Charakterisierung der Produktionszelle

Konsens auf Erfahrungsbasis: • Produktion proteinogener Wirkstoffe in Fermentationsprozessen kann prinzipiell gefahrlos erfolgen

gilt auch für kontinuierliche Fermentationsprozesse

gilt für prokaryontische und eukaryontischeProduktionszellen

abnormaler Karyotyp

Unsterblichkeit

Modifikationen, die mitTumorwachstum assoziiert sind

Charakterisierung der Produktionszelle

Expressionsplasmid • Herkunft • Herstellung • strukturelle und funktionelle Besonderheiten • Transfermethode • Zustand in der Zelle (stabil ins Genom integriert oder episomal) • Anzahl der Kopien

Expressions-plasmid

Charakterisierung der Produktionszelle

Haltung, Propagierung, Lagerung • Methoden • Materialien

kontrolliertgetestetdokumentiert

.

Charakterisierung der Produktionszelle

Wachstumsrate

Morphologische Charakteristika

Zellzahl

Zeit

unterProduktionsbedingungen

Charakterisierung der Produktionszelle

Produktionszellinie

• Marker• Charakteristika

Eindeutige Identifizierungsmöglichkeit

Charakterisierung der Produktionszelle

Arbeitszellbank

Charakterisierung der Produktionszelle

Produktionszellinie

karzinogenes PotentialendogeneRetroviren

In-Prozeß-Kontrolle während der Fermentation

Kontrolle: • aller Rohmaterialien auf

• Identität• Reinheit• Freiheit von Viren, Mykoplasmen, vermehrungsfähiger Kontaminationen• biologische Aktivität

Sicherung des Produktionsstandards

In-Prozeß-Kontrolle während der Fermentation

Kontrolle: • des Fermentationsprozesses auf

• Sterilität, durch Tests auf — Bakterien — Pilze — Mykoplasmen — exogene Viren• Reproduzierbarkeit der — Fermentationszeit — Ausbeute

Reinigungsprozeß und Reproduzierbarkeitder Aufreinigung

Ziel: • Standardisierung des Aufreinigungsverfahrens

• Entfernung auch unbekannter Kontaminationen• reproduzierbare Ausbeuten

Produktsicherheit

Reinigungsprozeß und Reproduzierbarkeitder Aufreinigung

Verunreinigungen: • Moleküle aus der Produktionszelle • Moleküle aus dem Kulturmedium

Entfernung durch chromatographische Verfahren: • Ionenaustausch-Chromatographie • Gelfiltrationschromatographie • Chromatographie auf der Basis hydrophober Interaktionen • Affinitätschromatographie • Immunabsorptions-Chromatographie

Reinigungsprozeß und Reproduzierbarkeitder Aufreinigung

Verunreinigungen und Kontaminationen • Moleküle aus der Produktionszelle • Moleküle aus dem Kulturmedium

Entfernung durch chromatographische Verfahren: • Ionenaustausch-Chromatographie • Gelfiltrationschromatographie • Chromatographie auf der Basis hydrophober Interaktionen • Affinitätschromatographie • Immunabsorptions-Chromatographie

Reinigungsprozeß und Reproduzierbarkeitder AufreinigungVerunreinigungen = alle prozeßbedingten, nicht zugesetzten Substanzen

Verunreinigung TestEndotoxin LAL-Test, Kaninchen-PyrogentestWirtszell-Protein SDS-PAGE, Immuno-AssayDNA HybridisationProtein-Varianten FingerprintAggregate HPLC-Größenfraktionierung, TrübungsassayProteolytische Derivate isoelektrische Fokussierung, FingerprintAminosäuresubstitutionen Fingerprintendogene Viren Elektronen-Mikroskopie, RT-Test, Immuno-Assay

Reinigungsprozeß und Reproduzierbarkeitder AufreinigungKontaminationen = unerwünschte Substanzen, die dem Prozeß zugeführt wurden

Quelle Test

Gewebe oder Serum Proteine, Viren oder virale Proteine, Mikroorganismen oder mikrobielle ProteineZellkultur Medienbestandteile, Endotoxine, Cytokine, Viren oder virale ProteineZellkulturmedium Schwermetalle, Endotoxine, Mikroorga- nismen, kleine organische MoleküleAufreinigungsprozeß Stabilisatoren, Affinitätsliganden, Filterkomponenten, Detergenzien

Reinigungsprozeß und Reproduzierbarkeitder AufreinigungBestimmung des Abreicherungsfaktorsdurch "spiking"

aufgetragene Menge

mit dem Produkt eluierte Menge

1015

106 abgereicherte Menge = 109

Abreicherungsfaktor = 9

Reinigungsprozeß und Reproduzierbarkeitder AufreinigungModellviren und Beispiele für eine Gesamt-reduzierung im Laufe eines Reinigungsprozesses

Virus Familie Genom Hülle Gesamtreduzierung

Mäuseleukämie-Virus retro ssRNA ja > 6,3 - 1012 (MuLV) Visna etro ssRNA ja > 4,0 - 109 Vesicular stomatitis virus rhabdo ssRNA ja 3,2 - 1010 (VSV) Polio Typ Virus1 picorna ssRNA nein 4,0 - 108 Herpes simplex Virus herpes dsDNA ja > 2,0 - 109 Typ 1 (HSV) Simianvirus 40 (SV40) papova dsDNA nein 3,2 - 106

Reinigungsprozeß und Reproduzierbarkeitder AufreinigungModellviren und Beispiele für eine Gesamt-reduzierung im Laufe eines Reinigungsprozesses

Virus Familie Hülle Gesamtreduzierung

BVD Papovaviridae nein > 2,3 x 1013

PI 3 Paramyxoviridae ja 2,5 x 108

Retro Retro ja > 1,7 x 1013

Rheo 3 Rheoviridae nein 1,2 x 107

SV40 Papovaviridae nein 3,3 x 108

BVD = Bovine Virusdiarrhö-Virus PI 3_ Parainfluenza-Virus Typ 3

Biologische Aktivität und Stabilitätrekombinanter Wirkstoffe rFVIII

In vitro Charakterisierung: • geeignete Testmodelle für alle biologischen Aktivitäten des rekombinanten Wirkstoffs • Test auf Denaturierung, Proteolyse, Aggregation, Dimerisierung, Oxidation, Reduktion, Photolyse

Präklinische Studien: • Test in verschiedenen Tierspezies (Ratten, Kaninchen und Hund)

Pharmakokinetik: • Bestimmung der biologische Halbwertszeit und der Gewebe- verteilung mittels radioaktiv-markierten Wirkstoffs

Biologische Aktivität und Stabilitätrekombinanter Wirkstoffe

Klinische Studien: • Bestimmung der biologischen und immunologischen Sicherheit und der Nachweis einer ausreichenden "Efficacy"

rFVIII

"Efficacy": • Vergleich der "Efficacy" des authentischen Biomoleküls mit der des rekombinanten Wirkstoffs

Immunologische Studien: • Antikörperbildung in Tier und Mensch