Cyanopeptoline und Scytocyclamide: Zyklische Peptide aus ...

Cyanopeptoline und Scytocyclamide: Zyklische

Peptide aus Scytonema hofmanni PCC 7110

Struktur und biologische Aktivität

Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde

der Fakultät für Biologie der Albert-Ludwigs-Universität

Freiburg im Breisgau

vorgelegt von Apotheker Jan Christoph Grewe

aus Landau i. d. Pfalz

2005

Dekan: Prof. Dr. G. Fuchs

Leiter der Arbeit: Prof. Dr. J. Weckesser

Referent: Prof. Dr. J. Weckesser

Koreferent: PD Dr. A. Liszkay

Tag der Verkündung des Prüfungsergebnisses: 22.12.2005

I

Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis........................................................................................................................I Chemikalien und Materialien ................................................................................................... IV Geräte .......................................................................................................................................VI Abkürzungen ...........................................................................................................................VII Zusammenfassung.................................................................................................................... IX 1. Einleitung ............................................................................................................................... 1

1.1. Cyanobakterien und sekundäre Stoffwechselprodukte ................................................... 1 1.2. Cyanobakterien................................................................................................................ 1 1.3. Symbiose ......................................................................................................................... 4 1.4. Sekundärmetabolismus.................................................................................................... 5 1.5. Ökologie der Sekundärstoffwechselprodukte ................................................................. 5 1.6 Biosynthese der Sekundärstoffwechselprodukte.............................................................. 6 1.7. Biologisch aktive Substanzen aus Cyanobakterien......................................................... 7

1.7.1 Cyanobakterielle Toxine ........................................................................................... 7 1.7.1.1. Hepatotoxine ..................................................................................................... 8 1.7.1.2. Neurotoxine....................................................................................................... 9 1.7.1.3. Dermatotoxine und hautreizende Toxine ........................................................ 10

1.7.2.Cyanobakterien als Quelle neuer Arzneistoffe........................................................ 11 1.7.2.1. Antimikrobielle Substanzen ............................................................................ 11 1.7.2.2. Zytostatika....................................................................................................... 13 1.7.2.3. Enzyminhibitoren ............................................................................................ 14 1.7.2.4. Weitere Substanzklassen ................................................................................. 16

2. Material und Methoden ........................................................................................................ 22 2.1. Kultivierung von Scytonema hofmanni PCC 7110....................................................... 22

2.1.1. Anzucht und Kulturmedium................................................................................... 22 2.1.2. Ernte der Kulturen und Lagerung........................................................................... 23

2.2. Peptid-Isolierung aus Scytonema hofmanni PCC 7110................................................. 23 2.2.1. Extraktion ............................................................................................................... 23 2.2.2. Festphasenchromatographie ................................................................................... 23

2.3. Hochleistungsflüssigchromatographie .......................................................................... 24 2.3.1. Analytische Umkehrphasenchromatographie ........................................................ 24 2.3.2. RP-HPLC im semipräparativen und präparativen Maßstab................................... 25

2.4. Identifizierung der Peptide und Reinheit ...................................................................... 27 2.4.1. Co-Chromatographie (Co-Elution) ........................................................................ 27

2.5. Strukturaufklärung der isolierten Substanzen ............................................................... 28 2.5.1. Ultraviolett-Spektroskopie ..................................................................................... 28 2.5.2. Infrarotspektroskopie ............................................................................................. 28 2.5.3. Massenspektroskopie ............................................................................................. 29 2.5.4. Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie ..................................................... 29 2.5.5. Magnetische Kernresonanzspektroskopie .............................................................. 30 2.5.6. Gaschromatographie-Massenspektrometrie-Messungen ....................................... 30 2.5.7. Konfigurationbestimmung der Aminosäuren......................................................... 30

2.6. Enzymhemmtests .......................................................................................................... 31 2.6.1. Trypsin ................................................................................................................... 31 2.6.2. α–Chymotrypsin..................................................................................................... 31 2.6.3. Plasmin ................................................................................................................... 32 2.6.4. Papain ..................................................................................................................... 32 2.6.5. Elastase Typ IV ...................................................................................................... 32

II

2.6.6. Thrombin................................................................................................................ 32 2.6.7. Glutathion-S-Transferase ....................................................................................... 33 2.6.8. Carboxypeptidase A ............................................................................................... 33 2.6.9. Leucin-Aminopeptidase ......................................................................................... 33 2.6.10. Thermolysin ......................................................................................................... 33 2.6.11. Proteinphosphatase PP1A .................................................................................... 34

2.7. Testung auf antimikrobielle Aktivität ........................................................................... 34 2.8. Hämolysetest ................................................................................................................. 35 2.9. Toxizitätstest mit Kleinkrebsen (Crustaceen) ............................................................... 35 2.10. Zytotoxizitätsversuche ................................................................................................ 36

2.10.1. Zelllinien .............................................................................................................. 36 2.10.2. Trypanblaufärbung ............................................................................................... 36

2.11. Versuche zur Membranschädigung............................................................................. 37 2.11.1. Testung auf porenbildende Aktivität.................................................................... 37 2.11.2. 86Rubidium+-Efflux .............................................................................................. 37

2.12. Immunhistochemische Untersuchungen ..................................................................... 38 2.13. Testung auf Apoptose.................................................................................................. 38

2.13.1. Fluoreszenz-aktivierte Zell-Sortierung (FACS-Analysen) .................................. 38 2.13.1.1. Apoptose-Färbung mit Annexin V-FITC und Propidiumiodid..................... 39 2.13.1.2. Mitochondriales Membranpotential .............................................................. 39 2.13.1.3. Detektion reaktiver Sauerstoffspezies ........................................................... 39

3. Ergebnisse ............................................................................................................................ 40 3.1. Charakterisierung der Cyanopeptoline und Scytocyclamide ........................................ 40

3.1.1. Extraktion und Isolierung....................................................................................... 40 3.1.2. Strukturaufklärung von Cyanopeptolin 1060A ...................................................... 43

3.1.2.1. Ultraviolett-Spektroskopie .............................................................................. 43 3.1.2.2. Infrarotspektroskopie ...................................................................................... 43 3.1.2.3. Massenspektrometrie....................................................................................... 44 3.1.2.4. Magnetische Kernresonanzspektroskopie ....................................................... 45

3.1.3. Strukturaufklärung von Cyanopeptolin 1067A ...................................................... 49 3.1.3.1. Ultraviolett-Spektroskopie .............................................................................. 49 3.1.3.2. Infrarotspektroskopie ...................................................................................... 49 3.1.3.3. Massenspektrometrie....................................................................................... 50 3.1.3.4. Magnetische Kernresonanzspektroskopie ....................................................... 51

3.1.4. Strukturaufklärung von Cyanopeptolin 946A ........................................................ 53 3.1.4.1. Ultraviolett-Spektroskopie .............................................................................. 53 3.1.4.2. Massenspektrometrie....................................................................................... 53 3.1.4.3. Magnetische Kernresonanzspektroskopie ....................................................... 55

3.1.5. Strukturaufklärung von Scytocyclamid A.............................................................. 57 3.1.5.1. Ultraviolett-Spektroskopie .............................................................................. 57 3.1.5.2. Infrarotspektroskopie ...................................................................................... 58 3.1.5.3. Massenspektrometrie Teil I ............................................................................. 59 3.1.5.4. Magnetische Kernresonanzspektroskopie ....................................................... 59 3.1.5.5. Massenspektrometrie Teil II............................................................................ 62 3.1.5.6. Bestimmung der Aminosäurekonfiguration .................................................... 64

3.1.6. Strukturaufklärung von Scytocyclamid B .............................................................. 65 3.1.6.1. Ultraviolett-Spektroskopie .............................................................................. 65 3.1.6.2. Infrarotspektroskopie ...................................................................................... 66 3.1.6.3. Massenspektrometrie....................................................................................... 67 3.1.6.4. Magnetische Kernresonanzspektroskopie ....................................................... 69

3.1.7. Struktur von Scytocyclamid C ............................................................................... 71

III

3.1.7.1. Infrarotspektroskopie ...................................................................................... 71 3.1.7.2. Massenspektrometrie....................................................................................... 72 3.1.7.3. NMR-Analytik zu Scytocyclamid C ............................................................... 73

3.2. Biologische Aktivität..................................................................................................... 75 3.2.1. Enzyminhibitions-Assays....................................................................................... 75 3.2.2. Antimikrobielle Untersuchungen ........................................................................... 77 3.2.3. Toxizitätsversuche mit Kleinkrebsen ..................................................................... 77 3.2.4. Zelltoxizitäts-Assays .............................................................................................. 78 3.2.5. Porenbildende Aktivität.......................................................................................... 80 3.2.6. Membranschädigung .............................................................................................. 81 3.2.7. Hämolysetest .......................................................................................................... 81 3.2.8. Apoptose-Assays.................................................................................................... 82 3.2.9. Immunhistochemische Untersuchungen ................................................................ 84

4. Diskussion ............................................................................................................................ 86 4.1. Isolierung und Strukturaufklärung ................................................................................ 86 4.2. Biologische Aktivität..................................................................................................... 92

4.2.1. Enzymhemmwirkung ............................................................................................. 92 4.2.2. Testung auf antimikrobielle Aktivität .................................................................... 93 4.2.3. Toxizitäts-Assays ................................................................................................... 94

4.2.3.1. Toxizitätstest mit Primärkonsumenten............................................................ 94 4.2.3.2. Testung auf Zytotoxizität ................................................................................ 94

4.3. Ökologie cyanobakterieller Sekundärstoffwechselprodukte......................................... 98 4.4. Therapeutische Relevanz peptidischer Sekundärmetabolite ....................................... 100 4.5. Ausblick ...................................................................................................................... 103

Literatur.................................................................................................................................. 105 Danksagung............................................................................................................................ 119

IV

Chemikalien und Materialien Acetonitril Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe Alexa 488 Anti Maus / Kaninchen IgG Molecular Probes, Heidelberg Alexa 594-Phalloidin Molecular Probes, Heidelberg Ammoniumeisen-(III)-citrat Merck KGaA, Darmstadt Ammoniumhydrogencarbonat Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe Anti-alpha-Tubulin III Antikörper Sigma-Aldrich, Taufkirchen APS Biorad München BAPNA Sigma-Aldrich GmbH (Fluka), Taufkirchen Borsäure Merck KGaA, Darmstadt BSA, Fraktion V, Lyophilisat Paesel und Lorei, Hanau BST Medium dehydrated Difco Laboratories GmbH, Heidelberg Trypticase Peptone Becton Dickinson AG, Basel C18-Kartuschen (1000 mg) Macherey-Nagel GmbH & Co KG, Düren Calciumchlorid • 2H2O Merck KGaA, Darmstadt Carboxypeptidase A Merck KGaA, Darmstadt Carboxypeptidase A Inhibitor (potato tuber) Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen CCCP Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen Chromabond C18 Material Macherey-Nagel GmbH & Co KG, Düren Chromozym PL Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen Chymotrypsin Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen Citronensäure Merck KGaA, Darmstadt Cobaltnitrat • 6 H2O Merck KGaA, Darmstadt Columbia Blood Agar Base Difco Laboratories GmbH, Heidelberg CSB-Puffer Pharmakologie-Freiburg Cystein Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen Dikalium-hydrogenphosphat • 3H2O Merck KGaA, Darmstadt Dinatrium - EDTA Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen Dinatriumhydrogenphosphat x 2 H2O p.a. Merck KGaA, Darmstadt DMSO Sigma-Aldrich GmbH (Fluka), Taufkirchen DTT Fluka, Taufkirchen EGTA Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen Elastase Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen EMEM Pharmakologie-Freiburg Essigsäure Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe Essigsäure p.a. Merck KGaA, Darmstadt Ethanol Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe FCS Biochrom AG, Berlin DiOC6(3) Molecular Probes, Heidelberg Fluoresceinisothiocyanat-Annexin V BD Pharmingen, Heidelberg Glycerin Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe Glycin Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe H-Bouillon Merlin 3-M-HCl-Gas in MeOH Supelco, Bellefonte, PA,USA Hippuryl-L-phenylalanin Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen Hydroethidin Molecular Probes, Heidelberg Kaliumchlorid p.a. Merck KGaA, Darmstadt Kaliumdihydrogenphosphat p.a. Merck KGaA, Darmstadt Kupfersulfat • 5 H2O Merck KGaA, Darmstadt D-FDAA Novabiochem, Läufelfingen, Schweiz L-FDAA Novabiochem, Läufelfingen, Schweiz Leucinaminopeptidase Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen l-Leucin-p-Nitroanilid Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen Magnesiumsulfat • 7 H2O Merck KGaA, Darmstadt Manganchlorid • 4 H2O Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen McCoys-Medium Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen Methanol Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe MH-Bouillon MacFarland Natriumacetat Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen Na-Benzoyl-DL-arginin-4-nitroanilid Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen

V

Natriumcarbonat Merck KGaA, Darmstadt Natriumchlorid Merck KGaA, Darmstadt Natriumdihydrogenphosphat x 2 H2O reinst Merck KGaA, Darmstadt Natriumhydrogencarbonat p.a. Merck KGaA, Darmstadt Natriummolybdat • 2 H2O Merck KGaA, Darmstadt Natriumnitrat Merck KGaA, Darmstadt Natriumphosphat Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen Natriumsulfat Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen p-Nitrophenolphosphat Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilid Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen N-(3-[2-Furyl]acryloyl-Gly-Leu-amid Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilid Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen Papain Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen Paraformaldehyd Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen PEG (MW 35.000) Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen PIPES Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen Plasmin Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen Propidiumiodid BD Pharmingen, Heidelberg Proteinphosphatase PP1A Calbiochem, Bad-Soden QMA Kartuschen (1000 mg) Waters GmbH, Eschborn SA Kartuschen (500 mg) Macherey-Nagel GmbH & Co, KG Düren Salzsäure Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe Sephadex LH-20 Material Amersham Biosciences Europe GmbH Freiburg TFA Sigma-Aldrich GmbH (Fluka), Taufkirchen TFAA Fluka, Schweiz Thermolysin Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen Thrombin Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen Tosyl-Gly-Pro-Lys-p-nitroanilid Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen Tris Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen Tris-HCl Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen Trypanblau Sigma-Aldrich GmbH (Fluka), Taufkirchen Trypsin Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen Valinomycin Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen Zinksulfat • 7 H2O Merck KGaA, Darmstadt

VI

Geräte Autoklav Webeco, Bad Schwartau Autosampler Vials Waters GmbH, Eschborn Chirasil-Val-Säule (Permabond-Chirasil-Val) Macherey-Nagel GmbH & Co. KG Düren CC 250/4 Nucleodur C18-5 Gravity (HPLC-S) Macherey-Nagel GmbH & Co. KG Düren SP 250/4 Nucleosil 100-5 C18 HPLC Säule Macherey-Nagel GmbH & Co. KG Düren SP 250/10 Nucleosil 100-7 C18 HPLC Säule Macherey-Nagel GmbH & Co. KG Düren SP 250/21 Nucleosil 100-7 C18 HPLC Säule Macherey-Nagel GmbH & Co. KG Düren FACS FACS-Calibur Becton/Dickinson Corp., Heidelberg Feinwaage R200D Sartorius AG, Göttingen Gefrierschränke Liebherr-Hausgeräte GmbH, Ochsenhausen HPLC 600 Controller Waters GmbH, Eschborn HPLC 717 Autosampler Waters GmbH, Eschborn HPLC 996 UV Detektor Waters GmbH, Eschborn HPLC Fraction Collector Waters GmbH, Eschborn IR-Spektrometer Spectrum One FT-IR-spectr. Perkin-Elmer, Boston, USA Lyophilisator lyovac 2 Leybold Heraeus GmbH, Hanau Magnetrührer Ikamag Ret IKA, Staufen Massenspektrometer (Maldi Voyager DE-PRO time of flight) PerSeptive BioSystems, Framingham, MS

Massenspektrometer (“LCQ ion trapter”) Finnigan Corp., San Jose Massenspektrometer (“LTQ-FT-ICR) Thermo Electron Corporation, Bremen Membranfilter 0,45 µm (Chromafil PET) Macherey-Nagel GmbH & Co. KG Düren Mikrotiterplatten Falcon, Becton Dickinson, 3072 Mikrotiterplatten (UV) Corning Incorporated 3635 costar, Corning, USA MR 5000 Elisa Reader Dynatech, Chantilly, Virginia NMR Spektrometer (Avance DMX500) Bruker AG, Rheinstetten NMR Spektrometer (Avance DRX500) Bruker AG, Rheinstetten NMR Spektrometer (Avance DRX600) Bruker AG, Rheinstetten Papierfilter 595 Schleicher & Schuell, Dassel PH-Meter 761 Calimatic Knick, Elektron. Messgeräte GmbH & Co Berlin Planktonnetz Hydro-Bios, Kiel-Holtenau Quarzküvetten (UV) Hellma, Müllheim Saugflasche Schott Glas, Duran®, Mainz Säulenofen Millipore GmbH, Eschborn Schütteltisch SWIP Edmund Bühler, Tübingen Szintillationszähler LKB Rackbeta 1209 LKB, Gräfelfing Speed Vac Heto-Holten GmbH, Wettenberg Steilbrustflaschen Schott Glas, Duran®, Mainz Sorvall RC-5B Zentrifuge DuPont Instruments, Bad Homburg Thamnotoxkit F MicroBiotests Inc., Nazareth, Belgien Thermomixer 5437 Eppendorf AG, Hamburg UV Spektrometer Varian Cary 100 Bio Cary, Cary, USA Vakuumfiltrationskammer Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Düren Vakuumpumpe Vaccubrand GmbH & Co KG, Wertheim Zentrifuge 5417 R Eppendorf AG, Hamburg

VII

Abkürzungen ACE Angiotensin converting enzyme Adda 3-amino-9-methoxy-10-phenyl-2,6,8 trimethyl deca,4,6 dienoic acid AFA Aphanizomenon flos aquae Ahp 3-Amino-6-hydroxy-2-oxo-piperidin Aoc Aminooctanoic acid ATCC American type culture collection BAPNA Benzoyl-L-arg-p-nitroanilid BST-Agar Bovine Somatotropin CCCP carbonyl-cyanide m-chlorophenylhydrazone COSY Correlated spectroscopy CSB Cytoskeleton stabilizing buffer Da Dalton Dhb Didehydrobutyrin DDT DiThiothreitol DiOC6(3) 3,3'-Dihexyloxacarbocyanine iodide DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonucleinsäure dubl Dublett EAWAG Eidgenössische Anstalt für Wasserversorgung EC Enzyme class ED50 Halbmaximale effektive Dosis EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ELISA Enzyme linked immunosorbent assay EMEM Eagle’s minimum essential medium ESI Electrospray et al. Et alii FACS Fluorescence activated cell sorter FCS Fötales Kälber Serum FITC Fluoreszeinthiocyanat FSC Forward scatter FT Fourrier Transform FT-ICR Fourrier Transform- Ionenzyklotron gp Glykoprotein ha Hektar HAc Essigsäure H-Bouillon Hinton-Bouillon HE Hydroethidin Hiv Hydroxyisovaleriansäure HMBC Heternuclear Multiple-Bond Correlation Hmv Hydroxymethylvaleriansäure HPLC High performance liquid chromatography HSQC Heteronuclear single quantum coherence spectroscopy HyPro Hydroxyprolin IC50 Inhibition concentration; malbmaximale Hemmwirkung IgG Immunglobulin G IR Infrarot IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry LC-MS Liquid chromatography; Flüssigchromatographie LD50 Letale Dosis; Dosis die zum Tod von 50%der Vergleichspopulation führt LPS Lipopolysaccharid LTQ-FT Linear Trap Q – Fourrier Transform MALDI-TOF-MS Matrix assisted laser deionisation ionisation Time of flight Me Methyl- MeOH Methanol MH-Bouillon Müller-Hinton-Bouillon MHZ Megaherthz

VIII

MIC Minimal inhibierende Konzentration mmu Milli mass units NMTyr N-Methyl-Tyrosin MS Massenspektrometrie mult Multiplett NMR Nuclear magnetic resonance NOE Nuclear overhauser effect NRPS Nichtribosomale Polypeptid Synthetase OD Optische Dichte OMTyr O-Methyl-Tyrosin PBS Phosphate buffered saline (Phosphatpuffer) PCC Pasteur culture collection PEG Polyethylenglykol PI Propidiumiodid PIPES Piperazin-N,N´-bis[2-ethansulfonsäure] ppm Parts per million PSD Post source decay RNA Ribonucleinsäure ROESY Rotating Frame Overhauser Effect Spectroscopy RP-HPLC Reversed phase-HPLC; Umkehrphasen-HPLC sing Singulett SSC Sideward scatter T Tesla TFA Trifuoressigsäure TFAA Trifluoressigsäureanhydrid TISTR Thailand Institute of Scientific and Technological Research TOCSY Total correlated spectroscopy trip Triplett Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan U/min Umdrehungen / Minute UV Ultraviolett v/v Volumenanteil (volume per volume)

Aminosäure Dreibuchstaben-Code Einbuchstaben-Code Alanin Ala A Arginin Arg R Asparagin Asn N Asparaginsäure Asp D Cystein Cys C Glutamin Gln Q Glutaminsäure Glu E Glycin Gly G Histidin His H Isoleucin Ile I Leucin Leu L Lysin Lys K Methionin Met M Phenylalanin Phe F Prolin Pro P Serin Ser S Threonin Thr T Tryptophan Trp W Tyrosin Tyr Y Valin Val V

IX

Zusammenfassung

Die vorliegende Arbeit beschreibt die Isolierung und Charakterisierung von Cyanopeptolinen

und Scytocyclamiden aus Zellen des Cyanobakteriums Scytonema hofmanni PCC 7110. Es

wurden drei Peptide vom Cyanopeptolin-Typ isoliert und mit den Scytocyclamiden A bis C

eine, für Scytonema hofmanni PCC 7110 bisher nicht beschriebene Peptidklasse identifiziert.

Die neu isolierten Cyanopeptoline wurden als Derivate mit Molekülmodifikationen zu den

von Matern et al. (2001 und 2003) beschriebenen Scyptolinen A und B, sowie Hofmannolin

identifiziert. Cyanopeptolin 1067A unterscheidet sich von Hofmannolin durch den Austausch

von Tyrosin gegen die basische Aminosäure Arginin auf N-terminaler Seite der Ahp-Gruppe

[2-Hydroxyisovaleryl-Glu-(Thr-Arg-Ahp-OMTyr-NMTyr-Val-O-)]. Mit Cyanopeptolin

1060A wurde eine weitere verwandte Struktur zu Hofmannolin aufgeklärt: anstatt 2-Hydroxy-

3-methylvaleriansäure findet man 2-Hydroxyisovaleriansäure als Acylrest am N-Terminus der

Seitenkette [2-Hydroxyisovaleryl-Glu-(Thr-Tyr-Ahp-OMTyr-NMTyr-Val-O-)]. Bei Cyano-

peptolin 946A [Butyryl-Ala-Thr-(Thr-Leu-Ahp-Thr-MTyr-Val-O-)] wurde das Fehlen der

Chlorierung am N-methylierten Tyrosin im Vergleich zu Scyptolin A belegt.

Scytocyclamid A gleicht zu großen Teilen Laxaphycin A, einem Peptid, welches erstmals bei

Anabaena laxa beschrieben wurde. Es ist ein zyklisches Undecapeptid [(βAoc-Gln-E-Dhb-

Hyp-Hse-Phe-Leu-Ile-Ile-Leu-Gly)]. Im Vergleich zu Laxaphycin A ist Homoserin gegen

Glutamin ausgetauscht. Zwei weitere Peptide aus dieser Substanzklasse wurden strukturell

aufgeklärt: Scytocyclamid B weist eine zu Laxaphycin D identische Masse und

Aminosäuresequenz auf. Scytocyclamid C unterscheidet sich von Scytocyclamid B durch das

Fehlen einer Hydroxylgruppe am Leucin. Beide sind zyklische Dodecapeptide: [(βAoc-Val-

Hle-Ala-Hle-Gln-NM-Ile-Has-Thr-Pro-Leu-Thr)] für Scytocyclamid B, bzw. [(βAoc-Val-Hle-

Ala-Leu-Gln-NM-Ile-Has-Thr-Pro-Leu-Thr)] für Scytocyclamid C. Die Strukturen der

bearbeiteten Peptide wurden durch Massenspektometrie, IR- und NMR-Spektroskopie gelöst.

Aufgrund der geringen Ausbeute musste bei den Cyanopeptolinen auf eine Konfigurations-

analyse verzichtet werden. Analog zu allen anderen beschriebenen Cyanopeptolinen liegt

jedoch vermutlich jeweils die L-Konformation der Aminosäuren vor. Bei Scytocyclamid A

wurde die Konfiguration durch GC-MS-Versuche an chiralen Phasen soweit möglich

bestimmt.

Die Cyanopeptoline sowie die Scytocyclamide wurden in verschiedenen Testsystemen auf

ihre antimikrobielle, enzyminhibierende, zytotoxische und toxische Wirkung überprüft. Eine

X

antimikrobielle Wirksamkeit wurde für keine der Substanzen festgestellt. Bei den

Enzymhemmtests hatte Cyanopeptolin 946A eine vergleichbare Wirkung auf Elastase (IC50

von 0,45 µg/ml entsprechend 0,47 µmol) wie Scyptolin A (0,16 µmol), bzw. Scyptolin B

(0,14 µmol). Bei allen anderen getesteten Enzymen wurde keine Wirkung beobachtet.

