lichtstrahlen drangen dabei an dieser Grenzfläche weniger als eine Wellenlänge in die zu vermessende Probe ein. Das nicht-absorbierte IR-Licht wurde totalreflektiert und gelangte zu den thermischen Detektoren. Wie bereits in Kapitel 2.1.2 (Abschnitt ATR-Messtechnik) beschrieben, hängt die Eindringtiefe 𝑑𝑑𝑜𝑜 („penetration depth“ dabei von der Wellenlänge 𝜆𝜆, dem Einfallswinkel 𝛽𝛽, dem Brechungsindex des ATR-Prismas 𝑛𝑛𝑜𝑜 und dem der Probe 𝑛𝑛𝑠𝑠 ab (s. Formel 2-11) [25]. Das ATR-Prisma des MIR-Sensors bestand aus ZnSe (𝑛𝑛𝑜𝑜 = 2,4) mit Einfachreflexion, welche bei einem Einfallswinkel von 𝛽𝛽 = 45° stattfand. Zudem beträgt der Brechungsindex einer wässrigen Fermentationsbrühe 𝑛𝑛𝑠𝑠 etwa 1,3. Damit ergab sich aus den ATR-Messungen mit dem Sensor folgende Eindringtiefe [23]:

𝑑𝑑𝑜𝑜 =

λ

2 · 𝜋𝜋 · 𝑛𝑛𝑜𝑜 · �𝑠𝑠𝑖𝑖𝑛𝑛2𝛽𝛽 − �𝑛𝑛𝑠𝑠𝑛𝑛𝑜𝑜�2

=λ

2 · 𝜋𝜋 · 2,4 · �𝑠𝑠𝑖𝑖𝑛𝑛245° − �1,32,4�

2≈𝜆𝜆7

3-3

Die Transmissionsbereiche der verwendeten optischen Bandpassfilter F1 – F4 sind in Tabelle 5 dargestellt. Dabei ließ beispielsweise Filter F1 (2558 ± 30 cm–1) infrarotes Licht in einem Spektralbereich von 2588 – 2528 cm–1 durch (maximale Transmission > 70 %).


Außerhalb dieses Bereiches blockierte der optische Filter fast das gesamte einfallende Licht (Transmission < 0,1 %).

Tabelle 5: Transmissionsbereiche der optischen Bandpassfilter F1 – F4 im MIR-ATR-Sensor.

Das elektrische Signal 𝐼𝐼 jedes Detektorelements (D1 – D4) stellte dabei die integrierte Intensität über den Transmissionsbereich des entsprechenden Filters (F1 – F4) dar, welcher sich vor dem jeweiligen Detektorelement befand (siehe Abbildung 10 (B)). Das Signal 𝐼𝐼 hing weiterhin von der Intensität der Lichtquelle und der Absorption der Probe an der Grenzfläche zum ATR-Prisma ab. Die vier Intensitätssignale wurden mit Hilfe eines Datenerfassungsmoduls (NI USB-6351, National Instruments) digitalisiert und auf einen Laptop übertragen. Verarbeitung, Visualisierung und Aufzeichnung der Daten erfolgte mittels LabVIEW [8]. Für jeden optischen Messkanal wurde die Absorption 𝐴𝐴 der Probe definiert als der negative dekadische Logarithmus aus dem Verhältnis zwischen der mit Probe gemessenen Intensität 𝐼𝐼 und einem Referenzsignal 𝐼𝐼0 (Gleichung 3-4). Das Referenzsignal 𝐼𝐼0 wurde dabei gegen Wasser aufgenommen.

𝐴𝐴 = −𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙10 �𝐼𝐼𝐼𝐼0� 3-4

Zur Überwachung der Hefe-Fermentationen wurde für eine optimale Signalstabilität als Algorithmus die schnelle Fourier-Transformation (englisch fast Fourier transform, FFT) auf die gemessenen Absorptionen der vergangenen 300 s angewendet. Diese Ansprechzeit konnte bei der Verfolgung eines Fermentationsprozesses mit einem Reaktionszeitraum von mehreren Stunden als ausreichend angesehen werden. Die mit dem MIR-ATR-Sensor erzeugten Messdaten (Absorptionen) wurden dabei jede Sekunde aufgezeichnet.

Zum direkten Vergleich des Sensors mit einem kommerziellen FT-MIR-Spektrometer (ALPHA FT-MIR-Spektrometer mit ATR-Durchflusszelle, Bruker Optik GmbH, vgl. Kapitel 3.2.1) wurden alle 3 min MIR-Spektren in einem Bereich von 700 – 4000 cm–1 aufgenommen. Die spektrale Auflösung betrug bei den durchgeführten Versuchen 4 cm–1 und jede Messung bestand aus 32 gemittelten Einzelspektren. Als Hintergrundspektrum diente ebenfalls eine Messung gegen Wasser, welche vor Beginn der Fermentation aufgenommen wurde. Die Datenerfassung erfolgte mit der firmeneigenen Software OPUS (Version 7.0, Bruker Optik GmbH). Die Überwachung der Hefe-Fermentationen mit dem entwickelten MIR-ATR-Sensor und dem kommerziellen MIR-ATR-Spektrometer erfolgte online in einem Bypass. Eine Schlauchpumpe (Typ Ismatec der Fa. Cole-Parmer GmbH) mit einem konstanten

Optischer Bandpassfilter Transmissionsbereich (cm–1) Transmissionsbereich (nm) F1 2558 ± 30 3909 ± 46 F2 1224 ± 19 8170 ± 127 F3 2966 ± 18 3372 ± 21 F4 1151 ± 14 8688 ± 105


Volumenstrom von 2,4 mL min–1 ermöglichte eine Zuführung des Fermentationsmediums vom Bioreaktor zu den Messgeräten. Beide optischen Analysensysteme waren hierfür mit einer Durchflusszelle ausgestattet [23]. Das Schema des Versuchsaufbaus ist in Abbildung 11 dargestellt.

Abbildung 11: Schematischer Aufbau zur Online-Überwachung von Hefe-Fermentationen mit dem

entwickelten MIR-ATR-Sensor und einem kommerziellen FT-MIR-Spektrometer in einem Bypass.

Kontaktlose Ramansonde 3.2.3

In Kooperation mit der BASF SE, dem Zentrum für Medizinische Forschung der Universität Heidelberg, der Fa. tec5 AG und der Fa. Gönnheimer Elektronic GmbH, wurde am Institut für Prozessmesstechnik und Innovative Energiesysteme der Hochschule Mannheim eine Ramansonde mit großer Brennweite entwickelt, welche auf einem koaxialen Sondenaufbau beruht [11]. Diese Sonde eignet sich sowohl zum Messen klarer als auch stark streuender Flüssigkeiten. Für die Überwachung der Hefefermentation war die Sonde dabei auf einem Lineartisch außerhalb des Reaktors befestigt und ermöglichte somit eine optimale Einstellung der effektiven Brennweite mit Fokus hinter der inneren Seite der Reaktorwand, welche aus 9 mm Borosilikat-Glas bestand. Aus Vorversuchen wurde eine optimale effektive Brennweite von ca. 2 mm ermittelt [110] und für die Fermentationsüberwachung eingestellt. Der optische Aufbau der Ramansonde basierte auf einem 1" Cage-System (Thorlabs Inc., Newton, USA) und die Brennweite betrug 25,4 mm. Die Simulation zur Optimierung des Strahlengangs wurde mit der Software OptiCAD® (OptiCAD Corporation, Santa Fe, USA) durchgeführt. Der optische Aufbau der Sonde mit Strahlengang ist in Abbildung 12 dargestellt.


Abbildung 12: Optischer Aufbau der kontaktlosen Ramansonde mit einer Brennweite von 25,4 mm zur Inline-

Ramananalyse. Die große Brennweite ermöglichte Messungen durch Schaugläser bzw. Glasmäntel von (Bio-)Reaktoren oder Rohrleitungen (siehe Grafik links oben).

Zur Anregung wurde ein 785 nm Diodenlaser mit 500 mW Ausgangsleistung verwendet (MultiSpec® Raman der Fa. tec5 AG). Das Laserlicht wurde von einem FC/APC-Anschluss über einen 200 µm NIR-Lichtwellenleiter aus Quarz (NA 0,22 der Fa. Edmund Optics GmbH, Mainz, Deutschland) mittels SMA-Anschluss an die Sonde gekoppelt. Anschließend wurde das monochromatische Laserlicht (grün dargestellt) von einer 1" Plankonvexlinse parallelisiert. Danach erfolgte ein sogenannter „Clean-up“ durch einen Schmalband-Filter (Semrock Inc., Rochester, USA), wobei nur die Emissionswellenlänge den Filter passierte und Nebenemissionen der Laserdiode geblockt wurden. Daraufhin leitete ein Umlenkspiegel das kollimierte Laserlicht auf einen dichroitischen Strahlenteiler (Semrock Inc.) weiter. Dieser war so konzipiert, dass das Laserlicht zur Raman-Anregung am Strahlenteiler reflektiert und auf eine zweite 1" Plankonvexlinse geführt wurde, welche das monochromatische Laserlicht fokussiert. Aufgrund des geringen Wirkungsquerschnitts der Raman-Streuung werden die Photonen des Laserlichtes nur mit einer geringen Wahrscheinlichkeit unelastisch gestreut. Diese langwellig verschobenen Photonen tragen zum Ramansignal (rot dargestellt) bei.

Die Sammeleffizienz einer Ramansonde ist abhängig vom Verhältnis aus Durchmesser zu Brennweite der Frontlinse. Um diese Sammeleffizienz konstant zu halten, lässt sich die Brennweite nur erhöhen, wenn auch der Linsendurchmesser der Frontlinse vergrößert wird. Alle in dieser Sonde verwendeten 1" Plankonvexlinsen besaßen eine Brennweite von 25,4 mm (Linsendicke: 11,7 mm, freie Gegenstandsweite: 17,6 mm = freier Abstand von Linse zu Brennpunkt). Die Wellenlänge des an der Probe unelastisch gestreuten Laserlichtes (Stokes-Shift bzw. Raman-Streuung), ist langwelliger als die Anregungswellenlänge von 785 nm. Von der Probe wurde sowohl das elastisch gestreute Licht (Rayleigh-Streuung) als

785 nmdichroitischer Strahlenteiler

Umlenk-spiegel

785 nm Notch-Filter

785 nm Laserlinien-Filter

Plankonvexlinse

Plankonvexlinse

Raman Spektrometer

785 nmDiodenlaser

Probenraum

9 mm Borosilikatglas

6 mm Brennweite (Standard Immersionssonde)

25.4 mm Brennweite(kontaktlose Ramansonde)

Plankonvex-Linse


auch das unelastisch gestreute Licht reflektiert und über die Frontlinse der Ramansonde kollimiert. Anschließend durchdrang das Licht den dichroitischen Spiegel, wobei ein Großteil des elastisch gestreuten Laserlichtes reflektiert wurde. Da jedoch ein Teil der wesentlich intensiveren Rayleigh-Streuung den Strahlenteiler passierte, wurde das Licht zusätzlich durch einen 785 nm Notch-Filter (Semrock Inc.) geleitet, um das elastisch gestreute Laserlicht zusätzlich zu blocken. Im Gegensatz dazu passierte die langwelligere Raman-Streuung den 785 nm Notch-Filter und wurde über eine weitere 1" Plankonvexlinse fokussiert. Anschließend wurde das erzeugte Ramansignal über einen 600 µm NIR-Lichtwellenleiter aus Quarz (NA 0,22 der Fa. Edmund Optics GmbH) auf einen peltiergekühlten CCD-Array-Detektor (MultiSpec® Raman, tec5 AG, s. Kapitel 3.2.1) abgebildet [11].

Die innerhalb des Bioreaktors an der Messstelle ankommende Laserleistung betrug 140 mW (Bestimmung mittels PowerMax/FieldMaxII, Fa. Coherent Inc.). Die Messdatenerfassung erfolgte mit der Software MultiSpec® Pro II (tec5 AG). Es wurde jede Minute ein Spektrum mit einem Spektralbereich von 350 bis 3200 cm–1, einer Integrationszeit von 30 s und einer Auflösung von 7 cm–1 aufgenommen. Das weitere Vorgehen beim Einsatz der kontaktlosen Ramansonde war identisch mit der Beschreibung in Kapitel 3.2.1, Abschnitt Raman-Messsystem. Der schematische Aufbau zur kontaktlosen Fermentationsüberwachung ist in Abbildung 13 dargestellt [70].

Abbildung 13: Schematischer Aufbau zur Inline-Überwachung von Hefe-Fermentationen mit einer

kontaktlosen Ramansonde sowie ein Foto des realisierten Aufbaus (rechts oben). Der Lineartisch ermöglichte eine auf den Prozess optimierte Einstellung der effektiven Brennweite.

Rührer

785 nm Diodenlaser

CCD-Array

kontaktlose Ramansonde

9 mm Borosolikat-Glasmantel Raman-Spektrometer-System

Lineartisch

6 L-Bioreaktor

Lichtleiter

6 L Bioreaktor

Nicht-invasive Ramansonde

6 L-Bioreaktorkontaktlose

Ramansonde


3.3 MLR-Auswertung

Datenkonvertierung 3.3.1

Die Analyse der Daten mittels Multipler Linearer Regression (MLR) wurde mit Hilfe der RGP-Funktion in Excel (Microsoft Corporation, Redmond, USA) durchgeführt. Bevor mit den erhaltenen MIR- und Raman-Daten die MLR-Modelle erstellt wurden, bedurfte es verschiedener Datenkonvertierungen für die Überführung und Bearbeitung in Excel. Die Raman-Spektren wurden mit der Software MultiSpec® Pro II erzeugt und lagen als .txt-Dateien vor. Dagegen wurden die MIR-Spektren mit der Software OPUS aufgenommen und als .0-Dateien gespeichert. Bei beiden Programmen wurde für jedes aufgenommene Spektrum eine einzelne Datei erzeugt, sodass pro Fermentation mehrere hundert Dateien generiert wurden.

Die Datenkonvertierung der MIR-ATR-Sensorsignale erfolgte über ein LabVIEW-Programm. Hierbei wurden zunächst die Sensordaten in das Programm eingelesen und in eine TDMS-Datei umgewandelt. Dieses Dateiformat konnte dann in Excel geöffnet und somit für die MLR verwendet werden. Von einer detaillierten Beschreibung der Datenkonvertierung wurde an dieser Stelle abgesehen, da das zur Verwendung genutzte LabVIEW-Programm bereits im Rahmen einer früheren Arbeit entwickelt und vorgestellt wurde ([8]).

Konvertierung der Raman-Spektren

Die erzeugten .txt-Dateien konnten mit Hilfe des Microsoft Editors geöffnet und gelesen werden. In Abbildung 14 ist eine solche Textdatei dargestellt. Hierbei sind alle relevanten Daten einer Messung angegeben: das Datum (grün), die Uhrzeit (rot), der selbst gewählte Name der Messreihe (blau), der Ramanshift in Wellenzahlen (schwarz) und die dazugehörigen detektierten Intensitäten (orange).

Abbildung 14: Mit dem Microsoft Editor geöffnete .txt-Datei welche durch Aufnahme eines Raman-Spektrums

mit der Software MultiSpec® Pro II erzeugt wurde [110].


Um die einzelnen .txt-Dateien nicht einzeln von Hand mit dem Editor öffnen, kopieren und in Excel einfügen zu müssen, wurde ein VBA-Makro erstellt, welches diese Aufgabe übernimmt [110].

Zur Durchführung des Makros öffnete man das Excel-File „Import_Daten_RAMAN“ und betätigte das Feld „Daten importieren“. Daraufhin erschien ein Fenster, in welchem man den Ordner auswählte, in dem sich die zu konvertierenden .txt-Dateien befanden und bestätigte die Auswahl mit „OK“. Anschließend wurden im ausgewählten Ordner alle Inhalte der .txt-Dateien nebeneinander in ein neues Blatt „Daten“ eingefügt. Dieser Schritt ist exemplarisch in Abbildung 15 dargestellt.

Abbildung 15: Mit Hilfe eines VBA-Makros als .txt-Dateien in Excel importierte Raman-Spektren.

Um eine korrekte zeitliche Reihenfolge bei der Übertragung der erstellten .txt-Dateien auf verschiedene Speichermedien zu gewährleisten, wurde folgendermaßen vorgegangen: Namen im entsprechenden Ordner alphabetisch sortieren, Bereich markieren, Rechtsklick auf die erste/oberste Datei, kopieren und in den Zielordner einfügen. Wenn diese Schritte nicht sorgfältig durchgeführt wurden, konnte es sein, dass die zeitliche Reihenfolge in der erzeugten Excel-Tabelle nicht stimmt.

Für die Auswertung der Daten in Excel wurden alle redundanten Spalten mit den Wellenzahlen zwischen den Intensitäten gelöscht, so dass nur noch einmal in Spalte A der Ramanshift in Wellenzahlen angegeben war. Dies erfolgte durch Betätigung des „Spalten zwischen den Werten löschen“-Feldes im Blatt „Eingabemaske“. Das Ergebnis der konvertierten Raman-Daten für die MLR ist beispielhaft in Abbildung 16 dargestellt.


Abbildung 16: Mit Hilfe eines VBA-Makros als .txt-Dateien in Excel konvertierte und um redundante

Wellenzahl-Spalten reduzierte Raman-Spektren zur MLR-Auswertung.

Konvertierung der MIR-Spektren

Zur Durchführung der MLR-Kalibration und -Analyse mussten die MIR-Daten, welche als .0-Dateien vorlagen, zunächst in .txt-Dateien umgewandelt werden. Hierbei nutzte man die Software OPUS und wählte in der Menüleiste „Makro/Sequenz ausführen“ das Makro „opus2xy.obs“ aus (Abbildung 17).

In dem Bedienfeld des Makros „opus2xy.obs“ wählte man nun den Speicherort aus, in dem sich die umzuwandelnden .0-Dateien befanden. In Abbildung 18 ist beispielhaft der Ordner C:\test mit zehn Textdateien gezeigt. Durch Betätigung des Feldes „Convert“ wurden die .0-Dateien von OPUS in .txt-Dateien konvertiert und standardmäßig in den Ordner C:\opusconvert\ eingefügt, wobei der Ablageort entsprechend abgeändert werden konnte (s. „OutputPath“ in Abbildung 18).


Abbildung 17: Bedienoberfläche der Software OPUS mit dem ausgewählten Makro „opus2xy.obs“ zur

Konvertierung von .0-Dateien in .txt-Dateien.

Abbildung 18: Bedienoberfläche des Makros „opus2xy.obs“ mit beispielhaft ausgewählten .0-Dateien. Durch

Betätigung des Feldes „Convert“ wurden diese in .txt-Dateien konvertiert, welche zur MLR-Auswertung in Excel benötigt wurden.


Zur Übertragung dieser .txt-Dateien in Excel wurde ebenfalls ein VBA-Makro erstellt, welches diese Aufgabe übernahm [110]. Das Vorgehen war dabei weitestgehend identisch mit dem in Abschnitt Konvertierung der Raman-Spektren (ebenfalls Kapitel 3.3.1) beschriebenen Ablauf, mit der Ausnahme, dass automatisch alle überflüssigen Spalten zwischen den gemessenen Absorptionen gelöscht wurden (Abbildung 19).

Abbildung 19: Mit Hilfe eines VBA-Makros als .txt-Dateien in Excel konvertierte und um redundante

Wellenzahl-Spalten reduzierte MIR-Spektren zur MLR-Auswertung.

Erstellung von MLR-Modellen 3.3.2

Ein MLR-Kalibrationsmodell beschreibt einen linearen Zusammenhang zwischen Analytkonzentration (Regressand) und der gemessenen spektralen Information (Regressor) [115]. Die gemessenen spektralen Informationen stellten Absorptionen im Fall der MIR-Spektroskopie und Intensitäten im Fall der Raman-Spektroskopie dar. Zur Datenauswertung wurden 2D- und 4D-MLR-Kalibrationsmodelle erstellt. Bei den 2D-MLR-Modellen wurden jeweils ein analytspezifischer Spektralbereich (bspw. ein Glucose-Messkanal) und ein spektral benachbarter Referenzbereich (bspw. ein Glucose-Referenzkanal) verwendet, wodurch die Auswertung analytspezifisch erfolgte. Bei den 4D-MLR-Modellen wurden vier Spektralbereiche (jeweils zwei Mess- und Referenzkanäle, bspw. für Glucose und Ethanol) verwendet, wodurch die Auswertung nicht nur auf einem Analyten basierte. Eine Datenauswertung mit Hilfe der MLR ermöglichte damit einerseits die Auswertung bereits realisierter Sensoraufbauten, bei welchem die Signale aus den vier optischen Bandpassfiltern verwendet wurden (vgl. Kapitel 3.2.2, Tabelle 5). Andererseits konnte eine solche Datenauswertung auch zu einer Simulation von Photometer- bzw. Sensor-Konzepten herangezogen werden, indem jeweils die Absorptionen bzw. Intensitäten innerhalb der zwei bzw. vier festgelegten Spektralbereiche verwendet wurden (vgl. Kapitel 4, Tabelle 6 und Tabelle 13).


Beispielhaft sei hier die allgemeine Gleichung für ein 4D-MLR-Modell gegeben:

𝑐𝑐 = 𝑎𝑎 + 𝛽𝛽𝑆𝑆1 ∙ 𝑥𝑥𝑆𝑆1 + 𝛽𝛽𝑆𝑆2 ∙ 𝑥𝑥𝑆𝑆2 + 𝛽𝛽𝑆𝑆3 ∙ 𝑥𝑥𝑆𝑆3 + 𝛽𝛽𝑆𝑆4 ∙ 𝑥𝑥𝑆𝑆4, 3-5

wobei 𝑐𝑐 den Regessanden (jeweilige Analytkonzentration), 𝑎𝑎 das Absolutglied (Achsenabschnitt), 𝛽𝛽𝑖𝑖 die Regressionskoeffizienten (Steigungen) und 𝑥𝑥𝑖𝑖 die Regressoren (Absorptionen bzw. Intensitäten in den festgelegten Spektralbereichen; 𝑖𝑖 = S1, S2, S3, S4, Zuordnung siehe z.B. Kapitel 4.1.3, Tabelle 6) darstellten.

Um ein MLR-Kalibrationsmodell zu erstellen, wurden die gemessenen Absorptionen bzw. Intensitäten zu den Zeiten der Probennahme innerhalb der zwei bzw. vier Spektralbereiche gemittelt. Für ein Kalibrationsmodell wurden neben den spektralen Informationen die entsprechenden Referenzkonzentrationen der Analyten (vgl. Kapitel 3.1.3) aus drei Fermentationen herangezogen. Da bei jeder einphasigen Fermentation 14 Proben und bei jeder zweiphasigen Fermentation 21 Proben entnommen wurden (vgl. Kapitel 3.1.2), bestand ein Kalibrationsmodell daher aus jeweils 42 bzw. 63 Konzentrationswerten pro Analyt sowie aus 42 bzw. 63 spektralen Informationen, welche zu den entsprechenden Probennahmezeiten zur Verfügung standen. Mit Hilfe der RGP-Funktion in Excel wurden nun die spektralen Informationen auf die Analytkonzentrationen aus der Referenzanalytik kalibriert, um die Regressionskoeffizienten und das Absolutglied zu berechnen.

Ein so erstelltes MLR-Kalibrationsmodell wurde anschließend genutzt, um Analytkonzentrationen anhand der spektralen Informationen einer weiteren Fermentation vorherzusagen, welche nicht im Kalibrationsdatensatz enthalten waren. Dabei wurde zu jeder Messzeit die jeweilige Analytkonzentration nach Gleichung 3-5 aus den entsprechenden spektralen Informationen mit Hilfe der aus dem MLR-Modell erhaltenen Regressionskoeffizienten und des Absolutglieds berechnet. Anschließend wurden die Fehlerquadrate zwischen den Analytkonzentrationen und den Referenzwerten ermittelt, womit im Anschluss die Qualitätsparameter RMSEC, RMSEP und das Bestimmtheitsmaß R2 berechnet wurden (vgl. Kapitel 2.2.3 bzw. Kapitel 4, Tabelle 9, Tabelle 12 und Tabelle 14).

3.4 PLS-Auswertung

Datenkonvertierung 3.4.1

Die Datenanalyse mithilfe der Partial Least Squares Regression (PLS-R) wurde mit der Software OPUS (Version 7.0, Bruker Optik GmbH) durchgeführt. Das Programm benötigte die spektralen Daten in Form von .0-Dateien. Da die MIR-Spektren bereits mit OPUS aufgenommen und daher als .0-Dateien vorlagen, bedurfte es für die MIR-Daten keiner zusätzlichen Konvertierung.


Konvertierung der Raman-Spektren

Für die PLS-R mussten die Raman-Daten, welche als .txt-Dateien vorlagen, in .0-Dateien umgewandelt werden. Dazu öffnete man die Software OPUS und wählte in der Menüleiste „Makro/Sequenz ausführen“ aus. Dadurch öffnete sich ein Fenster, in welchem man das Makro „jcamp2opus_Name.obs“ auswählte und mit dem Feld „Öffnen“ bestätigte (Abbildung 20).

Abbildung 20: Bedienoberfläche der Software OPUS mit dem ausgewählten Makro

„jcamp2opus_Name.obs“ zur Konvertierung von .txt-Dateien in .0-Dateien.

Das weitere Vorgehen war identisch mit dem in Kapitel 3.3.1, Abschnitt Konvertierung der MIR-Spektren, wobei hier die .txt-Dateien von OPUS in .0-Dateien konvertiert wurden.

Die zu .0-Dateien konvertierten Daten konnten durch einfaches „Drag and Drop“ in OPUS übertragen und für die PLS genutzt werden. Hierbei war, wie bereits in Kapitel 3.3.1 beschrieben, auf eine korrekte zeitliche Reihenfolge der in OPUS geladenen Dateien zu achten.

Erstellung von PLS-Modellen 3.4.2

Die Durchführung der Partial Least Squares Regression (PLS-R) erfolgte mit der Quant 2 Methode in der Software OPUS. Für die Erstellung eines PLS-Kalibrationsmodells wurden Informationen (Spektren + entsprechende Referenzkonzentrationen der Analyten) aus drei Fermentationen herangezogen. Hierbei wurden die spektralen Informationen auf die


Analytkonzentrationen aus der Referenzanalytik kalibriert. Da bei jeder Fermentation 21 Proben entnommen wurden, bestand ein Kalibrationsmodell daher aus jeweils 63 Konzentrationswerten für den jeweiligen Analyten (z.B. Glucose) sowie aus 63 Spektren, welche zu den entsprechenden Probennahmezeiten aufgenommen wurden. Ein solch erstelltes PLS-Kalibrationsmodell wurde anschließend genutzt, um Analytkonzentrationen anhand der spektralen Informationen einer weiteren Fermentation vorherzusagen, welche nicht im Kalibrationsdatensatz enthalten waren.

Um ein solches PLS-Kalibrationsmodell in OPUS zu erstellen, verwendete man die sogenannte Quant 2 Methode über die Option „Quant 2 Methode erstellen“ (Abbildung 21).

Abbildung 21: Erstellung eines PLS-Kalibrationsmodells mit Hilfe der Quant 2 Methode in OPUS.

In dem daraufhin geöffneten Fenster mussten unter dem Reiter „Komponenten“ die Analyten, die analysiert werden sollten (Glucose, Ethanol und BTM) sowie deren Einheiten (g L–1), hinzugefügt werden (Abbildung 22).

Anschließend wurden unter dem nächsten Reiter „Spektren“ die Raman- bzw. MIR-Spektren zu den entsprechenden Probennahmezeiten von drei Fermentationen geladen und die jeweils passenden Analytkonzentrationen aus der Referenzanalytik (HPLC bzw. Gravimetrie, s. Kapitel 3.1.3) in die Spalten „Glucose“, „Ethanol“ und „BTM“ eingefügt (Abbildung 23).

Im nächsten Reiter „Parameter“ konnte nun ausgewählt werden, welche Art der Datenvorbehandlung (siehe hierzu Abschnitt Spektrenvorbehandlung in Kapitel 3.4.2)


durchgeführt werden sollte. Zudem konnten ein oder mehrere Spektralbereiche, die zur PLS-Kalibration verwendet werden sollten (vgl. Kapitel 4.1.3), ausgewählt werden (Abbildung 24).

Abbildung 22: Hinzufügen der zu analysierenden Komponenten für ein PLS-Kalibrationsmodell mit Hilfe der

Quant 2 Methode.

Abbildung 23: Hinzufügen der Spektren zu den entsprechenden Probennahmezeitpunkten aus drei

Fermentationen sowie die jeweils passenden Analytkonzentrationen aus der Referenzanalytik zur Erstellung eines PLS-Kalibrationsmodells.


Abbildung 24: Auswahl der Datenvorbehandlung sowie Festlegung der Spektralbereiche zur Erstellung eines

PLS-Kalibrationsmodells.

Danach wurde das PLS-Kalibrationsmodell mittels Kreuzvalidierung bewertet (Prinzip der „leave-one-out-cross-validation“, Reiter „Validieren“, vgl. Kapitel 2.2.3) und das Ergebnis unter dem Reiter „Grafik“ angezeigt (siehe Abbildung 25, Beispiel Ethanol).

Unter dem Reiter „Report“ waren u.a. die Referenz- („Wahr“) und Vorhersagewerte der einzelnen Analyten zu den Probennahmezeiten aufgelistet. Diese ließen sich durch Auswahl des linken oberen Rechtecks manuell markieren (Abbildung 26), kopieren und anschließend in eine Exceldatei einfügen, in welcher die Modellparameter RMSEC und R2 berechnet wurden.

Aus dem nächsten Reiter „Methode speichern“ konnte für alle drei Komponenten der RMSECV entnommen werden. Außerdem wurde hier das erstellte PLS-Kalibrationsmodell als Methode gespeichert.


