Enzymkatalyse

Chemoenzymatische Synthese von Bausteinen f�rStatin-SeitenkettenMichael M�ller*

Professor Heinz G. Flosszum 70. Geburtstag gewidmet

Stichw�rter:Enzymkatalyse · Inhibitoren · Naturstoffe · Statine ·Steroide

Statine[1] hemmen das Enzym HMG-CoA-Reduktase (HMG = 3-Hydroxy-3-methylglutaryl), das die Reduktion vonHMG-CoA zu Mevalonat katalysiert,einen fr�hen und geschwindigkeitsbe-stimmenden Schritt der Cholesterol-Biosynthese. Diese Hemmung f�hrt zueinem reduzierten Gehalt an LDL-Cho-lesterol (LDL = low-density lipoprote-in). Bei klinischen Untersuchungen ingroßem Maßstab mit Cholesterol-sen-kenden Medikamenten der Statin-Klas-se wurde festgestellt, dass ein Zusam-menhang zwischen der Reduktion desGehalts an LDL-Cholesterol und einerAbnahme von koronaren Herzerkran-kungen besteht.[2] Zus�tzlich reduzierenStatine den Gehalt an Triglyceriden underh�hen den Gehalt an HDL-Choleste-rol (HDL = high-density lipoprotein).

Der Markt f�r Cholesterol-senken-de Medikamente, der auf mehr als20 Milliarden US $ gesch�tzt wird unddamit als einer der gr�ßten des pharma-zeutischen Sektors gilt, wird durch dieStatine dominiert. 2003 verzeichnetenAtorvastatin und Simvastatin einenUmsatz von 9.2 Milliarden US $ (2002:8.0 Milliarden US $) bzw. 6.1 MilliardenUS $ (2002: 6.2 Milliarden US $), wasbedeutet, dass diese beiden Pharmazeu-

tika weltweit die zwei umsatzst�rkstenMedikamente sind. Gegen�ber den mi-krobiell (partialsynthetisch) hergestell-ten Wirkstoffen Simvastatin, Pravasta-tin (2003: 2.8 Milliarden US $) undLovastatin (das erste, 1987 vermarkteteStatin) gewinnen die synthetischenHMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren Flu-vastatin, Atorvastatin[3] und Rosuvasta-tin (im August 2003 durch die US-FDAzugelassen)[4] zunehmend an Bedeu-tung.[5] Mit Pitavastatin (NK 104) hatbereits die n�chste Substanz die klini-sche Phase III erreicht.[2b] �blicherwei-se haben alle Statine ein homochiralesSeitenketten-Pharmakophor in Form ei-ner 3,5-Dihydroxys�ure[6] sowie einen(hetero-)aromatischen oder cyclischenRest (Schema 1).

Wegen des außerordentlich hohenMarktanteils und der Forderung nachhoher chemischer und stereochemischerReinheit (> 99.5 % ee, > 99% de) wur-den von konkurrierenden Forschungs-gruppen große Bem�hungen in die Pro-duktion synthetischer Statine investiert.Pharmazeutische, chemische und bio-technologische Firmen haben in letzterZeit chemoenzymatische Strategien f�rdie stereoselektive Synthese der 3,5-Dihydroxys�ure-Seitenkette entwickelt,bei denen unterschiedliche Biokatalysa-toren eingesetzt wurden (Schema 2).Dabei wurden einige beachtenswerte

Leistungen bei der Optimierung derbiokatalytischen Stufe f�r die Anwen-dung im industriellen Maßstab erbracht.Diese Beispiele verdeutlichen, dass zurSynthese eines bestimmten Zielmole-k�ls viele verschiedenartige enzymati-sche Umsetzungen anwendbar sind.

Die etablierte Strategie (Sche-ma 2A) der enantioselektiven Redukti-on von 4-Chloracetessigestern wie 1wurde von Shimizu et al. in Zusammen-arbeit mit Kaneka optimiert. Permeabi-lisierte Zellen eines rekombinanten E.-coli-Stammes, die sowohl eine Alkohol-Dehydrogenase (ADH) in Form einerCarbonyl-Reduktase aus Candida ma-gnoliae als auch Glucose-Dehydrogena-se aus Bacillus megaterium �berprodu-zieren, werden in einem Zweiphasen-system aus organischem L�sungsmittelund w�ssrigem Puffer zur Produktionvon enantiomerenreinem (S)-Ethyl-4-chlor-3-hydroxybutanoat ((S)-2) ver-wendet. Dabei werden Produktkonzen-trationen von 63 gL�1 in der organi-schen Phase in einer Ausbeute an iso-liertem Produkt von 95% erhalten,[7]

aber auch weit h�here Produktkonzen-trationen k�nnen erreicht werden.[7c]

Von Nachteil sind hier jedoch die hoheKonzentration des NebenproduktesGluconat und die Verwendung vonnichtlebenden Zellen. Lebende Orga-nismen, die sowohl den Katalysator als

[*] Prof. Dr. M. M�ller+

Institut f�r Biotechnologie 2Forschungszentrum J�lich GmbH52425 J�lich (Deutschland)Fax (+ 49)2461-613-870E-mail: mi.mueller@fz-juelich.de

