Biosynthese des Taxols: Klonierung und Expression des Taxa ... · 2 Abstract Görhardt, Bärbel...

Biosynthese des Taxols: K lonierung und Expression

des Taxa-4(5),11(12)-dien-Synthase-Gens

aus Taxus baccata

vorgelegt von Diplom-Chemikerin Bärbel Görhardt

aus Berlin

Der Fakultät III – Prozesswissenschaften

der Technischen Universität Berlin zur Erlangung des akademischen Grades

Doktor der Naturwissenschaften

- Dr. rer. nat.-

genehmigte Dissertation Promotionsausschuss: Vorsitzender: Prof. Dr. sc. techn. L.-G. Fleischer Berichter: Priv.-Doz. Dr. Rainer Zocher Berichter: Prof. Dr. U. Szewzyk

Tag der mündlichen Prüfung: 19.01.2001

Berlin 2000

D 83

2

Abstract Görhardt, Bärbel Biosynthese des Taxols: Klonierung und Expression des Taxa-4(5),11(12)-dien-Synthase-Gens aus Taxus baccata Taxol ist ein hochwirksames Antikrebsmittel gegen Brust- und Eierstockkrebs, das in geringen Mengen in der Rinde aller Taxus-Arten gefunden wird. Taxol stellt ein hoch funktionalisiertes cyclisches Diterpen dar, das durch chemische Synthese nur schwer zugänglich ist. Durch die begrenzte Verfügbarkeit von Taxol durch natürliche Ressourcen, ist es von großem biotechnologischem Interesse, die an der Biosynthese beteili gten Enzyme zu erforschen. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Klonierung und Expression des Taxa-4(5),11(12)-dien-Synthase-Gens aus der Europäischen Eibe Taxus baccata. Die Taxadien-Synthase stellt ein Schlüsselenzym in der Biosynthese des Taxols dar. Sie katalysiert die Cyclisierung des Diterpens Geranylgeranylpyrophosphat zu Taxa-4(5),11(12)-dien. Für die Charakterisierung des Taxadien-Synthase-Gens wurde dieses mittels PCR amplifiziert und in Escherichia coli kloniert. Die Sequenzanalyse des Gens ergab einen offenen Leserahmen von 3980 bp, bestehend aus 13 Exons und 12 Introns. Aus dem ORF lässt sich für die Taxadien-Synthase eine Größe von 98 kDa vorhersagen. Ein Sequenzvergleich mit verschiedenen pflanzlichen Isoprensynthasen zeigte eine hohe Übereinstimmung hinsichtlich der Intron/Exon-Struktur im C-terminalen Bereich, als auch das Vorhandensein eines, in allen verglichenen Isoprensynthasen vorhandenen, konservierten Motivs DDXXD. Interessanterweise weist die Isoprensynthase aus T. baccata höhere Ähnlichkeit im mittleren Bereich der Gen-Struktur zu der Linalool-Synthase, eine Hydroxylase, aus Clarkia concinna auf als zu den anderen Isoprencyclasen. Der N-terminale Bereich der Isoprensynthase-Gene zeichnet sich durch eine hohe Variabili tät aus, da dieser Bereich für das Signalpeptid codiert, das für den Transport der Synthasen in die jeweili gen Plastide zuständig ist. Für die Expression der rekombinaten Synthase in E. coli wurde mittels RT-PCR die entsprechende cDNA isoliert, und anschließend das Protein durch Affinitäts-Chromatographie an Nickel-Agarose angereinigt. Die Ausbeute an Taxadien-Synthase betrug 20 mg/l Kulturmedium. Durch Western Blot-Analyse mit Antikörpern sowohl gegen His5-Tag als auch gegen ein Peptid aus der Taxadien-Synthase und durch GC-MS-Analyse konnte das funktionale Enzym nachgewiesen werden. Mittels SDS-PAGE unter denaturierenden Bedingungen konnte für die rekombinante Taxadien-Synthase ein Molekulargewicht von 97 kDa bestimmt werden. Im Gegensatz dazu ist für das native Protein aus T. brevifolia eine Größe von 80 kDa beschrieben worden. Diese Diskrepanz lässt den Schluss zu, dass das rekombinante Protein (Preprotein) aus einem Transitpeptid für das Plastid und der eigentlichen Isoprensynthase besteht. Ein Vergleich der Aminosäure-Sequenzen der Taxadien-Synthasen aus T. baccata, T. brevifolia und T. chinensis zeigt, dass der Verwandtschaftsgrad der Synthasen aus T. baccata und T. brevifolia untereinander höher ist als zu der Taxadien-Synthase aus T. chinensis.

Inhaltsverzeichnis

3

Inhaltsverzeichnis

Abstract ............................................................................................................2

Abbildungsverzeichnis.....................................................................................5

Abkürzungsverzeichnis....................................................................................6

Einleitung .........................................................................................................8

Taxol - ein Zytostatikum aus der Eibe................................................................................8 Wirkungsmechanismus von Taxol ......................................................................................9 Gewinnung von Taxol ........................................................................................................10 Biosynthese von Taxol........................................................................................................11 Isoprenbiosyntheseweg und andere Cyclasen ...................................................................13 Ziel dieser Arbeit ...............................................................................................................15 Materialien und Methoden ............................................................................16

Materialien ................................................................ ................................ ...... 16 1. Chemikalien....................................................................................................................16 2. Enzyme und K its............................................................................................................17 3. weitere Materialen und Geräte......................................................................................17 4. Antiseren ........................................................................................................................18 5. M ikroorganismen...........................................................................................................18 6. Vektoren und Primer .....................................................................................................18 7. DNA-Sequenzierung ......................................................................................................19 8. Medien und Puffer .........................................................................................................19 Methoden ................................................................ ................................ ......... 23 Standardmethoden.............................................................................................................23 Präparation genomischer DNA aus Taxus baccata...........................................................23 Präparation von Gesamt-RNA aus Taxus baccata............................................................24 Isolierung von Plasmid-DNA .............................................................................................25 Kompetente Zellen .............................................................................................................25 Transformation von Plasmiden .........................................................................................26 Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen .....................................................26 PCR-Reaktion ....................................................................................................................27 Southern Blot .....................................................................................................................28 RT-PCR..............................................................................................................................28 Expression von rekombinanten Proteinen ........................................................................29 Northern Blot-Analyse der Expression .............................................................................30 Aff initätsreinigung an Nickel-Agarose..............................................................................30 Bestimmung der Proteinkonzentration.............................................................................31 Polyacrylamid-Gelelektrophorese.....................................................................................31 Immunologische Detektion der Taxadien-Synthase (Western Blot) ................................32 N-terminale Aminosäuresequenzierung der exprimierten Taxadien-Synthase...............33 Enzym-Assay......................................................................................................................33

Inhaltsverzeichnis

4

GC-MS-Messung................................................................................................................34 Anlegen einer λλ-Genbank von Taxus baccata ...................................................................34 Präparieren der Host-Bakterien........................................................................................36 Bestimmen des Titers der Genbank ..................................................................................36 Screenen der Genbank.......................................................................................................36 Ergebnisse.......................................................................................................38

Präparation von DNA aus Taxus baccata..........................................................................38 Amplifizierung des Taxadien-Synthase-Gens...................................................................39 Struktur des Taxa-4(5),11(12)-dien-Synthase-Gens aus T. baccata ................................. 39 Vergleich der Intronbereiche verschiedener Isoprensynthasen.......................................40 Southern Blot-Analyse des T. baccata-Genoms................................................................. 41 Rekombinante Taxa-4(5),11(12)-dien-Synthase aus Taxus baccata.................. 42 RT-PCR..............................................................................................................................42 Expression des rekombinanten Proteins...........................................................................43 Northern Blot-Analyse der Expression .............................................................................44 Reinigung des rekombinanten Proteins............................................................................44 Immunologische Detektierung der r ekombinaten Taxadien-Synthase aus Taxus baccata............................................................................................................................................46 N-terminale Aminosäuresequenzierung der Taxadien-Synthase aus T. baccata.............47 Molekulargewichtsbestimmung der rekombinanten Taxadien-Synthase........................47 Aktivitätstest ......................................................................................................................48 Vergleich der Taxadien-Synthasen aus T. baccata, T. brevifolia und T. chinensis...........50 Alignment der Aminosäuresequenz verschiedener Isoprensynthasen aus Pflanzen .......51 Anlegen einer T. baccata-Genbank....................................................................................55 Diskussion.......................................................................................................57

Gen-Struktur der Taxa-4(5),11(12)-dien-Synthase aus Taxus baccata ............................57 Rekombinante Taxadien-Synthase aus T. baccata............................................................58 Vergleich der Taxadien-Synthasen aus T. baccata, T. brevifolia und T. chinensis...........59 Genbank .............................................................................................................................60 Ausblick ..............................................................................................................................61 Literatur .........................................................................................................62

Danksagung.................................................................................................... 67

Lebenslauf ......................................................................................................68

Abbildungsverzeichnis

5

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Struktur von Taxol und anderen Taxanen 7

Abbildung 2: Cyclisierung von Geranylgeranylpyrophosphat zu Taxa-4(5),11(12)-dien 10

Abbildung 3a: Biosynthese des Taxols 11

Abbildung 3b: Bildung des Oxetanrings an Baccatin III 11

Abbildung 4: Isoprenbiosynthese und die darin involvierten Enzyme 13

Abbildung 5: Struktur des Taxa-4(5),11(12)-dien-Synthase aus T. baccata 39

Abbildung 6: Vergleich der Gen-Struktur verschiedener Isoprensynthasen 40

Abbildung 7: Southern Blot-Analyse von T. baccata 41

Abbildung 8: Northern Blot-Analyse der Expression 43

Abbildung 9: SDS-PAGE verschiedener Reinigungsschritte der Taxadien-Synthase 44

Abbildung 10: Western Blot-Analyse der rekombinanten Taxadien-Synthase 45

Abbildung 11: Molekulargewichtsbestimmung der Taxadien-Synthase aus T. baccata 46

Abbildung 12: GC-MS-Analyse des Taxadien-Synthase-Tests 48

Abbildung 13: C-Ring-Fragmentierung von Taxadien 48

Abbildung 14: Alignment der Aminosäuresequenz verschiedener Taxadien-Synthasen 49

Abbildung 15: Alignment verschiedener Isoprensynthasen aus Pflanzen 51

Abbildung 16: Phylogenischer Stammbaum verschiedener Isoprensynthasen aus Pflanzen 54

Einleitung

6

Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung

AK Antikörper

Amp Ampicilli n

AS Aminosäure

ATP Adenosintriphosphat

BCIP 5-Bromo-4-chloro-3-indoylphosphat

bidest entionisiertes Wasser

bp Basenpaare

BSA Rinderserumalbumin

Ci Curie

CoA Coenzym A

cpm counts pro Minute

CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid

DMAPP Dimethylallylpyrophosphat

DNA Desoxyribonucleinsäure

dNTP Desoxyribonukleotid

E. Escherichia

Gb Gigabasenpaare

GC Gaschromatographie

GTP Guanidintriphosphat

HMG-CoA 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coa

HMWM High molecular weight marker

IPP Isopentylpyrophosphat

IPTG Isopropylthiogalactosid

Kana Kanamycin

kb Kilobasenpaare

kDa Kilodalton

KLH keyhole limpet heamocyanin (Hämocyanin der Schlüsselloch-Napfschnecke)

LB Luria-Broth

LMWM Low molecular weight marker

Mb Megabasenpaare

MCS multiple Klonierungsstelle

Einleitung

7

mRNA messenger Ribonucleinsäure

MS Massenspektrometrie

NADPH Nicotinamidadenindinucleotidphosphat

NCI National Cancer Institute

NBT Nitro Blue Tetrazolium

OD optische Dichte

ORF offener Leserahmen

PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese

PCR Polymerase-Ketten-Reaktion

pfu Plaque formende Einheit

PVDF Polyvinylidendifluorid

RNA Ribonucleinsäure

rpm Rotation pro Minute

RT Raumtemperatur

RT-PCR Reverse Transkriptase-Polymerase-Ketten-Reaktion

SDS Natriumdodecylsulfat

TBS Tris gepufferte Kochsalzlösung

TRIS Tris(hydroxymethyl)aminomethan

U unit (Enzymeinheit)

X-Gal 5-Chloro-4-bromo-3-indoyl-ß-D-galactopyranosid

Einleitung

8

O

OH

HO AcOH

OBz

OO

O

CO

CO

NHBz

NHtBOC

OH

OH

R2

R1

R1=Ac; R2=(1a)

Taxol

(1b) R1=H; R2=

Taxotére

(1c) R1=R2=H

R1=Ac; R2=H(1d) Baccatin III

10-Deacetylbaccatin III

Abbildung 1: Struktur von Taxol und anderen Taxanen

Einleitung

Die Taxa-4(5),11(12)-dien-Cyclase aus Taxus baccata katalysiert den ersten entscheidenden

Schritt zur Biosynthese des Taxols. Als erstes soll hier beschrieben werden was Taxol ist,

welche Wirkungsweisen Taxol aufweist.

Da die Taxadien-Synthase den Klassen der Terpencyclasen zuzuordnen ist, wird auch

vorgestellt, welche Cyclasen schon beschrieben sind und wie die Taxadien-Synthase darin

einzuordnen ist.

Taxol - ein Zytostatikum aus der Eibe Taxol ist ein hoch funktionalisiertes cyclisches Diterpen, das in sehr geringen Mengen in allen

Taxus-Arten gefunden wurde (Wani et al., 1971; Strobel et al., 1996). Als erstes wurde es aus

der Rinde der Pazifischen Eibe, Taxus brevifolia, isoliert (Wani et al., 1971). Im Rahmen

eines groß angelegten Screening-Programms des

National Cancer Institute (NCI, Maryland, USA) zur

Suche nach neuen Naturwirkstoffen sammelte der

Botaniker Arthur Barcley auch Proben aus der Rinde der

Pazifischen Eibe. 1964 wurde am Research Triangle

Institute (North Carolina, USA) im Labor von Wall und

Wani die cytostatische Wirkung von Extrakten dieser

Proben auf Leukämiezellen nachgewiesen. Zwei Jahre

später isolierten Wall und Wani diesen wirksamen

Bestandteil und gaben ihm den Namen Taxol1, in

Anlehnung an die Eibe (Gattung Taxus). 1971 gelang es

ihnen, die Struktur zu entschlüsseln. Abb. 1

Taxol erwies sich in klinischen Tests als hochwirksam

gegen Eierstock- und Brustkrebs (McGuire et al., 1989;

Rowinsky et al., 1990; Holmes et al., 1991; Rowinsky

und Donehower, 1991). Insbesondere bei der

Behandlung des Ovarialkarzinoms konnten mit

1 Taxol ist ein registriertes Warenzeichen von Bristol-Myers Squibb. Paclitaxel ist der generische Name. Aufgrund des höheren Bekanntheitsgrades wird hier jedoch weiterhin der Name Taxol verwendet.

Einleitung

9

Taxol Erfolge bei Patientinnen erzielt werden, bei denen andere Zytostatika versagt hatten.

Dabei zeigte sich Taxol in 30% der Fälle mit beherrschbaren Nebenwirkungen wirksam. Ein

Problem stellte jedoch die sehr geringe Wasserlöslichkeit von Taxol dar, deren Verbesserung

durch den Lösungsvermittler Cremaphor® bei der Behandlung eine akute

Überempfindlichkeit hervorruft, so dass eine Vorbehandlung mit Antihistaminen notwendig

ist. Neuere Forschungsansätze versuchen durch Einbinden von Taxol in Liposome die

Wasserlöslichkeit zu erhöhen und so die akute Toxizität zu erniedrigen (Sharma et al., 1993;

Balasubramanian et al., 1994). Seit 1993 ist Taxol zur Behandlung des fortgeschrittenen

Ovarialkarzinoms in den USA, seit 1994 auch in Deutschland zugelassen.

Wirkungsmechanismus von Taxol Ähnlich wie andere Cytostatika greift Taxol in den Mitosezyklus ein. Im Gegensatz jedoch zu

Substanzen wie Colchicin, Vinblastin und Vinchristin, welche das Gleichgewicht zwischen

Tubulindimeren und Mikrotubuli in Richtung Tubulindimere verschieben, stabili siert Taxol

die Mikrotubuli (Schiff et al., 1979; Schiff und Horowitz, 1980). Die Mikrotubuli bilden das

Cytoskelett der Zelle und sind u.a. bei der Zellteilung zur Ausbildung der mitotischen Spindel

in der Mitose nötig. Die Mikrotubuli werden aus zwei strukturell verwandten Proteinen von

jeweils 50 kDa, dem α- und dem β-Tubulin, die sich zu einem Tubulindimer zusammen

lagern, gebildet. In Gegenwart von GTP und Magnesiumionen wird jeweils die

α-Untereinheit eines Dimers mit der β-Untereinheit des nächsten verknüpft, so dass sich

Protofilamente ausbilden, die in alle Richtungen weiterwachsen, bis die Randfilamente zu

einem Mikrotubulus verschmelzen und das weitere Wachstum an den Enden des Tubulus

erfolgen kann. Hierbei entsteht ein Gleichgewicht zwischen Wachstum und Zerfall der

Mikrotubuli. Nach einer bestimmten Zeit erreichen Mikrotubulus und freies Tubulin ihre

sogenannte kritische Konzentration, bei denen die Zerfalls- und Wachstumsrate des

Mikrotubulus ausgeglichen ist, also kein weiteres Wachstum stattfindet. Ein normaler

Mikrotubulus aus Gehirntubulin besteht aus 13 Protofilamenten und hat einen Durchmesser

von ca. 24 nm.

Cytostatika wie Cholchicin binden an die β-Untereinheit des Tubulindimers und verhindern

so die Polymerisation zu den Mikrotubuli. Taxol dagegen stabili siert die Mikrotubuli, in dem

es die kritische Konzentration des Tubulins gegen null herabsetzt und außerdem die

Induktionszeit für die Polymerisation sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von GTP

und Magnesiumionen verkürzt. Die so gebildeten Mikrotubuli bestehen nur aus 12

Einleitung

10

Protofilamenten und haben einen Durchmesser von 22 nm und können deshalb nicht zur

Bildung der bei der Zellteilung erforderlichen mitotischen Spindel verwendet werden. Da die

unter dem Einfluss von Taxol gebildeten Mikrotubuli auch eine große Resistenz gegenüber

Depolymerisation durch Kälte oder Zugabe von Calciumionen zeigen, ist die so erzielte

Hemmung der Zellteilung außerordentlich effektiv. Gesunde Zellen besitzen einen

Kontrollmechanismus, der gewährleistet, dass die Zellteilung nur bei korrekter Ausbildung

der mitotischen Spindel weiter abläuft. Tumorzellen dagegen besitzen diesen

Kontrollmechanismus nicht, so dass eine Zelle ohne korrekte mitotische Spindel abstirbt oder

eine extreme Veränderung ihres Metabolismus erfährt (Nicolaou et al., 1994a).