Cyanopeptolin 1060A konnte kein Zielenzym zugeordnet werden. Die Strukturvariante des

Cyanopeptolins 1067A mit der basischen Aminosäure Arginin neben der Ahp-Gruppe hatte

deutliche Wirkung gegenüber Trypsin (IC50 von 0,064 µg/ml entsprechend 60 nmol). Neben

Trypsin wurde auch Plasmin gehemmt (IC50 von 1,0 µg/ml entsprechend 0,94 µmol).

Für die Klasse der Scytocyclamide wurden toxische Effekte auf Primärkonsumenten belegt:

Im 24 h Toxizitätsassay hatten die genannten Substanzen bereits nach 2 h letale Wirkungen

bei Thamnocephalus platyurus (LD50 für Scytocyclamid B von 4 µmol und für

Scytocyclamid A von 12 µmol).

Bei den Tests zu einer möglichen Wirkung der isolierten Peptide auf humane Zelllinien waren

die Cyanopeptoline unwirksam, während Scytocyclamide eine ausgeprägte Zellzytotoxizität

aufwiesen. Bei den Zellzytotoxizitätstests wurden alle getesteten Zelllinien bei einer

Konzentration von 10 µg/ml (entsprechend ca. 8 µmol) gleichermaßen beeinflusst und die

Zellen abgetötet. Die Wirkung wurde neben Aufnahmen mit dem Phasenkontrastmikroskop

durch ein Differential-Interferenz-Kontrastmikroskop dokumentiert.

Bei den Ansätzen zur Frage nach der Ursache der Zytotoxizität wurden verschiedene

apoptotische Prozesse überprüft. Eine für Apoptose charakteristische Caspase-Aktivität oder

der Verlust des Mitochondrien-Membranpotentials wurden allerdings nicht bestätigt. Es gab

jedoch andere Hinweise auf mögliche Apoptose-Mechanismen, wie die Translozierung von

Phosphatidylserin von der Membraninnenseite auf die Membranaußenseite, welche mittels

Durchflusszytometrie verfolgt wurde. Eine mögliche Induktion der Apoptose könnte über

reaktive Sauerstoffspezies erfolgen, welche durch die Oxidierung von Hydroethidin zu

Ethidium nachgewiesen wurden.

Membranschädigung durch Porenbildung in künstlichen Membranen mit Diphytanoyl-

phosphatidylcholin als Membranbestandteil durch die isolierten Peptide wurde nicht

beobachtet. Bei cholesterolhaltigen Membranen wurde jedoch erhöhte Leitfähigkeit

gemessen. Die vermutete Membranschädigung wurde durch 86Rubidium+-Efflux-Experimente

an HT-29-Zellen belegt. Als weiterer zellschädigender Effekt wurde der Abbau von

α-Tubulin durch Scytocyclamide mittels Immunfluoreszenzfärbung nachgewiesen.

Einleitung 1

1. Einleitung

1.1. Cyanobakterien und sekundäre Stoffwechselprodukte

Naturprodukte sind eine wertvolle Quelle für biologisch aktive Verbindungen trotz der

Fortschritte in der synthetischen Chemie. Heute ermöglichen DNA-Sequenzdatenbanken neue

Zielstrukturen zu identifizieren. Nachdem man sich bei der Suche nach neuen Wirkstoffen

oder Leitstrukturen für neue Medikamente zunächst auf terrestrische Pflanzen und Tiere

beschränkte, wird mittlerweile das Gebiet der Mikroorganismen intensiv untersucht.

Meist sind es die Sekundärstoffwechselprodukte, die von besonderem Interesse sind. Sie sind

zwar für Wachstum und Entwicklung entbehrlich, wurden aber im Zuge der Evolution unter

dem Selektionsdruck der Umwelt optimiert und stellen ein großes Reservoir von

„Wirkstoffen“ dar. Auch die forschenden Pharmakonzerne bedienen sich dieses schier

unerschöpflichen Molekülbaukastens. Dabei gibt die traditionelle Medizin einzelner Völker

oft wichtige Hinweise bei der Suche nach potenten Verbindungen (Brunner, 2000). Hinweise

auf die Verwendung von Cyanobakterien finden sich beispielsweise aus der Zeit um 1500 v.

Chr. als Nostoc-Arten zur Behandlung von Gicht, Fisteln und verschiedenen Formen des

Krebs eingesetzt wurden (Burja et al., 2001). Neben der AFA-Alge (Aphanizomenon flos

aquae, kurz AFA) werden Nostoc sp. und Spirulina sp. als Nahrungsergänzungsmittel und

teilweise seit mehr als 1.000 Jahren als protein- und vitaminreiche Nahrungsquelle (Kay,

1991) eingesetzt. Seit mehreren Jahren werden cyanobakterielle Extrakte in die Screening-

Programme aufgenommen. Die stoffliche Vielfalt steht im Einklang mit der beobachteten

breiten Bioaktivität. Auf Grund der pharmakologischen Eigenschaften könnten solche

Substanzen, wie oben erwähnt, als Leitstrukturen zur Entwicklung neuer Pharmaka

Bedeutung erlangen (Radau, 2000).

1.2. Cyanobakterien

Cyanobakterien, früher auch Blaualgen oder Cyanophyceaen genannt, sind prokaryontische,

photoautotrophe Organismen, die keinen membranumhüllten Zellkern oder andere

membrangebundene Zellorganellen wie Chloroplasten oder Mitochondrien besitzen. Sie

besitzen Chlorophyll a, daneben zusätzlich Phycobiline, die im gelben und grünen

Spektralbereich (Phycocyanin, bzw. Phycoerythrin) Licht absorbieren. Phycobiline findet man

Einleitung 2

nur bei Cyanobakterien und Rotalgen. Sie sind es auch, welche die charakteristische Farbe

ausmachen.

Die Zugehörigkeit zu den Bakterien wurde unter anderem durch elektronenmikroskopische

Untersuchungen und 16s rRNA Analysen begründet. Cyanobakterien zählen zu den gram-

negativen Bakterien.

Die Einteilung der Cyanobakterien in Familien erfolgt derzeit noch nach morphologischen

Kriterien und nach der Vermehrungsweise (Anagnostidis et al., 1990; Baker et al., 1999). So

können Cyanobakterien einzellig, in Zellgruppen (Kolonien) oder als Zellfäden (Filamente)

auftreten. Sie vermehren sich durch Zwei- oder Mehrfachteilung oder durch wiederholte

Abgliederung endständiger Zellen. Es gibt Veröffentlichungen, welche eine Eingliederung der

Cyanobakterien unter dem „Bacteriological Code“ vornehmen. Bisher sind gerade einmal 13

cyanobakterielle Gattungen im „International Journal of Systematic and Evolutionary

Microbiology (IJSEM)/International Journal of Systematic Bacteriology (IJSB)“

vorgeschlagen worden; von diesen wurden aber nur fünf unter gültigen Gesichtspunkten

veröffentlicht (Oren, 2004). Beide Nomenklatursysteme werden im Augenblick parallel

angewandt, als Konsequenz daraus besitzen viele Cyanobakterienarten mehrere Synonyme

(Skulberg, 1993). In absehbarer Zeit ist eine neue Einteilung unter Berücksichtigung

genetischer Daten zu erwarten.

Zur Zeit werden 5 Sektionen unterschieden, wobei die Sektionen I (Chroococcales) und

II (Pleurocapsales) einzellige Formen umfassen, die sich auf Grund ihrer Zellteilung

unterscheiden, während die Sektionen III (Oscillatoriales), IV (Nostocales) und V

(Stigonematales) filamentöse Arten umfassen, welche sich durch Besitz von Heterocysten und

die Art der Differenzierung unterscheiden.

Fossile Funde (versteinerte Stromatoliten) belegen, dass die Vorläufer der heutigen

Cyanobakterien bereits vor 2,5 bis 3,5 Milliarden Jahren die Erde besiedelten und damit zu

den ältesten Organismen gehören, die zu einer sauerstoffbildenden Photosynthese fähig sind.

Stromatoliten sind calciumhaltige Strukturen, welche während starkem Wachstum von

Cyanobakterien gebildet werden können. Prominestestes Beispiel sind die Stromatoliten in

Shark Bay, Westaustralien.

Man nimmt heute an, dass Cyanobakterien im Proterozoikum eine der dominierenden

Lebensformen waren. Auch gilt es als gesichert, dass Cyanobakterien einen entscheidenden

Einfluss auf die Sauerstoffanreicherung der damals noch anaeroben Atmosphäre hatten.

Es gibt Evidenzen, die nahe legen, dass symbiontisch lebende Cyanobakterien sich evolutiv

zu Chloroplasten entwickelt haben (Stackebrandt, 1985): die innere Membran der

Einleitung 3

Chloroplasten enthält Transportsysteme und Enzyme, die denen von Cyanobakterien ähneln

(Douglas et al., 2001). Zum anderen ist die DNA der Chloroplasten ringförmig angeordnet

und nicht mit Histonen assoziiert. Die Organellen enthalten alle für die Transkription und

Translation benötigten Komponenten. Molekulargenetische Merkmale stützen diese

Endosymbiontentheorie (Martin et al., 1997; Kutschera und Niklas, 2005).

Neben der Fähigkeit zur oxygenen Photosynthese, besitzen manche Arten auch die

Fähigkeit Luftstickstoff zu Ammoniak zu reduzieren. Die Stickstofffixierung findet unter

Sauerstoffausschluss in spezialisierten Zellen, den Heterocysten, statt, welche eine verdickte

Zellwand besitzen und der Nitrogenase Schutz vor Sauerstoff bieten. Die Fähigkeit

Luftstickstoff zu fixieren, macht man sich heute beim Reisanbau zu nutze, indem man

Cyanobakterien als Düngemittel dem Boden zusetzt. Cyanobakterien sind auf der ganzen

Welt verbreitet und kommen terrestrisch, planktisch, benthisch, limnisch und marin vor.

Manche Arten sind in der Lage bestimmte Nischen zu ihrem Vorteil auszunutzen. So können

manche Arten zum Beispiel ihren Auftrieb im Wasser mittels Gasvakuolen steuern. Durch

diese Eigenschaften können sie sich an Licht- und Nahrungsverhältnisse optimal anpassen.

Unter bestimmten äußeren Bedingungen kann es zu Massenvermehrung von Cyanobakterien

kommen. Diese können dann als „Wasserblüten" an der Oberfläche von Gewässern

beobachtet werden. Wasserblüten wurden vor allem bei den Gattungen Aphanizomenon,

Microcystis, Anabaena, Nodularia, Nostoc, Lyngbya und Oscillatoria beschrieben.

Massenvermehrung wird insbesondere in den heißen Sommermonaten in eutrophen

Gewässern mit niedrigem Sauerstoffgehalt beobachtet. Insgesamt zeigen sich die

verschiedenen Gattungen als sehr anpassungs- und widerstandsfähige Organismen, welche

vorübergehende Austrocknung, Temperaturschwankungen, Sauerstoffmangel, oder

wechselndes Nährstoffangebot tolerieren können. Als photolithoautotrophe Bakterien sind

Cyanobakterien in der Lage bestimmte ökologische Nischen als Lebensräume zu nutzen,

unter anderem auch unter extremen Umweltbedingungen, wie in heißen Quellen, in der Wüste

und in arktischen Seen (Fay, 1983). Ein neuer Ansatzpunkt für ein Nischendasein wurde bei

dem Cyanobakterium Acaryochloris marina gefunden, welches anstatt Chlorophyll a und

Phycobilliproteine Chlorophyll d zur Photosynthese nutzt. Somit reichen geringere

Lichtintensitäten zur Energiegewinnung als bei Konkurrenten, welche Chlorophyll a nutzen,

aus (Kühl et al., 2005).

Einleitung 4

1.3. Symbiose

Einige Cyanobakterien leben in Symbiose mit verschiedenen Eukaryoten, dazu zählen

verschiedene Protisten, Pilze, Algen und Pflanzen (Sergeeva et al., 2002). Die Interaktionen

zwischen Wirt und Symbiont sind spezifisch. Ein Vorteil für den Wirt scheint in der Fähigkeit

der Cyanobakterien zu liegen, Stickstoff und Kohlendioxid fixieren zu können. Als

Gegenleistung bietet der Wirt eine Wachstumsumgebung, die die Cyanobakterien vor u. a. zu

hoher Lichtintensität oder vor Austrocknung schützt (Adams, 2000). Wie bereits erwähnt,

macht man sich aus agrarökonomischer Sicht die Fähigkeit der Stickstofffixierung von

Cyanobakterien in der Kultivierung von Reispflanzen zu Nutze. In diesem Zusammenhang

wurde auch eine spezifische Symbiose zwischen Azolla-Anabaena beschrieben, in welcher

der Stickstoffertrag von normalerweise 20-30 kg N ha-1 auf 600 kg N ha-1 erhöht war

(Vaishampayan et al., 2001). Azolla ist in den Reisfeldern Ostasiens verbreitet, wo ein

beachtlicher Teil des von ihm gebundenen Stickstoffs den Reispflanzen zugute kommt. Auch

marine Schwämme werden als Symbiosepartner beschrieben, wie etwa Dysidea herbacea mit

Oscillatoria spongeliae (Ridley et al., 2005). Die Geosiphon-Symbiose ist die einzige

bekannte Pilz-Cyanobakterien-Endosymbiose (Schüssler, 2001). Eine weitere Endosymbiose

findet man zwischen Nostoc sp. und dem Mammutblatt (Gunnera) (Meeks, 1998). In den

meisten Fällen jedoch sind es Symbiosen, bei denen die Bakterien extrazellulär vorliegen.

Flechten sind die am meisten verbreiteten Lebensgemeinschaften. Von den 15.000-20.000

Flechtenarten haben etwa 8 bis 15 % ein Cyanobakterium als Phycobiont, meistens Nostoc,

aber auch Calothrix, Scytonema und Fischerella (Adams, 2000).

Die Herkunft mancher Sekundärstoffwechselprodukte wird inzwischen kontrovers diskutiert.

Es konnte in einigen Fällen nachgewiesen werden, dass die ursprünglich einem Eukaryoten

zugeordnete Substanz auf ein in Symbiose lebendes Cyanobakterium zurückgeht. Die aus

dem im Indischen und Pazifischen Ozean heimischen Seehasen Dolabella auricularia

gewonnenen Dolastatine scheinen nicht von der marinen Schnecke produziert zu werden. Sie

gehen wahrscheinlich auf die mit der Nahrung eingenommenen Cyanobakterien zurück (Piel,

2004). Weiterhin ist oft ungeklärt, ob diese Metabolite nur als Produkt einer Symbiose

gebildet werden (Sings und Rinehart, 1996; Weckesser et al., 1996). Patellamide wurden

ursprünglich aus marinen Tunikaten Lissoclinum patella isoliert. Jetzt konnte schlüssig

nachgewiesen werden, dass die Biosynthese von Patellamide A und B über einen „microcin-

like pathway“ in Prochloron didemni, dem cyanobakteriellen Symbiont von Lissoclinum

patella erfolgt (Schmidt et al., 2005).

Einleitung 5

1.4. Sekundärmetabolismus

Unter Sekundärstoffwechselprodukten versteht man niedermolekulare Stoffwechselprodukte,

die für Wachstum und Vermehrung nicht essentiell sind. Man geht davon aus, dass sie

trotzdem einen Nutzen für den produzierenden Organismus bringen. Erst mit der Erforschung

der natürlichen Lebensbedingungen im Bereich des Mikrohabitats wird die Funktion der

Sekundärmetabolite erkennbar. Jedoch müssen die vielfach beschriebenen Bioaktivitäten

nicht mit der ökologischen Funktion übereinstimmen. Die Bildung ist von mehreren Faktoren

abhängig, wie Wachstumsbedingungen, Wachstumsphase, Induktion oder Repression der

Bildung. Verfügt ein Organismus über die notwendigen Gene zur Bildung der

Sekundärstoffwechselprodukte, so findet man häufig mehrere verschiedene, aber

strukturverwandte Produkte in unterschiedlichen Ausbeuten. Unter den

Sekundärstoffwechselprodukten finden sich eine Vielzahl von Stoffklassen, unter ihnen

Alkaloide, Polyketide oder nichtribosomal gebildete Peptide, manche davon sind toxisch. In

den folgenden Abschnitten wird eine Auswahl an Sekundärstoffwechselprodukten gegeben

ohne dabei Anspruch auf Vollständigkeit zu erheben.

1.5. Ökologie der Sekundärstoffwechselprodukte

Gesicherte Vorstellungen über die Funktion der Sekundärstoffwechselprodukte gibt es nur

wenige. Unter Einbeziehung der Lebensbedingungen in den Mikrohabitaten werden nur

manche Funktionen erklärbar. Viele publizierte Thesen beruhen daher auf Spekulationen.

Eine gängige These besagt, dass die Metabolite gebildet werden, um einen Selektionsvorteil

zu genießen und die ökologische Nische zu verteidigen. So wurde vor einiger Zeit eine

Serinprotease aus Anabaena beschrieben, welche unter Stickstoffmangel induziert wird (Yoon

und Golden, 1998). Diese Beobachtung steht im Einklang mit der Bildung von

Sekundärstoffwechselprodukten unter bestimmten Kulturbedingungen, bzw. nur in

bestimmten Entwicklungsphasen der Organismen oder Kulturen (Ruhephasen, oder

Stresssituationen). Vielfach sind exogene oder endogene Effektoren für die Existenz in

natürlichen Ökosystemen verantwortlich (Fritsche, 2002). Scytonemin, eine Substanz aus der

Ummantelung von Scytonema, wurde eine Lichtschutzfunktion zugeordnet. Als UV-Licht

absorbierende Substanz ermöglicht sie dem Cyanobakterium auch an Standorten hoher

Lichtintensität zu überleben, indem sie energiereiches Licht absorbieren und in unschädliche

Wärme umwandeln (Proteau et al., 1993).

Einleitung 6

Bei toxinbildenden Algen nimmt man an, dass das Toxin zur Abwehr von

Primärkonsumenten der Cyanobakterien produziert wird (Carmichael, 1992). Bei einem

Vergleich von käuflichen Proteasen (Isolate aus Rindern) mit Isolaten von Proteasen aus dem

Darm von Daphnien wurde belegt, dass die Proteaseinhibition in der natürlichen Umgebung

dazu führen kann, dass Cyanobakterien nicht von Fraßfeinden verdaut werden können

(Agrawal et al., 2005). Hierzu gehören die Ansätze, die eine Hemmung zellregulierender

Enzyme wie Proteinphosphatasen und endogenen Proteasen postulieren. Eine weitere

wirkungsvolle Abwehr von Fraßfeinden scheint die Produktion von ungenießbaren

Metaboliten zu sein, was dazu führt, dass die Fraßfeinde die Cyanobakterien wieder

„ausspucken“ (Nagle und Paul, 1999). Andere Autoren vermuten, dass die Substanzen als

Chelatoren potentiell toxischer Metalle fungieren (Humble et al., 1997).

1.6 Biosynthese der Sekundärstoffwechselprodukte

Aufgrund der Zusammensetzung der Peptid-Sekundärmetabolite lässt sich vermuten, dass sie

nichtribosomal synthetisiert werden. An Stelle von DNA und RNA als Informationsträger tritt

ein Protein-Multienzymkomplex. Dieser Biosynthesetyp kommt nur bei Bakterien und Pilzen

vor und ist für die Bildung der meisten peptidischen Sekundärmetabolite verantwortlich. Die

Synthese erfolgt nicht-ribosomal nach dem Thiotemplate-Mechanismus. Als Besonderheiten

findet man unter den Nichtribosomale-Peptid-Synthetase-Produkten Cyclopeptide,

D-Aminosäuren, nicht-proteinogene Aminosäuren, N-Methylierung, Einbau von

Hydroxysäuren (Depsipeptide), Einbau von Polyketideinheiten und

Aminosäuremodifikationen (z. B. oxidativ). Weitere Syntheseapparate wurden an Bacillus

untersucht. Dort sind sie für die Synthese der Peptidantibiotika Gramicidin S, Bacitracin und

Tyrocidin verantwortlich (Kleinkauf und von Döhren, 1996). Gene der Nichtribosomalen-

Peptid-Syntethase finden sich in den meisten cyanobakteriellen Gattungen (Christiansen,

2001). Durch Kristallstrukturen von NRPS-Domänen bekommt man einen immer genaueren

Einblick in die Biosynthese. Diese Kenntnisse sollen dazu genutzt werden in einem solchen

Biokatalysator einzelne Moleküle gezielt auszutauschen, um auf diese Weise

Peptidantibiotika mit neuen Eigenschaften zu gewinnen (Schwarzer et al., 2003; Dürfahrt und

Marahiel, 2005). Neben den Peptidsynthetasen sind auch Polyketidsynthasen charakterisiert

worden, sie sind für die Biosynthese von Polyketiden und Alkaloiden verantwortlich

(Dittmann et al., 2001). Bei Cyanobakterien ist die Biosynthese der toxischen Microcystin-

Peptide mit am genauesten untersucht (Tillett et al., 2000).

Einleitung 7

1.7. Biologisch aktive Substanzen aus Cyanobakterien

Auf der Suche nach neuen Quellen für bioaktive Substanzen werden immer wieder

Cyanobakterien als Untersuchungsgegenstand gewählt. Systematisches Screening nach

Bioaktivität zeigte, dass diese Mikroorganismen eine reiche Quelle an bisher unbekannten

bioaktiven Substanzen bietet (Patterson et al., 1991, 1993 und 1994; Honkanen et al., 1995;

Falch et al., 1995; Jaki et al., 1999). So offenbaren Cyanobakterien ein großes Potential für

die pharmazeutische Forschung, um eingangs erwähnte Leitsubstanzen mit ungewöhnlichen

oder unbekannten Strukturmerkmalen zu finden.

In den folgenden Abschnitten werden die Sekundärstoffwechselprodukte anhand ihrer

biologischen Aktivität unterschieden. Die Einteilung erfolgt nach den Wirkungseigenschaften

in pharmakologischen Klassen. Im Allgemeinen sind es Peptide, obwohl auch Ketide,

Makrolide oder Alkaloide genannt werden. Die hier behandelten Stoffwechselprodukte

spiegeln die große strukturelle Vielfalt an Substanzen aus dem Sekundärstoffwechsel wider.

Angesichts mehrerer hundert Substanzen, die bis heute strukturell aufgeklärt und

veröffentlicht wurden, erhebt die Auflistung jedoch keinen Anspruch auf Vollständigkeit.

1.7.1 Cyanobakterielle Toxine

Cyanotoxine umfassen ein breites Spektrum an algiziden, antimykotischen, antibakteriellen

aber auch tier- und humantoxischen Eigenschaften. Einige Beispiele sind im Folgenden

aufgelistet.

Zytotoxine und Biotoxine

Zytotoxine besitzen oftmals algizide, antimykotische, oder antibakterielle Eigenschaften, oder

besitzen Aktivität auf Zelllinien. Ihre Erforschung liegt in der Suche nach neuen

pharmazeutisch oder landwirtschaftlich nutzbaren Substanzen begründet. Einen Überblick zu

cyanobakteriellen Zytotoxinen gibt der Abschnitt „Cyanobakterien als Quelle neuer

Arzneistoffe“ (1.7.2.). Aus Cyanobakterien erhaltene Biotoxine mit hepatotoxischen,

neurotoxischen, dermatotoxischen und reizauslösenden Eigenschaften sind bekannt (Bartram

und Chorus, 1999).

Einleitung 8

1.7.1.1. Hepatotoxine

Die cyanobakteriellen Peptide vom Microcystin-Typ stellen die am besten untersuchte

Gruppe an cyanobakterielen Sekundärmetaboliten dar. Das Interesse an der Charakterisierung,

Toxizität und den zu Grunde liegenden Mechanismen liegt an ihrer potentiellen Gefahr für

Tier und Mensch sowie an dem Umstand, dass sie von Cyanobakterienarten wie Microcystis

aeruginosa gebildet werden, die besonders häufig vorkommen (Bartram und Chorus, 1999

1999). Neben Microcystis-Arten wurden Microcystine auch in Anabaena-, Nostoc- und

Planktothrix-Arten. identifiziert. Microcystine sind Hepatotoxine. Mit LD50-Werten zwischen

50 und 250 µg/kg Körpergewicht (i.p. Maustest) ist die Toxizität deutlich höher als bei

Cyanid (LD50 1 mg/kg). Microcystine werden über den Gallensäure-Transporter in die

Leberzellen eingeschleust. Die toxische Wirkung wird durch irreversible Hemmung der

Proteinphosphatasen 1 und 2A hervorgerufen. Dadurch kommt es zu einem Ungleichgewicht

zwischen Phosphatasen und Kinasen und einer Hyperphosphorelierung von Proteinen im

Zytosol, bzw. des Zytoskeletons. Durch die übermäßige Proteinphosphorelierung kommt es

zu einem Zusammenbruch des Zytoskeletts und zum Ausfall der Leberfunktionen.