Abbildung 25: Grafische Darstellung des Ergebnisses der Kreuzvalidierung für Ethanol zur Erstellung eines PLS-

Kalibrationsmodells.

Abbildung 26: Tabellarische Darstellung des Ergebnisses der Kreuzvalidierung für Ethanol zur Erstellung eines

PLS-Kalibrationsmodells.


Um mit einem PLS-Kalibrationsmodell Analytkonzentrationen anhand der spektralen Informationen einer weiteren Fermentation vorherzusagen, welche nicht im Kalibrationsdatensatz enthalten waren, wurde die Option „Quant 2 Analyse / Dateiliste“ (siehe Abbildung 21) ausgewählt. Dort wurde eine vorher erstellte Methode über „Methode hinzufügen“ geladen (Abbildung 27).

Anschließend wurden unter „Spektren“ die Raman- bzw. MIR-Spektren einer vorherzusagenden Fermentation geladen (Abbildung 28). Wie bereits erwähnt, waren bei dieser externen Validierung die ausgewählten Spektren nicht im PLS-Kalibrationsmodell enthalten.

Im Reiter „Analyse-Ergebnisse“ wurde durch Betätigen des Feldes „Analysieren“ die externe Validierung/Vorhersage durchgeführt (Abbildung 29). Die Vorhersage-Ergebnisse für die drei Analyten waren im gleichen Reiter tabellarisch gelistet und konnten ebenfalls (durch Auswahl des linken oberen Rechtecks in der Tabelle) in eine Exceldatei kopiert werden. In der Exceldatei erfolgte anschließend die Berechnung der Modellparameter RMSEP und R2.

Abbildung 27: Hinzufügen eines erstellten PLS-Kalibrationsmodells zur Methode „Quant 2 Analyse /

Dateiliste“ in OPUS zur Vorhersage der Glucose-, Ethanol- und BTM-Konzentrationen.


Abbildung 28: Quant 2 Analyse in OPUS zur Vorhersage von Analytkonzentrationen mittels PLS-

Kalibrationsmodell anhand von Spektren einer weiteren Fermentation, welche nicht im Kalibrationsdatensatz enthalten waren.

Abbildung 29: Tabellarische Darstellung des Ergebnisses der Quant 2 Analyse in OPUS zur Vorhersage der

Glucose-, Ethanol- und BTM-Konzentrationen mittels PLS-Kalibrationsmodell anhand von Spektren einer weiteren Fermentation, welche nicht im Kalibrationsdatensatz enthalten waren.


Spektrenvorbehandlung

Zusätzlich zum Einschränken der Spektralbereiche konnte bei der Erstellung von PLS-Kalibrationsmodellen auch noch eine spektrale Datenvorbehandlung vorgenommen werden (vgl. Abbildung 24). Durch eine Datenvorbehandlung konnten die Spektren so behandelt werden, dass mögliche Störungen minimiert bzw. eliminiert und spezifische Informationen verstärkt wurden. Für diese Arbeit wurden verschiedene Datenvorbehandlungen untersucht: Subtraktion einer Geraden, erste Ableitung, zweite Ableitung und Vektornormierung [109]. Durch die Subtraktion einer Geraden konnte eine Basislinienverschiebung kompensiert werden. Um die Gerade in dem jeweiligen Spektralbereich zu bestimmen, wurde die Methode der kleinsten Fehlerquadrate verwendet. Die Bildung der ersten Ableitung der Spektren bewirkte, dass konstante Offsets kompensiert und Signale mit einem steilen Anstieg hervorgehoben wurden. Diese Methode verwendet man, wenn relativ kleine scharfbandige Signale von einem dominanten, breiten Untergrund getrennt werden sollen. Mithilfe der zweiten Ableitung konnte man schräge Offsets kompensieren. Jedoch nahm bei dieser Art der Datenvorbehandlung das Rauschen stark zu, weshalb sie nur für eingeschränkte Spektralbereiche geeignet war. Bei der Vektornormierung wurden die Spektren zentriert, dann die Summe aller Quadrate der Y-Werte gebildet und anschließend die Spektren durch die jeweiligen Wurzeln dieser Summe dividiert. Bei dieser Methode wurden die Signalhöhen normiert, wodurch die Schichtdicken der Proben keinen Einfluss mehr auf die spektralen Informationen ausübten, da die strukturellen Informationen gleich blieben [82].

Um die beste Datenvorbehandlung heraus zu finden, wurden verschiedene PLS-Modelle (wie oben beschrieben) erstellt und anschließend der RMSECV verglichen. Dabei lieferte die Vektornormierung die kleinsten RMSECV-Werte sowohl bei der Raman- als auch bei der MIR-Spektroskopie welche daher (neben der PLS-Auswertung ohne Datenvorbehandlung) als einzige Datenvorbehandlung für den Methodenvergleich ausgewählt wurde [109, 114].

4 Ergebnisse 57

4 Ergebnisse

4.1 Prozessverfolgung einer zweiphasigen Hefefermentation mittels MIR-ATR- und Raman-Spektroskopie

Referenzanalytik 4.1.1

Insgesamt wurden vier zweiphasige Batch-Fermentationen von S. cerevisiae unter identischen Kultivierungsbedingungen durchgeführt (vgl. Kapitel 3.1.2). Die mit der Referenzanalytik (vgl. Kapitel 3.1.3) ermittelten zeitlichen Konzentrationsverläufe für Glucose, Ethanol und Biomasse (Zuwachs an Biomasse, angegeben in BTM) sind für die vier Fermentationen in Abbildung 30 dargestellt. Die einzelnen Konzentrationswerte sind im Anhang A (Tabelle 19) aufgelistet.

Abbildung 30: Mittels Referenzanalytik ermittelte zeitliche Konzentrationsverläufe für Glucose (HPLC), Ethanol

(HPLC) und Biomasse (Gravimetrie; Biomasse entspricht hier dem Zuwachs in BTM) für vier Batch-Fermentationen von Saccharomyces cerevisiae.

Die Fermentationen waren gut reproduzierbar, welches die Messergebnisse der Referenzanalytik zeigen. Während der ersten Phase der Hefefermentation wurde die Kohlenstoffquelle Glucose hauptsächlich in Ethanol, Biomasse und Kohlenstoffdioxid verstoffwechselt [116]. Die bei einer aeroben Fermentation unübliche Ethanolbildung kann, aufgrund der hohen Glucosekonzentration, auf die Umstellung des Metabolismus von oxidativ auf oxidoreduktiv zurückgeführt werden (Crabtree-Effekt, vgl. Kapitel 2.3.2) [117,

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0

10

20

30

0 2 4 6 8 10

Kon

zent

ratio

n Et

hano

l, B

iom

asse

(g L

−1)

Kon

zent

ratio

n G

luco

se (g

L−1

)

Fermentationsdauer (h)

Fermentation 1Fermentation 2Fermentation 3Fermentation 4

Glucose

Ethanol

Biomasse

4 Ergebnisse 58

118]. Wie man in Abbildung 30 erkennt, wurde die anfängliche Glucosekonzentration von 30 g L–1 innerhalb der ersten ca. 2,5 h in eine Ethanolkonzentration von etwa 10 g L–1 umgewandelt, wobei der Biomassezuwachs (in BTM) in dieser Zeit etwa 5 g L–1 betrug. Nach der vollständigen Verstoffwechselung von Glucose blieb die Biomassekonzentration für etwa 3 h nahezu konstant. In diesem Zeitraum erfolgte primär der Abbau von gebildeten Nebenkomponenten wie Pyruvat, Glycerin und Acetat sowie eine parallel dazu verlaufende enzymatische Anpassung der Hefezellen, mit dem Ziel, das vorher produzierte Ethanol als neue Kohlenstoffquelle zu nutzen (wobei bereits ein Teil des Ethanols abgebaut wird) [116, 119]. Nach der Stoffwechselumstellung wurde in einem Fermentationszeitraum zwischen ca. 6 – 9,5 h das verbliebene Ethanol vollständig zu Biomasse und CO2 umgewandelt [116, 119], wobei die BTM-Konzentration auf etwa 10 g L–1 anstieg. Ein solches zweiphasiges Wachstumsverhalten (erste Phase: Wachstum auf Glucose, zweite Phase: Wachstum überwiegend auf Ethanol) wird auch als Diauxie bezeichnet und beruht auf dem Mechanismus der Katabolitrepression (vgl. Kapitel 2.3.2). Nach 10 h wurden die Fermentationen beendet, da Ethanol als Kohlenstoffquelle aufgebraucht war.

Reinstoffspektren von Glucose und Ethanol 4.1.2

In Abbildung 31 sind die MIR-Absorptionsspektren von Glucose (30 g L–1) und Ethanol (10 g L–1), mit den maximal während der Fermentation vorhandenen Konzentrationen dargestellt. Als Bezugsspektrum diente hierbei VE-Wasser.

Abbildung 31: FT-MIR-Spektren von 30 g L–1 Glucose und 10 g L–1 Ethanol mit VE-Wasser als Bezugsspektrum.

-0,005

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

700100013001600190022002500280031003400

Abso

rptio

n

Wellenzahl (cm−1)

Glucose Ethanol

C-H-Streck-

schwingung

C-O-Streck-

schwingung

800900100011001200

4 Ergebnisse 59

Stark ausgeprägte und charakteristische Absorptionsbanden befanden sich für beide Analyten in einem Spektralbereich zwischen ca. 850 – 1200 cm–1. Hierbei wies Glucose den stärksten Peak bei ca. 1030 cm–1 sowie vier weitere niedrigere Absorptionsmaxima bei ca. 990 cm–1, 1080 cm–1, 1100 cm–1 und 1150 cm–1 auf, welche primär auf C-O-Streckschwingungen zurückzuführen waren [43, 120]. Im Vergleich dazu wies Ethanol zwei markante Peaks bei ca. 1040 cm–1 und 1090 cm–1 auf, welche ebenfalls durch C-O-Streckschwingungen hervorgerufen wurden und besaß darüber hinaus noch eine C-C-Streckschwingung bei ca. 880 cm–1 [43, 48, 67]. Die teilweise spektrale Überlappung der Absorptionspeaks wurde dabei durch das gleichzeitige Vorhandensein von verschiedenen C-O-Streckschwingungen in Glucose und Ethanol verursacht. Des Weiteren wiesen beide Analyten vergleichsweise geringe Absorptionsbanden zwischen 2800 – 3000 cm–1 auf, welche verschiedenen C-H-Streckschwingungen von aliphatischen Kohlenwasserstoff-bindungen zugeordnet werden konnten [38]. Der scharfe Ethanolpeak bei etwa 2980 cm–1 wurde dabei durch die Methylgruppe in diesem Analyten hervorgerufen [121].

In Abbildung 32 sind Raman-Spektren der Analyten Glucose und Ethanol mit VE-Wasser als Bezugsspektrum dargestellt.

Abbildung 32: Raman-Spektren von 30 g L–1 Glucose und 10 g L–1 Ethanol mit VE-Wasser als Bezugsspektrum.

Intensive und analytspezifische Ramanpeaks befanden sich sowohl für Ethanol als auch für Glucose in einem Spektralbereich zwischen ca. 350 – 1200 cm–1. Da der scharfe Peak bei etwa 880 cm–1 aus einer symmetrischen C-C-Streckschwingung von Ethanol resultiert und solche unpolaren Bindungen gut polarisierbar sind, war diese Bande – im Vergleich zur MIR-

-1,0E+03

1,0E+03

3,0E+03

5,0E+03

300700110015001900230027003100

Inte

nsitä

t

Ramanshift (cm−1)

Glucose Ethanol

Gerüst-schwingung

C-C-Streck-

schwingung

C-O-Streck-

schwingungC-H-

Streck-schwingung

800900100011001200

4 Ergebnisse 60

Spektroskopie (vgl. Abbildung 31) – im Raman-Spektrum sehr stark ausgeprägt [64, 67, 69]. Die charakteristischen Ramanpeaks für Glucose in einem Bereich zwischen 350 – 600 cm–1 wurden hauptsächlich durch Schwingungen des Molekülgerüstes hervorgerufen [122, 123]. Des Weiteren wurden – wie auch in den MIR-Spektren – die intensiven Peaks bei ca. 1060 cm–1 und 1125 cm–1 für Glucose [43, 120] sowie bei etwa 1045 cm–1und 1090 cm–1 für Ethanol [43, 48, 67] primär durch C-O-Streckschwingungen verursacht. Dagegen waren in einem Spektralbereich zwischen 1500 – 2700 cm–1 die gemessenen Ramanspektren für beide Analyten nahezu identisch. Wie auch bei der MIR-Spektroskopie konnten die Ramanpeaks zwischen 2800 – 3000 cm–1 verschiedenen C-H-Streckschwingungen von aliphatischen Kohlenwasserstoffbindungen zugeordnet werden [38], während die scharfe Bande bei etwa 2935 cm–1 auf der Methylgruppe von Ethanol basierte [121].

Auswahl der Spektralbereiche für die PLS- und MLR-Auswertung 4.1.3

Bei der Erstellung eines PLS-Kalibrationsmodells bestand die Möglichkeit, nur bestimmte Spektralbereiche für die Regression zu verwenden (vgl. Kapitel 3.4.2, Abbildung 24). In Abbildung 33 sind beispielhaft unbearbeitete MIR-Spektren einer zweiphasigen Batch-Fermentation von S. cerevisiae (vgl. Kapitel 3.1.2) zu verschiedenen Zeitpunkten dargestellt.

Abbildung 33: Unbehandelte FT-MIR-Spektren zu verschiedenen Zeitpunkten während einer zweiphasigen

Batch-Fermentation von S. cerevisiae.

Da Wasser im MIR-Bereich stark absorbiert und die Fermentationsmatrix zu über 90 % daraus bestand, wurden die Spektren von vier Wasserbanden dominiert. Diese lagen bei etwa 3300 cm–1 (O-H-Streckschwingung), 2200 cm–1 (Kombination aus O-H-

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

700100013001600190022002500280031003400

Abso

rptio

n

Wellenzahl (cm−1)

t = 0 h t = 1,5 h t = 3 h t = 10 h

O-H-Streck-

schwingung von H2O

asymmetrische O=C=OStreck-

schwingung von CO2

O-H-Deformatios-schwingung

von H2O

H-Brücken von H2O

Kombinations-schwingung

von H2O

Wasser-dampf

4 Ergebnisse 61

Deformationsschwingung und H-Brückenschwingung), 1650 cm–1 (O-H-Deformationsschwingung) und unterhalb von 800 cm–1 (H-Brückenschwingung) [13, 16, 67, 69]. Des Weiteren erkennt man eine Bande bei ca. 2350 cm–1 (asymmetrische O=C=O Streckschwingung), welche durch gelöstes bzw. gasförmiges Kohlendioxid im Medium bzw. im Strahlengang des Spektrometers hervorgerufen wurde. Zusätzlich verstärkte sich das Rauschen um den Wasserpeak bei 1650 cm–1 mit zunehmender Fermentationszeit, was auf in das Spektrometer eindringenden Wasserdampf zurückzuführen war und durch einen unabhängigen Versuch bestätigt werden konnte.

Charakteristische Absorptionsbanden von Ethanol und Glucose sind in einem Bereich zwischen ca. 800 – 1400 cm–1 zu finden (vgl. Abbildung 31). Dieser in Abbildung 33 eingerahmte Spektralbereich ist zur Verdeutlichung nochmals in Abbildung 34 dargestellt, wobei von den Spektren zuvor das Bezugsspektrum (Medium mit Hefe, ohne Zucker) und eine Gerade zur Korrektur des Offsets abgezogen wurde. Um den Fermentationsverlauf anschaulich darzustellen, wurden lediglich die Spektren zu den Zeitpunkten 0 h (Beginn der Fermentation), 1,5 h (Glucose fast abgebaut), 3 h (keine Glucose, nahezu maximale Konzentration an Ethanol) und 10 h (Ende der Fermentation) ausgewählt. Aufgrund der Lage der Absorptionsbanden von Ethanol und Glucose wurde der Spektralbereich für die PLS-Auswertung der MIR-Spektren auf 850 – 1250 cm–1 eingeschränkt, wo hauptsächlich C-O-Streckschwingungen liegen. Dadurch wurden Störeinflüsse wie Wasser(-dampf) und Kohlendioxid nicht in die PLS-Kalibration mit einbezogen.

Abbildung 34: FT-MIR-Spektren zu verschiedenen Zeitpunkten einer zweiphasigen Batch-Fermentation von

S. cerevisiae mit den gewählten MLR-Spektralbereichen S1, S2, S3 und S4 nach Abzug des Bezugsspektrums (Medium mit Hefe, ohne Glucose) sowie einer Geraden zur Korrektur des Offsets. Spektrenglättung mittels gleitendem Mittelwert über 11 Wellenzahlen (± 5).

-0,005

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

80090010001100120013001400

Abso

rptio

n

Wellenzahl (cm−1)

t = 0 h t = 1,5 h t = 3 h t = 10 h

S2 S1 S4 S3

4 Ergebnisse 62

Neben den PLS-Modellen wurden zur Datenauswertung 2D- und 4D-MLR-Kalibrationsmodelle erstellt (vgl. Abschnitt 3.3.2). Im Fall der 2D-MLR-Modelle wurde die Signalintensität in einem Messbereich (mit möglichst einer separaten Analytbande) sowie in einem benachbarten Referenzbereich (für Offset- und/oder Fluoreszenzkorrektur) gewählt. Die Breite der Spektralbereiche wurde dabei auf jeweils 20 cm–1 festgelegt, welches in etwa den Transmissionsbereichen kommerzieller optischer Filter entspricht (vgl. Kapitel 3.2.2, Tabelle 5). Im Fall der MIR-Spektroskopie wurde für Glucose als Messkanal (S1) der Wellenzahlbereich von 1140 – 1160 cm–1 verwendet, da in diesem Bereich nur Glucose eine Absorptionsbande besitzt (siehe Abbildung 34 und vgl. Abbildung 31). Zwar wären bei einer kleineren Wellenzahl die Glucoseabsorptionen und damit die gemessenen Signalintensitäten höher gewesen, jedoch hätte hierbei eine Querempfindlichkeit zu Ethanol bestanden. Als Glucose-Referenzkanal (S2) wurde ein Bereich in der Nähe gewählt, in dem sich keine stoffspezifischen Banden befanden. Für Ethanol wurde der Bereich 1040 – 1060 cm–1 als Messkanal (S3) festgelegt, da dort ein stark ausgeprägter Ethanolpeak zu erkennen war. Dieser Spektralbereich wurde zwar teilweise von einem Glucosepeak überlagert, jedoch gab es keine stärkere Bande, um Ethanol im MIR-Bereich zu bestimmen. Der Referenzkanal (S4) wurde in direkter spektraler Nachbarschaft festgelegt, da man durch die Differenz aus beiden Kanälen die Absorption von Glucose, welche den Messkanal überlagert, kompensieren konnte. Da für BTM in den aufgenommenen Spektren keine analytspezifische Bande zu finden war, wurde dieser Parameter mit dem Glucose- und Ethanolverlauf korreliert. Daher wurden zur Bestimmung der BTM die Messkanäle von Glucose (S1) und Ethanol (S3) verwendet.

In Abbildung 35 sind beispielhaft Raman-Spektren zu denselben Fermentationszeitpunkten wie im Fall der MIR-Spektroskopie dargestellt. Man erkennt, dass die Raman-Intensitätsbanden von einem ausgeprägten Fluoreszenzuntergrund überlagert waren, welcher zu kleinen Wellenzahlen hin anstieg. Weiterhin nahm der Fluoreszenzuntergrund im Laufe der Fermentation zu. Dabei stieg die Fluoreszenz bei kleinen Ramanshifts stärker an als bei großen. Einen wesentlichen Beitrag zum Fluoreszenzuntergrund lieferte hierbei der Biomassezuwachs, wie unabhängige Raman-Messungen an Zellsuspensionen gezeigt haben. Detaillierte Informationen über Fluoreszenz im Zusammenhang mit Hefe-Fermentationen wurden in einer vorherigen Arbeit ausführlich beschrieben [97]. Neben dem Fluoreszenzuntergrund in den Ramanspektren erkennt man zudem charakteristische Saphirbanden vom Hüllrohr der verwendeten Immersionssonde (vgl. Kapitel 3.2.1, Abschnitt Raman-Messsystem). Ähnlich wie in den MIR-Spektren befand sich ein Großteil der Ethanol- und Glucosebanden zwischen ca. 800 – 1400 cm–1 (vgl. Abbildung 32). Dieser in Abbildung 35 umrandete Bereich ist in Abbildung 36 vergrößert dargestellt, wobei zuvor von den Spektren erneut das Bezugsspektrum (Medium mit Hefe, ohne Zucker) und eine Offsetgerade abgezogen wurde. Nach dieser Spektrenbearbeitung erkennt man die spezifischen Banden für Glucose und Ethanol. Bei der Reaktionsverfolgung waren die gemessenen Signalintensitäten für die Analyten Glucose und Ethanol deutlich niedriger als die der

4 Ergebnisse 63

Reinstoffe (vgl. Abbildung 32). Dies kann mit der Streuwirkung der hierbei vorhandenen Hefezellen begründet werden, da diese Partikel sowohl das in die Probe fokussierte Laserlicht als auch die gesammelte Ramanintensität zusätzlich streuten und damit die gemessene Signalstärke verringerten.

Abbildung 35: Unbehandelte Raman-Spektren zu verschiedenen Zeitpunkten während einer zweiphasigen

Batch-Fermentation von S. cerevisiae.

Abbildung 36: Raman-Spektren zu verschiedenen Zeitpunkten während einer zweiphasigen Hefe-

Fermentation mit den gewählten MLR-Spektralbereichen S1, S2, S3 und S4 nach Abzug des Bezugsspektrums (Medium mit Hefe, ohne Glucose) sowie einer Geraden zur Korrektur des Offsets. Spektrenglättung mittels gleitendem Mittelwert über 11 Wellenzahlen (± 5).

0,0E+00

1,0E+04

2,0E+04

3,0E+04

4,0E+04

300700110015001900230027003100

Inte

nsitä

t

Ramanshift (cm−1)

t = 0 h t = 1,5 h t = 3 h t =10 h

Saphirbanden

Fluoreszenz

-200

0

200

400

600

800

80090010001100120013001400

Inte

nsitä

t

Ramanshift (cm−1)

t = 0 h t = 1,5 h t = 3 h t = 10 h

S1S2 S3 S4

4 Ergebnisse 64

Da Glucose und Ethanol im Bereich zwischen 2800 – 3000 cm–1 Raman-Banden besaßen, welche von C-H-Streckschwingungen herrührten (vgl. Abbildung 32), wurde dieser Bereich versuchsweise in den PLS-Modellen berücksichtigt. Eine Erweiterung des Spektralbereiches von 800 – 1400 cm–1 um den Bereich von 2800 – 3000 cm–1 brachte jedoch keine signifikante Verbesserung bei den Qualitätsparametern RMSEC und RMSEP. Des Weiteren lagen Banden für Glucose im Bereich zwischen 360 und 600 cm–1. Eine Erweiterung der PLS-Modelle um diesen Bereich brachte ebenfalls keine Verbesserung der Qualitätsparameter. Aufgrund dieser Erkenntnisse wurden die genannten Bereiche für die PLS-Auswertung der Raman-Spektren wieder fallen gelassen und der Spektralbereich auf 800 – 1400 cm–1 eingeschränkt.

Um die Raman-Spektren mittels MLR auszuwerten, wurde als Messkanal für Glucose (S1) der Ramanshiftbereich 1112 – 1132 cm–1 gewählt, da Glucose dort eine starke Bande besaß. Eine Auswertung mit einem der charakteristischen Ramanpeaks für Glucose im Bereich zwischen 350 – 600 cm–1 (vgl. Abbildung 32) brachte hierbei keine Verbesserung bei den Qualitätsparametern RMSEC und RMSEP und wurde deshalb wieder verworfen. Der Messkanal für Ethanol (S3) wurde von 868 – 888 cm–1 festgelegt, da dort eine starke Ethanolbande lag. Als Referenzkanäle (S2, S4) wurden jeweils Spektralbereiche gewählt, die in der Nähe der Messkanäle lagen und zudem möglichst keine anderen Analytbanden besaßen (Abbildung 36). Die Referenzkanäle ermöglichten zudem die Messung des Fluoreszenzuntergrunds. Dieser stieg aufgrund der Biomassebildung mit zunehmender Fermentationszeit bei kleineren Ramanshifts stärker an als bei großen (vgl. Abbildung 35). Da in den Referenzkanälen keine analytspezifischen Peaks vorhanden waren, wurde hier lediglich die Fluoreszenzzunahme aufgezeichnet. Durch die direkte spektrale Nachbarschaft von Mess- und Referenzkanal sowohl bei Glucose (S1, S2) als auch bei Ethanol (S3, S4) konnte ein sich verändernder Untergrund für die Quantifizierung dieser beiden Analyten kompensiert werden. Da durch den Zuwachs an Biomasse die Fluoreszenz anstieg, war es möglich, die BTM anhand des Fluoreszenzuntergrunds zu bestimmen. Dazu wurden die Referenzkanäle von Glucose (S2) und Ethanol (S4) verwendet. Zum einen lagen S2 und S4 spektral am weitesten auseinander, was zu einer maximalen Signaldifferenz führte (vgl. Abbildung 35) und zum anderen besaßen die beiden Analyten Glucose und Ethanol in diesen Spektralbereichen keine Raman-Banden. Zur Übersicht sind in Tabelle 6 nochmals die zur PLS- bzw. MLR-Auswertung verwendeten Spektralbereiche für die MIR- und Raman-Spektroskopie aufgeführt.

Tabelle 6: Für die MLR-Auswertung verwendete Mess- und Referenzbereiche von Glucose und Ethanol sowie Spektralbereiche für die PLS-Auswertung.

Kanal Raman (cm–1) MIR (cm–1) Funktion S1 1112 – 1132 1140 – 1160 Messbereich Glucose S2 1165 – 1185 1213 – 1233 Referenzbereich Glucose S3 868 – 888 1040 – 1060 Messbereich Ethanol S4 825 – 845 1060 – 1080 Referenzbereich Ethanol - 800 – 1400 850 – 1250 Bereich für PLS-Auswertung

4 Ergebnisse 65

Für die 2D-MLR wurden für Ethanol und Glucose die jeweiligen Signale in den Mess- und Referenzkanälen sowie die Konzentrationswerte aus der HPLC-Analyse verwendet. Um die BTM vorherzusagen, wurden im Fall der MIR-Spektren die Messkanäle von Glucose und Ethanol ausgewählt und bei der Raman-Spektroskopie die beiden Referenzkanäle. Als Referenzanalytik diente die gravimetrische Bestimmung der BTM. Bei der 4D-MLR wurden für die drei Analyten Glucose, Ethanol und BTM jeweils alle vier Kanäle mit den entsprechenden Referenzwerten verwendet.

MLR- und PLS-Auswertung 4.1.4

Wie bereits in Kapitel 4.1.3 beschrieben, wurden MLR- (2D- bzw. 4D-, vgl. Kapitel 3.3.2) und PLS-Modelle (vgl. Kapitel 3.4.2) zur Auswertung der Analyten Glucose, Ethanol und BTM (Zuwachs an Biomasse, vgl. Kapitel 4.1.1) erstellt. Für die Kalibration mittels MLR und PLS wurden drei zweiphasige Batch-Fermentationen von S. cerevisiae unter identischen Kultivierungsbedingungen verwendet (vgl. Kapitel 3.1.2). Die Kalibration auf der Grundlage der dabei aufgenommenen MIR- und Raman-Spektren basierte daher auf 63 Referenzwerten pro Analyt (21 pro Fermentation und Analyt, vgl. Kapitel 3.1.3). Eine detaillierte Beschreibung zur Datenkonvertierung und Modellerstellung für die MLR- und PLS-Auswertung ist in den Kapiteln 3.3 und 3.4 gegeben. Die MLR- und PLS-Kalibrationsmodelle wurden anschließend zur Vorhersage von Glucose, Ethanol und BTM während einer vierten Fermentation unter identischen Prozessbedingungen verwendet. Dabei waren sowohl die Analytkonzentrationen als auch die gemessenen Absorptionen nicht im Kalibrationsdatensatz enthalten. Die zur Kalibration und Vorhersage verwendeten Daten der Referenzanalytik sowie die Raman- und MIR-ATR-Messsignale in den festgelegten Spektralbereichen S1 – S4 (vgl. Kapitel 4.1.3) sind in Anhang A (Tabelle 19, Tabelle 23 und Tabelle 24) aufgeführt. Im Folgenden wird die multivariate Auswertung dabei beispielhaft für die Vorhersage von Fermentation 1 (Kalibration auf Basis von Fermentation 2, 3 und 4) dargestellt.

Für eine Vorhersage mit den 2D-MLR-Modellen wurde der unbekannte Regressand 𝑐𝑐 (jeweilige Analytkonzentration) berechnet, indem die zuvor bestimmten Regressionskoeffizienten (für Glucose 𝛽𝛽𝑆𝑆1 und 𝛽𝛽𝑆𝑆2 , für Ethanol 𝛽𝛽𝑆𝑆3 und 𝛽𝛽𝑆𝑆4 ) sowie das Absolutglied 𝑎𝑎 mit den gemessenen Regressoren (gemittelte Absorptionen bzw. Intensitäten in den festgelegten Spektralbereichen S1 – S4: für Glucose 𝑥𝑥𝑆𝑆1 und 𝑥𝑥𝑆𝑆2, für Ethanol 𝑥𝑥𝑆𝑆3 und 𝑥𝑥𝑆𝑆4, vgl. Kapitel 4.1.3, Tabelle 6) verrechnet wurden. Um die Regressionskoeffizienten und das Absolutglied zu bestimmen, wurden für eine Kalibration die in drei Fermentationen gemessenen Regressoren auf die aus der Referenzanalytik bekannten Analytkonzentrationen (Regressanden 𝑐𝑐) abgebildet und damit 𝑎𝑎 sowie 𝛽𝛽𝑆𝑆1 , 𝛽𝛽𝑆𝑆2 , 𝛽𝛽𝑆𝑆3 und 𝛽𝛽𝑆𝑆4 bestimmt. In den Gleichungen 4-1 bis 4-4 sind die 2D-MLR-Modelle für die Analyten Glucose, Ethanol und BTM gegeben, wobei die dazugehörigen berechneten Regressionskoeffizienten und

4 Ergebnisse 66

Absolutglieder für die drei Analyten und die zwei Spektroskopie-Methoden für die Kalibrationsmodelle in Tabelle 7 aufgeführt sind [109].