[+] Aktuelle Anschrift: Institut f�r Pharma-zeutische WissenschaftenLehrstuhl f�r Pharmazeutische undMedizinische ChemieAlbert-Ludwigs-Universit�t FreiburgAlbertstraße 25, 79104 Freiburg (Deutsch-land)

Highlights

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auch das Cofaktor-regenerierende En-zym bilden, k�nnten eine kontinuierli-che Produktion mit hohen Umsatzzah-len f�r Katalysator und den CofaktorNAD(P)H erm�glichen.[8]

Wissenschaftler von Avecia Pharma-ceuticals (vormals Zeneca, vormals ICI)haben f�r die problematische diastereo-selektive Reduktion von 3-Hydroxyke-

tonen (3), die aus �kologischen und�konomischen Gr�nden ein preislimi-tierender Faktor im industriellen Maß-stab ist, eine biokatalytische Alternativeentwickelt. Die Reduktion von (S)-3(X = OH) mit Zellen von Pichia angustaf�hrt zur Bildung des diastereomeren-reinen Triols in einer Ausbeute an iso-liertem Produkt von 80 % (Substratkon-

zentration 25 gL�1). Immobilisierte Li-pase aus Candida antarctica (Chirazy-me L2) erm�glicht in sehr hoher Aus-beute den Zugang zum regioselektivacetylierten 4, das anschließend bei derSynthese des wichtigen Bausteins 5 ver-wendet wird.[9] Abh�ngig vom Stammund vom Substituenten an C-6 wirdentweder das syn- oder anti-1,3-Diol(zum Beispiel 6) erhalten.[9b] Ein �hnli-cher Zugang wurde von Wissenschaft-lern der Kaneka ausgearbeitet, zumBeispiel unter Verwendung von Candi-da magnoliae.[10]

Die Gruppe um Patel (Bristol-Myers Squibb) verwendete zur stereo-selektiven Direduktion von Ethyl-6-benzyloxy-3,5-dioxohexanoat Zellsus-pensionen von Acinetobacter calcoaceti-cus (Schema 2B). Das entsprechendeDiol wurde in 85% Ausbeute an isolier-tem Produkt mit 97% ee erhalten.[11]

Die bekannte Desymmetrisierungvon prochiralen 3-substituierten Glutar-s�urediestern durch enzymatische Hy-drolyse (Schema 2 C)[12] wurde von Che-mikern der Ciba Speciality Chemicalsf�r die Synthese von 8 im Kilogramm-Maßstab optimiert.[13] a-Chymotrypsin,ein besonders preiswerter und robusterBiokatalysator, wurde bei der selektivenHydrolyse des Triesters 7 verwendet.Der Prozess ist charakterisiert durch diehohe Substratkonzentration[14] von285 gL�1 und eine Ausbeute von 94%

Schema 1. HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren.

Schema 2. Biokatalytische Transformationen zur Synthese von (3R,5S)-Dihydroxyhexanoaten.Bn = Benzyl.

AngewandteChemie

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an isoliertem Produkt mit 98.2% ee.Nach Kettenverl�ngerung wird dieMethoxyacetylester-Einheit durch eineSchweineleber-Esterase(PLE)-kataly-sierte Hydrolyse (9!10) selektiv ge-spalten, wobei die Ethylester-Einheitunver�ndert bleibt.[13] Wegen der M�g-lichkeit zur flexiblen Funktionalisierungdes monogesch�tzten Glutarates 8[12]

er�ffnet diese Strategie, genauso wiedie folgende, prinzipiell den Zugang zubeiden Enantiomeren von 3-Hydroxy-5-oxohexanoaten und 5-Hydroxy-3-oxo-hexanoaten.

Burk et al. (Diversa) identifiziertenmehr als 200 neue Nitrilasen mithilfegroßer Genom-Datenbanken, erstelltdurch Extraktion von DNA direkt ausUmweltproben. Vier der identifiziertenEnzyme wurden erfolgreich zur Desym-metrisierung des aus Epichlorhydrin(11) leicht zug�nglichen 3-Hydroxyglu-tarnitrils (12) verwendet (Schema 2D).Anschließend wurde durch S�ttigungs-mutagenese eine hoch enantioselektiveNitrilase generiert. Bei der so optimier-ten, effizienten enzymatischen Transfor-mation kann mit hohen Konzentratio-nen gearbeitet werden (die Transforma-tion wurde im Gramm-Maßstab miteiner Substratkonzentration von 3mdurchgef�hrt). Nach 15 Stunden Reak-tionszeit wurde das Produkt (98.5% ee)in 96% Ausbeute isoliert, was einerRaum-Zeit-Ausbeute an Produkt von619 gL�1 d�1 entspricht.[15]