Wahrscheinlich wirken Microcystine und Nodularine nicht nur primär auf

Proteinphosphatasen, sondern haben noch andere toxische Effekte (Börner, 2001). Dieser

Verdacht scheint sich nach neueren Veröffentlichungen zu bestätigen. Im Zusammenhang mit

Vergiftungserscheinungen durch Hepatotoxine wurde die Möglichkeit der Apoptoseinduktion

untersucht. Hierbei wurde eine Zellschädigung über verschiedene Wege der

Apoptoseeinleitung gezeigt (Chen et al., 2005).

Untersuchungen an Tieren und Zellkulturen zeigen, dass Microcystine in subletalen Dosen als

Tumorpromotoren wirksam sein können (Nishiwaki-Matsushima et al., 1992). In diesem

Zusammenhang steht auch die Beobachtung, dass in China in Gebieten mit einem zwar

niedrigen, aber stetigen Gehalt an Microcystinen im Trinkwasser eine erhöhte Rate am

Auftreten von Leberkrebs beobachtet wird (Kuiper-Goodman et al., 1999).

Bisher wurden mehr als 60 Strukturvarianten der Microcystine beschrieben. Alle

Microcystine besitzen die ungewöhnliche Aminosäure Adda (3-Amino-9-methoxy-2,6,8-

trimethyl-10-phenyldeka-4,6-diensäure), sowie D-iso-Glutamat, N-Methyldehydroalanin,

D-Alanin, und D-erythro-β-methyl-iso-Aspartat. Die ungewöhnliche Aminosäure Adda

bewirkt ein charakteristisches UV-Spektrum mit einem Absorptionsmaximum bei 238 nm.

Einleitung 9

Nodularine werden von Nodularia spumigena gebildet. Sie zeigen eine den Microcystinen

vergleichbare Bioaktivität und werden ebenfalls zu den Hepatotoxinen gezählt. Im Gegensatz

zu Microcystinen bestehen Nodularine nur aus fünf Aminosäuren. Wie Microcystine enthalten

sie ebenfalls Adda, D-MeAsp und D-Glu, zusätzlich noch L-Arg und N-Methyldehydro-α-

aminobutyrat.

Ein weiteres Lebertoxin, Cylindrospermopsin, wurde aus Cylindrospermopsis raciborskii,

Umezakia natans und Aphanizomenon ovalisporum isoliert. Cylindrospermopsin ist ein

Alkaloid mit einer zyklischen Guanidingruppe und ruft Schädigungen an Leber, Niere,

Thymus und Herz hervor (Moore et al., 1993.

1.7.1.2. Neurotoxine

Cyanobakterien sind in der Lage Alkaloide als Sekundärstoffwechselprodukte zu bilden.

Unter den von ihnen gebildeten Alkaloiden finden sich Neurotoxine. Im Gegensatz zu den

Hepatotoxinen, werden die Neurotoxine von den Zellen in die Umgebung abgegeben

(Exotoxine). Das erste charakterisierte Cyanobakterientoxin, Anatoxin-A, wird von Anabaena

gebildet. Anatoxin-A zeigt agonistische Wirkung an cholinergen Rezeptoren der Postsynapse

(Carmichael et al., 1979). Des Weiteren ist die Affinität zum Rezeptor im Vergleich zu

Acetylcholin bis zu 8-fach stärker ausgeprägt. Anatoxin-A löst eine Dauerpolarisation aus und

führt zu massiven Muskelkrämpfen. Acetylcholinesterase ist nicht in der Lage das Toxin

abzubauen. Dies führt dazu, dass sich unmittelbar Vergiftungserscheinungen zeigen, die zum

Erstickungstod binnen weniger Minuten führen können. Aus diesem Grund wird Anatoxin-A

NH

O

NHN

ONH

O

OMe

CO2H

NH

O

ONH

O

NH

ONH

NH2

NHCO2HMicrocystin LR

NH

N NH NH NH

O3SOOH

O

O

H

H H

Cylindrospermopsin

Einleitung 10

häufig auch als „very fast death factor“ (VFDF) bezeichnet (Draisci et al., 2001). Die LD50-

Werte für das Toxin liegen zwischen 200 und 250µg/kg Körpergewicht.

Die Tetrahydropurinalkaloide Saxitoxin und Neosaxitoxin (frühere Bezeichnung:

Aphantoxine) sind die bislang als giftigste bekannten Cyanobakterientoxine. Sie wirken über

eine Unterbrechung der Erregungsleitung indem sie Natriumionenkänale blockieren. Der Tod

tritt durch Lähmung der Atemmuskulatur und Ersticken ein. Die letale Dosis liegt bei 10µg/kg

Körpergewicht. Erstmals wurden diese Aphantoxine aus Aphanizomenon flos-aquae isoliert

(Mahmood & Carmichael 1986). Saxitoxine sind die Ursache für oft tödlich verlaufendes

„paralytic shellfish poisoning“. Saxitoxine werden in Muscheln stark angereichert und deren

Verzehr kann dann unbehandelt tödlich verlaufen. Vermehrt wird dieses Phänomen während

oder nach Auftreten massiver Wasserblüten („red tides“) beobachtet (Ueno und Nagata,

1994).

1.7.1.3. Dermatotoxine und hautreizende Toxine

Ein dem Teleocidin A-1 aus Streptomyces Arten identisches Molekül wurde aus Lyngbya

majuscula isoliert (Cardellina et al., 1979). Lyngbyatoxin A gehört zu den Indolalkaloiden.

Durch Aktivierung der Proteinkinase C bewirkt es eine verstärkte Phosphorelierung von

Serin- und Threoninresten eukaryotischer Proteine (Osborne et al., 2001). In dem vermehrten

Auftreten von Kontaktdermatiden beim Baden in Gewässern um Hawaii und zeitgleich

auftretenden Wasserblüten wird ein Zusammenhang mit Lyngbyatoxin gesehen. Die

Kontaktdermatitis wird auch als „swimmers itch“ bezeichnet (Mundt und Teuscher, 1988).

Lipopolysaccharide sind integrale Membranbestandteile gram-negativer Bakterien,

einschließlich Cyanobakterien. Hinsichtlich der Wirkung cyanobakterieller

Lipopolysaccharide auf Menschen und andere Organismen wurden kaum Untersuchungen

durchgeführt (Duy et al., 2000). Cyanobakterielle Endotoxine scheinen eine geringere

NHN

NH

NH

ONH2

O

NH OHOH

NH

HONH

Anatoxin-A Saxitoxin

Einleitung 11

Toxizität aufzuweisen als LPS von Salmonella (Bell und Codd, 1996). Hautreizungen werden

unter anderem auch auf Lipopolysaccharide zurückgeführt (Börner, 2001).

1.7.2.Cyanobakterien als Quelle neuer Arzneistoffe

Bei der Suche nach möglichst bisher unbekannten Substanzen bedient man sich auch der

Cyanobakterien. Unter den charakterisierten Substanzklassen aus Cyanobakterien finden sich

die unterschiedlichsten Bioaktivitäten. In Kenntnis der Wirkungsweise und der Struktur-

Wirkungsbeziehung der natürlichen Substanzen versucht man Strukturanaloga mit stärkeren

und spezifischen Aktivitäten zu entwickeln (Burja et al., 2001).

1.7.2.1. Antimikrobielle Substanzen

Einige cyanobakterielle zyklische Peptide weisen antimikrobielle Aktivität auf. Es gibt zum

Beispiel zahlreiche Veröffentlichungen zur Produktion von antifungalen Inhaltsstoffen aus

Cyanobakterien und Algen. Meistens wird jedoch nach möglichem Einsatz als Arzneimittel

gesucht. Untersuchungen zur Wirksamkeit gegen pathogene Pilze wurden nur wenige

durchgeführt (Nagle, 2002). Bereits Anfang der 90iger Jahre wurde cyanobakterielle Peptide

mit antifungalen Eigenschaften beschrieben. Unter ihnen die Laxaphycine, welche aus dem

Extrakt von Anabaena laxa isoliert wurden (Frankmölle et al., 1992). Laxaphycine sind

zyklische Peptide aus 10, bzw. 12 Aminosäuren. Interessanterweise wurde die antifungale

Wirkung nur bei Kombination beider Laxaphycin-Typen beobachtet. Die Einzelsubstanzen

wiesen keine Aktivität auf. Vergleichbare Ergebnisse wurden für die strukturell verwandten

Lobocyclamide aus Lyngbya confervoides (MacMillan et al., 2002) und Hormothamnine aus

Hormothamnion enteromorphoides (Gerwick et al., 1989) beschrieben. Hormothamnin A

besitzt eine geringe antimikrobielle Wirkung gegen Bacillus subtilis und Pseudomonas

aeruginosa. Es unterscheidet sich strukturell von Laxaphycin A durch die Geometrie der

Doppelbindung der Dehydrobutyryl-Einheit.

Einleitung 12

Neben den Laxaphycinen wurden eine Reihe weiterer zyklischer Peptide mit antifungalen

Eigenschaften beschrieben, wie Scytonemin A aus Scytonema sp. (Helms et al., 1988),

Schizotrin A aus Schizotrix sp. (Pergament et al., 1994), Majusculamid C aus Lyngbya

majuscula (Carter et al., 1984) sowie später aus einem Schwamm der Gattung Pilocaulis

(Williams et al., 1993). Die von Williams beschriebene Struktur lässt eine symbiotische

Ursache vermuten. Majusculamid C wurde zur Bekämpfung von fungalen

Pflanzenpathogenen, wie resistente Arten von Phytophthora infestans und Plasmopora

viticola, patentiert (Moore & Mynderse 1982, US Patent).

Weitere antifungale Wirkstoffe wurden aus Cyanobakterien beschrieben, unter ihnen

Lyngbyabellin B aus Lyngbya majuscula. Es hat antifungale Wirkung gegen Candida

albicans (Milligan et al., 2000). Ebenso wurden zwei neue zyklische Peptide aus Tolypothrix

byssoidea (EAWAG 195), Tolybyssidin A und B, mit moderater antifungaler Wirkung gegen

Candida albicans isoliert (Jaki et al., 2001).

NH

ONH

NH

NH

OH

O

OO

O

NOH

O

NH

ONH

ONH

ONH O

NHNH

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O

NHOH O

NH NH

O

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NH

OH

O NH

O

NHOH

NH ONH2

O

O

N

O

NH

OO

NH

OH

O

NH2

OH

O

NH

Laxaphycin A Laxaphycin D

Majusculamid C

NO

N

NH

O

O

NH

ONH

ON

ONH

O

O O

O

NH

O

OMe

Einleitung 13

Nicht nur Peptide haben antibiotische Eigenschaften: Fischerellin A aus Fischerella musciola,

hat wachstumsinhibierende Eigenschaften gegenüber anderen Cyanobakterien (MIC 14 nM

gegen Synechococcus PCC 6911, Hagmann et al., 1996). Die Wirkung beruht auf der

Hemmung des Photosystems II. Daneben besitzt Fischerellin A antifungale und herbizide

Aktivität.

1.7.2.2. Zytostatika

Zu den zytostatischen Substanzen gehören die Cryptophycine. Sie wurden erstmals aus

Nostoc sp. ATCC 53787 isoliert (Hirsch et al., 1990, US Patent). Bei den Cryptophycinen

wurde eine potente in vitro Aktivität (ng/ml bis pg/ml) gegen Tumorzellen festgestellt.

Cryptophycine greifen in die Tubulinpolymerisation ein. Sie zählen zu den zyklischen

Depsipeptiden. Ihre Sequenz setzt sich aus jeweils einer δ- und α-Hydroxysäure, sowie einer

α- und β-Aminosäure zusammen. Neben der zytostatischen wurde antifungale Wirkung

beschrieben. Ein aus Nostoc sp. GSV 224 isoliertes Cryptophycin-24 hat identische Struktur

zu Arenastatin A aus dem Schwamm Dysidea arenaria (Kobayashi et al., 1994).

Es gibt viele Sekundärmetabolite, welche auf zytotoxische Eigenschaften untersucht wurden.

In der Hoffnung neue Leitsubstanzen für antitumorale, respektive antivirale Wirkstoffe zu

finden, wurde Mitte der 80iger Jahre wurde ein breit angelegtes Screening auf Zytotoxizität

vom „National Cancer Institute“ durchgeführt (Boyd, 1985). Durch die vielfachen

Veröffentlichungen gehören Zytotoxizitätsassays oft zu den Standarduntersuchungen bei der

Beschreibung einer Bioaktivität. Bei einem kürzlich durchgeführten biologischen Screening

von terrestrischen und Süßwasser-Cyanobakterien auf antimikrobielle Aktivität, „Brine

Shrimp Lethality“ und Zytotoxizität wurden von 22 Proben lipophile und hydrophile Extrakte

hergestellt und untersucht. Zytotoxizität gegen KB-Zellen (human nasopharyngal carcinoma)

R R´ X

Cryptophycin-1 Me H Cl

Cryptophycin-2 Me H H

Cryptophycin-24 H H H

Cryptophycin-52 Me Me Cl

N

N

O

O HFischerellin A

O

NH

ONH

O

OOO

R´R

X

OMe

O

Einleitung 14

wurde für 38,6 % der Extrakte belegt (Mian et al., 2003). Eine weitere Substanz, der viel

Aufmerksamkeit gewidmet wurde, war Dolastatin aus dem Seehasen Dolabella auricularia

(Kap. 1.3.). Unter den Dolastatinen finden sich Strukturen vom Cyanopeptolin-Typ, sowie

weitere zyklische Depsipeptide. Zurzeit befinden sich Dolastatin 10 und Derivate in

verschiedenen Phasen klinischer Studien (de Jonge et al., 2005), unter anderem zum Einsatz

gegen metastasierenden Prostatakrebs (Vaishampayan et al., 2000).

Obyanamid aus dem marinen Cyanobakterium Lyngbya confervoides ist ein zyklisches

Depsipeptid, das auf KB und LoVo (human colorectal adenocarcinoma) Zellen zytotoxisch

wirkt (Williams et al., 2002).

Hapalosin, ebenfalls ein zyklisches Depsipeptid, hat eine MDR-Umkehr („multi drug

resistance“) mit einer Effektivität, welche die von Verapamil übersteigt. Aus diesem Grund

wurden Molekülmodifikationen vorgenommen, um die Effektivität in der Tumortherapie zu

untersuchen (Hermann et al., 2001).

Zytotoxische Effekte wurden auch für die Laxaphycine A und B auf CCRF-CEM (human

lymphoblastic cells) (Gbankoto et al., 2005) und für Wewakpeptine, einem zyklischen

Depsipeptid aus Lyngbya semiplena (Han et al., 2005) beschrieben.

1.7.2.3. Enzyminhibitoren

Unter den biologisch aktiven Substanzen befinden sich viele mit enzyminhibitorischer

Wirkung. Ein erstes Beispiel der später als Cyanopeptoline klassifierten Depsipeptide

(Weckesser et al., 1996) war das erwähnte Dolastatin 13 (Pettit, 1997). Auf Grund

struktureller Ähnlichkeit zu cyanobakteriellen Depsipeptiden geht man heute davon aus, dass

Dolastatin auf cyanobakteriellen Ursprung zurückzuführen ist (Rinehart et al.,1990). Den

vielfältigen Cyanopeptolinen gemeinsam ist ein 19-gliedriger Ring aus 6 Bausteinen. Der

Ring schließt konservierte Aminosäuren ein, sowie Variationsmöglichkeiten an den anderen

Positionen. Des Weiteren ergibt sich die Strukturvielfalt aus Modifikationen in der

Seitenkette. Als charakteristisches Merkmal enthalten die Cyanopeptoline einen Sechserring

im Ringgerüst, ein Piperidinderivat: Die Ahp-Gruppe (3-Amino-6-hydroxy-2-oxo-piperidin)

kann als zyklisches Glutaminsäurealdehyd interpretiert werden. Neben dieser ungewöhnlichen

Gruppe ist der Ringschluss durch eine Esterbindung charakteristisch. Bis auf eine Ausnahme

wird der Ringschluss über die Aminosäure Threonin geknüpft. Bei den Nostopeptinen A und

B befindet sich an dieser Stelle ein Hydroxymethylprolin (Okino et al., 1997). Die

Aminosäuren, die durch Lactonisierung den Ringschluss vermitteln, sind relativ konserviert.

Bisher wurden nur die Aminosäuren Valin oder Leucin an dieser Stelle gefunden (R1). An

Einleitung 15

Position R2 des Ringsystems findet man nur N-methylierte aromatische Aminosäuren. An

Position R4 dominieren basische Aminosäuren mit großer Varianz. Gleiches gilt für die

Position upstream der Ahp-Gruppe. Die für die Ringstruktur verantwortlichen Aminosäuren

liegen alle in der L-Konformation vor. Die Peptidbindungen upstream der Ahp-Gruppe (R2

und R3) sind cis-, alle anderen trans-konfiguriert. Weitere konservierte Strukturmerkmale

sind die Verknüpfung der Seitenkette über die am Ringschluss beteiligte Aminosäure

Threonin in Form einer Acylierung. Der N-Terminus ist durch eine Säure maskiert. Es finden

sich viele strukturelle Unterschiede durch die Varianz der Säure.

In absehbarer Zeit ist eine Novellierung der Nomenklatur zyklischer Peptide zu erwarten

(Moss, 2005). Bis jetzt sind die Vorschläge aber noch nicht durch die IUPAC veröffentlicht

worden, weshalb in dieser Arbeit die Bezeichnung analog zu vorangegangenen Arbeiten

erfolgt.

Bis heute wurden mehr als 70 Varianten der Cyanopeptoline veröffentlicht. Cyanopeptoline

haben je nach strukturellen Eigenschaften Enzymhemmung gegen verschiedene Proteasen:

unter ihnen Elastase, Trypsin, Thrombin, Chymotrypsin, Papain und Plasmin. Es konnte

jedoch nicht immer eine Bioaktivität im Sinne einer Enzymhemmung beschrieben werden.

Neben der Hemmung von Enzymen gibt es Hinweise auf toxische Effekte auf

Primärkonsumenten, wie Daphnien (Jakobi et al., 1995 und Agrawal et al., 2005).

Eine weitere Gruppe der Cyanopeptoline bilden die Microviridine, welche erstmals aus

Microcystis viridis isoliert wurden (Ishitsuka et al., 1990). Beispiele dieser Substanzklasse

wurden als Hemmstoffe der Tyrosinase, andere als Hemmstoffe der Elastase, bzw. des

Chymotrypsins beschrieben (Murakami et al., 1997a). Im Gegensatz zu den Cyanopeptolinen,

welche ebenfalls Serin-Proteaseinhibitoren sein können, sind es Tetradecapeptide mit

N

O

NHO

O

O

NH

O

NH

ONH

N

OO

NH O

OH

OH

OHO

R4

Ahp

R 3

X - L-Thr R 2

O R 1

Schematischer Aufbau eines Cyanopeptolins Cyanopeptolin 963A

Einleitung 16

trizyklischer Struktur. Microviridin J wirkt als Proteaseinhibitor im Häutungszyklus von

Daphnia sp. mit letaler Folge (Rohrlack et al., 2004).

Anabaenopeptin A wurde erstmalig als Nebenkomponente bei Anabaena flos-aquae NRC

525-17 gefunden (Harada et al., 1995). Dieses Peptid, bestehend aus zyklischen Strukturen,

hat als Besonderheit einen Ringschluss, welcher durch die ϖ-Aminogruppe eines Lysins und

der Carboxygruppe eines Phenylalanins vermittelt wird. Charakteristisch ist die Verknüpfung

der Seitenkette mit dem Ringgerüst über eine Ureido-Funktion.

Neben den zyklischen Peptiden aus Cyanobakterien gibt es unter den Proteasehemmstoffen

auch lineare Strukturen, wie in der Gruppe der Aeruginosine. Sie wurden erstmals aus

Microcystis aeruginosa isoliert (Murakami et al., 1994). Aeruginosine weisen ein breites

Wirkungsspektrum gegen unterschiedliche Serinproteasen auf. Besonders ausgeprägt ist die

Inhibition von Thrombin durch Aeruginosin 102-A mit einem IC50-Wert von 0,04 µg/ml

(Matsuda et al., 1996). Charakteristisch ist der Azabizyklus, welcher auf ein Octahydroindol

zurückgeht. Chemisch zählen die Aeruginosine zu den natürlichen Guanidinderivaten.

1.7.2.4. Weitere Substanzklassen

Das Interesse an Bluthochdruck- und Stärkungsmitteln für das Herz ist verständlicherweise

groß. Terrestrische Anabaena sp. produzieren ein chloridhaltiges zyklisches Dekapeptid,

Anabaenopeptin F

NH

NHO

N O

NH

OO

NH

O NH

NH

OO OH

NH NH2

NH

OH

Aeruginosin 98-B

N

ONH

ONH

O

OH

OH

NH NH

NH2

HO3SO

H

H

Einleitung 17

Puwainaphycin C, welches inotrope Wirkung, ohne chronotrope Begleiteigenschaften zu

zeigen, aufweist. Die ED50 von Puwainaphycin liegt bei 0,2 ppm. Die Strukturanaloga

Puwainaphycin A, B, D und E, welche als Nebenprodukte isoliert wurden, besitzen

verringerte Aktivität (Moore et al., 1989; Gregson et al., 1992).

Scytonemin A (Struktur siehe Kap. 1.7.2.4.), ein Hauptmetabolit aus Scytonema sp. (strain U-

3-3) hat Calcium-antagonistische Eigenschaften. Microginine, lineare Peptide aus Microcystis

aeruginos wurden als Inhibitoren von ACE („angiotensin-converting-enzyme“) mit IC50-

Werten von 7µg/ml beschrieben (Okino et al., 1993).

Zwei weitere lineare Lipopeptide wurden aus Lyngbya majuscula isoliert. Die Microcoline A

und B haben starke immunsuppressive Aktivität und sind stärker wirksam in der

Unterdrückung der Lymphozyten-Proliferation als Cyclosporin A (Koehn et al., 1992; Zhang

et al., 1997).

Scytonema hofmanni PCC 7110

Die Gattung Syctonema gehört in die Ordnung der Nostocales und in die Familie der

Scytonemataceae (Komarek und Anagnostidis, 1989). Die Trichome von Scytonema sind

isopolar und mit einer Hülle umschlossen. Des Weiteren zeichnet sie sich durch das

Vorhandensein von falschen Verzweigungen aus. Scytonema besitzt Heterocysten und kann

Luftstickstoff fixieren.

Abb. 1: a: schematische Darstellung einer falschen Verzweigung b: Trichom von Scytonema: falsche Verweigung und Heterozyste (verdickte, bräunliche Zelle).

Microcolin A

NN

N

O

O

NH

OAc

N

O

O OO

OH

a) b)

Einleitung 18

Scytonema Arten kommen vor allem terrestrisch vor. Sie formen raue, filzige Matten auf

feuchten Felsen, Holz und Boden (Bold und Wynne, 1985). Man findet Besiedelung auch im

Periphyton von Seen (Hawes et al., 1994) oder entlang der Meeresküste (unter anderem in

den Everglades bei Florida).

Aus Scytonema hofmanni PCC 7110 wurden bisher drei peptidische Substanzen

charakterisiert (Matern et al., 2001 und 2003). Es handelt sich um zyklische Peptide vom

Cyanopeptolin-Typ. Die Scyptoline (Scyptolin A und B) besitzen ein identisches Ringgerüst

und eine Variation in der Seitenkette. Bei Hofmannolin sind sowohl Ringgerüst, als auch die

Seitenkette modifiziert.

Für eine weitere Substanz wurde ein Strukturvorschlag anhand der Fragmentspektren der

Massenbestimmung gegeben. Weiterführende Versuche zur Strukturaufklärung und

Bestimmung der Bioaktivität von P12,8 wurden von Matern (2002) nicht unternommen.

Strukturvorschlag P12,8

N

O

NHO

O

O

NH

O

NH

NH

OH

N

OO

NH O

OHOH

OH

O

OH O

NH

NH2

NH

N

O

NHO

O

O

NH

O

NH

ONH

OH

N

OO

NH O

OH

Cl

OH

OR

NH

O

N

O

NH

OH

O

O

O

NH

ONH

OH O

OOH

NH

OH

N

OO

NH O

OH

O

ONH

O

R

Scyptolin A und B (+R) Hofmannolin

Einleitung 19

Weder den Scyptolinen A und B, noch Hofmannolin konnte in verschiedenen Testsystemen

antimikrobielle Wirksamkeit attestiert werden. Bei der Prüfung auf enzyminhibitorische

Wirkung auf Proteasen wurde für die Scyptoline eine signifikante Hemmung der Serin-

Protease Elastase (IC50 von 0,16 µg/ml) beschrieben. In geringem Umfang (IC50 > 500 µg/ml)

wurde auch eine Beeinflussung von Trypsin und der Cystein-Protease Papain beobachtet,

wohingegen keine Wirkung auf die Serin-Proteasen Thrombin und Plasmin erhalten wurde.

Die enzyminhibitorische Wirkung auf Elastase wurde durch kristallographische

Untersuchungen auf molekularer Ebene beschrieben (Matern et al., 2003).

