Aus dem Institut für Hygiene und Mikrobiologie

der Universität Würzburg

Vorstand: Prof. Dr. med. M. Frosch

Charakterisierung und Lokalisation der Toxoplasma gondiiKatalase: Peroxisomen in Apicomplexa?

Inaugural – Dissertation

zur Erlangung der Doktorwürde der

Medizinischen Fakultät

der

Bayerischen Julius-Maximilians-Universität zu Würzburg

vorgelegt von

Achim J. Kaasch

aus Rottweil

Würzburg, Juli 2002

Referent: Prof. Dr. med M. Frosch

Koreferent: Prof. Dr. rer. nat. H. Moll

Dekan: Prof. Dr. med V. ter Meulen

Tag der mündlichen Prüfung: 27. Juni 2003

Der Promovend ist Arzt

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 1

1.1 Die Gattung Toxoplasma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1.2 Medizinische Bedeutung von Toxoplasma gondii . . . . . . . . . . . . . . . . 4

1.3 Antioxidative Schutzmechanismen von T. gondii . . . . . . . . . . . . . . . 5

1.4 Das Enzym Katalase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

1.5 Peroxisomen – Morphologie und enzymatische Ausstattung . . . . . . . . 9

1.6 Peroxisomen – Biogenese und Protein Targeting . . . . . . . . . . . . . . . 10

1.7 Spezialisierte Peroxisomen: Glyoxysomen und Glykosomen . . . . . . . . 12

2 Ergebnisse 15

2.1 Klonierung und Sequenzierung der Toxoplasma gondii Katalase . . . . . . . 15

2.2 Analyse der Sequenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

2.3 Western Blot mit Antiserum gegen T. gondii Katalase . . . . . . . . . . . . . 25

2.4 Lokalisation in der Immunfluoreszenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

2.5 Lokalisation mittels Histochemie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

2.6 Expression von Katalase in CHO-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

2.7 Expression eines Reportergens in CHO-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . 29

3 Materialien und Methoden 31

3.1 Bakterienstämme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

3.2 Parasitenstämme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

3.3 Lambda-Phagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

3.4 Zellinien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

3.5 Plasmide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

3.6 Primäre Antikörper . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

3.7 Sekundäre Antikörper . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

3.8 Kulturbedingungen für Zellinien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

3.9 Passagieren der Zellinien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

3.10 Passage der Parasiten in der Zellkultur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

3.11 In vivo Exzision . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

3.12 Praktisches Vorgehen bei der in vivo Excision . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

3.13 „Rapid Amplification of cDNA Ends“ (5’ RACE) . . . . . . . . . . . . . . . 35

3.14 Sequenzierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

3.15 Herstellung des Antiserums gegen T. gondii Katalase . . . . . . . . . . . . . 36

3.16 Antikörper Aufreinigung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

3.17 Western Blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

3.18 Immunfluoreszenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

3.19 DAB Präzipitation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

3.20 Klonierung der Expressions-Konstrukte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

3.21 Transfektion der CHO-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

3.22 Allgemeine molekularbiologische Techniken . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

3.23 Oligonukleotide und Chemikalien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

3.24 Protein-Modellierung mit Swissmodel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

3.25 Verwendete Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

3.26 Puffer und Lösungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

3.27 Benutzte Geräte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

4 Diskussion 46

5 Zusammenfassung 50

6 Abkürzungsverzeichnis 52

1 Einleitung

1.1 Die Gattung Toxoplasma

Der eukaryontische Erreger Toxoplasma gondii gehört zu den Apicomplexa, einem Phylum

der Protozoa. Dieser Gruppe gehören ca. 5000 verschiedene Spezies an, die weitreichen-

de Bedeutung in der Medizin und Biologie besitzen [51]. Weitere wichtige Vertreter der

Apicomplexa sind Plasmodium, Sarcocystis, Babesia, Eimeria, Perkinsus und Theileria.

Insgesamt zählt Toxoplasma gondii zu den am weitesten verbreiteten Krankheitserre-

gern mit einer regional unterschiedlichen Durchseuchungsrate von 40-70 %. Plasmodium

hingegen, der Erreger der Malaria, stellt mit 300-500 Millionen Fällen die weltweit häu-

figste Infektionskrankheit dar. Die Infektion von Tieren mit Eimeria, Babesia, Theileria und

Perkinsus führt zu großen Verlusten in der Viehhaltung [19, 27, 89].

Das gemeinsame taxonomisches Merkmal der Apicomplexa ist der „apikale Komplex“,

eine aus mehreren Zellorganellen bestehende Struktur am vorderen Ende der Parasiten,

die bei der Invasion der Wirtszelle eine entscheidende Rolle spielt. Der apikale Komplex

besteht aus dem Konoid, Rhoptrien und Mikronemen (Abbildung 1). Weitere elektro-

nenmikroskopisch nachweisbare Zellorganellen von T. gondii sind der Apikoplast, ein

sekundär erworbener Chloroplast [87], ein einzelnes Mitochondrium, der Golgi-Apparat

und elektronendichte, sekretorische Granula, die sogenannten „dense granules“ [50]. Der

obligat intrazelluläre Einzeller ist ca. 5-6µm lang, 2-3 µm breit und leicht gekrümmt, was

in der Namensgebung berücksichtigt wurde (toxon = Bogen).

Der Lebenszyklus von Toxoplasma (Abb. 2) wechselt fakultativ zwischen geschlecht-

licher Vermehrung (Gamogonie) im Darmepithel des Endwirts (Katzen) und der unge-

schlechtlichen Vermehrung (Schizogonie) in einer Reihe von verschiedenen Zwischen-

wirten. Im Darmepithel einer infizierten Katze entstehen Oozysten, die mit dem Kot aus-

geschieden werden (Abb. 2, 1). In einer Oozyste reifen zwei Sporozysten mit jeweils vier

Sporozoiten heran (Abb. 2, 2). Nach oraler Aufnahme durch einen Zwischenwirt, wer-

den die Sporozoiten im Darm freigesetzt und dringen in extraintestinalen Zellen ein.

Innerhalb dieser Zellen bildet sich eine Pseudozyste (Vakuole), in der sich die Parasiten

ungeschlechtlich vermehren (Abb. 2, 4). Die Teilung findet in einem 6-8 h lang dauern-

dem Zyklus statt und führt zu Tachyzoiten, die Vakuole rasch anfüllen. Nach einigen

Teilungsschritten bricht die Wirtszelle auf und die Tachyzoiten werden freigesetzt.

Über Blut und Lymphe gelangen Tachyzoiten in Hirn- und Muskelgewebe, wo sie

sich zu Bradyzoiten, der langsam wachsenden Form, weiterentwickeln können. Brady-

zoiten bilden Gewebszysten, die bis zu mehreren hundert Parasiten enthalten können

(Abb. 2, 6). Durch Genuß von rohem Fleisch werden weitere Zwischenwirte infiziert, was

1

Abbildung 1: ElektronenmikroskopischeAbbildung eines einzelnen Parasiten ineiner Wirtszelle. Parasitäre Vakuole (PV),perivakuoläre Membran (PVM), Rhoptrien(R), Mikronemen (M), Dense Granules (DG),Endoplasmatisches Retikulum (ER), Golgi(G), Nukleus (N), Mitochondrium (Mt). Zubeachten sind auch die membranassoziiertenMitochondrien der Wirtszelle (hMt). Nicht zuerkennen ist der Apikoplast.

wiederum zur Entstehung von Tachyzoiten führt (Abb. 2, 8). Eine Infektion des Endwirts

kann entweder über die Aufnahme von Oozysten, Pseudozysten oder Gewebszysten er-

folgen.

Die Tachyzoiten von T. gondii dringen aktiv in die Wirtszellen ein [28]. Dieser Vorgang

dauert ca. 20-30 Sekunden. Zuerst dockt der Parasit mit seinem vorderen Ende an der

Oberfläche der Wirtszelle an. Dann entsteht die „moving junction“, eine elektronendichte

Verbindung zwischen der Parasiten und Wirtszellmembran, die für Membranproteine

undurchlässig ist [60]. Durch aktives Eindringen des Parasiten in die Zelle entsteht eine

Vakuole, in der T. gondii sich vermehren kann.

Bei der Invasion spielt das sekretorische System von T. gondii eine entscheidende Rol-

le [30,44]. Die Produkte von Mikronemen, Rhoptrien und Granula densa werden sequen-

tiell sezerniert und tragen zur Bildung und Erhaltung der Vakuole bei [29].

Die Exozytose der Mikronemen wird durch Erhöhung des intraparasitären Kalzium-

Spiegels ausgelöst [13]. Die sezernierten Produkte der Mikronemen dienen der Fortbe-

wegung des Parasiten und Erkennung von Oberflächen, indem sie eine Verbindung zwi-

schen dem Parasiten und extrazellulären Oberflächen schaffen [94]. Mit der Exozytose

der Rhoptrien beginnt die Einstülpung der Wirtszellmembran und die Bildung der Va-

kuole. Die Rhoptrien haben einen hohen Cholesterol- und Phospholipid-Gehalt und tra-

gen vermutlich zur Bildung der vakuolären Membran bei. Die aus den Rhoptrien se-

2

Abbildung 2: Lebenszyklus vonToxoplasma gondii. Einzelheitenfinden sich im Text. Abkürzun-gen: EN Teilung durch Endodyo-genie, HC Wirtszelle, N Nukleus,NH Wirtszellnukleus, OC Oozyste,PC primäre Zystenwand, PV para-sitäre Vakuole, RB Residualkörper,SP Sporozoit, SPC Sporozoitenzy-ste. Übersicht nach Mehlhorn [57].

zernierten Proteine werden entweder in die vakuoläre Membran eingebaut oder liegen

in löslicher Form innerhalb der Vakuole vor. Eines dieser Proteine, Rop2, vermittelt die

Assoziation von Mitochondrien der Wirtszelle mit der vakuolären Membran über einen

neuartigen Mechanismus [98, 99]. Die Sekretion aus den Granula densa trägt zur Aus-

bildung des tubulovesikulären Netzwerks bei [96]. Dieses Netz besteht aus Membranen,

die sich innerhalb der Vakuolenmembran fingerförmig ausstülpen. Eine Funktion dieses

Netzwerks ist bisher nicht bekannt.

Innerhalb der Vakuole vermehren sich die Tachyzoiten durch Endodyogenie. Endo-

dyogenie ist eine spezialisierte Form der Zellteilung, bei der zwei Tochterzellen innerhalb

der Mutterzelle entstehen. Während der Bildung der Tochterzellen wird die Mutterzelle

zerstört [26]. Unter entsprechenden Umweltbedingungen entwickeln sich Bradyzoiten.

Bradyzoiten, die langsam wachsende Form von T. gondii, liegen in Gewebszysten vor,

die viele hundert Parasiten enthalten können. Trigger für die Bildung von Gewebszy-

sten in vitro sind Stressoren wie Erhöhung des pH-Wertes oder der Temperatur [100]. Der

Induktor für die Zystenbildung in vivo ist jedoch nicht bekannt.

Andere Organismen, wie Legionella pneumophila oder Mycobacterium ssp., haben ver-

3

schiedene Strategien entwickelt, um dem lysosomalen System des Wirts zu entgehen. Sie

beeinflussen entweder die Fusion der Phagosomen mit den Lysosomen, entkommen aus

der Vakuole ins Zytoplasma oder verhindern die Ansäuerung des Phagosoms [97]. T.

gondii umgeht durch die aktive Invasion das endosomale System der Wirtszelle [42]. Im

weiteren Verlauf kommt es zu keiner Fusion des lysosomalen Kompartimentes mit der

parasitären Vakuole – die Vakuole bleibt für die Wirtszelle unsichtbar.

Die Nährstoff-Aufnahme von T. gondii ist nicht vollständig bekannt. Lösliche Mole-

küle bis zu einer Größe von 1300 Da, wie z. B. Aminosäuren oder Nukleotide, können

über Poren in der Membran in die Vakuole übertreten [90]. Die Aufnahme von Lipiden

und Cholesterol, letzteres erhält der Parasit vollständig von der Wirtszelle, ist nicht ge-

klärt [17].

1.2 Medizinische Bedeutung von Toxoplasma gondii

In den 1980er Jahren war die Toxoplasma-Enzephalitis häufigste Todesursache bei HIV-

Erkrankten. Dies hat sich erst nach Einführung der „highly active anti-retroviral therapy“

(HAART) und der Entwicklung neuer Antibiotika wie Pyrimethamin verändert.

Eine Übertragung auf den Menschen geschieht über Genuß von rohem Fleisch infi-

zierter Tiere, über oozystenhaltigen Katzenkot (z. B. ungewaschener Salat) oder diapla-

zentar bei einer Erstinfektion während der Schwangerschaft. In der Regel verläuft ei-

ne Infektion subklinisch. Gelegentlich treten Lymphknotenschwellungen, Fieber, sowie

Kopf- und Muskelschmerzen auf. Unter Immunsuppression, z. B. bei Zytostatika Be-

handlung oder im Verlauf einer HIV Erkrankung, manifestiert sich die Toxoplasmose

als fulminante Enzephalitis mit eventueller septischer Streuung in Herz, Leber und Milz.

Im Rahmen einer Erstinfektion in der Schwangerschaft führt die diaplazentare Über-

tragung von T. gondii Tachyzoiten zur Fetopathia toxoplasmotica. Hierbei kommt es zu

Früh- oder Totgeburt, Hepatosplenomegalie, Ikterus, Myokarditis oder einer interstitiel-

len Pneumonie. Leichtere Fälle gehen mit der typischen enzephalitischen Trias bestehend

aus Hydrozephalus, Chorioretinitis und periventrikulären Verkalkungen einher.

Der Nachweis einer frischen Toxoplasma Infektion gelingt serologisch über den An-

stieg des IgM-Titers. Dieser kann jedoch bei immunsupprimierten Patienten ausbleiben.

Hier kann ein direkter Erregernachweis aus Blut oder Liquor hilfreich sein. Schwangere

Frauen sollten prophylaktisch auf das Vorliegen von IgG Antikörpern untersucht wer-

den, und bei Serokonversion einer Therapie zugeführt werden. Therapie der ersten Wahl

ist Pyrimethamin kombiniert mit Sulfadiazin oder Clindamycin. Vor der 20. Schwanger-

schaftswoche wird mit Spiramycin behandelt [38].

4

1.3 Antioxidative Schutzmechanismen von T. gondii

Die Fähigkeit verschiedener intrazellulärer Parasiten, in Makrophagen zu überleben be-

ruht auf einer Reihe von unterschiedlichen Mechanismen [11, 58]. Generell kann man

mindestens vier Strategien abgrenzen: Rückzug des Parasiten in ein sicheres intrazellu-

läres Kompartiment, Unterdrückung der Produktion antimikrobieller Substanzen und

die Modulation der Wirtszelle auf der Ebene der Apoptose [71], der Zytokin-Produktion

[6, 12] und der Antigenpräsentation [53]. Auf die Modulation der Immunantwort durch

T. gondii soll an dieser Stelle nicht eingegangen werden.

Die Vakuole, in der T. gondii sich aufhält, ist ein idealer Schutzort, da sie einerseits

innerhalb der Zelle liegt und so vor extrazellulär freigesetzten Substanzen geschützt

ist, sowie andererseits keinen Kontakt zum lysosomalen System der Wirtszelle besitzt

[14, 97]. Letzteres wird dadurch erklärt, daß T. gondii nicht über Phagozytose aufge-

nommen wird [42, 61] und bei der Invasion alle Wirtszellproteine von der Vakuolen-

membran ausgeschlossen werden [60]. Da somit auch die Rezeptoren für die Vesikel-

fusion (SNARE-Proteine) fehlen, ist die Vakuole für die Wirtszelle als Kompartiment im

Membran-Verkehr unsichtbar.

Die wichtigsten antimikrobiellen Substanzen bei der Immunantwort auf eine T. gon-

dii Infektion sind freie Radikale [3, 66]. Dazu gehören Wasserstoffperoxid (H2O2 ), das

Superoxid-Radikal (O−2 ) und das Hydroxyl-Radikal (OH ·). Diese Sauerstoffradikale wer-

den durch Neutrophile und Makrophagen während des „respiratory burst“ freigesetzt

und schädigen DNA, Lipide und Proteine [54].

Beim „respiratory burst“ ist der Sauerstoff- und Glukoseverbrauch der Makrophagen

exzessiv gesteigert. Der Sauerstoff wird über die NADPH-Oxidase zu O−2 umgesetzt,

während die Glukose über den Hexose-Monophosphat-Shunt das verbrauchte NADPH

regeneriert.