2D-MLR Glucose: 𝑐𝑐 = 𝑎𝑎 + 𝛽𝛽𝑆𝑆1 ∙ 𝑥𝑥𝑆𝑆1 + 𝛽𝛽𝑆𝑆2 ∙ 𝑥𝑥𝑆𝑆2 4-1

2D-MLR Ethanol: 𝑐𝑐 = 𝑎𝑎 + 𝛽𝛽𝑆𝑆3 ∙ 𝑥𝑥𝑆𝑆3 + 𝛽𝛽𝑆𝑆4 ∙ 𝑥𝑥𝑆𝑆4 4-2

2D-MLR BTM (Raman): 𝑐𝑐 = 𝑎𝑎 + 𝛽𝛽𝑆𝑆2 ∙ 𝑥𝑥𝑆𝑆2 + 𝛽𝛽𝑆𝑆4 ∙ 𝑥𝑥𝑆𝑆4 4-3

2D-MLR BTM (MIR): 𝑐𝑐 = 𝑎𝑎 + 𝛽𝛽𝑆𝑆1 ∙ 𝑥𝑥𝑆𝑆1 + 𝛽𝛽𝑆𝑆3 ∙ 𝑥𝑥𝑆𝑆3 4-4

Tabelle 7: 2D-MLR-Kalibrationsmodelle mit Absolutglied 𝑎𝑎 und Regressionskoeffizienten 𝛽𝛽𝑆𝑆1,𝛽𝛽𝑆𝑆2,𝛽𝛽𝑆𝑆3,𝛽𝛽𝑆𝑆4 für Glucose, Ethanol und BTM zur Vorhersage von Fermentation 1 für die jeweilige Spektroskopiemethode (Kalibration auf Basis von Fermentation 2, 3 und 4, vgl. Anhang A, Tabelle 21).

System Analyt 𝒂𝒂 (g L–1) 𝜷𝜷𝑺𝑺𝑺𝑺 (g L–1) 𝜷𝜷𝑺𝑺𝑺𝑺 (g L–1) 𝜷𝜷𝑺𝑺𝑺𝑺 (g L–1) 𝜷𝜷𝑺𝑺𝑺𝑺 (g L–1)

Raman Glucose 17,44 0,0858 -0,0909 − − Ethanol -3,34 − − 0,0279 -0,0266

BTM -5,64 − -0,0117 − 0,0099

MIR-ATR Glucose -15,20 12544,66 -12462,80 − − Ethanol 2,09 − − 3087,67 -3126,09

BTM 11,80 1929,20 − -1730,55 −

Aus Tabelle 7 lässt sich entnehmen, dass sowohl bei der Raman- als auch bei der MIR-ATR-Spektroskopie die Regressionskoeffizienten für die Glucose- und Ethanol-Modelle in den Messkanälen (für Glucose 𝛽𝛽𝑆𝑆1, für Ethanol 𝛽𝛽𝑆𝑆3) ein positives Vorzeichen besaßen und in den Referenzkanälen (für Glucose 𝛽𝛽𝑆𝑆2, für Ethanol 𝛽𝛽𝑆𝑆4) ein negatives Vorzeichen aufwiesen. Aufgrund der positiven Koeffizienten in den Messkanälen konnte somit gefolgert werden, dass die 2D-MLR-Modelle für Glucose und Ethanol analytspezifisch waren. Die negativen Vorzeichen in den Referenzkanälen dienten zur Kompensation von zeitlichen Drifts des spektralen Untergrunds. Bei der BTM-Bestimmung mit Hilfe der Raman-Spektroskopie basierte die Korrelation im Wesentlichen auf der Zunahme des Fluoreszenzuntergrundes im Laufe der Fermentation (vgl. Kapitel 4.1.3). Deshalb wurde der Referenzkanal von Ethanol (S4: kleinere Ramanshifts als bei S2 und damit über die Fermentationszeit stärker ansteigender Fluoreszenzuntergrund) positiv und der Referenzkanal von Glucose (S2: größere Ramanshifts und damit weniger stark ansteigender Fluoreszenzuntergrund) negativ gewichtet. Im Fall der MIR-Spektroskopie wurde zur Bestimmung der BTM der Messkanal von Glucose (S1) und der Messkanal von Ethanol (S3) verwendet. Dabei besaß der Regressionskoeffizient 𝛽𝛽𝑆𝑆3 ein negatives Vorzeichen und der Regressionskoeffizient 𝛽𝛽𝑆𝑆1 ein positives Vorzeichen. Im Laufe der Fermentation nahm das Messsignal in S3 kontinuierlich ab. Dies spiegelt sich auch in dem negativen Korrelationskoeffizienten dieses Messkanals bei

4 Ergebnisse 67

der Bestimmung des Biomassezuwachses wider. Das entgegengesetzte Vorzeichen von S1 diente wiederum der Kompensation von zeitlichen Drifts des spektralen Untergrunds.

Im Gegensatz zur Raman-Spektroskopie waren die Gewichtungen (Regressionskoeffizienten) bei der MIR-Spektroskopie vom Betrag her wesentlich höher, da die Absorptionen, die mit dem verwendeten MIR-ATR-Aufbau gemessen wurden, kleiner waren als die Intensitäten, die beim Raman-Aufbau ermittelt wurden. Die Berechnung der Analytkonzentrationen mittels MIR-ATR-Spektroskopie in Kombination mit einem 2D-MLR-Kalibrationsmodell soll anhand der Glucosebestimmung für Fermentation 1 zum Zeitpunkt 𝑡𝑡 = 0 ℎ exemplarisch verdeutlicht werden: die in Anhang A (Tabelle 24) dargestellten MIR-ATR-Messsignale wiesen bei 𝑡𝑡 = 0 ℎ im Messkanal eine mittlere Absorption von 𝑥𝑥𝑆𝑆1 = 0,0547 und im Referenzkanal eine mittlere Absorption von 𝑥𝑥𝑆𝑆2 = 0,0511 auf. Multiplizierte man diese beiden Signale mit den entsprechenden Regressionskoeffizienten 𝛽𝛽𝑆𝑆1 = 12544,66 bzw. 𝛽𝛽𝑆𝑆1 = −12462,80 und addierte das Absolutglied 𝑎𝑎 = −15,2 gemäß Gleichung 4-1, so erhielt man eine vorhergesagte Glucosekonzentration von 34 g L–1 (vgl. Anhang A, Tabelle 27) [109, 114].

Für die 4D-MLR-Modelle von Glucose, Ethanol und BTM wurden die Messsignale in allen vier festgelegten Spektralbereichen (vgl. Tabelle 6 in Kapitel 4.1.3) verwendet:

4D-MLR 𝑐𝑐 = 𝑎𝑎 + 𝛽𝛽𝑆𝑆1 ∙ 𝑥𝑥𝑆𝑆1 + 𝛽𝛽𝑆𝑆2 ∙ 𝑥𝑥𝑆𝑆2 + 𝛽𝛽𝑆𝑆3 ∙ 𝑥𝑥𝑆𝑆3 + 𝛽𝛽𝑆𝑆4 ∙ 𝑥𝑥𝑆𝑆4 4-5

Die berechneten Regressionskoeffizienten und Absolutglieder der 4D-MLR-Modelle sind beispielhaft für eine Kalibration basierend auf den Fermentationen 2, 3 und 4 in Tabelle 8 dargestellt.

Tabelle 8: 4D-MLR-Kalibrationsmodelle mit Absolutglied 𝑎𝑎 und Regressionskoeffizienten 𝛽𝛽𝑆𝑆1,𝛽𝛽𝑆𝑆2,𝛽𝛽𝑆𝑆3,𝛽𝛽𝑆𝑆4 für Glucose, Ethanol und BTM zur Vorhersage von Fermentation 1 für die jeweilige Spektroskopiemethode (Kalibration auf Basis von Fermentation 2, 3 und 4, vgl. Anhang A, Tabelle 22).

System Analyt 𝒂𝒂 (g L–1) 𝜷𝜷𝑺𝑺𝑺𝑺 (g L–1) 𝜷𝜷𝑺𝑺𝑺𝑺 (g L–1) 𝜷𝜷𝑺𝑺𝑺𝑺 (g L–1) 𝜷𝜷𝑺𝑺𝑺𝑺 (g L–1)

Raman Glucose 41,67 0,0425 -0,0149 -0,0369 0,0110 Ethanol 13,09 -0,0093 0,0048 0,0212 -0,0173

BTM -4,70 -0,0055 -0,0061 0,0029 0,0073

MIR-ATR Glucose -4,71 9021,18 -10269,03 -191,46 1271,07 Ethanol -3,06 -1853,75 1470,40 3115,77 -2688,70

BTM 19,83 -2351,27 2782,37 -1643,52 1192,16

Anhand der Tabelle 8 erkennt man, dass die Messkanäle (Glucose: S1 bzw. Ethanol: S3) zur Bestimmung der jeweiligen Analyten Glucose bzw. Ethanol in Gleichung 4-5 positiv gewichtet wurden. Weiterhin besaßen die Regressionskoeffizienten der Referenzkanäle (Glucose: S2: bzw. Ethanol: S4) für die Bestimmung dieser beiden Analyten ein entgegengesetztes Vorzeichen zu den jeweiligen Messkanälen. Dies galt sowohl für die Raman- als auch für die MIR-ATR-Spektroskopie. Anhand der Werte der

4 Ergebnisse 68

Regressionskoeffizienten lässt sich jedoch ableiten, dass die 4D-MLR-Modelle weniger analytspezifisch waren als die 2D-MLR-Modelle. Beispielsweise war für die Raman-Spektroskopie der Regressionskoeffizient im Messkanal von Glucose (𝛽𝛽𝑆𝑆1 = 0,0425) nur noch halb so groß wie bei der 2D-MLR (𝛽𝛽𝑆𝑆1 = 0,0858). Für Ethanol lag die Gewichtung des Messkanals immerhin noch bei 75 % ( 𝛽𝛽𝑆𝑆3 = 0,0212 ) im Vergleich zur 2D-MLR (𝛽𝛽𝑆𝑆3 = 0,0279).

Zur Bestimmung der BTM-Konzentration wurde bei der Raman-Spektroskopie der Mess- und Referenzkanal von Glucose (S1 und S2) negativ gewichtet und der Mess- und Referenzkanal von Ethanol (S3 und S4) positiv. Dies kann, wie bereits bei den Regressionskoeffizienten der 2D-MLR beschrieben, durch den unterschiedlich starken Fluoreszenzuntergrund begründet werden. Dieser stieg im Laufe der Fermentation in den Kanälen S3 und S4 stärker an, weshalb eine positive Gewichtung dieser Messwerte mit einem Biomassezuwachs korrelierte. Bei der MIR-ATR-Spektroskopie wurden zur BTM-Bestimmung die Messkanäle von Glucose und Ethanol (S1 und S3) negativ gewichtet und die Referenzkanäle positiv (S2 und S4) [109]. Wie bei der 2D-MLR war der Biomassezuwachs mit einer Abnahme des Messsignals in S3 korreliert, da sich in diesem Kanal sowohl der Glucose- als auch der nachfolgende Ethanolabbau widerspiegelten (vgl. Abbildung 34). Durch das negative Vorzeichen des Regressionskoeffizienten 𝛽𝛽𝑆𝑆3 wurde der mittels 4D-MLR-Modell berechnete Wert mit zunehmender Fermentationsdauer größer, wodurch die Biomassebildung beschrieben werden konnte.

Vorhersage der Konzentrationsverläufe mit MLR- und PLS-Modellen anhand von MIR- und Raman-Spektren

Um die Eignung der Raman- und MIR-Spektroskopie für die Prozessverfolgung miteinander vergleichen zu können, wurden beide Analysenmethoden gleichzeitig bei der zweiphasigen Batch-Fermentation von S. cerevisiae eingesetzt. Dabei wurden die Konzentrationen der Analyten Glucose, Ethanol und Biomasse in Echtzeit verfolgt. Die gemessenen Raman-Intensitätsspektren und die MIR-Absorptionsspektren wurden mit Hilfe der erstellten MLR- und PLS-Modelle in die entsprechenden Analytkonzentrationen umgerechnet. Zur Kalibration und als Referenzanalytik für die Bestimmung der Ethanol- und Glucosekonzentrationen dienten HPLC-Analysen der aus dem Reaktor entnommenen Proben. Die Biomasse wurde gravimetrisch bestimmt. Wie bereits in Kapitel 3.4.2 (Abschnitt Spektrenvorbehandlung) beschrieben, wurde – neben der PLS-Auswertung ohne Datenvorbehandlung (PLS oDV) – die Vektornormierung als einzige Datenvorbehandlung (PLS DV) für den Methodenvergleich ausgewählt. Zudem wurden zur Simulation von Photometer- bzw. Sensorkonzepten 2D- bzw. 4D-MLR-Modelle erstellt (vgl. Kapitel 3.3.2). In den Abbildungen 37 (2D-MLR), 38 (4D-MLR), 39 (PLS ohne Datenvorbehandlung) und 40 (PLS mit Datenvorbehandlung) sind die vorhergesagten Konzentrationsverläufe von Glucose, Ethanol und Biomasse auf Basis der verschiedenen MLR- und PLS-Modelle im Vergleich zur

4 Ergebnisse 69

Referenzanalytik dargestellt (vgl. Kapitel 4.1.1). Die dafür verwendeten Kalibrationsmodelle wurden dabei beispielhaft mit den Fermentationen 2, 3 und 4 erstellt und Fermentation 1 vorhergesagt.

Abbildung 37: Mit 2D-MLR-Modellen vorhergesagte zeitliche Konzentrationsverläufe von Glucose, Ethanol

und Biomasse (Biomasse entspricht hier dem Zuwachs in BTM) während einer zweiphasigen Batch-Fermentation von S. cerevisiae (Vorhersage von Fermentation 1, Kalibration mit Fermentation 2, 3 und 4). Vergleich der in Echtzeit aufgenommenen Raman- und MIR-ATR-Messwerte mit der Referenzanalytik (HPLC, Gravimetrie).

Abbildung 38: Mit 4D-MLR-Modellen vorhergesagte zeitliche Konzentrationsverläufe von Glucose, Ethanol

und Biomasse während einer zweiphasigen Batch-Fermentation von S. cerevisiae (Vorhersage von Fermentation 1, Kalibration mit Fermentation 2, 3 und 4).

-5

0

5

10

15

20

-10

0

10

20

30

40

0 2 4 6 8 10

Kon

zent

ratio

n Et

hano

l, B

iom

asse

(g L

−1)

Kon

zent

ratio

n G

luco

se (g

L−1

)

Fermentationszeit (h)

Raman, 2D-MLR MIR-ATR, 2D-MLR Referenzanalytik

Glucose

Ethanol Biomasse

-5

0

5

10

15

20

-10

0

10

20

30

40

0 2 4 6 8 10

Kon

zent

ratio

n Et

hano

l, B

iom

asse

(g L

−1)

Kon

zent

ratio

n G

luco

se (g

L−1

)


Raman, 4D-MLR MIR-ATR, 4D-MLR Referenzanalytik

Glucose

Ethanol Biomasse

4 Ergebnisse 70

Abbildung 39: Mit PLS-Modellen (oDV = ohne Datenvorbehandlung) vorhergesagte zeitliche Konzentrations-

verläufe von Glucose, Ethanol und Biomasse während einer zweiphasigen Batch-Fermentation von S. cerevisiae (Vorhersage von Fermentation 1, Kalibration mit Fermentation 2, 3 und 4).

Abbildung 40: Mit PLS-Modellen (DV = mit Vektornormierung als Datenvorbehandlung) vorhergesagte

zeitliche Konzentrationsverläufe von Glucose, Ethanol und Biomasse (Vorhersage von Fermentation 1, Kalibration mit Fermentation 2, 3 und 4).

-5

0

5

10

15

20

-10

0

10

20

30

40

0 2 4 6 8 10

Kon

zent

ratio

n Et

hano

l, B

iom

asse

(g L

−1)

Kon

zent

ratio

n G

luco

se (g

L−1

)


Raman, PLS oDV MIR-ATR, PLS oDV Referenzanalytik

Glucose

Ethanol Biomasse

-5

0

5

10

15

20

-10

0

10

20

30

40

0 2 4 6 8 10

Kon

zent

ratio

n Et

hano

l, B

iom

asse

(g L

−1)

Kon

zent

ratio

n G

luco

se (g

L−1

)


Raman, PLS DV MIR-ATR, PLS DV Referenzanalytik

Glucose

Ethanol Biomasse

4 Ergebnisse 71

Die vorhergesagten zeitlichen Konzentrationsverläufe der Analyten Glucose, Ethanol und Biomasse stimmten sowohl für die MLR-Modelle als auch für die PLS-Modelle gut mit den Werten aus der Referenzanalytik überein. Jedoch kann man bei genauerer Betrachtung eine etwas höhere Schwankung der Messwerte bei der Raman-Spektroskopie im Vergleich zur MIR-ATR-Spektroskopie erkennen, wobei die 2D-MLR-Modelle die größten Schwankungen aufwiesen. Zusätzlich zeigten die Vorhersagen zu Beginn der Fermentation (bis ca. 1 h) mit den MLR-Modellen eine größere Abweichung zu den Referenzwerten im Vergleich zu den PLS-Modellen. Zwischen den 4D-MLR-Modellen und den beiden PLS-Auswertungen bestand jedoch kaum ein Unterschied.

Vergleich von MIR-ATR- und Raman-Spektroskopie 4.1.5

Anhand der Messdaten aus drei Fermentationen wurden MLR- und PLS-Modelle erstellt und mit diesen die entsprechenden Analytkonzentrationen anhand der spektralen Informationen einer vierten Fermentation vorhergesagt (vgl. Beispielauswertung in Kapitel 4.1.4). Jedoch konnten je nach Auswahl der Fermentationen zur Erstellung eines Kalibrationsmodells die jeweiligen Kalibrations- und Vorhersagefehler (RMSEC und RMSEP) stark voneinander abweichen. Durch die Permutation der Fermentationen 1 – 4 erhielt man für jede Auswertemethode (2D-MLR, 4D-MLR, PLS oDV, PLS DV) jeweils vier Kombinationen für jeden Analyten mit den entsprechenden Qualitätsparametern RMSEC und RMSEP. Es zeigte sich, dass eine Mittelung der Kalibrations- und Vorhersagefehler zu statistisch abgesicherten Aussagen beim Methodenvergleich führte [109–111]. Für einen Vergleich von Raman- und MIR-ATR-Spektroskopie wurden daher die RMSEC- und RMSEP-Werte der MLR- bzw. PLS-Auswertungen der jeweils vorhergesagten Fermentationen 1 – 4 gemittelt. In Tabelle 9 sind die durch Mittelung erhaltenen Kalibrations- und Vorhersagefehler für die verwendeten Regressionsmodelle aufgeführt.

Tabelle 9: Vergleich von Raman- und MIR-ATR-Spektroskopie zur Echtzeitverfolgung von zweiphasigen Hefe-Fermentationen anhand verschiedener Regressionsmodelle (2D-MLR, 4D-MLR, PLS ohne Datenvorbehandlung = PLS oDV, PLS mit Vektornormierung als Datenvorbehandlung = PLS DV). Über Fermentation 1 – 4 gemittelte Kalibrations- und Vorhersagefehler (RMSEC und RMSEP) in g L–1 für die Analyten Glucose, Ethanol und Biomasse.

Regressions-modell

Qualitäts-parameter

Raman-System MIR-ATR-System Glucose Ethanol BTM Glucose Ethanol BTM

2D-MLR RMSEC 1,83 0,68 0,86 1,06 0,61 0,66 RMSEP 1,86 0,71 0,86 1,18 0,77 0,73

4D-MLR RMSEC 1,03 0,47 0,33 0,87 0,31 0,44 RMSEP 1,08 0,50 0,36 0,97 0,38 0,47

PLS oDV RMSEC 0,90 0,41 0,30 1,00 0,45 0,47 RMSEP 0,92 0,39 0,30 0,68 0,48 0,37

PLS DV RMSEC 0,78 0,56 0,50 0,86 0,30 0,36 RMSEP 0,76 0,56 0,48 0,76 0,28 0,33

4 Ergebnisse 72

Je nach Regressionsmodell bewegten sich die ermittelten Kalibrations- und Vorhersagefehler zwischen ca. 0,3 – 1,9 g L–1 (Tabelle 9). Vergleicht man die beiden Spektroskopiemethoden miteinander, dann lagen die Fehler bezogen auf den jeweiligen Analyten in der gleichen Größenordnung. Dabei wiesen die 2D-MLR-Modelle, welche lediglich auf zwei spektralen Informationen basierten die größten Fehler auf. Ob eine PLS-Auswertung mit Datenvorbehandlung (PLS DV) oder ohne Datenvorbehandlung (PLS oDV) besser geeignet war, hing vom Analyten und der angewandten Spektroskopiemethode ab. Beispielsweise betrug der RMSEP für Glucose im Fall der Raman-Spektroskopie und PLS oDV 0,92 g L–1 und mit DV 0,76 g L–1. Umgekehrt wurde bei Ethanol ein kleinerer Vorhersagefehler bei der PLS-Auswertung oDV (0,39 g L–1) im Vergleich zur PLS-Auswertung mit DV (0,56 g L–1) erreicht. Bei dem MIR-ATR-Messsystem wurde im Gegensatz zur Raman-Spektroskopie für Glucose ein kleinerer RMSEP oDV (0,68 g L–1) als mit DV (0,76 g L–1) erzielt und für Ethanol umgekehrt. Daher lassen sich keine allgemeingültigen Aussagen treffen, ob eine PLS-Auswertung mit oder ohne Datenvorbehandlung besser geeignet war.

Zudem lässt sich aus Tabelle 9 entnehmen, dass – im Vergleich zu Glucose – die Kalibrations- und Vorhersagefehler für Ethanol und BTM etwa um den Faktor 2 – 3 kleiner waren. Dies lässt sich u. a. durch die verschiedenen Maximalkonzentrationen der Analyten während der Fermentation begründen, welche für Glucose 30 g L–1 betrug, für Ethanol und BTM jedoch lediglich etwa 10 g L–1 bzw. 15 g L–1. Aus diesem Grund sind in der folgenden Tabelle die RMSEC- und RMSEP-Werte als relative Fehler, bezogen auf die jeweilige Maximalkonzentration, in Prozent angegeben.

Tabelle 10: Vergleich von Raman- und MIR-ATR-Spektroskopie zur Echtzeitverfolgung von zweiphasigen Hefe-Fermentationen anhand verschiedener Regressionsmodelle (2D-MLR, 4D-MLR, PLS ohne Datenvorbehandlung = PLS oDV, PLS mit Vektornormierung als Datenvorbehandlung = PLS DV). Über Fermentation 1 – 4 gemittelte relative Kalibrations- und Vorhersagefehler (RMSEC und RMSEP) in Prozent, bezogen auf die jeweilige Maximalkonzentration, für die Analyten Glucose, Ethanol und Biomasse.

Regressions-modell

Qualitäts-parameter

Raman-System MIR-ATR-System Glucose Ethanol BTM Glucose Ethanol BTM

2D-MLR RMSEC 6,1 6,8 5,7 3,5 6,1 4,4 RMSEP 6,2 7,1 5,8 3,9 7,7 4,9

4D-MLR RMSEC 3,4 4,7 2,2 2,9 3,1 2,9 RMSEP 3,6 5,0 2,4 3,2 3,8 3,1

PLS oDV RMSEC 3,0 4,1 2,0 3,3 4,5 3,2 RMSEP 3,1 3,9 2,0 2,3 4,8 2,4

PLS DV RMSEC 2,6 5,6 3,3 2,9 3,0 2,4 RMSEP 2,5 5,6 3,2 2,5 2,8 2,2

In Tabelle 10 erkennt man, dass die relativen Fehler – je nach Regressionsmodell und Spektroskopiemethode – zwischen 2 % und 8 % lagen, wobei die 2D-MLR die höchsten Werte aufwies. Durch die Angabe der relativen Kalibrations- und Vorhersagefehler wird zudem deutlich, dass bis auf die 2D-MLR die Modelle unabhängig vom Analyten und der

4 Ergebnisse 73

Spektroskopiemethode, zu ähnlichen Werten führten. Eine Ausnahme stellten beispielsweise die Fehler für Ethanol bei der PLS mit DV dar, welche für die Mittelinfrarotmesstechnik etwa halb so groß im Vergleich zur Raman-Spektroskopie waren. Dagegen lieferte die Raman-Spektroskopie bei der BTM-Bestimmung mittels PLS oDV etwas bessere Werte als die MIR-ATR-Technik. Inwieweit diese Unterschiede jedoch signifikant waren, konnte nicht abschließend bewertet werden, da für die Raman-Spektroskopie die PLS-Modelle oDV die kleinsten Fehler lieferten und für die MIR-Spektroskopie die PLS-Modelle mit DV [109].

Eignung der MLR- und PLS-Modelle bei Prozessvariation 4.1.6

Wie bereits in Kapitel 3.1.2 (Abschnitt Simulierung einer Prozessvariation) beschrieben, wurde am Ende einer zweiphasigen Batch-Fermentation eine Glucosekonzentration von 30 g L–1 und eine Ethanolkonzentration von 10 g L–1 eingestellt. Damit sollte überprüft werden, inwieweit die erstellten MLR- und PLS-Modelle (vgl. Kapitel 3.3.2, 3.4.2 und 4.1.4) Probenzusammensetzungen vorhersagen können, welche nicht im Kalibrationsdatensatz enthalten waren. Zur Auswertung wurden die in Kapitel 3.3.2 und 3.4.2 erstellten Modelle verwendet, wobei für die eingestellte Prozessvariation die Abweichung der vorhergesagten Konzentrationen im Vergleich zur Referenzanalytik (Probe Nr. 22, s. Tabelle 20 in Anhang A) in Abbildung 41 dargestellt ist.

Abbildung 41: Ermittelte Abweichungen der mit den verschiedenen MLR- (2D- bzw. 4D-) und PLS- (mit

Datenvorbehandlung (DV) bzw. ohne DV (oDV)) Modellen vorhergesagten Konzentrationen im Vergleich zur Referenzanalytik (Probe Nr. 22) für die manuell eingestellte Prozessvariation (30 g L–1 Glucose, 10 g L–1 Ethanol) am Ende einer zweiphasigen Batch-Fermentation.

-40

-20

0

20

40

2D 4D DV oDV 2D 4D DV oDV

MLR PLS MLR PLS

MIR Raman

Diff

eren

z de

r vor

herg

esag

ten

Kon

zent

ratio

n zu

r Ref

eren

zana

lytik

(g L

−1)

Glucose Ethanol Biomasse

4 Ergebnisse 74

Für die Prozessvariation konnte mit Hilfe der MIR-Spektroskopie die Glucosekonzentration mit allen erstellten Modellen ohne große Abweichung (≤ 4,1 g L–1) zur Referenzanalytik vorhergesagt werden. Bei der Raman-Spektroskopie ergaben sich für die Vorhersage der Glucosekonzentration, mit Ausnahme des verwendeten 2D-MLR-Modells, die größten Abweichungen (≥ 19,3 g L–1). Dabei kann beispielsweise die Abweichung der Glucosekonzentration bei dem 4D-MLR-Modell durch die Gewichtung des Ethanol- (S3) und Glucose- (S1) Messkanals sowie den entsprechenden Raman-Signalintensitäten begründet werden. Die Regressionskoeffizienten 𝛽𝛽𝑆𝑆3 und 𝛽𝛽𝑆𝑆1 waren ähnlich groß, wobei 𝛽𝛽𝑆𝑆3 ein negatives Vorzeichen aufwies (vgl. Tabelle 8 in Kapitel 4.1.4, sowie Tabelle 22 in Anhang A). Diese Koeffizienten waren etwa um den Faktor 3 – 4 größer als 𝛽𝛽𝑆𝑆2 und 𝛽𝛽𝑆𝑆4 und trugen damit stärker zur berechneten Konzentration bei. Zudem war die Signalintensität in S3 am Ende der Fermentation deutlich höher als die Intensität in S1 (vgl. Tabelle 23 in Anhang A), welches u.a. auf den stärker ansteigenden Fluoreszenzuntergrund im Ethanol-Messkanal (S3; mehr Fluoreszenz, da kleinerer Ramanshift; vgl. Kapitel 4.1.3, Abbildung 35) zurückzuführen war. Durch die Kombination aus den Regressionskoeffizienten des 4D-MLR-Modells und den gemessenen Signalintensitäten wurde letztendlich eine negative Glucosekonzentration vorhergesagt.