Neben den durch Matern et al. (2001 und 2003) beschriebenen Cyanopeptolinen gibt es nur

wenige Veröffentlichungen, welche die Gattung Scytonema als Untersuchungsgegenstand

wählten: Neben den Cyanopeptolinen wurden aus Scytonema sp. antibiotisch wirksame

Substanzen beschrieben: Scytonemin A aus Scytonema sp. (strain U-3-3) hat nur schwache

Aktivität gegen ein breites Spektrum an Bakterien und Pilzen. Daneben besitzt es stark

calciumantagonistische Eigenschaften und nur schwache Zytotoxizität auf CCRF-CEM-

Zellen (Helms et al., 1988).

Eine weitere antibiotisch wirksame Substanz aus Scytonema sp. TISTR 8208 ist von

Chetsumon et al. (1995) beschrieben worden: ein zyklisches Peptid mit einem breiten

Wirkspektrum gegen sowohl gram-positive und gram-negative Keime, ebenso gegen

pathogene Hefen und Dermatophyten. Eine Struktur wurde nicht veröffentlicht, aber anhand

erster NMR-Daten wurde Ähnlichkeit zu Scytonemin A vermutet.

Scytonemin A

NOO

NHOH

NHO

ONH

OH

O

NH

O

OH

O

OHO

NH

NH

O

O

NH

OH

ONH

O

N

N

O

OH

OH

O NH

Einleitung 20

Als weiterer bioaktiver Stoff wurde Cyanobacterin aus Scytonema hofmanni isoliert (Gleason

et al., 1991). Es findet Verwendung als Herbizid, bzw. Algizid. Aus Scytonema varium wurde

ein potentes anti-HIV-Protein isoliert. Scytovirin bindet spezifisch an das hoch glycosylierte

virale Hüllprotein gp120, gp160 und gp41 des HI-Virus, jedoch nicht an den zellularen CD4

Rezeptor oder andere getestete Proteine (Bokesch et al., 2003). Makrolide, wie Scytophycine

und Tolytoxine, isoliert aus Scytonema sp., haben zytotoxische und antimykotische

Eigenschaften (Ishibashi et al., 1986 und Carmeli et al., 1990).

O

O

OH O

O

OMe

OMe

OH O OMe

OMeN H

O

Scytophycin A

Einleitung 21

Zielsetzung

Ziel der vorgelegten Arbeit war es, axenisch kultivierte Zellen des Cyanobakterienstamms

Scytonema hofmanni PCC 7110 hinsichtlich der Expression an Sekundärstoffwechsel-

produkten näher zu charakterisieren. Neben den aus diesem Stamm bereits bekannten

Peptiden Scyptolin A und B sowie Hofmannolin beobachtet man in HPLC-

Chromatogrammen bisher nicht identifizierte Signale, deren Strukturen aufgeklärt werden

sollten. Auf Grund ähnlicher Retentionszeiten und UV-Spektren wurden zum einen

Cyanopeptolin-Strukturen unter den Signalen vermutet, zum anderen schloss die Analyse

Peaks ein, deren Retentionzeiten und UV-Spektren dies nicht zwingend vermuten ließen. Für

die Strukturaufklärung waren die Peptide in präparativer Menge zu isolieren und mit den

derzeit verfügbaren chemischen Methoden zu charakterisieren.

Es sollte die bereits für Cyanopeptoline beschriebene inhibitorische Wirkung auf Serin- und

Cysteinproteasen geprüft werden. Auch sollten zuvor nicht geprüfte Enzymhemmtests

eingesetzt werden, darunter Metalloproteasen. Der Fokus sollte auch mögliche antimikrobielle

Aktivitäten einschließen. Des Weiteren sollten die neu isolierten Stoffe, wie auch die

Scyptoline und Hofmannolin auf Zytotoxizität geprüft werden. Bei positivem Befund sollten

weiterführende, auf den Wirkungsmechanismus zielende Versuche, wie z. B. Testung auf

Apoptose, Porenbildung, Membranschädigung etc. durchgeführt werden. Mit der Testung auf

Toxizität gegenüber Primärkonsumenten aus der Klasse der Crustaceen (z. B.

Thamnocephalus platyurus und Daphnia magna) sollte in der vorgelegten Arbeit auch ein

Beitrag zur möglichen Bedeutung der cyanobakteriellen Peptide geleistet werden, da sich die

Befunde mehren, dass diese Sekundärmetabolite eine ökologische Funktion haben.

Material und Methoden 22

2. Material und Methoden

2.1. Kultivierung von Scytonema hofmanni PCC 7110

2.1.1. Anzucht und Kulturmedium Zur Kultivierung von Stamm- und Batchkulturen von Scytonema hofmanni PCC 7110 wurde

BG 11-Medium (Tabelle 1) verwendet. Ausgehend von den Stammlösungen wurden

Konzentrate für jeweils 5 l BG11-Medium hergestellt und portionsweise bei -20 °C

eingefroren.

Tabelle 1: Zusammensetzung des BG11-Mediums (Rippka et al., 1979) und der Stammlösung Komponenten Konz. (g/l) Konz. (mM) Stammlösung (g/l) NaNO3 1,5 17,7 150 K2HPO4 • 3H2O 0,04 0,18 40 MgSO4 • 7 H2O 0,075 0,3 75 CaCl2 • 2H2O 0,036 0,25 36 Citronensäure 0,006 0,03 6 Ammoniumeisen-(III)-citrat 0,006 0,03 6 Na2-EDTA 0,001 0,0027 1 Na2CO3 0,02 0,38 20 Spurenelement-Lösung 1 ml - - Tabelle 2: Spurenelemente-Stammlösung Komponenten Komz. (g/l) H3BO3 2,860 MnCl2 • 4 H2O 1,810 ZnSO4 • 7 H2O 0,222 Na2MoO4 • 2 H2O 0,390 CuSO4 • 5 H2O 0,079 Co(NO3)2 • 6 H2O 0,0494 Zum Herstellen der Medien der Batch-Kulturen wurden die Aliquote aufgetaut und mit Aqua

dest. ad 7 l aufgefüllt und auf pH 7,8 eingestellt. Anschließend wurden die Medien bei 121 °C

3 h autoklaviert. Nach Abkühlen wurden die Medien unter sterilen Bedingungen mit den

Vorkulturen angeimpft. Die Anzucht erfolgte photoautotroph als Flüssigkultur bei 26 °C unter

24 h Beleuchtung mit Weißlicht (1.000 Lux). Um ausreichende Belüftung zu gewährleisten,

wurde das Kulturmedium mit Druckluft (ca. 0,5 bar) begast. Zusätzlich wurden die Kulturen

mittels Magnetrührer (Ikamag Ret, Staufen) durchmischt. Bei den Vorkulturen wurde die

Durchmischung durch Verwendung eines Schütteltischs (Swip, Edmund Bühler) mit

100 Upm gewährleistet, während auf eine zusätzliche Belüftung verzichtet wurde. Die

Kulturen wurden unter den genannten Bedingungen für 8-10 Wochen im Brutraum kultiviert.


2.1.2. Ernte der Kulturen und Lagerung Dank der fädigen Morphologie von Scytonema hofmanni PCC 7110 war es möglich die

Biomasse nach 8-10 wöchigem Wachstum über ein Planktonnetz mit der Maschengröße

55 µm zu ernten. Die feuchte Biomasse wurde bei -20 °C tiefgefroren und lyophilisiert

(Lyovac 2, Leybold-Heraeus, Hanau). Die getrockneten Zellen wurden bei -20 °C bis zur

weiteren Bearbeitung gelagert.

2.2. Peptid-Isolierung aus Scytonema hofmanni PCC 7110

2.2.1. Extraktion Das Extraktionsschema wurde anfangs unverändert zu Matern et al. (2001) angewandt. Da

jedoch Peptide mit unterschiedlichen Substanzeigenschaften isoliert werden sollten, wurde

das Extraktionsschema abgewandelt. Nach Vorversuchen wurden einige Parameter geändert,

so dass sich folgender Extraktionsweg herauskristallisierte:

Lyophilisiertes Zellmaterial (ca. 6-10 g) wurde in einem Mörser fein pulverisiert und in einen

Messbecher überführt. Die Zellen wurden 15 min mit ca.150 ml 50 % (v/v) Methanol, gefolgt

von weiteren zwei Extraktionschritten mit jeweils 100 ml 50 % (v/v) Methanol, extrahiert.

Nach jedem Extraktionsschritt wurde bei 9.000 U/min 20 min zentrifugiert (Sorvall RC-5B,

Rotor: GSA; DuPont Instruments, Bad Homburg). Die Überstände wurden dekantiert,

vereinigt und über eine Porzellanfritte mit doppeltem Papierfilter (Schleicher & Schuell, 595

Rundfilter, Durchmesser 110 mm) filtriert. Das Filtrat wurde nochmals bei 15.000 U/min 20

min (Rotor: SS34) zentrifugiert. Der Extrakt wurde bis zur weiteren Verarbeitung bei 4 °C

gelagert.

2.2.2. Festphasenchromatographie Zur Vorbereitung der C18-Chromatographie wurde 20 g pulverförmiges C18-Material in

200 ml 90 % (v/v)Methanol suspendiert und ca. 3 h zum Quellen stehen gelassen. Das

gequollene Säulenmaterial wurde in eine Glassäule (Sigma, Taufkirchen; Länge 25 cm,

Durchmesser 2,8 cm) gefüllt und mit einem Säulenvolumen 90 % (v/v) Methanol gewaschen

und mit zwei Säulenvolumina 10 % (v/v) Methanol equilibriert. Der Rohextrakt wurde auf

10 % bis 20 % (v/v) Methanol eingestellt und auf die Säule aufgetragen. Zusätzlich wurde

Vakuum (Vaccubrand GmbH & Co KG, Wertheim) an die Säule angelegt, um einen


gleichmäßigen Durchfluss zu gewährleisten. Der Durchbruch wurde mittels HPLC-Analytik

auf etwaige Peptide getestet. Bei Abwesenheit von Peptiden konnte der Durchbruch

verworfen werden. Durch drei Elutionsschritte wurden die an das Säulenmaterial gebundenen

Stoffe eluiert. Dazu wurden 30 %, 60 % und 90 % (v/v) Methanol verwendet, die Eluate

wurden jeweils separat gesammelt. Um die Qualität der Extraktion, wie auch der Elution

beurteilen zu können, wurden Proben genommen und mittels HPLC-Analytik untersucht.

Proben mit einem Methanolgehalt größer 50 % wurden mit Aqua dest. 1:2 verdünnt. Alle

Proben wurden mit einem Membranfilter (Chromafil PET, Durchmesser 0,45 µm, Macherey

Nagel, Düren) filtriert und in HPLC-Vials überführt.

Abb. 2: Extraktionsschema zur Isolierung von Peptiden aus Scytonema hofmanni PCC 7110

2.3. Hochleistungsflüssigchromatographie

2.3.1. Analytische Umkehrphasenchromatographie Die verschiedenen Eluate, der Durchbruch sowie bereits isolierte Peptide wurden mittels RP-

HPLC analysiert und auf Reinheit geprüft. Dazu wurden die isolierten, getrockneten Peptide

wieder in wenig 50 % (v/v) Methanol aufgenommen, die Proben der Extraktion wurden bei

einem Methanolgehalt > 50 % mit Aqua dest. 1:2 verdünnt. Alle Proben wurden mit einem

Membranfilter (Chromafil PET, Durchmesser 0,45 µm, Macherey Nagel) filtriert und

LyophilisiertesZellmaterial

MethanolischerRohextrakt

Umkehrphasen -Chromatographie

30% MeOH 50% MeOH 75% MeOH 90% MeOH

HPLC - Analytik

50% Methanol

Elution mit

Wasch-Lösung: keine Peptide

Hofmannolin, Cyanopeptolin 1042A

Scyptolin A, B, Cyanopeptoline 946A, 1067A

Scytocyclamide A, B, C

Analytisch / Semipräparativ / Präparativ


zusätzlich bei 14.000 U/min 5 min zentrifugiert (Eppendorf Centrifuge 5417R, Hamburg). Für

einen analytischen HPLC-Lauf wurden 50 µl Probe mit Hilfe eines Autosamplers (Waters

717, Eschborn) auf eine RP-HPLC-Säule (SP 250/4 Nucleosil 100-5 C18, bzw. CC250/4

Nucleodur C18 Gravity, 5 µm, Macherey-Nagel, Düren) aufgetragen. Die gesamte aus

Einzelmodulen aufgebaute HPLC-Anlage musste vor Beginn der Analysen konditioniert und

programmiert werden.

Zur Konditionierung der Säule, wie auch für die Analysen wurden Gradienten nach Lawton et

al. (1994) benutzt (Tabelle 3). Es wurde jeweils eine Methodenprogrammierung für die

Konditionierung (Lawton Ende MS) und eine für die Analyse (Lawton Anfang MS) benutzt.

Das Laufmittel bestand aus den Komponenten Aqua bidest. (A), Acetonitril (B) und

Acetonitril mit 0,5 % Trifluoressigsäure (C). Um eventuelle Analysenrückstände aus der

Säule zu spülen, wurden die Säulen in wechselnden zeitlichen Abständen zusätzlich mit

100 % Methanol gespült.

Tabelle 3: Gradientenzusammensetzung für HPLC-Läufe nach Lawton et al. (1994) Lawton Anfang MS (Method Set)

Zeit (min) Flussrate (ml / min) A % B % C % curve

0 1 70 20 10 0

10 1 65 25 10 6

40 1 30 60 10 6

42 1 0 90 10 6

Lawton Ende MS (Method Set)


0 1 0 90 10 0

1 1 70 20 10 6

9 1 70 20 10 6

2.3.2. RP-HPLC im semipräparativen und präparativen Maßstab Um die gewünschten Peptide in veritablen Mengen isolieren zu können, musste ein scale-up

auf größere Injektionskapazitäten vorgenommen werden. Die peptidhaltigen Fraktionen der

C18-Eluate wurden dazu zunächst im Rotationsverdampfer (Rotavapor, Büchi, Flawil)

eingeengt und nochmals bei 15.000 U/min 10 min zentrifugiert (Sorvall RC-5B, Rotor: GSA,

DuPont Instruments, Bad Homburg). Vor der Auftrennung wurden die Proben zusätzlich

durch einen Membranfilter (Chromafil PET, Durchmesser 0.45 µm, Macherey-Nagel, Düren)


filtriert. Für die verschiedenen Trennläufe wurden die Proben mit Hilfe eines Autosamplers

(Waters 717, Eschborn) auf eine RP-HPLC-Säule (SP 250/10 Nucleosil 100-7 C18, bzw. SP

250/21 Nucleosil 100-7 C18, Macherey-Nagel, Düren) aufgetragen. Je nach Säulenart wurde

die Flussrate ausgewählt. Bei semipräparativer Auftrennung (SP 250/10-Säule) betrug sie

5 ml/min und bei präparativen Bedingungen 9 ml/min. Je nach Trennleistung der Säulen

musste die Fließmittelzusammensetzung variiert werden. Des Weiteren waren zusätzliche

Reinjektionen notwendig sofern nach Vereinigung der jeweils gleichen Peptide keine

Reinsubstanzen erhalten wurden, oder aber wenn zuerst eine Vortrennung vorgenommen

wurde. Als Fließmittel wurden Aqua bidest., Acetonitril, sowie Acetonitril mit 0,5 % (v/v)

TFA in unterschiedlichen Mengenverhältnissen eingesetzt. Die Menge an Acetonitril mit

0,5 % (v/v) TFA war als einzige konstant und betrug zu jeder Zeit 10 % (v/v) an der

Fließmittelzusammensetzung. Dies gewährleistete, dass der Gehalt an TFA konstant bei

0,05 % (v/v) lag. Die HPLC-Läufe wurden sowohl unter isokratischen Bedingungen als auch

unter einem Gradienten durchgeführt. Um die optimalen Trennbedingungen zu finden,

wurden die peptidhaltigen Fraktionen zuerst einem Gradientenlauf unterzogen, dessen

einziger Unterschied zur analytischen Auftrennung in der Programmierung der Flussrate sich

widerspiegelte. Anhand der erhaltenen Chromatogramme wurden die neuen

Trennbedingungen festgelegt. Entweder bediente man sich eines Gradienten oder man wählte

eine isokratische Fließmittelzusammensetzung analog der Retentionszeit weniger 5-7 % des

organischen Anteils des Fließmittels. Bei unzureichender Reinheit war bei Reinjektion

meistens eine isokratische Fließmittelzusammensetzung gewählt worden, die je nach

Trennanforderung jedes Mal neu bestimmt werden musste.

Die einzelnen Peptidfraktionen wurden im „peak mode“ mit einem Fraktionensammler

(Waters Fraction Collector, Eschborn) gesammelt. Beispielhaft werden die angewendeten

Gradienten zur Fließmittelbestimmung, sowie die zur Vortrennung genutzten

Programmierungen angegeben (Tabelle 4).

Tabelle 4: Gradient für semipräparative Läufe Lawton Anfang 5ml MS (Method Set)


0 5 70 20 10 0

10 5 65 25 10 6

40 5 30 60 10 6

42 5 0 90 10 6


Diese Fraktion wurde jedoch nicht ausschließlich über eine Gradienten-Trennung

aufgearbeitet. Vielmehr wurden auch isokratische Fließmittelzusammensetzungen eingesetzt

(A: 60 %, B: 30 %, C: 10 % oder aber A: 50 %, B: 40 %, C: 10 %). Es gab keine allgemein

verlässliche Programmierung.

Tabelle 5: Gradient für C18 Eluat mit 75 % (v/v) Methanol C18E75_Gradient MS (Method Set)


0 5 60 30 10

5 5 70 20 10 11

20 5 30 60 10 6

Tabelle 6: Gradient für C18 Eluat mit 90 % (v/v) Methanol C18E90_Gradient MS (Method Set)


0 5 60 30 10 0

10 5 40 50 10 6

15 5 20 70 10 6

25 5 20 70 10 6

2.4. Identifizierung der Peptide und Reinheit Die einzelnen Peptide wurden anhand der Retentionszeiten im Chromatogramm zugeordnet.

Bei Verschiebung der Retentionszeiten, z. B. durch nachlassende Trennbodenzahl der Säule,

wurde versucht die Zuordnung anhand Peakhöhe, Peakform und anhand der aufgenommen

UV-Spektren vorzunehmen (Maxima, Minima und Aussehen). War eine genaue Zuordnung

nicht möglich, so wurde entweder eine Massenbestimmung der gesammelten Fraktion

veranlasst, oder man verglich die gesammelte Fraktion mit bereits eindeutig identifizierten

Peptiden.

2.4.1. Co-Chromatographie (Co-Elution) Um Reinsubstanzen mit bereits isolierten Substanzen ähnlicher Retentionszeit vergleichen zu

können, bedient man sich der Co-Chromatographie (Co-Elution). Hierzu werden zunächst in

direkt aufeinander folgenden getrennten Läufen die Retentionszeiten von Probe und Referenz

verglichen. Stimmen die Retentionszeiten im Rahmen der üblichen Verschiebung überein,


erstellt man eine Mischung aus Probe und Referenz, wobei beachtet werden muss, dass beide

Lösungen im selben Konzentrationsbereich liegen. Andernfalls kann eine Überlagerung der

Signale stattfinden und eventuelle Unterschiede in den Retentionszeiten überdeckt werden.

Die Auswertung der so co-eluierten Proben erfolgt einmal anhand der Peaksymmetrie und

zum anderen mittels UV-Spektren-Vergleich von Peakschultern und Peakmaximum. Wenn

der Peak des Gemischs symmetrisch ist und nur eine deutliche Spitze aufweist und wenn auch

die UV-Spektren sich decken, so liegen bei den beiden untersuchten Proben die gleichen

Verbindungen vor.

2.5. Strukturaufklärung der isolierten Substanzen

2.5.1. Ultraviolett-Spektroskopie UV-Spektren der gereinigten Substanzen wurden spektrometrisch (Varian Cary 100 Bio UV-

visible Spectrophotometer, Cary, USA) im Wellenlängenbereich von 195 bis 350 nm

aufgenommen. Zur Messung wurden Quarzküvetten (Hellma, Müllheim) mit der Schichtdicke

von 1 cm verwendet. Die Substanzen wurden in Methanol p.a. gelöst und auf eine

Konzentration von 1 mg/ml eingestellt. Als Referenz wurde Methanol p.a. verwendet.

2.5.2. Infrarotspektroskopie Molekülschwingungen und -rotationen werden durch Absorption von Strahlung im infraroten

Bereich des elektromagnetischen Spektrums angeregt. Es gibt zwei Möglichkeiten, solche

Molekülschwingungen oder -rotationen zu messen:

- direkt als Absorption im Infrarot-Spektrum oder

- indirekt als Streustrahlung im Raman-Spektrum

Im Institut für Pharmazeutische Wissenschaften (Universität Freiburg) wurden Messungen an

einem Fourier-Transform-IR-Spektrometer (Spectrum One FTIR-Spectrometer, Perkin-Elmer,

Boston) direkte Absorptionsmessungen vorgenommen. Die einzelnen Peptide wurden in

lyophilisierter Form auf einen Diamantkristall aufgetragen und im Transmissionsmodus

vermessen. Die Spektren wurden über einen Wellenlängenbereich von 4.000 bis 650 cm-1

aufgezeichnet.


2.5.3. Massenspektroskopie Die MS-Analysen wurden zum einen von Dr. M. Erhard (AnagnosTec GmbH, Luckenwalde),

zum anderen in der Arbeitsgruppe von Prof. W. Haehnel (Universität Freiburg, Institut für

Biologie II) zusammen mit Frau B. Knapp sowie zusammen mit Frau Dr. J. Blom an der

Limnologischen Station der Universität Zürich durchgeführt. Hieraus ergaben sich

verschiedene Durchführungsprotokolle.

Im Folgenden wird die Vorgehensweise bei der Analyse mittels Matrix unterstützter Laser

Desorptions/Ionisations-Flugzeit-Massenspektroskopie (MALDI-TOF-MS) beschrieben.

Für MALDI-TOF-MS wurden die Peptide in 10 µl Aqua dest./Ethanol/Acetonitril (1/1/1)

gelöst. Alle Proben wurden in einer gesättigten α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure-Matrix (gelöst

in 50 % Acetonitril mit 0,03 % TFA(v/v)) analysiert. Je 1 µl Matrix wurde mit 1µl Probe

gemischt und direkt auf die Platte aufgetragen. Das Molekulargewicht der Peptide wurde mit

einem „Maldi Voyager Elite time-of-flight Massenspektrometer“ (PerSeptive BioSystems,

Farmingham, MS) ermittelt. Das Licht des N-Lasers hatte eine Wellenlänge von 337 nm, die

Beschleunigungsspannung betrug 20 kV. Die Messungen wurden im „delayed extraction

mode“ durchgeführt und erlaubten so die Bestimmung der monoisotopischen Massen. Ein

Filter für Massen < 400 verbesserte die Messungen, indem die stärksten Matrix-Ionen

ausgeblendet wurden. Die Spektren wurden in der Betriebsart für Erfassung und Beugung

positiver Ionen aufgezeichnet („positive ion detection mode“ und „reflector mode“). Für die

„post-source-decay“ (PSD)-Messungen wurde die Reflektorspannung schrittweise

herabgesetzt. Es wurden zwölf spektrale Segmente gemessen und danach addiert (Erhard et

al., 1999).

2.5.4. Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie Alle Versuche mit Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie wurden an einem Thermo

Finnigan LTQ-FT-Massenspektrometer (Thermo Electron Corporation, Bremen) mit ESI-

Quelle durchgeführt. Die Ionisierung erfolgte über Elektrospray, die Detektion über eine

lineare Ionenfalle kombiniert mit einem Fourier Transform Ion Cyclotron Resonanz

Massenspektrometer (FTICR-MS; supraleitender Magnet mit 7 Tesla). Die gereinigten

Peptide wurden in 70 % (v/v) Methanol mit 0,1 % Essigsäure gelöst (0,01 mg/ml). Die

Flussrate wurde auf 5 µl/min eingestellt.


2.5.5. Magnetische Kernresonanzspektroskopie Alle NMR-Messungen wurden von L. Oberer (Novartis Pharma AG, Basel) durchgeführt. Die

Spektren wurden auf einem Bruker Avance (Bruker, Rheinstetten) DMX 500, bzw. DRX 500

Spektrometer bei 300 K, 500 MHZ und 11.746T sowie auf einem Bruker Avance DRX 600

bei 295 K, 600 MHZ und 14.095T aufgezeichnet, die mit selektiven TXI-Probenköpfen für 1D-13C Spektren und dreifach inversen Probenköpfen für die 1D-1H und 2D Spektren

ausgestattet sind. Die Peptide wurden in DMSO-d6 gelöst (< 2 mg/0,5ml), 1H und 13C

Resonanzverschiebungen wurden gegen DMSO-d6 (2,49 ppm bzw. 39,9 ppm) bestimmt. Es

wurden folgende NMR Experimente durchgeführt: 1D-1H, 1D-13C, 1H-1H-COSY, 1H-1H-

ROESY, 1H-1H-TOCSY, 1H-13C-COSY (HSQC).