Gewinnung von Taxol Da Taxol nur zu 0,02% des Trockengewichtes in der Rinde von Taxus brevifolia enthalten ist

(Wani et al., 1971), jedoch für die Behandlung eines Patienten 2 g benötigt werden, wurde

nach Alternativen zur Gewinnung von Taxol gesucht. Eine Variante ist die Totalsynthese von

Taxol im Labor. 1994 wurden unabhängig von einander durch Nicolaou und Mitarbeiter und

Holton und Mitarbeiter chemische Totalsynthesen von Taxol veröffentlicht, die aber für eine

Anwendung im großtechnischen Bereich zu aufwendig und zu ineffizient sind (Nicolaou et

al., 1994b; Holton et al., 1994). Seit 1993 wird Taxol kommerziell auf semisynthetischem

Weg ausgehend von den Vorstufen Deacetylbaccatin III oder Baccatin III hergestellt (Holton

et al., 1995). Diese werden aus nachwachsenden Eibennadeln extrahiert. Ebenfalls

halbsynthetisch wird Taxotère® produziert, ein Analogon, das sich strukturell an zwei Stellen

von Taxol unterscheidet und eine bessere Wasserlöslichkeit als dieses aufweist. (Taxotère ist

ein registriertes Warenzeichen von Rhône-Poulenc Rorer. Der generische Name ist

Docataxel.) (Guérnard et al., 1993) Abb. 1.

Eine andere Möglichkeit der Gewinnung von Taxol besteht in der Züchtung von

Pflanzenzellkulturen, welche gegenüber der intakten Pflanze den Vorteil der einfacheren

Extraktion der Metaboliten sowie einer leichteren Manipulation haben. (Yukimune et al.,

1996). Die Produktionsraten sind für eine ökonomische Nutzung immer noch zu gering, aber

wegen der leichten Handhabbarkeit der Zellkulturen sind diese sehr nützlich für die

Untersuchungen der Biosynthese von Taxanen.

Die Entdeckung von Stierle und Strobel 1993 ermöglichte eine weitere Variante der Taxol-

Gewinnung. Sie konnten einen endophyten Pilz von Taxus brevifolia isolieren, der

unabhängig von seiner Wirtspflanze Taxol und andere Taxane in sehr geringen Mengen

Einleitung

11

produziert (Stierle et al., 1993). Sie nannten den Pilz Taxomyces andreanae. Bei der im

Himalaja vorkommenden Eibe Taxus wallachiana fand man den Pilz Pestalopsis microspora

als Taxolproduzenten (Strobel et al., 1996). Eine Untersuchung an anderen Koniferenarten,

die in sumpfigen Gebieten wachsen, führte zur Entdeckung mehrerer Stämme von

P. microspora, die nachweislich Taxol produzieren. Der Wirt war aber nicht die Eibe, sondern

die Zypresse Taxodium distichum (Li et al., 1996). Die aus dem Anzucht-Medium der

einzelnen Stämme extrahierten Taxolmengen unterschieden sich sehr stark. Es wurde

vermutet, dass aufgrund eines unregelmäßigen sektorartigen Mycelwachstums eines

Hochproduzenten dieser genetisch instabil ist. Diese These würde die Theorie stützen, dass

die isolierten Pilze die Fähigkeit, Taxol zu synthetisieren, von der Eibe durch einen

horizontalen Gentransfer erworben haben.

Biosynthese von Taxol Taxol ist strukturell ein sehr komplexer Vertreter der Familie der Taxoide und durch ein

tricyclisches Triterpen-Taxan-Ringsystem gekennzeichnet. Nicht zuletzt sind 12 verschiedene

enzymatische Reaktionen in der Taxolbiosynthese involviert (Walker und Croteau, 2000a).

Als ersten entscheidenden Schritt in der Biosynthese des Taxols wurde die elektrophile

Cyclisierung von Geranylgeranylpyrophosphat über die kationischen Zwischenstufen des

Verticill en und Cembren zu Taxa-4(5),11(12)-dien charakterisiert (Koepp et al., 1995; Lin et

al., 1996) Abb. 2. Diese Reaktion wird von dem Enzym Taxa-4(5),11(12)-dien-Synthase

katalysiert und diese Synthase wurde zum ersten Mal von Hezari und Mitarbeiter 1995 aus

der Pazifischen Eibe Taxus brevifolia isoliert (Hezari, et al., 1995). Die Klonierung des

Taxadien-Synthase-Gens aus T. brevifolia gelang 1996 Wildung und Croteau.

1

+ +

1 23

45

1112

12 11

421+

53 A B C

Geranylgeranylpyrophosphat

Verticillyl-Kation

Taxenyl-Kation Taxa-4(5),11(12)-dien

OPP H H

H

H

HH

H

H

Abbildung 2: Cycli sierung von Geranylgeranylpyrophosphat zu Taxa-4(5),11(12)-dien in der Taxolbiosynthese

Einleitung

12

Der Schritt, der zu einer Umlagerung der Doppelbindung in die 4,20-Position (exo) führt,

wurde ebenfalls aufgeklärt (Hefner et al., 1996). Diese Umlagerung geht einher mit einer

α-Hydroxylierung an Position 5 Abb. 3a. Das verantwortliche Enzym stellte sich als

NADPH-abhängige P450-Oxygenase heraus.

Die Acetylierung von Taxa-4(20),11(12)-dien-5α-ol zu Taxa-4(20),11(12)-dien-5α-yl-acetat

durch eine O-Acetyltransferase wurde ebenfalls charakterisiert (Walker et al., 1999a)

(Abb. 3a). Auch das dazugehörige Gen der 5α-ol-Transacylase aus Taxus cuspidata ist

kloniert und in E. coli exprimiert (Walker et al., 2000b).

Welche Reaktionen zur Bildung des charakteristischen Oxetanrings führen, ist noch nicht

sicher, man geht jedoch davon aus, dass diese eine Epoxidierung der 4,20-Doppelbindung

beinhalten (Guéritte-Voegelein et al., 1987) Abb. 3b.

Späte Schritte der Taxol-Biosynthese (Acetylierungen und Benzylierungen) sind bisher nur

teilweise aufgeklärt. Für die Acetylierung von 10-Deacetylbaccatin III zu Baccatin III wurde

OH

H

H H

H

H

H

OAc

HOAc

O

HO

OH

OHO

OBz

HO

HOAc

O

HO

OH

OHO

OBz

AcO

HOAc

O

OH

OHO

OBz

R1O

R2O

Taxa-4(5),11(12)-dien Taxa-4(20),11(12)-dien-5α-ol Taxa-4(20),11(12)-dien-5α-yl acetat

10-Deacetylbaccatin III Baccatin III Taxol: R1=Ac

R2= N-Bz Phenylisoserinyl

Taxotére: R1=H

R2= N-tBOC Phenylisoserinyl Abbildung 3a: Biosynthese des Taxols a) Hydrolysierung von Taxadien zu Taxadien-5α-ol durch Taxadien-5α-Hydroxylase; b) Acetylierung von Taxadien-5α-ol durch Taxa-4(20),11(12)-dien-5α-ol-O-Acetyltransferase; c) Acetylierung von 10-DAB III zu Baccatin III durch 10-DAB III -10-O-Acetyltransferase und d) Verknüpfung der Seitenkette mit Baccatin III zu Taxol.

45

20 20

54

54

20

54

20

OH OAcO

OAc OAcO

4(20)-en-5α-ol 4(20)-en-5α-yl acetat 4(20)-epoxy-5α-yl acetat 4-acetoxy-oxetan

Abbildung 3b: Bildung des Oxetanr ings an Baccatin III

Einleitung

13

bereits das verantwortliche Enzym, eine spezifische O-Acetyltransferase, in Wurzeln von

Taxus baccata nachgewiesen (Zocher et al., 1996) und das entsprechende Gen aus Taxus

cuspidata funktionell in E. coli exprimiert (Walker und Croteau, 2000a).

Die für die Antitumoraktivität essentielle Phenylisoserin-Seitenkette wurde ebenfalls

eingehend untersucht. So wird zuerst Benzoylphenylisoserin mit dem Taxangrundkörper

kondensiert und die Seitenkette später modifiziert.

Isoprenbiosyntheseweg und andere Cyclasen Schon seit über zehn Jahren werden verschiedene Pflanzengene kloniert, die in der

Isoprenbiosynthese involviert sind. Die Grundlage aller Isoprenbiosynthesen ist die Synthese

von Isopentenylpyrophosphat (IPP) und dessen Isomer Dimethylallylpyrophosphat (DMAPP).

Für deren Bildung sind zwei verschiedene Synthesewege möglich. Ausgehend von

Acetoacetyl-CoA, Acetyl-CoA und H2O wird das daraus gebildete 3-Hydroxy-3-methyl-

glutaryl-CoA (HMG-CoA) durch eine Reduktase im Cytosol zu Mevalonsäure reduziert. Die

Mevalonsäure wird durch ATP-abhängige Reaktionen in IPP umgewandelt. Wahrscheinlicher

ist aber ein alternativer Biosyntheseweg, der in den Chloroplasten abläuft, bei dem IPP aus

Pyruvat und Glycerinaldehyd-3-phosphat gebildet wird Abb. 4.

Abbildung Abb. 4 gibt einen Überblick über die Verknüpfung der Isopreneinheiten durch die

jeweili gen, an den Reaktionen beteili gten Enzymen und deren Produkte.

1 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-coenzym A-Reductase

5 Geranylgeranylpyrophosphatsynthase 6 Hexaprenylpyrophosphat-Synthase - verwandtes Protein

4 Farnesylpyrophosphat-Synthase 3 Mevalonat-5-pyrophosphat-Decarboxylase 2 Mevalonsäurekinase

11 5-epi-Aristolochensynthase10 4s-Limonensynthase 9 s-Linanoolsynthase 8 Chrysanthemylpyrophosphatsynthase 7 Isopentenylpyrophosphatisomerase

15 Squalenepoxidase14 Squalensynthase

12 Vetispiradiensynthase13 (+) δ -Cardiensynthase

16 Oxidosqualencyclase (Cycloartenolsynthase)

20 ent-Copalylpyrophosphatsynthase A21 ent-Kaurensynthase

19 Casbensynthase18 Abietadiensynthase17 Geranylgeranylpyrophosphathydrogenase

26 Lycopencyclase (b)

24 Phytoendesaturase23 Phytoensynthase22 Taxadiensynthase

25 ζ -Carotendesaturase

30 Violaxanthindeeopxidase29 Zeaxanthinepoxidase

27 Lycopencyclase (e)28 β -Carotenhydroxylase

Einleitung

14

Aus Abb. 4 ist ersichtlich, dass sowohl die Abietadien-Synthase aus Tanne (Abies grandies,

LaFever et al., 1994) als auch die Casben-Synthase aus Rhizinus (Ricinus communis L, Mau

and West, 1994), die ent-Kauren-Synthase aus Kürbis (Curcurbita maxima L, Yamaguchi et

al., 1996) wie die Taxadien-Synthase der Familie der Diterpen-Synthasen zuzuordnen sind.

Alle diese Synthasen katalysieren die Cyclisierung von Geranylgeranylpyrophosphat zu

einem jeweils unterschiedlichen Produkt. Weitere Isoprencyclasen sind die Linalool-Synthase

und Limonen-Synthase; beide zu der Familie der Monoterpen-Synthasen gehörend und an der

Cyclisierung des Geranylphosphats beteili gt. Die Linalool-Synthase aus einer Kanadischen

Geranylgeranylpyrophosphat

Solanesylpyrophosphat

Kautschuk

HMG-CoA

Mevalonsäure

Mevalonsäure-5-phosphat

Mevalonsäure-5-pyrophosphat

Isopentylpyrophosphat (IPP)

Geranylpyrophosphat

Farnesylpyrophosphat

Alternativer Pathway in Chloroplasten

Pyruvat Glycerinaldehyd- 3-phosphat

+

?

Dimethylallylpyrophospat

Chrysanthemylpyrophosphat

tRNA

Cytokinin

Ergoline

Isoprene

Monoterpene LinaloolLimonen

z.B.:

IPP

Indolalkaloide

Sesquiterpene

Squalene

IPP

5 IPP

viele IPP

Triterpene

PhytolTocopheroleDiterpene Abietadien

Casbenent-KaurenTaxol

z.B.:

Phytoen

Zeaxaethin

Lycopen -Carotinα

Lutein

Ubichinon-45

Plastochinon

Violaxanthin

Abscisic Säure

Neoxanthin

Solanesyl-50-pyrophosphat Ubichinon-50

IPP

z.B.: 5-epi-AristolochenVetispiraden

-Cardinenδ(+)

-Carotinζ

-Carotinβ

1

2

4,5

3

5

4,5

6?

6?

7 8

9,10

11,12,13

x 2 14

17

x 2 23

18,19,20,21,

22

24

25

26

28

17

26,27

30

29

28+

2626

z.B.: Cycloartenolvia 2,3-Oxidosqualen

15,16

Abbildung 4: Isoprenbiosynthese und die dar in involvierten Enzyme Rot markiert ist der für diese Arbeit wichtige Weg der Biosynthese des Taxols ausgehend von Geranylgeranylpyrophosphat. Diese Abbildung wurde der Veröffentli chung von Scolnik und Bartley, 1996 entnommen.

Einleitung

15

Wildblume (Clarkia breweri) wurde 1998 isoliert (Cseke et al., 1998). Mittlerweile sind auch

verschiedene Limonen-Synthasen aus unterschiedlichen Pflanzen bekannt (Yuba et al., 1996;

Colby et al., 1993 und Adam et al., 1996). Eine weitere Familie sind die Sesquiterpen-

Synthasen, welche die Cyclisierung des Farnesylpyrophosphates katalysieren. Vertreter dieser

Familie sind die 5-epi-Aristolochen-Synthase aus Tabak (Nicotiana tabacum; Facchini and

Chappel, 1992), Vetispiraden-Synthase aus Ägyptischem Bilsenkraut (Hyoscyamos muticus;

Back and Chappel, 1995) und die (+)-δ-Cardinen-Synthase aus Baumwolle (Gossypium

hirsutum L; Davis et al., 1998).

Ein Vergleich der verschiedenen Terpencyclasen auf Aminosäurebasis zeigt Bereiche, die

hoch konserviert sind. Vor allem das aspartatreiche Motiv DDXXD ist sowohl für alle

Terpencyclasen als auch für die Farnesyldiphosphat-Synthase beschrieben worden; und es

wird vermutet, dass dieses Motiv für die Bindung des Komplexes aus zweiwertigen

Metalli onen und der jeweili gen Prenyleinheit verantwortlich ist (Starks et al., 1997). Allen

Isoprencyclisierungen geht eine Katalysierung der Ionisation und elektrophilen Reaktion des

Allyl-Diphosphatesters voraus. Wahrscheinlich ist diese Reaktion die Basis der evolutionären

Entwicklung dieser Klasse von Enzymen (Cane und Kang, 2000).

Ziel dieser Arbeit

Einen wichtigen Beitrag zur Aufklärung des Biosyntheseweges des Taxols leistet die

strukturelle und funktionelle Charakterisierung der an der Synthese beteili gten Enzyme. Ein

Schlüsselenzym der Biosynthese des Taxols stellt die Taxa-4(5),11(12)-dien-Synthase dar.

Ziel dieser Arbeit war es, das Gens der Taxa-4(5),11(12)-dien-Synthase aus Taxus baccata

zur Aufklärung der Struktur mittels PCR zu amplifizieren, zu klonieren und in E. coli zu

exprimieren. Des Weiteren sollten Homologievergleiche mit bekannten Taxadien-Synthasen

und anderen Isoprensynthasen aus Pflanzen durchgeführt werden.

Materialien und Methoden

16


Materialien

1. Chemikalien

Gebräuchliche Chemikalien in p.a. Qualität wurden von den Firmen Sigma, Deisenhofen;

Merck, Darmstadt und Fluka, Neu-Ulm bezogen.

Acrylamid Life Technologies, Karlsruhe

Agarose Sigma, Deisenhofen

Antipain, Leupeptin, Pepstain Sigma, Deisenhofen

Bactotrypton Becton Dickinson, Heidelberg

BCIP/NBT-Tabletten Sigma, Deisenhofen

Benzamidin Sigma, Deisenhofen

Bromphenolblau Serva, Heidelberg

BSA Sigma, Deisenhofen

Coomassie Brill ant Blue Serva, Heidelberg

DTT AppliChem GmbH, Darmstadt

EDTA Merck, Darmstadt

Glycin Sigma, Deisenhofen

Hefeextrakt Becton Dickinson, Heidelberg

HMWM Sigma, Deisenhofen

Imidazol Merk, Darmstadt

IPTG AppliChem GmbH, Darmstadt

isoPropanol Merck, Darmstadt

Mercaptoethanol Merck, Darmstadt

NAOH Merck, Darmstadt

Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) Amresco, Biometra, Göttingen

Ponceau S Sigma, Deisenhofen

PMSF Serva, Heidelberg

SDS Fluka, Neu-Ulm

TEMED Serva, Heidelberg

Tris-HCl Sigma, Deisenhofen

Tween-20 Merk, Darmstadt


17

X-Gal AppliChem GmbH, Darmstadt

2. Enzyme und K its

DNase I Sigma, Deisenhofen

Restriktionsenzyme Life Technologies, Karlsruhe

T4-DNA-Ligase Life Technologies, Karlsruhe

Tag-DNA-Polymerase Life Technologies, Karlsruhe

DNeasy Plant Mini/Maxi-Kit Qiagen, Hilden

RNeasy Plant Mini-Kit Qiagen, Hilden

RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden

Plasmid-Midi/Maxi-Kit Qiagen, Hilden

Gel-Extraktions-Kit Qiagen, Hilden

QIAprep-Spin-Kit Qiagen, Hilden

Enhanced Avian RT-PCR Kit Sigma, Deisenhofen

QIAexpressionistâ Qiagen, Hilden

Lambda DASHâ II /BamHI Vector Kit Stratagene, Heidelberg

Gigapackâ III XL Packaging Extract Stratagene, Heidelberg

3. weitere Materialen und Geräte

Mikrotiterplatten Dynatech, Denkendorf

Nitrocellulose(BA85)-Membran Schleicher&Schuell, Dassel

PVDF-Membran Schleicher&Schuell, Dassel

Spannungsquelle Life Technologies, Karlsruhe

Gel-Apparaturen Hoefler,

Fastblot-Apparatur Biometra, Göttingen

Tankblot-Apparatur Werkstatt, TU Berlin

Liquid Scintill ation Counter 1409 Wallac, Turku, Finnland

Tischzentrifuge Heraeus Christ,

Kühlzentrifuge Sorvall, Newton, Conneticut, USA

Rotoren GSA und SS34 DuPont, Boston, USA

Transill uminator Herolab

Agarosegelelektrophorese Werkstatt, TU Berlin


18

PCR-Cycler Uno Thermoblock II Biometra, Göttingen

Spektralphotometer Kontron Instruments,

clean bench Weidner, Hamburg

Microelisa Auto Reader MR 580 Dynatech, Denkendorf

Peptid Sequenzer

ProciseTM Protein Sequencing System Applied Biosystem (Perkin Elmer), Norwalk,

USA

4. Antiseren

Polyklonales Antiserum aus Kaninchen gegen Taxadien-Synthase aus Taxus baccata.