O2 +NADPH −→ O−2 +NADP+ +H+

Der überwiegende Teil des entstehenden O−2 reagiert weiter zu H2O2 :

2O−2 + 2H+ −→ H2O2 +O2

Über die metallkatalysierte Haber-Weiss Reaktion entsteht das Hydroxyl-Radikal (OH ·):

O−2 +H2O2

Fe2+−→ OH ·+OH− +O2

Das Hydroxyl-Radikal kann nun Lipide, Proteine, Kohlenhydrate und sogar DNA

angreifen und irreversibel schädigen. Besonders Membranlipide können an ihren mehr-

fach ungesättigten Fettsäuren angegriffen werden, was eine Transformation von cis nach

5

trans und damit eine Formänderung bewirkt. Häufig wird eine Kettenreaktion ausgelöst,

die zur Polymerisierung der Fettsäuren führt.

Schutzmechanismen gegen freie Radikale umfassen Antioxidantien (Vitamin E, β-

Karotin, Ascorbinsäure und Glutathion) und Enzymsysteme wie Superoxid-Dismutase,

Katalase, Peroxidasen und Peroxidoxin. Antioxidantien reagieren mit freien Sauerstoffra-

dikalen und neutralisieren sie. Superoxid-Dismutase (SOD) eliminert das Superoxid-Ra-

dikal (O−2 ). Katalase und Peroxidasen setzen H2O2 um.

O−2 +O2 + 2H −→ H2O2 +O2 (SOD)

H2O2 +H2O2 −→ 2H2O +O2 (Katalase)

H2O2 +R−H2 −→ 2H2O+ R (Peroxidase)

Peroxidoxine (oder Peroxiredoxine) sind eine relative neu entdeckte Familie antioxi-

dativer Enzyme [56]. Sie können unterschiedliche Peroxide, so auch Wasserstoffperoxid,

spalten. Ihre Besonderheit besteht darin, daß sie, im Gegensatz zu allen anderen bis-

her bekannten antioxidativen Enzymen, keine Metalle im aktiven Zentrum enthalten.

Ihr Reaktions-Mechanismus ist noch nicht eindeutig geklärt, jedoch spielen redox-aktive

Cysteine eine entscheidende Rolle.

Die Toleranz von T. gondii gegenüber H2O2 ist ungewöhnlich hoch [40, 65–68]. Diese

Beobachtung führte schon vor 15 Jahren zum enzymatischen und elektrophoretischen

Nachweis von Superoxid-Dismutase und Katalase [69, 95]. Die entsprechenden Gene

wurden jedoch erst neuerdings kloniert [23, 45, 74].

Auf die Existenz des Glutathion-Systems läßt sich anhand einer EST-Sequenz für

Glutathion-Reduktase schließen (Genbank Acc. Nr. W00127), die eine Ähnlichkeit von

58 % mit der Glutathion-Reduktase von Plasmodium falciparum aufweist. Das T. gondii Per-

oxidoxin wurde ebenfalls beim EST-Projekt identifiziert und nachfolgend kloniert [102].

Ihr Beitrag zum Überleben des Parasiten ist noch nicht geklärt.

1.4 Das Enzym Katalase

Das Enzym Katalase kommt in fast allen aeroben Lebewesen vor und katalysiert die Zer-

setzung von Wasserstoffperoxid zu Wasser und Sauerstoff. Diese Reaktion verhindert

die Entstehung von Sauerstoffradikalen und schützt die Zelle vor deren toxischen Wir-

kung. Ein Beispiel hierfür ist das seltene Krankheitsbild der Akatalasämie (Morbus Kata-

hara). Dieser autosomal-dominant vererbten Krankheit liegt eine verminderte Katalase-

Funktion in den Erythrozyten zugrunde. Sie führt infolge fehlendem Abbaus des von

vergrünenden Streptokokken gebildeten Wasserstoffperoxids zu einer Stomatitis ulcero-

sa [75].

6

Biochemisch unterscheidet man zwischen zwei verschiedenen Typen der Katalase:

Mangan-Katalasen und Häm-Katalasen. Die Mn-Katalasen sind Hexamere, enthalten ein

zentrales Mangan-Atom im aktiven Zentrum und kommen nur in Prokaryoten vor [15].

Die Häm-Katalasen hingegen sind ubiquitär verbreitet und haben ein Molekulargewicht

von 200-330 kDa. Jede Untereinheit des tetrameren Enzyms enthält ein Häm-Molekül.

Dieses besteht aus einem zentralen Eisenatom und Protoporphyrin IX.

Die klassische katalytische Aktivität der Katalase ist die Spaltung von zwei Molekü-

len Wasserstoffperoxid:

2H2O2 −→ H2O +O2

Zusätzlich zeigt Katalase unter bestimmten Bedingungen eine Peroxidase-Aktivität.

Die postulierte Reaktion von Katalase (E ), einem kleinen Peroxid als Substrat (S ) und

einem Wasserstoff-Donator (AH2) findet folgendermaßen statt:

E + S −→ ES (Katalase-Peroxid Komplex)

ES + AH2 −→ E + SH2 +A

Die Reaktionskinetik der Katalase ist ungewöhnlich, da bereits geringe Konzentratio-

nen des Substrates H2O2 die Aktivität des Enzyms hemmen. Betrachtet man den Reak-

tionsmechanismus der Zersetzung von H2O2 genauer, fallen zwei Teilschritte auf [33].

Zuerst erfolgt eine Oxidation von zwei Elektronen:

E − FeIII +H2O2 −→ E − FeV=O +H2O

Der oxidierte Zustand (FeV =O ) wird „Compound I“ genannt und entspricht einer

oxoferryl-Gruppe mit einem π-Porphyrin Radikal. Der zweite Schritt der Reaktion ist

eine zweimalige Reduktion des „Compound I“ durch ein weiteres Molekül H2O2 :

E − FeV +H2O2 −→ E − FeIII=O +H2O +O2

Bei kontinuierlichem Flux von H2O2 wird der „Compound I“ langsam zum „Com-

pound II“ reduziert. Dieser „Compound II“ ist gegenüber H2O2 enzymatisch inaktiv.

Wird der Zufluß von H2O2 jedoch gestoppt, kehrt das Enzym spontan zum Ausgangs-

zustand zurück.

Viele Katalasen enthalten NADPH als Kofaktor, der in der Peripherie des Enzyms fest

gebunden ist. Die Oxidation von NADPH zu NADP+ verhindert die Inaktivierung des

Enzyms durch H2O2 und beschleunigt die Reaktion [39, 46]. Ein Modell für den Reakti-

onsmechanismus [33], der diesen Eigenschaften Rechenschaft trägt ist in Abb. 3 darge-

stellt.

7

FerricCatalase(E-FeIII)

Compound I(E-FeV)

Compound II(E-FeIV=O)

NADP+

NADPH

(2 e-)

Reaktion 1

H2O2 H2O

Reaktion 2

Reaktion 3

NADP+

NADPH

A*

AH

(1 e-)

(2 e-)

(1 e-) AH

A*

H2O2

(2 e-)

(2 e-)

O2 + H2O

Abbildung 3: Möglicher Reaktionsmechanismus der Katalase bei konstantem Substratflux. Re-aktion 1: Compound I oxidiert das gebundene NADPH zu NADP+. Reaktion 2: Nach Oxidationdes NADPH wird Compound I durch einen endogenen oder hinzukommenden Elektronendona-tor (AH) zu Compound II reduziert. Reaktion 3: Der inaktive Compound II wird durch spontaneReduktion oder durch Zugabe von NADPH in den Ausgangszustand (Ferric Catalase) zurück-versetzt.

8

Die Katalase war eines der ersten Enzyme, das aufgereinigt und kristallisiert werden

konnte [104]. Die Kristallstruktur der bovinen Katalase wurde zuerst 1981 mit einer Auf-

lösung von 2.5 Å erstellt [70,85]. Zur Zeit sind 24 Kristallstrukturen von 7 verschiedenen

Organismen in der Entrez-Structure Datenbank (National Institute of Health, Bethesda)

verzeichnet. Da die Aminosäuresequenz des Proteins über die Arten hinweg hinreichend

konserviert ist, können modellbildende Algorithmen (z. B. Swissmodel) zu einer relativ

präzisen Strukturvorhersage benutzt werden.

1.5 Peroxisomen – Morphologie und enzymatische Ausstattung

Die Peroxisomen sind subzelluläre Organellen, die erstmals im Jahre 1954 von Rhodin

elektronenmikroskopisch im proximalen Tubulus der Mäuseniere als „Microbodies“ be-

schrieben wurden [86]. In der nachfolgenden Dekade zeigte de Duve durch biochemische

und morphologische Studien, daß Katalase, Urat-Oxidase und D-Aminosäuren-Oxidase

in einem eigenständigen subzellulären Kompartiment vorliegen, das den Microbodies

entspricht [5, 18]. Dieses Kompartiment wurde Peroxisom genannt, um auf das bioche-

mische Zusammenspiel zwischen H2O2 -bildenden Oxidasen und Katalase hinzuweisen

(Abbildung 4). In den darauf folgenden Jahren wurden Peroxisomen in fast allen euka-

ryontischen Zellen nachgewiesen (mit Ausnahme der Trichomonaden).

Morphologisch sind Peroxisomen durch eine fein granulierte Matrix und eine sie um-

gebende einfache Membran gekennzeichnet. In einigen Spezies enthält die Matrix kristal-

line Strukturen. Die Membran enthält ca. 1,2 nm große Poren, die für Moleküle bis 800 Da

durchlässig sind. Häufig sind Peroxisomen rund oder oval, in manchen Zelltypen können

sie allerdings auch miteinander verbunden sein oder in anderen komplexen Formationen

vorliegen [117]. Der Durchmesser runder Peroxisomen liegt abhängig vom Zelltyp zwi-

schen 100-500 nm. In den Leberzellen der Ratte sind sie mit einem Volumenanteil von

1,5 % vertreten [114]. Innerhalb einer Zelle sind die Peroxisomen in der Regel gleichmä-

ßig verteilt, es wird jedoch eine Assoziation mit dem Endoplasmatischen Retikulum (ER)

H2O

KATALASE

H2O2 + H2O2

reduziertesSubstrat

oxidiertesProdukt

O2

OXIDASE

Abbildung 4: Prinzip der peroxiso-malen Oxidation. Substrate derperoxisomalen Oxidasen werdenunter Bildung von H2O2 oxidiert.H2O2 wird anschließend durchKatalase enzymatisch in O2 undH2O gespalten. Das Ineinander-greifen dieser Reaktionen verhin-dert die Entstehung von toxischenSauerstoff-Radikalen.

9

Abbildung 5: Peroxisomen verschiedener Vo-gelarten. Peroxisomen sind sehr polymorpheZellorganellen. Häufig finden sich kristallineEinschlüsse (64, 66, 67), die bei Vögeln zum Teilals tubuläre Strukturen auftreten (62). Eine As-soziation mit dem ER (67) und Marginalplatten(66, rechts oben) treten auch auf. (Abbildungaus [10]).

gelegentlich beschrieben (Abb. 5).

Die enzymatische Ausstattung der Peroxisomen variiert sehr stark zwischen verschie-

denen Zelltypen. Insgesamt sind etwa 50 verschiedene Reaktionen beschrieben worden.

Interessanterweise haben die meisten peroxisomalen Enzyme Gegenstücke in anderen

Zellkompartimenten, die gleiche oder ähnliche Reaktionen katalysieren, jedoch ohne das

toxische Nebenprodukt H2O2 zu bilden. Eine Auswahl von biochemischen Reaktionen,

die in Peroxisomen zu finden sind, sind in Tabelle 1 dargestellt [84].

1.6 Peroxisomen – Biogenese und Protein Targeting

Die Entstehung von Peroxisomen wird noch kontrovers diskutiert [103]. Nach dem von

Lazarow und Fujiki postulierten Modell entstehen neue Peroxisomen nicht de novo, son-

dern nur durch Teilung oder Abspaltung von bestehenden Peroxisomen [49]. Dieses Mo-

dell begründet sich aus der Beobachtung, daß Matrix- und Membranproteine der Pero-

xisomen im Zytosol synthetisiert werden und dann posttranslational in die Organellen

transportiert werden. Daraus leitet sich eine Interaktion zwischen Import-Signalen auf

dem importierten Protein und Rezeptoren auf der peroxisomalen Oberfläche, sowie die

10

Oxidation Synthese Metabolismus

kurz- und langkettige Fett-säurenProstaglandineXenobiotikaSpermidin und SperminHarnsäureD-AminosäurenEthanol, MethanolNitritIsozitrat

CholesterolDolicholGlycerolipidelangkettige FettsäurenGallensäuren

Wasserstoffperoxidfreie RadikaleEpoxideAlaninGlyoxylatL-AminosäurenPurinePolyamineEicosanoide

Tabelle 1: Biochemische Stoffwechselvorgänge in den Peroxisomen.

Existenz einer Import-Maschinerie ab. Zwei dieser „peroxisomal targeting signals“ (PTS1

und PTS2) konnten bisher für Matrix-Proteine definiert und die dazu korrespondieren-

den Rezeptoren (Pex5p und Pex7p) isoliert werden [34, 77, 105].

Das PTS1 wurde zuerst am Luciferase-Genprodukt der Glühwürmchen entdeckt. Es

ist ein aus drei Aminosäuren bestehendes Signal am C-Terminus des Proteins mit fol-

gender Konsensus-Sequenz: (S/T/A/G/C/N) - (R/K/H) - (L/I/V/M/A/F/I) 1. Nicht

alle dieser Kombinationen sind jedoch Import-Signale und auch die Region unmittelbar

vor dem Signal hat einen noch nicht vollkommen geklärten Einfluß auf die Effizienz des

Imports [63, 64, 82].

Das PTS2-Signal liegt am N-terminus und hat die Konsensus-Sequenz (X)2-(R/K)-

(L/V/I)-(Q)-(X)5-(H/Q)-(L/A). Ein Beispiel ist das Importmotiv der peroxisomale Thio-

lase von Saccharomyces cerevisiae mit der Sequenz XXRLQX5HL [77, 105]. Die bisher be-

kannten Interaktionen von PTS1 und PTS2 mit den Import-Proteinen ist in Abb. 6 darge-

stellt.

Targeting-Signale, die die Membran-Proteine in die peroxisomale Membranen ein-

bauen (mPTS1), konnten bisher noch nicht exakt definiert werden. Unter anderem wur-

de im PEX3-Genprodukt von Pichia pastoris eine 40 Aminosäuren lange, N-terminale Se-

quenz [116] und ein 20 Aminosäuren langer Abschnitt im PMP47-Genprodukt von Can-

dida boidini identifiziert [31]. Beide Sequenzen enthalten fünf basische Aminosäuren hin-

tereinander, die von teilweise konservierten Regionen flankiert werden. Ein Konsensus

Motiv läßt sich aus der bisherigen Datenlage allerdings nicht ableiten.

In den letzten Jahren jedoch gab es Hinweise, daß das ER eine wichtige Rolle in der

Biogenese der Peroxisomen spielt [48, 111]. Nach dem Modell von Titorenko und Rachu-

binski gelangen einige Membran-Proteine (Pex2p und Pex16p) vom ER, wo sie glyko-

1PROSITE, Swiss Institute of Bioinformatics

11

Pex5p

Pex13p

PTS2

Pex7p

PTS1 - Katalase

PTS1

PTS2 - Thiolase

Docking & Import

Pex14p

Abbildung 6: Importsignalefür Matrixproteine. Der post-translationale Proteinimportin die Peroxisomen wird überzwei verschiedene peroxiso-male Targeting-Signale (PTS)vermittelt. Das C-terminalePTS1 (z. B. Katalase) interagiertmit seinem Rezeptor Pex5p,das N-terminale PTS2 (z. B.Thiolase) mit Pex7p. Es bildetsich ein Protein-Komplex mitPex13p und Pex14p, der in dasOrganell transportiert wird.

syliert werden, mittels kleiner sekretorischer Vesikel [109]zu den Peroxisomen (Abb. 7)

[110]. Hierbei entstehen zwei verschiedene transiente Kompartimente (PV1 und PV2),

die Katalase bzw. Thiolase enthalten und somit die beiden Importwege (PTS1 und PTS2)

widerspiegeln. Durch die Verschmelzung von PV1 und PV2 mit wachsenden Peroxiso-

men werden die Proteine in der peroxisomalen Membran integriert. Der Vesikeltransport

zwischen ER und Peroxisomen basiert auf Interaktionen der beteiligten Membranen mit

den Coatomeren COPI und COPII und wird von ARF reguliert [79].

1.7 Spezialisierte Peroxisomen: Glyoxysomen und Glykosomen

Die unterschiedlichen Anforderungen an die metabolischen Leistungen hat spezialisierte

Peroxisomen in verschiedenen Tier- und Pflanzenzellen hervorgebracht. Prominenteste

Beispiele sind die Glyoxysomen der Pflanzenzellen und die Glykosomen der Kinetopla-

stidae.