2.5.6. Gaschromatographie-Massenspektrometrie-Messungen Zur Bestimmung der Konfiguration der Aminosäuren in Scytocyclamid A wurden 100 µg des

gereinigten Peptids und äquivalente Mengen an Aminosäurestandards mit 100 µl 3 M HCl-

Gas in Methanol (Supelco; Bellefonte, PA, USA) bei 110 °C über 24 h verestert. Die

Reaktionsgemische wurden getrocknet und mit Trifluoressigsäureanhydrid (TFAA; Fluka,

Schweiz) acyliert bei 80 °C über 1 h. Die gaschromatographischen Analysen wurden mit einer

Chirasil-Val-Säule (Permabond®-L-Chirasil-Val; 25m x 0,25mm; Macherey-Nagel, Düren)

durchgeführt. Die Trennung erfolgte 2 min bei 80 °C, gefolgt von einem

Temperaturgradienten von 80 °C auf 180 °C bei 8 °C min-1, sowie 10 min bei 180 °C. Die

Zuordnung der Enantiomeren erfolgte über Vergleich der Retentionzeiten mit denen der

Aminosäurestandards.

2.5.7. Konfigurationbestimmung der Aminosäuren Die Bestimmung erfolgte nach Marfey (1984). Zur Analyse der Aminosäuren wurden 100 µg

Peptid zunächst mit 6 N HCl bei 110 °C innerhalb 24 h hydrolysiert. Das resultierende

Aminosäurengemisch aus 100 µg Scytocyclamid A wurde mit 50 µl einer Lösung (10 mg /

ml) von 1-Fluor-2,4-Dinitrophenyl-5-L-Alaninamid (L-FDAA, Novabiochem, Läufelfingen,

Schweiz) in Aceton versetzt. Nach Zugabe von 100 µl 1M NaHCO3 wurde die Lösung 3 min

bei 80 °C erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurden 120 µl einer 1 M HCl und 300

µl 50 % (v/v) Acetonitril zugegeben. Die so derivatisierten Proben wurden auf einer C-18

Supelco-Sil ODS Umkehrphasensäule (4,6 x 250 mm; Supelco; Bellefonte, PA, USA)


untersucht. Ein weiterer Versuch wurde mit D-FDAA (D-FDAA, Novabiochem,

Läufelfingen, Schweiz), wobei die Probenaufbereitung und Versuchsdurchführung

beibehalten wurde.

2.6. Enzymhemmtests Die isolierten Peptide wurden in 50 % (v/v) MeOH gelöst (1 µg/µl) und für ein erstes

Aktivitäts-Screening in einer 1:100 Verdünnung eingesetzt. Bei einer nennenswerten

Hemmung wurden die Verdünnungsstufen angepasst, um eine IC50-Bestimmung

vorzunehmen. In diesen Fällen wurden anstatt Einzelbestimmungen Mehrfachbestimmungen

(dreifach, beziehungsweise vierfach Bestimmungen) durchgeführt. Die einzelnen

Verdünnungsstufen wurden mit den jeweiligen Enzymen inkubiert, mit Substrat versetzt, die

Änderung der Absorption wurde mit einem ELISA Reader (MR 5000 Elisa Reader, Dynatech,

Chantilly, Virginia) verfolgt. Alle Testansätze wurden im Mikrotiterplatten-Maßstab

durchgeführt. Des Weiteren wurden in den Testserien Positivkontrollen mit 50 % (v/v) MeOH

an Stelle der Peptidlösung und Blindproben ohne Enzym mitgeführt. Zur Überprüfung der

Funktionalität der entsprechenden Tests wurden zu Beginn der Untersuchungen käufliche

Inhibitoren der Enzyme eingesetzt.

2.6.1. Trypsin Trypsin (EC 3.4.21.4, Sigma, Taufkirchen) wurde in 1 mM HCl mit 20 mM CaCl2 (pH 3,1,

0,1 mg/ml) gelöst. 10 µl dieser Lösung wurden mit 10 µl der jeweiligen Peptidverdünnung

und 130 µl Puffer (0,1 M Tris-HCl, pH 8,2, mit 23 mM CaCl2) 10 min bei 25 °C vorinkubiert.

Danach wurden 150 µl Substrat (BAPNA, 0,3 mg/ml in Wasser) zugesetzt. Nach weiteren

3 min Inkubation wurde die Absorption bei 405 nm gemessen (Elfant et al., 1985).

2.6.2. α–Chymotrypsin α–Chymotrypsin (EC 3.4.21.1-2, Sigma, Taufkirchen) wurde in 100 mM Tris-HCl mit 10 mM

CaCl2 (pH 7,8, 0,2 mg/ml) gelöst. 50 µl dieser Lösung wurden mit 10 µl der jeweiligen

Peptidverdünnung und 190 µl Puffer (0,1 M Tris-HCl, pH 7,8, mit 10 mM CaCl2) 10 min bei

25 °C inkubiert. Danach wurden 50 µl Substratlösung zugegeben. Nach weiteren 10 min

Inkubation wurde die Absorption bei 405 nm gemessen (Delmar et al., 1979).


2.6.3. Plasmin Der Test wurde in modifizierter Form nach Lottenberg et al. (1981) durchgeführt. Plasmin

(EC 3.4.21.7, Sigma, Taufkirchen) wurde in einem Tris-Puffer (0.05 M Tris-HCl, pH 8.9,


und 170 µl Puffer 10 min bei 25 °C inkubiert. Danach wurde 10 µl Substrat (N-p-Tosyl-Gly-

Pro-Lys-p-nitroanilid, 1,1 mg/ml in Wasser) zugesetzt. Nach weiteren 3 min Inkubation

wurde die Absorption bei 405 nm gemessen.

2.6.4. Papain Papain (EC 3.4.22.2, Sigma, Taufkirchen) wurde in einem Natriumphosphat-Puffer (0,1 M

Natriumphosphat, pH 6,5, mit 1 mM EDTA, 100 µl/ml) aufgenommen. 10 µl dieser Lösung

wurden mit 10 µl der jeweiligen Peptidverdünnung und 170 µl Puffer, der zusätzlich 2 mM

Cystein enthielt, 10 min bei 40 °C vorinkubiert. Danach wurde 10 µl Substrat zugesetzt

(BAPNA, 4,2 mg/ml in DMSO). Nach weiteren 3 min Inkubation wurde die Absorption bei

405 nm gemessen (Barrett, 1981).

2.6.5. Elastase Typ IV Elastase (EC 3.4.21.36, Sigma, Taufkirchen) wurde in Tris-Puffer (0,2 M Tris-HCl, pH 8,0,


und 150 µl Puffer bei 30 °C 20 min inkubiert. Danach wurden 30 µl Substrat (N-succinyl-

Ala-Ala-Ala-p-nitroanilid, 18 mg/20 ml Puffer) zugesetzt. Nach weiteren 3 min Inkubation

wurde die Absorption bei 405 nm gemessen (Bieth et al., 1974).

2.6.6. Thrombin Der Test wurde in modifizierter Form nach Lottenberg et al. (1981) durchgeführt. Thrombin

(EC 3.4.21.5, Sigma, Taufkirchen) wurde in einem Tris-Puffer (0,2 M Tris-HCl, pH 8,0,


und 170 µl Puffer bei 25 °C 10 min inkubiert. Danach wurden 10 µl Substrat (N-p-Tosyl-Gly-

Pro-Lys-p-nitroanilid, 0,5 mg/ml in Wasser) zugesetzt. Nach weiteren 3 min Inkubation

wurde die Absorption bei 405 nm gemessen.


2.6.7. Glutathion-S-Transferase Der Test wurde in modifizierter Form nach Habig et al. (1974) durchgeführt. Glutathion-S-

Transferase (EC 2.5.1.18, Sigma, Taufkirchen) wurde in einem Kaliumphosphat-Puffer

(0,1 M Kaliumphosphat, pH 6,5, mit 1 mM EDTA, 1 unit/ml) gelöst. Zu 260 µl

Kaliumphosphat-Puffer (0,1 M Kaliumphosphat, pH 6,5, mit 1 mM EDTA) wurden 10 µl

einer Glutathion-Lösung (75 mM der reduzierten Form in Puffer), sowie 10 µl Substrat

(1-Chlor-2,4-Dinitrobenzen, 30 mM in 95 % (v/v) Ethanol) gegeben und bei 25 °C inkubiert

bis die Absorption bei 340 nm konstant war. Danach wurden 10 µl der Enzymlösung

zugegeben und die Absorptionsänderung über 5 Minuten verfolgt.

2.6.8. Carboxypeptidase A Carboxypeptidase A (EC 3.4.17.1, Sigma, Taufkirchen) wurde in eiskalter NaCl-Lösung (1

M, 0,5 mg/ml) gelöst. 50 µl dieser Lösung wurden mit 10 µl der jeweiligen Peptidverdünnung

und 140 µl Tris-Puffer (0,025 M Tris-HCl, pH 7,5, mit 0,5 M NaCl) versetzt und 30 min bei

Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden 150 µl Substrat (Hippuryl-L-phenylalanin,

0,001 M in Tris-HCl mit NaCl) zugegeben und die Absorption bei 254 nm gemessen

(Bergmeyer et al., 1974).

2.6.9. Leucin-Aminopeptidase Leucin-Aminopeptidase (EC 1.1.1.42, Sigma, Taufkirchen) wurde in kaltem Aqua dest.

(2,4 µl/ml). 10 µl dieser Lösung wurden mit 10 µl der jeweiligen Peptidverdünnung und

270 µl Natriumphosphat-Puffer (0,05 M Natriumphosphat, pH 7,2, 7,2 mg/ml) 15 min bei

37 °C inkubiert. Danach wurden 10 µl Substrat (L-Leucin-p-Nitroanilid, 0,024 M in Methanol

100 %) zugegeben. Nach weiteren 30 min Inkubation bei 37 °C wurde die Absorption bei

405 nm gemessen (Pfleiderer et al., 1970).

2.6.10. Thermolysin Der Test wurde in modifizierter Form nach Holmquist et al. (1974) durchgeführt.

Thermolysin (EC 3.4.24.27, Sigma, Taufkirchen) wurde in Acetat-Puffer (Natriumacetat

10 mM, Calciumacetat 5 mM, 0,5 mg/ml) gelöst. 60 µl dieser Lösung wurden mit 10 µl der

jeweiligen Peptidverdünnung und 140 µl Tris-Puffer (Tris-HCl 0,05 M, mit CaCl2 0,01 M,

mit NaCl 0,1 M, pH 7,5, 0,5 mg/ml) 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden


90 µl Substrat (N-(3-[2-Furyl]acryloyl)-Gly-Leu-amid in Tris-Puffer (Tris-HCl 0,05 M, mit

CaCl2 0,01 M, mit NaCl 0,1 M, pH 7,5, 0,5 mg/ml) zugegeben. Nach weiteren 3 min

Inkubation wurde die Absorption bei 405 nm gemessen.

2.6.11. Proteinphosphatase PP1A Der Test wurde in modifizierter Form nach An und Carmichael (1994) durchgeführt. Es

wurde im Enzympuffer gelöste Protein-Phosphatase (EC 3.1.3.16, Calbiochem, Bad Soden)

verwendet, welche vor Gebrauch mit Verdünnungspuffer (Tris-HCl 50 mM, 1 mg/ml BSA,

MgCl2 20 mM, MnCl2 1 mM, DTT 2 mM, pH 7,4) auf 0,1 u/10 µl eingestellt wurde. Es

wurden 10 µl der Phosphatase-Verdünnung mit 10 µl der jeweiligen Peptidverdünnung

10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden 180 µl des Reaktionspuffers (Tris-HCl

50 mM, MgCl2 20 mM, MnCl2 1 mM, DDT 1 mM, 0,5 mg/ml BSA, p-Nitrophenolphosphat

(Tris-Salz) pH 8,1)zugegeben. Nach weiteren 20 min wird Inkubation wurde die Absorption

bei 405 nm gemessen.

2.7. Testung auf antimikrobielle Aktivität Als Methode wurde Mikrodilution nach Chmel et al. (1980) gewählt. Hierzu wurden zunächst

Stammlösungen der Peptide (128 µg/ml) sowie eines Peptidgemischs (je 42,7 µg/ml)

hergestellt: die Peptide wurden in DMSO aufgenommen und bis zur gewünschten

Konzentration mit Mueller-Hinton-Bouillon verdünnt. Vor Beginn der Versuche wurde die

Sterilität der Peptide ausgetestet, indem die Peptidstammlösungen auf BST-Agar-Platten

aufgetragen und bei 36 °C für 48 h inkubiert wurden. Es wurde kein Wachstum beobachtet.

Die Stammlösung des Peptidgemischs wurde aufgrund einer Keimbelastung mit einem

Sterilfilter (0,2 µm, Schleicher & Schuell FP 030/3, Dassel) filtriert.

Aus den Keimsuspensionen in MH-Bouillon Mac Farland (Ausnahme: Streptococcus

pyogenes Gr. A in H-Bouillon FA Merlin) mit 0.5 = 1 x 108 Keime/ml wurde ein Inokulum

mit 5 x 105 Keime/ml hergestellt (1:200 Verdünnung).

Von den jeweiligen Stammlösungen (128 µg/ml) wurden 1:2 Verdünnungen bis zur

Endkonzentrationen von 0.125 µg/ml hergestellt. In alle Vertiefungen der 96er Deep-Well-

Platten wurden jeweils 50 µl MH-Bouillon vorgelegt, anschließend wurden 50 µl der

betreffenden Verdünnungen der Peptide zupipettiert. Die einzelnen Wells wurden mit 10 µl

der 1:200 Keimverdünnung beimpft, so dass eine weitere Keimverdünnung stattfand und die


Endkonzentration bei annähernd 5 x 104 Keime / ml lag. Die Platten wurden über Nacht im

Brutschrank bei 36 °C inkubiert und am nächsten Tag ausgewertet.

Tabelle 7: Medium für Sterilitätsassay: BST-Agar Komponenten Menge BST Medium dehydrated 36,8 g Aqua dest. ad 1000 ml pH 7,4 Tabelle 8: Medium für Mikrodilutionsassays: Mueller-Hinton-Bouillon Komponenten Menge ( g / l ) Rinder Infus 2,0 Stärke 1,5 Pepton aus Casein 17,5 pH 7,4 ± 0,2 Herstellung:

21 g der Bouillon-Mischung wurden in einem Liter destillierten Wasser suspendiert, gut

gemischt und unter häufigem Rühren/Schütteln erhitzt, bis die Komponenten vollständig

gelöst waren. Das Medium wurde bei 118-121 °C 15 min sterilisiert.

2.8. Hämolysetest Von den isolierten Peptiden wurde jeweils eine gesättigte Stammlösung in Ethanol hergestellt.

Die Stammlösungen wurden mit PBS-Puffer auf eine Ethanolkonzentration von 10 % (v/v)

verdünnt. Mögliche Auswirkungen wurden am Lichtmikroskop verfolgt. Hierzu wurden zu

einer Erythrozyten-Lösung (vom Schaf) jeweils 20 µl Peptid-Lösung zupipettiert. Zusätzlich

wurde eine Blutagarplatte mit jeweils 10 µl Peptidlösung beimpft und im Brutschrank 48 h

inkubiert.

2.9. Toxizitätstest mit Kleinkrebsen (Crustaceen) Hierzu wurde die Mortalität der Kleinkrebse nach 24 h Inkubation mit den jeweiligen

Peptiden untersucht (Centeno et al., 1995). Die Testbedingungen orientierten sich am

käuflichen Thamnotoxkit FTM (MicroBioTests Inc., Nazareth, Belgien) und dem

mitgelieferten Standardprotokoll. Es kamen die Cyanopeptoline Hofmannolin, Scyptolin A


und B, sowie Scytocyclamide A und B zum Einsatz. Die Versuche wurden in 24er

Zellkulturplatten durchgeführt, wobei folgende Peptidkonzentrationen eingesetzt wurden:

100, 50, 25, 10, 1 und 0,1 µM bei einem Volumen von jeweils 500 µl. In jedes Well sollten

wenn möglich mindestens 10 Crustaceen gegeben werden. Als Kontrollen wurden Wasser

und 1 % (v/v) MeOH mitgeführt. Nach 24 h Inkubation bei 20 °C im Dunkeln wurde die

Todesrate pro Well bestimmt.

Vergleichend wurden die Scytocyclamide A und B auf Ihre Wirkung auf Daphnia magna

getestet. Es wurden keine vollständigen Versuchsreihen durchgeführt, die Versuche sollten

lediglich einem Screening dienen. Es wurden jeweils zweimal die Konzentrationen 100, 50

und 10 µM auf eine Daphnie getestet.

2.10. Zytotoxizitätsversuche

2.10.1. Zelllinien Insgesamt wurden 6 Peptide (Scyptolin A / B, Hofmannolin sowie die Scytocyclamide A bis

C) aus Scytonema hofmanni PCC 7110 auf Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Zelllinien

getestet. Für die Versuche wurden gebrauchsfertige Zelllinien zur Verfügung gestellt:

CaCo 2 Zellen aus humanen Colorectalem Adenokarzinom

HeLa humane Epithelzellen eines Zervixkarzinoms

Swiss 3T3 Zellen aus embryonalen Mäusefibroblasten

Ebl embryonale Rinderlungenzellen

RBL basophile Rattenleukämiezellen

LoVo Zellen aus humanen Colorectalem Adenokarzinom

2.10.2. Trypanblaufärbung Um die Lebensfähigkeit von Zellen zu prüfen, wird heute auf den einfach und schnell

anzuwendenden Routinetest der Trypanblaufärbung zurückgegriffen. Trypanblau ist ein

saurer Farbstoff, dessen Anion an Zellproteine bindet. Trypanblau dringt durch defekte

Zellmembranen toter Zellen in das Cytosol und färbt diese Zellen tiefblau. Lebende Zellen

erscheinen unter dem Mikroskop leuchtend hell. Jedoch ist bei zu langer Einwirkzeit des

Trypanblau ist ein Anstieg von toten Zellen zu beobachten, da dieser Farbstoff zytotoxisch

wirkt. Die Zellzahl abgetöteter Zellen wurde mit einem Hämozytometer nach Neubauer


bestimmt (Schichttiefe: 0,1 mm). Vor dem Zählen wurden die Zellen vom Flaschenboden

gelöst, abzentrifugiert und nochmals mit PBS-Puffer gewaschen. Die Zellen wurden in

frisches Medium aufgenommen und resuspendiert. Anschließend wurden 20 µl

Zellsuspension mit 20 µl Trypanblau-Lösung gut vermischt und auf die Zählkammer

aufgebracht.

2.11. Versuche zur Membranschädigung

2.11.1. Testung auf porenbildende Aktivität

„Lipid-bilayer“-Studien sind eine Möglichkeit, um durch Toxine verursachte Porenbildung in

einem in vitro-System zu untersuchen (Benz et al., 1978): Hierbei verwendet man einen mit

wässriger Lösung gefüllten Behälter, der durch eine Scheidewand in zwei Bereiche unterteilt

ist. In der Scheidewand befindet sich ein Loch mit einem Durchmesser von etwa einem

Millimeter. Über diesem Loch kann man nun eine Membran aus Lecithin entstehen lassen. Sie

ist etwa 5 nm dick und damit ungefähr genau so dick wie eine natürliche Membran und

besteht ausschließlich aus Diphytanoyl-Phosphatidylcholin und n-Dekan.

Abb. 3: Messapparatur zur Bestimmung der Membranleitfähigkeit; Versuchsbedingungen: 1 M KCl, pH 6, Membranen aus Diphytanoyl-Phosphatidylcholin/n-Dekan

2.11.2. 86Rubidium+-Efflux Scytocyclamid A und B wurden in DSMO gelöst (10 µg/µl). Zu einer Zellsuspension aus HT-

29-Zellen wurde 1 µCi 86Rb+/ml zugegeben (Barth et al., 2001). Die Zellen wurden in

24-Well-Platten mit 2 x 105/well ausgesät. Das Volumen des Inokulums betrug 500 µl. Nach


4 Tagen Wachstum wurden die Zellen zweimal mit PBS-Puffer gewaschen. Anschließend

wurden die Zellen in 500 µl Medium ohne FCS (McCoys-Medium, Sigma, Taufkirchen)

aufgenommen und mit 1,76 µl Peptid 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Aliquote der

Versuchsansätze wurden entnommen und der Rubidiumefflux durch Szintillationszählung

(LKB, Rackbeta 1209, Gräfelfing) bestimmt. Es wurden jeweils 3-fach Bestimmungen

durchgeführt. DMSO (1,76 µl) wurde als Kontrolle mitgeführt.

2.12. Immunhistochemische Untersuchungen HeLa-Zellen wurden in einem Zytoskelett stabilisierenden Puffer (CSB), welcher 80 mM

PIPES, 5 mM EGTA, 1 mM MgCl2, und 4 % (v/v) PEG (MW 35.000) enthielt mit 4 % (v/v)

Paraformaldehyd 12 min fixiert (Schaefer et al., 2002). Nach Waschen mit CSB-Puffer

wurden die Zellen 2 min mit 0,1 % (v/v) Triton X-100 in CSB permeabilisiert. „normal goat

serum“ wurde zugegeben um unspezifische Bindungen zu verhindern. Zur α-Tubulin III

Färbung wurden die Zellen mit monoklonalem Mäuse anti-α-Tubulin III Antikörper (1:4.000;

Sigma, Taufkirchen) inkubiert. Der resultierende Immunkomplex wurde mit Alexa 488

gekoppeltem F(ab´)2 Fragment eines anti-Mäuse, bzw. anti-Kaninchen IgG (Molecular

Probes, Heidelberg) visualisiert. F-actin-Färbung wurde mit Alexa 594 gekoppeltem

Phalloidin (Molecular Probes, Heidelberg) inkubiert und mit PBS-Puffer gewaschen.

2.13. Testung auf Apoptose

2.13.1. Fluoreszenz-aktivierte Zell-Sortierung (FACS-Analysen) Die FACS-Analysen wurden mit dem Becton /Dickinson FACS-Calibur (Becton / Dickinson

Corp., Heidelberg). Die verschiedenen Fluoreszenzkanäle wurden auf Vorwärtsstreulicht

(„forewardscatter“ FSC), Seitwärtsstreulicht („sidewardscatter“ SSC), Fluorescein-

Isothiocyanat (FITC), Hydroethidin (2-HE, Molecular Probes), Dihexyloxacarbocyanin-Iodid

(DiOC6(3) (Molecular Probes) und auf Propidiumiodid (PI) eingestellt. Die

Messwellenlängen wurden je nach Untersuchungsziel auf die passenden Wellenlängen

eingestellt. Die Fluoreszenzintensität war hierbei Maß für die Absorption bei der

Maximalwellenlänge des betreffenden Markers. Die Daten wurden in Form von

Häufigkeitshistogrammen akquiriert und mit CellQuest® (Becton / Dickinson Corp.,

Heidelberg) ausgewertet.


2.13.1.1. Apoptose-Färbung mit Annexin V-FITC und Propidiumiodid Die Apoptosebestimmung erfolgte mit Hilfe von FITC-markiertem Annexin V und

Propidiumiodid gemäß Protokoll (BD Pharmingen, Heidelberg). Die mit Scytocyclamid A

(10 µmol) für 5-6 h inkubierten Zellen (MEF-Zelllinie: embryonale Mäusefibroblasten)

wurden 1-2 Mal mit PBS-Puffer gewaschen und in 100 µl Annexin Bindungspuffer

aufgenommen. Dieser Puffer enthielt Ca2+-Ionen. Es folgte die Zugaben von 5 µl Annexin V

und 2 µl Propidiumiodid. Der Versuchsansatz wurde bei Raumtemperatur im Dunkeln 15 min

inkubiert. Anschließend wurden weitere 100 µl Annexinbindungspuffer zugegeben und

innerhalb von 1 h die Messungen durchgeführt.

2.13.1.2. Mitochondriales Membranpotential Die Messung des Membranpotentials wurde über die DiOC6(3)-Färbung am

Durchflusszytometer verfolgt. Die verwendeten Zellen (250.000) wurden abzentrifugiert, der

Überstand aus Medium (EMEM, unter Zusatz von 5 % (v/v) fötalem Kälberserum) wurde

verworfen. Anschließend resuspendierte man die Zellen in 200 µl Medium, welches 2 µM

Hydroethidin enthielt. Es wurde bei 37 °C, 5 % CO2 unter Lichtausschluß 15 min inkubiert

gefolgt von der Zugabe von 20 nM DiOC6(3) und nochmaliger Inkubation bei 37 °C, 5 %

CO2 unter Lichtausschluß für weitere 15 min. Eine Positivkontrolle wurde parallel dazu

bearbeitet: 250.000 Zellen wurden nach Zentrifugation in Medium, welches 200 µM CCCP

enthielt, resuspendiert und 1 h bei 37 °C inkubiert. Der Ansatz wurde abzentrifugiert, der

Überstand verworfen und die Zellen in 100 µl Medium, welches 40 nM DiOC6(3) enthielt

resuspendiert. Es folgte Inkubation bei 37 °C für 15 min. Es wurde auf 1 ml Gesamtvolumen

mit PBS-Puffer aufgefüllt und die Proben mit Durchflusszytometrie (Becton / Dickinson

Corp., Heidelberg) gemessen.

2.13.1.3. Detektion reaktiver Sauerstoffspezies Die Versuchsdurchführung ist bei „Mitochondrien Membranpotential“ des Methodenteils

(siehe 2.16.1.2.) angegeben. Es wurde lediglich auf einen anderen, für Ethidium geeigneten

Fluoreszenzlichtkanal umgestellt.