5. M ikroorganismen

E. coli XL1-Blue (Bullock et al., 1987)

E. coli M15[pREP4] (Zamenhofer and Vill arejo, 1972)

E. coli P2392 (Kretz and Short, 1989)

6. Vektoren und Primer

Vektoren

pBlueskript pBBSK+ (Stratagene)

pCR®2.1-TOPO (Invitrogen)

pQE31 (Qiagen)

PCR-Primer

Start- und Stopcodons sind fett und Restriktionsschnittstellen kursiv markiert.

TBC1A 5’-ATGGCTCAGCTCTCATTTAAT (TIBMOL, Berlin)

TBC2A 5’-TCATACTTGAATTGGATCAAT (TIBMOL, Berlin)

TBC1B 5’-GGAATTCCATGGCTCAGCTCTCATTTAAT (metabion, Ebersberg)

TBC2B 5’-AGGGCCCTCATACTTGAATTGGATCAAT (metabion, Ebersberg)

TBC3 5’-CGGGATCCTTAGAAA TGGCAAAA TTGGACTTCAAT (metabion,Ebersberg)

TBC4 5’-GGAATTCAGCATAAGTCCTTAAGTACTCTTCAAA (metabion, Ebersberg)


19

Sequenzierungsprimer

Reverse Primer 5’-AACAGCTATGACCAT (Stratagene)

T7 Primer 5’-AATACGACTCACTATAG (Stratagene)

TBS1 5’-GCAACACTAGATGAATTG (TIBMOL, Berlin)

TBS2R 5’-CTCCGCCAATCGGTGTCG (TIBMOL, Berlin)

TBS3 5’-GCAAGTTTGCATACACTC (metabion, Ebersberg)

TBS3A 5’-GCCACTAGAATTGCCTTC (metabion, Ebersberg)

TBS4 5’-CCAAGAACGGGCAGATGA (metabion, Ebersberg)

TB4A 5’-CTACTTTCCAAGAACGGG (metabion, Ebersberg)

TBS5 5’-CTCACCTATATAGAGTCT (metabion, Ebersberg)

TBS6 5’-AGATCCACCACGCTTCTC (metabion, Ebersberg)

TBS7 5’-GCGTTGGGGATCAATCTT (metabion, Ebersberg)

TBS8R 5’-GTCTGCTGCCGCAGAAA C (metabion, Ebersberg)

TBS9R 5’-TTACTCAAA GATGGCATT (metabion, Ebersberg)

pQE/forward 5’-CGGATAACAATTTCACACAG (TIBMOL, Berlin)

pQE/reverse 5’-GTTCTGAGGTCATTACTGG (TIBMOL, Berlin)

cTBCycS1 5’-GGGGATCTGTGGCACCAC (metabion, Ebersberg)

cTBCycS2R 5’-GCTCAAGGATACAAGCTC (metabion, Ebersberg)

cTBCycS3R 5’-AAGGACTTGTAAA CAACC (metabion, Ebersberg)

7. DNA-Sequenzierung

Die Sequenzierung der DNA wurde von der Firma Martin Meixner, Berlin durchgeführt. Zum

Einsatz kam dabei ein ABI373 DNA sequencing system von Applied Biosystem unter der

Verwendung von BigDye-Terminator cycle sequencing-Kit von Perkin-Elmer.

8. Medien und Puffer

LB-Medium 10 g NaCl, 5 g Hefeextrakt, 10 g Bactotrypton auf 1 l H2O. Festes Medium

enthielt 2 % Agar. Zur Selektion auf ampicilli nresistente (und kanamaycinresistente)

Plasmide wurde Ampicilli n (100 µg/ml) (und Kanamycin [25 µg/ml]) zugegeben. Das

Medium wurde bei 121 °C 20 min autoklaviert.

LB Top Agar 0,7% (w/v) Agarose auf 1 l LB-Medium


20

TBS-Tween 25 mM Tris-HCl pH 7,4, 16 g NaCl, 0,4 g KCl, 2 ml TWEEN 20 auf 2 l H2O

Puffer1 50 mM Glucose, 10 mM EDTA pH 8,0; 25 mM Tris-HCl pH 8,0

Puffer2 0,2 N NaOH, 1% SDS

Puffer 3 3 M KOAc pH 5,5

Blotpuffer A 14,4 g Glycin, 3,0 g Tris-HCl, 200 ml Ethanol (techn.) auf 1 l H2O

Blotpuffer B 14,4 g Glycin, 3,0 g Tris-HCl, 100 ml Methanol (techn.) auf 1 l H2O

20 x SSC 3,6 M NaCl, 0,2 M NaH2PO4•H2O, 0,02 EDTA, pH 7,7

Elektrophoresepuffer 28,8 g Glycin, 6,0 g Tris-HCl, 4,0 g SDS auf 2 l H2O

50 x TAE 242 g Tris-HCl, 57,1 ml Eisessig, 100 ml EDTA, pH 8,0 auf 1 l H2O

5 x TBE 54 g Tris-HCl, 27,5 g Borsäure, 20 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0 auf 1 l H2O

Hybridisierungspuffer 5x SSPE, 5x Denhardts-Lsg., 0,5% SDS

Waschpuffer 1 2x SSPE, 0,1% SDS

Waschpuffer2 1x SSPE, 0,1% SDS

Waschpuffer3 0,1x SSPE, 0,1% SDS

Aufschlusspuffer 50 mM NaH2PO4 pH 8,0, 300 mM NaCl, 10% Glycerin, 1 mM

ß-Mercaptoethanol, 10 mM Imidazol, 0,7 µg/ml Pepstain, 30 µg/ml Chymostatin, 50 µg/ml

Antipain

Waschpuffer 50 mM NaH2PO4 pH 8,0, 300 mM NaCl, 10% Glycerin, 1 mM

ß-Mercaptoethanol, 20 mM Imidazol


21

Elutionspuffer 50 mM NaH2PO4 pH 8,0, 300 mM NaCl, 10% Glycerin, 1 mM

ß-Mercaptoethanol, 250 mM Imidazol

Assaypuffer 25 mM Hepes pH 8,0, 10% Glycerin

Bradford-Reagenz 100 mg Coomassie Brill ant Blue, 50 ml Ethanol p.a., 100 ml 85%ige

Phosphorsäure auf 1 l H2O

Auftragspuffer 50 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 100 mM DTT, 0,1% Bromphenolblau,

10% Glycerin

Coomassie Brillant Blue-Lösung 1 g/l Coomassie Brill ant Blue in 50% Methanol und 10%

Essigsäure

Ponceau S-Lösung 1 mg/ml Ponceau S, 5 % Essigsäure in H2O

TBF1 100 mM RbCl, 50 mM MnCl2, 30 mM Natriumacetat, 10 mM CaCl2, 15% Glycerin,

pH 5,8; steril filtrieren

TBF2 10mM MOPS, 10 mM RbCl, 75 mM CaCl2, 15% Glycerin, mit KOH auf pH 6,8

einstellen und steril filtrieren

SM-Puffer 50,0 ml 1 M Tris-HCl pH 7,5; 5,8 g NaCl, 2,0 g MgSO4•7H2O, 5,0 ml 2%ige

Gelatine auf 1 l H2O

1,2% FA-Gel (130 ml) 1,56 g Agarose, 13 ml 10x FA-Gelpuffer, auf 117 ml RNase-freies

Wasser

10x FA-Gelpuffer 200 mM MOPS, 50 mM Natriumacetat, 10 mM EDTA, pH 7,0 mit

NaOH einstellen

1x FA-Laufpuffer 100 ml 10x FA-Gelpuffer, 20 ml 37% (=12,3 M) Formaldehyd, 880 ml

RNase-freies Wasser


22

5x RNA Ladepuffer 16 µl gesättigte Bromphenolblau-Lösung 80 µl 500 mM EDTA,

pH 8,0, 720 µl 37%iges Formaldehyd, 2 ml Glycerin, 3,084 ml Formamid, 4 ml 10x FA-

Gelpuffer auf 10 ml mit RNase-freies Wasser


23

Methoden

Standardmethoden

Standardmethoden wie Restriktionsanalyse, Agarose-Gelektrophorese, Southern/Northern

Blot-Analyse und Ligation wurden nach Sambrook et al. (1989) durchgeführt.

Präparation genomischer DNA aus Taxus baccata

Methode 1

Eine in dem Labor der Arbeitsgruppe Zocher etablierte Methode zur Isolierung und

Reinigung von chromosomaler DNA ist die Beschreibung von E. M. Möller (Möller et al.,

1992). Durch eine CTAB-Fällung sollen die von Pilzen und Pflanzen vermehrt produzierten

Polysaccharide abgetrennt werden, da diese nur eine inakzeptable Quantität an Isolierung von

DNA erlauben.

100 mg frisch geernteter Wurzeln von T. baccata wurden in flüssigem Stickstoff

schockgefroren und fein zermörsert. Das Homogenat wurde in 500 µl TES-Puffer

aufgenommen, und nach der Zugabe von 50-100 µg Proteinase K wurde der Ansatz 1 h bei

60 °C unter gelegentlichem Schütteln inkubiert. Nach Zugabe von 140 µl 5 M NaCl-Lösung

und 65 µl 10%iger CTAB-Lösung wurde für weiterer 10 min bei 65 °C inkubiert.

Anschließend wurden 700 µl Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) zugegeben, gemischt und für

30 min auf Eis inkubiert. Es folgte eine Zentrifugation für 10 min bei 13.000 rpm und 4 °C.

Der Überstand wurde in ein frisches Eppendorftube überführt und 225 µl 5 M NH4Ac-Lösung

zugegeben, für 30 min auf Eis inkubiert und bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde

abgenommen, und zur Präzipitation der DNA wurden 500 µl isoPropanol gegeben. Nach einer

sofortigen Zentrifugation (5 min bei 13.000 rpm) wurde der Überstand verworfen, das Pellet

zweimal mit 70%igem Ethanol gewaschen und anschließend getrocknet. Die DNA wurde in

50 µl TE-Puffer aufgenommen.

Methode 2

Die Präparation der genomischen DNA erfolgte mit einem DNeasy Plant Kit der Firma

Qiagen laut Angaben des Herstellers.

Dazu wurden entsprechende Mengen frisch geernteter Wurzeln der Europäischen Eibe in

flüssigem Stickstoff schockgefroren und in einem Mörser zu feinem Pulver zerrieben. Die


24

weitere Aufarbeitung erfolgte analog der Anleitung des Kits.

Methode 3

Als 3. Methode zur DNA-Präparation wurde die Methode von Ziegenhagen und Mitarbeiter

modifiziert (Ziegenhagen et. al., 1993).

200 mg frisch geerntete Nadeln von T. baccata-Setzlingen wurden mit flüssigem Stickstoff

schockgefroren und in einem Mörser fein zermahlen. In 1 ml Extraktionsmedium wurde das

Homogenat vorsichtig aufgetaut und anschließend unter mehrmaligem Mixen für 20 min bei

65 °C inkubiert. Nach dem Abzentrifugieren (10.000 rpm für 10 min bei RT) wurde dem

Überstand 1/3 Vol. 5 M Natriumacetat pH 5,2 zugefügt und nach dem Vermischen 30 min auf

Eis inkubiert. Die Suspension wurde bei 10.000 rpm für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Zu dem

Überstand wurden 0,6 Vol isoPropanol zugegeben, vermischt und die DNA für 30 min bei

-20 °C die DNA gefällt. Nach abermaligem Zentrifugieren (10.000 rpm, 10 min, 4 °C) wurde

der Überstand verworfen und die DNA 10 min luftgetrocknet. Die DNA wurde in 200 µl 1x

TAE für 30 min bei RT gelöst und nach Zugabe von 2 µl RNase bei 37 °C für 1 h inkubiert.

Nach Zugabe von 200 µl Phenol wurde die Lösung ausgiebig gemischt, 10 min bei RT und

10.000 rpm zentrifugiert. Zu dem Überstand wurden je 100 µl Phenol und Chloroform

gegeben und nach Vermischen wieder zentrifugiert. Ein erneuter Extraktionsschritt erfolgte

mit 200 µl Chloroform. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt wurde der Überstand mit

300 mM Natriumacetat pH 5,2 eingestellt und die DNA mit 2,5 Vol EtOH durch Inkubation

bei –80 °C für 1 h gefällt. Anschließend wurde ein letztes Mal zentrifugiert (10.000 rpm,

10 min, 4 °C), die DNA für 10 min luftgetrocknet und das Pellet in 1x TAE aufgenommen.

Präparation von Gesamt-RNA aus Taxus baccata

Für die Präparation von Gesamt-RNA aus T. baccata wurde der RNeasy Plant Mini Kit der

Firma Qiagen verwendet. Dabei wurde beachtet, dass RNA durch ubiquitär vorkommende

RNasen sehr rasch abgebaut werden und somit einige zusätzlichen Maßnahmen erforderlich

waren. Dafür wurde nach Sambrook et al., 1989 und nach dem Manual der Firma Qiagen

verfahren.

Verwendet wurden frisch geerntete Nadeln von T. baccata-Setzlingen, die von Dr. Ewald,

Institut für Forstpflanzenzüchtung, Bundesforschungsanstalt für Forst- und Holzwirtschaft,

Waldsieversdorf, freundlicherweise zur Verfügung gestellt wurden. Diese wurden nach

Zugabe von flüssigem Stickstoff fein zermörsert. Die weitere Aufarbeitung erfolgte nach

Anleitung des Kits.


25

Isolierung von Plasmid-DNA

Plasmid-DNA in größerem Maßstab wurde über Midi-(50 ml Kulturvolumen) bzw. Maxi-

(150 ml Kulturvolumen) Säulen der Firma Qiagen laut Manual präpariert. Plasmid-DNA zum

Sequenzieren wurde aus 4 ml Kulturen mit Hilfe des „QIAprep-spin“-Kits nach Vorschrift der

Firma Qiagen gewonnen.

Zur schnellen Isolierung von Plasmid-DNA aus einer großen Anzahl von Klonen wurde das

Protokoll von Birnboim und Doly (1979) verwendet. Dazu wurden die E. coli-Einzelkolonien

in je 2 ml LBAmp (LBAmp/Kana) über Nacht bei 37 °C und 250 rpm angezogen. Die Zellen

wurden abzentrifugiert und in 100 µl Puffer1 durch vortexen resuspensiert. Nach 5 Minuten

Inkubation bei Raumtemperatur wurden 200 µl Puffer2 zugegeben, durch Umschwenken

vorsichtig durchmischt und fünf Minuten auf Eis gestellt. Nach Zugabe von 150 µl Puffer3

wurde weitere fünf Minuten auf Eis inkubiert, eine Minute abzentrifugiert und der Überstand

jeweils mit 400 µl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) extrahiert. Die wässrige

Phase wurde mit 800 µl Ethanol versetzt und fünf Minuten abzentrifugiert. Das DNA-Pellet

wurde mit 50 µl 70%-Ethanol gewaschen, getrocknet und anschließend in 50 µl 0,5 mM

EDTA aufgenommen.

Kompetente Zellen

E coli XL1-Blue

Kompetente Zellen wurden in Anlehnung an ein Protokoll von Hanahan et al. (1983)

präpariert. Dazu wurde eine Einzelkolonie des E. coli-Stammes XL1-Blue über Nacht in 2 ml

LB-Medium bei 37 °C und 250 rpm angezogen.

100 ml LB-Medium wurden mit 50 µl der Vorkultur angeimpft und bis zu einer optischen

Dichte von OD600 = 0,3 bei 37 °C und 250 rpm wachsen gelassen. Die Zellen wurden bei 4 °C

und 2.500 rpm 10 min abzentrifugiert und das Pellet dann in 50 ml 0,1 M CaCl2 (steril)

resuspensiert. Nach 20 min auf Eis wurde erneut 15 min bei 4 °C und 2.500 rpm

abzentrifugiert. Das entstandene Pellet wurde in 10 ml 0,1 M CaCl2 / 15% Glycerin

resuspensiert, in Aliquots von je 250 µl geteilt und sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren.

Die Zellen wurden bei -80 °C gelagert.


26

E. coli M15[pREP4]

Das Protokoll zur Präparation von kompetenten M15[pREP4]-Zellen wurde dem Handbuch

des QIAexpressionistTM -Kits entnommen. Eine Einzelkolonie der E. coli-Zellen wurde über

Nacht in 10 ml LBKana (25 µg/ml)-Medium bei 37 °C und 250 rpm angezogen. 100 ml

vorgewärmtes LBKana-Medium wurden mit 10 ml Übernachtkultur in einem 250 ml-Kolben

angeimpft und bis zu einer optischen Dichte von OD600= 0.5 bei 37 °C und 250 rpm wachsen

gelassen. Die Kultur wurde 5 min auf Eis gestellt und anschließend die Zellen 5 min bei 4 °C

und 2.500 rpm abzentrifugiert. Das Pellet wurde in 30 ml kaltem TBF1-Puffer resuspensiert

und die Kultur für weitere 90 min auf Eis gestellt. Nach einer weiteren Zentrifugation (5 min,

4 °C und 2.500 rpm) wurde das Pellet in 4 ml eiskaltem TFB2-Puffer aufgenommen, in

200 µl-Portionen aliquotiert und sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die

kompetenten Zellen wurden bei -80 °C gelagert.