Die Glyoxysomen sind der Ort des Glyoxylat-Zyklus. Bei diesem bisher nur in Pflan-

zen nachgewiesenen Zyklus wird Acetat zu Succinat umgewandelt, was im weitesten

Sinne einem Umbau von Fettsäuren zu Zuckern entspricht. Die beiden Hauptenzyme

des Glyoxylat-Zyklus, Isozitrat-Lyase und Malat-Synthase, konnten bisher nicht sicher

in Toxoplasma gondii nachgewiesen werden. Glyoxysomen unterliegen einer hohen Wan-

delbarkeit. Sie können während ihres Lebenszyklus unterschiedliche Enzyme enthalten

und sich von Glyoxysomen zu Blatt-Peroxisomen und wieder zurück verwandeln [37].

Eine weitere wichtige Gruppe der spezialisierten Peroxisomen sind die Glykosomen

der parasitären Protozoen der Ordnung Kinetoplastida, zu der unter anderem Trypanosoma

12

PV1

PV2

ReifePeroxisomen

COP I & ARF vermitteltes Retrieval

CatalasePTS1

ThiolasePTS2

Pex16p

Pex2p

Budding Fusion

COP IIER

Abbildung 7: Biogenese von Peroxisomen. Das Modell von Titorenko und Rachubinski postuliertdie Entstehung des peroxisomalen Kompartimentes aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER)und verknüpft die zwei Importwege für Matrixproteine (PTS1 und PTS2) mit zwei verschiede-nen vesikulären Kompartimenten (PV1 und PV2), die unreifen peroxisomalen Kompartimentenentsprechen. Vesikel, die Pex2p und Pex16p als Membranproteine enthalten, spalten sich vom ERab und werden mit peroxisomalen Matrixproteinen beladen. Die Kompartimente PV1 und PV2verschmelzen mit schon bestehenden peroxisomalen Vesikeln und bilden reife Peroxisomen.

und Leishmania gehören. In den Glykosomen sind Enzyme der Glykolyse kompartimen-

talisiert [108]. Es wird spekuliert daß dadurch die biochemischen Reaktionen effizienter

ablaufen [76].

Die Glykolyse ist für Kinetoplastida von Bedeutung, wenn sie sich im Blut des Wirts-

organismus aufhalten, da dort hohe Glukosespiegel einen Abbau zu Pyruvat fördern. Im

Vergleich zur oxidativen Phosphorylierung ist die Energiegewinnung bei der Glykolyse

geringer, was nach dieser Hypothese durch eine Kompartimentalisierung ausgeglichen

wird. Befindet sich der Parasit wieder im Insektenvektor, werden glykosomale Enzyme

vermindert exprimiert und die ATP-Erzeugung auf oxidative Phosphorylierung in den

Mitochondrien umgestellt.

Neuere Arbeiten haben allerdings die Sichtweise verschoben [59]. Bakker et al. konn-

ten anhand einer Computermodellierung zeigen, daß die Kompartimentalisierung kei-

neswegs den Substratflux erhöht [4]. Durch virtuelle Entfernung der glykosomalen Mem-

bran in ihrem Modell entstand eine Akkumulation von Hexose-6-Phosphaten im Zytosol,

die vermutlich zu einem osmotischen Schaden führt. Blattner et al. demonstrierten, daß

Expression von Phosphoglycerat-Kinase im Zytosol zum Tod der amastigoten Parasiten

führt [8].

Die Biogenese der Glykosomen ähnelt, soweit untersucht, der Biogenese der Pero-

xisomen [78, 101]. Bei einigen glykosomalen Enzymen konnte gezeigt werden, daß auch

13

hier PTS1-Signale als Import-Signale wirken. Der zugehörige Rezeptor wurde kloniert

[20]. Jedoch sind die Sequenzen, die PTS1-abhängigen Import bewirken, nicht so strin-

gent, wie in den bisher untersuchten Systemen. So gibt es PTS1-Sequenzen, die Import

in Glykosomen bewirken, nicht jedoch in Peroxisomen der Säugetiere [9]. Die Analyse

der Kristallstruktur der Trypanosoma brucei Aldolase läßt vermuten, daß hier ein PTS2

vermittelter Import in die Glykosomen vorliegt [16].

14

2 Ergebnisse

2.1 Klonierung und Sequenzierung der Toxoplasma gondii Katalase

Die Existenz von Katalase in Toxoplasma gondii wurde vor knapp fünfzehn Jahren enzy-

matisch und elektrophoretisch nachgewiesen [95]. Weitere Schritte zur Charakterisierung

dieses Enzyms sind jedoch nie unternommen worden. Dies veranlaßte uns, gezielt nach

Katalase Sequenzen in der „expressed sequence tag“ (EST) Datenbank für das Toxoplasma

gondii Genom 2 zu suchen [1, 113]. Dort sind zwei Sequenzen verzeichnet (W63499 und

W99737), die Ähnlichkeit mit Katalasen anderer Species aufweisen.

Aus den beiden λ-Phagen Klonen der EST Datenbank wurde das Insert, das die T.

gondii spezifische Sequenz trägt, mit einem Helferphagen (VCSM13) in vivo exzidiert

und sequenziert. Ausgehend von dieser Sequenz wurde mittels „Rapid Amplification

of cDNA Ends“ (5‘RACE) weitere 300 Basenpaare gewonnen. Da jedoch keine größeren

Fragmente kloniert werden konnten, wurde mittels „nested“ reverser Transkriptase PCR

(RT-PCR) mit einem degenerierten Primer (Fdeg) und drei spezifischen Primern (R3, R4,

R5) weitere 700 Basenpaare kloniert und sequenziert. Durch eine weitere 5‘RACE konn-

ten weitere Basenpaare über das Startcodon hinaus bestimmt werden. Die Basenabfolge

der Katalase wurde mittels Sequenzierung vier unabhängiger Klone eines per RT-PCR

(F4, R0) gewonnen Fragmentes von 2480 bp bestätigt. Die zur Klonierung verwendeten

Methoden sind in Abb. 8 dargestellt. Die verwendeten Oligonukleotide sind in einer Ta-

belle in Materialien und Methoden auf S. 42 zusammengefaßt.

R7, R6

Fdeg

Phagen Sequenz

5’RACE

RT-PCR mit degenerierten Primern

5’RACE

R0R2, R1R5, R4 R3

F1160 1685 2480

R9

Abbildung 8: Methoden zur Klonierung der T. gondii Katalase. T. gondii Katalase wurde mitHilfe von verschiedenen Techniken kloniert. Die Balken zeigen an, welche Methode für welchenAbschnitt der Sequenz verwendet wurde. Die 5‘ und 3‘ UTRs (untranslated regions) sind weiß,die kodierende Region schwarz dargestellt. Die Pfeile geben die Position der Primer an.

2http://www.cbil.upenn.edu/ParaDBs/Toxoplasma

15

2.2 Analyse der Sequenz

Die vollständige DNA Sequenz ist in Abb. 9 dargestellt. Die cDNA kodiert für ein 502

Aminosäuren langes Protein mit einem molekularen Gewicht von 57,2 kDa. Ein Vergleich

der Aminosäuresequenz mit anderen eukaryotischen Katalasen zeigt starke Homologien

(Tabelle 2), während die DNA Sequenz eine vergleichsweise geringe Ähnlichkeit mit an-

deren Katalasen aufweist. Ein Alignment von Katalasen verschiedener Species mit der T.

gondii Katalase ist in Abb. 10 gezeigt.

Eine weitergehende Analyse der Aminosäuresequenz bestätigt, daß es sich in der Tat

um Katalase handelt. Beide Katalase Konsensus-Sequenzen 3 sind vorhanden: Die Signa-

tur des aktiven Zentrums (As 53-69) und die proximale Häm-Bindungsstelle (As 343-

351).

Konsensus Sequenz T. gondii SequenzProximale HämBindungsstelle

R-[LIVMFSTAN]-F-[GASTNP]-Y-x-D-[AST]-[QEH]

RMFSYIDTH

Signatur desaktiven Zentrums

[IF]-x-[RH]-x(4)-[EQ]-R-x(2)-H-x(2)-[GAS]-[GASTF]-[GAST]

FDRERIPERVVHAKGGG

Dreidimensionale Modelle eines Proteins können aus der Aminosäuresequenz durch

Vergleich mit bekannten Strukturen verwandter Proteine errechnet werden. Diese Struk-

turvorhersagen sind erstaunlich präzise [36,80,81]. Mit Hilfe geeigneter Software erfolgte

eine dreidimensionale Modellierung der T. gondii Katalase. Als Modellvorlage dienten

bekannte Strukturen der bovinen Katalase. Die folgenden Stereobilder können durch

leichtes Einwärtsschielen betrachtet werden. (Näheres zur Modellierung in Materialien

und Methoden).

Die Homologie zwischen der bovinen Katalase und der T. gondii Katalase beträgt

63 %, was für eine 3D-Modellierung gut geeignet ist. Die geringe Abweichung der Koh-

3PROSITE, Swiss Institute of Bioinformatics

Organismus GenBank Nr. Identische As. Positive As. Wahrscheinlichkeit

B. taurus S49452 63 % 75 % 10 −170

H. sapiens P04040 61 % 74 % 10 −168

C. elegans 690941A 57 % 72 % 10 −153

P. mirabilis P42321 53 % 69 % 10 −141

S. cerevisiae 115709 49 % 65 % 10 −124

Tabelle 2: Ergebnisse eines Alignments mittels PSI-Blast [2] von Katalasen fünf ausgewählter Or-ganismen.

16

GTG CGG CTC CTC GAA GGA CTG AGT GAA ACG CTG AGG TGC GCG TCT CGT GAA GGC CAC TGT 60TGC TTG TCC TCA CGG TGA AGG TCG GCC AGC CAG CTT TTG ACG GTA CGG AGA TTC TTC TGT 120TTT TGA CCC CGA AGG GAA ACG TGC GCG CCG TCA GCG AAA ATG ACT CAG GTT CCG CCC GTA 180

M T Q V P P VACA TTC CAG CAG TAT GGA CCG GTT ATC ACG ACC TCT GCT GGG AAC CCA GTC GAT GAC AAC 240T F Q Q Y G P V I T T S A G N P V D D NCAA AAC TCG GTA ACT GCT GGA CCC TAC GGC CCC GCG ATC CTG AGT AAC TTC CAT CTC ATC 300Q N S V T A G P Y G P A I L S N F H L IGAC AAG CTG GCC CAC TTC GAT CGA GAA CGC ATT CCC GAG CGC GTT GTG CAT GCC AAG GGC 360D K L A H F D R E R I P E R V V H A K GGGT GGC GCC TTT GGC TAT TTC GAG GTC ACT CAT GAC ATC ACC AGA TTC TGC AAA GCG AAG 420G G A F G Y F E V T H D I T R F C K A KCTG TTC GAG AAA ATC GGA AAG CGG ACG CCT GTG TTT GCA CGT TTT TCG ACG GTG GCT GGC 480L F E K I G K R T P V F A R F S T V A GGAG TCG GGG AGT GCG GAC ACC AGG CGC GAC CCG CGC GGC TTC GCA CTC AAG TTC TAC ACG 540E S G S A D T R R D P R G F A L K F Y TGAG GAG GGG AAC TGG GAC ATG GTT GGA AAC AAC ACT CCT ATC TTT TTC GTT CGA GAC GCC 600E E G N W D M V G N N T P I F F V R D AATA AAG TTC CCC GAC TTC ATT CAT ACG CAG AAG CGG CAT CCG CAA ACG CAC CTC CAC GAC 660I K F P D F I H T Q K R H P Q T H L H DCCG AAC ATG GTG TGG GAT TTC TTC TCG CTC GTT CCG GAA AGT GTG CAT CAA GTG ACC TTC 720P N M V W D F F S L V P E S V H Q V T FCTG TAC ACG GAC CGT GGC ACA CCG GAC GGC TTC CGC CAT ATG AAT GGC TAC GGG AGT CAC 780L Y T D R G T P D G F R H M N G Y G S HACG TTC AAA TTC ATC AAC AAA GAC AAC GAA GCC TTT TAT GTC AAG TGG CAC TTC AAG ACA 840T F K F I N K D N E A F Y V K W H F K TAAC CAA GGA ATC AAG AAC CTG AAC AGA CAG CGC GCA AAA GAA CTC GAG AGC GAA GAT CCT 900N Q G I K N L N R Q R A K E L E S E D PGAC TAC GCG GTT CGT GAC CTG TTC AAC GCC ATT GCC AAG CGA GAG TTT CCC TCT TGG ACC 960D Y A V R D L F N A I A K R E F P S W TTTC TGT ATT CAG GTA ATG CCC TTG AAA GAT GCA GAG ACG TAC AAA TGG AAT GTC TTT GAC 1020F C I Q V M P L K D A E T Y K W N V F DGTG ACC AAA GTG TGG CCG CAC GGA GAC TAC CCA CTC ATC CCG GTC GGA AAA CTC GTG CTG 1080V T K V W P H G D Y P L I P V G K L V LGAT CGC AAC CCA GAA AAC TAT TTC CAA GAC GTG GAA CAA GCA GCT TTT GCG CCA GCT CAT 1140D R N P E N Y F Q D V E Q A A F A P A HATG GTG CCA GGG ATT GAA CCG AGC GAA GAT CGC ATG CTG CAG GGA CGC ATG TTC TCC TAC 1200M V P G I E P S E D R M L Q G R M F S YATC GAC ACT CAT CGG CAC AGA CTT GGC GCC AAT TAC CAT CAG ATT CCT GTG AAC CGC CCG 1260I D T H R H R L G A N Y H Q I P V N R PTGG AAC GCC CGT GGG GGC GAC TAC TCC GTC CGC GAT GGT CCA ATG TGC GTC GAC GGG AAC 1320W N A R G G D Y S V R D G P M C V D G NAAA GGG TCT CAG CTG AAT TAC GAA CCG AAC AGT GTG GAC GGC TTT CCA AAG GAA GAC AGA 1380K G S Q L N Y E P N S V D G F P K E D RAAT GCT GCT GTG TCG GGA ACG ACC ACA GTG AGT GGC ACG GTC GCG TGC CAT CCT CAA GAG 1440N A A V S G T T T V S G T V A C H P Q ECAC CCC AAC AGT GAC TTT GAG CAG CCA GGG AAC TTT TAT AGG ACG GTC TTG AGT GAG CCG 1500H P N S D F E Q P G N F Y R T V L S E PGAG AGG GAA GCG CTC ATT GGC AAC ATC GCC GAG CAT CTC AGG CAG GCG AGA CGA GAT ATT 1560E R E A L I G N I A E H L R Q A R R D ICAA GAG CGA CAG GTG AAG ATT TTT TAC AAG TGC GAT CCA GAG TAT GGC GAG CGC GTC GCT 1620Q E R Q V K I F Y K C D P E Y G E R V ACGA GCC ATC GGT TTG CCG ACT GCG GCG TGC TAC CCA GCC AAG ATG TAG GCG TGC GTT GTC 1680R A I G L P T A A C Y P A K M *CCG CTT GAG CCA GAA GAC CAA CAA TAG AGG GAC TAA ATA TGC GCA AGG AAG GAA GAC AGG 1760ACC CTT TCG AAG ACG GAA AAC ACG CAG TCT GAA TTC TTG GCG CTG AGG GGA CCA ACG GGT 1820TCG TCG CCT TGT GTG ACA ACG ACG AGT AAA AAG ACA AAG CGA ACA GCG ATG ACC GTA GCG 1880TTC GTC CAC CTG CGT AAA TGT GGC TTA TCT CTG TCA CGA TGC GCA CAA GCG TTT GGT CAT 1940CGC GTA ATT ACA GAT AGT TGT GTA GTG ACT TGC TGC TGT TGC GTC TTC CAA CAC TTG TAG 2000TTA GAG AAA TGC ATG TGT ATG GGT AAG CTT GCA TGA ACT GCT ACA TAT CCA TGG TAA ACC 2060AAT TTG ACT GCA GGT GTC GGC GTT TAC GAC GTC AGT TTC ACA TTC TTG TTC TTG ATT TCC 2120TTC TTG CAA TCA CTT GCA CTC TGG CAA TTT TTG GAA GGG AAA GGA AAT GTG AGG GTG GGA 2180GGG CTC AGC ATC CTC TTC CAG TGG TCC TGC CGT GTC CAG TTT GCG CCT AAA GGT AGA GAT 2240CGC GGG GGG GGT CTC AGG AAT CTA TCC GCG TTT TTT CTC AAA GGA TTT GCA TTT ACT GTT 2300TCT GAA AGG TGA AAG ACC GGG TGT ATG TGC ACC CAC CTG AGC CAA CCC AGC ATT TCG TAA 2360TTC CAT CTG CAG CGT GTT TCC CCC TTT TCA AAG CGG ACC TTT TGT GAG AAA ACG TTC CCG 2420CGG GAA CAG CAC TTT CTG AAC GAG AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA 2480

Abbildung 9: cDNA Sequenz der T. gondii Katalase. Die komplette cDNA Sequenz der T. gondiiKatalase ist in der „Genbank“- Datenbank unter der Zugriffsnummer AF136344 gespeichert. Dieunterstrichenen Basenpaare entsprechen der Position der zur Klonierung verwendeten Primer.