Für die Vorhersage von Ethanol mit Hilfe der Mittelinfrarot-Spektren erzielten die PLS-Modelle (Abweichung ≤ 2,4 g L–1) bessere Ergebnisse als die MLR-Modelle (Abweichung ≤ 7,4 g L–1). Die zu hoch vorhergesagten Ethanolkonzentrationen bei den MLR-Modellen lassen sich durch die Gewichtung von Ethanolmess- (S3) und Referenzkanal (S4) sowie durch die entsprechenden Absorptionen in diesen Spektralbereichen begründen. Dabei waren sowohl für das 2D-MLR-Modell als auch für das 4D-MLR-Modell die Regressionskoeffizienten 𝛽𝛽𝑆𝑆3 und 𝛽𝛽𝑆𝑆4 ähnlich groß, wobei 𝛽𝛽𝑆𝑆3 ein positives Vorzeichen aufwies (vgl. Tabelle 7 und Tabelle 8 in Kapitel 4.1.4, bzw. Tabelle 21 und Tabelle 22 in Anhang A). Das 2D-MLR-Modell war für Ethanol jedoch nicht analytspezifisch, da S3 zwar in einem Spektralbereich lag, in welchem Ethanol eine starke Bande aufwies, diese aber teilweise durch einen Glucosepeak überlagert wurde (vgl. Kapitel 4.1.3, Abbildung 34). Da bei der Prozessvariation eine gleichzeitig hohe Glucose- und Ethanolkonzentration eingestellt wurde, waren die gemessenen Absorptionen in S3 größer als in S4, wodurch mit beiden MLR-Modellen eine zu hohe Ethanolkonzentration vorhergesagt wurde. Dagegen wurde bei der Raman-Spektroskopie die geringste Abweichung für Ethanol mit dem analytspezifischen 2D-MLR-Modell (2,7 g L–1) erzielt.

Die größten Abweichungen bei der MIR-Spektroskopie lagen in der Vorhersage der BTM-Konzentration welche mit allen MLR- und PLS-Modellen zu niedrig bestimmt wurde, wobei die Abweichung ca. 17 g L–1 betrug. Dies ist dadurch zu begründen, dass bei den MLR- (und vermutlich auch bei den PLS-) Modellen die Korrelation der BTM auf dem anfänglichen Glucose- und späteren Ethanolabbau beruhte, da mit dem MIR-Messsystem keine analytspezifischen Banden für die BTM bestimmt werden konnten (vgl. Kapitel 4.1.3). Bei

4 Ergebnisse 75

diesen Modellen wurde somit bei hohen Absorptionen in den entsprechenden Spektralbereichen lediglich eine kleine Biomassekonzentration vorhergesagt. Da nun aber sowohl Glucose als auch Ethanol in einer hohen Konzentration vorlagen und damit die gemessenen Absorptionen noch höher als zum Zeitpunkt 𝑡𝑡 = 0 ℎ waren (vgl. Abbildung 34 in Kapitel 4.1.3), wurden letztendlich sogar negative BTM-Konzentrationen vorhergesagt. Im Fall der Raman-Spektroskopie konnte die BTM-Konzentration – sowohl mit den PLS-, als auch mit den MLR-Modellen – vergleichsweise gut vorhergesagt werden, wobei die Abweichung zur Referenz zwischen 6,0 g L–1 (PLS DV) und 0,7 g L–1 (PLS oDV) betrug.

Einfluss der Zellkonzentration auf die Raman-Signalintensität von gelösten 4.1.7Analyten

Da der Raman-Effekt auf der unelastischen Lichtstreuung von Molekülen beruht, waren die gemessenen Signalintensitäten von der Partikel- bzw. Zellkonzentration abhängig. Aufgrund der Vermehrung der Hefezellen während der Fermentation kam es zudem zu einem Anstieg der Zellkonzentration. Um die Auswirkungen der Zellkonzentration auf die Intensität der Raman-Signale zu untersuchen, wurde eine gleichbleibende Konzentration an Ethanol vermessen, die Hefekonzentration aber variiert (vgl. Kapitel 3.2.1).

In Abbildung 42 sind die gemessenen Raman-Intensitäten in Abhängigkeit der Hefekonzentration dargestellt. Die Raman-Signale wurden berechnet, indem die Intensität im Ethanol-Messbereich (S3) von der Intensität im Ethanol-Referenzbereich (S4) abgezogen wurde (vgl. Tabelle 6, Kapitel 4.1.3).

Abbildung 42: Raman-Signalintensität (Mess- minus Referenzbereich von Ethanol (S3, S4)) bei einer

Ethanolkonzentration von 10 g L–1 in Abhängigkeit der Hefekonzentration.

y = -387,8ln(x) + 395,29R² = 0,9889

y = -48,279x + 13,688R² = 0,9544

-2,0E+03

-5,0E+02

1,0E+03

2,5E+03

-1,5E+03

0,0E+00

1,5E+03

3,0E+03

0 5 10 15

Inte

nsitä

t lin

eare

r Te

il

Inte

nsitä

t log

arith

mis

cher

Tei

l

Konzentration BTM (g L−1)

logarithmischer Teil linearer Teil

4 Ergebnisse 76

Der Zusammenhang zwischen der Zellkonzentration und der gemessenen Raman-Signalintensität (Mess- minus Referenzbereich von Ethanol (S3, S4)), schwarze Punkte mit logarithmischer Regressionsfunktion) konnte gut mit einer logarithmischen Funktion beschrieben werden. Hierbei war eine starke Abschwächung des Raman-Signals bei kleinen Zellkonzentrationen zu beobachten. Jedoch konnte ab einer BTM-Konzentration von 5 g L−1 ein nahezu lineares Verhalten zwischen Raman-Intensität und steigender Zellkonzentration angenommen werden (graue Punkte mit linearer Regressionsfunktion). Die zusätzlich zur linearen Abhängigkeit fast konstante Messempfindlichkeit begünstigte eine MLR-Auswertung. Aus diesem Grund wurden die durchgeführten zweiphasigen Hefe-Fermentationen mit einer BTM-Konzentration von 5 g L−1 gestartet (vgl. Kapitel 3.1.2, Abschnitt Kultivierungsbedingungen und Fermentationsablauf).

Nachweisgrenzen für Glucose und Ethanol 4.1.8

Die Nachweisgrenzen für die Analyten Glucose und Ethanol wurden für beide verwendeten Spektrometer-Systeme (vgl. Kapitel 3.2.1, Abschnitt Raman-Messsystem bzw. MIR-Messsystem) mit der Methode des Standard-Additionsverfahrens bestimmt (vgl. Kapitel 3.2.1, Abschnitt Bestimmung der Nachweisgrenzen von Glucose und Ethanol). In Abbildung 43 (Glucose, MIR-ATR), 44 (Glucose, Raman), 45 (Ethanol, MIR-ATR) und 46 (Ethanol, Raman) sind die Signale gegen die Analytkonzentrationen aufgetragen und mit einer linearen Regressionsfunktion versehen. Dabei wurden die gleichen Mess- und Referenzbereiche wie bei der MLR-Auswertung (vgl. Kapitel 4.1.3, Tabelle 6) verwendet. Die Signale wurden berechnet, indem die Absorptionen (MIR-Spektroskopie) bzw. Intensitäten (Raman-Spektroskopie) im Messbereich (S1 bzw. S3) von den Absorptionen bzw. Intensitäten im Referenzbereich (S2 bzw. S4) abgezogen wurden. Zur Berechnung der Nachweisgrenzen wurden jeweils alle vermessenen Konzentrationen (pro Analyt und Messsystem) berücksichtigt (siehe Tabelle 18, Anhang A).

Abbildung 43: Mit einem MIR-ATR-Spektrometeraufbau ermittelte Absorptionen (Mess- minus

Referenzbereich von Glucose (S1, S2)) in Abhängigkeit der Glucosekonzentration.

y = 0,00006544x + 0,00015086R² = 0,9646

0

0,001

0,002

0,003

0 5 10 15 20 25 30

Abs

orpt

ion

Glucosekonzentration (g L−1)

4 Ergebnisse 77

Abbildung 44: Mit einem Raman-Spektrometeraufbau ermittelte Intensitäten (Mess- minus Referenzbereich

von Glucose (S1, S2)) in Abhängigkeit der Glucosekonzentration.


Referenzbereich von Ethanol (S3, S4)) in Abhängigkeit der Ethanolkonzentration.

Abbildung 46: Mit einem Raman-Spektrometeraufbau ermittelte Intensitäten (Mess- minus Referenzbereich

von Ethanol (S3, S4)) in Abhängigkeit der Ethanolkonzentration.

Prinzipiell zeigten alle Auswertungen – unabhängig von Analyt und Messsystem – eine gute lineare Korrelation zwischen gemessener Intensität bzw. Absorption und Analytkonzentration (R2 ≥ 0,96).

y = 68,02x + 124,06R² = 0,9998

0,0E+00

1,0E+03

2,0E+03

3,0E+03

0 5 10 15 20 25 30

Inte

nsitä

t


y = 0,00022914x + 0,00120356R² = 0,9895

0

0,002

0,004

0 2 4 6 8 10

Abs

oprt

ion

Ethanolkonzentration (g L−1)

y = 148,38x - 742,91R² = 0,9941

-1,0E+03

0,0E+00

1,0E+03

0 2 4 6 8 10

Inte

nsitä

t

Ethanolkonzentration (g L−1)

4 Ergebnisse 78

Die Nachweisgrenzen wurden mit der in Kapitel 2.2.3, Abschnitt Nachweisgrenze, beschriebenen Methode bestimmt und lagen unter 1000 ppm. Allerdings wurde zunächst mit dem MIR-ATR-System eine Nachweisgrenze für Glucose von 3587 ppm (3,587 g L–1) ermittelt. Aufgrund der vergleichsweise hohen Streuung der MIR-ATR-Messwerte sowie dem signifikant geringerem Bestimmtheitsmaß (vgl. Abbildung 43), wurde die Nachweisgrenze für diese Methode mit einem veränderten Glucosemessbereich (S1: 1070 – 1090 cm–1) bestimmt. Die Auftragung der Absorption in diesem Spektralbereich gegen die Analytkonzentration führte zu einer verbesserten Korrelation (Abbildung 47). Mit der dadurch erhaltenen Regressionsfunktion wurde eine deutlich geringere (972 ppm) MIR-ATR-Nachweisgrenze für Glucose ermittelt.


Referenzbereich von Glucose (geänderter Messbereich S1: 1070 – 1090 cm–1, S2)) in Abhängigkeit der Glucosekonzentration.

In Tabelle 11 sind die ermittelten Nachweisgrenzen für Glucose und Ethanol in ppm bzw. g L–1 für die beiden Messsysteme gegenübergestellt. Die Nachweisgrenze für Glucose war mit 283 ppm (0,283 g L–1) beim Raman-Spektrometersystem etwa um den Faktor 3 kleiner als beim MIR-Messsystem (972 ppm bzw. 0,972 g L–1). Im Fall des Analyten Ethanol wurde mittels Raman-Spektroskopie eine Nachweisgrenze von 520 ppm bestimmt, während mit dem MIR-System 785 ppm ermittelt wurden. Somit lagen die Nachweisgrenzen beim Raman-Messsystem sowohl für Glucose als auch für Ethanol bei geringeren Konzentrationen als beim MIR-ATR-System.

Tabelle 11: Nachweisgrenzen von Glucose und Ethanol, ermittelt mit einem MIR- und einem Raman-Spektrometersystem.

y = 0,00027295x + 0,00247364R² = 0,9973

0

0,004

0,008

0,012

0 5 10 15 20 25 30

Abs

orpt

ion


Analyt MIR-Spektrometersystem Raman-Spektrometersystem Glucose 972 ppm (0,972 g L–1) 283 ppm (0,283 g L–1) Ethanol 785 ppm (0,785 g L–1) 520 ppm (0,520 g L–1)

4 Ergebnisse 79

4.2 Prozessverfolgung einer einphasigen Hefefermentation mit einem MIR-ATR-Sensor

Wie in Kapitel 4.1 aufgezeigt werden konnte, war es möglich, verschiedene Analyten während eines biotechnologischen Prozesses anhand spezifischer Spektralbereiche quantitativ in Echtzeit zu verfolgen. Im Vergleich zu den in Kapitel 4.1 verwendeten Spektrometeraufbauten können diese wenigen spektralen Informationen prinzipiell auch mit einem vergleichsweise kostengünstigen und kompakten Photometer bzw. Sensor erfasst werden. Um dieses Potential aufzuzeigen, wurde ein im PI-Institut entwickelter Vierkanal-MIR-ATR-Sensor (vgl. Kapitel 3.2.2) zur Prozessverfolgung eingesetzt und mit einem kommerziellen FT-MIR-Spektrometersystem verglichen.

Die praktische Einsatzfähigkeit des Sensors wurde anhand einer einphasigen Batch-Fermentation von S. cerevisiae (vgl. Kapitel 3.1.2) bei gleichzeitiger Echtzeit-Überwachung der Kohlenstoffquelle Glucose und des Produkts Ethanol getestet. In Abbildung 48 sind beispielhaft FT-MIR-Absorptionsspektren während einer solchen Hefe-Fermentation dargestellt. Zudem sind die Transmissionsbereiche der vier optischen Bandpassfilter F1 – F4 des Sensors eingezeichnet. Dabei spiegelte der Spektralbereich zwischen 1200 – 850 cm–1 den Abbau der Glucose und den gleichzeitigen Aufbau von Ethanol wider (vgl. Kapitel 4.1, Abbildung 31 und Abbildung 34). Ähnliche Tendenzen ließen sich, bei deutlich niedrigeren Signalintensitäten, auch im Spektralbereich zwischen 3400 – 2600 cm–1 erkennen.

Abbildung 48: FT-MIR-Spektren zu verschiedenen Zeitpunkten während einer einphasigen Batch-

Fermentation von S. cerevisiae nach Abzug des Bezugsspektrums (Medium mit Hefe, ohne Glucose) sowie spektrale Transmissionsbereiche der optischen Bandpassfilter F1, F2, F3 und F4 des MIR-ATR-Sensors zur MLR-Auswertung.

-0,02

0

0,02

0,04

0,06

3400 3000 2600 1400 1200 1000 800

Abso

rptio

n

Wellenzahl (cm−1)

t = 0 h t = 3 h t = 6 h

F3 F1 F2 F4

4 Ergebnisse 80

Der MIR-ATR-Sensor wurde mit Bandpassfiltern ausgestattet, welche standardmäßig in der IR-Gasanalytik eingesetzt werden. Die spektralen Transmissionsbereiche der optischen Filter (vgl. Kapitel 3.2.2, Tabelle 5) wurden so gewählt, dass diese eine hohe Sensitivität gegenüber einer Vielzahl an Kohlenwasserstoffen in biotechnologischen und chemischen Reaktionen aufweisen. Der Durchlassbereich von Filter F3 (2966 cm–1 ± 18 cm–1) lag dabei in einer Wellenzahlregion von C-H-Streckschwingungen, welche in aliphatischen Kohlenwasser-stoffen wie Ethanol und Glucose vorkommen (vgl. Kapitel 4.1.2). Die optische Transmission von Filter F4 (1151 cm–1 ± 14 cm–1) überlappte teilweise mit den C-O-Streckschwingungen von Glucose. Da Ethanol nicht im Durchlassbereich von Filter F4 absorbierte, war dieser Bandpassfilter für eine spezifische Detektion von Glucose geeignet (vgl. Abbildung 48). Die Positionen der Filter F1 und F2 lagen in einem Spektralbereich, in welchen die untersuchten Analyten keine charakteristischen Banden aufwiesen. Dennoch wurden die in diesen beiden optischen Kanälen gemessenen Absorptionen zur Verbesserung der MLR-Modelle mit einbezogen.

Da für die Kalibration des MIR-ATR-Sensors die gemessenen Absorptionen aus allen vier optischen Kanälen verwendet wurden, werden nachfolgend die Kalibrationsmodelle als 4D-MLR-Modelle bezeichnet (vgl. Kapitel 3.3.2). Für die 4D-MLR-Kalibration der Glucose- und Ethanolkonzentrationen wurden drei einphasige Hefe-Fermentationen verwendet. Die Kalibration des MIR-ATR-Sensors basierte daher auf 42 Referenzwerten pro Analyt (14 pro Fermentation und Analyt, vgl. Kapitel 3.1.2 bzw. 3.1.3). Die dadurch erhaltenen 4D-MLR-Kalibrationsmodelle für Glucose und Ethanol (vgl. Gleichung 4-5) lauten:

𝑐𝑐𝐺𝐺𝐹𝐹𝐺𝐺𝐹𝐹𝑜𝑜𝑠𝑠𝑒𝑒 (𝑙𝑙 𝐿𝐿−1) = −1450 + 9080 · 𝑥𝑥𝐹𝐹1 + 21733 · 𝑥𝑥𝐹𝐹2 + 5834 · 𝑥𝑥𝐹𝐹3 − 3243 · 𝑥𝑥𝐹𝐹4 4-6

𝑐𝑐𝐸𝐸𝑜𝑜ℎ𝐺𝐺𝑛𝑛𝑜𝑜𝐹𝐹 (𝑙𝑙 𝐿𝐿−1) = 469 − 1904 · 𝑥𝑥𝐹𝐹1 − 6534 · 𝑥𝑥𝐹𝐹2 − 2258 · 𝑥𝑥𝐹𝐹3 + 1047 · 𝑥𝑥𝐹𝐹4 4-7

Die 4D-Kalibrationsmodelle wurden zur Vorhersage von Glucose und Ethanol während einer vierten Fermentation unter identischen Prozessbedingungen verwendet. Die zur Kalibration und Validierung verwendeten Daten der Referenzanalytik sowie die entsprechenden Sensorsignale sind in Tabelle 29 in Anhang B aufgeführt. Um den entwickelten MIR-ATR-Sensor mit einem kommerziellen Spektrometer vergleichen zu können, wurden bei jeder Fermentation (neben den Absorptionssignalen in den vier Sensorkanälen) parallel FT-MIR-Spektren aufgenommen. Das hierzu verwendete Spektrometer ist in Kapitel 3.2.1, Abschnitt MIR-Messsystem beschrieben. Für einen direkten Vergleich der gemessenen Messeffekte wurden die FT-MIR-Absorptionsspektren ebenfalls durch 4D-MLR-Modelle nach Gleichung 4-5 ausgewertet. Dazu wurden (wie beim Sensor) lediglich die jeweiligen Mittelwerte der gemessenen Absorptionen in den einzelnen spektralen Transmissions-bereichen der optischen Filter F1 – F4 (vgl. Tabelle 5) verwendet. Eine ausführliche Beschreibung zur Auswertung der spektralen Daten ist in [8] gegeben.

4 Ergebnisse 81

In Abbildung 49 sind die auf Grundlage der Messergebnisse des MIR-ATR-Sensors und des FT-MIR-Spektrometers erhaltenen zeitlichen Konzentrationsverläufe der beiden Analyten dargestellt. Zum Vergleich sind die Ergebnisse aus der HPLC-Referenzanalytik ebenfalls eingezeichnet. Während der einphasigen Batch-Fermentation von S. cerevisiae wurde Glucose überwiegend in Ethanol, Biomasse und Kohlenstoffdioxid verstoffwechselt [116], wobei die Ethanolbildung durch den Crabtree-Effekt begründet werden konnte [117, 118] (vgl. Kapitel 4.1.1). Wie in Abbildung 49 zu erkennen, wurde die anfängliche Glucosekonzentration von 100 g L–1 innerhalb der ersten 5 h in eine Ethanolkonzentration von ca. 30 g L–1 umgewandelt. Nach der Umwandlung von Glucose blieb die Konzentration von Ethanol nahezu konstant.

Abbildung 49: Mit 4D-MLR-Modellen vorhergesagte zeitliche Konzentrationsverläufe von Glucose und Ethanol

während einer einphasigen Batch-Fermentation von S. cerevisiae. Vergleich der in Echtzeit aufgenommenen Messdaten eines MIR-ATR-Sensors und eines FT-MIR-Spektrometers mit den Referenzwerten der HPLC-Analytik.

Die mit dem MIR-ATR-Sensor und dem FT-MIR-Spektrometer über 4D-MLR-Modelle vorhergesagten zeitlichen Konzentrationsverläufe der beiden Analyten stimmten gut mit den HPLC-Werten aus der Referenzanalytik überein, wobei die Sensorsignale eine etwas höhere Schwankung aufwiesen. Diese Ergebnisse spiegeln sich ebenfalls in den Qualitätsparametern in Tabelle 12 wider. Die Werte für RMSECV, RMSEC und RMSEP waren dabei für den MIR-ATR-Sensor höher als für das FT-MIR-Spektrometer. Dennoch können die erreichten Vorhersagegenauigkeiten beim Sensor, welche für Glucose bei 6,15 g L–1 (6 % relativer Fehler,

-20

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6

Kon

zent

ratio

n (g

L−1

)


Sensor

Spektrometer

HPLCGlucose

Ethanol

4 Ergebnisse 82

bezogen auf die Maximalkonzentration) und für Ethanol bei 1,36 g L–1 (5 %) lagen, für einen breiten biotechnologischen Anwendungsbereich als geeignet angesehen werden [23].

Tabelle 12: Auf der Basis von 4D-MLR-Modellen erzielte Kalibrations- und Validierungsergebnisse mit dem MIR-ATR-Sensor im Vergleich zu einem FT-MIR-Spektrometer für die Analyten Glucose und Ethanol. Auswertung der Signale in den Transmissionsbereichen der optischen Filter F1 – F4.

Analyt und Messgerät Kreuzvalidierung Kalibration Vorhersage RMSECV (g L–1) R2 RMSEC (g L–1) R2 RMSEP (g L–1) R2

Glucose: Sensor 4,30 0,984 4,01 0,988 6,15 0,994 Glucose: Spektrometer 3,72 0,988 3,20 0,992 4,34 0,998

Ethanol: Sensor 1,77 0,972 1,62 0,989 1,36 0,995 Ethanol: Spektrometer 1,38 0,983 1,24 0,988 0,61 0,997

4.3 Prozessverfolgung einer einphasigen Hefefermentation mit einer kontaktlosen Ramansonde

Eine im PI-Institut entwickelte kontaktlose Raman-Prozesssonde wurde von außen an den Glasmantel eines Bioreaktors angebracht und zur Reaktionsüberwachung einer einphasigen Batch-Fermentation von S. cerevisiae eingesetzt (vgl. Kapitel 3.2.3 und 3.1.2). Aufgrund der langen Brennweite ermöglicht eine solche Sonde berührungslose Inline-Messungen durch Schauglasarmaturen von Fermentern oder chemischen Anlagen. Das Ziel dieser Untersuchung war eine Echtzeitverfolgung von Glucose und Ethanol, ohne eine Ramansonde direkt in den Prozess einbringen zu müssen. Die Quantifizierung erfolgte über MLR-Modelle. Die Datenauswertung sollte dabei mit minimalem Aufwand betrieben werden, weshalb hier einfache MLR-Modelle zum Einsatz kamen. Für die Auswertung wurden zweidimensionale (2D-) und vierdimensionale (4D-) MLR-Modelle für Glucose und Ethanol erstellt. Im Fall der 2D-MLR-Modelle wurde die Signalintensität in einem Messbereich (mit möglichst einer separaten Analytbande für Glucose bzw. Ethanol) sowie in einem benachbarten Referenzbereich (für Offset- und Fluoreszenzkorrektur) gewählt. In Abbildung 50 sind beispielhaft Ramanspektren während einer Hefe-Fermentation dargestellt. Der zeitliche Verlauf der Ramanspektren in den für die MLR-Auswertung der beiden Analyten gewählten Spektralbereichen zeigte die Verstoffwechselung von Glucose bei gleichzeitiger Bildung von Ethanol (vgl. Kapitel 4.1, Abbildung 32 und Abbildung 36). Hierbei erkannte man zwischen 0 – 6 h eine Abnahme der gemessenen Intensität im Glucose-Messbereich S1 (Gerüstschwingung von Glucose) sowie eine Zunahme der Signalintensität im Ethanol-Messbereich S3 (C-C-Streckschwingung von Ethanol).

4 Ergebnisse 83

Abbildung 50: Raman-Spektren zu verschiedenen Zeitpunkten während einer einphasigen Batch-Fermentation

von S. cerevisiae mit MLR-Spektralbereichen S1, S2, S3 und S4 nach Abzug des Bezugsspektrums (Medium mit Hefe, ohne Glucose) sowie einer Geraden zur Korrektur des Offsets.

Für die 4D-MLR-Modelle wurden die gemessenen Intensitäten aus den Messbereichen für beide Analyten sowie die Intensitäten aus beiden Referenzbereichen verwendet. Im Gegensatz zu den 4D-MLR-Modellen, welche die Informationen aus vier Spektralbereichen beinhalteten, waren die erstellten 2D-MLR-Modelle analytspezifisch. Die gewählten Spektralbereiche zur Erstellung der verschiedenen MLR-Modelle für Glucose und Ethanol sind in Tabelle 13 aufgelistet.

Tabelle 13: Für die MLR-Auswertung verwendete Mess- und Referenzbereiche von Glucose und Ethanol.

Identisch zu der Beschreibung in Kapitel 4.2 wurden auch hier drei einphasige Hefe-Fermentationen für die Kalibration der Glucose- und Ethanolkonzentrationen verwendet, womit 42 Referenzwerte pro Analyt zur Verfügung standen (14 pro Fermentation und Analyt, vgl. Kapitel 3.1.2 bzw. 3.1.3). Die Vorhersage der beiden Analyten erfolgte mit Hilfe der in den Spektralbereichen S1 – S4 (Tabelle 13) gemessenen Intensitäten während einer vierten, nicht im Kalibrationsdatensatz enthaltenen Fermentation. Die zur Kalibration und Validierung verwendeten Daten der Referenzanalytik sowie der gemessenen Intensitäten in

0,0E+00

4,0E+02

8,0E+02

1,2E+03

450550650750850950

Inte

nsitä

t

Ramanshift (cm−1)

t = 0 h t = 3 h t = 6 h

S3 S4 S2 S1

Kanal Spektralbereich (cm–1) Funktion S1 515 – 527 Messbereich Glucose S2 607 – 619 Referenzbereich Glucose S3 872 – 884 Messbereich Ethanol S4 780 – 792 Referenzbereich Ethanol

4 Ergebnisse 84

den Mess- und Referenzbereichen sind in Tabelle 31 (Anhang C) aufgeführt. Die erhaltenen 2D- und 4D-MLR-Kalibrationsmodelle für Glucose und Ethanol lauten:

𝑐𝑐𝐺𝐺𝐹𝐹𝐺𝐺𝐹𝐹𝑜𝑜𝑠𝑠𝑒𝑒_2𝐷𝐷 (𝑙𝑙 𝐿𝐿−1) = −76,83 + 0,142 · 𝑥𝑥𝑆𝑆1 − 0,165 · 𝑥𝑥𝑆𝑆2 4-8

𝑐𝑐𝐸𝐸𝑜𝑜ℎ𝐺𝐺𝑛𝑛𝑜𝑜𝐹𝐹_2𝐷𝐷 (𝑙𝑙 𝐿𝐿−1) = −38,41 + 0,053 · 𝑥𝑥𝑆𝑆3 − 0,048 · 𝑥𝑥𝑆𝑆4 4-9

𝑐𝑐𝐺𝐺𝐹𝐹𝐺𝐺𝐹𝐹𝑜𝑜𝑠𝑠𝑒𝑒_4𝐷𝐷 (𝑙𝑙 𝐿𝐿−1) = 28,51 + 0,082 · 𝑥𝑥𝑆𝑆1 − 0,122 · 𝑥𝑥𝑆𝑆2 − 0,079 · 𝑥𝑥𝑆𝑆3 + 0,103 · 𝑥𝑥𝑆𝑆4 4-10

𝑐𝑐𝐸𝐸𝑜𝑜ℎ𝐺𝐺𝑛𝑛𝑜𝑜𝐹𝐹_4𝐷𝐷 (𝑙𝑙 𝐿𝐿−1) = 14,42 − 0,018 · 𝑥𝑥𝑆𝑆1 + 0,029 · 𝑥𝑥𝑆𝑆2 + 0,032 · 𝑥𝑥𝑆𝑆3 − 0,039 · 𝑥𝑥𝑆𝑆4 4-11

Die vorhergesagten Konzentrationsverläufe von Glucose und Ethanol im Vergleich zur HPLC-Referenzanalytik sind in Abbildung 51 dargestellt. Hierbei wurde 100 g L–1 Glucose innerhalb von 6 h zu etwa 30 g L–1 Ethanol verstoffwechselt. Der zeitliche Konzentrationsverlauf der beiden Analyten, welcher mit einer kontaktlosen Ramansonde in Echtzeit aufgenommen wurde, stimmte dabei gut mit den Referenzwerten aus der HPLC überein.

Abbildung 51: Mit 2D- und 4D-MLR-Modellen vorhergesagte zeitliche Konzentrationsverläufe von Glucose und

Ethanol während einer einphasigen Batch-Fermentation von S. cerevisiae. Vergleich der in Echtzeit aufgenommenen Messdaten mit einer kontaktlosen Ramansonde mit den Referenzwerten der HPLC-Analytik.

Die entsprechenden Qualitätsparameter RMSEC, RMSEP und R2 sind für die beiden Analyten und die verschiedenen MLR-Modelle in Tabelle 14 aufgelistet.

-20

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6

Kon

zent

ratio

n (g

L−1

)


2D-MLR

4D-MLR

HPLCGlucose

Ethanol

4 Ergebnisse 85

Tabelle 14: Mit einer kontaktlosen Ramansonde und auf der Basis von 2D- und 4D-MLR-Modellen erzielte Kalibrations- und Validierungsergebnisse für die Analyten Glucose und Ethanol. Auswertung der Signale in den gewählten Spektralbereichen S1 – S4.