Transformation von Plasmiden

Ligationsansätze und Plasmid-DNA wurden in Anlehnung an ein Protokoll der Firma Life

Technologies transformiert. Dazu wurden 100 µl kompetente Zellen zu 10 µl eines

Ligationsansatzes bzw. zu 1 µl Plasmid-DNA gegeben und mindestens 20 min auf Eis

inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz für 2 min auf 37 °C erwärmt, kurz auf Eis gestellt

und nach Zugabe von 500 µl LB-Medium nochmals 45-60 min bei 37 °C inkubiert. Pro LB-

Platte wurden 100 µl eines solchen Ansatzes mit einem Drigalski-Spatel ausplattiert und über

Nacht bei 37 °C angezogen. Sollten die Kolonien auf Blau-Weiß-Färbung selektiert werden

(ß-Galaktosidase-Aktivität durch α-Komplementation), wurden pro LB-Platte zusätzlich je

10 µl 1 M IPTG und 25 µl 4% X-Gal in DMF ausplattiert.

Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen

Nach Auftrennung der DNA durch Gelelektrophorese in einem Agarose-Gel wurde das

gewünschte Fragment mit Hilfe eines Skalpells ausgeschnitten. Die weitere Aufarbeitung

erfolgte mit einem Gel-Extraktions-Kit der Firma Qiagen laut Herstellerangaben.


27

PCR-Reaktion

Die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) ist eine routinemäßig angewendete Methode zur

Amplifizierung eines DNA-Abschnittes mit Hilfe einer hitzestabilen DNA-Polymerase. Die

drei Schritte der Reaktion sind die DNA-Denaturierung bei 94 °C, Bindung und

Hybridisierung eines Primer-Paares am 3’- und am 5’-Ende des zu amplifizierenden

Abschnittes bei einer niedrigen Temperatur und schließlich die Synthese der neuen DNA

durch die hitzestabile DNA-Polymerase bei 72°C. Diese Reaktionsfolge wird 20-30 mal

wiederholt, so dass der gewünschte DNA-Abschnitt in expotenziell steigender Menge

synthetisiert wird. Die optimalen Reaktionsbedingungen (Inkubationszeit und -temperatur,

Konzentration der einzelnen Komponenten) sind von der jeweili gen Primer-Template-

Kombination abhängig und müssen für jede Reaktion optimiert werden.

Es wurde zuerst zeitabhängige Denaturierungsversuche zur Thermostabili tät der T. baccata-

DNA durchgeführt. So wurde 1 µg DNA in 20 µl H2O für 15, 30, 45 und 60 Sekunden bei

92 °C und 94 °C inkubiert.

Zur Amplifizierung des gesamten Cyclase-Gens wurde folgendes Programm verwendet:

94 °C, 25 s; 49 °C, 4,5 min; 72 °C, 2 min für 5 Zyklen

94 °C, 35 s; 49 °C, 4,5 min, 72 °C, 2 min für 25 Zyklen und

72 °C, 10 min für die Extension.

Für eine Reaktion wurden folgende Mengen eingesetzt:

500 ng Template-DNA; je 140 pmol Primer (TBC1A und TBC2A); 1 µl 10 mM dNTP-Mix

(Life Technologies); 10 µl PCR-Mix (Life Technologies); 100 µmol MgCl2; 2 µl DMSO;

5 units Taq-DNA-Polymerase, mit H2O auf 100 µl auffüllen.

Zur Amplifizierung eines 800 bp großen Fragments der Taxadien-Synthase (AS 754-770)

wurde eine anderes Programm gewählt:

94 °C, 25 s (initial hot start); 92 °C, 20 s; 48 °C, 1 min; 72 °C, 30 s für 10 Zyklen,

94 °C, 45 s; 48 °C, 1 min; 72 °C, 30 s für 20 Zyklen und

72 °C, 10 min für die Extinktion.


28

Folgende Mengen wurden für eine Reaktion eingesetzt:

300 ng Template-DNA, je 80 pmol Primer (TBC3 und TBC4); 1 µl 10 mM dNTP-Mix (Life

Technologies), 10 µl PCR-Mix (Life Technologies), 150 µM MgCl2, 5 units Taq-DNA-

Polymerase, mit H2O auf 100 µl auffüllen.

Zur Überprüfung der PCR-Reaktionen wurden 10 µl des Reaktionsansatzes nach der Reaktion

entnommen und auf einem Agarose-Gel aufgetrennt. Zur Isolierung des gewünschten

Produktes wurde der gesamte Ansatz auf ein Agarose-Gel aufgetragen, aufgetrennt und die

Bande mit der erwarteten Größe wurde aus dem Gel ausgeschnitten und eluiert. Das Produkt

konnte dann kloniert werden.

Southern Blot

Zur Analyse des T. baccata Genoms auf Vorhandensein eines Gens, das die Taxadien-

Synthase codiert, wurden 10 µg chromosomaler DNA mit den Restriktionsenzymen BamHI

und HincII geschnitten und darauf hin über ein 0,8%iges Agarose-Gel in 1x TAE-Puffer bei

20 V über Nacht aufgetrennt. Die aufgetrennte DNA wurde mittels Kapill ar-Transfer in 20x

SSC auf Nylonmembran (Hybond-N, Amersham, Braunschweig) geblottet und anschließend

mittels UV-Licht auf der Membran fixiert.

Das 800 bp-Fragment aus dem Plasmid TBCyc800SK wurde mit α-[32P]-dCTP und α-[32P]-

dATP auf eine spezifische Aktivität von durchschnittlich 1x109 cpm / 25 ng DNA gelabelt

(Random Primer DNA Labelli ng System, Life Technologies). Die Hybridisierung wurde in 5x

SSPE, 5x Denhardt’s Lösung und 0,1% SDS bei 65 °C über Nacht durchgeführt. Die Blots

wurden mit steigender Stringenz (2x 10 min Waschpuffer 1 bei RT, 1x 15 min Waschpuffer 2

bei 65 °C, 2x 10 min Waschpuffer 3 bei 65 °C) gewaschen und anschließend die Signale

mittels Autoradiographie detektiert.

RT-PCR

Für die Amplifizierung der cDNA der Taxadien-Synthase wurde die Zwei-Schritt-RT-PCR-

Strategie angewandt. Im Gegensatz zur Ein-Schritt-Strategie werden die Synthese des ersten

Stranges und die Primer-spezifische cDNA-Synthese nacheinander in zwei verschiedenen

Ansätzen durchgeführt. Diese Methode hat sich bei sehr großen DNA-Abschnitten bewährt.

Zur Synthese des cDNA-Klons der Taxadien-Synthase wurde ein Enhanced Avian RT-PCR

Kit der Firma Sigma verwendet und nach dessen Anleitung vorgegangen:


29

Schritt 1: 0,1 µg Gesamt-RNA

je 500 µM dNTP

3,5 µM Oligo(dT)23

mit H20 auf 16,5 µl auffüllen.

Der Ansatz wurde vermischt, kurz zentrifugiert und für 10 min bei 70 °C inkubiert.

Anschließend wurde der Ansatz auf Eis gestellt und 2 µl 10x Puffer, 0,5 U RNase-Inhibitor

und 1 U Reverse Transkriptase zugegeben. Eine Vorinkubation erfolgte bei 25 °C für 15 min,

im Anschluss daran wurde der Ansatz 50 min bei 42 °C inkubiert.

Schritt 2: 1x AccuTaq Puffer

je 200 µM dNTPs

1 µl cDNA-Synthese Ansatz

je 100 pM Primer TBC1B und TBC2B

0,05 U AccuTaq LA DNA Polymerase Mix

mit H2O auf 50 µl auffüllen.

Folgendes Programm zeigte bestmögliche Ausbeute: 94 °C 3 min (initial hot start); 94 °C

45 s; 54 °C, 1 min; 72 °C, 3 min für 40 Zyklen und 10 min, 72°C.

10 µl des Reaktionsansatzes wurden zur Kontrolle über ein Agarose-Gel aufgetrennt. Zur

Isolierung des gewünschten Produktes wurde der gesamte Ansatz über ein Gel aufgetrennt,

ausgeschnitten, eluiert und kloniert.

Expression von rekombinanten Proteinen

Sowohl für die Expression als auch für die anschließende Aufreinigung des exprimierten

Proteins wurde nach Anleitung des Kits QiaExpressionistâ der Firma Qiagen verfahren. Eine

M15[pREP4]-Einzelkolonie, die das gewünschte Plasmid trug, wurde für eine Vorkultur in

10 ml LBAmp/Kana bei 37 °C über Nacht angezogen. 500 ml LBAmp/Kana wurden mit 10 ml

Vorkultur angeimpft und 2 h bei 37 °C und 250 rpm wachsen gelassen. Anschließend wurde

mit 1 mM IPTG induziert und für ca. 20 h bei 16 °C und 250 rpm inkubiert. Die Zellen

wurden je nach Verwendung nach dem Zentrifugieren (GSA-Rotor, 30 min bei 4.000 rpm)

entweder gleich weiter verarbeitet oder bei -20 °C tiefgefroren.


30

Northern Blot-Analyse der Expression

Zur Überprüfung, ob das gesuchte Protein in ausreichendem Maße unter den oben

angegebenen Bedingungen exprimiert wurde, war es wichtig, die Expression auf

Vorhandensein von mRNA für die Taxadien-Synthase zu untersuchen. Dazu wurde als erstes

eine Wachstumskurve der exprimierten Zellen erstellt und die geeignete Verdünnung

bestimmt.

109 Zellen der Expressionskultur wurden durch Zentrifugation (8000 rpm für 5 min) bei 4 °C

in der log-Phase geerntet. Zur Präparation von Bakterien-RNA wurde der RNeasy Mini Kit

der Firma Qiagen verwendet und nach Protokoll verfahren. Dabei wurde beachtet, dass RNA

durch ubiquitär vorkommende RNasen sehr rasch abgebaut wird und somit einige

zusätzlichen Maßnahmen erforderlich waren. Dafür wurde nach Sambrook et al, 1989 und

nach dem Manual der Firma Qiagen verfahren.

Für den Blot wurde die RNA auf einem 1,2%igen Formaldehyd/Agarose-Gel (130 ml)

aufgetrennt. Dazu wurde zu 4 Vol. RNA 1 Vol. 5x RNA loading buffer gegeben, 5 min bei

65 °C inkubiert, auf Eis gestellt und anschließend auf das mit 1x FA-Laufpuffer für 30 min

equili brierte Gel aufgetragen. Das Gel wurde mit 5-7 V pro cm Laufstrecke in 1x

FA-Laufpuffer laufen gelassen, zur Hydrolysierung der OH-Gruppen für 30 min in 0,05 N

NaOH equili briert und anschließend mit RNase-freiem Wasser 3x 20 min gewaschen.

Die RNA wurde über Nacht auf eine Nylonmembran (Hybond-N, Amersham, Braunschweig)

in 20x SSC mittels Kapill ar-Transfer geblottet und durch UV-Licht auf der Membran fixiert.

Das 800 bp-Fragment aus dem Plasmid TBCyc800SK wurde mit α-[32P]-dCTP und α-[32P]-

dATP auf eine spezifische Aktivität von durchschnittlich 1x109 cpm / 25 ng DNA gelabelt

(Random Primer DNA Labelli ng System, Life Technologies). Die Hybridisierung wurde in 5x

SSPE, 5x Denhardt’s Lösung und 0,1% SDS bei 65 °C über Nacht durchgeführt. Die Blots

wurden mit steigender Stringenz (2x 10 min Waschpuffer 1 bei RT, 1x 15 min Waschpuffer 2

bei 65 °C, 2x 10 min Waschpuffer 3 bei 65 °C) gewaschen und anschließend die Signale

mittels Autoradiographie detektiert.

Aff initätsreinigung an Nickel-Agarose

Durch die Klonierung der Taxadien-Synthase in den pQE31-Vektor von Qiagen trägt das

rekombinante Protein eine 6xHis-Sequenz am N-Terminus. Die Affinität der 6xHis-Sequenz

zu Ni2+-Ionen wurde zur Aufreinigung des exprimierten Proteins an Ni-Agarose genutzt. Es

wurde ein QIAexpressionistÒ -Kit der Firma Qiagen verwendet. Nach der Expression der


31

Taxadien-Synthase wurden die Zellen bei -20 °C tiefgefroren und am nächsten Tag in

flüssigem Stickstoff zermörsert. Da das gesuchte Protein sich in der löslichen Phase befand,

wurde in nicht-denaturierenden Medien gearbeitet. Das Homogenat wurde in 4 ml

Aufschlusspuffer pro Gramm Zellen aufgenommen und nach Zugabe von 1 µg/ml DNaseI 1 h

auf Eis gerührt. Nach 30 minütiger Zentrifugation bei 10.000 rpm in einem SS34-Rotor wurde

der Überstand mit 1 ml Ni-NTA-Agarose-Suspension je 4 ml Proteinlösung versetzt und 2 h

bei 4 °C vorsichtig geschüttelt. Anschließend wurde die Suspension in eine Säule (∅ 1 cm,

l=5 cm) mit Fritte gegeben, der Durchlauf aufgefangen und mit 2x 4 ml Waschpuffer

gewaschen. Das Protein wurde mit 4x 0,5 ml Elutionspuffer eluiert.

Bestimmung der Proteinkonzentration

Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte nach der Methode von Bradford (1976).

10 µl der zu bestimmenden Probe wurden mit 100 µl Bradford-Reagenz in einer

Mikrotiterplatte pipettiert und die Absorption bei 570 nm gemessen. Durch Vergleich mit

Standardproteinmengen (BSA) erfolgte die Bestimmung der Konzentration.

Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Die Durchführung der Polyacrylamid-Gelelektrophorese erfolgte nach der Methode von

Laemmli (1970). Es wurden 10% Gele verwendet. Als Marker diente zum einen ein Low

Molecular Weight Marker (Dalton Mark VII -L), der sich aus den Proteinen BSA (66 kDa),

Ovalbumin (45 kDa), Glycerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase (36 kDa), Carbanhydrase

(29 kDa), Trypsinogen (24 kDa), Trypsininhibitor (20,1 kDa) und α-Lactalbumin (14,2 kDa)

zusammensetzte und zum anderen ein High Molekular Weight Marker (Dalton Mark V), der

folgende Zusammensetzung hatte: Myosin (205 kDa), ß-Galaktosidase (116 kDa),

Phosphorylase G (97 kDa), Eialbumin (45 kDa) und Carbanhydrase (29 kDa). Die Gele liefen

im Elektrophoresepuffer, die Färbung erfolgte mit Coomassie Brilli ant Blue - Lösung


32

Immunologische Detektion der Taxadien-Synthase (Western Blot)

Es wurden folgende Antikörper für die Detektierung der Taxadien-Synthase verwendet:

A) polyklonaler Antikörper gegen Taxadien-Synthase aus T. baccata

Mit Hilfe des Programms RASMOL wurde an Hand der Aminosäuresequenz eine 3D-

Struktur modelli ert und außenliegende Bereiche postuliert. Das Peptid mit der Sequenz 754RLTNDTKTYQAEKARGQ770 wurde dann von der Firma BioTeZ Berlin-Buch GmbH

synthetisiert, über die Carboxylgruppe an KLH (Hämocyanin der Schlüsselloch-

Napfschnecke) gekoppelt und zur Immunisierung eines Kaninchens eingesetzt.

B) Penta•His Antibody, BSA-frei der Firma Qiagen, Hilden.

Für die Immundetektion mit Antikörpern gegen die Taxadien-Synthase wurde eine

Proteinfraktion nach der Ni-NTA-Agaroseaufreinigung über ein 10%iges Acrylamidgel

aufgetrennt und über Nacht auf eine Nitrocellulosemembran (BA85, Schleicher&Schuell) im

Tankverfahren mit Blotpuffer A (I=20 mA) geblottet. Der erfolgreiche Transfer wurde mittels

Ponceau S-Färbung kontrolli ert. Die Membran wurde für 30 min in TBS/3% BSA abgesättigt

und anschließend 3x 20 min mit TBS/Tween gewaschen. Die Inkubation mit dem ersten

Antikörper (gegen Taxadien-Synthase) erfolgte für 1 h mit einer 1:1000 Verdünnung in

TBS/3% BSA bei 37 °C. Danach wurde 3x 20 min mit TBS/Tween gewaschen und eine

weitere Stunde die Membran mit dem anti-rabbit-Antikörper (konjugiert mit alkalischer

Phosphatase, Sigma, 1:10.000 Verdünnung) bei 37 °C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen

á 20 min mit TBS/Tween wurden mit BCIP/NBT (Sigma) in 10 ml H2O die immunreaktiven

Proteine angefärbt.

Zur Kontrolle der erfolgreichen Klonierung der Taxadien-Synthase wurde auch eine

Immunreaktion auf die 6xHis-Sequenz durchgeführt. Dazu wurde ein Penta•His-Antikörper

der Firma Qiagen verwendet. Eine Enzymfraktion der Ni-NTA-Agarose-Aufreinigung wurde

über ein 10%-Mini-Gel aufgetrennt. Der Western Blot erfolgte in einer Fastblotapparatur für

1 h in dem Blotpuffer B. Die weitere Behandlung des Blots erfolgte nach der Anleitung der

Firma Qiagen.


33

N-terminale Aminosäuresequenzierung der exprimierten Taxadien-Synthase

Für die N-terminale Aminosäuresequenzierung wurde eine Taxadien-Synthase-haltige

Fraktion der Ni-Agarose-Aufreinigung auf einem 10 %igen Acrylamidgel aufgetrennt und

über Nacht auf eine, zuvor mit Methanol equili brierte, PVDF-Membran (Schleicher&Schuell)

geblottet. Der Blot erfolgte in einer Tankapparatur in dem Blotpuffer A über Nacht bei 4 °C

und 20 mA. Der Transfer der Proteine wurde mittels Ponceau S–Färbung kontrolli ert. Die

entsprechenden Proteinbanden wurden ausgeschnitten und sequenziert.