17

1 10 20 30 40T.gondii MTQVPPVTFQQYGPVITTSAGNPVDDNQNSVTAGPYGPAILSNFHLIDKH.sapiens MADSRDPASDQMQHWKEQRAA.KAD.L..G.....G.KL.VI.V..R..LLVQDVVFT.EC.elegans MPNDPSDNQLKTYKET--YPKPQ.....N.A.IYSKTAVL...RR..MLMQDVVYM.ES.cerevisae MSKLGQEKNEVNYSDVREDR.V.N.T.N.INEPFVTQRI.EH..LL.QDYN...S

50 60 70 80 90 100T.gondii LAHFDRERIPERVVHAKGGGAFGYFEVTHDITRFCKAKLFEKIGKRTPVFARFSTVAGESH.sapiens M.................A.............KYS...V..H...K..IAV.........C.elegans M.................A..H.........SKY...DI.N.V..Q..LLI.....G...S.cerevisae ....N..N..Q.NP..H.S.........D...DI.GSAM.S......KCLT.....G.DK

# ># : # : / ++- --- /

110 120 130 140 150 160T.gondii GSADTRRDPRGFALKFYTEEGNWDMVGNNTPIFFVRDAIKFPDFIHTQKRHPQTHLHDPNH.sapiens .....V.......V.....D....L.........I..P.L..S...S...N.....K..DC.elegans .....A.......I..........L.........I..P.H..N.......N.....K...S.cerevisae .....V.......T........L.W.Y....V..I..PS...H.......N...N.R.AD

++ # / \\ ++ + ++ ++> >

170 180 190 200 210 220T.gondii MVWDFFSLVPE---SVHQVTFLYTDRGTPDGFRHMNGYGSHTFKFINKDNEAFYVKWHFKH.sapiens .....W..R..---.L...S..FS...I...H............LV.ANG..V.C.F.Y.C.elegans .IF..WLHR..---AL...M..FS...L...Y............MV...GK.I...F.F.S.cerevisae .F...LTT-..NQVAI...MI.FS.....ANY.S.H..SG..Y.WS..NGDWH..QV.I.

o + \+ o o o \ < o \230 240 250 260 270 280

T.gondii TNQGIKNLNRQRAKELESEDPDYAVRDLFNAIAKREFPSWTFCIQVMPLKDAETYKWNVFH.sapiens .D......SVED.AR.SQ.....GI........TGKY....FY....TFNQ...FPF.P.C.elegans PT..V...TVEK.GQ.A.S....SI.......E.GD..V.KMF....TFEQ..KWEF.P.S.cerevisae .D......TIEE.TKIAGSN...CQQ...E..QNGNY....VY..T.TER..KKLPFS..

\290 300 310 320 330 340

T.gondii DVTKVWPHGDYPLIPVGKLVLDRNPENYFQDVEQAAFAPAHMVPGIEPSEDRMLQGRMFSH.sapiens .L......K............N...V...AE...I..D.SN.P....A.P.K.....L.AC.elegans ..............E...M..N...R...AE...S..C...I.....F.P.K.....I..S.cerevisae .L.....Q.QF..RR...I..NE..L.F.AQ........STT..YQ.A.A.PV..A.L..

\o\o # < #

350 360 370 380 390 400T.gondii YIDTHRHRLGANYHQIPVNRPWNARGGDYSVRDGPMCVDGNKGSQLNYEPNSVDGFPKEDH.sapiens .P........P..LH....C.YR..VAN.Q-......MQD.Q.GA...Y...FG--AP.QC.elegans .T...F....P..I.L...C.YRS.AHNTQ-...A.AY-D.QQHA..FF...FN--YGKTS.cerevisae .A.A..Y...P.F......C.YASKFFNPAI.....N.N..F..E.T.LA.DKSYTYIQQ

# - :/

410 420 430 440 450 460T.gondii RNAAVSGTTTVSGTVACHPQEHP--NSDFEQPGNFYRTVLSEP-EREALIGNIAEHLRQAH.sapiens QPS.LEHSIQY..E.RRFNTAND--D-NVT.VRA..VN..N.E-Q.KR.CE...G..KD.C.elegans .PDVKDT.FPAT.D.DRYESGDD--.-NYD..RQ.WEK..DTG-A..RMCQ.F.GP.GECS.cerevisae DRPIQQHQEVWN.PAIPYHWATSPGDV..V.AR.L..VLGKQ.GQQKN.AY..GI.VEG.

o \ o\ \470 480 490 500

T.gondii RRDIQERQVKIFYKCDPEYGERVARAIGLPTAACYPAKMH.sapiens QIF..KKA..N.TEVH.D..SHIQALLDKYNAEKPKNAIHTFVQSGSHLAAREKANLC.elegans HDF.IKGMIDH.S.VH.DF.A..KALIQKQARSHIS.cerevisae CPQ..Q.VYDM.ARV.KGLS.AIKKVAEAKHASELSSNSKF

Abbildung 10: Sequenzvergleich verschiedener Katalasen. Katalasen der folgenden Spezies sindin einem Alignment dargestellt: T. gondii (GenBank Zugriffsnummer AF136344 ), H. sapiens (NCBZugriffsnummer 179950), C. elegans (NCB Zugriffsnummer 1078837) und S. cerevisae (NCB Zu-griffsnummer 115709). Punkte zeigen an, daß die As. mit denen der T. gondii Katalase identischsind, wohingegen ein Bindestrich eine Lücke anzeigt. Die Symbole unter dem Alignment wei-sen auf mögliche Funktionen der As. hin: Distale Häm Bindungsstelle ”>”, Proximale Häm Bin-dungsstelle ”<”; Bindung der Propionat-Seitenketten des Häm ”:”; As. in der Nähe des aktivenZentrums ”# ”; Bindungspartner des NADPH ”o”; As., die am katalytischen Mechanismus teil-nehmen ”/”; Säurereste in der Umgebung des NADPH ”\”; As. des Substrat-Kanals ”+”; As., diemit den anderen Homomeren interagieren ”-”. PTS-Signale sind fett gedruckt. Die Signatur desAktiven Zentrums (aa 53-69) und die Proximale Häm-Bindungs-Signatur (aa 343-351) sind unter-strichen. Das Alignment wurde mittels ClustalW1.73 durchgeführt [107].

18

Funktion Aminosäuren

Aktives Zentrum distale Hämbindungspartner: F142, F150, F53

proximale Hämbindungspartner: H207, R343

Interaktion mit Propionatgruppe: H207, R343

Umgebung des aktiven Zentrums Y347, D54, H64, V135, F323, S346A und L50M

Katalytischer Mechanismus H64, N137, S103, Y347

NADPH Bindungsstelle R192, T190, N202, H294, H183, Q435, W292, H224, V443

Umgebung des NADPH E448, F187, T139, P140, Y204, K226, Q271, P293, V291,

F439, L444, T190S und E448Q

Substratkanal V105, A106, D117, P118, F142, F143, F150, F153, I154,

V185, L188, Q157, und K158

Tetramerinteraktion L50, D54, F53, D349 und R55

PTS1 A500, K501, M502

Tabelle 3: Funktionell relevante Aminosäurereste der T. gondii Katalase.

lenstoffgerüste in der Übereinanderprojektion dieser Katalasen in Abb. 11 unterstreicht

dies.

Die Anordnung der Sekundärstrukturen weist einige Besonderheiten auf (Abb. 13).

Acht antiparallele β-Faltblätter schirmen die Hämgruppe auf einer Seite ab. Die ande-

re Seite des Häms ist frei zugänglich und bildet den Substratkanal (s. u.). Die NADPH -

und die Hämgruppe befinden sich in relativer Nähe, was ein Zusammenwirken beim ka-

talytischen Mechanismus wahrscheinlich macht. Dabei soll NADPH die Rolle des Elek-

tronendonators übernehmen und die Bildung des inaktiven „Compound II“ rückgängig

machen [7]. Der lange „wrapping loop“, der keiner eindeutigen Sekundärstruktur zu-

geordnet werden kann, ist auf der rechten Seite zu sehen. Er dient der Interaktion mit

den benachbarten Monomeren [43]. Der C -Terminus ist in dieser Abbildung oben links

als α-Helix zu sehen. Er bildet das peroxisomale Targeting-Signal. Da Katalase erst nach

der Proteinfaltung und Zusammenbau des Tetramers in die Peroxisomen transportiert

wird [112], ist seine exponierte Lage nachvollziehbar.

Die Darstellung der Oberfläche eines Katalase Monomers in Abb. 12 zeigt, wie kom-

pakt die Katalase in ihrem Kernbereich gefaltet ist. In der oberen Mitte ist ein Teil des

NADPH -Moleküls zu sehen, das von der Oberfläche zugänglich ist.

Ein Vergleich der T. gondii Katalase Sequenz mit anderen Katalasen zeigt, daß nicht

nur die Sekundärstrukturen ähnlich sind. Aminosäuren mit entscheidenden Funktionen

sind hoch konserviert. Eine Übersicht über diese Aminosäuren bietet Tabelle 3.

Aminosäurereste der T. gondii Katalase, die das aktive Zentrum bilden, sind identisch

mit den entsprechenden Aminosäuren der humanen Katalase. Alle weiteren Aminosäu-

19

N

C

WL

Abbildung 11: Projektion des Kohlenstoffrückgrats verschiedener Katalasen. Das Kohlen-stoffrückgrat der T. gondii Katalase (grün) wurde auf die Modellvorlagen der verschiedenen Un-tereinheiten der bovinen Katalase projiziert. Beachtenswert ist die geringe Abweichung im zen-tralen Bereich des Proteins. Der N- und C-Terminus sind entsprechend bezeichnet. WL: „wrap-ping loop“ rot: Häm und NADPH.

ren aus der Umgebung des aktiven Zentrums sind ebenfalls konserviert, mit Ausnahme

geringer Abweichungen (S346A und L50M) [33]. Weiterhin sind Aminosäuren konser-

viert, die im katalytischen Mechanismus eine Rolle spielen [52]. Drei der Aminosäuren

in der Nähe des aktiven Zentrums (L50, F53, D54) gehören zum benachbarten Monomer.

Die sterischen Verhältnisse im aktiven Zentrum sind in Abb. 14 dargestellt.

Einige Katalasen, wie z. B. humane und bovine Katalase, binden NADPH als Cofak-

tor. NADPH soll dabei unter anderem die Bildung des „Compound II“, ein inaktiver

Zustand im katalytischen Zyklus, verhindern [39, 46]. Konservierte Aminosäuren lassen

darauf schließen, daß T. gondii Katalase auch NADPH binden kann (Abb. 15). Die Säu-

rereste der möglichen NADPH -Bindungsstelle und deren Umgebung sind identisch mit

jenen der humanen Katalase mit Ausnahme von T190S und E448Q [33].

Das Substrat H2O2 diffundiert zum aktiven Zentrum der Katalase durch einen circa

30 Å langen Kanal (Abb. 16) [33]. Aminosäuren, die vermutlich die Wände dieses Kanals

bilden, sind identisch mit der humanen Sequenz. Dies weist darauf hin, daß die Band-

20

Abbildung 12: Oberflächen-Modell der T. gondii Katalase. Dieses Modell zeigt die errechneteOberflächenstruktur der T. gondii Katalase. grau: Kohlenstoff; blau: Stickstoff; rot: Sauerstoff.

Abbildung 13: α-Helices und β-Faltblattstrukturen der T. gondii Katalase. Ein β-Barrel ausacht antiparallelen β-Faltblättern schirmt die Häm-Gruppe zur einen Seite ab. Die Häm undNADPH Bindungsstellen sind in relativer Nähe. Der lange „wrapping loop“ auf der rechtenSeite interagiert mit den benachbarten Monomeren. Am exponierten C-Terminus befindet sichdas peroxisomale Targeting-Signal. rot: α-Helices; grün/blau: β-Faltblattstrukturen; grau: coils;gelb:NADPH und Häm.

21

Abbildung 14: Aktives Zentrum der T. gondii Katalase. rot: Häm; pink: Aminosäuren des be-nachbarten Monomers; blau: Aminosäuren, die am katalytischen Mechanismus teilnehmen; grün:Bindungspartner des Häm; grau: weitere Aminosäuren aus der Umgebung des Häm.

Abbildung 15: Aminosäuren aus der Umgebung der NADPH-Bindungsstelle der T. gondii Ka-talase. rot: NADPH ; grün: NADPH -Bindungspartner; grau: Nähere Umgebung des NADPH .

22

Abbildung 16: Substrat-Kanal der T. gondii Katalase. Aminosäuren, die den Substratkanal bil-den, der von der Oberfläche des Proteins zum Häm (gelb) führt sind hier im Kugelmodell darge-stellt (blau). α-Helices und β-Faltblätter sind analog zu Abb. 13 dargestellt.

breite möglicher Substrate ähnlich ist [118].

Die meisten Katalasen sind Homotetramere, mit Ausnahme der prokaryontischen

Mangan-Katalasen. Aminosäuren, die in Proteus mirabilis Katalase Interaktionen zwi-

schen den einzelnen Monomeren vermitteln, sind identisch mit den entsprechenden Säu-

reresten der T. gondii Katalase (L50, D54, F53, D349 und R55). Humane und bovine Kata-

lase haben zusätzlich einen längeren C-terminus, der die gegenseitige Bindung der ein-

zelnen Monomere stabilisiert [33]. In Abb. 17 sind die vier Untereinheiten unterschiedlich

eingefärbt, um die Lage der einzelnen Monomere zueinander deutlich zu machen.

Weiterhin besitzt T. gondii Katalase ein peroxisomales Targeting Signal (PTS1) am C-

Terminus. Die letzten drei Aminosäuren (-AKM) stimmen mit dem Konsensusmotiv für

peroxisomale Targeting Signale (PTS) der Klasse 1 überein. Experimentell wurde bereits

in Affennierenzellen (CV1) gezeigt, daß –AKM als PTS1 wirken kann, wenn es an Chlor-

amphenicol-Acetyltransferase gekoppelt ist [106]. Die exponierte Lage des PTS1 in der

3D-Struktur ist Vorbedingung für den peroxisomalen Transport.

23

Abbildung 17: T. gondii Katalase als Homotetramer. Unten: Die vier Monomere sind in den Far-ben grün, blau, pink und orange dargestellt, die Häm-Gruppe in gelb, das NADPH in rot. Oben: DieLage der einzelnen Monomere zueinander wird durch Betrachtung der Sekundärstrukturelemen-te deutlich.

24

RH Vero

102

81

47

32

30

27

GST-Kat

alase

rKat

in C

HO

Abbildung 18: Western Blot mit Antiserum gegen ein T. gondii-Katalase-GST Fusionsprotein.Das Antiserum gegen die T. gondii Katalase reagiert mit den Parasitenlysat (Spur 1), das aus einerVero-Zellkultur stammt. Die negative Kontrolle mit einer nicht-infizierten Vero-Zellkultur (Spur2) zeigt keine Reaktion. Als positive Kontrolle fungiert das GST-Katalase Fusionsprotein (Spur 3)und die in CHO-Zellen exprimierte rekombinante T. gondii-Katalase.

2.3 Western Blot mit Antiserum gegen T. gondii Katalase

Für die Produktion eines Antiserums wurde ein Fusionsprotein aus der Glutathion-S-

Transferase (GST) von Schistosoma mansoni mit den Aminosäuren 335-502 der T. gondii

Katalase hergestellt (Molekulargewicht: 47 kDa). Diese Region der Katalase wurde als

Antigen gewählt, da sie die größten Unterschiede gegenüber der humanen Katalase Se-

quenz aufweist. Die Herstellung und Testung des Antiserums ist im Kapitel Materialien

und Methoden genauer beschrieben.

Wie erwartet, reagiert das Antiserum mit dem rekombinantem GST-Katalase Fusions-

protein, das bei 47 kDa läuft (Abb. 18, Spur 3). Eine einzelne Bande bei 63 kDa erkennt

das Antiserum im Lysat ganzer Parasiten (Abb. 18, Spur 1). Die Größe dieses Proteins

ist im Einklang mit der vorhergesagten Größe von T. gondii Katalase (57,2 kDa). Zudem

läuft es in derselben Höhe wie rekombinante in CHO-Zellen exprimierte T. gondii Ka-

talase (Abb. 18, Spur 4). Kein Signal gibt es im Lysat der unveränderten Wirtszellen

(Abb. 18, Spur 2) und bei Inkubation mit prä-Immun-Serum (nicht dargestellt). Somit

reagiert das Antiserum mit einem 63 kDa T. gondii Protein, das wahrscheinlich der Kata-

lase entspricht.