Analyt und MLR-Modell Kalibration Vorhersage RMSEC (g L–1) R2 RMSEP (g L–1) R2

Glucose: 2D-MLR 5,52 0,974 6,28 0,974 Glucose: 4D-MLR 4,70 0,982 4,74 0,983 Ethanol: 2D-MLR 1,47 0,979 0,79 0,991 Ethanol: 4D-MLR 1,29 0,985 1,05 0,989

Im Fall von Ethanol brachte ein 4D-MLR-Modell gegenüber einem 2D-Modell beispielsweise kaum eine Verbesserung der Qualitätsparameter. Die sehr starke und schmale Ethanolbande im Messbereich (872 – 884 cm–1) sowie der Referenzbereich für Offset- und Fluoreszenzkorrektur (780 – 792 cm–1) ermöglichten somit eine gute Bestimmung dieses Analyten anhand von lediglich zwei Spektralbereichen. Bei Glucose führte das 4D-Modell zu Beginn der Fermentation zu einem stabileren Signalverlauf (Abbildung 51) sowie zu besseren Qualitätsparametern im Vergleich zu dem 2D-Modell. Jedoch bestand bei einem 4D-Modell eine hohe Wahrscheinlichkeit auf Kollinearitäten und damit instabilen Vorhersagen, da nicht-analytspezifische Spektralbereiche zur Bestimmung eines Analyten in die Kalibration mit einbezogen wurden (vgl. Kapitel 4.1.4). Im Vergleich zu den 4D-Modellen basierten die 2D-Modelle auf Spektralbereichen, welche spezifisch für den jeweiligen Analyten waren (vgl. Abbildung 32, Abbildung 51 sowie Tabelle 13) und beruhten damit auf einem stärkeren kausalen Zusammenhang zwischen gemessener Ramanintensität und Analytkonzentration. Dieser Zusammenhang spiegelt sich auch in den Regressionskoeffizienten (Gleichungen 4-8 bis 4-11) wider. Falls Prozessvariationen auftreten, welche nicht in den Kalibrationsdaten enthalten sind, sollten analytspezifische 2D-MLR-Modelle gegenüber den 4D-Modellen zu einer besseren Vorhersage der Analytkonzentrationen führen (vgl. Kapitel 4.1.6). Insgesamt wurden mit beiden MLR-Modellen mittlere Vorhersagegenauigkeiten von etwa 5 g L–1 für Glucose (5 % relativer Fehler, bezogen auf die Maximalkonzentration) und 1 g L–1 (3 %) für Ethanol mit der in Kapitel 3.2.3 beschriebenen kontaktlosen Ramansonde erreicht (vgl. Tabelle 14) [70].

5 Diskussion 86

5 Diskussion

5.1 Simultane Prozessverfolgung mittels MIR-ATR- und Raman-Spektroskopie

Ein MIR-Messsystem (Kaufpreis ca. 25.000 €) und ein Raman-Messsystem (ca. 65.000 € mit Sonde) wurden anhand einer gleichzeitigen Verfolgung zweiphasiger Batch-Fermentationen von S. cerevisiae verglichen. Dabei wurden die Konzentrationen von Glucose, Ethanol und Biotrockenmasse in Echtzeit verfolgt. Der Raman-Aufbau bestand aus einer Immersionssonde mit Quarzlichtleitern und einem CCD-Array-Spektrometer. Das MIR-System bestand aus einem FT-MIR-Spektrometer mit einer ATR-Durchflusszelle im Bypass. Als Referenzanalytik für Glucose und Ethanol dienten HPLC-Analysen, die Biotrockenmasse wurde gravimetrisch bestimmt. Um anhand der Raman-Intensitätsspektren und der MIR-Absorptionsspektren Analytkonzentrationen vorherzusagen, wurden multivariate Kalibrationsmodelle gebildet und somit die spektralen Informationen mit den jeweiligen Analytkonzentrationen aus der Referenzanalytik in Zusammenhang gebracht. Hierfür wurden jeweils zwei verschiedene MLR- (2D, 4D) und PLS- (PLS ohne Datenvorbehandlung, PLS mit Vektornormierung als Datenvorbehandlung) Regressionsmodelle gebildet. Insgesamt wurden vier Fermentationen unter identischen Kultivierungsbedingungen durchgeführt. Zur Erstellung eines Kalibrationsmodells wurden dabei jeweils drei Fermentationen verwendet und der Kalibrationsfehler (RMSEC) bestimmt. Mit diesem Kalibrationsmodell wurden die Konzentrationsverläufe von Glucose, Ethanol und Biotrockenmasse für eine vierte Fermentation vorhergesagt und mit der Referenzanalytik verglichen (RMSEP). Durch die anschließende Permutation der Fermentationen 1 – 4 wurde jede Fermentation einmal vorhergesagt. Damit erhielt man für jede Auswerte- und Spektroskopiemethode jeweils vier Kombinationen für jeden Analyten mit den entsprechenden Qualitätsparametern RMSEC und RMSEP. Diese Qualitätsparameter wurden anschließend gemittelt, um einzelne Schwankungen besser ausgleichen zu können und somit einen aussagekräftigeren Vergleich zwischen den beiden Spektroskopiemethoden zu erhalten.

Bezogen auf die jeweiligen Maximalkonzentrationen der untersuchten Analyten lagen die relativen Kalibrations- und Vorhersagefehler, je nach Regressionsmodell und Spektroskopiemethode, zwischen 2 – 8 % (vgl. Tabelle 10, Kapitel 4.1.5). Die größten Fehler (4 – 8 %) wiesen dabei die analytspezifischen 2D-MLR-Modelle auf. Dagegen lagen die RMSEC- und RMSEP-Werte für die restlichen Modelle (4D-MLR, PLS oDV, PLS DV) niedriger und befanden sich, unabhängig von Analyt und Spektroskopiemethode, etwa in der gleichen Größenordnung (ca. 2 – 5 %). Beispielsweise resultierte die Prozessverfolgung mit Hilfe der MIR-ATR-Spektroskopie in Kombination mit PLS-Modellen ohne Datenvorbehandlung in Vorhersagefehlern von 0,68 g L–1 (2 % relativer Fehler), 0,48 g L–1 (5 %) und 0,37 g L–1 (2 %) für Glucose, Ethanol und Biomasse. Im Fall der Raman-Spektroskopie betrugen die

5 Diskussion 87

entsprechenden RMSEP-Werte 0,92 g L–1 (3 %), 0,39 g L–1 (4 %) und 0,30 g L–1 (2 %). Zusammenfassend kann man sagen, dass – je nach Modell und trotz etwas kleinerer Fehler bei der MIR-Messtechnik – keine großen Abweichungen zwischen den beiden Spektroskopiemethoden bestanden [109, 114].

Um die Stabilität der erstellten MLR- und PLS-Modelle bei einer Prozessvariation zu bewerten, wurden Probenzusammensetzungen eingestellt und vorhergesagt, welche nicht im Kalibrationsdatensatz der Modelle enthalten waren (vgl. Kapitel 4.1.6). Im Fall der Raman-Spektroskopie zeigten die analytspezifischen 2D-MLR-Modelle für alle drei Analyten im Vergleich zu den übrigen Modellen (4D-MLR, PLS DV, PLS oDV) lediglich kleine Konzentrationsabweichungen (vgl. Abbildung 41). Bei der MIR-ATR-Spektroskopie konnte zwar die Glucosekonzentration mit Hilfe des 2D-MLR-Modells gut vorhergesagt werden, dagegen zeigten sich größere Abweichungen sowohl für Ethanol als auch für die Biomasse. Letztendlich zeigte sich, dass bei der in Kapitel 4.1.6 simulierten Prozessabweichung die analytspezifischen 2D-MLR-Modelle oftmals geringere Vorhersagefehler im Vergleich zu 4D-MLR- bzw. PLS-Modellen aufwiesen.

Die ermittelten und in Tabelle 10 dargestellten Messgenauigkeiten sind dabei mit verschiedenen Literaturangaben, sowohl für die Raman- [69, 124, 125] als auch für die MIR-ATR-Spektroskopie [40, 45] vergleichbar. Dabei analysierten beispielsweise Sivakesava et al. [45] Offline-Proben von anaeroben Hefe-Fermentationen mit einem FT-MIR-Spektrometer inkl. ATR-Modul. Die anfängliche Glucosekonzentration betrug dabei etwa 50 g L–1, welche in 20 g L–1 Ethanol verstoffwechselt wurde. Die quantitative Analyse der spektralen Daten erfolgte mit Hilfe verschiedener PLS-R- und PCR-Modelle. Dabei lieferten die PLS-Modelle mit erster Ableitung als Datenvorbehandlung die kleinsten Vorhersagefehler, welche für Glucose 1,819 g L–1 (3 % relativer Fehler, bezogen auf die Maximalkonzentration), für Ethanol 1,243 g L–1 (6 %) und für die optische Zelldichte 0,590 (20 %) ergaben. Bis auf die vergleichsweise große relative Abweichung von 20 % bei der Bestimmung der optischen Zelldichte (Biomasse) stimmten die Vorhersagefehler mit denen in dieser Arbeit ermittelten Werten sehr gut überein. Im Fall der Raman-Spektroskopie stellten Wang et al. [125] bei einer Wein-Fermentation ein FT-Spektrometer mit Autokalibrierung vor, um die Auswirkungen der Umgebungstemperatur auf die Ramanspektren zu kompensieren. Der Messaufbau bestand aus einem Bruker MultiRAM-System mit einem 1064 nm Laser und einem Germanium-Detektor, welcher mit flüssigem Stickstoff gekühlt wurde. Um die Streueffekte während der Fermentation zu eliminieren, befand sich die verwendete Raman-Immersionssonde in einem speziellen Filterrohr. Die Vorhersagefehler der PLS-PCA-Modelle lagen für Glucose bei 0,22 g L–1 (0,4 % relativer Fehler) und für Ethanol bei 0,03 Vol.-% (0,2 %). Damit waren die erzielten RMSEP-Werte deutlich kleiner als die in Tabelle 10 dargestellten Vorhersagefehler, wobei Wang et al. ein im Vergleich zu dieser Arbeit anderes Spektrometersystem verwendeten und die Raman-Messungen in einer partikelfreien Umgebung stattfanden.

5 Diskussion 88

In den oben genannten Publikationen wurde entweder die Raman- oder die MIR-Spektroskopie zur Prozessüberwachung eingesetzt bzw. es erfolgten lediglich Offline-Messungen aufgetauter Proben mit Hilfe der beiden Spektroskopiemethoden. Dagegen wurden in dieser Arbeit erstmals sowohl die Raman- als auch die Mittelinfrarotspektroskopie gleichzeitig zur Echtzeitverfolgung von Hefefermentationen eingesetzt und miteinander verglichen. Bei den in Abbildung 37, 38, 39 und 40 (vgl. Kapitel 4.1.4) dargestellten zeitlichen Konzentrationsverläufen der Analyten sowie in den in Tabelle 9 und 10 (vgl. Kapitel 4.1.5) aufgeführten Qualitätsparametern zeigten sich keine signifikanten Unterschiede. Generell ist jedoch zu beachten, dass die Bewertung der beiden Spektroskopiearten anhand der durchgeführten Hefe-Fermentationen und der unterschiedlichen multivariaten Auswertemodelle nur für die in dieser Arbeit verwendeten Messaufbauten gilt. Eine Änderung der Systemkomponenten wie Spektrometer, Laserwellenlänge und Laserleistung, Brennweite der Ramansonde oder der Einsatz einer MIR-ATR-Immersionssonde anstelle einer Durchflusszelle würde einen Einfluss auf die Ergebnisse haben. Zum Beispiel würde in unserem Ramansystem der Einsatz eines 1064 nm Nd:YAG Lasers anstelle des 785 nm Diodenlasers zu einer deutlichen Reduzierung des Fluoreszenzuntergrunds in Abbildung 35 (vgl. Kapitel 4.1.3) führen. Jedoch würde der langwelligere Laser, bei gleicher Laserleistung, eine Verringerung der gemessenen Signalintensitäten um den Faktor 3 zur Folge haben. Weiterhin könnte der Einfluss von Hefezellen und anderen Partikeln auf das Raman-Signal aufgrund von Lichtstreuung durch eine speziell für opake Medien optimierte Raman-Immersionssonde mit sehr kurzer Brennweite [68, 69] reduziert werden (vgl. Kapitel 2.1.3). Auch beeinflussen Laserinstabilitäten sowie eine kontinuierliche Verringerung der Laserleistung mit zunehmender Betriebsdauer die Messempfindlichkeit. Instabilitäten in der Laserleistung können jedoch beispielsweise mit Hilfe von internen oder externen Standards [66, 67] kompensiert werden. Im Gegensatz zur Raman-Spektroskopie haben langzeitbedingte Intensitätsschwankungen von Schwarzkörperstrahlern in MIR-Aufbauten keinen Einfluss auf die Stabilität von Kalibrationsmodellen, wenn in regelmäßigen Intervallen Hintergrundmessungen (z.B. Aufnahme eines Intensitätsspektrums gegen Umgebungsluft) durchgeführt und als neue Referenz verwendet werden. Eine Schwachstelle von MIR-Messsystemen mit ATR-Durchflusszellen könnte eine Biofilmbildung oder Ablagerung durch Antischaummittel auf dem ATR-Kristall darstellen. Eine dadurch erforderliche Reinigung der ATR-Oberfläche würde in der betrieblichen Praxis zu einem hohen Wartungsaufwand führen. Eine mögliche aber kostenintensivere Alternative zu ATR-Durchflusszellen stellt die Verwendung von ATR-Immersionssonden [26] zur Inline-Messung dar, wobei auch hier Ablagerungen auf der Messoberfläche nicht auszuschließen sind. Aufgrund der schlechten Transmissionseigenschaften ist die Länge der dabei eingesetzten und zusätzlich fragilen MIR-Fasern auf weniger als 5 m eingeschränkt. Diese Umstände erschweren bisher einen Transfer dieser Messtechnik vom Labor- in den Produktionsmaßstab.

5 Diskussion 89

Basierend auf den in dieser Arbeit präsentierten Resultaten sollte für eine Prozessverfolgung im Laborbereich die MIR-Spektroskopie gegenüber der Raman-Spektroskopie vorteilhaft sein. Zudem liegt der Preis des hier verwendeten MIR-ATR-Messsystems mit 25.000 € deutlich unter dem des Raman-Systems (65.000 €). Dagegen besitzt die Raman-Spektroskopie den Vorteil, dass mit Hilfe von Quarzlichtleitern große Distanzen (bis ca. 100 m, vgl. Kapitel 2.1.3) zwischen Sonde und Spektrometer oder Laser überbrückt werden können, was einer Implementierung in industriellen Umgebungen zugutekommt [109]. Je nach Probenzusammensetzung und Messumgebung haben somit beide Messmethoden ihre Vor- und Nachteile. Wichtige Kriterien für die Prozessimplementierung der Raman- und MIR-ATR-Spektroskopie sind in Tabelle 15 aufgeführt und können dem Anwender bei der Wahl der geeigneten Spektroskopiemethode für die jeweilige Anwendung unterstützen.

Tabelle 15: Vergleich der Funktionalitäten von Raman- und MIR-ATR-Spektroskopie für die Bioprozessanalytik (+ Vorteil, o Ausreichend, – Nachteil / Herausforderung).

Wie bei der Fermentationsüberwachung aufgezeigt, ermöglichte sowohl die Raman- als auch die MIR-ATR-Spektroskopie eine simultane Bestimmung mehrerer Analyten in Echtzeit. Die Datenauswertung mit Hilfe einfacher MLR-Modelle konnte dabei zur Simulation fiktiver Photometer- bzw. Sensorsysteme mit zwei oder mehr Spektralbereichen genutzt werden (vgl. Kapitel 4.1 und 4.3). Solch ein mathematisches Verfahren eröffnet neue Möglichkeiten zur Planung von kosteneffizienten photometrischen Hardwarekonzepten. Anstelle von kommerziellen und kostenintensiven Raman-Spektrometersystemen mit peltiergekühlten CCD-Array-Detektoren könnten geeignete Filtereinheiten in Kombination mit kostengünstigeren Detektoren wie bspw. Avalanche-Photodioden (APD’s) oder Multi Pixel Photon Counters (MPPC’s) etabliert werden [70]. Im MIR-Bereich wurde dagegen bereits ein Vierkanal-Sensor, bestehend aus einem IR-Strahler, einem ATR-Prisma aus ZnSe und vier thermischen Detektoren mit je einem optischen Bandpassfilter realisiert (vgl. Kapitel 3.2.2), wobei die erzielten Ergebnisse in dem nachfolgenden Abschnitt diskutiert werden.

Kriterium MIR-ATR Raman Sensitivität + o Selektivität + +

Kalibrations- und Vorhersagefehler + + Querempfindlichkeit durch Lichtstreuung oder Fluoreszenz + –

Querempfindlichkeit durch (Bio-)Filmbildung – + Einsatz optischer Lichtwellenleiter – + Langzeitstabilität der Lichtquelle + o

Kosten + o Prozessimplementierung o +

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5.2 Prozessverfolgung mit einem MIR-ATR-Sensor

Der im PI-Institut entwickelte MIR-ATR-Sensor wurde bei einphasigen Batch-Fermentation von S. cerevisiae getestet und mit einem kommerziellen FT-MIR-Spektrometer verglichen. Hierbei konnte die Verstoffwechselung der Kohlenstoffquelle Glucose und die gleichzeitige Produktbildung von Ethanol quantitativ in Echtzeit verfolgt werden. Bei dieser Prozessverfolgung wies der kostengünstige Prototyp-Sensor (Materialkosten zwischen ca. 2.000 – 5.000 €, abhängig vom ATR-Material und der Wahl der Filter) eine etwas schlechtere Messperformance auf als das technisch ausgereifte Spektrometer. Jedoch lässt sich ein solcher Sensor aufgrund seiner Robustheit (keine beweglichen Komponenten) sowie der kompakten Bauweise vergleichsweise einfach in einen Prozess implementieren.

Aus vorherigen Arbeiten war bereits bekannt, dass der MIR-ATR-Sensor mit den verwendeten Standard-Bandpassfiltern F1 – F4 den Analyten Glucose durch einen direkten kausalen Zusammenhang zwischen Konzentration und gemessenen Absorptionswerten bestimmen konnte [126]. Dagegen konnte Ethanol in dem hier verwendeten Konzentrationsbereich nicht direkt detektiert werden, da im vorgesehenen Ethanol-Messkanal F3 einerseits der Ethanolpeak zu schwach ausgeprägt war und andererseits dieser durch die gleichzeitig vorhandene Absorptionsbande von Glucose überlagert wurde (vgl. Abbildung 48 und Abbildung 31). Dies spiegelte sich auch in den in Gleichung 4-6 und 4-7 dargestellten 4D-MLR-Kalibrationsmodellen wider, da die Regressionskoeffizienten von Ethanol gegenüber den von Glucose ein entgegengesetztes Vorzeichen aufwiesen. Zudem lagen die Verhältnisse der jeweiligen Koeffizienten zwischen Glucose und Ethanol in der gleichen Größenordnung [8]. Dies galt insbesondere für die Kanäle F2 und F4, da hier die Verhältnisse der Regressionskoeffizienten –3,3 bzw. –3,1 betrugen, was in guter Übereinstimmung mit dem Zusammenhang aus eingesetzter Glucosekonzentration (100 g L–1) und produzierter Ethanolmenge (30 g L–1) lag [8] und daher auf eine Korrelation mit dem Glucoseabbau schließen lässt.

Theoretisch kann der entwickelte MIR-ATR-Sensor aufgrund seiner vier optischen Absorptionskanäle die Konzentrationsänderungen von bis zu vier verschiedenen Analyten gleichzeitig verfolgen. Dies konnte bereits in einer früheren Arbeit unter Beweis gestellt werden. Hier wurden bei der Veresterung von Ameisensäure und Ethanol zu Ethylformiat und Wasser alle vier Analyten gleichzeitig verfolgt [8, 28]. Die Kalibration des Sensors erfolgte dabei ebenfalls durch MLR, wobei der Vorhersagefehler für Ethanol, Ameisensäure, Ethylformiat und Wasser bei 0,38 mol L–1, 0,48 mol L–1, 0,38 mol L–1 und 1,12 mol L–1 lag. Die Voraussetzung für die gleichzeitige Bestimmung sämtlicher Analyten war, dass die gemessenen Absorptionen der Analyten in den vier Kanälen linear unabhängig voneinander waren (keine Kollinearitäten bestanden). Zudem haben die hohen Edukt- und Produktkonzentrationen die erfolgreiche Anwendung des Sensors unterstützt.

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Im Gegensatz zu chemischen Reaktionen besteht die Matrix vieler biotechnologischer Prozesse hauptsächlich aus Wasser. Daher sind die entsprechenden Analytkonzentrationen von Produkten und Edukten vergleichsweise gering. Des Weiteren führt die komplexe Zusammensetzung von Fermentationsmedien oftmals zu Überlappungen von Absorptionsbanden unterschiedlicher Analyten. Um zu testen, ob der MIR-ATR-Sensor unter diesen anspruchsvollen Rahmenbedingungen für die Bioprozessanalyse eingesetzt werden kann, wurden einphasige Batch-Fermentation von S. cerevisiae in Echtzeit verfolgt. Dabei führte die Änderung der Biomassekonzentration, im Vergleich zu Glucose und Ethanol, zu keiner signifikanten Absorptionsänderung in den Transmissionsbereichen der optischen Bandpassfilter, weshalb an dieser Stelle auf ein MLR-Modell zur Vorhersage der Biomasse verzichtet wurde. Zudem konnte für Biomasse in den aufgenommenen FT-MIR-Spektren keine analytspezifische Bande identifiziert werden (vgl. Kapitel 4.1.3). In Bezug auf die Maximalkonzentrationen der beiden untersuchten Analyten betrug der relative Fehler zur Bestimmung von Glucose 6 % und von Ethanol 5 %. Die erzielten Messgenauigkeiten stimmten dabei sehr gut mit den in Kapitel 4.1.5 erhaltenen Vorhersagefehlern überein, obwohl hierbei die Maximalkonzentrationen um den Faktor 3 niedriger waren. Im Vergleich dazu verfolgten Veale et al. [40] eine anaerobe Fermentation von S. cerevisiae mit einem kommerziellen FT-MIR-Spektrometer und verschiedenen PLS-R- und PCR-Modellen. Solche statistischen Analyseverfahren nutzen bei der Modellerstellung, im Gegensatz zu MLR-Modellen, den gesamten spektralen Informationsgehalt und werden daher standardmäßig bei der Prozessverfolgung mit Spektrometersystemen eingesetzt. Bei der von Ihnen untersuchten alkoholischen Gärung wurden 75 g L–1 Glucose in etwa 30 g L–1 Ethanol umgewandelt. Dabei betrugen die bestmöglichen Vorhersagefehler 1,386 g L–1 für Glucose (2 % relativer Fehler) und 0,985 g L–1 für Ethanol (3 %) und sind damit vergleichbar mit den Vorhersagefehlern, welche mit einem FT-MIR-Spektrometer und einer MLR-Auswertung erreicht wurden (vgl. Tabelle 12, Kapitel 4.2) [23].

Die Messgenauigkeit des Sensors kann durch die Auswahl von analytspezifischen Bandpassfiltern verbessert werden. Solche optischen Filter weisen eine hohe Transmission in Spektralbereichen auf, in denen die bei einer Reaktion untersuchten Analyten starke und – wenn möglich – selektive Absorptionsbanden aufweisen (vgl. Kapitel 4.1.3). Durch einen Austausch der optischen Bandpassfilter kann ein solcher Sensor an eine Vielzahl biotechnologischer und chemischer Prozesse individuell angepasst werden. Die für jede Anwendung spezifisch auszuwählenden Filter erschweren jedoch die Kommerzialisierung eines solchen Sensors. Da zudem der Vierkanal-Thermopile-Detektor während des Herstellungsprozesses mit den vorgeschalteten Bandpassfiltern ausgestattet wird, muss die Wahl der Filter im Voraus erfolgen. Die spektralen Transmissionsbereiche der optischen Bandpassfilter (vgl. Kapitel 3.2.2, Tabelle 5) wurden für den hier gezeigten MIR-ATR-Sensor so gewählt, dass diese eine hohe Sensitivität gegenüber einer Vielzahl an Kohlenwasserstoffen in biotechnologischen und chemischen Reaktionen aufweisen. Derzeit sind nur wenige kostengünstige Filtertypen erhältlich. Viele dieser Bandpassfilter werden

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standardmäßig in MIR-Gasanalysatoren zur Detektion von CO2, CO, NOx, SO2 und CH4 eingesetzt [27]. Für optische Bandpassfilter, welche nicht auf dem Markt erhältlich sind, muss eine komplette Filtereinheit hergestellt werden. Aus dieser Filtereinheit wird dann wiederum eine bestimmte Anzahl an Filtern ausgeschnitten. Die Kosten für eine solche Sonderanfertigung einschließlich dem Zuschneiden der Filter belaufen sich derzeit auf etwa 4.000 €. Der Preis für eine speziell angefertigte Filtereinheit liegt damit in der gleichen Größenordnung wie die gesamten Materialkosten für den hier vorgestellten MIR-ATR-Sensor, welcher mit vier Standard-Bandpassfiltern ausgestattet wurde. Ist die spezielle Anfertigung mehrerer Filtereinheiten erforderlich würden die Kosten entsprechend steigen. Jedoch könnten durch die Produktion höherer Stückzahlen eines MIR-ATR-Sensors die Herstellungskosten für solche Bandpassfilter deutlich reduziert werden. Die weitere Etablierung kompakter MIR-ATR-Sensoren zur Prozessüberwachung in der Flüssigphase würde zudem zu einer größeren Auswahl von Filtern für die wichtigsten funktionellen Gruppen bzw. Analyten in der biotechnologischen und chemischen Industrie führen. Dadurch könnte ein solcher Sensor mit einer Vielzahl an analytspezifischen optischen Bandpassfiltern ausgestattet werden, ohne dass dies einen wesentlichen Einfluss auf die Produktionskosten hätte [28].

5.3 Prozessverfolgung mit einer kontaktlosen Ramansonde

Eine neu entwickelte nicht-invasive Ramansonde, welche bereits großes Potential bei wässrigen und partikelfreien Stoffsystemen zeigte [11], wurde bei einem opaken System getestet. Als Modellreaktion wurde der etablierte biotechnologische Prozess der Hefe-Fermentation von Glucose zu Ethanol durch S. cerevisiae gewählt. Mit der Ramansonde wurden dabei Inline-Messungen in Echtzeit durchgeführt, wobei die Sonde von außen an den Glasbehälter eines Bioreaktors angebracht war und damit nicht in die Fermentationsbrühe eintauchte. Die Konzentrationsänderungen wurden mit Hilfe einfacher MLR-Modelle berechnet und die dadurch vorhergesagten zeitlichen Verläufe für Glucose und Ethanol stimmten gut mit den HPLC-Referenzanalysen überein.

Bezogen auf die während der Fermentation vorhandenen Maximalkonzentrationen lag der relative Fehler zur Bestimmung von Glucose bei 5 % und für Ethanol bei 3 %. Diese Ergebnisse lagen in etwa in dem Bereich, welche mit dem MIR-ATR-Sensor (vgl. Kapitel 4.2, Tabelle 12) bzw. den beiden simultan angewendeten Spektrometersystemen (vgl. Kapitel 4.1.5, Tabelle 10) erzielt wurden und müssten daher für die Überwachung vieler biotechnologischer Prozesse geeignet sein [70]. Zudem ist damit die Angabe der relativen Fehler für beide Spektroskopiemethoden auf verschiedene, in dieser Arbeit untersuchte, Konzentrationsbereiche übertragbar (vgl. Kapitel 5.1 und 5.2). Die erreichten Messgenauigkeiten können zudem mit Angaben aus der Literatur verglichen werden. Beispielsweise ermittelten Iversen et al. [69] bei einer anaeroben Hefe-Fermentation einen bestmöglichen RMSEP-Wert von 2,357 g L–1 für Glucose (6 % relativer Fehler) und 1,611 g L–1

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für Ethanol (8 %). Die Datenauswertung erfolgte über lineare Regression, wobei vorher eine Streukorrektur der Messsignale mit Hilfe quadratischer Funktionen erfolgte. Im Vergleich dazu verfolgten Ávila et al. [124] die Fermentation von S. cerevisiae mit einem kommerziellen Raman-Spektrometer und einer Durchfluss-Quarzküvette im Bypass. Hierbei wurden mit komplexeren multivariaten Auswertemethoden, welche auf PLS-R-Modellen basieren, RMSEP-Werte von 0,54 % für Glucose (5 % relativer Fehler) und 0,25 % für Ethanol (2 %) erreicht.

Neben Hefe-Fermentationen könnte die entwickelte nicht-invasive Ramansonde auch für die Überwachung anderer Bioprozesse, wie bspw. die Produktion von Antikörpern durch CHO-Zellen, von großem Interesse sein. Da die meisten Fermentationsprozesse über mehrere Stunden bis hin zu Wochen andauern, ist hierbei das Risiko einer Kontamination ein wichtiges Thema. Im Gegensatz zu kommerziellen Ramansystemen bei welchen faseroptische Immersionssonden im direkten Kontakt zur Zellkultur stehen [127, 128], ermöglichte die hier vorgestellte Ramansonde kontaktlose Messungen in der Fermentationsmatrix durch optische Schaugläser oder Glasmäntel von Bioreaktoren. Mit einer solchen Prozesslösung könnten mögliche Kontaminationen durch eine Tauchsonde zur Überwachung verschiedener Analytkonzentrationen ausgeschlossen werden. Darüber hinaus weist die nicht-invasive Ramansonde zusätzliche Vorteile auf, vor allem in Bezug auf industrielle Anwendungen. Da kein direkter Kontakt zum Reaktionsmedium besteht, muss die Sonde nicht autoklaviert bzw. extra gereinigt werden. Diese Art der Raman-Spektroskopie erlaubt eine einfache, kosteneffiziente und kontaktlose Prozessüberwachung durch die Adaption der Sonde an bereits existierende Messstellen in Produktionsanlagen (z.B. an optischen Schaugläsern von Reaktoren oder produktführenden Leitungen). Zudem kann eine Wartung oder ein Austausch der Sonde während des laufenden Prozesses stattfinden.