Enzym-Assay

1 g frische Zellen der Übernachtexpression (18 h) wurden in flüssigem Stickstoff tiefgefroren

und fein zermörsert. Das Homogenat wurde in 4 ml Assay-Puffer resuspensiert und nach

Zugabe von 1 µg/ml DNaseI 1 h auf Eis gerührt. Die Suspension wurde bei 10.000 rpm in

einem SS34-Rotor für 30 min bei 4 °C zentrifugiert. 2,5 ml des Überstandes wurden über eine

mit 20 ml Assay-Puffer equili brierte PD10-Säule gegeben, um die Probe zu entsalzen. Die

Proteinfraktion wurde mit 3,5 ml Assay-Puffer eluiert und ca. 500 µl für den Enzymtest

eingesetzt:

490 µl entsalzte Probe

4 µl Geranylgeranylpyrophosphat (1 mg/ml in Methanol, Sigma)

1µl 3H-Geranylgeranylpyrophosphat (10-30 Ci/mmol; NEN Life Science)

5 µl 100 mM MgCl2

Nach dem Vortexen der Lösungen wurde bei 32 °C für 1 h inkubiert und anschließend mit 2x

1 ml Hexan extrahiert. Die Hexanphasen wurden vereinigt, über eine mit Kieselgel 60 gefüllte

Pasteurpipette gegeben und nach Zugabe von 4 ml Szintill ationsflüssigkeit die Radioaktivität

bestimmt. Als Negativprobe wurde statt der exprimierten Taxadien-Synthase die

Proteinfraktion des E. coli-Stamms mit dem Plasmid ohne Insert verwendet.

Für die GC-MS-Messung wurde der Test mit nicht radioaktiv markiertes

Geranylgeranylpyrophosphat durchgeführt. Nach der Kieselgelsäule wurde die Probe im

Stickstoffstrom auf 200 µl eingeengt und 1 µl davon für die GC-MS-Messung eingesetzt.


34

GC-MS-Messung

Gaschromatograph: HP6890, Hewlett Packard

Säule: HP-S MS, 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm

Injektion: 1 µl splitlos

Trägergas: Helium

Injektortemp: 200°C

Säulenvordruck: 180 kPa

Temp.-Programm: 40°C, 3 min – 20°C/min – 320°C, 3 min

Massenspektrometer: MSD 5973, Hewlett Packard

Temp. der Transferleitung: 280°C

Temp. der Quelle: 230°C

Ionisierungstechnik: EI, 70eV

Aufnahmemodus: TIC/SCAN

Flow: 1,5 ml/min

Anlegen einer λλ-Genbank von Taxus baccata

Für eine λ-Genbank wird mit Restriktionsenzymen verdaute genomische DNA definierter

Größe (9-23 kb) statt des durch Restriktionsverdau entfernten Mittelstücks mit den

verbleibenden beiden Armen der λ-Phagen-DNA ligiert. Die beiden λ-Phagen-Arme besitzen

zusammen nur 72% der normalen Größe des Genoms, und diese ist zu gering für eine

Verpackung in einen λ-Partikel. Durch die Ligation mit der Fremd-DNA wird nun eine

ausreichende Größe erreicht, und diese kann in einen λ-Phagen verpackt werden. Man erhält

eine statistische Verteilung des Genoms des Fremdorganismus, das in der λ-Genbank

verpackt ist (Stryer, 1988; Kaiser und Murray, 1985).

Es wurde nach den Anleitungen des Lambda DASH II â /BamHI Vector Kits und des

Gigapackâ III XL Packaging Extract gearbeitet. Dazu wurde als erstes ein Testverdau von

T. baccata-DNA mit dem Restriktionsenzym Sau3AI durchgeführt, um die optimalen

Bedingungen für einen Hauptverdau zu bestimmen. Dieser wurde durch ein 0,3% Agarose-

Gel kontrolli ert. Durch verschiedene Zeit- und Konzentrationsreihen wurde folgender Ansatz

als bestmöglichster Restriktionsverdau ermittelt:

1 µg DNA

100 µl Reakt 4 (Life Technologies)

698 µl 10 mM Tris-HCl pH 8.0


35

1,8 U Sau3AI (Life Technologies)

Der Ansatz wurde 1 h bei 37 °C inkubiert und anschließend 15 min bei 70 °C inaktiviert. Der

Verdau wurde durch ein 0,3%iges Agarose-Gel kontrolli ert. Die restriktionsgeschnittene

DNA wurde durch Ethanolfällung konzentriert und einer Gradientenzentrifugation

unterzogen. Dazu wurde die Probe auf einen 25-5%igen NaCl-Gradienten in 3 mM EDTA

pH 8.0 (Polycarbonat-Röhrchen, Beckmann, Ultra-Clear) aufgetragen und 5 h bei 35.000 rpm

(SW41-Rotor) zentrifugiert. Das Zentrifugenröhrchen wurde am Boden mit einer Kanüle

vorsichtig eingestochen und der Inhalt durch Aliquotieren (je 300 µl) aufgefangen. Die

Aliquots wurden mit Bidest 1:1 verdünnt und über ein 0,3%iges Agarose-Gel kontrolli ert. Die

Fraktionen, die die geeigneten Größen der DNA aufwiesen (10-20 kb), wurden vereinigt, mit

EtOH gefällt, gründlich mit 70%igem EtOH gewaschen, getrocknet und in 5 µl 10 mM Tris

pH 8,0 aufgenommen. Bei 4 °C über Nacht wurde mit folgenden Ansätzen die Ligation der

Insert-DNA mit den Phagen-Armen durchgeführt:

A) 1 µl λ DASH II x BamHI B) 1 µl λ DASH II x BamHI

1 µl Insert-DNA 1,5 µl Insert-DNA

0,5 µl 10x Puffer 0,5 µl 10x Puffer

0,5 µl rATP 0,5 µl rATP

0,5 µl Ligase (2 U) 0,5 µl Ligase (2 U)

2,5 µl H20 2,5 µl H20

Das Verpacken des Konstrukts in die Phagenhülle wurde mit dem Gigapackâ III XL

Packaging Extract durchgeführt, welcher eine hohe Verpackungsrate für sehr große Inserts

(≥14 kb) aufweist.

Dazu wurden je 2 µl der Ligationsansätze mit einem Aliquot des Verpackungsextrakts gut

vermischt, die Ansätze kurz zentrifugiert und 2 h bei RT inkubiert. Anschließend wurden

500 µl SM-Puffer und 20 µl Chloroform zugegeben und gevortext. Nach einer weiteren

kurzen Zentrifugation wurde der Überstand in ein frisches Eppendorftubes überführt und die

Genbank bei 4 °C gelagert.


36

Präparieren der Host-Bakterien

E. coli P2392-Zellen wurde nach Anleitung des Herstellers Stratagene präpariert. Eine

Impföse mit dem Glycerinstock wurde auf LB-Medium ausplatiert und über Nacht bei 37 °C

inkubiert. Eine Einzelzelle wurde in LB-Medium mit 10 mM MgSO4 und 2% Maltose 4-6 h

bei 37 °C und 250 rpm bis zu einer optischen Dichte von OD600 = 1,0 wachsen gelassen. Die

Zellen wurde bei 4 °C und 2000 rpm für 10 min pelletiert. Die Zellen wurden mit steriler

10 mM MgSO4-Lösung aufgenommen und eine OD600 = 0,5 eingestellt.

Bestimmen des Titers der Genbank

Für das Screenen der Genbank ist es erforderlich, dass die Agar-Platten mit ausreichend hoher

Anzahl von Plaques (lysierte Bakterienzellen = Zellen, in die eine Phage ihr Genom

geschleust und nach Vervielfältigen dieser zerstört werden) bedeckt sind. Die Anzahl sollte

jedoch nicht zu hoch sein, um ein Überdecken verschienener λ-Klon-DNA zu vermeiden.

Deshalb ist es wichtig, vorher den Titer der Genbank zu bestimmen.

Verschiedene Verdünnungen der Genbank in SM-Puffer wurden mit den vorbereiteten Host-

Bakterien (OD600=0,5 in 10 mM MgSO4) für 15 min bei 37 °C inkubiert. Die Phagen haben so

Zeit, an den Zellen zu haften. Nach Zugabe von 3 ml 48 °C warmen Top-Agar wurde diese

Lösung sofort auf vorgewärmten LB-Platten ausplattiert, kurz antrocknen gelassen und über

Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Plaques wurden ausgezählt und auf Plaque-formende

Einheiten pro Millili ter (pfu/ml) hochgerechnet.

Screenen der Genbank

Zum Screenen der Genbank nach einem λ-Klon, der ein Teil oder das gesamte Gen der

Taxadien-Synthase trägt, wurde ein Abklatsch der lysierten Bakterienkulturen auf eine

Membran gezogen und diese, nach Fixieren der Nucleinsäuren, mittels einer radioaktiv

markierten Sonde, die ein Teil der Sequenz der Taxadien-Synthase trägt, hybridisiert.

λ-Klone, die DNA der Taxadien-Synthase enthalten, geben so ein radioaktiv markiertes

Signal, das mit Hilfe eines Röntgenfilms detektiert werden kann. Positive Klone wurden

anschließend aus der Agar-Platte ausgestochen, angezogen und eine weiteres Mal gescreent.

Diese Prozedur wurde so lange wiederholt, bis die Probe sauber war, das heißt, dass jedem

Plaque ein positives Signal zugeordnet werden konnte. Nach folgendem Protokoll wurde

verfahren:


37

200 µl der Genbank wurden mit 600 µl zuvor angezogener Hostbakterien (P2392, OD600=0,5)

15 min bei 37°C inkubiert, mit 6,5 µl Top-Agar vermischt und auf einer Petrischale

(∅ 135 mm) ausplattiert. Nach dem Trocknen wurde diese dann über Nacht bei 37°C

inkubiert. Auf die lysierte Bakterienkultur wurde eine Nitrocellulosemembran gelegt (BA 85,

Schleicher&Schuell, 0,45 µm, ∅ 132 mm), diese mit einer in Tinte getauchte Kanüle zur

Markierung an verschiedenen Seiten durchstochen und nach 2 min vorsichtig abgezogen. Die

Petrischalen wurden mit Parafilm verschlossen und bei 4°C gelagert. Die Membran wurde

in folgender Reihenfolge gewaschen: 2 min in Denaturierungspuffer, 5 min in

Neutralisierungspuffer und 30 s in 0,2 M Tris-HCl pH 7,5, 2x SSC. Nach dem Trocknen der

Membran wurde durch 2-minütige UV-Bestrahlung die Nucleinsäuren auf dieser fixiert.

Als Sonde diente das 800 bp große Insert aus dem Plasmid TBCyc800SK, dass mit α-[32P]-

dCTP und α-[32P]-dATP auf eine spezifische Aktivität von durchschnittlich 1x109 cpm / 25

ng DNA gelabelt wurde (Random Primer DNA Labelli ng System, Life Technologies). Die

Hybridisierung wurde in 5x SSPE, 5x Denhardt’s Lösung und 0,1% (w/v) SDS bei 65 °C über

Nacht durchgeführt. Die Blots wurden mit niedriger Stringenz (2x 10 min Waschpuffer 1 bei

RT und 1x 10 min Waschpuffer 2 bei 50 °C) gewaschen und anschließend die Signale mittels

Autoradiographie detektiert. Diese wurden mit den Kulturplatten verglichen und potentielle

Plaques mit sterilen Pasteurpipetten ausgestochen. Die Agarstücke wurden in 500 µl

SM-Puffer equili briert und diese Lösung wurde für ein weiteres Screening eingesetzt.

Ergebnisse

38

Ergebnisse

Präparation von DNA aus Taxus baccata Für die Isolierung der DNA aus Taxus baccata standen verschiedene Methoden zur Auswahl.

Es war vor allem für die PCR und Präparation der Genbank wichtig, dass die DNA völli g

intakt war und auch keinerlei Verunreinigung mehr aufwies. Koniferen-Arten enthalten unter

anderem sehr viele Harze und Polysaccharide, vor allem in den Nadeln, die sehr schwer

abzutrennen sind. Deshalb wurden als Ausgangsmaterial für die DNA-Präparation Wurzeln

von T. baccata-Setzlingen gewählt.

Verschiedene Methoden wurden ausprobiert, doch nur durch eine konnte ein

zufriedenstellender Reinigungsgrad erreicht werden (siehe Tabelle 1). Die Präparation der

DNA mit dem DNeasy Plant Maxi/Mini Kit (Qiagen) lieferte hochreine DNA ohne

Degradationsanzeichen, die sich sehr gut mit Restriktionsenzymen schneiden ließ. Leider war

die Ausbeute sehr gering (20 µg DNA/ 1 g Wurzeln).

Die DNA-Präparationsmethode nach E. M. Möller und Mitarbeiter, bei der vor allem durch

die CTAB-Fällung die Polysaccharide abgetrennt werden, erwies sich als nicht geeignet

(Möller et al., 1992). Die durch diese Methode präparierte DNA wies eine bräunliche

Verfärbung auf und ließ sich nur schwer von verschiedenen Restriktionsenzymen schneiden.

Die dritte Methode, nach der Anleitung von Ziegenhagen und Mitarbeiter, war ungeeignet für

die Isolierung von genomischer DNA aus T. baccata, da diese nach der Präparation eine

ziemliche Degradierung aufwies (Ziegenhagen et al., 1993).

Deshalb wurde sowohl für die PCR und die Southern Blot-Analyse als auch für das Anlegen

der Genbank die DNA aus T. baccata mit Hilfe des DNeasy Plant Kits isoliert, auch wenn die

Ausbeute nicht zufriedenstellend war.

Möller et al. DNeasy Plant K it Ziegenhagen et al.

Ausbeute µg DNA/1 g Wurzeln

60 µg 20 µg 30 µg

visuelle Beschaffenheit der DNA

Bräunliche Verfärbung der DNA

in Ordnung Degration der DNA nach Auftrennung

über ein Agarose-Gel

Restriktionsverdau mit BamHI und HincII

ließ sich nicht von BamHI und HincII

schneiden

DNA ließ sich gut schneiden

Restriktionsverdau nicht durchgeführt

Tabelle 1: Vergleich verschiedener Methoden zur DNA-Präparation aus T. baccata

Ergebnisse

39

Amplifizierung des Taxadien-Synthase-Gens Als Grundlage für die Auswahl der Primer für die Amplifizierung eines genomischen Klones

der Taxadien-Synthase aus T. baccata wurde die Sequenz der cDNA der Taxadien-Synthase

aus T. brevifolia gewählt (Wildung und Croteau, 1996). Der Primer für den N-terminalen

Bereich begann mit dem Startcodon ATG und enthielt weitere 12 Basen, die den

Sequenzanfang der Taxadien-Synthase aus T. brevifolia repräsentieren. Der C-terminale

Primer repräsentiert die 21 Basen des Endes des cDNA-Klons, einschließlich des Stopcodons

TGA. Für die Wahl des Temperaturprogramms war die geringe Thermostabili tät der

T. baccata-DNA zu berücksichtigen. Vorversuche zeigten, dass die DNA aus T. baccata bei

längerer Inkubation (> 30 s) bei 94 °C degradiert wurde (Daten nicht gezeigt, siehe auch

Materialien und Methoden S. 26). Deshalb wurde für die ersten fünf Cyclen eine kürzere

Denaturierungszeit als für die restlichen 25 Cyclen gewählt (siehe Materialien und Methode

S. 26).

Der Reaktionsansatz wurde über ein 0,8%iges Agarose-Gel aufgetrennt, die PCR-Produkte

ausgeschnitten und aus dem Gel eluiert. Die amplifizierten DNA-Fragmente wurden in einen

T-Vektor (pCR®2.1-TOPO, Clontech) kloniert. Die Transformation der Ligationsansätze

erfolgte in E. coli XL1-Blue und die positiven Klone wurden über eine Blau-Weiß-Selektion

bestimmt.

Struktur des Taxa-4(5),11(12)-dien-Synthase-Gens aus T. baccata Die Sequenzierung beider Stränge von vier Klonen des Taxadien-Synthase-Gens aus

T. baccata, pTBCyc4.0 (Klon 1-4), die alle identisch waren, ergab für das Taxa-4(5),11(12)-

dien-Synthase-Gen aus T. baccata einen ORF von 3980 bp. Durch Vergleiche mit der cDNA

der Taxadien-Synthase aus T. brevifolia und Exon/Intron-Schranken konnte der codierende

Bereich des Gens, bestehend aus 13 Exons und 12 Introns, mit einer Gesamtgröße von

1437 bp, bestimmt werden Abb. 5. Alle Intronbereiche beginnen und enden mit den für das

Spleißen wichtigen Sequenzen GT/AG, wie sie von Häger und Mitarbeiter auch für Pflanzen

beschrieben wurden (Häger et al., 1996). Das konservierte Motiv DDXXD, das für alle

Isoprensynthasen beschrieben ist, befindet sich zwischen Intron IX und X.

Aus dem ORF von 3980 bp lässt sich für das Taxadien-Synthase-Protein eine Größe von

98 kDa vorhersagen.

Ergebnisse

40

Vergleich der Intronbereiche verschiedener Isoprensynthasen In der Literatur ist für einige Isoprensynthasen die Gen-Struktur beschrieben worden. Ein

Vergleich der Lage der Intronbereiche dieser Isoprensynthasen mit der Taxadien-Synthase aus

T. baccata ist in Abb. 6 gezeigt. Die Lage der Introns ist durch vertikale Striche verdeutlicht.

Als Bezugspunkt wurde das Motiv DDXXD gewählt. Für den Vergleich wurden die

5-epi-Aristolochen-Synthase aus Capsicum annuum und Nicotiana tabacum, die Limonen-

Synthase aus Perilla frutescens und die Casben-Synthase aus Ricinus communis ausgewählt.

Alle vier Synthasen katalysieren eine Cyclisierung von Isoprenen. Im Gegensatz dazu ist

Linalool-Synthase aus Clarkia concinna keine Cyclase, sie katalysiert die Hydroxylierung

von Geranyldiphosphat und die Umlagerung einer Doppelbindung (Jia, J.-W. et al., 1999).

Wie aus der Abbildung ersichtlich ist, lässt sich die Struktur der Taxadien-Synthase aus

T. baccata mit den verschiedenen Terpensynthasen vergleichen. Im C-terminalem Bereich

sind hohe Homologien zwischen den Synthasen zu finden. Die Lage der Introns und die

Größe der vier letzten Exons stimmen gut überein. Das Exon 12 der Linalool-Synthase ist

geringfügig größer als die entsprechenden Exons der anderen Synthasen, aber auch die Lage

der vier Intronbereiche ist identisch. Die Größe der Exons und die Lage der Introns im

N-terminalen Bereich sind nicht in diesem Maße konserviert. Interessanterweise sind sich im

mittleren Bereich (Exon 3-9 der Taxadien-Synthase) die Taxadien-Synthase aus T. baccata

und die Linalool-Synthase aus Clarkia concinna, obwohl keine Isoprencyclase, wesentlich

ähnlicher als die anderen Cyclasen. Nur die N-terminalen Bereiche aller Isoprensynthasen

sind völli g verschieden. Die Gen-Struktur der Taxa-4(5),11(12)-dien-Synthase, dass heißt, die

Lage der Intronbereiche und Größe der Exons ist der der Linalool-Synthase ähnlicher als der

der anderen Isoprensynthasen.