Kasai et al. (Daiso) beschrieben dieDehalogenase-katalysierte Racemat-trennung von rac-2.[16] Prochirales 1,3-Dichlorpropanol wurde bei der Synthe-se von (R)-4-Chlor-3-hydroxybutannitril((R)-16) �ber (R)-Epichlorhydrin ((R)-11) verwendet. Das Dehalogenase-En-zym katalysiert sowohl die reversibleHCl-Abspaltung von 1,3-Dichlorpropa-nol als auch die Einf�hrung einer Cyan-gruppe in (R)-Epichlorhydrin.[17] DasEnantiomer (S)-16 kann in zwei Stufen

entweder aus racemischem Epichlorhy-drin oder aus prochiralem 1,3-Dichlor-propanol synthetisiert werden.[18]

Vor kurzem wurde durch Wissen-schaftler bei Codexis zusammen mitRoger Sheldon die Kombination einerKetoreduktase- und einer Dehalogena-se-katalysierten Eintopfreaktion be-schrieben (Schema 2E).[19] Dies ist zwarein interessanter Zugang, allerdings ge-n�gen die publizierten Ergebnisse bis-lang nicht einer Anwendung dieserZweistufenumsetzung in gr�ßeremMaßstab.

Ein auf C-C-Bindungskn�pfung ba-sierender, hochinteressanter Zugang,der auf einer von Wong et al. vorgestell-ten Umsetzung beruht, wurde von Wis-senschaftlern bei DSM ausgearbei-

tet.[20,21] Die durch 2-Desoxyribose-5-phosphat-Aldolase (DERA) katalysier-te Bildung des Pyrans 17 erfolgt �bereine asymmetrische C-C-Bindungs-kn�pfung ausgehend von den preiswer-ten Grundstoffen Acetaldehyd undChloracetaldehyd. Die im urspr�ngli-chen Artikel ver�ffentlichten Reakti-onsbedingungen waren zwar nicht sehrvielversprechend (niedrige Substratkon-zentration, hoher Katalysatorbedarf,sieben Tage Reaktionszeit), diese Bio-transformation konnte aber jetzt in denindustriellen Maßstab �bertragen wer-den.[20c] Die optimierte enzymatischeUmsetzung, die bei niedriger Tempera-tur (2–4 8C) durchgef�hrt wird, ist durcheine hohe Endkonzentration des Pro-duktes (> 100 gL�1) gekennzeichnet.[20a]

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Vor kurzem haben Wissenschaftlerbei Diversa die bereits am Beispiel derNitrilasen erw�hnte Strategie der Isolie-rung von DNA aus Umweltproben zurErstellung von Genom-Datenbankengenutzt, um verbesserte DERA-Enzy-me zu identifizieren.[22] Mehr als 15DERA-Enzyme wurden dabei entdeckt,von denen eines zur Prozessoptimierungim 100-g-Maßstab verwendet wurde.Burk et al. haben durch Verwendungeiner Fed-Batch-Strategie, die wegenSubstrathemmung erforderlich ist, eineEndkonzentration von 93 gL�1 (>99.5%ee, 96.6% de) an 17 erreicht und konn-ten zugleich die Enzymmenge auf 2%(wt/wt) reduzieren. Zus�tzlich habenWong et al. k�rzlich die durch dieDERA-S238D-Mutante katalysierteUmsetzung von 3-Azidopropionaldehydmit zwei Molek�len Acetaldehyd ver�f-fentlicht.[21d] Damit ist der Atorvastatin-Seitenketten-Baustein 18 �ber eine di-rekte chemoenzymatische F�nfstufen-synthese ausgehend von preiswertenGrundstoffen zug�nglich.

Diese Beispiele zeigen, dass moder-ne enzymatische Umsetzungen ein au-ßerordentlich hohes Niveau erreicht ha-ben, was sie zu wertvollen und konkur-renzf�higen Methoden f�r die chemi-sche und pharmazeutische Industriemacht. Offensichtlich werden Biokata-lysatoren „erwachsen“, was ihre Akzep-tanz bei Chemikern angeht. Biokataly-tische Strategien erm�glichen innovati-ve L�sungen f�r Probleme wie gekreuz-te Aldoladditionen, die regio- und ste-reoselektive Reduktion von 1,3-Diketonen, die stereoselektive Bildungvon 1,3-Diolen oder problematische De-symmetrisierungen prochiraler Verbin-dungen. Dies wird auch einen Einflussauf die Entwicklung und Aufkl�rungnichtenzymatischer Reaktionen undnicht zuletzt auf die Ausbildung vonStudenten der Chemie, Pharmazie undBiologie haben.

Online ver�ffentlicht am 9. Dezember 2004

[1] Entsprechend der Anatomisch-thera-peutisch-chemischen (ATC-)Klassifika-tion der WHO wird den InternationalenFreinamen (international nonproprieta-ry names, INN) der so genannten „Sta-tine“ die Endung „-vastatin“ zugeord-net.

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[5] Cerivastatin, vermarktet von Bayer,wurde 2001 vom Markt genommen, daF�lle von Rhabdomolyse (starker Mus-keltoxizit�t) auftraten.

[6] Fluvastatin wird als Racemat vertrieben.[7] a) Y. Yasohara, N. Kizaki, J. Hasegawa,

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