Die Vorteile der in dieser Arbeit gezeigten kontaktlosen Raman-Sonde können wie folgt zusammengefasst werden:

• keine Reinigung/Autoklavierung der Sonde erforderlich, da kein Kontakt zum Messgut besteht

• einfache Wartung bzw. Veränderungen im Sondenaufbau möglich, da keine direkte Prozessimplementierung erforderlich ist

• kostengünstig, da keine speziellen Materialien wie z.B. Hastelloy, Tantal oder Keramik notwendig sind und kein Anlageneingriff erfolgt

• variable Einstellung der effektiven Brennweite (bspw. über Lineareinheit) ermöglicht sowohl Messungen von klaren Lösungen als auch von lichtstreuenden Suspensionen

• einfache Adaptierung an Messstelle, da die Sonde keinen hohen Temperaturen und Drücken sowie aggressiven chemischen Umgebungsbedingungen ausgesetzt ist

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Um dieses Messkonzept zu einer vollständigen Lösung in der Prozessanalysentechnik (PAT) voranzutreiben, sind neben den Anforderungen der DIN zusätzlich diejenigen der chemischen Industrie einzuhalten. Exemplarisch sei hier die elektromagnetische Verträglichkeit EMV nach NAMUR NE 21 oder die explosionsgeschützte Ausführung des Systems (ATEX-Zulassung) genannt. Selbst unter diesen Randbedingungen würde der hier vorgestellte Sondenaufbau die Möglichkeit einer unkomplizierten Nachrüstung von Raman-Messtechnik an existierende industrielle Anlagen ermöglichen. Es ist daher plausibel, dass diese kontaktlose Raman-Sonde zu einer kostengünstigen Inline-Prozesslösung beiträgt und in der PAT etabliert werden kann [11].

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Verzeichnisse 105

Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Schematische Darstellung zur Veranschaulichung von Grundschwingungen

(𝑣𝑣 = 0 𝑣𝑣 = 1) im MIR-Bereich, Oberschwingungen (𝑣𝑣 = 0 𝑣𝑣 = 2,3,4, …) i.d.R. im NIR-Bereich sowie der elastischen Rayleigh-Streuung und der unelastischen Raman-Streuung mit Hilfe des Jablonski-Schemas. Die beiden rot markierten Pfeile verdeutlichen dabei die Anregung von Grundschwingungen sowohl bei der MIR-Spektroskopie als auch bei der Raman-Spektroskopie.................................................. 5

Abbildung 2: Schematischer Aufbau eines Gitterspektrometers mit einem InGaAs-Diodenarray für die NIR-Spektroskopie bzw. einem CCD-Array für die Raman-Spektroskopie (abgeändert nach [15, 16]). ......................................................................................... 11

Abbildung 3: Schematischer Aufbau eines Fourier-Transformations-Spektrometers für die MIR-Spektroskopie (übernommen aus [8, 15]). .................................................................. 12

Abbildung 4: Schematischer Aufbau des optischen Strahlengangs in einer ATR-Messzelle mit drei Reflexionsstellen zwischen Probe und Prisma (abgeändert nach [8, 15]). ................. 13

Abbildung 5: Foto des 6 L-Laborfermenters (rechts) mit Steuereinheit (links) und Messsonden während einer Batch-Fermentation von Saccharomyces cerevisiae. .......................... 29

Abbildung 6: Foto des Fermenterdeckels mit Belegung der Anschlüsse. ......................................... 29 Abbildung 7: Chromatogramm einer vermessenen Fermentationsprobe in der Chromatographie-

Software ChemStation mit Glucose- (grünes Rechteck) und Ethanolpeak (rotes Oval) sowie den dazu tabellarisch dargestellten Informationen (blaues Parallelogramm), übernommen aus [110]. .............................................................................................. 33

Abbildung 8: HPLC-Kalibrationsgeraden von jeweils einer Verdünnungsreihe zur Bestimmung der Glucose- und Ethanolkonzentration in den Proben der zweiphasigen Batch-Fermentationen. .......................................................................................................... 34

Abbildung 9: Messaufbau für die simultane Prozessanalytik einer Hefefermentation mittels Raman- und MIR-ATR-Spektroskopie. ......................................................................... 34

Abbildung 10: Aufbau des Vierkanal-MIR-ATR-Sensors. Technische CAD-Zeichnung (A) sowie Messprinzip und optischer Strahlengang (B) [8, 13]. .................................................. 37

Abbildung 11: Schematischer Aufbau zur Online-Überwachung von Hefe-Fermentationen mit dem entwickelten MIR-ATR-Sensor und einem kommerziellen FT-MIR-Spektrometer in einem Bypass. .............................................................................................................. 40

Abbildung 12: Optischer Aufbau der kontaktlosen Ramansonde mit einer Brennweite von 25,4 mm zur Inline-Ramananalyse. Die große Brennweite ermöglichte Messungen durch Schaugläser bzw. Glasmäntel von (Bio-)Reaktoren oder Rohrleitungen (siehe Grafik links oben). .................................................................................................................. 41

Abbildung 13: Schematischer Aufbau zur Inline-Überwachung von Hefe-Fermentationen mit einer kontaktlosen Ramansonde sowie ein Foto des realisierten Aufbaus (rechts oben). Der Lineartisch ermöglichte eine auf den Prozess optimierte Einstellung der effektiven Brennweite. ................................................................................................................. 42

Abbildung 14: Mit dem Microsoft Editor geöffnete .txt-Datei welche durch Aufnahme eines Raman-Spektrums mit der Software MultiSpec® Pro II erzeugt wurde [110]. ........................ 43

Abbildung 15: Mit Hilfe eines VBA-Makros als .txt-Dateien in Excel importierte Raman-Spektren. .. 44 Abbildung 16: Mit Hilfe eines VBA-Makros als .txt-Dateien in Excel konvertierte und um redundante

Wellenzahl-Spalten reduzierte Raman-Spektren zur MLR-Auswertung. .................... 45 Abbildung 17: Bedienoberfläche der Software OPUS mit dem ausgewählten Makro „opus2xy.obs“

zur Konvertierung von .0-Dateien in .txt-Dateien. ...................................................... 46

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Abbildung 18: Bedienoberfläche des Makros „opus2xy.obs“ mit beispielhaft ausgewählten .0-Dateien. Durch Betätigung des Feldes „Convert“ wurden diese in .txt-Dateien konvertiert, welche zur MLR-Auswertung in Excel benötigt wurden. ......................... 46

Abbildung 19: Mit Hilfe eines VBA-Makros als .txt-Dateien in Excel konvertierte und um redundante Wellenzahl-Spalten reduzierte MIR-Spektren zur MLR-Auswertung. ......................... 47

Abbildung 20: Bedienoberfläche der Software OPUS mit dem ausgewählten Makro „jcamp2opus_Name.obs“ zur Konvertierung von .txt-Dateien in .0-Dateien. ............ 49

Abbildung 21: Erstellung eines PLS-Kalibrationsmodells mit Hilfe der Quant 2 Methode in OPUS. .. 50 Abbildung 22: Hinzufügen der zu analysierenden Komponenten für ein PLS-Kalibrationsmodell mit

Hilfe der Quant 2 Methode. ........................................................................................ 51 Abbildung 23: Hinzufügen der Spektren zu den entsprechenden Probennahmezeitpunkten aus drei

Fermentationen sowie die jeweils passenden Analytkonzentrationen aus der Referenzanalytik zur Erstellung eines PLS-Kalibrationsmodells. ................................. 51

Abbildung 24: Auswahl der Datenvorbehandlung sowie Festlegung der Spektralbereiche zur Erstellung eines PLS-Kalibrationsmodells. ................................................................... 52

Abbildung 25: Grafische Darstellung des Ergebnisses der Kreuzvalidierung für Ethanol zur Erstellung eines PLS-Kalibrationsmodells. .................................................................................... 53

Abbildung 26: Tabellarische Darstellung des Ergebnisses der Kreuzvalidierung für Ethanol zur Erstellung eines PLS-Kalibrationsmodells. ................................................................... 53

Abbildung 27: Hinzufügen eines erstellten PLS-Kalibrationsmodells zur Methode „Quant 2 Analyse / Dateiliste“ in OPUS zur Vorhersage der Glucose-, Ethanol- und BTM-Konzentrationen. ..................................................................................................................................... 54

Abbildung 28: Quant 2 Analyse in OPUS zur Vorhersage von Analytkonzentrationen mittels PLS-Kalibrationsmodell anhand von Spektren einer weiteren Fermentation, welche nicht im Kalibrationsdatensatz enthalten waren. ................................................................ 55

Abbildung 29: Tabellarische Darstellung des Ergebnisses der Quant 2 Analyse in OPUS zur Vorhersage der Glucose-, Ethanol- und BTM-Konzentrationen mittels PLS-Kalibrationsmodell anhand von Spektren einer weiteren Fermentation, welche nicht im Kalibrationsdatensatz enthalten waren. ................................................................ 55

Abbildung 30: Mittels Referenzanalytik ermittelte zeitliche Konzentrationsverläufe für Glucose (HPLC), Ethanol (HPLC) und Biomasse (Gravimetrie; Biomasse entspricht hier dem Zuwachs in BTM) für vier Batch-Fermentationen von Saccharomyces cerevisiae. ..... 57

Abbildung 31: FT-MIR-Spektren von 30 g L–1 Glucose und 10 g L–1 Ethanol mit VE-Wasser als Bezugsspektrum. ......................................................................................................... 58

Abbildung 32: Raman-Spektren von 30 g L–1 Glucose und 10 g L–1 Ethanol mit VE-Wasser als Bezugsspektrum. ......................................................................................................... 59

Abbildung 33: Unbehandelte FT-MIR-Spektren zu verschiedenen Zeitpunkten während einer zweiphasigen Batch-Fermentation von S. cerevisiae. ................................................. 60

Abbildung 34: FT-MIR-Spektren zu verschiedenen Zeitpunkten einer zweiphasigen Batch-Fermentation von S. cerevisiae mit den gewählten MLR-Spektralbereichen S1, S2, S3 und S4 nach Abzug des Bezugsspektrums (Medium mit Hefe, ohne Glucose) sowie einer Geraden zur Korrektur des Offsets. Spektrenglättung mittels gleitendem Mittelwert über 11 Wellenzahlen (± 5). ...................................................................... 61

Abbildung 35: Unbehandelte Raman-Spektren zu verschiedenen Zeitpunkten während einer zweiphasigen Batch-Fermentation von S. cerevisiae. ................................................. 63

Abbildung 36: Raman-Spektren zu verschiedenen Zeitpunkten während einer zweiphasigen Hefe-Fermentation mit den gewählten MLR-Spektralbereichen S1, S2, S3 und S4 nach Abzug des Bezugsspektrums (Medium mit Hefe, ohne Glucose) sowie einer Geraden

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zur Korrektur des Offsets. Spektrenglättung mittels gleitendem Mittelwert über 11 Wellenzahlen (± 5). ...................................................................................................... 63

Abbildung 37: Mit 2D-MLR-Modellen vorhergesagte zeitliche Konzentrationsverläufe von Glucose, Ethanol und Biomasse (Biomasse entspricht hier dem Zuwachs in BTM) während einer zweiphasigen Batch-Fermentation von S. cerevisiae (Vorhersage von Fermentation 1, Kalibration mit Fermentation 2, 3 und 4). Vergleich der in Echtzeit aufgenommenen Raman- und MIR-ATR-Messwerte mit der Referenzanalytik (HPLC, Gravimetrie). ................................................................................................................ 69

Abbildung 38: Mit 4D-MLR-Modellen vorhergesagte zeitliche Konzentrationsverläufe von Glucose, Ethanol und Biomasse während einer zweiphasigen Batch-Fermentation von S. cerevisiae (Vorhersage von Fermentation 1, Kalibration mit Fermentation 2, 3 und 4). ..................................................................................................................................... 69

Abbildung 39: Mit PLS-Modellen (oDV = ohne Datenvorbehandlung) vorhergesagte zeitliche Konzentrations-verläufe von Glucose, Ethanol und Biomasse während einer zweiphasigen Batch-Fermentation von S. cerevisiae (Vorhersage von Fermentation 1, Kalibration mit Fermentation 2, 3 und 4). ................................................................... 70

Abbildung 40: Mit PLS-Modellen (DV = mit Vektornormierung als Datenvorbehandlung) vorhergesagte zeitliche Konzentrationsverläufe von Glucose, Ethanol und Biomasse (Vorhersage von Fermentation 1, Kalibration mit Fermentation 2, 3 und 4). ............ 70

Abbildung 41: Ermittelte Abweichungen der mit den verschiedenen MLR- (2D- bzw. 4D-) und PLS- (mit Datenvorbehandlung (DV) bzw. ohne DV (oDV)) Modellen vorhergesagten Konzentrationen im Vergleich zur Referenzanalytik (Probe Nr. 22) für die manuell eingestellte Prozessvariation (30 g L–1 Glucose, 10 g L–1 Ethanol) am Ende einer zweiphasigen Batch-Fermentation. ............................................................................. 73

Abbildung 42: Raman-Signalintensität (Mess- minus Referenzbereich von Ethanol (S3, S4)) bei einer Ethanolkonzentration von 10 g L–1 in Abhängigkeit der Hefekonzentration. .............. 75

Abbildung 43: Mit einem MIR-ATR-Spektrometeraufbau ermittelte Absorptionen (Mess- minus Referenzbereich von Glucose (S1, S2)) in Abhängigkeit der Glucosekonzentration. .. 76

Abbildung 44: Mit einem Raman-Spektrometeraufbau ermittelte Intensitäten (Mess- minus Referenzbereich von Glucose (S1, S2)) in Abhängigkeit der Glucosekonzentration. .. 77

Abbildung 45: Mit einem MIR-ATR-Spektrometeraufbau ermittelte Absorptionen (Mess- minus Referenzbereich von Ethanol (S3, S4)) in Abhängigkeit der Ethanolkonzentration. ... 77

Abbildung 46: Mit einem Raman-Spektrometeraufbau ermittelte Intensitäten (Mess- minus Referenzbereich von Ethanol (S3, S4)) in Abhängigkeit der Ethanolkonzentration. ... 77

Abbildung 47: Mit einem MIR-ATR-Spektrometeraufbau ermittelte Absorptionen (Mess- minus Referenzbereich von Glucose (geänderter Messbereich S1: 1070 – 1090 cm–1, S2)) in Abhängigkeit der Glucosekonzentration. .................................................................... 78

Abbildung 48: FT-MIR-Spektren zu verschiedenen Zeitpunkten während einer einphasigen Batch-Fermentation von S. cerevisiae nach Abzug des Bezugsspektrums (Medium mit Hefe, ohne Glucose) sowie spektrale Transmissionsbereiche der optischen Bandpassfilter F1, F2, F3 und F4 des MIR-ATR-Sensors zur MLR-Auswertung. .................................. 79

Abbildung 49: Mit 4D-MLR-Modellen vorhergesagte zeitliche Konzentrationsverläufe von Glucose und Ethanol während einer einphasigen Batch-Fermentation von S. cerevisiae. Vergleich der in Echtzeit aufgenommenen Messdaten eines MIR-ATR-Sensors und eines FT-MIR-Spektrometers mit den Referenzwerten der HPLC-Analytik. ................ 81

Abbildung 50: Raman-Spektren zu verschiedenen Zeitpunkten während einer einphasigen Batch-Fermentation von S. cerevisiae mit MLR-Spektralbereichen S1, S2, S3 und S4 nach Abzug des Bezugsspektrums (Medium mit Hefe, ohne Glucose) sowie einer Geraden zur Korrektur des Offsets. ............................................................................................ 83

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Abbildung 51: Mit 2D- und 4D-MLR-Modellen vorhergesagte zeitliche Konzentrationsverläufe von Glucose und Ethanol während einer einphasigen Batch-Fermentation von S. cerevisiae. Vergleich der in Echtzeit aufgenommenen Messdaten mit einer kontaktlosen Ramansonde mit den Referenzwerten der HPLC-Analytik. ................... 84

Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Übersicht über typische Lichtquellen, Sonden und Spektrometer für NIR-, MIR- und

Raman-spektroskopische Prozessaufbauten zur Echtzeitmessung in der Flüssigphase. ....................................................................................................................................... 7

Tabelle 2: Übersicht der möglichen Stoffwechselwege von Hefen sowie deren theoretische Energiegewinne unter Einsatz von Glucose bzw. Ethanol als Kohlenstoffquelle (modifiziert nach [89]). ................................................................................................ 28

Tabelle 3: Vollsynthetisches Medium zur Batch-Fermentation von S. cerevisiae, abgeändert nach [108]. ................................................................................................................... 30

Tabelle 4: Konzentration von Glucose, Hefe und Antischaummittel in Abhängigkeit der durchgeführten Batch-Fermentationen. ..................................................................... 31

Tabelle 5: Transmissionsbereiche der optischen Bandpassfilter F1 – F4 im MIR-ATR-Sensor. ... 39 Tabelle 6: Für die MLR-Auswertung verwendete Mess- und Referenzbereiche von Glucose und

Ethanol sowie Spektralbereiche für die PLS-Auswertung. .......................................... 64 Tabelle 7: 2D-MLR-Kalibrationsmodelle mit Absolutglied 𝑎𝑎 und Regressionskoeffizienten

𝛽𝛽𝑆𝑆1,𝛽𝛽𝑆𝑆2,𝛽𝛽𝑆𝑆3,𝛽𝛽𝑆𝑆4 für Glucose, Ethanol und BTM zur Vorhersage von Fermentation 1 für die jeweilige Spektroskopiemethode (Kalibration auf Basis von Fermentation 2, 3 und 4, vgl. Anhang A, Tabelle 21). ............................................................................ 66

Tabelle 8: 4D-MLR-Kalibrationsmodelle mit Absolutglied 𝑎𝑎 und Regressionskoeffizienten 𝛽𝛽𝑆𝑆1,𝛽𝛽𝑆𝑆2,𝛽𝛽𝑆𝑆3,𝛽𝛽𝑆𝑆4 für Glucose, Ethanol und BTM zur Vorhersage von Fermentation 1 für die jeweilige Spektroskopiemethode (Kalibration auf Basis von Fermentation 2, 3 und 4, vgl. Anhang A, Tabelle 22). ............................................................................ 67

Tabelle 9: Vergleich von Raman- und MIR-ATR-Spektroskopie zur Echtzeitverfolgung von zweiphasigen Hefe-Fermentationen anhand verschiedener Regressionsmodelle (2D-MLR, 4D-MLR, PLS ohne Datenvorbehandlung = PLS oDV, PLS mit Vektornormierung als Datenvorbehandlung = PLS DV). Über Fermentation 1 – 4 gemittelte Kalibrations- und Vorhersagefehler (RMSEC und RMSEP) in g L–1 für die Analyten Glucose, Ethanol und Biomasse. .............................................................................................................. 71

Tabelle 10: Vergleich von Raman- und MIR-ATR-Spektroskopie zur Echtzeitverfolgung von zweiphasigen Hefe-Fermentationen anhand verschiedener Regressionsmodelle (2D-MLR, 4D-MLR, PLS ohne Datenvorbehandlung = PLS oDV, PLS mit Vektornormierung als Datenvorbehandlung = PLS DV). Über Fermentation 1 – 4 gemittelte relative Kalibrations- und Vorhersagefehler (RMSEC und RMSEP) in Prozent, bezogen auf die jeweilige Maximalkonzentration, für die Analyten Glucose, Ethanol und Biomasse. . 72

Tabelle 11: Nachweisgrenzen von Glucose und Ethanol, ermittelt mit einem MIR- und einem Raman-Spektrometersystem. ...................................................................................... 78

Tabelle 12: Auf der Basis von 4D-MLR-Modellen erzielte Kalibrations- und Validierungsergebnisse mit dem MIR-ATR-Sensor im Vergleich zu einem FT-MIR-Spektrometer für die Analyten Glucose und Ethanol. Auswertung der Signale in den Transmissionsbereichen der optischen Filter F1 – F4. ................................................ 82

Tabelle 13: Für die MLR-Auswertung verwendete Mess- und Referenzbereiche von Glucose und Ethanol. ........................................................................................................................ 83

Verzeichnisse 109

Tabelle 14: Mit einer kontaktlosen Ramansonde und auf der Basis von 2D- und 4D-MLR-Modellen erzielte Kalibrations- und Validierungsergebnisse für die Analyten Glucose und Ethanol. Auswertung der Signale in den gewählten Spektralbereichen S1 – S4. . 85

Tabelle 15: Vergleich der Funktionalitäten von Raman- und MIR-ATR-Spektroskopie für die Bioprozessanalytik (+ Vorteil, o Ausreichend, – Nachteil / Herausforderung). ........... 89

Tabelle 16: Beispielhafte Berechnung der BTM-Konzentration in g L–1 mittels Gravimetrie für eine Fermentation. ............................................................................................................ 110

Tabelle 17: Tabellarische Auflistung der berechneten Volumenzugaben von BFM und Ethanol zur Untersuchung des Einflusses der Zellkonzentration auf die Raman-Signalintensität von gelösten Analyten. .............................................................................................. 111

Tabelle 18: Gewählte Konzentrationsschritte zur Bestimmung der Nachweisgrenze von Glucose und Ethanol. ............................................................................................................... 111

Tabelle 19: Mit der Referenzanalytik (HPLC, Gravimetrie) ermittelte Konzentrationen von Glucose, Ethanol und BTM für die vier Fermentationen. .......................................... 112

Tabelle 20: Mit den verschiedenen MLR- und PLS-Modellen vorhergesagte Konzentrationen im Vergleich zur Referenzanalytik (Probe Nr. 22) für die manuell eingestellte Prozessvariation am Ende einer zweiphasigen Batch-Fermentation. ....................... 114

Tabelle 21: Ergebnisse der Kalibration (2D-MLR) mit Absolutglied 𝑎𝑎 und Regressionskoeffizienten 𝛽𝛽𝑆𝑆1,𝛽𝛽𝑆𝑆2,𝛽𝛽𝑆𝑆3,𝛽𝛽𝑆𝑆4 für Glucose, Ethanol und BTM zur Vorhersage der vier Fermentationen. ........................................................................................................ 114

Tabelle 22: Ergebnisse der Kalibration (4D-MLR) mit Absolutglied 𝑎𝑎 und Regressionskoeffizienten 𝛽𝛽𝑆𝑆1,𝛽𝛽𝑆𝑆2,𝛽𝛽𝑆𝑆3,𝛽𝛽𝑆𝑆4 für Glucose, Ethanol und BTM zur Vorhersage der vier Fermentationen. ........................................................................................................ 115

Tabelle 23: Raman-Messsignale in den gewählten Spektralbereichen S1, S2, S3, S4 für die vier Fermentationen. ........................................................................................................ 115

Tabelle 24: MIR-ATR-Messsignale in den gewählten Spektralbereichen S1, S2, S3, S4 für die vier Fermentationen. ........................................................................................................ 117

Tabelle 25: Mit einer 2D- bzw. 4D-MLR vorhergesagte Konzentrationen anhand der Raman-Messsignale. .............................................................................................................. 119

Tabelle 26: Mit einer PLS mit Datenvorbehandlung (DV) bzw. einer PLS ohne DV vorhergesagte Konzentrationen anhand der Raman-Messsignale. .................................................. 121

Tabelle 27: Mit einer 2D- bzw. 4D-MLR vorhergesagte Konzentrationen anhand der MIR-ATR-Messsignale. .............................................................................................................. 123

Tabelle 28: Mit einer PLS mit Datenvorbehandlung (DV) bzw. einer PLS ohne DV vorhergesagte Konzentrationen anhand der MIR-ATR-Messsignale................................................. 125

Tabelle 29: Messsignale des MIR-ATR-Sensors für die vier Fermentationen mit den entsprechenden Ethanol- und Glucosekonzentrationen aus der HPLC-Referenzanalytik [8, 126]. Fermentation vom 15.10.2015 vorhergesagt. ................ 127

Tabelle 30: Messsignale des FT-MIR-Spektrometers für die vier Fermentationen mit den entsprechenden Ethanol- und Glucosekonzentrationen aus der HPLC-Referenzanalytik [8, 126]. Fermentation vom 15.10.2015 vorhergesagt. ................ 129

Tabelle 31: Messsignale des Raman-Aufbaus mit der kontaktlosen Ramansonde für die vier Fermentationen mit den entsprechenden Ethanol- und Glucosekonzentrationen aus der HPLC-Referenzanalytik. Fermentation vom 22.03.2016 vorhergesagt. .............. 130

Anhang 110

Anhang

A Anhang zur simultanen Prozessverfolgung mittels MIR-ATR- und Raman-Spektroskopie

Tabelle 16: Beispielhafte Berechnung der BTM-Konzentration in g L–1 mittels Gravimetrie für eine Fermentation.

Nr. Inhalt Falcon (mL)

mFalcon_leer (g)

mGesamt (g)

mFalcon+

Probe_nass (g)

mFalcon+Pellet_

trocken (g)

mPellet_

trocken (g)

BTM (g g−1)

Dichte (g mL−1)

BTM (g L−1)

1 9,0 6,6362 15,6843 9,0481 6,6772 0,0410 0,0045 1,0053 4,48 2 9,0 6,6273 15,6612 9,0339 6,6694 0,0421 0,0047 1,0038 4,60 3 8,9 6,6632 15,3960 8,7328 6,7082 0,0450 0,0052 0,9812 5,09 4 9,2 6,6508 15,7849 9,1341 6,7082 0,0574 0,0063 0,9928 6,21 5 8,6 6,6485 15,2426 8,5941 6,7153 0,0668 0,0078 0,9993 7,68 6 8,4 6,6400 14,9013 8,2613 6,7126 0,0726 0,0088 0,9835 8,68 7 9,0 6,6640 15,5746 8,9106 6,7453 0,0813 0,0091 0,9901 9,01 8 8,4 6,6531 14,8092 8,1561 6,7274 0,0743 0,0091 0,9710 9,00 9 7,8 6,6144 14,4976 7,8832 6,6882 0,0738 0,0094 1,0107 9,25

10 8,0 6,6112 14,5486 7,9374 6,6879 0,0767 0,0097 0,9922 9,55 11 9,3 6,6629 15,6535 8,9906 6,7485 0,0856 0,0095 0,9667 9,41 12 8,7 6,6607 15,1755 8,5148 6,7426 0,0819 0,0096 0,9787 9,50 13 8,7 6,6700 15,1969 8,5269 6,7562 0,0862 0,0101 0,9801 9,99 14 9,0 6,6625 15,6178 8,9553 6,7571 0,0946 0,0106 0,9950 10,44 15 8,9 6,6770 15,4545 8,7775 6,7750 0,0980 0,0112 0,9862 11,03 16 8,7 6,6862 15,2224 8,5362 6,7831 0,0969 0,0114 0,9812 11,22 17 8,0 6,6341 14,4461 7,8120 6,7322 0,0981 0,0126 0,9765 12,41 18 8,0 6,6542 14,6490 7,9948 6,7550 0,1008 0,0126 0,9994 12,46 19 8,7 6,6429 15,2761 8,6332 6,7609 0,1180 0,0137 0,9923 13,50 20 9,0 6,6262 15,4734 8,8472 6,7507 0,1245 0,0141 0,9830 13,90 21 8,9 6,7557 15,4752 8,7195 6,8788 0,1231 0,0141 0,9797 13,95

Mittelwert Dichte 0,9880

Anhang 111

Tabelle 17: Tabellarische Auflistung der berechneten Volumenzugaben von BFM und Ethanol zur Untersuchung des Einflusses der Zellkonzentration auf die Raman-Signalintensität von gelösten Analyten.

Konzen-tration

BTM (g L−1)

Gesamt-volumen

Reaktor (L)

BTM (g)

BFM (g)

Ethanol (g)

Gewicht Ethanol-gemisch

(g)

Volumen Ethanol-

gemisch (g)

Zugabe BFM (g)

Zugabe Ethanol

(mL)

0 5,068 0,0 0,0 50,7 53,9 67,47 0,0 67,47 1 5,085 5,1 16,9 50,9 54,1 67,70 16,9 0,23 2 5,102 10,2 34,0 51,0 54,3 67,92 17,1 0,23 3 5,12 15,4 51,2 51,2 54,5 68,16 17,2 0,24 4 5,137 20,5 68,5 51,4 54,6 68,39 17,3 0,23 5 5,155 25,8 85,9 51,6 54,8 68,63 17,4 0,24 6 5,173 31,0 103,4 51,7 55,0 68,87 17,5 0,24 7 5,191 36,3 121,1 51,9 55,2 69,11 17,7 0,24 8 5,209 41,7 138,9 52,1 55,4 69,35 17,8 0,24 9 5,227 47,0 156,8 52,3 55,6 69,59 17,9 0,24

10 5,245 52,5 174,8 52,5 55,8 69,83 18,0 0,24 11 5,264 57,9 193,0 52,6 56,0 70,08 18,2 0,25 12 5,282 63,4 211,3 52,8 56,2 70,32 18,3 0,24 13 5,301 68,9 229,7 53,0 56,4 70,57 18,4 0,25 14 5,32 74,5 248,2 53,2 56,6 70,83 18,6 0,25 15 5,338 80,1 266,9 53,4 56,8 71,06 18,6 0,24

Tabelle 18: Gewählte Konzentrationsschritte zur Bestimmung der Nachweisgrenze von Glucose und Ethanol.

MIR-ATR-Messsystem Raman-Messsystem

Konzentration Ethanol (g L–1)

Konzentration Glucose (g L–1)

Konzentration Ethanol (g L–1)

Konzentration Glucose (g L–1)

0,0 0,0 0,0 0,0 0,1 0,1 0,1 0,1 0,2 0,2 0,2 0,2 0,3 0,3 0,3 0,3 0,4 0,4 0,4 0,4 0,5 0,5 0,5 0,5 0,6 0,6 0,6 0,6 0,7 0,7 0,7 0,7 0,8 0,8 0,8 0,8 0,9 0,9 0,9 0,9 1,0 1,0 1,0 1,0 2,0 1,1 2,0 1,1 3,0 1,2 3,0 1,2 4,0 1,3 4,0 1,3 5,0 1,4 5,0 1,4

10,0 1,5 10,0 1,5

2,0

2,0 3,0 3,0 4,0 4,0 5,0 5,0

30,0 30,0

Anhang 112

Tabelle 19: Mit der Referenzanalytik (HPLC, Gravimetrie) ermittelte Konzentrationen von Glucose, Ethanol und BTM für die vier Fermentationen.