32488

313190

nt

17887

21598 83

113112130

215181

113110

99106

210100

139118

249100

300

0 3980

I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII

34242588

TBCyc800

Intron

DDXXD

Abbildung 5: Struktur des Taxa-4(5),11(12)-dien-Synthase-Gens aus Taxus baccata. Die Zahlen in den Kästchen geben die Anzahl der Nucleotide für das jeweili ge Exon an, die Introns sind mit römischen Ziffern markiert. TBCyc800 wurde als Sonde für Southern Blots mittels PCR ampli fiziert und umfasst die Intronbereiche IX – XI und die Exonbereiche 9-11.

Ergebnisse

41

Southern Blot-Analyse des T. baccata-Genoms Für die Southern Blot-Analyse des T. baccata-Genoms auf das eventuelle Vorhandensein

mehrerer Kopien des für die Taxadien-Synthase codierenden Gens, wurde genomische DNA

mittels der Restriktionsenzyme BamHI und HincII fraktioniert, über ein Agarose-Gel

aufgetrennt, auf eine Membran geblottet und mit einer radioaktiv markierter Sonde

hybridisiert. Es wurde mit höchster Stringenz gewaschen (2x 10 min Waschpuffer 3 bei

65 °C). Die Sonde wurde mittels PCR-Reaktion amplifiziert und repräsentiert eine 800 bp

große Sequenz (Position 2588-3424) aus T. baccata (TBCyc800), die den für Terpencyclasen

konservierten Bereich mit dem DDXXD-Motiv und die Introns IX, X und XI enthält Abb. 5.

Die Primer wurden in Anlehnung der Taxadien-Synthase-Sequenz aus T. baccata ausgewählt,

für die PCR-Reaktion siehe Materialien und Methoden. Das Autoradiogramm (Abb. 7) zeigt

Signale für Fragmente in der Größe von 4,4 kb (BamHI-Verdau) und 2,7 kb für den HincII -

Verdau. Die Fragmente für den HincII -Verdau korrelieren mit den Schnittstellen für dieses

Enzym in der Taxadien-Synthase aus Taxus baccata. Ein 200 bp großes Fragment ist bei der

42 78 126 72 47 82 97

153 88 125 73 46 82 98

84 87 132 73 46 83 98

86 91 126 73 46 83 96

DDXXD

10083477033387238407259104108

Ricinus communis Casbene synthase

Taxadiene synthaseTaxus baccata

Nicotiana tabacum L046805-epi-aristolochene synthase

5-epi-aristolochene synthaseCapsicum annuum AJ005588

Perilla frutescens AB005744Limonene synthase

*

17584437233397838427766123 Linalool synthaseClarkia concinna AF067602

Abbildung 6: Vergleich der Gen-Struktur verschiedener Isoprensynthasen. Die Lage der Introns ist durch vertikale Striche gekennzeichnet. Die jeweili ge Sequenz ist unter der angegebenen Accession number der EMBL-Datenbank entnommen. *Die Struktur der Casben-Synthase ist der Veröffentli chung von Mau und West, 1994 entnommen.

Ergebnisse

42

Auftrennung des HincII -Verdaus durch ein 0,8%iges Agarose-

Gel nicht mehr sichtbar. BamHI schneidet nicht innerhalb der

Taxadien-Synthase. Das 4,4 kb große Fragment lässt den

Schluss zu, dass sowohl kurz vor als auch nach dem Gen eine

Schnittstelle für BamHI sein muss. Es konnte eine zusätzliche

Bande für den BamHI-Verdau in der Größe von 3,3 kb

detektiert werden.

Abbildung 7: Southern Blot-Analyse von Taxus baccata: A) Autoradiogramm des Blots: Je 10 µg BamHI und HincII geschnittene DNA wurde über ein 0,8 %iges Gel aufgetrennt, auf eine Membran geblottet, mit [α32P]-dCTP markierter TBCyc800-Sonde hybridisiert, mit hoher Stringenz gewaschen und mittels Autoradiographie die Signale detektiert. B) Schnittstellen der Enzyme HincII und BamHI im Taxadien-Synthase-Gen von T. baccata.

Rekombinante Taxa-4(5),11(12)-dien-Synthase aus Taxus baccata

RT-PCR Für die Amplifizierung der cDNA der Taxadien-Synthase wurde Gesamt-RNA aus Wurzeln

von T. baccata isoliert und eine Zwei-Schritt-RT-PCR-Methode nach Anleitung der Firma

Sigma gewählt, da diese sich bei sehr großen DNA-Fragmenten bewährt hat. Nach der

Synthese des ersten Stranges erfolgte die Primer-spezifische Amplifizierung der cDNA. Die

Primer wurden anhand der Sequenz des genomischen Klons ausgesucht. Zur besseren

Klonierung des PCR-Produktes in den Expressionsvektor wurden zusätzliche

Restriktionsschnittstellen an die Primersequenz angefügt. Der Primer für den N-terminalen

A

Bam

HI

Hin

c II

kb

0.83

1.4

1.6

2.0

3.6

5.2

21.5

B

0 3980

Hin

cII

834

Hin

cII

10663786

Hin

cII

Bam

HI

Bam

HI

Ergebnisse

43

Bereich begann mit der ApaI-Schnittstelle, gefolgt von dem Startcodon ATG und 12 weiteren

Basen, die den Anfang der Taxadien-Synthase aus T. baccata repräsentieren. Der C-terminale

Primer enthielt die EcoRI-Schnittstelle, das Stopcodon TGA und die 12 letzten Basen der

Taxadien-Synthase. Für die Bedingungen der RT-PCR-Reaktion siehe Materialen und

Methoden S. 27.

Ein 2589 bp großes PCR-Produkt konnte amplifiziert werden. Dieses wurde mit den

Restriktionsenzymen (ApaI und EcoRI) geschnitten und in den mit denselben

Restriktionsschnittstellen ausgestatteten pBBSK+-Vektor kloniert. Nach der Transformation

der Ligationsansätze in den E. coli-Stamm XL1-Blue wurde auf LBAmp selektiert und von fünf

verschiedenen positiven Klonen beide Stränge sequenziert. Die Umklonierung erfolgte in den

pQE31-Vektor, da diesem vor der MCS ein His-tag vorgeschaltet ist, der die Aufreinigung

des exprimierten Proteins an Nickel-Agarose ermöglicht. Nach der Umklonierung wurden die

Plasmide in den E. coli-Stamm M15[pREP4] transformiert, auf LBAmp/Kana selektiert und

abermals positive Klone doppelsträngig sequenziert. Das Plasmid pcTBCyc2.6 enthält den

ORF der Taxadien-Synthase aus T. baccata.

Expression des rekombinanten Proteins Für die Anzucht wurde eine Transformation des pcTBCyc2.6 in E. coli M15[pREP4] auf

LBAmp/Kana-Platten ausgestrichen, eine Einzelkolonie über Nacht angezogen und 10 ml dieser

Vorkultur in 500 ml LBAmp/Kana in Schikane-Kolben bis zu einer OD600=0,6 wachsen gelassen.

Die Induktion erfolgte mit 0,1 mM IPTG und die Expression bei 16 °C über Nacht. Eine

Zeitabhängigkeit der Expression ergab, dass nach 16 h das gesuchte Protein in der höchsten

Konzentration auftrat (Daten nicht gezeigt). Als Negativkontrolle diente die Transformation

des Vektors pQE31 ohne Insert in M15[pREP4]-Zellen. Die Anzucht erfolgte unter den

selben Bedingungen.

Ergebnisse

44

Northern Blot-Analyse der Expression

Zur Kontrolle, ob das gesuchte Protein unter den oben angegebenen Bedingungen exprimiert

wurde, sollte eine Northern Blot-Analyse durchgeführt werden. Dazu wurde direkt nach der

Expression aus den Zellen Gesamt-RNA präpariert und 5 µg über ein 1,2%iges

Formaldehyd/Agarose-Gel aufgetrennt. Als

Sonde diente das radioaktiv markierte 800 bp

große Fragment TBCyc800 der Taxadien-

Synthase (siehe oben). Die ebenfalls

exprimierten Proteine des Plamids pQE31

dienten als Negativkontrolle. Das Waschen des

Blots erfolgte mit hoher Stringenz (2x 10 min

Waschpuffer 3 bei 65 °C).

Wie aus Abb. 8 ersichtlich, hybridisiert ein

2,6 kb großes RNA-Fragment der exprimierten

Proteine des Plasmids pcTBCyc2.6 mit der

radioaktiv markierten Sonde TBCyc800. Bei

der Negativkontrolle, das Plasmid ohne Insert,

konnten keine Signale detektiert werden.

Reinigung des rekombinanten Proteins Zur Aufreinigung der Taxadien-Synthase aus T. baccata wurde die Reinigung an Nickel-

Agarose gewählt. Diese Reinigungsmethode basiert auf der Tatsache, dass zweiwertige

Nickelionen von Histidinresten in Proteinen komplexiert werden. Dies kann zur

Proteinreinigung genutzt werden, indem das rekombinante Protein mit sechs aufeinander

folgenden Histidinresten versehen wird und an einem mit Nickelionen beladenen

Säulenmaterial durch Affinitäts-Chromatographie gereinigt wird. Es bestehen zwei

pcT

BC

yc2.

6

pQE

31

9,49

7,46

4,40

2,37

1,35

0,24

kb

Abbildung 8: Nor thern Blot-Analyse der Expression Als Vergleich sind je 5 µg RNA aus M15[pREP4]-Zellen nach der Expression der Plasmide pcTBCyc2.6 und pQE31 über ein 1,2%-Gel aufgetrennt und mit der radioaktiv markierten Sonde TBCyc800 hybridisiert.

Ergebnisse

45

Möglichenkeiten ein Protein auf diese Weise zu reinigen: Die eine Variante ist, das Protein

nativ zu reinigen. Dafür muss sich das zu reinigende Protein nach dem Zellaufschluss in der

löslichen Phase befinden. Sollte dies nicht der Fall sein, evtl. membrangebunden oder in

inclusion bodies vorliegend, kann man unter denaturierenden Bedingungen arbeiten.

Im Fall der rekombinanten Taxadien-Synthase aus T. baccata lag diese in nativer Form nach

der Expression vor. Die über Nacht nach der Expression tiefgefrorenen Zellen wurden mit

flüssigem Stickstoff gemörsert, in Natriumhydrogenphosphat-Puffer aufgenommen und nach

einem DNaseI-Verdau die nicht löslichen Bestandteile abzentrifugiert. Die Bindung an

Nickel-Agarose erfolgte im Anschluss unter Schütteln bei 4 °C. Nach Einfüllen in eine Säule

wurde durch Zugabe von steigenden Mengen

Imidazol zuerst unspezifisch gebundenes

Fremdprotein und später das gesuchte Protein

vom Säulenmaterial eluiert. Als Kontrolle

wurden die Proteine des pQE-Vektors in

gleicher Weise behandelt.

Abb. 9 zeigt ein 10%iges Acrylamid-Gel auf

dem die verschiedenen Reinigungsschritte

dargestellt sind. In Spur 4 ist der nicht an

Nickel-Agarose gebundene Durchlauf von

pcTBCyc2.6 aufgetrennt. Spur 3 zeigt einen

Waschschritt mit 20 mM Imidazol in

Natriumhydrogenphosphat-Puffer und Spur 2

zeigt die aufgetrennten Proteine von

pcTBCyc2.6, die an Nickel-Agarose gebunden

haben und die mit 250 mM Imidazol in

Natriumhydrogenphosphatpuffer von der Säule

eluiert wurden. Spur 1 zeigt im Vergleich dazu

die aufgetrennten Proteine der Elution von pQE31-Proteinen, die unspezifisch an Nickel-

Agarose gebunden waren. M1 und M2 sind Markerproteinmischungen. In Spur 2 ist eine

Proteinbande mit der für die Taxadien-Synthase zu erwartenden Größe von ca. 97 kDa zu

sehen. Diese Proteinbande konnte in den unten beschriebenen Untersuchungen als Taxadien-

Synthase aus T. baccata charakterisiert werden. Die Ausbeute an Taxadien-Synthase betrug

nach 16 stündiger Expression 10 mg pro 500 ml Kulturmedium.

66 kDa

116 kDa

97 kDa

45 kDa

205 kDa

29 kDa

M1 2M21 43

Abbildung 9: SDS-PAGE (10% Trenngel) verschiedener Reinigungsschr itte der rekombinaten Taxadien-Synthase aus T. baccata: M1 und M2 sind Marker; 4 Durchlauf, 3 Waschschritt mit 20 mM Imidazol, 2 Eluat pcTBCyc2.6 mit 250 mM Imidazol, 1 Eluat pQE31 mit 250 mM Imidazol. Die Färbung des Gels erfolgte mit Coomassie Brill ant Blue.

Ergebnisse

46

Immunologische Detektierung der r ekombinaten Taxadien-Synthase aus Taxus baccata Zur Detektierung der in E. coli exprimierten Taxadien-Synthase aus T. baccata wurden zum

einen angereinigte Proteinfraktionen der Expression auf die Reaktion mit den gegen die

N-terminale Histidinsequenz gerichteten Antikörpern und zum anderen auf die Reaktion

gegen eine Peptidsequenz der Taxadien-Synthase gerichteten Antikörpern im Western Blot-

Verfahren getestet. Die Antikörper gegen die Histidinsequenz sind kommerziell von der

Firma Qiagen zu beziehen. Für die Antikörpergewinnung gegen die Taxadien-Synthase wurde

für diese mit Hilfe des Programms RASMOL auf Grundlage der Aminsäuresequenz eine

3D-Struktur modelli ert und außenliegende Bereiche ermittelt. Einen solchen Bereich stellt das

Peptid mit der Sequenz 754RLTNDTKTYQAEKARGQ770 dar Abb. 14. Dieses Peptid wurde

synthetisiert, an KLH gekoppelt und zur Immunisierung von Kaninchen eingesetzt. Für die

Antikörper gegen die Taxadien-Synthase wurde eine Verdünnung von 1:1000 und für die

Antikörper gegen His5-Sequenz 1:2000 in TBS/Tween gewählt. Die Verdünnung des Anti-

Rabbit-Antikörpers betrug in beiden Fällen 1:5000 in TBS/Tween. Als Negativkontrolle

wurde eine Nickel-Agarose-gereinigte Proteinfraktion des in E. coli exprimierten pQE31-

Vektors verwendet.

In Abb. 10 sind die Western Blots der Proteinfraktionen von pcTBCyc2.6 und pQE31 nach

Reaktion mit den Antikörpern gegen His5 (C) oder Taxadien-Synthase (B) gezeigt, und in (A)

ist die Auftrennung der Proteinfraktionen pcTBCyc2.6 und pQE31 über ein 10%iges

Acrylamidgel zu sehen. Eine ca. 97 kDa großes Protein reagierte sowohl mit den His5- als

auch mit den Taxadien-Synthase-Antikörpern.

66 kDa

116 kDa

97 kDa

45 kDa

pcT

BC

yc2.

6

pQE

31

pcT

BC

yc2.

6

pcT

BC

yc2.

6

pQE

31

pQE

31

A B C205 kDa

Abbildung 10: Western Blot-Analyse der Taxadien-Synthase aus Taxus baccata A) 10%ige SDS-PAGE einer Taxadienfraktion und einer pQE-Fraktion mit Marker, Coomassie Brill ant Blue gefärbt. B) Western Blot Analyse mit AK gegen die Taxadien-Synthase. C) Western Blot Analyse mit AK gegen His-Tag.

Ergebnisse

47

N-terminale Aminosäuresequenzierung der Taxadien-Synthase aus T. baccata Proteinfraktionen des Plasmids pcTBCyc2.6 nach der Nickel-Agarose-Aufreinigung wurden

mittels SDS-PAGE (10%-Gel) aufgetrennt und über Nacht auf eine PVDF-Membran

geblottet. Die Proteinbande der entsprechenden Größe wurde ausgeschnitten und über

Edmanabbau ansequenziert. Folgende N-terminale Sequenz wurde gefunden:

Ein Vergleich mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz des Taxadien-Synthase-Gens aus

T. baccata zeigt die Übereinstimmung der N-Termini.

Molekulargewichtsbestimmung der r ekombinanten Taxadien-Synthase Zur Größenbestimmung des in E. coli exprimierten Taxadien-Synthase-Proteins aus

T. baccata wurde eine Nickel-Agarose-gereinigte Fraktion von pcTBCyc2.6 über SDS-PAGE

(10%-Trenngel) aufgetrennt. Als Markerproteine wurden Enniatin-Synthetase (350 kDa),

Myosin (205 kDa), ß-Galactosidase (116 kDa), Phosphorylase G (97 kDa),

Rinderserumalbumin (66 kDa), Eialbumin (45 kDa) und Carbanhydrase (29 kDa) verwendet.

Für die Taxadien-

Synthase aus

T. baccata konnte

ein Molgewicht von

97 kDa bestimmt

werden, welches mit

der von der Gen-

Struktur abgeleiteten

Größe von 98 kDa

nicht 100%ig über-

einstimmt.