Ergebnisse 40

3. Ergebnisse In der vorliegenden Arbeit wurde das Spektrum an Peptid-Sekundärmetaboliten des

Cyanobakterienstamms Scytonema hofmanni PCC 7110 analytisch-chemisch sowie

hinsichtlich biologischer Wirksamkeit näher untersucht. Durch Matern (2002) waren bereits 3

Cyanopeptoline charakterisiert worden. Für ein weiteres Peptid wurde anhand von

Fragmentdaten aus der Massenspektrometrie eine Struktur vom Cyanopeptolin-Typ postuliert,

ohne dass diese durch weiterführende Analysen bestätigt werden konnte.

3.1. Charakterisierung der Cyanopeptoline und Scytocyclamide Das HPLC-Chromatogramm des Zell-Rohextraktes (Abb. 4) bestätigte zunächst die von

Matern et al. (2002) identifizierten Peptide. Neben diesen Signalen wurden jedoch weitere

bisher nicht näher untersuchte Signale erhalten. Die Signale mit Retentionszeiten > 25 min

hatten untypische UV-Spektren im Vergleich zu den bisher charakterisierten Peptiden aus

Scytonema hofmanni. Ausgehend von einem methanolischen Rohextrakt wurden in der

vorgelegten Arbeit die einzelnen Peptide über mehrere Schritte der Festphasen-

chromatographie isoliert. Die Strukturen der einzelnen Verbindungen wurden über UV- und

IR-Messungen, Massenspektrometrie und durch NMR-Analytik näher charakterisiert. Wie im

weiteren Verlauf der Arbeit belegt wird, erwiesen sich die zusätzlich identifizierten

Cyanopeptoline als potente Hemmstoffe neuer Zielenzyme aus der Klasse der Proteasen. Mit

den bisher unbekannten Scytocyclamiden wurden Peptide mit zytotoxischen Eigenschaften

identifiziert.

3.1.1. Extraktion und Isolierung Die Zellen aus Scytonema hofmanni PCC 7110 wurden mit 50 % (v/v) Methanol extrahiert,

und der so gewonnene Rohextrakt wurde durch RP-HPLC untersucht. Anhand der UV-

Absorptionsspektren einzelner Signale wurden von Matern (2002) nicht identifizierte bisher

nicht untersuchte Peptide vermutet (Abb. 4 und 5). Neben den für die Cyanopeptoline

bekannten UV-Spektren wurden bei den Signalen mit einer Retentionszeit > 25 min für

Cyanopeptoline untypische Spektren detektiert. Diese Peptide wurden in die Untersuchungen

mit einbezogen (Abb.5).

Ergebnisse 41

Abb. 4: RP-Elutionsprofil des Rohextraktes von Scytonema hofmanni PCC 7110. Gradient nach Lawton et al. (1994). Die Datenaufzeichnung erfolgte von 5 bis 45 min. Säule: ODS-4HE Grom-Sil; Flussrate: 1 ml/min; Wellenlänge: 200-300 nm

Abb. 5: RP-Elutionsprofil des Rohextraktes von Scytonema hofmanni PCC 7110. Gradient nach Lawton et al. (1994). Die Datenaufzeichnung erfolgte von 5 bis 45 min. Säule: ODS-4HE Grom-Sil; Flussrate: 1 ml/min; Wellenlänge: 200-300 nm Zur weiteren Aufarbeitung wurden die Peptide durch Bindung an einer Chromabond® C18-

Festphase konzentriert und mit Methanol steigender Konzentration [60 %, 75 % und 90 %

(v/v)] von der Säule eluiert. Die Bindung an die Festphasensäule erfolgte über hydrophobe

Wechselwirkungen, die Fraktionierung über die unterschiedliche Elutionskraft des

Lösungsmittels. Neben der Elutionskraft des Lösungsmittels hatte auch die Menge des

Elutionsmittel einen Einfluss auf die Zusammensetzung des Eluates. Da es sich bei diesem

Verfahrensschritt nur um eine Aufkonzentrierung handelt, welche von weiteren

Auftrennungsschritten gefolgt wird, waren Unterschiede in der Zusammensetzung der

Fraktionen von Extraktion zu Extraktion ohne Einfluss. Je nach Signalmuster musste die

Fließmittelzusammensetzung während der semipräparativen Auftrennung angepasst werden.

Auf Verfahrensschritte wie Ionenaustauschchromatographie wurde verzichtet, da zusätzliche

Verfahrensschritte mit Substanzverlust einhergehen. Die Ausbeute an einzelnem Peptid lag

bei maximal 0,4 mg/g Trockengewicht.

Scyt.C

Scyt.B Scyt.A

Scyp.B

Hofm.

1060

Scyp.A

946

5 10 15 20 25 30 35 40

0.00

0.25

0.50

0.75

Hofmanno lin Scypto lin B

Scypto lin A

Scytocyclamid BScytocyclamid C

Scytocyclamid A

Cyanopepto lin946A

Cyanopepto lin1067A

Cyanopep to lin1060A

min

OD

220

nm

Ergebnisse 42

Abb. 6: HPLC-Chromatogramme der C18-Eluate; Gradient nach Lawton et al., 1994. Die Datenaufzeichnung erfolgte von 4 min bis 42 min; Säule: Nucleosil 100-5 C18; Flussrate: 1 ml/min.; Wellenlänge: 220 nm

Abb. 7: Elutionsprofile der isolierten Peptide (Trennung über semipräparative Säule: SP 250/10 Nucleosil 100-7 C18) nach Trocknen, Wiederaufnahme und Reinjektion. Gradient nach Lawton et al., 1994. Säule: Nucleosil 100-5 C18; Flussrate: 1 ml/min; Wellenlänge: 220 nm

C18E90%

3.5 13.5 23.5 33.5 43.5-0.05

0.20

0.45

0.70

Scytocyclamid B

Scytocyclamid C

Scytocyclamid A

Scyptolin B

min

OD

220

nm

C18E 75%

3.5 13.5 23.5 33.5 43.50.00

0.05

0.10

0.15

0.20 Scyptolin B

Cyanopeptolin1060A

Cyanopeptolin946A

Scyptolin A

min

OD

220

nm

C18E 60%

3.5 13.5 23.5 33.5 43.5-0.1

0.9

1.9

Hofmannolin

Cyanopeptolin1060A

Cyanopeptolin1067A

min

OD

220

nm

Cyanopeptolin 1060A

13.5 18.5 23.5-0.05

0.45

0.95

nm

OD

220

nm

Cyanopeptolin 1067A

13.5 14.5 15.5 16.5 17.5 18.5-0.01

0.04

0.09

0.14

0.19

0.24

min

OD

220

nm

Scytocyclamid B

17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0-0.01

0.09

0.19

0.29

0.39

0.49

0.59

0.69

min

OD

220

nm

Scytocyclamid A

20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.00.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

min

OD

220

nm

Cyanopeptolin 946A

7.5 8.5 9.5 10.5 11.5 12.50.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

min

OD

220

nm

Scytocyclamid C

20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0-0.01

0.04

0.09

0.14

0.19

0.24

0.29

min

OD

220

nm

Ergebnisse 43

3.1.2. Strukturaufklärung von Cyanopeptolin 1060A 3.1.2.1. Ultraviolett-Spektroskopie Die UV-Spektren der einzelnen Signale wurden während der HPLC-Läufe online

aufgezeichnet. Da nicht alle Daten vom HPLC-Rechner exportierbar sind, wurde das isolierte

Cyanopeptolin 1060A in Methanol gelöst und die Absorption im ultravioletten Bereich (195

bis 400 nm) aufgezeichnet. Dabei wurden für Cyanopeptolin 1060A Maxima bei 221 und 276

nm gemessen (Abb. 8). Im Bereich von 220 nm werden Peptidbindungen detektiert, um 280

nm absorbieren aromatische Aminosäuren.

Abb. 8: UV-Spektrum von Cyanopeptolin 1060A

3.1.2.2. Infrarotspektroskopie Mit einem FTIR-Spektrometer lassen sich mit geringem Substanzbedarf IR-Spektren

aufzeichnen. Cyanopeptolin 1060A wurde in lyophilisierter Form auf einen Diamantkristall

aufgetragen und im Transmissionsmodus vermessen (Abb. 9). Die Transmission wurde bei

Wellenzahlen von 4.000-680 cm-1 aufgezeichnet. Im Spektrum kann man Verunreinigungen

erkennen, welche auf die Verwendung von Trifluoressigsäure als Ionenpaar-Reagenz im

Fließmittelgemisch während der HPLC-Auftrennungen zurückzuführen sind. TFA ist leicht

flüchtig, jedoch bleiben Rückstände nach dem Trocknen. Typische Wellenzahlen im Bereich

um 1.800 cm-1 (C=O-Valenzschwingungen) und um 3.300 cm-1 (OH-/ NH-

Valenzschwingungen) sind als Hinweis auf Peptidstrukturen zu werten.

Ergebnisse 44

Abb. 9: IR-Spektrum von Cyanopeptolin 1060A

Tabelle 9: Zuordnung der Wellenzahlen Wellenzahl Interpretation Wellenzahl Interpretation

3284,74 (O-H / N-H) Valenzschwingungen 1339,13 (O-H)-Deformationsschwingung

2968,51 (C-H) Valenzschwingungen 1145,45 (C-O) Valenzschwingung

1735,23 Ester (C=O-Valenzschwingung) 1027,77

1643,48 Amid I (C=O-Valenzschwingung) 919,10

1515,08 Amid II (C=O-Valenzschwingung) 834,97 (C-H) Deformationsschwingung an 1,4-disubstituierten Aromaten

1443,96 (C-H) Deformationsschwingung 723,19 CH2-rocking-Schwingung

3.1.2.3. Massenspektrometrie

Erste Hinweise auf Strukturelemente von Cyanopeptolin 1060A wurden durch MALDI-TOF-

Massenspektroskopie-Daten gewonnen. Die Messungen wurden im positive ion mode

durchgeführt und lieferten drei Signale. Der base peak wurde bei m/z 1.082,24 [M+Na]

detektiert. Daneben wurden Signale bei 1.042,24 [M-H2O+H], 1.064,23 [M-H2O+Na] und

1.096,28 [M+K] beobachtet.

Anhand der post source decay (PSD)-Spektren konnten Teilstrukturen identifiziert werden.

Dabei war es hilfreich die Fragmentspektren mit denen bereits charakterisierter

Cyanopeptoline (Matern et al., 2002) zu vergleichen. Analogien wurden zu Hofmannolin

festgestellt: die Signale der Fragmentspektren des neuen Cyanopeptolins 1060A wiesen

oftmals einen Massenunterschied von minus 14 Dalton auf. Dieser Massenunterschied wurde

in einer um eine Methylengruppe (-CH2-) verkürzten Strukturmodifikation vermutet.

Die bei der Fragmentierung gebildeten Bruchstücke hatten eine zufällige Verteilung. So

führten verschiedene Bruchstellen zu unterschiedlichen Fragmentbruchstücken. Durch

1060

8001300180023002800330038000

25

50

75

100

3284,742968,51

705,83

1735,23

1515,081643,48

1443,96

1339,13

1145,45

919,10

834,97

799,44

1027,77

723,19

cm-1

% T

rans

mis

sion

Ergebnisse 45

Überschneidungen der Bruchstücke kann man Rückschlüsse auf die vollständige Sequenz

bekommen. Durch die Vergleiche der Fragmentspektren und die Zuordnungen der

Fragmentmassen zu bestimmten Bruchstücken konnte man ableiten, dass Cyanopeptolin

1060A das gleiche Ringgerüst aufweist wie Hofmannolin und dass die Molekülmodifikation

in der Seitenkette lokalisiert ist (siehe hierzu Abb. 11). Die Fragmentzuordnungen sind in

Tabelle 10 angegeben.

Tabelle 10: MALDI-TOF PSD-Fragmentzuordnung von Cyanopeptolin 1060A Sequenz Ion m/z Tyr Ahp OMTyr NMTyr Val Thr Glu Hiv M-H2O+H 1042 Tyr Ahp OMTyr NMTyr Val Thr Glu Hiv M-CO- H2O+H 1015 Tyr Ahp OMTyr NMTyr Thr Glu Hiv M-H2O+H 944 Tyr Ahp OMTyr Val Thr Glu Hiv M- H2O+H 865 Tyr Ahp OMTyr Val Thr Glu Hiv M-CO- H2O+H 837 Tyr Ahp OMTyr NMTyr Val Thr M-H2O+H 814 Tyr NMTyr Val Thr Glu Hiv M+H 770 NMTyr Val Thr Glu Hiv M+H 607 Ahp OMTyr NMTyr Val M+H 567 Ahp OMTyr NMTyr Val M- H2O+H 549 Tyr Thr Glu Hiv M- H2O+H 476 Ahp OMTyr NMTyr M-H2O+H 450 Tyr Ahp OMTyr M-H2O+H 436 Ahp OMTyr M-H2O+H 273 Ahp OMTyr M-CO- H2O+H 245 Val Thr M+H 200 NMTyr Immoniumion 150 Tyr Immoniumion 136 Tyr Seitenkette 107 Glu Seitenkette 102 Val Immoniumion 72 Es wurde eine Summenformel von C53H69N7O16 bestimmt. Die Struktur konnte jedoch anhand

der Massenzahlen nicht gelöst werden. Die Strukturmodifikation der Seitenkette musste daher

durch H-NMR-Messungen bestimmt werden.

3.1.2.4. Magnetische Kernresonanzspektroskopie

Aus den 1H-NMR-Spektren von Cyanopeptolin 1060A ließen sich 48 unterschiedliche

chemische Verschiebungen bestimmen, welchen 69 Protonen zugeordnet werden mussten.

Von den 69 Protonen waren 68 auf den Bereich von 0,5 ppm bis 9,5 ppm verteilt. Neben

diesen Resonanzsignalen war ein weiteres breites Signal mit hoher Linienbreite bei 12,1 ppm

detektiert worden. Linienverbreiterungen sind oftmals durch intermolekulare

Austauscheffekte zu erklären. Die chemische Verschiebung zu diesem Signal lässt vermuten,

dass es sich mit hoher Wahrscheinlichkeit um ein Proton einer Hydroxylgruppe handelt.

Durch weitere Messungen, wie TOCSY- und ROESY-Korrelationsmessungen, sowie durch

Ergebnisse 46

HSQC-Aufnahmen konnte dieses Signal der Säurefunktion von Glutaminsäure zugeordnet

werden (siehe hierzu Abb. 11).

In Analogie zu dem von Matern et al. (2003) gefundenen Hofmannolin konnten 7 Methyl-

und 12 Methingruppen bestimmt werden. Wie auch die Daten aus der Massenspektroskopie

nahe legten, konnten nur 7 anstatt der 8 in Hofmannolin gefundenen Methylengruppen

zugeordnet werden. Daneben wurden 12 aromatische Protonen detektiert. Die Auswertung der

HSQC-Korrelationen ergab, dass 59 Protonen an Kohlenstoff gebunden sind. Weitere

10 Protonen müssen in diesem Fall an andere Atome gebunden sein. Jeweils 2 Protonen

konnten phenolischen und olefinischen Hydroxylgruppen zugeordnet werden. Die

verbleibenden 5 Protonen konnten an Stickstoffatomen der Amidbindungen (Dubletts

zwischen 7,0 und 8,6 ppm) gefunden werden.

Es wurden 5 Signale ausgewertet, welche keine Aufspaltung aufwiesen. Durch Integration

konnten 2 dieser 5 Signale Methylgruppen zugeordnet werden, welche nicht in Nachbarschaft

zu anderen Kohlenstoffatomen stehen (2,75 und 3,72 ppm). Die anderen 3 Signale gehören zu

2 phenolischen OH-Gruppen (9,07 und und 9,37 ppm), sowie zur Säurefunktion der

Glutaminsäure (12,13 ppm) (siehe hierzu Abb. 11).

Neben den Singuletts der aromatischen Methoxygruppe und der N-Methylgruppe zeigen die

anderen Methylgruppen Duplizität durch die Nachbarschaft eines weiteren Protons. Alle 7

Methylengruppen sind an Kohlenstoff gebunden, wie aus den 1H bzw. 13C Verschiebungen

hervorgeht (Tabelle 11). Anhand der HSQC-Korelationen der Methingruppen lassen sich drei

an Sauerstoff und sieben an Stickstoff gebundene Methingruppen identifizieren.

Bei den aromatischen Aminosäuren mit insgesamt 12 Protonen ergeben sich durch para-

Substitution für 4 Protonen einer Aminosäure jeweils zwei chemisch äquivalente

Protonenpaare. Es handelt sich um ein AA`BB`-Spinsystem. Die Signale werden jeweils

durch die Nachbarschaft eines weiteren Protons in Dubletts aufgespaltet.

Die Unterschiede zu Hofmannolin zeigen sich in der Seitenkette. Durch die um eine

Methylengruppe verkürzte Seitenkette bekommt man keine Aufspaltung zu einem Triplett bei

0,93 ppm. In Einklang dazu stehen fünf Korrelationen aus dem TOCSY-Spektrum, welche

durch die Protonen tragende Gruppen verursacht werden (siehe hierzu Abb. 11).

Ergebnisse 47

Abb. 10: H-NMR-Spektrum von Cyanopeptolin 1060A

Tabelle 11: NMR-Spektroskopie und Teilstrukturen von Cyanopeptolin 1060A Aminosäure Position δ 13C

(aus HSQC) δ 1H Multiplizität, J (Hz) NOE-Korrelationen

Hiv1 1 2 75,8 3,75 trip. Glu2-NH 3 31,4 2,00 mult. 4 19,5 0,93 dubl. (7,3) 5 16,8 0,81 dubl. (6,6) OH 5,48 dubl. (5,1) Glu2-NH Glu2 1 2 52,4 4,46 mult. Thr3-NH 3 28,0 1,81/1,95 2x mult. 4 30,5 2,24 trip. (8,0) 5 5-OH 12,13 sing. (breit) NH 7,78 dubl. (9,5) Hiv1-2; Hiv1-OH, Thr3-NH Thr3 1 2 54,6 4,58 dubl. (8,7) Tyr4-NH 3 5.40 quadr. (6,6) Tyr4-NH 4 18,0 1,12 dubl. (5,9) NH 7,78 dubl. (9,5) Glu2-2, Glu2-NH Tyr4 1 2 54,2 4,34 mult. Ahp5-NH, 3 72,4 2,55/3,12 2x mult. 1´ 35,5 2´/6´ 130,2 6,91 dubl. (8,0) 3´/5´ 115,5 6,58 dubl. (8,8) 4´ OH 9,07 sing. Thr3-2 NH 8,53 dubl. (8,8) Ahp5-NH, Thr3-2 Ahp5 1 2 49,5 3,70 mult. 3 22,0 1,66/2,43 2x mult. 4 29,6 1,59/1,70 2x mult. Tyr6-3, Tyr6-2´,6´,3´,5´ 5 74,4 5,05 sing. mTyr7-NCH3 5-OH 5,98 dubl. (2,1) Val8-4,5, Val8-NH, Tyr6-2´,6´,3´,5 NH 7,10dubl. (9,5) Tyr4-NH, Tyr4-2 Tyr6 1 2 50,8 4,70 mult. 3 34,8 1,74/2,79 2x mult.

Ergebnisse 48

1´ 2´/6´ 130,8 6,76 dubl. (8,0) Ahp5-5 3´/5´ 113,8 6,76 dubl. (8,0) Ahp5-5 4´ OCH3 55,4 3,72 sing. Ahp5-NH mTyr7 1 2 61,0 4,91 mult. 3 33,4 3,07 2x mult. Ahp5-4 2´/6´ 130,8 6,99 dubl. (8,8) Ahp5-4 3´/5´ 115,8 6,78 dubl. (8,0) 4´ OH 9,37 sing. NCH3 30,5 2,75 sing. Val8-4,5, Val8-NH Val8 1 2 56,4 4,69 mult. 3 31,4 2,02 mult. 4 19,5 0,84 dubl. (6,6)) mTyr7-NCH3 5 17,6 0,71 dubl. (6,6) mTyr7-NCH3, Ahp5-OH NH 7,39 dubl. (9,6) mTyr7-NCH3, Ahp5-OH Korrelationen innerhalb des Spinsystems einer Aminosäure werden nicht aufgeführt.

Aus den NMR-Daten geht hervor, dass Cyanopeptolin 1060A das gleiche Ringgerüst wie

Hofmannolin besitzt. Insoweit wurde der Strukturvorschlag aus der Massenspektrometrie

bestätigt. Des Weiteren wurde die Strukturmodifikation in der Seitenkette aufgeklärt.

Während in Hofmannolin der N-Terminus der Seitenkette durch 2-Hydroxy-3-

methylisovaleriansäure acyliert ist, betseht der Acylrest im neu isolierten Cyanopeptolin aus

2-Hydroxy-isovaleriansäure. Die NMR-Ergebnisse stimmen mit der postulierten

Summenformel C53H69N7O16 und der errechneten Massen von 1.060 Da, bzw. der Masse des

base peak von m/z 1.082 ([M+Na]) vollständig überein, so dass die Struktur von

Cyanopeptolin 1060A bestätigt wurde.

Abb. 11: Struktur von Cyanopeptolin 1060A aus Scytonema hofmanni, Hiv: 2-Hydroxy-isovaleriansäure, MTyr: N-Methyl-Tyrosin, OMTyr: O-Methyl-Tyrosin, Ahp: 3-Amino-6-Hydroxy-2-Oxo-Piperidin

N

O

NH

OH

O

O

O

NH

O

NH

OH O

OOH

NH

OH

N

OO

NH O

OH

O

Tyr4

Ahp5

OMTyr6

NMTyr7Val8

Glu2

Hiv1 Thr3

Ergebnisse 49

3.1.3. Strukturaufklärung von Cyanopeptolin 1067A 3.1.3.1. Ultraviolett-Spektroskopie Cyanopeptolin 1067A wurde in Methanol gelöst und die Absorption im ultravioletten Bereich

(195 bis 400 nm) aufgezeichnet. Dabei wurde das Maximum bei 276 nm gemessen. Im

Bereich um 220nm wurde die durch die Peptidbindungen verursachte Absorption gemessen,

während bei 276 nm die im Molekül vorkommenden aromatischen Aminosäuren absorbieren.

3.1.3.2. Infrarotspektroskopie

Wie im Fall des Cyanopeptolins 1060A wurde das gereinigte Peptid in lyophilisierter Form

auf einen Diamantkristall aufgetragen und im Transmissionsmodus mit einem FTIR-

Spektrometer vermessen (Abb. 12). Die Transmission wurde bei Wellenzahlen von 4.000-680

cm-1 aufgezeichnet. Ebenfalls wie bei Cyanopeptolin 1060A sind Verunreinigungen auf den

Zusatz von TFA zum Fließmittelgemisch der HPLC-Läufe zurückzuführen.

Abb. 12: IR-Spektrum von Cyanopeptolin 1067A

Tabelle 12: Zordnung der Wellenzahlen Wellenzahl Interpretation Wellenzahl Interpretation

3282,06 (O-H / N-H) Valenzschwingungen 1383,34 symmetrische Deformationschwingung

2967,40 (C-H) Valenzschwingungen 1248,27

1646,82 Amid I (C=O-Valenzschwingung) 1181,68 Verunreinigung TFA

1534,32 1136,36 (C-O) Valenzschwingung

1515,18 Amid II (C=O-Valenzschwingung) 837,07 (C-H) Deformationsschwingung an 1,4-disubstituierten Aromaten


Im Vergleich zu Hofmannolin und Cyanopeptolin 1060A ergeben sich hier zunächst keine

nennenswerten Unterschiede bei der Zuordnung von charakteristischen Banden. Die für

1066

75012501750225027503250375020

30

40

50

60

70

80

90

100

3282,062967,40

1646,82

1534,32

1515,18

1443,151383,34

1248,27

1181,68

1070,37

722,09

cm-1

% T

rans

mis

sion

799,68

837,07919,08

Ergebnisse 50

Peptide typischen Valenzschwingungen sind im Bereich um 1.650 cm-1 und 3.300 Da zu

erkennen.

3.1.3.3. Massenspektrometrie Aus MALDI-TOF-Massenspektroskopie-Daten wurden Hinweise auf die Struktur von

Cyanopeptolin 1067A gewonnen. Der positive ion mode lieferte drei Signale. Der base peak

wurde bei m/z 1.067,60 [M+H] detektiert. Daneben wurden Signale bei 1.049,59 [M-H2O+H],

1.089,59 [M+Na] und 1.105,63 [M+K] beobachtet.


Das Fragmentspektrum wurde mit dem von Hofmannolin (Matern et al., 2003) verglichen, da

einige Signale aus den PSD-Spektrum identische Massen aufwiesen. Aus diesem Grund

wurde eine Strukturanalogie vermutet. Die Fragmentzuordnungen sind in Tabelle 13

angegeben. Zur Kontrolle wurde an einem FT-ICR-Massenspektrometer die gereinigte

Substanz (0,01 mg/ml in 70 % (v/v) MeOH, 0,1 % (v/v) HAc) erneut vermessen. Es wurde

eine monoisotopische Masse von 1067,5410 bestimmt. Der Fehler der Messung liegt bei 0,2

ppm (2,1 x 10-4 mmu). Es wurde eine Summenformel von C51H75N10O15 für die

monoisotopische Masse berechnet. Hieraus ergibt sich eine Massendifferenz von 7 Dalton zu

Hofmannolin. Diese 7 Dalton Unterschied entsprechen genau der Massendifferenz von

Tyrosin zu Arginin (siehe hierzu Abb. 13). Dieses galt es per NMR-Analysen zu überprüfen.