Fermentation (Nr., Datum)

Dauer (h)

HPLC Gravimetrie Glucose (g L–1)

Ethanol (g L–1)

BTM (g L–1)

Zunahme BTM (g L–1)

- 1 -

17.03.2017

0,0 29,76 0,20 4,23 0,00 0,5 26,28 1,35 4,45 0,21 1,0 21,74 2,97 5,41 1,17 1,5 15,54 5,11 6,56 2,32 2,0 7,53 7,86 7,57 3,34 2,5 0,00 9,97 9,22 4,99 3,0 0,00 9,48 9,26 5,02 3,5 0,00 9,22 9,61 5,37 4,0 0,00 8,72 9,46 5,22 4,5 0,00 8,26 9,52 5,29 5,0 0,00 7,81 9,86 5,62 5,5 0,00 7,38 9,93 5,70 6,0 0,00 6,90 10,40 6,17 6,5 0,00 6,04 11,08 6,84 7,0 0,00 5,18 11,40 7,16 7,5 0,00 4,15 11,93 7,70 8,0 0,00 3,04 12,61 8,38 8,5 0,00 1,96 13,16 8,93 9,0 0,00 0,83 14,11 9,87 9,5 0,00 0,15 14,60 10,37

10,0 0,00 0,14 14,67 10,44

- 2 -

20.03.2017

0,0 29,78 0,32 4,56 0,00 0,5 26,56 1,56 5,10 0,53 1,0 22,24 3,23 5,91 1,34 1,5 15,17 5,23 6,50 1,94 2,0 7,26 7,98 7,88 3,31 2,5 0,00 10,00 9,40 4,83 3,0 0,00 9,65 9,45 4,89 3,5 0,00 9,19 9,67 5,11 4,0 0,00 8,87 9,38 4,82 4,5 0,00 8,41 9,66 5,10 5,0 0,00 8,05 10,01 5,45 5,5 0,00 7,56 9,78 5,21 6,0 0,00 6,81 10,62 6,06 6,5 0,00 5,88 10,99 6,43 7,0 0,00 4,84 11,03 6,47 7,5 0,00 3,84 11,98 7,41 8,0 0,00 2,91 12,36 7,80 8,5 0,00 1,84 12,95 8,39

Anhang 113

9,0 0,00 0,81 13,92 9,35 9,5 0,00 0,14 14,26 9,70

10,0 0,00 0,14 15,31 10,75

- 3 -

21.03.2017

0,0 29,98 0,20 4,24 0,00 0,5 26,78 1,58 4,67 0,43 1,0 22,16 3,19 5,21 0,98 1,5 15,45 5,16 6,40 2,16 2,0 7,68 7,68 7,85 3,61 2,5 0,00 9,80 9,20 4,96 3,0 0,00 9,42 9,58 5,35 3,5 0,00 9,06 9,45 5,21 4,0 0,00 8,77 9,22 4,98 4,5 0,00 8,45 9,90 5,66 5,0 0,00 7,96 9,84 5,60 5,5 0,00 7,53 10,14 5,90 6,0 0,00 6,94 10,51 6,27 6,5 0,00 6,02 10,86 6,62 7,0 0,00 4,99 11,15 6,91 7,5 0,00 3,92 11,86 7,62 8,0 0,00 2,96 12,39 8,15 8,5 0,00 2,02 13,29 9,06 9,0 0,00 0,99 13,73 9,49 9,5 0,00 0,15 14,80 10,56

10,0 0,00 0,14 14,86 10,62

- 4 -

22.03.2017

0,0 30,15 0,19 4,48 0,00 0,5 26,56 1,40 4,60 0,13 1,0 21,97 2,90 5,09 0,61 1,5 15,70 5,11 6,21 1,73 2,0 8,19 7,73 7,68 3,20 2,5 0,00 9,97 8,68 4,21 3,0 0,00 9,68 9,01 4,54 3,5 0,00 9,33 9,00 4,52 4,0 0,00 8,91 9,25 4,77 4,5 0,00 8,54 9,55 5,07 5,0 0,00 8,15 9,41 4,93 5,5 0,00 7,65 9,50 5,03 6,0 0,00 6,99 9,99 5,51 6,5 0,00 6,31 10,44 5,96 7,0 0,00 5,36 11,03 6,55 7,5 0,00 4,30 11,22 6,74 8,0 0,00 3,20 12,41 7,93 8,5 0,00 2,12 12,46 7,98 9,0 0,00 1,04 13,50 9,03 9,5 0,00 0,18 13,90 9,43

10,0 0,00 0,15 13,95 9,47

Anhang 114

Tabelle 20: Mit den verschiedenen MLR- und PLS-Modellen vorhergesagte Konzentrationen im Vergleich zur Referenzanalytik (Probe Nr. 22) für die manuell eingestellte Prozessvariation am Ende einer zweiphasigen Batch-Fermentation.

Methode Regressionsmodell Glucose (g L–1)

Ethanol (g L–1)

BTM (g L–1)

Zunahme BTM (g L–1)

Referenzanalytik − 29,50 10,50 14,24 9,44

MIR

2D-MLR 28,58 17,50 -3,22 -8,02 4D-MLR 25,44 17,93 -4,20 -9,00

PLS mit DV 28,56 12,92 -1,89 -6,69 PLS ohne DV 29,77 12,58 -2,49 -7,29

Raman

2D-MLR 28,58 7,81 17,37 12,57 4D-MLR -3,56 3,13 15,18 10,38

PLS mit DV 10,20 4,54 8,25 3,45 PLS ohne DV -2,05 0,13 14,92 10,12

Tabelle 21: Ergebnisse der Kalibration (2D-MLR) mit Absolutglied 𝑎𝑎 und Regressionskoeffizienten 𝛽𝛽𝑆𝑆1,𝛽𝛽𝑆𝑆2,𝛽𝛽𝑆𝑆3,𝛽𝛽𝑆𝑆4 für Glucose, Ethanol und BTM zur Vorhersage der vier Fermentationen.

Vorhersage Fermentation (Nr., Datum)

System Analyt 𝒂𝒂 (g L–1)

𝜷𝜷𝑺𝑺𝑺𝑺 (g L–1)




- 1 -

17.03.2017


BTM -5,64 − -0,0117 − 0,0099


BTM 11,80 1929,20 − -1730,55 −

- 2 -

20.03.2017


BTM -5,17 − -0,0130 − 0,0109


BTM 11,99 2008,60 − -1801,70 −

- 3 -

21.03.2017


BTM -8,99 − -0,0091 − 0,0081


BTM 18,49 1764,66 − -1697,95 −

- 4 -

22.03.2017


BTM -7,30 − -0,0101 − 0,0088


BTM 12,75 1843,42 − -1667,78 −

Anhang 115

Tabelle 22: Ergebnisse der Kalibration (4D-MLR) mit Absolutglied 𝑎𝑎 und Regressionskoeffizienten 𝛽𝛽𝑆𝑆1,𝛽𝛽𝑆𝑆2,𝛽𝛽𝑆𝑆3,𝛽𝛽𝑆𝑆4 für Glucose, Ethanol und BTM zur Vorhersage der vier Fermentationen.


System Analyt 𝒂𝒂 (g L–1)





- 1 -

17.03.2017


BTM -4,70 -0,0055 -0,0061 0,0029 0,0073

MIR-ATR Glucose -4,71 9021,18 -10269,03 -191,46 1271,07 Ethanol -3,06 -1853,75 1470,40 3115,77 -2688,70

BTM 19,83 -2351,27 2782,37 -1643,52 1192,16

- 2 -

20.03.2017


BTM -3,70 -0,0064 -0,0059 0,0022 0,0084

MIR-ATR Glucose 0,55 7406,78 -9185,98 -165,40 1659,11 Ethanol -4,48 -1906,13 1540,82 3134,44 -2699,88

BTM 17,94 -1790,43 2433,16 -1671,85 1054,42

- 3 -

21.03.2017


BTM -6,05 -0,0062 -0,0039 0,0024 0,0066


BTM 18,34 -1811,26 2396,66 -1625,27 1051,12

- 4 -

22.03.2017


BTM -4,73 -0,0058 -0,0059 0,0031 0,0070


BTM 16,16 -1187,20 2027,89 -1585,40 808,62

Tabelle 23: Raman-Messsignale in den gewählten Spektralbereichen S1, S2, S3, S4 für die vier Fermentationen.


Dauer (h)

Raman-Messsignale S1 S2 S3 S4

- 1 -

17.03.2017

0,0 11706,1 10917,1 13581,5 14124,9 0,5 12142,4 11356,3 14132,9 14629,3 1,0 11704,4 11024,4 13743,3 14199,9 1,5 11653,2 11028,4 13881,8 14243,1 2,0 11902,2 11365,7 14398,9 14694,3 2,5 11941,2 11459,6 14683,3 14918,0 3,0 12067,5 11578,4 14788,0 15070,6 3,5 12194,8 11692,1 14979,6 15220,9 4,0 12305,4 11824,4 15069,2 15373,2 4,5 12939,9 12435,3 15861,8 16161,2 5,0 13087,4 12535,0 15975,4 16320,1 5,5 13116,7 12600,2 16039,4 16365,3 6,0 13438,2 12916,8 16380,1 16827,4

Anhang 116

6,5 13828,4 13256,1 16863,1 17267,8 7,0 13979,3 13426,8 17042,5 17545,4 7,5 14200,6 13616,1 17210,7 17740,6 8,0 14368,0 13726,7 17435,1 18015,5 8,5 14567,8 13945,1 17708,8 18331,8 9,0 14797,1 14155,7 17946,5 18665,6 9,5 15016,0 14365,5 18295,5 19050,2

10,0 15241,2 14603,5 18537,5 19352,4

- 2 -

20.03.2017

0,0 11799,3 11002,5 13685,1 14203,8 0,5 12254,5 11486,0 14275,1 14740,9 1,0 11976,9 11251,2 14084,3 14504,4 1,5 12044,1 11436,6 14389,6 14705,8 2,0 12221,2 11640,8 14776,2 15056,3 2,5 12240,1 11708,3 14990,5 15197,1 3,0 12436,3 11897,6 15216,9 15448,7 3,5 12584,0 12063,7 15394,1 15679,0 4,0 12705,1 12188,3 15511,8 15827,5 4,5 12873,7 12335,3 15763,9 16023,9 5,0 13041,3 12489,9 15927,5 16239,4 5,5 13138,2 12596,3 16017,4 16377,2 6,0 13438,5 12866,3 16368,8 16773,7 6,5 13699,6 13127,9 16642,4 17090,8 7,0 13825,5 13272,5 16831,9 17316,4 7,5 14250,5 13626,0 17241,2 17809,0 8,0 14443,4 13854,9 17517,4 18113,5 8,5 14808,6 14201,3 17982,2 18622,5 9,0 15190,5 14541,9 18485,8 19201,9 9,5 15214,0 14542,8 18533,5 19310,5

10,0 15110,0 14449,3 18405,3 19209,6

- 3 -

21.03.2017

0,0 11690,7 10909,0 13513,9 14039,5 0,5 12310,0 11512,6 14278,9 14796,5 1,0 11857,9 11146,6 13930,7 14338,4 1,5 11719,7 11073,3 13922,8 14282,7 2,0 12001,3 11427,5 14497,3 14771,0 2,5 11993,2 11519,6 14731,6 14970,5 3,0 12146,4 11631,7 14860,9 15139,7 3,5 12194,2 11712,6 14972,9 15240,0 4,0 12387,6 11892,0 15154,2 15446,0 4,5 12595,7 12049,4 15362,5 15669,9 5,0 12736,2 12222,0 15539,2 15875,4 5,5 13165,8 12670,0 16083,6 16455,6 6,0 13423,5 12876,5 16378,7 16770,7 6,5 13631,0 13042,1 16531,4 17011,6 7,0 13775,8 13226,4 16790,3 17284,0 7,5 14257,6 13662,2 17310,9 17885,3 8,0 14474,1 13841,8 17582,3 18193,1

Anhang 117

8,5 14704,6 14050,7 17865,2 18523,0 9,0 14993,4 14333,0 18206,1 18899,3 9,5 15140,3 14469,5 18421,1 19167,9

10,0 14641,4 13993,1 17814,7 18560,2

- 4 -

22.03.2017

0,0 11658,0 10886,2 13525,9 14087,2 0,5 12252,0 11466,6 14270,6 14742,0 1,0 11832,9 11153,7 13896,7 14314,4 1,5 11830,2 11206,6 14085,1 14450,4 2,0 12049,8 11491,2 14589,7 14892,9 2,5 12157,1 11654,9 14901,1 15176,2 3,0 12250,7 11723,3 15004,6 15260,1 3,5 12340,2 11873,4 15142,7 15434,8 4,0 12442,3 11943,9 15245,5 15534,8 4,5 12599,2 12090,8 15437,9 15785,6 5,0 12770,4 12234,1 15621,3 15935,0 5,5 12855,6 12303,2 15682,4 16028,8 6,0 13432,7 12894,0 16383,0 16793,4 6,5 13684,3 13093,5 16649,0 17099,9 7,0 13821,8 13290,2 16854,0 17344,6 7,5 14119,6 13516,9 17156,6 17734,1 8,0 14396,4 13790,8 17460,7 18084,1 8,5 14562,0 13946,6 17670,7 18349,5 9,0 14780,9 14174,3 17994,9 18675,5 9,5 14963,6 14317,9 18169,8 18918,0

10,0 14467,3 13854,7 17620,4 18339,5

Tabelle 24: MIR-ATR-Messsignale in den gewählten Spektralbereichen S1, S2, S3, S4 für die vier Fermentationen.


Dauer (h)

MIR-ATR-Messsignale S1 S2 S3 S4

- 1 -

17.03.2017

0,0 0,0547 0,0511 0,0654 0,0645 0,5 0,0548 0,0518 0,0652 0,0642 1,0 0,0545 0,0519 0,0645 0,0631 1,5 0,0539 0,0518 0,0634 0,0614 2,0 0,0527 0,0513 0,0614 0,0588 2,5 0,0520 0,0510 0,0598 0,0565 3,0 0,0518 0,0509 0,0595 0,0563 3,5 0,0513 0,0504 0,0590 0,0559 4,0 0,0512 0,0502 0,0584 0,0554 4,5 0,0504 0,0496 0,0577 0,0549 5,0 0,0501 0,0493 0,0573 0,0547 5,5 0,0505 0,0497 0,0575 0,0550 6,0 0,0512 0,0502 0,0579 0,0555 6,5 0,0515 0,0507 0,0581 0,0560

Anhang 118

7,0 0,0515 0,0507 0,0576 0,0560 7,5 0,0514 0,0507 0,0572 0,0557 8,0 0,0515 0,0506 0,0570 0,0559 8,5 0,0516 0,0507 0,0566 0,0559 9,0 0,0517 0,0509 0,0564 0,0561 9,5 0,0521 0,0513 0,0567 0,0565

10,0 0,0521 0,0514 0,0566 0,0565

- 2 -

20.03.2017

0,0 0,0541 0,0505 0,0637 0,0630 0,5 0,0535 0,0505 0,0632 0,0623 1,0 0,0528 0,0504 0,0625 0,0610 1,5 0,0518 0,0498 0,0610 0,0589 2,0 0,0505 0,0491 0,0591 0,0564 2,5 0,0496 0,0487 0,0574 0,0540 3,0 0,0498 0,0489 0,0575 0,0543 3,5 0,0503 0,0494 0,0578 0,0547 4,0 0,0506 0,0498 0,0578 0,0551 4,5 0,0497 0,0489 0,0568 0,0541 5,0 0,0512 0,0502 0,0587 0,0562 5,5 0,0518 0,0508 0,0596 0,0571 6,0 0,0516 0,0507 0,0581 0,0557 6,5 0,0521 0,0512 0,0582 0,0561 7,0 0,0519 0,0511 0,0576 0,0560 7,5 0,0513 0,0505 0,0566 0,0551 8,0 0,0509 0,0501 0,0559 0,0548 8,5 0,0512 0,0503 0,0560 0,0554 9,0 0,0514 0,0505 0,0557 0,0555 9,5 0,0516 0,0508 0,0558 0,0556

10,0 0,0520 0,0510 0,0562 0,0561

- 3 -

21.03.2017

0,0 0,0542 0,0509 0,0646 0,0642 0,5 0,0540 0,0511 0,0642 0,0636 1,0 0,0538 0,0513 0,0638 0,0626 1,5 0,0538 0,0517 0,0633 0,0617 2,0 0,0537 0,0522 0,0628 0,0602 2,5 0,0533 0,0524 0,0616 0,0585 3,0 0,0537 0,0527 0,0617 0,0588 3,5 0,0541 0,0533 0,0621 0,0593 4,0 0,0546 0,0537 0,0623 0,0596 4,5 0,0549 0,0540 0,0626 0,0599 5,0 0,0551 0,0542 0,0625 0,0601 5,5 0,0554 0,0546 0,0627 0,0603 6,0 0,0556 0,0548 0,0625 0,0604 6,5 0,0553 0,0545 0,0620 0,0601 7,0 0,0555 0,0546 0,0621 0,0604 7,5 0,0553 0,0545 0,0613 0,0601 8,0 0,0558 0,0550 0,0618 0,0608 8,5 0,0558 0,0549 0,0616 0,0610

Anhang 119

9,0 0,0562 0,0554 0,0620 0,0618 9,5 0,0563 0,0554 0,0617 0,0619

10,0 0,0558 0,0552 0,0613 0,0615

- 4 -

22.03.2017

0,0 0,0534 0,0500 0,0631 0,0624 0,5 0,0536 0,0507 0,0633 0,0623 1,0 0,0537 0,0511 0,0631 0,0618 1,5 0,0536 0,0514 0,0626 0,0608 2,0 0,0531 0,0516 0,0616 0,0590 2,5 0,0525 0,0514 0,0602 0,0570 3,0 0,0527 0,0518 0,0603 0,0571 3,5 0,0529 0,0520 0,0603 0,0573 4,0 0,0534 0,0524 0,0606 0,0576 4,5 0,0537 0,0528 0,0610 0,0582 5,0 0,0539 0,0530 0,0609 0,0584 5,5 0,0540 0,0530 0,0609 0,0584 6,0 0,0538 0,0529 0,0603 0,0580 6,5 0,0540 0,0532 0,0606 0,0586 7,0 0,0540 0,0532 0,0602 0,0586 7,5 0,0543 0,0534 0,0603 0,0589 8,0 0,0544 0,0535 0,0604 0,0594 8,5 0,0542 0,0534 0,0598 0,0591 9,0 0,0544 0,0535 0,0602 0,0600 9,5 0,0547 0,0539 0,0605 0,0606

10,0 0,0544 0,0536 0,0596 0,0597

Tabelle 25: Mit einer 2D- bzw. 4D-MLR vorhergesagte Konzentrationen anhand der Raman-Messsignale.


Dauer (h)

2D-MLR 4D-MLR Glucose (g L–1)

Ethanol (g L–1)

BTM (g L–1)

Glucose (g L–1)

Ethanol (g L–1)

BTM (g L–1)

- 1 -

17.03. 2017

0,0 29,72 -0,30 6,77 29,61 0,07 4,95 0,5 27,24 1,66 6,64 26,76 1,08 5,08 1,0 19,83 2,22 6,26 22,79 2,73 5,31 1,5 15,06 4,93 6,64 15,91 5,42 6,28 2,0 5,78 7,34 7,17 7,33 7,87 7,59 2,5 0,59 9,32 8,29 -0,46 10,11 9,23 3,0 0,63 8,19 8,42 0,94 9,09 9,21 3,5 1,23 9,53 8,58 -0,76 9,91 9,45 4,0 -1,30 7,98 8,54 0,32 8,78 9,39 4,5 -2,38 9,12 9,21 -2,46 8,97 10,12 5,0 1,21 8,06 9,62 -0,13 7,74 10,17 5,5 -2,20 8,65 9,31 -1,73 8,35 10,12 6,0 -3,39 5,86 10,19 -0,31 6,11 10,73 6,5 -0,75 7,61 10,59 -1,79 6,73 11,06 7,0 -3,31 5,23 11,35 -1,51 5,14 11,71

Anhang 120

7,5 -1,52 4,73 11,07 1,00 4,18 11,22 8,0 2,79 3,68 12,50 1,19 3,16 12,26 8,5 0,09 2,90 13,09 -0,21 2,67 12,89 9,0 0,62 0,65 13,94 1,27 0,82 13,43 9,5 0,34 0,15 15,30 -1,22 0,53 14,72

10,0 -1,97 -1,14 15,52 -0,83 -0,52 14,90

- 2 -

20.03. 2017

0,0 29,68 0,84 6,46 28,65 0,53 4,66 0,5 24,86 2,94 6,03 25,25 1,88 4,68 1,0 22,52 3,92 6,51 21,33 3,29 5,44 1,5 11,77 7,03 6,29 12,79 6,59 6,27 2,0 8,48 8,44 7,45 6,79 7,90 7,71 2,5 4,11 10,64 8,10 0,26 10,03 8,84 3,0 3,71 10,24 8,38 0,19 9,57 9,07 3,5 1,33 9,05 8,73 0,06 8,86 9,46 4,0 0,40 8,38 8,73 0,70 8,32 9,45 4,5 1,45 10,15 8,96 -1,54 9,26 9,69 5,0 1,72 8,97 9,29 -0,41 8,22 9,87 5,5 0,39 7,82 9,41 0,38 7,45 9,97 6,0 1,52 7,05 10,22 0,39 6,49 10,54 6,5 0,13 6,22 10,27 1,08 5,72 10,58 7,0 -2,16 5,49 10,84 -0,22 5,39 11,23 7,5 1,95 3,78 11,61 2,69 3,26 11,44 8,0 -2,20 3,36 11,95 0,78 3,23 12,01 8,5 -2,42 2,75 12,99 -0,52 2,49 12,90 9,0 -0,74 1,35 14,87 -1,89 1,08 14,40 9,5 1,13 -0,20 16,04 -1,73 -0,08 15,26

10,0 0,74 -1,08 16,16 -1,15 -0,49 15,35

- 3 -

21.03. 2017

0,0 29,32 0,39 5,89 30,65 0,27 4,15 0,5 27,67 1,50 6,56 28,18 0,29 4,79 1,0 22,09 3,90 6,16 22,28 3,37 5,16 1,5 16,87 5,11 6,38 17,16 5,19 5,92 2,0 8,87 8,00 7,12 8,13 7,90 7,40 2,5 -0,21 9,16 7,90 -0,15 10,11 8,97 3,0 2,77 8,29 8,26 1,83 8,99 9,01 3,5 -0,49 8,73 8,34 -0,44 9,61 9,33 4,0 -0,17 8,31 8,38 0,64 8,91 9,23 4,5 3,40 8,16 8,77 2,06 8,14 9,30 5,0 -0,22 7,63 8,87 1,01 7,94 9,54 5,5 -4,02 7,36 9,51 -1,23 7,59 10,27 6,0 -0,65 7,20 10,19 -0,61 6,86 10,66 6,5 2,13 5,12 10,64 2,66 4,84 10,68 7,0 -2,19 5,08 11,18 -0,60 5,24 11,49 7,5 -0,41 3,63 12,10 0,77 3,43 12,02 8,0 1,87 3,02 12,97 0,76 2,66 12,66 8,5 2,69 2,16 13,75 0,65 1,81 13,28 9,0 1,84 1,66 14,24 0,22 1,18 13,69

Anhang 121

9,5 2,06 0,54 15,18 -0,56 0,46 14,54 10,0 2,50 -0,14 14,57 0,93 0,66 14,02

- 4 -

22.03. 2017

0,0 27,98 -0,51 6,69 29,05 0,14 4,90 0,5 26,17 2,64 6,59 25,80 1,52 4,97 1,0 18,90 3,58 5,99 21,47 3,58 5,06 1,5 14,01 5,13 6,65 15,26 5,41 6,30 2,0 7,16 7,30 7,67 6,84 7,62 8,03 2,5 1,63 8,38 8,51 0,66 9,07 9,41 3,0 3,39 9,00 8,55 0,91 9,14 9,37 3,5 -2,43 8,23 8,58 -1,06 9,17 9,63 4,0 -0,15 8,42 8,74 -0,31 8,90 9,65 4,5 -0,06 7,16 9,46 -0,24 7,95 10,24 5,0 1,54 8,24 9,33 0,00 8,18 10,03 5,5 2,53 7,47 9,46 1,31 7,43 9,98 6,0 -1,60 6,66 10,22 -0,56 6,62 10,72 6,5 1,73 5,93 10,90 0,86 5,47 11,07 7,0 -4,20 5,16 11,06 -1,44 5,48 11,48 7,5 0,58 3,30 12,20 1,06 3,42 12,10 8,0 -0,57 2,48 12,51 1,25 2,62 12,30 8,5 -0,53 1,31 13,27 1,09 1,74 12,94 9,0 -2,42 1,64 13,84 -1,30 1,98 13,63 9,5 0,11 0,13 14,52 0,52 0,50 13,98

10,0 -0,31 0,23 14,11 0,14 1,33 13,80

Tabelle 26: Mit einer PLS mit Datenvorbehandlung (DV) bzw. einer PLS ohne DV vorhergesagte Konzentrationen anhand der Raman-Messsignale.


Dauer (h)

PLS mit DV PLS ohne DV Glucose (g L–1)

Ethanol (g L–1)

BTM (g L–1)

Glucose (g L–1)

Ethanol (g L–1)

BTM (g L–1)

- 1 -

17.03. 2017

0,0 29,48 -0,27 4,93 29,56 0,23 4,90 0,5 26,19 1,63 4,96 26,25 1,65 4,72 1,0 21,88 3,12 5,53 22,49 3,34 5,29 1,5 14,57 5,71 6,50 15,72 5,64 6,32 2,0 6,71 8,15 7,72 7,59 7,93 7,67 2,5 0,32 10,56 8,49 0,12 10,05 9,05 3,0 0,42 9,07 9,25 1,39 9,16 9,12 3,5 -0,14 9,49 9,21 -0,04 9,34 9,46 4,0 0,22 8,38 9,69 0,91 8,60 9,56 4,5 -1,26 8,77 9,95 -1,93 8,97 9,89 5,0 0,18 7,69 10,06 -0,16 7,83 9,91 5,5 0,05 7,66 10,13 -0,25 7,85 9,90 6,0 -0,20 6,16 11,01 0,15 6,72 10,34 6,5 -0,34 6,38 10,94 -1,46 6,52 10,89 7,0 -0,55 4,79 11,86 -0,52 5,29 11,30

Anhang 122

7,5 1,13 3,32 12,11 1,76 3,68 11,49 8,0 0,62 3,01 12,45 0,87 3,24 12,09 8,5 -0,13 2,37 13,04 0,18 2,50 12,80 9,0 0,18 0,89 13,73 1,15 0,84 13,54 9,5 -0,73 1,04 13,94 -1,32 0,50 14,67

10,0 0,00 0,27 14,12 -0,49 -0,63 15,04

- 2 -

20.03. 2017

0,0 29,24 0,08 4,63 28,95 0,43 4,46 0,5 25,87 1,45 4,98 26,15 1,35 4,74 1,0 20,82 3,60 5,48 21,38 3,42 5,27 1,5 12,65 7,02 6,29 12,81 6,37 6,54 2,0 6,48 8,12 7,73 6,87 7,70 7,83 2,5 -0,06 10,37 8,67 -0,43 9,99 9,06 3,0 1,16 9,91 8,51 0,18 9,44 9,12 3,5 -0,30 8,92 9,53 -0,07 9,13 9,34 4,0 0,20 8,23 9,75 0,68 8,44 9,48 4,5 0,01 8,54 9,63 -0,51 8,54 9,79 5,0 -0,77 8,10 10,14 -0,70 8,28 9,98 5,5 0,48 7,33 10,14 0,33 7,51 10,06 6,0 -0,03 6,22 10,92 0,49 6,61 10,46 6,5 1,11 5,45 10,97 1,30 5,75 10,64 7,0 -0,48 4,89 11,80 0,02 5,39 11,28 7,5 1,15 3,51 12,02 1,84 3,73 11,55 8,0 -0,35 2,66 12,98 0,95 3,16 12,18 8,5 0,71 1,92 13,04 0,45 1,61 13,25 9,0 -0,12 1,36 13,62 -1,37 0,69 14,38 9,5 -0,46 1,12 13,88 -1,98 0,14 14,98

10,0 -0,47 0,70 14,10 -1,83 -0,02 15,05

- 3 -

21.03. 2017

0,0 30,61 -0,50 4,62 30,30 0,13 4,39 0,5 27,99 0,70 4,81 27,74 0,58 4,72 1,0 21,78 3,42 5,36 21,95 3,35 5,27 1,5 16,05 5,50 6,09 16,42 5,28 6,14 2,0 7,07 8,03 7,64 7,62 7,74 7,68 2,5 0,66 9,97 8,68 0,55 9,74 9,01 3,0 0,52 9,36 9,05 0,67 9,32 9,20 3,5 0,21 9,61 9,00 0,08 9,49 9,26 4,0 1,47 8,17 9,37 1,76 8,24 9,36 4,5 2,25 7,85 9,29 1,77 7,82 9,57 5,0 -0,02 6,77 10,61 1,04 7,49 9,99 5,5 -1,16 7,01 10,86 -0,55 7,54 10,31 6,0 0,24 6,44 10,71 -0,21 6,72 10,63 6,5 0,73 4,63 11,52 1,57 5,27 10,83 7,0 -0,42 4,73 11,87 -0,25 5,16 11,57 7,5 0,91 3,28 12,21 0,77 3,39 12,15 8,0 0,41 2,11 13,01 0,76 2,28 12,81 8,5 -0,56 1,86 13,46 -0,39 2,11 13,25 9,0 -0,21 1,58 13,50 -0,99 1,22 13,98

Anhang 123

9,5 0,14 0,93 13,74 -0,79 0,27 14,49 10,0 -0,76 0,77 14,13 -0,33 0,88 14,16

- 4 -

22.03. 2017

0,0 29,92 -0,41 4,60 29,83 0,29 4,63 0,5 26,14 2,20 4,56 25,76 1,46 4,92 1,0 21,82 3,57 5,27 21,27 3,37 5,33 1,5 14,08 5,59 6,63 15,02 5,60 6,43 2,0 10,23 8,51 6,46 8,60 7,05 7,74 2,5 0,53 9,03 9,22 1,39 9,37 9,18 3,0 0,66 9,06 9,25 0,91 9,28 9,22 3,5 -0,61 9,57 9,25 -0,71 9,50 9,58 4,0 -0,71 8,85 9,87 -0,83 8,94 9,74 4,5 -0,70 8,25 10,12 -0,93 8,57 10,04 5,0 0,28 7,75 10,04 0,11 7,91 10,08 5,5 0,54 7,04 10,24 0,42 7,28 10,19 6,0 -0,85 6,51 11,04 -0,83 6,83 10,73 6,5 1,09 5,62 10,76 1,29 5,67 10,96 7,0 -0,24 5,26 11,45 -0,83 5,37 11,48 7,5 -0,54 3,31 12,92 0,55 3,90 11,93 8,0 0,23 2,71 12,95 0,48 2,94 12,33 8,5 0,51 1,94 13,16 1,17 2,09 12,80 9,0 -0,29 1,72 13,79 -0,44 1,66 13,60 9,5 0,45 0,48 13,89 1,20 0,39 13,97

10,0 0,30 0,74 13,96 0,93 1,11 13,84

Tabelle 27: Mit einer 2D- bzw. 4D-MLR vorhergesagte Konzentrationen anhand der MIR-ATR-Messsignale.