25

Abbildung 19: Immunfluoreszenz der T. gondii Katalase. Dargestellt ist ein Immunfluoreszenz-Assay mit einem aufgereinigten Antikörper gegen die T. gondii Katalase an intra- und extrazellu-lären Parasiten. a: Intrazelluläre Parasiten replizieren sich in der Wirtszelle und bilden dabei eineRosette in der Vakuole. Das anteriore Ende der Parasiten zeigt nach außen. b: Eine Schemazeich-nung der Parasiten in der Vakuole verdeutlicht deren Position in der Phasenkontrastdarstellung.In einem Parasiten wurde zusätzlich der Nukleus (N) und die Katalase enthaltenden Strukturendargestellt. c und d: In extrazellulären Parasiten erscheint das Signal kompakter als in intrazellu-lären Parasiten, was möglicherweise jedoch ein Fixationsartefakt ist. Skalierung 2µm.

2.4 Lokalisation in der Immunfluoreszenz

In der Immunfluoreszenz markiert das anti-GST-Katalase Antiserum vesikuläre Struk-

turen im vorderen Ende des Parasiten (Abb. 19). Zusätzlich besteht ein diffuses Signal

im Inneren des Parasiten. Dieses Signal ist spezifisch für Katalase, da es verschwindet,

wenn das Antiserum zuerst mit rekombinanten Protein inkubiert wird. Vermutlich ent-

spricht diese diffuse Verteilung einem Pool von Katalase im Zytosol des Parasiten. Der

Immunfluoreszenz-Assay mit einem kommerziell erhältlichen monoklonalen Antikörper

gegen die Glutathion-S-Transferase ergibt kein Signal in T. gondii.

Werden zwei verschiedene Antikörper bei der Immunfluoreszenz verwendet, kann

eine Kolokalisation von Katalase mit bisher bekannten Zellorganellen ausgeschlossen

werden. In Abb. 20 überlappt das Signal für Katalase (grün) mit keiner der Zellorga-

nellen (Rhoptrien, Mikronemen, Granula densa und den Apikoplasten). Daraus läßt sich

schließen, daß Katalase in einem eigenständigen Kompartiment innerhalb von Toxoplas-

ma gondii vorkommt.

26

Abbildung 20: Kolokalisation der T. gondii Katalase mit verschiedenen subzellulären Orga-nellen. Katalase (in grün) kolokalisiert nicht mit den bekannten subzellulären Kompartimentenvon T. gondii. Mikronemen (a), Rhoptrien (c) und Dense granules (e) (hier rot dargestellt) wur-den mit monoklonalen Antikörpern markiert. Die entsprechenden Phasenkontrastbilder sind in(b) und (d) gezeigt. Die Anfärbung der Apikoplast DNA (f, Pfeile) wurde mit 4’,6-Diamidino-2-Phenylindol erreicht. Die Pfeilspitzen in (f ) zeigen auf die Nuklei der Parasiten. Skalierung 2µm.

27

Abbildung 21: Katalase Nachweis mitder DAB Präzipitationstechnik. Elek-tronenmikroskopische Aufnahmen in-trazellulärer Parasiten (a und b). MMitochondrium; N, Nukleus; p, Pero-xisom (Skalierung 0,5µm). Das Inset in azeigt eine vergrößerte Darstellung einesPeroxisoms (Skalierung 0,5µm). In derLichtmikroskopie erscheint das DAB-Präzipitat als dunkle Spots im Phasen-kontrastbild (c, Pfeile). In der Nomarski-Optik (d) stellen sich Parasiten besserdar.

2.5 Lokalisation mittels Histochemie

Katalase kann durch die DAB-Präzipitationstechnik licht- und elektronenmikroskopisch

nachgewiesen werden [22]. Diaminobenzidin (DAB) bildet mittelsH2O2 und Katalase ein

instabiles Zwischenprodukt, das spontan zu einem braunen Niederschlag oxidiert, wenn

folgende Bedingungen vorliegen: eine milde Fixierung, hohe Substrat (H2O2 ) Konzentra-

tion und eine alkalische Umgebung. Spezifisch hemmbar ist dieser Prozess mit Katalase

Inhibitoren, wie z. B. 20 mM 3-Amino-1,2,4-Triazol (AT) [21].

In der Lichtmikroskopie kann das Reaktionsprodukt im Inneren des Parasiten gefun-

den werden (Abb. 21 b, c). Dieses Präzipitat ist spezifisch, da es bei gleichzeitiger Inku-

bation mit AT nicht auftritt. Elektronenmikroskopisch finden sich 100 bis 300 nm große,

spezifische Präzipitate in juxtanukleärer Position, die meist eine sehr geordnete, kristall-

ähnliche Struktur aufweisen (Abb. 21, a, b und Inset). Zudem tritt das Reaktionsprodukt

in den Cristae der Mitochondrien auf. Wird das Substrat H2O2 in der Präzipitationsreak-

tion weggelassen oder der Inhibitor AT zugegeben, verschwinden die spezifischen Prä-

zipitate, das Signal in den Cristae der Mitochondrien jedoch bleibt. Folglich ist das Signal

in den Mitochondrien ein unspezifisches Reaktionsprodukt und kann wahrscheinlich auf

dort ansässige Peroxidasen [22] zurückgeführt werden.

2.6 Expression von Katalase in CHO-Zellen

Die funktionelle Bedeutung des C -terminalen peroxisomalen Targeting Signals der T.

gondii Katalase kann durch Expression rekombinanter Proteine in Säugetierzellen und

28

Feststellung der Lokalisation mittels Immunfluoreszenz, getestet werden. Dafür eigenen

sich CHO-Zellen im besonderen, da sie ein gut definiertes peroxisomales Kompartiment

aufweisen [119]. Die Lokalisation des peroxisomalen Kompartiments in der Immunfluo-

reszenz kann mit einem anti-SKL Antikörper gezeigt werden (Abb. 22e). Dieser Antikör-

per, der das C -terminale Tripeptid S-K-L erkennt, reagiert mit Peroxisomen vieler ver-

schiedener Organismen [35].

Transiente Expression der kompletten T. gondii Katalase führt zu punktförmigen Si-

gnalen im Zellkörper, die mit einer peroxisomalen Lokalisation im Einklang stehen (Abb.

22c). Werden jedoch die letzten drei Aminosäuren der Katalase entfernt, verteilt sich das

Signal diffus über die ganze Zelle, was charakteristisch für die zu erwartende zytosoli-

sche Lokalisation ist (Abb. 22d). Somit ist das PTS1 der T. gondii Katalase, zumindest in

einem heterologem System, funktionell von Bedeutung.

2.7 Expression eines Reportergens in CHO-Zellen

Die Frage, ob ein PTS1-Motiv ausreichend ist, um Katalase in Peroxisomen zu importie-

ren, kann durch einen Suffizienztest beantwortet werden. Hierbei wird das vermutliche

PTS1-Motiv an ein Reportergen angehängt und dieses in CHO-Zellen exprimiert.

Expression von Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) in CHO-Zellen führt zu

einer zytosolischen Lokalisation (Abb. 22b) [106]. CAT-SKL hingegen, das CAT-Gen mit

dem PTS1-Motiv –SKL, ergibt ein peroxisomales Muster (nicht dargestellt), da das Prote-

in in die Peroxisomen importiert wird [106].

Fusioniert man die drei letzten Aminosäuren der T. gondii Katalase (-AKM) an das

CAT-Gen, ergibt sich ebenso eine peroxisomale Lokalisation (Abb. 22a). Diese Experi-

mente zeigen, daß das PTS1 der T. gondii Katalase ausreicht, um den Import eines zyto-

solisches Reporterproteins in die Peroxisomen zu veranlassen.

29

CAT AKM CAT

T. gondii Katalase AKM T. gondii Katalase ∆500-502Abbildung 22: Import der T. gondii Ka-talase und CAT in CHO-Zellen. Dieperoxisomale Lokalisation des CAT-AKM (a) und die diffuse zytosolischeVerteilung der nativen CAT ohne PTS(b) in der Immunfluoreszenz. In CHO-Zellen exprimierte T. gondii Katalasezeigt eine gepunktete Verteilung (c).Deletion der letzten drei Aminosäurenführt zu einer zytosolischen Lokalisati-on (d). In (e) ist das typische peroxiso-male Signal des anti-SKL Antikörpersgezeigt. Skalierung 5µm.

30

3 Materialien und Methoden

3.1 Bakterienstämme

DH5α (Gibco BRL): F−−φ80d lacZ ∆M15∆(lacZYA-argF) U169 endA1 recA1 hsdR17(r−Km+K)

deoR thi-1 supE44 λ− gyrA96 relA1

XL1 Blue (Stratagene, La Jolla, CA): recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac

[F’ proAB lacIqZ ∆M15 Tn10 (Tetr)]

3.2 Parasitenstämme

In der vorliegenden Arbeit wurde ausschließlich der RH-Stamm verwendet. Diese Para-

sitenlinie wird seit über 50 Jahren (Sabin und Feldman 1946) im Labor passagiert und hat

die Fähigkeit zur Zystenbildung in vivo weitgehend verloren [88]. In vitro jedoch ist eine

Induktion der Zystenbildung z. B. durch Hitzeschock noch möglich [100].

3.3 Lambda-Phagen

Folgende Lambda-Phagen-Klone aus der T. gondii EST Datenbank wurden verwendet:

dbEST ID gi Nummer Accession EST ID Library

571279 1370813 W63499 TgESTzy67b01.r1 ME49 tachyzoite

607975 1435613 W99737 TgESTzz06g03.r1 ME49 tachyzoite

3.4 Zellinien

Folgende Zellinien wurden in der vorliegenden Arbeit verwendet:

Vero-Zellen African green monkey kidney cells (ATCC-Nr. 4: CCL81)

CHO-Zellen Chinese hamster ovary cells K1 (ATCC-Nr.: CCL 61)

HFF-Zellen Human foreskin fibroblasts. Die Primärkultur dieser Fibroblasten

stammt aus der Yale University Dermatology Core Facility. In dieser

Arbeit verwendete Zellen waren in der 10. Passsage.

4ATCC: American Type Culture Collection

31

3.5 Plasmide

Folgende Plasmide wurden in der vorliegenden Arbeit verwendet:

Klonierung pGEM-T (Promega, Madison, WI)

pBluescript II SK+ (Stratagene, La Jolla, CA)

Expression in E. coli pGEX-4T-1 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway,

NJ)

Expression in CHO-Zellen DNA3.1/Zeo(+) (Invitrogen Carlsbad, CA)

3.6 Primäre Antikörper

Folgende monoklonale Antikörper wurden freundlicherweise von J. F. Dubremetz, Lille,

Frankreich, zur Verfügung gestellt:

T3 4A7 monoklonaler Maus-Antikörper gegen das Rop2,3,4-Antigen

T6 2H11 monoklonaler Maus-Antikörper gegen das Gra3-Antigen

D2 R3 monoklonaler Maus-Antikörper gegen das Mic2-Antigen

Folgende polyklonale Antiseren wurden in dieser Arbeit verwendet:

Rabbit anti-CAT (5prime 3prime Inc., Boulder, CO)

Rabbit anti-SKL (Zymed Laboratories Inc., San Francisco, CA)

3.7 Sekundäre Antikörper

Folgende sekundäre Antikörper wurden in dieser Arbeit verwendet:

FITC linked goat anti-rabbit-IgG (Calbiochem-Novachem Corp. La Jolla, CA)

Rhodamine-linked goat anti-mouse-IgG (Roche Molecular Biochemicals)

HRP-conjugated goat anti-rabbit-IgG (Calbiochem-Novachem Corp. La Jolla, CA)

3.8 Kulturbedingungen für Zellinien

Alle Inkubationen fanden bei 37˚ C in 5 % CO2 Atmosphäre statt. Alle Zellkulturmedien

und Zusätze wurden von der Media Core Facility des Department of Cell Biology (Yale

University, New Haven, CT) hergestellt.

Vero-Zellen Minimum Eagle Medium (MEM) + 7 % FBS + Penicillin/Streptomycin

HFF-Zellen αMEM + Glutamin + 7 % FBS + Penicillin/Streptomycin

CHO-Zellen αMEM + Glutamin + 3.5 % FBS + Penicillin/Streptomycin

32

3.9 Passagieren der Zellinien

Um eine konfluente Zellkultur auf weitere Kulturschalen (Falcon, Ø 10 cm) aufzuteilen,

wurden die anheftenden Zellen mit 5 ml sterilem PBS-Puffer mehrmals gewaschen. Nach

kurzer Inkubation (5 min) wurde der PBS-Puffer entfernt und durch 1 ml Trypsin-Lösung

(Gibco-BRL) ersetzt. Nach kurzer Inkubation bei 37˚ C für 2 min wurden die Zellen in

12 ml angewärmten Kulturmedium resuspendiert und im Verhältnis 1 : 4 bis 1 : 6 auf neue

Kulturschalen verteilt. Alternativ wurden 2 ml dieser Suspension auf einer 6-well Platte

gleichmäßig verteilt. Die durchschnittliche Zeit bis zur erneuten Konfluenz der Zellen

betrug für CHO- und Vero-Zellen etwa 2-3 Tage, für HFF-Zellen eine Woche.

3.10 Passage der Parasiten in der Zellkultur

Etwa 5x106 Parasiten wurden zu einer 80 % konfluenten Vero-Zellkultur in einer 10 cm

Kulturschale hinzugegeben und für 2-3 Tage bei 37˚ C in 5 % CO2 Atmosphäre inkubiert.

Während dieser Zeit vermehren sich die Parasiten in den Wirtszellen. Das Kulturmedium

wurde abgesaugt, die Zellen mit PBS-Puffer gewaschen, mit einem Teflon-beschichteten

Schaber abgekratzt und in 2 ml PBS-Puffer resuspendiert. Die Zellsuspension wurde mit

Hilfe einer Spritze (3 ml Luer Lock) durch eine 19 Gauge Nadel getrieben. Dadurch wer-

den die Wirtszellen zerstört, während die Parasiten intakt bleiben. Das Lysat wurde ab-

zentrifugiert (5 min bei 1500 rpm in einem Beckmann Swingout-Rotor), das Sediment in

1 ml PBS-Puffer resuspendiert und die Parasitenzahl in einer Zählkammer bestimmt.

3.11 In vivo Exzision

Die Klone aus der EST Datenbank (W63499 und W99737) lagen in einem Lamda ZAP II

Vektor (Stratagene, La Jolla, CA) vor. Durch Koinfektion mit einem Helferphagen kann

das pBluescript Phagemid, das die EST-Klone enthält, aus dem Lambda ZAP II Vektor

(Abb. 23) ausgeschnitten werden und als Plasmid in E. coli propagiert werden [93].

Diese „In vivo Exzision“ ist abhängig von DNA Sequenzen im Lambda ZAP II Vektor,

sowie von Hilfsproteinen eines M13 Phagen oder F1 Phagen. Die Proteine des F1 Pha-

gen erkennen eine Region der DNA, die normalerweise der „origin of replication“ für

den positiven DNA-Strang in einem F1 Phagen ist. Dieser Bereich kann jedoch in eine

Initiations- und eine Terminations-Region aufgeteilt werden [25]. Zwischen diese beiden

Regionen ist im Lambda Zap II Vektor der pBluescript Vektor als Träger der ESTs kloniert.

Um nun die λ-Phagen DNA den Proteinen des F1 Phagen zugänglich zu machen,

wird ein E. coli Stamm mit beiden Phagen gleichzeitig infiziert. In E. coli erkennen nun

33

A - J c1857pBluescript + EST-DNAT I

Exzision mit F1-Phagen

pBluescript SK+

EST Klon

lacZ

Amp

EST-DNA

coscos

Initiator

Terminatorf1 ori

Abbildung 23: Prinzipder in vivo Exzision desLambda ZAP II Vektors.Mittels des λ-Phagen kanneine DNA Bibliothek er-stellt werden. Ko–Infektioneines Wirtsbakterium miteinem F1 Phagen schnei-det den Bereich zwischender Initiator- (I) undTerminator-Region (T) her-aus und ligiert ihn, so daßsich ein funktionsfähigespBluescript Plasmid bildet.

die F1 „Hilfs“-Proteine die Initiator-Region im λ-Phagen. Sie setzen einen „nick“ in der

Initiator DNA und replizieren einen Strang bis zur Terminatorregion. Das Gen II Produkt

des M13 Phagen bildet nun zirkuläre DNA, die nur noch das pBluescript Plasmid, die

EST Sequenz, einen F1-origin, die Terminator- und Initiatorregion enthält, während alle

anderen Sequenzen des λ-Phagen nicht mehr enthalten sind.