MRGSHHHHHHTDPPGCRNSMAQVektor pQE31 Restriktionsschnittstellen N-Terminus

Taxadiensynthase

1

10

10 0

100 0

0 2 4 6 8 10 12 14

cm

kD

a

M T

205

29

45

66

97116

kDa

Taxadiensynthase

Abbildung 11: Molekulargewichtsbestimmung der Taxadien-Synthase aus Taxus baccata unter denatur ierenden Bedingungen Halblogarithmische Auftragung der Markerproteingrößen. Kleines Foto: 10 %ige SDS-PAGE einer Taxadien-Synthase-haltigen Ni-Agarose-Fraktion, Coomassie Brill ant Blue gefärbt (T) und High Molecular Weight Marker (M)

Ergebnisse

48

Aktivitätstest

Der Aktivitätstest der Taxadien-Synthase wurde nach Willi ams und Mitarbeiter durchgeführt

(Willi ams et al., 2000). Nach der Expression des Klons pcTBCyc2.6 in M15[pREP4]-Zellen

wurden diese abzentrifugiert, mit flüssigem Stickstoff aufgeschlossen und nach einem

DNaseI-Verdau die lösliche Proteinfraktion für den Test eingesetzt. Unter Zugabe von

[1-3H]-Geranylgeranylpyrophosphat und Magnesium-Ionen erfolgte die Inkubation bei 32 °C

für eine Stunde. Anschließend wurde der Ansatz mit Hexan extrahiert, die Hexanphasen zum

Abtrennen der olefinhaltigen Fraktion über Kieselgel passagiert und anschließend im

Szintill ationszähler die Radioaktivität bestimmt. Nachdem dort kein Unterschied zur

Kontrolle (pQE31 in M15[pREP4]) auftrat, wurde die Proteinlösung zuerst entsalzt und dann

für den Test eingesetzt. Hier zeigte sich, dass nun ein deutlicher Anstieg der Radioaktivität

der Hexanphase bei pcTBCyc2.6 zu verzeichnen war Tabelle 2.

gemessene Radioaktivität (cpm)

pcTBCyc2.6 in M15[pREP4] 48

pcTBCyc2.6 in M15[pREP4], entsalzt 2402

pQE31 in M15[pREP4] 50

pQE31 in M15[pREP4], entsalzt 47

Tabelle 2: Vergleich der Radioaktivitätsmessung für den Taxadien-Synthase-Test

Für die GC-MS-Messung wurde der Assay wie oben beschrieben durchgeführt, nur diesmal

wurde nicht radioaktiv markiertes Geranylgeranylpyrophosphat eingesetzt. Je 1 µl der

eingeengten Hexanphase von pcTBCyc2.6 und pQE31 wurden zur GC-MS-Messung

eingesetzt. Leider war eine cool on-column injection nicht möglich, so dass die Probe bei

200 °C auf die Säule gegeben wurde (siehe auch Materialen und Methoden S. 30). Die

gaschromatographische Analyse beider Proben weist einen zusätzlichen Peak (Retentionszeit

von 16,45 min) für pcTBCyc2.6 in dem für das Ion m/z=122 extrahierten Elutionsprofil auf

Abb. 12 A und B. Das Massenspektrum für diesen Peak ist in Abb. 12 C gezeigt. Im

Vergleich dazu ist in Abb. 12 D das MS von Squalen dargestellt, einem aus

6 Isopreneinheiten bestehenden Molekül. Ein aus 8 Isopreneinheiten bestehendes Molekül

zeigt das gleiche Spektrum. Leider war in der Datenbank des Massenspektrometers kein

Massenspektrum von Taxadien (4 Isopreneinheiten) enthalten.

Ergebnisse

49

Das relativ stabile Fragment m/z=122 ist als Bruchstück von Taxadien durch zweifachen

Bruch einer C-Bindung und Wanderung von Wasserstoff beschrieben worden Abb. 13 (Lin et

al., 1996).

Auch das Fragment m/z=121 gehört zu dem C-Ring-Fragmentierungscluster von Taxadien,

wie es von Wildung und Croteau, 1996 beschrieben wurde.

Das Ion m/z=69 ist als einzelne Isopreneinheit (C5H9) zu erklären und das Ion m/z=136

entspricht genau der Hälfte des Molekulargewichts von Taxadien, also 2 Isopreneinheiten

(C10H16).

A

B

D

C

Abs

orpt

ion

Abs

orpt

ion

Retentionszeit

Abs

orpt

ion

Abs

orpt

ion

m/z

Abbildung 12: GC-MS-Analyse des Taxadien-Synthase-Tests. A) GC-Elutionsprofil von pQE31 für das Ion m/z=122, B) GC-Elutionsprofil für pcTBCyc2.6 für das Ion m/z=122. C) Massenspektrum des Ion m/z=122, D) MS von Squalen.

+.

H2

34

5

67

8

.+

m/z=272 m/z=122

Abbildung. 13: mögli che C-Ring-Fragmentierung von Taxadien

Ergebnisse

50

Vergleich der Taxadien-Synthasen aus T. baccata, T. brevifolia und T. chinensis Als Ausgangspunkt der Untersuchung an der Taxadien-Synthase aus T. baccata wurden die

Arbeiten von Wildung und Croteau, 1996 an T. brevifolia genommen. Sie isolierten einen

cDNA-Klon, der für die Taxadien-Synthase codiert. Im August 2000 veröffentlichten Wang

und Mitarbeiter in der Genbank von NCBI die Sequenz der Taxadien-Synthase aus

T. chinensis. Ein Vergleich dieser Taxadien-Synthasen zeigt eine 99,3 %ige Identität auf

Nucleotidbasis (PC-Gene) und eine 97%ige Identität auf Aminosäurebasis (Clustal W)

zwischen T. baccata und T. brevifolia; zwischen T. chinensis und den anderen beiden eine

98,6 %ige Identität auf Nucleotidbasis und 96 %ige Identität auf Proteinbasis. Abb. 14 zeigt

die Aminosäurepositionen, in denen sich die Proteinsequenzen unterscheiden (grün/gelb

markiert).

Tbacc MAQLSFNAALKMNALGNKAIHDPTNCRAKSERQMMWVCSRSGRTRVKMSRGSGGPGPVVMMSSSTG 66 Tbrev MAQLSFNAALKMNALGNKAIHDPTNCRAKSERQMMWVCSRSGRTRVKMSRGSGGPGPVVMMSSSTG 66 Tchin MAQLSFNAALKMNALGNKAIHDPTNCRAKSEGQMMWVCSGSGRTRVKMSRGSGGPGPVVMMSSSTG 66 Motiv I Motiv II Motiv III Tbacc TSKVVSETSSTIVDDIPRLSANYHGDLWHHNVIQTLETPFRESSTFQERADELVVKIKDMFNALGD 132 Tbrev TSKVVSETSSTIVDDIPRLSANYHGDLWHHNVIQTLETPFRESSTYQERADELVVKIKDMFNALGD 132 Tchin TSKVVSETSSTIVDDIPRLSANYHGDLWHHNVIQTLETPFRESSTYQERADELVVKIKDMFNALGD 132 Tbacc GDISPSAYDTAWVARVATVSSDGSEKPRFPQALNWVLNNQLQDGSWGIESHFSLCDRLLNTVNSVI 198 Tbrev GDISPSAYDTAWVARLATISSDGSEKPRFPQALNWVFNNQLQDGSWGIESHFSLCDRLLNTTNSVI 198 Tchin GDISPSAYDTAWVARVATISSDGSEKPRFPQALNWVFNNQLQDGSWGIESHFSLCDRLLNTTNSVI 198 Tbacc ALSVWKTGHSQVEQGTEFIAENLRLLNEEDELSPDFEIIFPALLQKAKALGINLPYDLPFIKSLST 264 Tbrev ALSVWKTGHSQVQQGAEFIAENLRLLNEEDELSPDFQIIFPALLQKAKALGINLPYDLPFIKYLST 264 Tbrev ALSVWKTGHSQVEQGTEFIAENLRLLNEEDELSPDFEIIFPALLQKAKALGINLPYDLPFIKYLST 264 Tbacc TREARLTDVSAVADNIPANMLNALEGLEEVIDWNKIMRFQSKDGSFLSSPASTACVLMNTGDEKCF 330 Tbrev TREARLTDVSAAADNIPANMLNALEGLEEVIDWNKIMRFQSKDGSFLSSPASTACVLMNTGDEKCF 330 Tchin TREARLTDVSAAADNIPANMLNALEGLEEVMDWKKIMRFQSKDGSFLSSPASTACVLMNTGDEKCF 330 Tbacc TLLNNLLDKFGGCVPCMYSIDLLERLSLVDNIEHLGIGRHFKQEIK VALDYVYRHWSERGIGWGRD 396 Tbrev TFLNNLLDKFGGCVPCMYSIDLLERLSLVDNIEHLGIGRHFKQEIKGALDYVYRHWSERGIGWGRD 396 Tchin TFLNNLLVKFGGCVPCMYSIDLLERLSLVDNIEHLGIGRHFKQEIK VALDYVYRHWSERGIGWGRD 396 Tbacc SLVPDLNTTALGLRTLRTHGYDVSSDVLNNFKDENGRFFSSAGQTHVELRSVVNLFRASDLAFPDE 462 Tbrev SLVPDLNTTALGLRTLRMHGYNVSSDVLNNFKDENGRFFSSAGQTHVELRSVVNLFRASDLAFPDE 462 Tchin SLVPDLNTTALGLRTLRTHGYDVSSDVLNNFKDENGRFFSSAGQTHVELRSVVILFRASDLAFPDE 462 Tbacc GAMDDARKFAEPYLRDALATKISTNTKLYKEIEYVVEYPWHTSIPRLEARSYIDSYDDDYVWQRKT 528 Tbrev RAMDDARKFAEPYLREALATKISTNTKLFKEIEYVVEYPWHMSIPRLEARSYIDSYDDNYVWQRKT 528 Tchin GAMDDARKFAEPYLRDALATKISTNTKLFKEIEYVVEYPWHMSIPRSEARSYIDSYDDDYVWERKT 528 Tbacc LYRMPSLSNSKCLELAKLDFNIVQSLHQEELKLLTRWWKESGMADINFTRHRVAEVYFSSATFEPE 594 Tbrev LYRMPSLSNSKCLELAKLDFNIVQSLHQEELKLLTRWWKESGMADINFTRHRVAEVYFSSATFEPE 594 Tchin LYRMPSLSNSKCLELAKLDFNIVQSLHQEELKLLTRWWKESGMADINFTRHRVAEVYFSSATFEPE 594 Tbacc YSATRIAFTKIGCLQVLFDDMADIFATLDELKSFTEGVKRWDTSLLHEIPECMQTCFKVWFKLMEE 660 Tbrev YSATRIAFTKIGCLQVLFDDMADIFATLDELKSFTEGVKRWDTSLLHEIPECMQTCFKVWFKLMEE 660 Tchin YSATRIAFTKIGCLQVLFDDMADIFATLDELKSFTEGVKRWDTSLLHEIPECMQTCFKVWFKLIEE 660

Ergebnisse

51

Tbacc VNNDVVKVQGRDMLAHIRKPWELYFNCYVQEREWLEAGYIPTFEEYLKTYAISVGLGPCTLQPILL 726 Tbrev VNNDVVKVQGRDMLAHIRKPWELYFNCYVQEREWLEAGYIPTFEEYLKTYAISVGLGPCTLQPILL 726 Tchin VNNDVVKVQGRDMLAHIRKPWELYFNCYVQEREWLDAGYIPTFEEYLKTYAISVGLGPCTLQPILL 726 Tbacc MGELVKDDVVEKVHYPSNMFELVSLSWRLTNDTKTYQAEKARGQQASGIACYMKDNPGATEEDAIK 792 Tbrev MGELVKDDVVEKVHYPSNMFELVSLSWRLTNDTKTYQAEKARGQQASGIACYMKDNPGATEEDAIK 792 Tchin MGELVKDDVVEKVHYPSNMFELVSLSWRLTNDTKTYQAEKARGQQASGIACYMKDNLGATEEDAIK 792 Tbacc HICRVVDRALKEASFEYFKPSNDIPMGCKSFIFNLRLCVQIFYKFIDGYGIANEEIKDYIRKVYID 858 Tbrev HICRVVDRALKEASFEYFKPSNDIPMGCKSFIFNLRLCVQIFYKFIDGYGIANEEIKDYIRKVYID 858 Tchin HICRVVDRALKEASFEYFKPSNDIPMGCKSFIFNLRLCVQIFYKFIDGYGIANEEIKDYIRKVYID 858 Tbacc PIQV 862 Tbrev PIQV 862 Tchin PIQV 862 Abbildung 14: Alignment der Aminosäuresequenzen der Taxadien-Synthasen aus Taxus baccata (Tbacc), Taxus brevifolia (Tbrev) und Taxus chinensis (Tchin). Die unterschiedli chen Aminosäurepositionen sind gelb bzw. grün markiert. Das Peptid, das zur Antikörpergewinnung gegen Taxadien-Synthase eingesetzt wurde, ist blau markiert. Motiv I, II und III markieren die homologen Bereiche für Transitpeptide wie sie von Karlin-Neumann und Tobin, 1986 beschrieben wurden.

Wie das Alignment zeigt, sind es 30 Aminosäurepositionen, in denen sich die Taxadien-

Synthasen unterscheiden. Die Taxadien-Synthasen aus T. baccata und T. brevifolia

unterscheiden sich in 19 Aminosäurepositionen, der C- und N-terminale Bereich ist

konserviert. T. chinensis unterscheidet sich gegenüber T. baccata und T. brevifolia in

20 AS-Positionen, auch im C- und vor allem im N-terminalen Bereich sind Unterschiede zu

verzeichnen Tabelle 3.

AS-Position 32 40 112 148 151 169 194 211 214 235 261 276 295 298 332

Tbrev R R Y L I F T Q A Q Y A I N F

Tbacc R R F V V L V E T E S V I N L

Tchin G K Y V I F T E T E Y A M K F

AS-Position 338 377 414 418 450 463 478 491 504 509 521 525 658 696 783

Tbrev D G M N N R E F M L N Q M E P

Tbacc D V T D N G D Y T L D Q M E P

Tchin V V T D I G D F M S D E I D L

Tabelle 3: Gegenüberstellung der unterschiedli chen Aminosäuren und deren Positionen in den Taxadien-Synthasen aus T. baccata, T. brevifolia und T. chinensis.

Alignment der Aminosäuresequenz verschiedener Isoprensynthasen aus Pflanzen In der Literatur sind für alle Isoprensynthasen konservierte Bereiche beschrieben. Dabei ist

das Motiv DDXXD in der Aminosäuresequenz aller Isoprensynthasen zu finden (Stofer Vogel

et al., 1996). Ein Vergleich verschiedener Isoprensynthasen miteinander sollte weitere

konservierte Bereiche, bzw. die Verwandtschaft der Synthasen untereinander aufzeigen. Ein

Alignment der beiden Taxadien-Synthasen aus T. baccata und T. brevifolia (Accession

Ergebnisse

52

number U48796), der Linalool-Synthase aus Clarkia concinna (AF067603), der 5-epi-

Aristolochen-Synthase aus Nicotiana tabacum (U50768), Limonen-Synthase aus

Mentha spicata (L13459), Casben-Synthase aus Ricinus communis (L32134), Abietadien-

Synthase aus Abies grandis (U50768), ent-Kauren-Synthase B aus Cucurbita maxima

(U43904) und E-α-Bisbolen-Synthase aus Abies grandis (AF006195) ist in Abb. 15

dargestellt. Der Sequenzvergleich erfolgte mit Hilfe des Programms ClustalW im Genedoc-

Programm-Paket. Wie zuvor schon beschrieben, ist auch hier der konservierte Bereich mit

dem Motiv1 DDXXD für alle Synthasen zu finden. Doch auch die Bereiche davor und danach

zeigen hohe Homologien zwischen den Synthasen. Der konservierte Asparaginsäure-Rest

(758D für TS) im Motiv2 gehört zu einem Bereich, der bei Röntgenstrukturanalysen dem

Motiv1 direkt gegenüber liegt (Cane und Kang, 2000). Weitere, für verschiedene Terpen-

Synthasen beschriebene, konservierte Aminosäurereste sind in der Abbildung mit Pfeilen

markiert: die Tyrosine 585Y und 841Y, die Cysteine 329C und 650C und die Histidine 370H, 415H, 503H und 555H (Stofer Vogel et al., 1996). Doch wie sich zeigt, sind diese Reste nicht bei allen

Isopren-Synthasen zu finden. Auffälli g ist der homologe N-terminale Bereich der „großen“

Terpen-Synthasen (>700 Aminosäuren). Insbesondere das Motiv3 ist, mit Ausnahme der

Casben-, 5-epi-Aristolochen- und Limonen-Synthase bei allen anderen Synthasen zu finden.

3

Ergebnisse

53

Abbildung 15: Alignment verschiedener Isoprensynthasen aus Pflanzen. 80-100%ige Identitäten sind rot, 60-79%ige sind gelb und 40-59%ige Identitäten sind grau unterlegt. TSbacc: Taxadien-Synthase aus Taxus baccata, TSbrev: Taxadien-Synthase aus T. brevifolia, TSchin: Taxadien-Synthase aus T. chinensis, AS: Abietadien-Synthase aus Abies grandis, LiS: Linalool-Synthase aus Clarkia concinna, KSB: ent-Kauren-Synthase B aus Arabidopsis thaliana, EBS: E-α-Bisbolen-Synthase aus Abies grandis, CS: Casben-Synthase aus Ricinus comunis, EAS: 5-epi-Aristolochen-Synthase aus Nicotiana tabacum, LS: Limonen-Synthase aus Mentha spicata. Das Alignment wurde mit dem Programm Clustal W aus dem Genedoc-Programm-Paket erstellt und die Maske Blossum 62 verwendet.

1

2

Ergebnisse

54

Für den Vergleich der Sequenzen untereinander sind die Identitäten in Tabelle 4 dargestellt.

Diese variieren von nur 7% Identität zwischen Casben-Synthase aus Ricinus communis und

Linalool-Synthase aus Clarkia breweri, und 97% Identität zwischen den beiden Taxadien-

Synthasen aus T. baccata und T. brevifolia.

TSbacc TSbrev TSchin AS LiS KSB EBS CS EAS LS

TSbacc 100%

TSbrev 97% 100%

TSchin 96% 96% 100%

AS 43% 43% 42% 100%

LIS 16% 16% 16% 18% 100%

KSB 22% 22% 22% 23% 17% 100%

EBS 41% 41% 41% 42% 16% 24% 100%

CS 14% 14% 14% 14% 7% 10% 14% 100%

EAS 12% 12% 12% 13% 9% 10% 13% 30% 100%

LS 13% 13% 13% 14% 10% 11% 14% 25% 27% 100%

Tabelle 4: Vergleich der Identitäten der Isoprensynthasen in Prozent

Auf Grundlage dieser Identitäten wurde ein phylogenetischer Stammbaum erstellt, der den

Verwandtschaftsgrad der Terpensynthasen untereinander aufzeigt Abb. 16. So kann man

diese in drei verschiedene Gruppen aufteilen. Die Limonen-Synthase aus Mentha spicata, die

Casben-Synthase aus Ricinus communis und die 5-epi-Aristolochen-Synthase aus Nicotiana

tabacum gehören einer Gruppe an. Der Verwandtschaftsgrad zwischen der 5-epi-

Aristolochen-Synthase und der Casben-Synthase ist aber höher (30% Identität) als der

Verwandtschaftsgrad der beiden zur Limonen-Synthase (25% und 27% Identität). Die

Linalool-Synthase aus Clarkia concinna und die ent-Kauren-Synthase aus Cucurbita maxima

bilden eine weitere Gruppe mit 17% Identität zueinander. Zu der dritten Gruppe gehören die

beiden Taxadien-Synthasen aus T. baccata und T. brevifolia, die mit 97% Identität am

stärksten verwandt miteinander sind, die Abietadien-Synthase aus Abies grandis und die

E-α-Bisbolen-Synthase aus Abies grandis.