Dauer (h)

2D-MLR 4D-MLR Glucose (g L–1)

Ethanol (g L–1)

BTM (g L–1)

Glucose (g L–1)

Ethanol (g L–1)

BTM (g L–1)

- 1 -

17.03. 2017

0,0 33,97 2,52 4,22 33,24 1,16 2,80 0,5 26,36 2,57 4,74 26,63 1,97 4,61 1,0 21,24 3,93 5,39 21,49 3,54 5,43 1,5 15,83 6,09 6,05 15,83 5,77 6,04 2,0 7,21 7,93 7,36 7,32 7,86 7,69 2,5 1,11 10,19 8,68 0,66 10,07 8,60 3,0 -0,07 9,93 8,82 -0,27 9,92 9,02 3,5 0,00 9,58 8,79 0,01 9,56 9,16 4,0 0,99 9,29 9,47 0,55 8,99 9,24 4,5 -1,01 8,72 9,28 -0,66 8,68 9,91 5,0 -1,12 8,01 9,40 -0,49 8,01 10,25 5,5 -1,05 7,55 9,88 -0,60 7,54 10,52 6,0 0,91 7,44 10,35 0,70 7,17 10,20 6,5 -1,79 6,42 10,59 -1,30 6,59 11,24 7,0 -0,82 4,99 11,48 -0,47 5,01 11,80 7,5 -1,94 4,44 12,10 -1,55 4,50 12,44

Anhang 124

8,0 -0,31 3,34 12,39 0,06 3,29 12,57 8,5 -0,21 1,97 13,48 0,02 1,82 13,35 9,0 -0,53 0,77 14,04 -0,12 0,70 14,02 9,5 0,05 0,64 14,26 0,22 0,52 13,97

10,0 -1,50 0,20 14,47 -1,00 0,27 14,54

- 2 -

20.03. 2017

0,0 32,33 1,98 5,71 30,53 0,20 3,95 0,5 25,27 2,32 5,56 25,26 1,31 5,23 1,0 19,30 4,28 5,55 19,84 3,64 5,80 1,5 13,85 6,31 6,04 14,45 5,74 6,45 2,0 6,49 8,27 7,03 7,30 7,84 7,70 2,5 0,16 10,58 8,30 0,44 10,11 8,70 3,0 0,28 9,97 8,50 0,65 9,55 8,94 3,5 0,19 9,81 8,84 0,31 9,42 9,10 4,0 -0,59 8,59 9,50 -0,23 8,35 9,88 4,5 -0,58 8,59 9,49 -0,05 8,17 9,94 5,0 1,65 7,73 9,05 2,19 7,55 9,53 5,5 1,68 7,55 8,63 2,53 7,64 9,38 6,0 0,69 7,58 10,96 -0,08 7,10 10,42 6,5 0,07 6,61 11,68 -0,70 6,23 11,10 7,0 -0,73 4,85 12,41 -0,91 4,55 12,13 7,5 -0,27 4,81 13,02 -0,92 4,16 12,31 8,0 -0,09 3,60 13,61 -0,54 2,85 12,93 8,5 -0,03 2,20 13,84 0,01 1,62 13,45 9,0 0,35 0,92 14,89 0,10 0,21 14,17 9,5 -0,46 0,66 15,21 -0,67 0,04 14,52

10,0 0,88 0,44 15,22 0,39 -0,25 14,30

- 3 -

21.03. 2017

0,0 29,55 -0,08 4,38 30,54 -0,54 4,65 0,5 25,08 0,68 4,73 26,40 0,51 5,41 1,0 20,54 2,74 5,13 21,54 2,72 5,77 1,5 14,28 3,99 5,91 15,42 4,32 6,87 2,0 6,58 7,08 6,58 7,33 7,74 7,61 2,5 0,84 9,01 7,94 0,94 9,70 8,61 3,0 0,38 8,31 8,41 0,48 9,09 9,08 3,5 -0,66 7,83 8,55 -0,32 8,84 9,46 4,0 -0,02 7,62 8,90 -0,09 8,61 9,49 4,5 -0,54 7,61 8,93 -0,60 8,71 9,58 5,0 -0,40 6,51 9,66 -0,54 7,61 10,16 5,5 -0,73 6,43 9,84 -0,97 7,60 10,29 6,0 -1,30 5,79 10,37 -1,54 7,00 10,80 6,5 -1,27 5,12 10,85 -1,45 6,22 11,21 7,0 -0,55 4,44 10,95 -0,66 5,54 11,32 7,5 -0,86 3,05 12,04 -0,98 4,05 12,25 8,0 -1,89 2,31 11,91 -1,45 3,62 12,62 8,5 0,94 0,99 12,53 0,97 2,02 12,72 9,0 -1,55 -0,36 12,40 -0,34 1,18 13,58 9,5 -0,60 -1,51 13,01 0,51 -0,08 13,99

Anhang 125

10,0 -3,10 -1,50 13,01 -1,36 0,10 14,51

- 4 -

22.03. 2017

0,0 30,39 1,74 5,84 29,33 0,15 4,58 0,5 24,53 2,39 6,04 24,45 1,51 5,49 1,0 21,57 3,42 6,54 21,14 2,61 5,95 1,5 16,35 5,29 7,10 15,65 4,66 6,61 2,0 9,00 7,54 8,03 8,10 7,15 7,71 2,5 2,40 9,44 9,14 1,16 9,16 8,87 3,0 1,23 9,69 9,34 -0,08 9,49 9,09 3,5 0,76 8,96 9,73 -0,38 8,87 9,54 4,0 1,92 8,80 10,08 0,13 8,49 9,54 4,5 0,75 8,23 10,09 -0,44 8,27 9,88 5,0 0,88 7,50 10,53 -0,34 7,53 10,25 5,5 0,78 7,40 10,61 -0,44 7,44 10,33 6,0 0,89 6,59 11,34 -0,51 6,49 10,88 6,5 -0,54 5,99 11,23 -1,10 6,31 11,21 7,0 0,17 4,79 11,87 -0,45 5,02 11,71 7,5 1,09 3,88 12,33 0,28 4,02 12,00 8,0 1,05 2,84 12,26 0,97 3,25 12,24 8,5 -0,04 1,74 12,91 0,31 2,29 13,02 9,0 0,34 0,25 12,65 1,76 1,17 13,21 9,5 0,45 -0,64 12,74 2,25 0,47 13,46

10,0 0,21 -0,71 13,60 1,34 0,09 13,93

Tabelle 28: Mit einer PLS mit Datenvorbehandlung (DV) bzw. einer PLS ohne DV vorhergesagte Konzentrationen anhand der MIR-ATR-Messsignale.


Dauer (h)

PLS mit DV PLS ohne DV Glucose (g L–1)

Ethanol (g L–1)

BTM (g L–1)

Glucose (g L–1)

Ethanol (g L–1)

BTM (g L–1)

- 1 -

17.03. 2017

0,0 30,13 0,75 3,91 30,80 0,75 4,02 0,5 26,76 1,87 4,63 26,66 1,98 4,78 1,0 21,91 3,23 5,12 22,42 3,43 5,38 1,5 16,63 5,27 5,98 16,87 5,16 6,06 2,0 7,51 7,79 7,50 8,22 7,79 7,59 2,5 -0,45 10,09 8,90 -0,19 10,15 8,96 3,0 -0,67 9,84 9,18 -0,25 9,85 9,17 3,5 -0,93 9,64 9,17 -0,13 9,83 9,18 4,0 -0,93 9,04 9,63 -0,59 9,17 9,59 4,5 -0,58 8,40 9,83 -0,05 8,57 9,80 5,0 -0,29 8,04 9,84 0,24 8,20 9,97 5,5 -1,14 7,60 10,31 -0,26 7,74 10,34 6,0 -0,34 7,08 10,27 0,51 7,21 10,37 6,5 -1,20 6,24 11,08 -0,48 6,39 11,12 7,0 -0,65 5,11 11,60 -0,19 5,27 11,72 7,5 -0,26 4,24 11,85 0,57 4,36 11,85

Anhang 126

8,0 -0,66 3,21 12,64 0,17 3,42 12,64 8,5 -0,64 2,10 13,13 0,10 2,22 13,24 9,0 -0,70 0,75 13,81 0,39 0,84 13,82 9,5 -0,15 0,22 14,06 0,62 0,33 14,09

10,0 -1,34 -0,08 14,58 -0,46 0,09 14,59

- 2 -

20.03. 2017

0,0 28,73 0,80 4,42 28,30 0,92 4,49 0,5 25,32 1,47 5,06 25,27 1,75 5,07 1,0 19,64 3,57 5,67 20,40 3,89 5,52 1,5 13,99 5,64 6,51 14,52 6,15 6,29 2,0 6,30 7,93 7,74 7,15 8,22 7,60 2,5 -0,40 10,25 8,97 -0,06 10,79 8,72 3,0 -0,57 9,90 9,11 0,26 10,40 8,82 3,5 -1,34 9,56 9,38 -0,50 10,07 9,17 4,0 -0,80 8,71 9,83 -0,61 9,13 9,68 4,5 -0,93 8,45 10,11 0,42 5,20 11,08 5,0 0,26 7,66 9,97 1,13 7,10 10,11 5,5 0,25 7,10 10,37 1,62 7,35 10,03 6,0 -0,71 7,14 10,59 -1,09 7,44 10,65 6,5 -1,51 6,28 11,21 -1,28 6,68 11,11 7,0 -1,10 5,11 11,79 -1,49 5,73 11,75 7,5 -1,22 4,36 12,20 -1,44 4,80 12,25 8,0 -0,64 3,42 12,54 -1,35 4,12 12,62 8,5 -0,27 1,65 13,24 -0,26 2,03 13,34 9,0 0,31 0,61 13,83 -0,60 1,35 13,92 9,5 0,17 0,38 13,95 -0,73 0,70 14,18

10,0 -0,29 0,09 14,33 -0,96 0,38 14,49

- 3 -

21.03. 2017

0,0 30,37 0,02 4,35 30,23 0,13 4,46 0,5 26,79 0,74 5,16 26,54 0,80 5,27 1,0 22,77 2,82 5,25 22,59 2,81 5,36 1,5 16,26 4,62 6,53 16,06 4,56 6,58 2,0 8,59 7,61 7,30 8,52 7,56 7,31 2,5 1,79 9,36 8,71 1,47 9,35 8,72 3,0 1,02 9,21 8,99 0,55 9,20 9,04 3,5 0,62 8,77 9,34 -0,06 8,75 9,41 4,0 0,77 8,31 9,60 0,01 8,26 9,65 4,5 0,41 8,36 9,52 -0,23 8,32 9,57 5,0 0,72 7,59 9,86 -0,03 7,55 9,91 5,5 1,16 7,00 9,99 0,34 6,94 10,07 6,0 0,37 6,69 10,45 -0,51 6,64 10,49 6,5 1,21 5,61 10,75 0,45 5,54 10,79 7,0 0,65 5,31 11,15 -0,15 5,28 11,23 7,5 0,55 4,13 11,87 -0,36 4,05 11,91 8,0 0,64 3,34 12,20 -0,17 3,31 12,27 8,5 0,83 1,96 13,01 0,12 1,95 13,01 9,0 0,79 0,91 13,59 0,10 0,97 13,59 9,5 0,51 0,12 14,10 -0,20 0,20 14,09

Anhang 127

10,0 0,36 -0,13 14,22 -0,19 -0,05 14,24

- 4 -

22.03. 2017

0,0 29,33 0,33 4,69 29,10 0,27 4,59 0,5 26,17 1,50 4,93 25,82 1,44 4,91 1,0 22,02 2,81 5,46 21,89 2,72 5,39 1,5 16,58 4,93 6,19 16,52 4,77 6,14 2,0 8,59 7,45 7,57 8,74 7,35 7,60 2,5 1,25 9,53 8,85 1,21 9,50 8,92 3,0 -0,56 9,83 9,31 -0,68 9,88 9,43 3,5 0,49 9,02 9,24 0,25 9,00 9,27 4,0 0,18 8,62 9,66 0,10 8,58 9,79 4,5 -0,10 8,54 9,93 -0,25 8,54 10,09 5,0 -0,29 8,03 10,25 -0,50 8,00 10,45 5,5 -0,03 7,78 10,19 -0,17 7,77 10,30 6,0 0,45 6,97 10,32 0,07 6,93 10,40 6,5 -0,18 6,24 11,12 -0,44 6,24 11,24 7,0 -0,05 5,43 11,53 -0,52 5,41 11,64 7,5 0,33 4,33 11,94 -0,07 4,32 12,02 8,0 0,28 3,35 12,89 0,50 3,36 13,00 8,5 1,00 2,07 13,06 1,18 2,10 13,10 9,0 0,10 1,06 14,17 0,78 1,19 14,22 9,5 0,20 0,49 14,53 1,10 0,64 14,57

10,0 -0,12 0,03 14,76 0,30 0,16 14,74

B Anhang zur Prozessverfolgung mit einem MIR-ATR-Sensor

Tabelle 29: Messsignale des MIR-ATR-Sensors für die vier Fermentationen mit den entsprechenden Ethanol- und Glucosekonzentrationen aus der HPLC-Referenzanalytik [8, 126]. Fermentation vom 15.10.2015 vorhergesagt.


Dauer (h)

HPLC Messsignale MIR-ATR-Sensor Glucose (g L–1)

Ethanol (g L–1) F1 F2 F3 F4

- 1 -

02.10.2015

0,0 97,70 0,77 0,02203 0,05575 0,04987 0,04717 0,5 94,62 2,32 0,02187 0,05510 0,04933 0,04665 1,0 88,10 4,22 0,02183 0,05532 0,04915 0,04618 1,5 79,23 5,70 0,02172 0,05485 0,04871 0,04593 2,0 71,34 7,63 0,02174 0,05485 0,04842 0,04572 2,5 64,35 10,84 0,02159 0,05449 0,04869 0,04520 3,0 54,65 14,03 0,02151 0,05411 0,04826 0,04473 3,5 46,56 16,81 0,02135 0,05368 0,04755 0,04401 4,0 34,93 20,50 0,02110 0,05327 0,04739 0,04339 4,5 21,22 23,97 0,02103 0,05300 0,04634 0,04252 5,0 8,80 29,65 0,02078 0,05270 0,04580 0,04157 5,5 3,45 31,63 0,02072 0,05209 0,04560 0,04112 6,0 2,45 30,11 0,02068 0,05218 0,04551 0,04121 6,5 2,10 28,64 0,02063 0,05218 0,04572 0,04111

- 2 - 0,0 96,07 0,90 0,02197 0,05525 0,05011 0,04592

Anhang 128

08.10.2015

0,5 88,59 2,36 0,02189 0,05531 0,04882 0,04544 1,0 80,30 3,93 0,02184 0,05496 0,04918 0,04522 1,5 74,08 5,80 0,02168 0,05457 0,04874 0,04480 2,0 69,37 8,74 0,02158 0,05455 0,04852 0,04477 2,5 61,90 11,78 0,02161 0,05402 0,04804 0,04396 3,0 54,07 15,41 0,02145 0,05391 0,04788 0,04315 3,5 40,97 18,47 0,02118 0,05340 0,04713 0,04265 4,0 28,94 22,37 0,02097 0,05280 0,04652 0,04185 4,5 16,92 26,74 0,02077 0,05247 0,04645 0,04100 5,0 5,62 29,05 0,02062 0,05204 0,04585 0,04037 5,5 2,49 29,41 0,02056 0,05182 0,04565 0,04016 6,0 2,26 28,63 0,02046 0,05155 0,04546 0,03985 6,5 2,20 27,42 0,02046 0,05183 0,04572 0,03984

- 3 -

13.10.2015

0,0 102,88 0,27 0,02206 0,05534 0,05082 0,04614 0,5 93,44 2,26 0,02196 0,05524 0,05028 0,04602 1,0 84,65 4,49 0,02179 0,05500 0,05008 0,04572 1,5 75,82 5,83 0,02161 0,05456 0,04957 0,04570 2,0 67,31 8,02 0,02167 0,05449 0,04928 0,04504 2,5 60,22 11,12 0,02154 0,05438 0,04850 0,04458 3,0 51,62 13,72 0,02144 0,05379 0,04860 0,04386 3,5 42,30 17,99 0,02132 0,05331 0,04851 0,04362 4,0 27,78 21,76 0,02116 0,05288 0,04769 0,04284 4,5 14,33 25,84 0,02095 0,05237 0,04706 0,04191 5,0 3,06 28,85 0,02086 0,05194 0,04636 0,04120 5,5 2,57 29,43 0,02073 0,05183 0,04646 0,04115 6,0 2,22 28,90 0,02079 0,05185 0,04632 0,04144 6,5 2,00 27,87 0,02075 0,05194 0,04638 0,04102

- 4 -

15.10.2015

0,0 99,69 0,58 0,02189 0,05544 0,04930 0,04631 0,5 93,98 2,55 0,02170 0,05517 0,04884 0,04576 1,0 85,89 4,33 0,02158 0,05527 0,04849 0,04567 1,5 81,91 6,54 0,02155 0,05479 0,04868 0,04503 2,0 72,33 8,55 0,02126 0,05445 0,04838 0,04508 2,5 65,65 12,35 0,02122 0,05430 0,04755 0,04460 3,0 54,36 15,26 0,02108 0,05406 0,04755 0,04395 3,5 40,88 17,60 0,02111 0,05351 0,04710 0,04341 4,0 30,54 21,69 0,02089 0,05324 0,04637 0,04265 4,5 15,15 25,37 0,02074 0,05269 0,04589 0,04194 5,0 4,20 29,13 0,02064 0,05222 0,04519 0,04120 5,5 2,68 30,07 0,02053 0,05209 0,04518 0,04092 6,0 2,26 29,15 0,02059 0,05236 0,04526 0,04119 6,5 2,02 28,51 0,02053 0,05221 0,04533 0,04091

Anhang 129

Tabelle 30: Messsignale des FT-MIR-Spektrometers für die vier Fermentationen mit den entsprechenden Ethanol- und Glucosekonzentrationen aus der HPLC-Referenzanalytik [8, 126]. Fermentation vom 15.10.2015 vorhergesagt.


Dauer (h)

HPLC Messsignale MIR-ATR-Spektrometer Glucose (g L–1)

Ethanol (g L–1) F1 F2 F3 F4

- 1 -

02.10.2015

0,0 97,70 0,77 0,00550 0,04793 0,05140 0,05481 0,5 94,62 2,32 0,00487 0,04753 0,05092 0,05411 1,0 88,10 4,22 0,00468 0,04732 0,05072 0,05365 1,5 79,23 5,70 0,00466 0,04704 0,05044 0,05308 2,0 71,34 7,63 0,00464 0,04698 0,05014 0,05255 2,5 64,35 10,84 0,00497 0,04707 0,05009 0,05219 3,0 54,65 14,03 0,00438 0,04626 0,04909 0,05092 3,5 46,56 16,81 0,00439 0,04519 0,04858 0,04975 4,0 34,93 20,50 0,00410 0,04499 0,04767 0,04824 4,5 21,22 23,97 0,00402 0,04442 0,04726 0,04716 5,0 8,80 29,65 0,00399 0,04405 0,04658 0,04599 5,5 3,45 31,63 0,00380 0,04407 0,04612 0,04549 6,0 2,45 30,11 0,00400 0,04431 0,04628 0,04580 6,5 2,10 28,64 0,00391 0,04421 0,04616 0,04559

- 2 -

08.10.2015

0,0 96,07 0,90 0,00467 0,04746 0,05078 0,05430 0,5 88,59 2,36 0,00480 0,04758 0,05083 0,05418 1,0 80,30 3,93 0,00485 0,04756 0,05074 0,05387 1,5 74,08 5,80 0,00469 0,04748 0,05047 0,05340 2,0 69,37 8,74 0,00478 0,04722 0,05031 0,05284 2,5 61,90 11,78 0,00463 0,04682 0,04985 0,05195 3,0 54,07 15,41 0,00468 0,04680 0,04955 0,05143 3,5 40,97 18,47 0,00457 0,04629 0,04905 0,05027 4,0 28,94 22,37 0,00436 0,04575 0,04845 0,04905 4,5 16,92 26,74 0,00434 0,04533 0,04798 0,04794 5,0 5,62 29,05 0,00413 0,04477 0,04725 0,04660 5,5 2,49 29,41 0,00417 0,04460 0,04722 0,04634 6,0 2,26 28,63 0,00413 0,04462 0,04733 0,04621 6,5 2,20 27,42 0,00393 0,04444 0,04717 0,04601

- 3 -

13.10.2015

0,0 102,88 0,27 0,00488 0,04793 0,05150 0,05492 0,5 93,44 2,26 0,00601 0,04897 0,05241 0,05573 1,0 84,65 4,49 0,00509 0,04797 0,05130 0,05428 1,5 75,82 5,83 0,00516 0,04789 0,05122 0,05402 2,0 67,31 8,02 0,00490 0,04752 0,05067 0,05304 2,5 60,22 11,12 0,00471 0,04709 0,05014 0,05221 3,0 51,62 13,72 0,00447 0,04651 0,04956 0,05108 3,5 42,30 17,99 0,00439 0,04610 0,04896 0,05007 4,0 27,78 21,76 0,00462 0,04616 0,04900 0,04953 4,5 14,33 25,84 0,00434 0,04553 0,04833 0,04810 5,0 3,06 28,85 0,00429 0,04509 0,04775 0,04717 5,5 2,57 29,43 0,00421 0,04487 0,04757 0,04669

Anhang 130

6,0 2,22 28,90 0,00422 0,04508 0,04739 0,04672 6,5 2,00 27,87 0,00418 0,04498 0,04738 0,04645

- 4 -

15.10.2015

0,0 99,69 0,58 0,00487 0,04812 0,05151 0,05503 0,5 93,98 2,55 0,00496 0,04837 0,05150 0,05486 1,0 85,89 4,33 0,00488 0,04807 0,05118 0,05429 1,5 81,91 6,54 0,00492 0,04790 0,05098 0,05372 2,0 72,33 8,55 0,00496 0,04772 0,05072 0,05318 2,5 65,65 12,35 0,00488 0,04741 0,05043 0,05239 3,0 54,36 15,26 0,00488 0,04716 0,05005 0,05165 3,5 40,88 17,60 0,00476 0,04687 0,04962 0,05070 4,0 30,54 21,69 0,00469 0,04637 0,04910 0,04955 4,5 15,15 25,37 0,00454 0,04583 0,04855 0,04837 5,0 4,20 29,13 0,00443 0,04546 0,04798 0,04723 5,5 2,68 30,07 0,00428 0,04525 0,04775 0,04689 6,0 2,26 29,15 0,00424 0,04508 0,04773 0,04679 6,5 2,02 28,51 0,00427 0,04524 0,04773 0,04680

C Anhang zur Prozessverfolgung mit einer kontaktlosen Ramansonde

Tabelle 31: Messsignale des Raman-Aufbaus mit der kontaktlosen Ramansonde für die vier Fermentationen mit den entsprechenden Ethanol- und Glucosekonzentrationen aus der HPLC-Referenzanalytik. Fermentation vom 22.03.2016 vorhergesagt.


Dauer (h)

HPLC Messsignale Raman-Spektrometer mit kontaktloser Ramansonde

Glucose (g L–1)

Ethanol (g L–1) S1 S2 S3 S4

- 1 -

18.03.2016

0,0 96,38 0,58 26566,2 21803,0 18131,6 19189,1 0,5 89,73 3,26 26607,0 21887,0 18234,1 19302,7 1,0 86,22 4,69 26949,2 22237,4 18551,5 19613,7 1,5 80,20 7,03 27193,6 22493,7 18810,7 19824,1 2,0 65,02 12,76 27048,8 22437,9 18860,2 19782,3 2,5 62,97 12,90 26630,9 22096,5 18566,5 19462,8 3,0 57,90 14,33 26285,4 21812,7 18434,6 19264,2 3,5 48,98 16,72 26248,9 21851,4 18483,2 19294,0 4,0 38,64 18,87 26264,3 21920,9 18632,1 19356,3 4,5 29,40 22,55 26442,3 22183,1 18871,8 19547,0 5,0 18,73 24,93 26607,8 22342,4 19068,6 19709,6 5,5 7,58 27,18 26722,2 22519,8 19235,1 19850,0 6,0 0,53 29,90 26127,6 22057,3 18866,4 19459,8 6,5 0,51 28,75 26303,1 22236,4 18998,7 19611,7

- 2 -

21.03.2016

0,0 95,78 0,01 26300,2 21593,5 17963,3 19088,8 0,5 91,73 2,12 25697,6 21093,9 17597,5 18626,9 1,0 83,91 3,83 26687,2 22004,7 18400,8 19409,2 1,5 77,54 6,62 26881,2 22232,5 18593,8 19587,6 2,0 72,84 9,41 27256,4 22616,6 18968,2 19911,0 2,5 64,37 11,47 26762,6 22277,2 18693,0 19631,1 3,0 54,62 13,38 26710,6 22187,8 18656,8 19540,9

Anhang 131

3,5 46,49 16,15 26953,4 22439,4 18897,9 19775,2 4,0 37,89 19,39 26975,0 22522,5 19021,3 19874,7 4,5 28,18 21,97 27130,6 22724,8 19224,8 20016,2 5,0 16,77 25,12 27209,2 22864,9 19342,2 20083,5 5,5 6,51 28,75 27329,1 23009,5 19543,1 20249,9 6,0 0,37 29,61 27520,6 23198,0 19709,9 20385,3 6,5 0,51 27,94 27646,0 23319,7 19800,0 20485,5

- 3 -

22.03.2016

0,0 98,91 1,03 26385,9 21588,0 17859,3 18948,6 0,5 94,91 2,90 26316,9 21568,0 17857,3 18927,6 1,0 88,54 4,31 26808,3 22071,9 18353,7 19424,4 1,5 81,27 6,56 26914,4 22256,4 18570,6 19569,4 2,0 72,62 9,56 27132,1 22488,3 18781,7 19750,8 2,5 64,79 11,47 26899,4 22284,9 18685,4 19609,0 3,0 55,83 13,86 26900,7 22367,5 18764,8 19668,7 3,5 48,58 16,15 26980,4 22538,1 18978,9 19814,6 4,0 38,89 18,96 27233,5 22825,6 19199,8 20044,7 4,5 29,99 21,30 27306,0 22920,9 19327,5 20134,3 5,0 17,98 24,46 27519,2 23129,4 19573,7 20344,2 5,5 5,38 27,80 27597,6 23270,3 19772,9 20465,4 6,0 0,53 29,80 27908,3 23556,9 20004,2 20699,3 6,5 0,39 28,61 27968,7 23626,0 20033,0 20749,8

- 4 -

23.03.2016

0,0 98,47 0,55 26366,9 21598,0 17857,3 18977,6 0,5 95,87 2,40 25883,7 21229,1 17671,0 18674,6 1,0 89,24 4,31 26572,5 21866,0 18168,8 19196,6 1,5 80,81 6,56 26739,4 22120,0 18427,5 19411,8 2,0 73,25 9,13 26699,2 22090,6 18463,5 19422,0 2,5 66,48 11,52 26524,3 21979,2 18435,0 19331,8 3,0 57,29 14,52 26218,0 21736,7 18287,7 19124,7 3,5 40,95 18,20 26336,8 21901,0 18509,5 19287,4 4,0 34,49 20,73 26424,8 22035,4 18651,9 19380,7 4,5 27,01 22,83 26451,0 22140,3 18739,6 19493,7 5,0 15,02 25,74 26635,7 22340,1 18973,1 19656,4 5,5 5,23 29,56 26757,8 22508,1 19150,2 19788,3 6,0 0,51 29,61 26971,3 22692,9 19346,7 19962,4 6,5 0,41 28,90 27135,6 22857,7 19418,5 20082,2

Bioprozessanalytik mittels Raman- und MIR-ATR-Spektroskopie · Bioprozessanalytik mittels Raman-...

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