Die F1 Terminatorregion ermöglicht es nun, daß das Phagemid verpackt und von E.

coli sezerniert wird. Die E. coli Bakterien im Überstand werden nun durch Erhitzung auf

70˚ C abgetötet, während das Phagemid diese Temperatur übersteht. Um doppelsträngi-

ge DNA zu erzeugen, werden frische E. coli Zellen mit dem Phagemid (das sich ja selbst

nicht replizieren kann) inkubiert und auf Ampicillin ausgestrichen. Nur die Bakterien,

die das Phagemid als Plasmid tragen, sind Ampicillin resistent und können zur DNA

Isolation verwendet werden.

Als E. coli Stamm wurde XL1-Blue verwendet, da dieser Stamm das F‘-Episome trägt,

welches hier zwei Funktionen hat: Einerseits trägt es ein lacZ Gen mit der ∆M15 Mu-

tation, das eine blau/weiss-Selektion mit dem Lambda Zap II Vektor gestattet (weiße

Kolonien haben DNA in der „Multiple Cloning Site“ von pBluescript), andererseits ent-

hält das F‘-Plasmid die Gene für die Expression der F‘ Pili, die für eine Infektion mit

einem filamentösen Phagen (F1 oder M13) benötigt werden. Zudem trägt es das TN10

Tetrazyklin-Resistenz Gen, so daß mit Tetrazyklin für das F‘-Episome selektiert werden

kann.

34

RNA cDNA tailed cDNA

5’ 3’ 3’ 5’3’CCCC 5’

CCCC

CCCC

CCCC

PCR

3’CCCC 5’5’GGGG 3’

spezifisches Produkt

TdTrT

Pol

Abbildung 24: Prinzip der 5’ RACE.Bei der 5’ RACE wird RNA durch re-verser Transkriptase (rT) umgeschrie-ben und die entstandene cDNA en-zymatisch mittels Terminaler desoxy-nukleotid Transferase (TdT) um ca. 20Cytosin-Nukleotiden verlängert. Mit-tels Polymerasekettenreaktion (PCR)kann dann das spezifische Produktamplifiziert werden.

3.12 Praktisches Vorgehen bei der in vivo Excision

Eine 5 ml Schüttel-Kultur XL1-Blue wurde mit VCSM13 (kanr) infiziert, der gegenüber

dem klassischem F1-Phagen den Vorteil besitzt, eine Kanamycin Resistenz zu tragen. Mit

Phagen infizierte Bakterien wurden mit Kanamycin selektiert (In 5 ml LB: 1 Kolonie XL1-

Blue, 20 λ einer 20 % Maltose-Lösung, 50 λ von 1 M MgSO4, nach 3 h wird Kanamycin

hinzugegeben). Die Zellen wurden mit 1000 x g abzentrifugiert und in 2 ml SM Puffer re-

suspendiert. Alle Bakterien tragen nun den Helferphagen in sich. Es wurden 200 λ einer

Lambda-Phagen-Suspension hinzugegeben und 20 min bei 37˚ C inkubiert, damit sich die

Phagen an die Bakterien anheften können. Nach Zugabe von 5 ml 2xYT Medium wur-

de nochmals für 3 h bei 37˚ C inkubiert. In dieser Zeit integriert sich der Lambda Phage

im Chromosom und der Bluescript Vektor wird vom Helferphagen ausgeschnitten. Die

Bakterien wurden abzentrifugiert (4000 x g für 5 min) und 20 min auf 70˚ C erhitzt. Nach

Abkühlung wurden 200 λ des Überstands mit 200 λ XL1-Blue Zellen für 15 Min. bei 37˚ C

inkubiert. Während dieser Inkubation infiziert das Phagemid E. coli und repliziert sich als

Plasmid. Danach werden 10 λ und 100 λ auf Ampicillin Platten ausgestrichen. Kolonien

wurden isoliert, eine Plasmid-Präparation durchgeführt und die Plasmid-DNA sequen-

ziert.

3.13 „Rapid Amplification of cDNA Ends“ (5’ RACE)

Mittels 5’ RACE kann die Sequenz einer mRNA upstream von einem bekannten Teilstück

bestimmt werden. Hierbei werden enzymatisch mehrere Cytosin-Nukleotide an das 3’-

Ende der cDNA angehängt und dieses mit einem komplementären Primer in mehreren

nested PCRs amplifiziert, was die nachfolgende Klonierung und das Screening verein-

facht (Abb. 24). Die einzelnen Schritte sind im folgenden kurz dargestellt.

35

Zur RNA-Isolierung wurde TRIzol Reagenz nach den Angaben des Herstellers (Li-

fe Technologies, Rockville, MD) verwendet. Die mRNA wurde mit Superscript II rever-

se Transkriptase (Life Technology, Rockville, MD) in cDNA umgeschrieben, dann die

mRNA mit RNAseH degradiert und die cDNA über Qiaquick-Säulen (Qiagen, Valen-

cia, CA) aufgereinigt. Bei der sogenannten „Tailing“-Reaktion wird durch die Terminale-

deoxynukleotidyl-Transferase (TdT) eine Kette von entsprechend zugegebenen Nukleo-

tiden an das 3’-Ende der cDNA angehängt. Die Länge dieses poly-Nukleotid-Stückes

kann über die Reaktionsdauer gesteuert werden. Hier wurde mit Cytosin und einer Re-

aktionsdauer von 12 Minuten gearbeitet, was erfahrungsgemäß einen poly-C Stretch von

durchschnittlich 15-20 Basen erzeugt. Durch nested PCR wird die cDNA amplifiziert,

wobei spezifische Primer auf der einen und ein poly-dG Primer auf der anderen Seite

benutzt wird. Das entstehende Reaktionsprodukt wird auf einem Agarose-Gel aufgetra-

gen, ausgeschnitten, aufgereinigt und in den pGEM-T Vektor ligiert. Durch Screening der

Kolonien mittels PCR werden positive Klone identifiziert, das Plasmid aufgereinigt und

die Sequenz analysiert.

3.14 Sequenzierung

Die Basenabfolge der Katalase wurde mittels Sequenzierung vier unabhängiger Klone ei-

nes per RT-PCR (F4, R0) gewonnen Fragmentes von 2480 bp bestätigt. Es wurden jeweils

beide Stränge eines DNA Stücks mittels Dideoxy-Sequenzierung analysiert. Die Sequen-

zierung der DNA wurde vom W.M. Keck Sequencing center, Yale University School of

Medicine, durchgeführt.

3.15 Herstellung des Antiserums gegen T. gondii Katalase

Mittels Polymerase Kettereaktion (PCR) wurde das entsprechende Stück der T. gondii

Katalase amplifiziert (Primer: ExF und ExR) und in die BamHI und XmaI Schnittstelle

des Vektors pGEX-4T-1 kloniert. Das entstandene GST-Katalase-Fusionsprotein wurde

in Escherichia coli exprimiert, die Synthese mit Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranosoid

(IPTG) induziert und das Fusionsprotein über Glutathion-Sepharose Perlen aufgereinigt

(Abb. 25). Im folgenden wird dies näher beschrieben.

Eine 6 ml Übernachtkultur wurde mit LB Medium und Ampicillin auf 300 ml ver-

dünnt und bis zum Erreichen einer optischen Dichte von 0,6 bei 37˚ C geschüttelt. Nach

Zugabe von 0.5 mM IPTG zur Induktion der Fusionsprotein-Synthese wurden weitere 4 h

geschüttelt. Die Bakterien wurden abzentrifugiert, und mit 20 ml eiskaltem STE gewa-

schen. Die eine Hälfte des Ansatzes wurde für spätere Verwendung eingefroren, mit der

36

+ IPTG

- IPTG

GST-fusio

n

47 kD

102 kD

81 kD

47 kD

32 kD

+ IPTG

Eluat

1

Eluat

2

Centri

prep-3

Centri

con-3

0

Standar

d

a b

Abbildung 25: Aufreinigung des GST-Katalase Fusionsproteins. In (a) sind die Unterschiedezwischen induzierten und nicht induzierten Bakterien in der SDS PAGE mit Coomassie-Färbungdargestellt. Das Fusionsprotein ist bei 47 kDa in den mit IPTG induzierten Bakterien (a, Spur 1) zusehen. Dem aufgereinigten Fusionsprotein als positive Kontrolle (a, Spur 3) entspricht die Bandebei 47 kD. Die Bande bei 20 kDa entspricht einem Fragment des Fusionsproteins. Die Aufreini-gung des Fusionsproteins mittels einer Abfolge von verschiedenen Auftrennungs- und Konzen-trationsschritten ist in (b) auf einem Silber-Gel dargestellt.

anderen auf Eis weitergearbeitet. Nach nochmaligem Abzentrifugieren wurde das Sedi-

ment in 6 ml STE gelöst und Lysozym auf 100 µg/ml hinzugegeben. Nach 15-minütiger

Inkubation auf Eis wurde DTT auf 5 mM und N-Laurylsarcosin auf 1,5 % hinzugege-

ben [32]. Die Probe wurde 5 s gevortext, 60 s im Eisbad beschallt und bei 10.000 x g für

5 Min. abzentrifugiert. Bei sehr viskösen Proben wurde die chromosomale DNA mittels

Passage durch eine 25 Gauge Nadel geschert. Zum Überstand wurde Triton X100 auf

2 % hinzugegeben und 5 s gevortext. 5 ml einer Suspension von Agarose Perlen in PBS

(50/50) wurden hinzugegeben und auf einem rotierendem Rad 15 Min. inkubiert. Die

Glutathion-Sepharose Beads wurden 6 Mal in eiskaltem PBS gewaschen und dann zwei-

mal mit jeweils 2,5 ml Elutions-Puffer eluiert. Um die Proteinkonzentration der Probe zu

erhöhen, wurde sie mit Centriprep (Millipore, Bedford, MA) nach Angaben des Herstel-

lers konzentriert. Die Probe wurde mit 10 % Glycerin versetzt und bei –80˚ C eingefroren.

Seren von speziellen, pathogen-frei gezüchteten Hasen wurden auf Reaktivität mit

T. gondii in Western Blots überprüft und ein Tier mit geringem Antikörper-Titer ausge-

sucht (Abb. 26, Spur 38). Die Immunisierung des Hasen mit jeweils 100µg Protein wurde

von Cocalico Biologicals (Reamstown, NJ, USA) durchgeführt. Der Verlauf der Antikör-

perbildung wurde regelmäßig mittels Western Blot getestet. Nach drei Immunisierungen

innerhalb von zwei Monaten wurde sämtliches Serum entnommen.

37

102

81

47

32

30

27

RH HFF

F G H I K F G H I K

a b Abbildung 26: Screening der Prä-immun-Sera. Test der Sera aufReaktion mit T. gondii Proteinen vorder Immunisierung. In jeder Spurwurde das native Serum eines Hasenaufgetragen. In (a) wurden Parasitenaufgetragen, die in HFF-Zellkulturangezüchtet wurden und in (b) HFF-Zellen ohne Parasiten als Kontrolle.Zur Immunisation wurde der Hase Ggewählt, da die Signale in (a) über-wiegend auch in (b) zu finden sind,was für einen niedrigen endogenenAntikörper-Titer gegen ToxoplasmaProteine spricht.

3.16 Antikörper Aufreinigung

Zur Kopplung des Fusionsproteins an CNBr -aktivierte Agarose (Sigma, St. Louis, MO)

wurde folgende Methode durchgeführt. In 2 ml einer 1 mM HCl -Lösung wurden 500 mg

der Agarose-Kügelchen über Nacht eingeweicht und anschließend mehrmals in H2O ge-

waschen. Die Agarose wurde in Bindungspuffer (50 mM Na2CO3, 50 mM NaCl pH=9,0)

resuspendiert, der 500µg des Antigens enthielt. Nach einer Inkubation über Nacht bei

Raumtemperatur wurden die freien Bindungsstellen durch Zugabe von 1 M Ethanolamin

während einer 4 h Inkubation abgesättigt. Die Agarose-Kügelchen wurden anschließend

in PBS-Puffer gewaschen und nach Zugabe eines Konservierungsmittel bei 4˚ C aufbe-

wahrt. Die Bindung der Antikörper an das immobilisierte Antigen erfolgte in PBS-Puffer

bei 4˚ C über Nacht. Nicht gebundene Bestandteile des Serums wurden beim Waschen

mit PBS-Tween (0,1 %) entfernt. Danach wurden die gebundenen Antikörper mit einem

Gelatine-Glycine-Puffer (pH = 2,8) eluiert und das Eluat schnellstmöglich durch Zugabe

von TRIS Base neutralisiert. Die Effizienz der Antigenbindung an die Agarose, sowie der

Antikörperaufreinigung wurde mittels SDS-PAGE und Western-Blot überprüft.

3.17 Western Blot

Western-Blots wurden nach einem Standard-Protokoll durchgeführt [55]. Circa 5x106 Pa-

rasiten oder eine äquivalente Menge an Wirtszellmaterial wurden abzentrifugiert, mit

Lade-Puffer versetzt, auf einem 10 % SDS-Polyacrylamid Gel aufgetrennt und auf Nitro-

cellulose-Membran transferiert. Nach Inkubationen mit primären und HRP-konjugierten

sekundären Antikörpern und entsprechenden Waschschritten wurde das Signal mittels

Chemoluminiszenz (ECL-Kit, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) nachge-

wiesen.

38

Antikörper-Konzentrationen:

T. gondii Katalase Antiserum 1 : 500

HRP-konjugierter goat anti-rabbit IgG Antikörper 1 : 2000

3.18 Immunfluoreszenz

Für den Immunfluoreszenz-Assay wurden Zellen auf runden Deckgläschen mit 15 mM

Durchmesser über Nacht herangezogen. Nach dreimaligem Waschen in PBS++ (1mM

CaCl2 und 1 mM MgCl2 als Zusatz zu PBS-Puffer) innerhalb von 5 min mit ca. 2 ml/well

wurden die Zellen in 3 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur fixiert. Dann folgte wie-

derholtes dreimaliges Waschen und anschließend eine Permeabilisierung der Membran

mit 0.1 % Triton X-100 in PBS++ für 5 Minuten. Nach anschließendem zweimaligem Wa-

schen in PBS++ wurden durch Inkubation für 30 Minuten mit 50 % Ziegen-Serum freie

Bindungsstellen geblockt. Die Antikörper wurden in 3 % BSA in PBS++ verdünnt, die

Deckgläschen umgekehrt auf einen Tropfen dieser Lösung gegeben und 30 Minuten bei

Raumtemeperatur inkubiert. Nach dreimaligen Waschen in PBS++ wurde mit dem zwei-

ten Antikörper auf die gleiche Weise inkubiert. Nach 30 Minuten wurden drei weitere

Waschschritte mit PBS++ vorgenommen und die Deckgläser mittels Mowiol 40-88 (Sig-

ma St. Louis, MO) auf einem Objektträger upside-down montiert. Nach 4 h Aushärtung

können die Präparate betrachtet werden.

Alternativ kann die Fixation für 15 min in eiskaltem Aceton erfolgen. Dabei entfällt

der anschließende Permeabilisierungsschritt mit TritonX-100. Eine Färbung des Apiko-

plast läßt sich durch Zugabe von wenigen Kristallen 4’,6-Diamidino-2-Phenylindol in

die Einbettungsflüssigkeit erreichen.

Antikörperkonzentrationen für den Immunfluoreszenz Assay

T. gondii Katalase Antiserum 1 : 250

aufgereinigtes T. gondii Katalase Antiserum 1 : 5

Rabbit anti-CAT 1 : 500

Rabbit anti-SKL 1 : 500

T3 4A7 1 : 250

T6 2H11 1 : 250

D2 R3 1 : 250

FITC linked goat anti-rabbit IgG 1 : 500

Rhodamine-linked goat anti-mouse-IgG 1 : 500

39

3.19 DAB Präzipitation

Die Parasiten wurden in der Kulturschale für 15 min mit 1,5 % Glutaraldehyd in 0,1 M PI-

PES Puffer (pH 7,4) fixiert, zweimal in PBS und einmal in Teorell-Stenhagen (T/S) Puffer

(pH 10,5) gewaschen. Nach einer zweistündigen Inkubation mit 2 mM DAB in T/S wur-

de H2O2 in einer End-Konzentration von 1,5 % für 1-3 h hinzugegeben, danach jeweils

einmal mit T/S und 100 mM Natrium-Cacodylat (pH 7,4) gewaschen und die Probe über

Nacht bei 4˚ C in 2,5 % Glutaraldehyd und 100 mM Natrium-Cacodylat fixiert. Die Pro-

be wurde mittels eines Teflon Schabers in ein Eppendorf-Cap überführt und in EPON

eingebettet. Im Microtom wurden 60-80 nm dicke Schnitte angefertigt und auf Formvar

beschichteten Nickel Trägern montiert. Die Schnitte wurden nicht mit Bleizitrat gegen-

gefärbt, damit das DAB Präzipitat leichter erkannt werden kann. Zur Kontrolle wurden

Inkubationen ohne H2O2 oder in Anwesenheit eines Katalase Inhibitors (z. B. 20 mM 3-

Amino-1,2,4-Triazol) durchgeführt.