Ergebnisse

55

Anlegen einer T. baccata-Genbank Für die Untersuchung von regulatorischen up- und downstream-Bereichen des Taxadien-

Synthase-Gens sollte eine genomische Genbank angelegt, und nach einem geeigneten Klon

gesucht werden. Es konnte keine Genbank mit einem das ganze Genom repräsentierenden

Titer hergestellt werden. 10 µl einer Genbank ergaben ca. 30 Plaques formende Einheiten

(pfu). Bei Annahme, dass pro Plaque 20 kb des Genoms von T. baccata verpackt sind,

ergeben sich für eine Genbank (= 500 µl) 30 Mb. Das Genom von Koniferen ist aber im

Gegensatz dazu ca. 30 Gb groß (persönliche Mitteilung von R. Croteau). Das heißt, dass nur

ein tausendstel des Genoms von T. baccata nach einem für die Taxadien-Synthase

codierenden Gen durchsucht wurde. Alle möglichen Faktoren bei der Präparierung (DNA-

Isolierung und –Aufreinigung, Verpacken der DNA in einen λ-Phagen oder Cosmid-Vektor

und die Wahl der Hostbakterien) wurden variiert. Durch all diese Faktoren ließ sich der Titer

der Genbank nicht steigern und durch ein Screening konnte kein Klon isoliert werden, der das

0.1

LiS

KSB

LSCS

EAS

AS

TSbacc TSbrev

EBS

TSchin

Abbildung 16: Phylogenetischer Stammbaum verschiedener Isoprensynthasen aus Pflanzen, in Form eines Sterns gezeichnet. Der Stammbaum ist mit dem Programm Clustal W kalkuliert. Die Armlängen sind proportional zu den phylogenetischen Distanzen zwischen den Terpensynthasen. 0,1 = Armlängenmarker; repräsentiert den Abstand, bei der eine Aminosäure-Substitution in jeder 10. Position gefunden wurde. TSbacc: Taxadien-Synthase aus Taxus baccata, TSbrev: Taxadien-Synthase aus T. brevifolia, TSchin: Taxadien-Synthase aus T. chinensis, AS: Abietadien-Synthase aus Abies grandis, LiS: Linalool-Synthase aus Clarkia concinna, KSB: ent-Kauren-Synthase B aus Arabidopsis thaliana, EBS: E-α-Bisbolen-Synthase aus Abies grandis, CS: Casben-Synthase aus Ricinus comunis, EAS: 5-epi-Aristolochen-Synthase aus Nicotiana tabacum, LS: Limonen-Synthase aus Mentha spicata

Ergebnisse

56

Gen für die Taxadien-Synthase enthielt. Es konnten zwar in der ersten Screening-Runde

positive Plaques identifiziert werden, aber eine Anreichung und Reinigung dieser Klone war

nicht möglich.

Diskussion

57

Diskussion In der vorliegenden Arbeit wurde das Taxa-4(5),11(12)-dien-Synthase-Gen aus Taxus baccata

isoliert, die Genstruktur charakterisiert, mit verschiedenen Genen anderer Isoprensynthasen

aus Pflanzen verglichen und die rekombinante Taxadien-Synthase aus T. baccata in E. coli

exprimiert. Des Weiteren sollte eine genomische λ-Genbank von T. baccata zur

Untersuchung der flankierenden Bereiche des isolierten Gens konstruiert werden.

Gen-Struktur der Taxa-4(5),11(12)-dien-Synthase aus Taxus baccata In Anlehnung an den von Wildung und Croteau, 1996 veröffentlichten cDNA-Klon der

Taxadien-Synthase aus T. brevifolia konnte mittels PCR das Taxadien-Synthase-Gen aus

T. baccata, pTBCyc4.0, isoliert werden, das einen ORF von 3980 bp repräsentiert und aus

dem sich für das Taxadien-Synthase-Protein eine Größe von 98 kDa vorhersagen lässt. Der

codierende Bereich der Taxadien-Synthase umfasst 13 Exons und 12 Introns, das konservierte

Motiv DDXXD, welches für alle Isoprensynthasen beschrieben ist, befindet sich zwischen

Intron IX und X.

Durch Southern Blot-Analyse konnte nachgewiesen werden, dass, im Gegensatz zur 5-epi-

Aristolochen-Synthase aus Tabak, das Taxadien-Synthase-Gen nur in einer Kopie im Taxus-

Genom vorhanden ist. Für die 5-epi-Aristolochen-Synthase konnten zwei strukturell

unabhängige Cyclase-Gene in dem Genom von Nicotiana tabacum gefunden werden

(Facchini und Chappell, 1992).

Ein Vergleich der Genstruktur, d.h. Lage der Introns und Größe der Exonbereiche

verschiedener Isoprensynthasen aus Pflanzen, die, mit Ausnahme der Linalool-Synthase aus

Clarkia concinna, auch Isoprencyclasen sind, zeigte für den C-terminalem Bereich große

Homologien für alle Synthasen. Vor allem aber der Bereich um das konservierte Motiv

DDXXD (Exon 10, 11 und 12 für die Taxadien-Synthase) ist in seiner Intron/Exon-Struktur

für all diese Isoprensynthasen hochhomolog und wurde für die Bindung des Komplexes aus

zweiwertigen Metalli onen und der jeweili gen Prenyleinheit charakterisiert (Starks et al.,

1997).

Cseke und Mitarbeiter beschreiben in ihrem Alignment verschiedener Terpensynthasen, dass

sich die Linalool-Synthase aus C. concinna im N-terminalen Bereich von denen der Limonen-

Diskussion

58

Synthase-ähnlichen Cyclasen deutlich unterscheidet (Cseke et al., 1998). In dieser Arbeit

konnte gezeigt werden, dass die Taxadien-Synthase aus T. baccata gerade in diesem Bereich

(Exon 3-9 der Taxadien-Synthase) mit der Linalool-Synthase und nicht mit den Limonen-

Synthase-ähnlichen Cyclasen übereinstimmt. Für die 5-epi-Aristolochen-Synthase aus

Nicotiana tabacum ist der entsprechende Bereich (Exon 2 und der überwiegende Teil von

Exon 3) als strukturverwandt zu Glycosylhydrolasen beschrieben worden und soll nicht in die

Terpenbiosynthese involviert sein. (Starks et al., 1997).

Die miteinander verglichenen Isoprensynthasen unterscheiden sich hinsichtlich der Größe des

ersten Exons, was auf die Größe des entsprechenden N-terminalen Transitpeptids

zurückzuführen ist, das zum Transfer des Proteins in die jeweili gen Plastide notwendig ist.

Rekombinante Taxadien-Synthase aus T. baccata Mittels RT-PCR wurde, auf der Basis der genomischen Sequenz von T. baccata, die cDNA

der Taxadien-Synthase amplifiziert und das Protein in E. coli exprimiert. Die Ausbeute an

Taxadien-Synthase betrug nach 16 stündiger Expression 10 mg pro 500 ml Kulturmedium.

Für eine einfache Aufreinigung des Proteins an Nickel-Agarose wurde der Sequenz der

Taxadien-Synthase ein His-Tag vorgeschaltet. Dadurch konnte in einem Reinigungsschritt ein

Reinigungsgrad von ca. 30 % erreicht werden. Für die anschließende Identifikation des

angereinigten Proteins als Taxadien-Synthase aus T. baccata wurde dieser Reinigungsgrad als

ausreichend betrachtet.

Für die Identifikation des Proteins als Taxadien-Synthase wurde zum einen das angereinigte

Protein N-terminal ansequenziert, mittels Western Blot-Analyse die Antikörper-Reaktion

gegen den His-Tag und gegen das Peptid aus der Taxadien-Synthase beobachtet und zum

anderen die Synthese von Taxadien durch Inkorporation von radioaktiv markiertem

Geranylgeranylpyrophosphat mit dem angereinigten Protein und mittels GC-MS-Analyse

nachgewiesen.

Durch eine denaturierende SDS-PAGE wurde für die rekombinante Taxadien-Synthase aus

T. baccata ein Molgewicht von 97 kDa bestimmt. Dies ist in guter Übereinstimmung mit der

von dem ORF abgeleiteten Größe von 98 kDa. Im Gegensatz dazu ist für die native Taxadien-

Synthase aus T. brevifolia eine Größe von 80 kDa beschrieben worden (Hezarin et al., 1995).

Diese Diskrepanz und die Tatsache, dass die Biosynthese von Terpenen in Plastiden

lokalisiert ist (West et al., 1979), lässt den Schluss zu, dass das rekombinante Protein

Diskussion

59

(Preprotein) aus einem Transitpeptid für das Plastid und der eigentlichen Isoprensynthase

besteht.

Für die Bestimmung der exakten Schranken zwischen Transitpeptid und der prozessierten

Synthase können nur Sequenzvergleiche herangezogen werden, da der N-Terminus der

nativen Taxadien-Synthase geblockt ist (Wildung und Croteau, 1996).

Karlin-Neumann und Tobin beschreiben 1986 konservierte Transitpeptidstrukturen für den

Transport in Chloroplasten, die auch in der N-terminalen Sequenz des Preproteins der

Taxadien-Synthase aus T. baccata zu finden sind. Auf Grundlage dieser Studien ist die

mögliche Schranke in Aminosäureposition 60 des Preproteins zu erwarten. Jedoch hätte das

resultierende prozessierte Protein eine Größe von 91 kDa (803 AS). Ausgehend von einem

Molgewicht von 80 kDa (analog der Taxadien-Synthase aus T. brevifolia) ergäbe sich eine

Schnittstelle nach Aminosäureposition 125. In dem Sequenzbereich zwischen AS 60-125

lassen sich auch Strukturen finden, die für Transitpeptide aus Pflanzen beschrieben sind. So

sind diese Bereiche vor allem Serin-, Threonin- und Asparagin-reich, wohingegen positiv

geladene Reste unterrepräsentiert sind (Bruce, 2000). Eine Serie von verkürzten Taxadien-

Synthasen aus T. brevifolia zeigte, dass die um 59 AS verkürzte Taxadien-Synthase eine

höhere Syntheseaktivität als das Preprotein hat. Aber schon eine Verkürzung um 93 AS hatte

eine völli gen Verlusst der Aktivität zur Folge (Willi ams et al., 2000). Deshalb ist es

wahrscheinlich, dass die gesuchte Schranke für das Transitpeptid zwischen AS 60 und 93

liegt.

Vergleich der Taxadien-Synthasen aus T. baccata, T. brevifolia und T. chinensis Ein Vergleich der Aminosäure-Sequenzen der Taxadien-Synthasen aus T. baccata,

T. brevifolia (Wildung und Croteau, 1996) und T. chinensis (Genbank von NCBI) zeigt, dass

der Verwandtschaftsgrad der Synthasen aus T. baccata und T. brevifolia untereinander höher

ist als zu der Taxadien-Synthase aus T. chinensis. In zusätzlich 11 Aminosäurepositionen sind

Unterschiede in der AS-Sequenz für T. chinensis zu finden. Auch im N- und C-terminalen

Bereich, in denen die Taxadien-Synthasen aus T. baccata und T. brevifolia konserviert sind,

sind Austäusche für AS zu verzeichnen. Doch liegen sämtliche Austäusche außerhalb der für

alle Isoprensynthasen beschriebenen konservierten Bereiche.

Diskussion

60

Alignment der Aminosäure-Sequenz verschiedener Isoprensynthasen aus Pflanzen

Das Alignment der Taxadien-Synthasen mit anderen Isoprensynthasen aus Pflanzen zeigte

nicht nur große Homologien im Bereich des konservierten Motivs DDXXD, sondern es lässt

sich auch darstellen, dass viele weitere Bereiche homolog sind. Es ließ sich zeigen, dass die

im Alignment verglichenen Synthasen in drei Gruppen eingeteilt werden können, unabhängig

von dem Substrat ihrer Cyclisierungsreaktion. Die eine Gruppe sind die Limonen-Synthase-

ähnlichen Cyclasen (Limonen-Synthase (Monoterpencyclase), Casben-Synthase

(Diterpencyclase) und 5-epi-Aristolochen-Synthase (Sesquiterpencyclase)). Eine zweite

Gruppe wird aus den Taxadien-Synthasen (Diterpencyclasen), der Abietadien-Synthase

(Diterpencyclase) und der E-α-Bisbolen-Synthase (Diterpencyclase) gebildet. In die dritte

Gruppe werden die ent-Kauren-Synthase B, eine Diterpencyclase, und die Linalool-Synthase,

eine Monoterpenhydroxylase, eingeordnet. Dieses Ergebnis deckt sich mit der Beobachtung

von Bohlmann und Mitarbeiter, dass Isoprensynthasen innerhalb der Familie der

Gymnospermen oder der Familie der Angiospermen näher miteinander verwandt sind als

durch die Abhängigkeit vom Substrat. (Bohlmann et al., 1997).

Genbank

Für die Charakterisierung der up- und downstream Bereiche sollte eine genomische Genbank

von T. baccata konstruiert und ein Klon isoliert werden, der Aufschluss über die

flankierenden Bereiche des Taxadien-Synthase-Gens geben würde. Zum einen sollten

regulatorische Elemente untersucht werden und zum anderen besteht die Vermutung, dass

weitere, an der Biosynthese von Taxol beteili gte, Enzyme geclustert vorliegen. Es wurden

z.B. verschiedene Pilze gefunden, die, unabhängig von ihrem Taxol-produzierenden Wirt,

eigenständig Taxol synthetisieren (Taxomyces andreanae, Stierle et al., 1993; Pestalopsis

microspora, Strobel et al., 1996). Diese Fähigkeit kann Folge eines horizontalen Gentranfers

von dem Wirt auf den Pilz sein. Auch die Tatsache, dass in der Haselnuss Taxol gefunden

wurde (Hoffmann, 2000), unterstützt diese Theorie.

Im Rahmen dieser Arbeit war es aber nicht möglich, einen geeigneten Klon für diese

Untersuchungen zu isolieren. Sicherlich spielen viele Faktoren eine Rolle, nicht zuletzt ist

aber die Größe des Genoms von Koniferen (ca. 30 Gb) bei der Untersuchung von

unterrepräsentierten Genen hinderlich.

Diskussion

61

Ausblick In der vorliegenden Arbeit konnte die Isolierung des genomischen Klons der Taxadien-

Synthase gezeigt werden, der in seiner Genstruktur nicht den Limonen-Synthase-ähnlichen

Cyclasen gleicht, sondern strukturverwandt mit der Linalool-Synthase aus C. concinna ist, die

keine Cyclase sondern eine Hydroxylase ist. Bisher ist von keinen weiteren, nicht den

Limonen-Synthase-ähnlichen Isoprencyclasen die Genstruktur beschrieben worden. Es ist von

Interesse, ihre Intron/Exon-Struktur im Vergleich mit den anderen zu untersuchen.

Auch wurden bisher keine genauen Schnittstellen für die den Synthasen vorgeschalteten

Transitpeptide gefunden. Eine schrittweise Verkürzung des Preproteins konnte auch keine

zufriedenstellenden Ergebnisse liefern. Doch es wäre für enzymatische und

kristallographische Untersuchungen von Vorteil, wenn man in ausreichendem Maße natives

Protein erhalten könnte, und dies ist im Hinblick auf die Ausbeute bei der Isolierung aus den

natürlichen Ressourcen nur durch rekombinantes Enzym zu erreichen.

Für die Untersuchung von flankierenden Bereichen hat sich die Konstruktion einer

genomischen λ-Genbank nicht bewährt. Es wäre zu überlegen, ob eventuell die Konstruktion

einer Cosmidbank sinnvoll ist, und in wieweit die Untersuchung von up-und downstream-

Bereichen durch Genomwalking realisiert werden könnte.

Literatur

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Danksagung

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Danksagung Herrn Prof. Dr. U. Szewzyk danke ich für die Übernahme der Berichtertätigkeit meiner

Doktorarbeit.

Ganz besonders möchte ich mich bei Herrn Priv.-Doz. Dr. R. Zocher für die hervorragende

Betreuung und jederzeit gewährte Unterstützung bedanken.

Mein Dank geht auch an alle Mitglieder der Arbeitsgruppe Zocher für die einzigartige

Arbeitsatmosphäre und die hilfreiche Unterstützung bei dieser Arbeit.

Bei Frau Denaro möchte ich mich für die ausgezeichneten photographischen Arbeiten

bedanken.

Für die Durchführung der GC-MS-Messungen danke ich Stefanie Heimroth.

Anke Doller und Christine Hacker danke ich im besonderen für ihre Freundschaft und die

Hilfe in allen Lebenslagen.

Meinen Eltern danke ich insbesondere für den jederzeit gegebenen Rückhalt.

Ein besonderes Dankeschön an Reinhard; und nicht nur, weil ich ohne ihn diese Arbeit

wahrscheinlich nicht fertig gestellt hätte.

Lebenslauf

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Lebenslauf

Persönliche Daten

Name, Vorname: Görhardt, Bärbel

Straße: Friedrichstr.114

PLZ/Wohnort: 10117 Berlin

Geburtsdatum/-ort: 07.03.1970 / Berlin

Schulausbildung

von / bis 1976 - 1986 Oberschule in Berlin

1986 - 1988 Erweiterte Oberschule in Berlin

Juli 1988 Reifeprüfung bestanden

Studium

von / bis Sept. 1988 - Juli 1989 Praktikum im Institut für Lebensmittelhygiene des Fachbereichs Veterinärmed. der Humboldt-Uni zu Berlin

Sept. 1989 - Juli 1990 Studium an der TH Leuna Merseburg in Merseburg im Fachbereich Chemie

seit Oktober 1990 Studium an der TU Berlin im Fachbereich Chemie

März 1993 Diplom-Vorprüfung bestanden

Nov. 1994- Sept. 1996 Student. Hilfskraftstelle am Inst. f. Biochemie u. Mol. Biologie der TU-Berlin

19. 04. 1996 Beendigung des Studiums der Chemie an der TU Berlin mit Abschluss Diplom-Chemiker Beruflicher Werdegang

Okt. 1996 - April 1997 Werkvertrag mit TU-Berlin

01.05.1997 – 30.06.2000 wiss. Mitarbeiter am Max-Volmer-Institut für Biophysikalische Chemie und Biochemie

01.07.2000 - 31.12.2000 Promotionsabschlussstipendium der TU Berlin

19.01.2001 Promotionprüfung mit Prädikat „sehr gut“ bestanden

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