Des Weiteren bedurfte die Struktur der Seitenkette einer Überprüfung, da sie anhand der

Massenzahlen nicht eindeutig belegt werden konnte.

Tabelle 13: MALDI-TOF PSD-Fragmentzuordnung von Cyanopeptolin 1067A Sequenz Ion m/z Arg Ahp OMTyr NMTyr Val Thr Glu Hmv M+H 1067 Arg Ahp OMTyr NMTyr Val Thr Glu Hmv M-H2O+H 1049 Arg Ahp OMTyr NMTyr Val Thr M+H 824 Arg Ahp OMTyr NMTyr Val Thr M-H2O+H 806 Arg NMTyr Val Thr Glu Hmv M+H 777 NMTyr Val Thr Glu Hmv M+H 621 Arg Val Thr Glu Hmv M+H 600 Ahp OMTyr NMTyr Val M+H 568 Ahp OMTyr NMTyr M-H2O+H 450 Thr Glu Hmv M-H2O+H 327 Ahp OMTyr M-H2O+H 273 Ahp OMTyr M-CO- H2O+H 245 Val Thr M+H 200 NMTyr Immoniumion 150 Glu Seitenkette 102 Arg Immoniumion 112/100/87/70/59

Ergebnisse 51

3.1.3.4. Magnetische Kernresonanzspektroskopie

Die NMR-Messungen von Cyanopeptolin 1067A dokumentieren den Austausch einer

Aminosäure (siehe hierzu Abb.13). Es ergaben sich wenige Änderungen in den NMR-

Spektren im Vergleich zu Hofmannolin. Im Bereich von 6,5 bis 7,5 ppm fehlen die Signale,

welche bei Hofmannolin von Tyrosin hervorgerufen werden (Tabelle 14). Die Signale, welche

vom Peptidrückgrad gebildet werden unterscheiden sich kaum, da sich hier keine Änderungen

durch den Wechsel der Aminosäure bemerkbar machen. Man erhält allerdings eine

zusätzliche Signalgruppe, welche durch die sekundäre Amingruppe in der Seitenkette des

Arginins verursacht wird (7,73 ppm). Zusätzliche Signale erhält man durch zwei weitere

Methylengruppen (Arg4-C4/5) in Arginin (1,43 und 3,06ppm). Die NOE-Korellationen sind

mit denen von Tyrosin vergleichbar, Unterschiede ergeben sich nur innerhalb des

Spinsystems von Arginin. Die zur Seitenkette zugehörigen Signale von 2-Hydroxy-3-

methylvaleriansäure sind mit denen aus Hofmannolin kongruent (HSQC-Korrelationen, wie

H-NMR-Daten). Damit stimmen die Ergebnisse aus der NMR-Analytik mit dem

Strukturvorschlag aus der Massenspektrometrie überein, so dass die vorgeschlagene Struktur

(Abb. 13) von Cyanopeptolin 1067 A bestätigt wurde.

Abb.13: Struktur von Cyanopeptolin 1067A aus Scytonema hofmanni, Hmv: 2-Hydroxy-3-methylvaleriansäure, MTyr: N-Methyl-Tyrosin, OMTyr: O-Methyl-Tyrosin, Ahp: 3-Amino-6-Hydroxy-2-Oxo-Piperidin

N

O

NHO

O

O

NH

O

NH

OH O

OOH

NH

OH

N

OO

NH O

OH

ONH

NH

NH2

Thr3

Glu2

Hmv1

Val8

NMTyr7

Ahp5Arg4

OMTyr6

Ergebnisse 52

Abb. 14: H-NMR-Spektrum von Cyanopeptolin 1067A:



Hmv1 1 2 75,4 3,80 dubl. (4,4) Glu2-NH 3 38,7 1,72 mult. Glu2-NH 4 23,9 1,38 mult., 1,12 mult. Glu2-NH 5 12,0 0,80 trip. (8,0) 6 15,9 0,88 Glu2-NH 2-OH 5,58 breit Glu2 1 2 52,1 4,55 mult. Thr3-NH, 3 28,6 1,98/1,88 2x mult. 4 30,4 2,26 trip. (8,0) 5 5-OH 2-NH 174,0 7,91 dubl. (8,7) Hmv1-2/3/4/6, Thr3-NH Thr3 1 2 55,3 4,61 dubl. (9,5) 3 72,4 5,45 quadr. (6,5) Arg4-NH, Ahp5-NH 4 18,3 1,17 dubl. (6,6) 2-NH 172,7 8,12 dubl. (8,8) Glu2-2, Glu2-NH Arg4 1 2 52,1 4,22 mult. Ahp5-NH 3 27,8 1,91 mult., 1,43 mult. 4 25,5 1,43 mult. Thr3-3 5 40,7 3,06 6(NH) 7,73 trip. (5,2) 7 NH, NH2 2-NH 169,5 8,57 dubl. (8,8) Thr3-3; Ahp5-NH Ahp5 1 2 49,1 3,71 mult. 3 22,0 2,41/1,62 2x mult. 4 29,7 1,72/1,60 2x mult. 5 74,3 5,06 sing. Tyr6-3, Tyr6-2´/6´ 5-OH 6,03 sing. 2-NH 170,3 7,16 dubl. (9,6) Arg4-2, Thr3-3, Arg4-NH Tyr6 1 2 51,0 4,70 mult. mTyr7-2, mTyr7-NCH3 3 34,8 2,79/1,75 2x mult. Ahp5-5

Ergebnisse 53

1´ 2´/6´ 131,0 6,74 sing. Ahp5-5 3´/5´ 113,8 6,74 sing. 4´ OCH3 55,3 3,70 sing. mTyr7 1 2 61,3 4,91 dubl. (11,7) Tyr6-2, Val8-NH 3 33,4 3,10/2,71 2x mult. 2´/6´ 131,0 6,99 dubl. (8,0) 3´/5´ 115,5 6,79 dubl. (8,1) 4´ 4´-OH 9,45 sing. NCH3 30,8 2,75 sing. Val8-NH, Tyr6-2, Val8-4 Val8 1 2 56,3 4,73 mult. 3 31,2 2,07 mult. 4 19,7 0,86 dubl. (7,3) mTyr7-NCH3 5 17,8 0,73 dubl. (6,6) 2-NH 169,5 7,45 dubl. (9,5) mTyr7-NCH3, mTyr7-2 Korrelationen innerhalb des Spinsystems einer Aminosäure werden nicht aufgeführt.

3.1.4. Strukturaufklärung von Cyanopeptolin 946A 3.1.4.1. Ultraviolett-Spektroskopie Mit Cyanopeptolin 946A wurde ein weiteres bisher unbekanntes Cyanopeptolin aus

Scytonema hofmanni PCC 7110 isoliert. Während der HPLC-Auftrennung zeigte

Cyanopeptolin 946A das für Cyanopeptoline typische UV-Absorptionspektrum. Die Maxima

(202 nm sowie 276nm) wurden aus den Datensätzen der HPLC-Auftrennung übernommen.

Absorption bei 220 nm weist auf Peptidbindung, 276 nm lässt aromatische Aminosäuren

vermuten.

3.1.4.2. Massenspektrometrie Erste Hinweise auf die Struktur von Cyanopeptolin 946A lieferten MALDI-TOF-

Massenspektroskopie-Daten. Hierzu wurde die Probe wiederum im positive ion mode

analysiert. Es wurden drei Signale detektiert. Der base peak wurde bei m/z 969,40 [M+Na]

detektiert. Daneben wurden Signale bei 951,39 [M-H2O+Na] und 929,39 [M-H2O+H]

beobachtet.


Das Fragmentspektrum wurde mit denen der Scyptoline (Matern et al., 2001) verglichen, da

einige Signale aus den PSD-Spektrum identische Massen aufwiesen. Aus diesem Grund

wurde eine Strukturanalogie vermutet. Die Fragmentzuordnungen sind in Tabelle 15

angegeben. Zur Kontrolle wurde an einem FT-ICR-Massenspektrometer die gereinigte

Substanz (0,01 mg/ml in 70 % (v/v) MeOH, 0,1 % (v/v) HAc) erneut vermessen. Es wurde

Ergebnisse 54

eine monoisotopische Masse von 947,5084 [M+H] bestimmt. Der Fehler der Messung liegt

bei 0,6 ppm (5,7 x 10-4 mmu). Es wurde eine Summenformel von C45H71N8O14 für die

monoisotopische Masse berechnet. Hieraus ergibt sich eine Massendifferenz von 35 Dalton zu

Scyptolin A. Diese 35 Dalton Unterschied könnten der Massendifferenz von chloriertem

Tyrosin zu nicht chloriertem Tyrosin entsprechen. Die Zuordnung der Fragmentspektren

ermöglichte die Lokalisierung der Strukturmodifikation am N-methylierten Tyrosin. Als

weiteres Indiz fehlt in den Fragmentspektren die Massenzahl für das Immoniumion des

chlorierten und N-methylierten Tyrosins. Somit konnte ein vollständiger Strukturvorschlag

vorgelegt werden (siehe hierzu Abb. 16), welchen es durch NMR-Messungen zu bestätigen

galt.

Tabelle 15: MALDI-TOF PSD-Fragmentzuordnung von Cyanopeptolin 946A Sequenz Ion m/z Leu Ahp Thr NMTyr Val Thr Thr Ala-But M-H2O+H 929 Leu Ahp Thr NMTyr Thr Thr Ala-But M-H2O+H 830 Leu Ahp Thr NMTyr Val Thr Thr M-H2O+H 787 Leu Ahp Thr NMTyr Val Thr M-H2O+H 687 Leu Ahp Thr NMTyr Val M+H 604 Leu Ahp Thr NMTyr Val M-H2O+H 586 Leu Ahp Thr NMTyr M+H 505 Leu Ahp Thr NMTyr M-H2O+H 487 Ahp Thr NMTyr Val M+H 491 Ahp Thr NMTyr Val M-H2O+H 473 Leu Thr Thr Ala-But M+H 457 Leu Thr Thr Ala-But M-H2O+H 439 Ahp Thr NMTyr M+H 393 Ahp Thr NMTyr M-H2O+H 374 Thr Thr Ala-But M+H 344 Thr Thr Ala-But M-H2O+H 326 Leu Ahp Thr M-CO-H2O+H 282 Thr Thr Ala-But M+H 243 Leu Ahp M-H2O+H 209 Ahp Thr M-H2O+H 197 Ahp Thr M-CO-H2O+H 169 NMTyr Immoniumion 150 Ahp M+H 114 Leu M+H 114 Ahp Immoniumion 86 Leu Immoniumion 86 Thr Immoniumion 74 Val Immoniumion 72 Ala Immoniumion 44

Ergebnisse 55

3.1.4.3. Magnetische Kernresonanzspektroskopie Die Integration des 1H-NMR Spektrums von Cyanopeptolin 946A lässt 70 Protonen

vermuten, welche in einem Bereich bis 11 ppm Resonanzsignale verursachten. Zusammen mit

den Daten aus HSQC-Messungen ließen sich 34 verschiedene C-H-Korrelationen bestehend

aus 10 Methyl-, 6-Methylen- und 18 Methingruppen unterscheiden. Neben diesen an

Kohlenstoffatome gebundenen Protonen gibt es weitere 10 Protonen, welche Resonanzsignale

verursachen. Eine Zuordnung zu 6 NH-Gruppen, einer phenolischen und drei alkoholischen

Funktionen konnte getroffen werden. Bei den Methylgruppen konnte man eine Unterteilung

anhand der Nachbarstrukturen vornehmen. Dabei handelt es sich um eine primäre

(Aufspaltung des Signals zum Triplett), acht sekundäre (Dubletts) und eine N-Methyl-Gruppe

(Singulett). Die chemischen Verschiebungen im 1H- und HSQC-Spektrum belegen, dass alle

sechs Methylengruppen an Kohlenstoff gebunden vorliegen. Bezüglich der Methingruppen

ließ sich die Aussage treffen, dass vier an Sauerstoff und acht an Stickstoff gebunden sind.

Die restlichen Methingruppen verteilen sich auf vier aromatische und zwei aliphatische

Gruppen. Bei der aromatischen Aminosäure ergeben sich durch para-Substitution für die 4

Protonen jeweils zwei chemisch äquivalente Protonenpaare. Es handelt sich um ein AA`BB`-

Spinsystem. Die Signale werden durch die Nachbarschaft eines weiteren Protons in Dubletts

aufgespaltet. Aus den Spinsystemen der TOCSY-Experimente und den 13C-Korrelationen in

den HSQC-Spektren konnten N-acyliertes Alanin, Leucin, Valin und Threonin Reste neben

O-acyliertem Threonin, N-alkyliertem Threonin und N-alkyliertem Tyrosin bestimmt werden

(siehe hierzu Abb. 16).

In Übereinstimmung mit Hauptstrukturmerkmalen für Cyanopeptoline lag das Ahp-

Ringsystem vor. Die NOE-Korrelationen dieser Teilstruktur entsprachen der Konfiguration

früherer Publikationen (Weckesser et al., 1996). Weitere Übereinstimmung zu bekannten

Cyanopeptolinen konnte durch α-α-NOE-Korrelationen bei der cis-Konfiguration der

Amidbindung zwischen Thr7 und N-Methyl-Tyrosin nachgewiesen werden, während die

restlichen Amidbindungen trans-konfiguriert vorliegen. HMBC-Messungen belegten die

Esterbrückenbildung von Val9 zu Thr4 entsprechend beobachtet von Matern et al. (2001 und

2003). Die Seitenkette mit der Butyryl-Gruppe ergab ein Spinsystem entsprechend einer

Propyleinheit. Die aus den NMR-Messungen gewonnenen Strukturdaten stimmen mit dem

aus den MALDI-TOF-Ergebnissen gewonnenen Strukturvorschlag vollständig überein. Somit

ergeben sich für Cyanopeptolin 946A ein Molekulargewicht von 946 Da und eine

Summenformel von C45H70N8O14.

Ergebnisse 56

Abb. 15: NMR-Spektrum von Cyanopeptolin 946A



But1 1 2 37,5 2,10 trip. (7,3) Ala2-NH 3 19,0 1,52 mult. 4 14,0 0,86 trip. (8,0) Ala2 1 2 48,5 4,41 mult. Thr3-NH 3 18,5 1,25 dubl. (8,1) NH 8,02 dubl. (7,3) Thr3-NH, But1-2 Thr3 1 2 58,0 4,38 mult. Thr4-NH 3 67,0 4,03 mult. Thr4-2 4 19,5 1,04 dubl. (6,6) NH 7,80 dubl. (8,0) Thr4-NH, Ala2-2 OH 4,93 dubl. (4,4) Thr4 1 2 55,3 4,67 dubl. (9,5) Leu9-NH, Thr3-3 3 5,51 mult. 4 18,5 1,23 dubl. (6,6) NH 7,68 dubl. (8,1) Thr3-NH, Thr3-2 Leu5 1 2 51,5 4,29 mult. Ahp6-NH 3 39,7 1,84 / 1,40 2x mult. 4 24,8 1,52 mult. 5 23,8 0,89 6 21,5 0,77 dubl. (7,3) NH 8,48 dubl. (8,0) Ahp6-NH, Thr4-2 Ahp6 1 2 49,5 4,45 mult. 3 22,0 2,57 / 1,73 2x mult. 4 29,5 1,95 / 1,69 2x mult. 5 75,3 5,08 sing. NH 7,36 dubl. (9,6) Leu5-NH, Leu5-2 OH 6,02 dubl. (2,2) Val9-NH Thr7 1 2 55,5 4,41 mult. 3 65,0 3,60 mult. NM-Tyr8-2

9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5Chemical Shif t (ppm)

9.24

(8-M

eTyr

10)

8.48

(5-L

eu1)

8.02

(2-A

la1)

7.80

(3-T

hr1)

7.70

(4-T

hr1)

7.68

(9-V

al1)

7.36

(6-A

hp1)

6.99

(8-M

eTyr

5,8-

Me

6.66

(8-M

eTyr

6,8-

Me

6.02

(6-A

hp6)

5.51

(4-T

hr3)

5.08

(6-A

hp5)

4.99

(8-M

eTyr

2)4.

93(3

-Thr

5)4.

67(4

-Thr

2)4.

64(9

-Val

2)4.

47(7

-Thr

5)4.

45(6

-Ahp

2)4.

41(2

-Ala

2)4.

38(3

-Thr

2)4.

29(5

-Leu

2)4.

03(3

-Thr

3)

3.60

(7-T

hr3)

3.15

(8-M

eTyr

3)

2.71

(8-M

eTyr

12)

2.69

(8-M

eTyr

3)2.

57(6

-Ahp

3)

2.10

(1-B

ut3)

2.06

(9-V

al3)

1.95

(6-A

hp4)

1.84

(5-L

eu3)

1.73

(6-A

hp3)

1.69

(6-A

hp4)

1.52

(5-L

eu4,

1-B

ut2)

1.40

(5-L

eu3)

1.25

(2-A

la3)

1.23

(4-T

hr4)

1.04

(3-T

hr4)

0.89

(5-L

eu5)

0.87

(9-V

al4)

0.86

(1-B

ut1)

0.77

(5-L

eu6)

0.76

(9-V

al5)

0.27

(7-T

hr4)

Ergebnisse 57

4 19,8 0,27 dubl. (5,9) OH 4,47 dubl. (4,4) NM-Tyr8 1 2 61,0 4,99 mult. Val9-NH Thr7-2 3 33,5 3,15 / 2,69 2x mult. 2´/6´ 132,0 6,99 dubl. (8,8) 3´/5´ 116,0 6,66 dubl. (8,1) 4´-OH 9,24 sing. NCH3 30,3 2,71 sing. Val9-NH Val9 1 2 56,5 4,64 mult. 3 31,0 2,06 mult. 4 19,8 0,87 mult. 5 18,0 0,76 dubl. (7,4) NH 7,68 dubl. (8,0) Ahp6-OH, NM-Tyr8-2 / -NCH3 Korrelationen innerhalb des Spinsystems einer Aminosäure werden nicht aufgeführt.

Abb. 16: Strukturvorschlag zu Cyanopeptolin 946A aus Scytonema hofmanni, But: Butyryl, NMTyr: N-Methyl-Tyrosin, Ahp: 3-Amino-6-Hydroxy-2-Oxo-Piperidin

Cyanopeptolin 946A hat die typischen Merkmale eines Cyanopeptolins, wie Ahp-Gruppe,

Lactonblidung über Threonin, 19-gliedrige Ringstruktur. Die Struktur unterscheidet sich von

der von Scyptolin A (Matern et al., 2001) durch Fehlen der Chlorierung an N-Methyltyrosin.

3.1.5. Strukturaufklärung von Scytocyclamid A 3.1.5.1. Ultraviolett-Spektroskopie Während der HPLC-Auftrennung wurde für Scytocyclamide A ein für cyanobakterielle

Peptide aus Scytonema hofmanni untypisches UV-Spektrum gemessen. Es waren keine

Maxima in dem für Peptide typischen Spektralbereich von 200 bis 300 nm sichtbar. Im

Bereich um 220 nm verursachen die Peptidbindungen im Molekül Absorption, im Bereich um

280 nm typischerweise aromatische Strukturelemente. Scytocyclamid A wies eine von 200 bis

250 nm sinkende Absorption auf. Bei 220 nm war kein Maximum messbar, jedoch wurde

N

O

NHO

O

O

NH

O

NH

ONH

OH

N

OO

NH O

OHOH

OH

NH

OBut1 Ala2 Thr3

Leu5 Ahp6

Thr7

Val9

NMTyr8

Thr4

Ergebnisse 58

deutliche Absorption festgestellt. Im aromatischen Absorptionsbereich war keine deutliche

Absorption zu beobachten.

Abb. 17: UV-Absorptionsspektrum von Scytocyclamid A

3.1.5.2. Infrarotspektroskopie Isoliertes Scytocyclamid A wurde wie die übrigen Peptide im FTIR-spektrometrisch

vermessen (4.000-680 cm-1). Es lassen sich für Peptide typische Resonanzbanden der C=O-,

OH-, und NH-Valenzschwingungen erkennen (Abb. 18).

Abb. 18: IR-Spektrum von Scytocyclamid A Tabelle 17: Zuordnung der Wellenzahlen Wellenzahl Interpretation Wellenzahl Interpretation




1645,45 Amid I (C=O-Valenzschwingung) 1177,34 Verunreinigung TFA

1512,28 Amid II (C=O-Valenzschwingung) 1135,00 (C-O) Valenzschwingung


Scytocyclamid A

80013001800230028003300380060

70

80

90

100

3291,002960,132932,21

1645,45

1512,28

1450,58

1386,331252,83

1201,581177,341135,00

836,11799,85

720,08

698,90

cm-1

% T

rans

mis

sion

Ergebnisse 59

3.1.5.3. Massenspektrometrie Teil I Scytocyclamid A wurde mittels MALDI-TOF-Massenspektroskopie analysiert. Im positive

ion mode wurden drei Signale detektiert. Der base peak wurde bei m/z 1.245,83 [M+Na]

detektiert. Daneben wurden Signale bei 1.223,83 [M+H] und 1.261,81 [M+K] beobachtet.

Anhand der post source decay (PSD)-Spektren wurden Strukturhinweise gesucht. So wie das

unbekannte UV-Spektrum zeigten auch die PSD-Spektren keine Ähnlichkeit zu bereits

isolierten Peptiden aus Scytonema hofmanni. Die Fragmentspektren zeigten jedoch für

Aminosäuren typische Massenzahlen, so dass man von einer Peptidstruktur ausgehen konnte

(siehe hierzu Abb. 24). Ausgehend vom Molekulargewicht von 1.223 Da für das

monoisotopische Signal [M+H] wurde eine Struktur mit 11 bis 12 Aminosäuren erwartet. Aus

dem PSD-Spektrum wurden Leucin, bzw. Isoleucin, Phenylalanin und Glycin als Bausteine

über die Fragmentmasse ihrer Immoniumionen abgeleitet. Weitere Fragmente konnten zuerst

nicht zugeordnet werden. Es wurden NMR-Untersuchungen vorgenommen um weitere

Strukturelemente zu identifizieren.

3.1.5.4. Magnetische Kernresonanzspektroskopie Umfangreiche NMR-Analysen (1H-NMR-, COSY-, ROESY-, HSQC-Messungen) in

DMSO-d6 ergaben eine Summenformel von C61H98N12O14 und ließen eine Zusammensetzung

aus 11 bis 12 Aminosäuren vermuten. Es wurden die folgenden Aminosäuren bestimmt: 2

Leucine, 2 Isoleucine, Homoserin, Glutamin, Phenylalanin, Glycin, 4-Hydroxyprolin,

Dehydrobutyrin sowie 3-Aminooctansäure. Die Sequenz der Aminosäuren wurde durch NOE-

Korrelationen aus dem ROESY-Spektrum bestimmt. Dabei wurden Sequenz-NOE-Effekte

zwischen den α-Protonen einer Aminosäure-Einheit und dem NH-Proton der nachfolgenden

Aminosäure beobachtet: zwischen 2-H von Homoserin und NH von Phenylalanin, 2-H von

Isoleucin8 und NH von Isoleucin9, von 2-H von Isoleucin9 und NH von Leucin10, zwischen

2-H von Leucin10 und NH von Gly11 sowie von 2-H von Gly11 und NH von Aoc1. Die

letztgenannte Korrelation spiegelt den Ringschluss wieder. Des Weiteren konnten NOE-

Korrelationen zwischen NH-Protonen benachbarter Aminosäuren beobachtet werden: Aoc1 zu

Gly11und Phe6 zu Leu7. Dehydrobutyrin besitzt kein α-Proton, jedoch konnte eine Kopplung

der Protonen der Methylgruppe zum α-Proton des Hydroxyprolins zugeordnet werden. Für

den Dehydrobutyryl-Rest kann aus starken NOEs zwischen dem NH und dem 3-H der Dhb-

Einheit die E-Konfiguration abgeleitet werden. Anhand der Auswertungen wurde die Struktur

cyclo-(βAoc-Gln-E-Dhb-Hyp-Hse-Phe-Leu-Ile-Ile-Leu-Gly) vorgeschlagen (siehe hierzu

Abb. 24).