Sämtliche Materialien für die Elektronenmikroskopie wurden von er Firma Electron

Microscopy Sciences, Fort Washington, PA bezogen. Für die Lichtmikroskopie wurde obi-

ge Prozedur auf Objektträgern durchgeführt, die nach der Inkubation mit H2O2 unter-

sucht werden können.

3.20 Klonierung der Expressions-Konstrukte

Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde die DNA-Sequenz der Chlor-

amphenicol-Acetyltransferase um die Aminosäuren -AKM am C -terminus erweitert, so-

wie an den Enden eine HindIII und KpnI Restriktionsenzym-Schnittstelle eingefügt. Das

entstandene PCR-Produkt wurde in den pcDNA3.1/Zeo(+)-Vektor eingefügt, der für

die Expression des CAT-AKM Genprodukts in Säugerzellen einen Zytomegalie-Virus-

Promoter enthält.

Auf die gleiche Weise wurde die T. gondii Katalase in die NheI und BamHI Restrikti-

onsenzym-Schnittstellen des pcDNA3.1/Zeo(+)-Vektors eingefügt. Die unterschiedliche

Länge der T. gondii Katalase wurde durch Verwendung verschiedener Primer erreicht:

NheCat und AKMBgl für die volle Länge, NheCat und CYPBgl für die drei Aminosäuren

kürzere Version.

3.21 Transfektion der CHO-Zellen

Zur Transfektion der Säugerzellen wurde Superfect (Qiagen, Valencia, CA) nach den An-

gaben des Herstellers verwendet. Die Transfektion wurde in Kulturschalen durchgeführt,

40

die Zellen nach 24-48 h auf Deckgläser umgesetzt und 24-48 h später mittels Immunfluo-

reszenz angefärbt.

3.22 Allgemeine molekularbiologische Techniken

Die Plasmid-Präparationen wurden nach dem alkalische Lyse-Verfahren durchgeführt

[55], bzw. Mini-, Midi- und Maxiprep-Kits (Qiagen, Valencia, CA) benutzt. Als Enzyme

für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde Taq-Polymerase und PfU-Polymerase

(New England Biolabs, MA) nach Angaben des Herstellers verwendet.

Alle Restriktionsendonukleasen, die T4-DNA-Ligase und die Calf-Intestinal-Phos-

phatase wurden von New England Biolabs, MA, bezogen und nach Angabe des Her-

stellers verwendet.

Die Auftrennung von DNA erfolgte auf Gelen aus Seakem LE Agarose oder Sea-

plaque Agarose (Sigma, St. Louis, MO). Die DNA wurde mit Ethidiumbromid unter

UV-Licht dargestellt. DNA wurde aus Seaplaque Agarose-Gelen mit Phenol extrahiert

und auf einer Qiaquick-Säule (Qiagen, Valencia, CA) aufgereinigt. Proteine wurden auf

Acrylamid-Gelen mittels SDS-PAGE nach einem Standardverfahren aufgetrennt [55].

Transformations-kompetente E. coli wurden mit der CaCl-Methode hergestellt und

die Transformation mit Hitzeschock eingeleitet [55].

3.23 Oligonukleotide und Chemikalien

Sämtliche Oligonukleotide (siehe Tabelle 4) wurden von der W.M. Keck Foundation Bio-

technology Resource Labaratroy (Yale University, New Haven, CT) bezogen. Alle wei-

teren Chemikalien, deren Hersteller nicht aufgeführt ist, wurden von Sigma (St. Louis,

MO) bezogen.

3.24 Protein-Modellierung mit Swissmodel

Die Modellierung der T. gondii Katalase wurde mit Hilfe des Swiss-Model-Servers 5 vor-

genommen. Dieser Server vergleicht die eingegebene Aminosäuresequenz mit den Se-

quenzen experimentell erfaßter 3D-Strukturen mittels BlastP2 und sucht geeignete Vor-

lagen für ein 3D-Modell aus. Anschließend wird mittels ProModII die eingegebene Se-

quenz anhand der dreidimensionalen Vorlagen modelliert und eine Energieminimierung

5http://www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html

41

Name Sequenz

R0 TTCTCGTTCAGAAAGTGCTG

R1 CATTTCTGTCTTCCTTTGGAAAGC

R2 TCGCCTGCCTGAGATGC

R3 GGGAAACTCTCGCTTGGC

R4 CATTACCTGAATACAGAAGG

R5 GGCGTTGAACAGGTCACG

R6 GTCGCGCCTGGTGTCC

R7 CACTCCCCGACTCGCC

R9 GGAAGTTACTCAGGATCGC

F1 GCTGCAGGGACGCATGTTCTC

F4 GTGCGGCTCCTCGAAGG

Fdeg CCnGArmGnGTnGTnCAyGC

ExF CGGGATCCCCGAGCGAAGATCGCATGC

ExR TCCCCCGGGACAACGCACGCCTAC

NheCat CTTCGTCAGCTAGCATGACTCAGGTTCCGCCCG

AKMNot CGTTTAGCGGCCGCAGATCTACATCTTGGCTGGGTAG

CYPNot CGTTTAGCGGCCGCAGATCTATGGGTAGCACGCCGCAG

CATFHind CCCAAGCTTAATGCATGAGAAAAAAATCACTGG

CATAKMKpn GGGGTACCTTACATCTTTGCTCCCGCCCCGCCCTGCC

Tabelle 4: In dieser Arbeit verwendete Primer. Schnittstellen für Restriktionsenzyme sind fett ge-druckt. n = A,C,G,T; r = A,G; m = A,C; y = C,T.

mit Gromos96 durchgeführt [36, 80, 81]. Die Ausgabe erfolgt als PDB-Datei, die alle mo-

dellierten Atomkoordinaten enthält. Diese Datei kann nun mit Hilfe eines PDB-Viewers

dargestellt werden.

Die Aussagekraft der 3D-Modelle hängt von mehreren Einflußgrößen ab. Man unter-

scheidet zwischen der correctness, die von der Qualität des Alignments abhängt, und der

accuracy, die Abweichung des errechneten Modells von der experimentell gewonnenen

Struktur beschreibt. Bei mangelnder correctness treten Fehler beim Alignment auf und

die entsprechende Region wird räumlich falsch modelliert. Diese Fehler können durch

ein sorgfältiges Alignment vermieden werden. Zum Teil fallen diese durch stereoche-

misch unmögliche Konformationen auf. Die Abweichung eines errechneten Modells von

einer experimentell bestimmten Struktur, accuracy, kann zwei Ursachen haben. Einerseits

Fehler im Modelling-Verfahren, andererseits die Variabilität in den Verfahren der experi-

mentellen Strukturbestimmung.

Um eine genauere Vorstellung von der accuracy zu bekommen wurden im 3DCrunch-

Projekt 1200 Modell/Struktur-Paare verglichen [91]. Es zeigte sich, daß eine Überein-

42

stimmung der Aminosäuresequenz zwischen Modell und Vorlage von über 70 % zu äu-

ßerst präzisen Strukturvorhersagen führt. Diese Modelle sind aufgrund ihrer Präzision

u. a. für Compound-Optimierung im Drug Design geeignet. Modelle mit korrekten Ali-

gnment trotz geringerer Sequenzübereinstimmung sind noch immer nützliche Werkzeu-

ge bei „rational mutagenesis“ Experimenten. Modelle mit inkorrekten Alignment haben

ihre Aussagekraft in den Regionen mit falschen Alignment verloren, können aber für die

anderen Regionen durchaus korrekt modelliert sein.

Die Modellstruktur der Aminosäuren 10 bis 490 der T. gondii Katalase wurde mit-

tels dem Swiss-Model-Server anhand folgender Strukturen der bovinen Katalase aus

der ExNRL-3D Datenbank errechnet: 4BLCA, 8CATA, 7CATA, 4BLCD, 4BLCC. Die hohe

Identität der Aminosäuren zwischen T. gondii und boviner Katalase (63 %) läßt auf eine

hohe Qualität des Modells schließen.

Die fehlenden N- und C -terminalen Aminosäuren wurden mit dem Swiss PDB View-

er von Hand hinzugefügt. Da keinerlei Daten über die dreidimensionale Anordnung

dieser Aminosäuren vorhanden ist, sind Fehler in diesem Bereich des Modells unver-

meidlich. Das Rendering der Stereo-Abbildungen wurde mittels Raytracing (Pov-Ray)

durchgeführt. Ein 3D-Effekt läßt sich bei den Stereobildern durch leichtes Einwärtsschie-

len erreichen.

3.25 Verwendete Software

Die vorliegende Arbeit wurde mit dem Textsatzprogramm LATEX 2ε und BIBTEX 0. 99 c aus

der Distribution MiKTEX 2. 0 6 gesetzt. Abbildungen wurden mit Adobe Photoshop 5. 5

und Adobe Illustrator 8. 0 bearbeitet. Die 3D-Modellierung der T. gondii Katalase wurde

mit Swiss-PdbViewer v 3. 7 7 durchgeführt und mit Pov-Ray 3. 1 8 nachbearbeitet.

6http://www.miktex.de7http://www.expasy.ch/spdbv/mainpage.html8http://www.pov-ray.org

43

3.26 Puffer und Lösungen

10 x PBS 800 ml dH2O , 80 g NaCl , 2 g KCl , 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4,

auf 1 Liter auffüllen, pH auf 7,2 bringen, 1 x Lösung autoklavieren

und bei Raumtemperatur aufbewahren.

PBS++ 1 l 1 x PBS, 1 ml 1 M MgCl2 und 1 ml 1 M CaCl2 hinzugeben, bei

Raumtemperatur lagern.

TE 10 mM Tris, 1 mM EDTA: 0.06 g Tris, 0.19 g Na2EDTA in 50 ml dH2O ,

pH auf 7,6 einstellen.

20 x TBE 108 g Tris, 55 g Borsäure in 900 ml dH2O , 80 ml 0,25 M EDTA pH 8,0

hinzugeben, pH auf 8,4 bringen und auf 1 l mit dH2O auffüllen.

EDTA 9.3 g NaEDTA in 100 ml dH2O , 10 N NaOH zugeben bis zu einem

pH von 8,4.

STE 10 mM TRIS, 150 mM NaCl , 1 mM EDTA.

Elutions-Puffer 75 mM Hepes (pH 7,4), 150 mM NaCl , 10 mM reduziertes GSH,

5 mM DTT, 2 % N-Octylguanid.

44

3.27 Benutzte Geräte

Die folgende Tabelle führt einige bisher nicht näher bezeichnete Geräte an. Kleinere La-

borgeräte und Massenartikel, wie z. B. Pipettenspitzen, wurden ausgelassen.

Gerät Bezeichnung Hersteller/Vertrieb

Elektronenmikroskop Philips 101 Philips Inc., Peawick, NY

Fluoreszenz-Mikroskop Microphot-FxA Nikon, JP

Ölimmersionsobjektiv PlanApo100/1.40 Nikon, JP

Quecksilberdampflampe HB10101 AF Nikon, JP

Kamera Sensys II Photometrics, NJ

Spektrometer Genesys 5 Spectronic Instruments, Roche-

ster, NY

SpeedVac DNA110 Savant Instruments Inc., Far-

mingdale, NY

Transilluminator FBTIV88 Fisher Scientific

PCR-Gerät Thermal-Cycler III Hybaid, NJ

Gene Pulser Biorad 2010 Bio-Rad Inc. Hercules, CA

Sonicator Modell G112SP1G Laboratory Supplies Co. Inc.,

Hicksville, NY

Tabletop-Zentrifuge Eppendorf 5415c Fisher Scientific

Swingout Rotor Modell GPR Beckman Inc, Wakefield, MA

45

4 Diskussion

Die Katalase ist ein ubiquitär vorkommendes Enzym das in vielen Organismen eine

wichtige Bedeutung für den Stoffwechsel hat. Sie katalysiert die Umwandlung von Was-

serstoffperoxid in Wasser und Sauerstoff und verringert somit die Bildung von freien

Radikalen. Dadurch schützt sie vor deren toxischen Wirkung auf DNA, Proteine und Li-

pide [54]. Da Wasserstoffperoxid leicht über biologische Membranen diffundieren kann,

ist es auch ein wesentlicher Bestandteil der Immunabwehr und tötet z. B. Bakterien in den

Phagosomen ab [41]. Reaktive Sauerstoffradikale sind ein wesentlicher Abwehrmecha-

nismus zur Bekämpfung einer Toxoplasma gondii Infektion [40,65–68]. Untersuchungen an

Ucp2-Knockout Mäusen, die resistent gegen Infektionen mit Toxoplasma sind, untermau-

ern dies [3]. Die Makrophagen dieser Knockout-Mäusen produzieren größere Mengen

freier Radikale als Wildtyp-Makrophagen und können Toxoplasma gondii fünffach besser

abtöten.

Ein Vergleich der Protein-Expression zwischen einem Wildtyp und einem attenuier-

ten T. gondii Stamm, ersterer wurde in Mäusen passagiert, letzterer ausschließlich in Zell-

kultur, ergab eine verminderte Expression der Katalase in dem attenuierten Stamm [73].

Dies ist ein weiterer Hinweis darauf, daß Katalase ein Pathogenitätsfaktor ist.

Gegen die Sauerstoffradikale der Makrophagen schützt sich T. gondii mit einer Reihe

von Enzymen. Die schon vor langer Zeit beobachtete hohe Resistenz gegen H2O2 [66]

erklärt sich aus dem Zusammenspiel von Katalase [45, 95] Superoxid-Dismutase [74, 95],

Peroxidasen und Peroxiredoxin [102].

In der vorliegenden Arbeit haben wir die Katalase von Toxoplasma gondii kloniert und

genauer untersucht. Die Ergebnisse unserer Sequenzierung bestätigten Ding et al. in einer

zeitgleichen, unabhängigen Arbeit [23]. Außerdem konnte diese Gruppe mit Northern-

und Southern-Blot-Analyse die Transkription der Katalase DNA nachweisen.

Bei unseren Untersuchungen zeigte sich im Western-Blot mit einem polyklonalen An-

tiserum gegen ein Katalase-GST-Fusionsprotein ein Protein in der Größe von ca. 63 kDa.

Dies steht in guter Übereinstimmung mit der berechneten Größe. Somit gehen wir davon

aus, daß das Antiserum in der Tat mit Katalase reagiert.

Die starke Konservierung von Katalase verschiedener Organismen über die Artgren-

zen hinweg begünstigt eine strukturelle Analyse. So können Voraussagen über struk-

turelle Zusammenhänge durch Analogieschluss mit hoher Wahrscheinlichkeit getroffen

werden. Die absolute Konservierung der Aminosäuren, die für die Bindung des Häm-

und NADPH -Moleküls verantwortlich sind und das aktive Zentrum bilden, läßt auf eine

Ähnlichkeit des katalytischen Reaktionsmechanismus schließen. Aminosäurereste, die

46

in anderen Katalasen mit den anderen Untereinheiten interagieren, sind auch in der T.

gondii Katalase vorhanden. Dies spricht für eine Organisation der Katalase als Homo-

tetramer, wie sie bei allen bisher bekannten eukaryontischen Katalasen vorkommt. Das

C -terminale PTS1 der T. gondii Katalase legt eine Lokalisation in einem peroxisomalen

Kompartiment nahe.

Die starke Homologie der T. gondii Katalase zu anderen Katalasen begünstigt auch

Aussagen über die Struktur des Enzyms im dreidimensionalen Raum. Durch Vergleich

mit bekannten Röntgendiffraktions- oder NMR-Strukturen kann eine Modellierung des

Proteins erfolgen. Hierfür sind zahlreiche Computeralgorithmen entwickelt worden. Ei-

ne Nachbearbeitung zur Verbesserung und Erweiterung eines computergenerierte Mo-

dells wird von Hand vorgenommen. Entscheidend für die Qualität der Modellierung ist

einerseits die Kenntnis der räumliche Auflösung der Vorlage und andererseits die Ähn-

lichkeit in der Aminosäuresequenz zwischen Modell und Vorlage. Im Falle der T. gondii

Katalase sind beide Einflußfaktoren günstig verteilt: Mit einer Homologie von 63 % zur

bovinen Katalase und einer Auflösung deren Kristallstruktur von 2.5 Å finden sich sehr

gute Voraussetzungen. Da sich die meisten Katalasen relativ einfach kristallisieren lassen,

stehen mehrere dreidimensionale Strukturen als Vorlage zur Verfügung [24, 33, 47, 85].

Durch die dreidimensionale Modellierung von Proteinen können die sterischen Ver-

hältnisse wesentlich anschaulicher dargestellt und besser interpretiert werden. Bei der

Sekundärstruktur der Katalase fällt ein β-Barrel aus acht antiparallelen β-Faltblattstruk-

turen auf, das das Häm-Molekül auf einer Seite abschirmt, während die andere Seite re-

lativ frei zugänglich ist. Ein Kanal führt direkt zum Eisenatom des Häms und dient dem

Anfluten des Substrats H2O2 . Die Modellierung des aktiven Zentrums und der NADPH -

Bindungsstelle illustriert die räumliche Anordnung der katalytischen Aminosäurereste.

Auch die Interaktionen zwischen den Monomeren sind durch eine 3D-Ansicht wesent-

lich anschaulicher dargestellt.

In den meisten eukaryontischen Zellen liegt Katalase in den Peroxisomen (Microbo-

dies) vor. Aus diesem Grunde ist sie zum Leitenzym dieses Kompartiments geworden. In

einigen Fällen jedoch, wie z. B. in Saccharomyces cerevisiae, finden sich zwei Isoformen, von

denen die eine in Peroxisomen und die andere im Zytosol vorliegt. In Toxoplasma haben

wir, sowie Ding et al., keine weitere Isoform der Katalase gefunden. Um die Lokalisation

der Katalase in T. gondii zu klären, haben wir die Verteilung licht- und elektronenmikro-

skopisch untersucht.

In der Immunfluoreszenz-Mikroskopie mit einem Antiserum gegen T. gondii Katalase

zeigte sich ein punktförmiges Signal im vorderen Ende des Parasiten, das an vesikuläre

Strukturen erinnert. Zudem lag ein diffuses, aber spezifisches Signal innerhalb des Para-

47

siten vor, das zytosolisch anmutet. Gleichzeitiges Anfärben verschiedener Zellorganellen

(Rhoptrien, Granula densa, Mikronemen und der Apikoplast) zeigte keine Signalüberla-

gerung. Daher muß davon ausgegangen werden, daß das vesikuläre Signal einem nicht

näher definierten Kompartiment entspricht.

Allerdings sind in Toxoplasma nicht alle Kompartimente definiert, die in Säugetierzel-

len bekannt sind. So gibt es kein überzeugendes Äquivalent für die Lysosomen und En-

dosomen. Obwohl es einige Hinweise für eine Rezeptor vermittelte Endozytose an der

„micropore“ (einem spezialisierten, eingestülpten Bereich der Zellmembran) gibt [72],

entzieht sich die Endozytose des Parasiten bisher der experimentellen Untersuchung

[92]. Auch der Nachweis von Lysosomen ist bisher nicht gelungen.

Die elektronenmikroskopische Darstellung der Katalase-Aktivität durch DAB-Präzi-

pitation zeigte 100-300 nm große, runde Ablagerungen. Diese Ablagerungen traten zu-

meist in juxtanukleärer Position auf und enthielten kristallähnliche Einschlüsse. Durch

gleichzeitige Inkubation mit einem Katalase-Inhibitor oder bei Auslassung des Substrats

(H2O2 ) verschwinden diese Ablagerungen, während das unspezifische Signal in den Mit-

ochondrien bestehen bleibt. Dies spricht für ein Katalase-spezifisches Signal in den run-

den Ablagerungen. Aus der geringen Häufigkeit der runden Präzipitate (1 auf 20-30 Pa-

rasitenanschnitte) kann man schließen, daß nur wenige Strukturen pro Parasit vorliegen.

Dies steht im Einklang mit den Immunfluoreszenz-Bildern auf denen jeweils 2-5 punkt-

förmige Signale pro Parasit zu sehen sind.

Unsere Ergebnisse legen nahe, daß wir ein bisher noch nicht näher definiertes, subzel-

luläres Kompartiment entdeckt haben. Es befindet sich im vorderen Ende der Parasiten,

in der Nähe des Golgi-Apparats. In diesem Bereich liegt vermutlich auch das Zentromer,

das Organisationszentrum der Mikrotubuli. Aus Experimenten an CHO-Zellen ist be-

kannt, daß Peroxisomen sich entlang Mikrotubuli bewegen können [83, 115]. Allerdings

findet man in vielen anderen eukaryontischen Zellen eine Vielzahl von Vesikeln in der

Nähe des Zentromers.

Das in der Fluoreszenz-Mikroskopie sichtbare, diffuse Signal innerhalb des Parasiten

spricht für die Existenz eines Katalase-Pools im Zytosol. Dies könnte durch eine Sätti-

gung der Importmaschinerie oder eine andere Isoform hervorgerufen sein. Ding et al.

haben allerdings keine weiteren Katalasen im T. gondii Genom entdeckt [23]. Der zyto-

solische Pool der Katalase könnte ein Schutzmechanismus gegen freie Radikale sein, der

das Überleben des Parasiten bei einer Immunreaktion des Wirtes sichert.

Entscheidend für die Definition eines peroxisomalen Kompartiments ist eine umge-

bende Membran. Die hier verwendeten elektronenmikroskopischen Methoden können

diese leider nicht überzeugend dargestellen, da keine Gegenfärbung mit Bleizitrat durch-

48

geführt wurde. Andererseits wird durch Auslassung der Gegenfärbung die Möglichkeit

falsch positive Resultate zu erreichen, stark verringert. Der Versuch, durch Immunogold-

labeling mit dem polyklonalen Antiserum gegen Katalase elektronenmikroskopisch eine

Klärung herbeizuführen, ist uns und anderen Arbeitsgruppen bisher nicht gelungen.

Ein weiteres Argument für eine peroxisomale Lokalisation der T. gondii Katalase ist

die Tatsache, daß sie in einem heterologen System (CHO-Zellen) in die Peroxisomen

transportiert wird. Die Funktionalität des PTS1 der T. gondii Katalase in CHO-Zellen er-

höht die Wahrscheinlichkeit, daß ein solches Signal in Toxoplasma auch funktionell in T.

gondii von Bedeutung ist. Eine endgültige Klärung der Bedeutung des PTS1 kann jedoch

nur durch Expression der rekombinanten Katalase in einem T. gondii Katalase knock-out

Stamm erzielt werden. Die dafür nötige Methodik ist seit einiger Zeit entwickelt [88].

Die Funktion eines peroxisomalen Kompartimentes in T. gondii ist zur Zeit nicht ab-

zuschätzen. Viele Stoffwechselwege bieten sich an. Von besonderem Interesse ist der Bei-

trag peroxisomaler Enzyme in der Lipid-Synthese und Metabolismus. Der Parasit scheint

unfähig zu sein, Cholesterol und Phospholipide de novo zu synthetisieren und bekommt

diese von der Wirtszelle [17]. Andererseits werden Enzyme der Fettsäurebiosynthese in

den Apikoplast importiert, ein Überrest eines Chloroplasten in vielen, wenn nicht allen

Apikomplexa [87]. Das Vorkommen von Enzymen des Glyoxylat-Zyklus wie Isozitrat-

Lyase und Malat-Synthetase [62], die in den Glyoxysomen der Pflanzen enthalten sind,

konnte von uns nicht eindeutig bestätigt werden, jedoch sind diese Enzyme potentiell in

Peroxisomen anzutreffen.

Mit der vorliegenden Arbeit konnte die Existenz eines peroxisomalen Kompartimen-

tes in T. gondii nicht zweifelsfrei geklärt werden, jedoch eröffnet sie die Möglichkeit in

neuer Weise über Stoffwechselvorgänge dieses Parasiten nachzudenken. Eine genauere

Untersuchung der Peroxisomen von T. gondii führt letztlich zu einem genaueren Ver-

ständnis des Metabolismus des Parasiten und potentiell zu neuen therapeutischen An-

sätzen.

49

5 Zusammenfassung

Toxoplasma gondii ist ein obligat intrazellulärer, einzelliger Parasit aus dem Phylum der

Apicomplexa. Infektionen des Menschen mit T. gondii verlaufen meist subklinisch. Nach

einer Infektion persistiert der Erreger für viele Jahre in Hirn- und Muskelgewebe. Durch

Reaktivierung des Erregers, z. B. durch eine Immunschwächekrankheit oder unter Im-

munsuppression, kann eine Enzephalitis mit septischer Streuung entstehen. Eine diapla-

zentare Infektion führt zur Fetopathia toxoplasmotica mit Früh- und Totgeburten oder zu

der typischen enzephalitischen Trias aus Chorioretinitis, Hydrozephalus und zerebralen

Verkalkungen.

Ein Mechanismus, der es T. gondii ermöglicht im Wirtsorganismus zu überleben, ist

die ungewöhnlich hohe Widerstandsfähigkeit gegenüber freien Radikalen. Die wichtig-

ste Quelle für freie Radikale bei der Abwehrreaktion des Wirtsorganismus ist Wasser-

stoffperoxid (H2O2 ). Es wird beim sogenannten „respiratory burst“ von Makrophagen

freigesetzt, diffundiert dann durch biologische Membranen und schädigt DNA, Lipide

und Proteine durch Zerfall in Sauerstoffradikale. Außerdem entsteht (H2O2 ) auch bei

normalen Stoffwechselvorgängen in den Persoxisomen der Zelle.

Das Enzym Katalase (EC 1.11.1.6) wandelt zwei Wasserstoffperoxidmoleküle in Was-

ser und Sauerstoff um und eliminiert somit toxisches Wasserstoffperoxid. Katalase liegt

zumeist in spezialisierten Zellorganellen, den Peroxisomen oder Microbodies, vor. Dort

dient es zum Abbau von bei metabolischen Prozessen entstehendem Wasserstoffperoxid.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Katalase von Toxoplasma gondii klo-

niert und charakterisiert. Die Klonierung von T. gondii Katalase cDNA ergab ein Prote-

in mit 502 Aminosäuren und einem errechneten Gewicht von 57.2 kDa mit starker Ho-

mologie zu anderen eukaryontischen Katalasen. Ein polyklonales Antiserum gegen ein

GST-Fusionsprotein zeigte im Western-blot eine Bande bei ungefähr 63 kDa. Die Immun-

fluoreszenz zeigte ein vesikuläres Kompartiment im vorderen Ende des Parasiten. Die-

ses kann von anderen Zellorganellen (Mikronemen, Rhoptrien, Granula densa und dem

Apikoplast) durch doppelte Immunfluoreszenzmarkierung unterschieden werden. Zyto-

chemisch können Katalasen durch die DAB-Präzipitationstechnik nachgewiesen werden.

Hier zeigten sich vesikuläre Strukturen vor dem Nukleus in der Lichtmikroskopie und

runde, spezifische Präzipitate mit einem Durchmesser von 100 bis 300 nm in der Elektro-

nenmikroskopie.

Am C-terminus der T. gondii Katalase findet sich ein „peroxisomales Targeting Signal“

(PTS1) in den letzten 3 Aminosäuren (-AKM). Die Expression der vollständigen Katala-

se in CHO-Zellen resultiert in einer peroxisomalen Lokalisation, während ein Konstrukt

50

ohne die letzten 3 Aminosäuren im Zytosol verbleibt. Wird das PTS1 mit einem Repor-

terprotein (Chloramphenicol-Acetyltransferase) fusioniert, wechselt dessen Lokalisation

vom Zytosol zu den Peroxisomen. Damit wurde gezeigt, daß das PTS1 der T. gondii Kata-

lase in einem heterologen System sowohl im Kontext der Katalase als auch eines Repor-

terproteins den Import in Peroxisomen vermitteln kann.

Diese Ergebnisse sind die ersten Hinweise auf Peroxisomen in einem Parasiten der

Apikomplexa. Zugleich ist T. gondii, evolutionsbiologisch gesehen, der bisher niedrigste

Eukaryont in dem bisher Peroxisomen nachgewiesen wurden.

51

6 Abkürzungsverzeichnis

5’ RACE Rapid Amplification of cDNA Ends

CAT Chloramphenicol-Acetyltransferase

DAB Diamino-Benzidin

DAPI 4’6-Diamidino-2-phenylindol

DTT Dithiothreitol

EST Expressed Sequence Tag

FBS Fetales Kälberserum

GST Glutathion S-Transferase

IFA Immunfluoreszenz Assay

IPTG Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranosoid

PBS Phosphate buffered saline

PCR Polymerase Kettenreaktion

PTS Peroxisomales Targeting Signal

RT-PCR Reverse Transkriptase PCR

T/S Teorell-Stenhagen Puffer

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271(31): 18973–80, 1996.

[117] Yamamoto K and Fahimi HD. Three-dimensional reconstruction of a peroxisomal

reticulum in regenerating rat liver: evidence of interconnections between heteroge-

neous segments. J Cell Biol, 105(2): 713–22, 1987.

[118] Zamocky M, Herzog C, Nykyri LM, and Koller F. Site-directed mutagenesis of

the lower parts of the major substrate channel of yeast catalase A leads to highly

increased peroxidatic activity. FEBS Lett, 367(3): 241–5, 1995.

62

[119] Zoeller RA and Raetz CR. Isolation of animal cell mutants deficient in plasmalogen

biosynthesis and peroxisome assembly. Proc Natl Acad Sci U S A, 83(14): 5170–4,

1986.

63

Danksagung

An dieser Stelle möchte ich meinen Eltern danken, die mich immer unterstützt haben.

Ganz besonderer Dank gebührt Prof. Dr. Keith Joiner von der Yale University Medical

School, in dessen Labor der experimentelle Teil dieser Arbeit durchgeführt wurde, sowie

allen Mitgliedern des Labors, insbesondere Dr. Heinrich Hoppe, Dr. Anthony Sinai, Dr.

Verena Karsten, Dr. Timothy Stedman und Dr. Isabelle Coppens.

Herrn Prof. Dr. M. Frosch möchte ich für die kritische Durchsicht des Manuskripts und

die konstruktive Kritik danken.

Rottweil im Juli 2002, Achim Kaasch

Lebenslauf von Achim Kaasch

Geboren am 17.09.1973 in Fulda, Deutschland.

Ausbildung

15.04.1993 Abitur am Leibniz Gymnasium Rottweil.

01.08.1993-

30.10.1994

Zivildienst im stationären Pflegedienst des KKH Hiltrup.

01.11.1994 Beginn des Medizinstudiums an der Julius-Maximilians-Universität

Würzburg.

01.08.1996 Ärztliche Vorprüfung mit der Note „gut“.

20.08.1997 Erstes Staatsexamen mit der Note „gut“.

01.09.1997-

31.03.1999

Predoctoral Associate im Labor von Prof. Dr. K. Joiner, Infectious Di-

seases Section, Internal Medicine, Yale University School of Medicine,

New Haven (USA).

01.05.1999-

30.03.2000

Hilfswissenschaftler im Institut für Mikrobiologie und Hygiene der

Universität Würzburg.

29.03.2001 Zweites Staatsexamen mit der Note „gut“.

04.06.2002 Drittes Staatsexamen mit der Note „sehr gut“.

Klinische Ausbildung

23.04.2001-

12.08.2001

PJ-Tertial in der Neurologischen Uniklinik Würzburg.

01.09.2001-

31.12.2001

Chirurgisches PJ-Tertial im Kantonsspital Herisau (Schweiz).

01.01.2002-

28.02.2002

Medizinisches PJ-Tertial im St. Lukes Hospital, Gwardamangia (Malta).

04.03.2002-

28.04.2002

Medizinisches PJ-Tertial am Clinical Center der National Institutes of

Health, Bethesda (USA).

Studentische Aktivitäten

WS 1995 Studentischer Beirat im Uni-med Verlag.

WS 1996 Organisation des Kurses „Anatomie am Lebenden“.

WS 1996 Organisation einer biochemischen Seminarreihe für Medizinstudenten.

1999, 2000, 2001 Konzeption und Organisation des Promomed-Kongresses an der Uni-

versität Würzburg.

Stipendien und Preise

08/1997 FEBS Stipendium zur Teilnahme am Sommer-Kurs „Protein Targeting

and Secretion“ in Cargèse, Korsika (Frankreich).

01.02.1998-

30.03.1999

Stipendium der Yale University Medical School zur Durchführung der

Doktorarbeit.

seit 08/2000 Internet-Stipendium von „E-Fellows.net“.

11/2000 Preisträger beim Wettbewerb „CEO of the future“ von McKinsey & Co.

und dem Manager Magazin.

Hiermit bestätige ich, dass obige Angaben richtig sind.

Rottweil, Juni 2002