Ergebnisse 60

Abb. 19: NMR-Spektrum Scytocyclamid A

Tabelle 18: NMR-Spektroskopie und Teilstrukturen von Scytocyclamid A Aminosäure Position δ 13C


Aoc1 1 2 44,2 4,28 mult. 3 39,2 1,90 / 1,60 4 34,8 1,36 / 1,26 5 30,7 1,23 6 28,7 1,23 7 22,0 1,23 8 14,3 0,85 3-NH 6,81 dubl. (4,4) Gly11-NH, Gly11-2, Leu10-2 Gln2 1 2 51,4 4,35 mult. 3 26,7 1,88 / 1,75 4 30,7 2,14 mult 5 5-NH2 7,51 / 6,80 2-NH 7,00 Dhb3 1 2 3 5,62 quart. (7,4) 4 12,0 1,72 dubl. Hyp4-2 2-NH 10,94 sing. Hyp4 1 2 59,0 4,52 dubl. v. dubl. (9,9 / 8,5) Dhb3-4, Phe6-2´/6´ 3 37,7 2,29 / 1,87 mult. 4 68,9 4,30 mult. 5 57,2 3,55 / 3,35 dubl. v. dubl (11,0 / 6,6) 4-OH 5,22 dubl. (3,0) Hse5 1 2 46,3 4,30 mult. Phe6-NH 3 33,7 1,97 / 1,93 4 56,5 3,44 / 3,23 mult. 5-OH 4,35 mult. 2-NH 7,10 Phe6 1 2 56,5 4,25 mult. 3 36,8 3,06 / 2,94 dubl. v. dubl. 1´ 2´/6´ 7,36 dubl. (7,7) Hyp4-2

11.0 10.5 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5Chemical Shif t (ppm)

10.9

4(3-

Dha

1)

8.89

(11-

Gly1

)

8.45

(10-

Leu1

)8.

39(9

-Ile1

)

7.83

(6-P

he1)

7.51

(2-G

ln6)

7.36

(6-P

he5,

6-Ph

e9)

7.25

(6-P

he6,

6-Ph

e8)

7.19

(6-P

he7)

7.11

(7-L

eu1)

7.10

(5-H

se1)

7.00

(2-G

ln1)

6.81

(1-O

ct1)

6.80

(2-G

ln6)

6.42

(8-Il

e1)

5.62

(3-D

ha3)

5.22

(4-H

yp6)

4.68

(8-Il

e2,9

-Ile2

)4.

52(4

-Hyp

2)4.

35(2

-Gln

2,5-

Hse

5)4.

30(4

-Hyp

4,5-

Hse

2)4.

25(1

-Oct

2,6-

Phe2

)4.

23(7

-Leu

2)4.

00(1

0-Le

u2)

3.82

(11-

Gly2

)3.

55(4

-Hyp

5)3.

44(5

-Hse

4)3.

41(1

1-G

ly2)

3.23

(5-H

se4,

11-G

ly2)

3.06

(6-P

he3)

2.94

(6-P

he3)

2.49

2.29

(4-H

yp3)

2.14

(2-G

ln4)

1.90

(1-O

ct3)

1.87

(4-H

yp3)

1.72

(3-D

ha4)

1.60

(1-O

ct3)

1.36

(1-O

ct4)

1.32

(10-

Leu3

)1.

26(7

-Leu

3,1-

Oct

4)1.

23(1

-Oct

5,1-

Oct

6,1-

Oct

7)0.

90(1

0-Le

u5)

0.85

(1-O

ct8)

0.83

(10-

Leu6

)0.

77(9

-Ile6

,7-L

eu5)

0.73

(9-Il

e5)

0.70

(7-L

eu6)

Ergebnisse 61

3´/5´ 7,25 trip. (7,7) 4´ 7,19 trip. (7,4) 2-NH 7,83 dubl. (7,7) Leu7-NH, Hse2-2 Leu7 1 2 51,6 4,23 mult. 3 38,8 1,24 / 1,05 4 24,0 1,54 5 22,8 0,77 6 20,0 0,70 2-NH 7,11 Phe6-NH Ile8 1 2 55,7 4,68 dubl. (3,3) Ile9-NH 3 39,2 1,85 4 21,7 1,09 mult. 5 14,3 0,79 6 11,0 0,83 2-NH 6,42 breites sing. Ile9 1 2 53,0 4,68 dubl. (3,3) Leu10-4, Leu10-NH 3 37,0 2,05 4 26,0 1,18 / 1,10 mult. 5 15,3 0,73 6 11,5 0,77 2-NH 8,39 dubl (9,6) Ile8-2 Leu10 1 2 52,8 4,00 mult. Gly11-NH, Aoc1-NH 3 38,9 1,52 / 1,32 4 24,0 1,54 Ile9-2 5 22,5 0,90 dubl. 6 21,3 0,83 2-NH 8,45 dubl. (4,0) Ile9-2 Gly11 1 2 42,2 3,82 / 3,23 dubl. v. dubl. Aoc1-NH 2-NH 8,89 Aoc1-NH, Leu10-2 Korrelationen innerhalb des Spinsystems einer Aminosäure werden nicht aufgeführt.

Abb. 20: Ausschnitt aus COSY-Spektrum von Scytocyclamid A

Ergebnisse 62

Abb. 21: Ausschnitt aus TOCSY-Spektrum von Scytocyclamid A. Aus den gezeigten Ausschnitten der COSY- und TOCSY-Spektren ließ sich die β-Stellung der Aminogruppe der Amino-Octansäure bestimmen.

Konfiguration von Hydroxyprolin in Scytocyclamid A

Starke NOE-Effekte werden zwischen 2-H und 3-H und zwischen 3-H`und 4-H beobachtet.

Anhand dieser NOE-Effekte lässt sich die Aussage treffen, dass das Hydroxyprolin-alpha

Proton auf die gleiche Seite schaut, wie das gamma-OH. Hieraus ergibt sich das trans-

Diastereomere, trans-4-Hydroxyprolin in der (2S 4R)-Konfiguration (Abb. 22).

Abb. 22: NOE-Korrelationen am Hydroxyprolin (s=strong, m=medium, w=weak)

3.1.5.5. Massenspektrometrie Teil II Anhand der Struktur aus den NMR-Daten wurde die vorgeschlagene Sequenz durch

Zuordnungen der Fragmentmassen aus der MALDI-TOF-Analyse von Scytocyclamid A

bestätigt. Aus den Zuordnungen der Massenzahlen in Tabelle 18 lassen sich unter anderem

Ergebnisse 63

die jeweils zueinander passenden Bruchstücke finden. Beispielhaft seien die Fragmente

[M+H] 353 und [M+H] 871 angeführt, die zusammengenommen die Masse des ganzen

Peptids von [M+H] 1.223 ergeben. Durch Überlappung von Bruchstücken konnte die Sequenz

lückenlos verfolgt werden (siehe hierzu Abb. 24).

Tabelle 18: Fragmentzuordnungen von Scytocyclamid A Sequenz Ion m/z HyPro HSer Phe Leu Ile Ile Leu Gly Aoc Gln Dhb M+H 1223 HSer Phe Leu Ile Ile Leu Gly Aoc Gln Dhb M+H 1110 Phe Leu Ile Ile Leu Gly Aoc Gln Dhb M+H 1008 Leu Ile Ile Leu Gly Aoc Gln Dhb M-CO+H 835 Ile Ile Leu Gly Aoc Gln Dhb M+H 749 Ile Leu Gly Aoc Gln Dhb M+H 636 Leu Gly Aoc Gln Dhb M+H 523 Gly Aoc Gln Dhb M+H 410 Aoc Gln Dhb M+H 353 Gln Dhb M+H 212 Dhb M+H 84 HyPro HSer Phe Leu Ile Ile Leu Gly Aoc Gln Dhb M+H 1223 HyPro HSer Phe Leu Ile Ile Leu Gly M+H 871 HyPro HSer Phe Leu Ile Ile Leu M+H 814 HyPro HSer Phe Leu Ile Ile M+H 701 HyPro HSer Phe Leu Ile M+H 588 HyPro HSer Phe Leu M+H 475 HyPro HSer Phe M+H 362 HyPro HSer M+H 215 HyPro M-CO+H 86 HSer Phe Leu Ile Ile Leu Gly Aoc Gln M+H 1027 HyPro HSer Phe Leu Ile Ile Leu Gly Dhb M-CO+H 926 Phe Leu Ile Ile Leu Gly Aoc Gln M+H 926 HyPro HSer Phe Leu Ile Ile Leu Dhb M+H 897 HyPro HSer Phe Leu Gly Aoc Gln Dhb M+H 884 HyPro HSer Phe Leu Ile Ile Dhb M+H 784 HSer Phe Leu Ile Ile Leu M+H 701 HSer Phe Leu Ile Ile M+H 588 HyPro HSer Phe Leu Ile Ile Leu Gly Aoc Gln Dhb M+H 588 HyPro Gly Aoc Gln Dhb M+H 523 Phe Leu Ile Ile M+H 487 HSer Phe Leu Ile M+H 475 HSer Phe Leu Ile M-CO+H 447 HyPro HSer Phe Dhb M+H 445 Leu Gly Aoc Gln M+H 440 HSer Phe Leu M+H 362 Leu Ile Ile M+H 340 Gly Aoc Gln M+H 327 Gly Aoc Gln M-CO+H 299 Leu Gly Aoc M+H 312 Phe Leu M+H 261 Leu Ile M+H 227 Gly Aoc M+H 199 HyPro Dhb M+H 187 Phe Immoniumion 120 Gln Immoniumion 101 Leu Immoniumion 86 Ile Immoniumion 86 HyPro Immoniumion 86 HSer Immoniumion 74 Gly Immoniumion 30

Ergebnisse 64

3.1.5.6. Bestimmung der Aminosäurekonfiguration Die Bestimmung der Konfigurationen von Dehydrobutyrin, sowie von 4-trans-Hydroxy-

prolin erfolgte anhand der NOE-Effekte aus den NMR-Studien. Durch Gaschromatographie

wurden weitere Aminosäuren über Vergleiche der Retentionszeiten (Rt) mit denen der

Aminosäurestandards bestimmt (Abb. 23 und Tabelle 19).

Tabelle 19: Zuordnung der Retentionszeiten und Bestimmung der Aminosäure Referenzaminosäure (Retentionszeit) Identifizierte Aminosäure Glycin (6,80 min) Glycin D-Isoleucin D-allo-Isoleucin (7,85 min) Vorhanden, können anhand Rt nicht unterschieden werden!

L-Isoleucin (8,14 min) L-Isoleucin L-allo-Isoleucin (7,96 min) D-Leucin (8,71 min) D-Leucin L-Leucin (8,92) L-Leucin D-Homoserin (11,28 min) L-Homoserin (11,39 min) L-Homoserin (2S, 4R) Hydroxyprolin (11,85 min) (2S, 4R) Hydroxyprolin (2S, 4S) Hydroxyprolin (13,21 min) (2R, 4S) Hydroxyprolin kein Standard erhältlich (2R, 4R) Hydroxyprolin (13,28 min) D-Glutaminsäure (13,64 min) L-Glutaminsäure (13,72 min) L-Glutaminsäure D-Phenylalanin (14,81 min) D-Phenylalanin L-Phenylalanin (14,87 min)

Abb. 23: A) Ausschnitt GC-Chromatogramm der Hydrolyseprodukte von Scytocyclamid A B) Massenspektrum von L-Glutaminsäure aus GC-MS-Analyse L-Glutaminsäure ist in Scytocyclamid A nicht vorhanden. Bedingt durch die sauer

katalysierte Derivatisierung werden Säureamide wie Glutamin oder Asparagin zur jeweiligen

Säure hydrolysiert. Da aus den NMR-Daten ein Vorhandensein der jeweiligen Säure

ausgeschlossen wurde, konnte die L-Konfiguration zugeordnet werden.

A: GC-MS ChromatogrammHydrolyseprodukte Scytocyclamid A

6 8 10 12 14 16-5.0×10 -4

1.5×10 5

3.5×10 5

5.5×10 5

7.5×10 5

9.5×10 5 Gly6,80

D-Ile oder D-allo-Ile7,85

L-Ile8,14

D-Leu8,70

L-Leu8,92

L-Hse11,41

2S4RHyp11,87 L-Glu

13,76

D-Phe14,81

Zeit [min]

Inte

nsitä

t

B: L-Glu Spektrum bei Rt 13,76 min

0 50 100 150 200 250 3000

2.0×10 5

4.0×10 5

6.0×10 5

8.0×10 5

1.0×10 6

69,0

152,1

180,1212,2

m / z

Inte

nsitä

t

Ergebnisse 65

D-Isoleucin und D-allo-Isoleucin wiesen die gleiche Retentionszeit auf, weshalb eine

Zuordnung nicht getroffen wurde. Um dieses Problem zu lösen, wurde versucht die

Konfiguration dieser beiden Aminosäuren über eine Aminosäurebestimmung nach Marfey zu

lösen (Marfey et al., 1984). Die Proben wurden dazu nach Derivatisierung mittels HPLC-

Messungen untersucht. Dies führte nicht zum Erfolg, so dass eine Zuordnung nicht getroffen

werden konnte. Aminooctansäure konnte mangels Referenzsubstanz nicht aufgeklärt werden.

Ebenso wenig war ein Standard für (2R, 4R) Hydroxyprolin zu bekommen, jedoch konnte die

Konfiguration über die NOE-Daten bestimmt werden (Abb. 22). Die restlichen Aminosäuren

wurden jeweils passenden Referenzsubstanzen zugeschrieben. Die genaue Position der

Diastereomeren Aminosäuren D- und L-Leucin, sowie der Isoleucine im Ringgerüst konnte

nur anhand der Vergleiche mit den Strukturanaloga aus Hormothamnion sp. und Lyngbya sp.

postuliert werden.

Abb. 24: Struktur von Scytocyclamid A

3.1.6. Strukturaufklärung von Scytocyclamid B 3.1.6.1. Ultraviolett-Spektroskopie Während der HPLC-Auftrennung zeigte Scytocyclamide B, ebenso wie Scytocyclamid A, ein

für die bisher aus Scytonema hofmanni isolierten Peptide untypisches UV-Spektrum. Im

Vergleich zu Scytocyclamid A nahm die Absorption im Bereich zwischen 200 und 250 nm

stärker ab und die Absorption hatte einen kurvenartigen Verlauf, während die Abnahme der

NH

ONH

NH

NH

O

OO

O

NOH

O

O

NH2

NH

ONH

ONH

ONH O

NHNH

O

OH

Aoc1

Gln2

Dhb3

Hyp4

Hse5Phe6

Leu7

Ile8

Ile9

Leu10 Gly11

Ergebnisse 66

Absorption bei Scytocyclamid A in diesem Bereich eher linear abnahm. Eine für aromatische

Aminosäuren typische Absorption um 280 nm wurde nicht beobachtet.

Abb. 25: UV-Spektrum von Scytocyclamid B.

3.1.6.2. Infrarotspektroskopie Nähere Informationen über Funktionalitäten von Scytocyclamid B wurden durch

Infrarotspektroskopie (4.000-680 cm-1) aufgezeichnet. Rückstände von Trifluoressigsäure

konnten zugeordnet werden. Aus den Zuordnungen der Wellenzahlen (Tabelle 20) ließ sich

auf das Vorhandensein von Amidbindungen schließen. Weitere charakteristische

Absorptionsbanden im hohen Wellenzahlbereich werden durch OH- und NH-

Valenzschwingungen verursacht und sind zusammen mit den C=O-Valenzschwingungen

typisch für Naturstoffe mit Peptid-Charakter.

Abb. 26: IR-Spektrum von Scytocyclamid B

Tabelle 20: Zuordnung der Wellenzahlen Wellenzahl Interpretation Wellenzahl Interpretation



Scytocyclamid B

50010001500200025003000350020

30

40

50

60

70

80

90

100

3299,502966,702936,322877,89

1780,39

1634,47

1522,42

1451,11

1385,52

1293,73

1202,06

1154,45

1059,42

838,57

699,56

721,61799,97

cm-1

% T

rans

mis

sion

Ergebnisse 67


2877,89 1154,45 (C-O) Valenzschwingung

1780,39 1059,42

1634,47 Amid I (C=O-Valenzschwingung) 838,57

1522,42 Amid II (C=O-Valenzschwingung) 721,51 CH2-rocking-Schwingung

1451,11 (C-H) Deformationsschwingung 699,56

3.1.6.3. Massenspektrometrie Weitere Hinweise auf die Struktur von Scytocyclamid B wurden per MALDI-TOF-Analysen

gewonnen. Hierzu wurde die Probe im positive ion mode analysiert. Es wurden drei Signale

detektiert. Der base peak wurde bei m/z 1.367,79 [M+H] detektiert. Daneben wurde ein

Signal bei 1.389,84 [M+Na] beobachtet. Bei einer weiteren unabhängigen Proben-

Aufbereitung wurde zusätzlich die Masse von 1.405,70 [M+K] detektiert.

Ausgehend von einem Molekulargewicht von 1.367 Da für das monoisotopische Signal

[M+H] wurde eine Struktur mit 12 oder 13 Aminosäuren erwartet. Zur Bestätigung des

Peptidcharakters wurden post source decay (PSD)-Spektren aufgenommen. Die PSD-

Spektren hatten keine Ähnlichkeit zu bereits isolierten Peptiden aus Scytonema hofmanni.

Jedoch wurden Fragmentmassen mit für Aminosäuren typischen Massenzahlen detektiert, so

dass man von einer Peptidstruktur ausgehen konnte. Aus dem PSD-Spektrum konnten Leucin,

bzw. Isoleucin, ein methyliertes Leucin, bzw. methyliertes Isoleucin, Alanin, Valin, Threonin

und Prolin als Bausteine über die Fragmentmasse ihrer Immoniumionen abgeleitet werden.

Weitere Fragmente konntenzuerst nicht zugeordnet werden. Da zu dem

Untersuchungszeitpunkt die Struktur von Scytocyclamid A bereits bekannt war, wurde nach

Strukturanalogien gesucht. In die Suche wurden ebenfalls die verwandten Laxaphycine,

Hormothamnine und Lobocyclamide einbezogen. Bei den Laxaphycinen wurde eine Struktur

mit dem Nominalgewicht von 1.366 Da beschrieben (Frankmölle et al., 1992). Deshalb lag

das Augenmerk auf Sequenzvergleichen bei denen Peptidfragmente analog zu Laxaphycin D

konstruiert und mit den Fragmentmassen aus den PSD-Spektren verglichen wurden. Hieraus

ergaben sich zahlreiche Hinweise auf eine analoge Struktur. Die so getroffenen

Fragmentzuordnungen sind in Tabelle 21 angegeben. Somit konnte ein Strukturvorschlag für

die NMR-Analysen vorgelegt werden (Abb. 27). Zur Bestätigung der Strukturanalogie

wurden umfangreiche NMR-Analysen vorgenommen.

Ergebnisse 68

Abb. 27: Strukturvorschlag für Scytocyclamid B

Tabelle 21: PSD-Fragmente von Scytocyclamid B Sequenz Ion m/z Aoc Val Hle Ala Hle Gln NM-Ile Has Thr Pro Leu Thr M+H 1367 Aoc Val Hle Ala Hle Gln NM-Ile Has Thr Pro Leu M+H 1267 Aoc Val Hle Ala Hle Gln NM-Ile Pro Leu Thr M+H 1136 Aoc Val Hle Ala Hle Gln Pro Leu Thr M+H 1009 Aoc Val Hle Ala Hle Pro Leu Thr M+H 881 Aoc Val Hle Ala Pro Leu Thr M+H 752 Aoc Val Hle Pro Leu Thr M+H 682 Aoc Val Pro Leu Thr M+H 552 Aoc Val Hle Ala Hle Gln Has Thr Pro Leu Thr M+H 1241 Aoc Val Hle Ala Hle Gln Thr Pro Leu Thr M+H 1110 Aoc Val Hle Ala Hle Thr Pro Leu Thr M+H 983 Aoc Val Hle Ala Hle Pro Leu Thr M+H 881 Aoc Val Hle Ala Hle Leu Thr M+H 784 Aoc Val Hle Ala Hle Gln NM-Ile M+H 825 Aoc Val Hle Ala Hle Gln M+H 698 Hle Ala Hle Gln NM-Ile M+H 585 Ala Hle Gln NM-Ile M+H 456 Hle Gln NM-Ile M+H 385 Gln NM-Ile M+H 256 NM-Ile Has Thr Pro M+H 456 NM-Ile Has Thr M+H 359 NM-Ile Has Thr Pro Leu M+H 569 Has Thr Pro Leu M+H 442 Pro Leu Thr M+H 312 Pro Leu M+H 211 Aoc Val Hle Ala M+H 441 Aoc Val Hle Thr M+H 471 Aoc Val Thr M+H 342 Aoc Thr M+H 243 NM-Ile Immoniumion 100 Leu Immoniumion 86 Thr Immoniumion 74 Thr Immoniumion 74 Pro Immoniumion 70 Ala Immoniumion 44

N

O

NHOH O

NH NH

O

O

NH

OH

O NH

O

NHOH

NH ONH2

O

O

N

O

NH

OO

NH

OH

O

NH2

OH

O

NH

Aoc1Val2

Hle3

Ala4

Hle5

Gln6

N-Me-Ile7

Has8

Thr9

Pro10

Leu11

Thr12

Ergebnisse 69

3.1.6.4. Magnetische Kernresonanzspektroskopie Durch 1H-NMR-Analysen, sowie zweidimensionale 1H-NMR-Spektroskopie wurde der

Strukturvorschlag auf seine Richtigkeit überprüft. Erschwerend kam hinzu, dass

Scytocyclamid B als Konformerengemisch vorlag, was zu Duplizität einzelner Signale führte,

so dass nicht für alle chemischen Verschiebungen Zuordnungen zu einzelnen

Strukturelementen gemacht werden konnten (Tabelle 22). Über H, H-COSY werden skalar

gekoppelte Protonenpaare detektiert. Kopplungen über mehr als 3 Bindungen fallen schwach

aus, so dass ausschließlich vicinal und geminal gekoppelte Protonen erfasst wurden. Alle

miteinander koppelnden Protonen bilden ein Spinsystem. Die Identifizierung einzelner

Aminosäuren erfolgte über die Zuordnung ihrer charakteristischen Spinsysteme. Die Sequenz

der Aminosäuren wurde über H, H-ROESY-Experimente verifiziert. Hierbei wurden

Sequenz-NOE-Korrelationen vom Typ α-N, i , i+1 ausgewertet. Informationen über die

chemische Umgebung des Kohlenstoffatoms lieferten H, C-HSQC-Messungen, welche

direkte C-H-Korrelationen erfassen. Die chemische Verschiebung der Kohlenstoffatome

wurde aus den HSQC-Messungen bestimmt.

Die in der Massenspektrometrie nicht zu unterscheidenden Aminsäuren Leucin und Isoleucin,

sowie deren Strukturmodifikationen wurden durch die Aufspaltungsmuster der einzelnen

Signale, sowie zugehörigen Kopplungskonstanten bestimmt. Hydroxyasparagin und Glutamin

konnte durch Zuordnung von Signalen der Amidgruppen in den Seitenketten eindeutig von

ihren jeweiligen Säuren unterschieden werden. Ein Vergleich mit den publizierten Daten zu

Laxaphycin D (Frankmölle et al., 1992) zeigt keine Unregelmäßigkeiten oder Abweichungen.

Alle gewonnen Daten stützen den Strukturvorschlag aus der Massenspektrometrie, so dass der

Strukturvorschlag bestätigt werden kann (siehe hierzu Abb. 27).

Abb. 27: NMR-Spektrum Scytocyclamid B

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5Chemical Shif t (ppm)

51.6622.9910.8613.302.412.947.222.6316.249.001.021.655.029.051.00

0.99

(12-

Thr4

)1.

04(9

-Thr

4)

1.31

(4-A

la3)

2.32

(1-O

ct3)

2.40

(1-O

ct3)

2.96

(7-M

e-Ile

1)

3.47

(5-H

le3,

3-H

le3)

3.65

(10-

Pro5

)3.

67(1

0-Pr

o5)

3.90

(9-T

hr3)

3.98

(12-

Thr3

)4.

08(2

-Val

2)4.

11(1

-Oct

2,12

-Thr

2)4.

20(4

-Ala

2)4.

30(5

-Hle

2)4.

34(8

-Has

3,10

-Pro

2,11

-Leu

2,3-

H4.

47(9

-Thr

2)4.

61(8

-Has

2,6-

Gln

2)4.

73(7

-Me-

Ile2)

4.82

(12-

Thr5

)4.

97(3

-Hle

7)4.

98(9

-Thr

5)5.

10(5

-Hle

7)

5.82

(8-H

as6)

6.88

(6-G

ln6)

7.24

(6-G

ln6)

7.30

(8-H

as5)

7.32

(9-T

hr1)

7.59

(1-O

ct1)

7.70

(8-H

as1,

5-H

le1)

7.77

(6-G

ln1)

7.80

(12-

Thr1

)7.

87(1

1-Le

u1)

7.88

(4-A

la1)

7.99

(3-H

le1)

8.21

(2-V

al1)

Ergebnisse 70

Tabelle 22: NMR-Daten zu Scytocyclamid B Aminosäure Position δ 13C


Aoc1 1 2 2,40 / 2,32 mult. 3 45,8 4,11 mult. 4 5 6 7 8 3-NH 7,59 dubl. Thr12-3, Thr12-2, Thr12-5 Val2 1 2 59,0 4,08 mult. Hle3-NH 3 4 5 2-NH 8,21 dubl. HLe3 1 2 55,2 4,34 3 76,2 3,47 mult. 4 5 6 2-NH 7,99 dubl. Val2-2 3-OH 4,97 mult. Hle5-NH Ala4 1 2 49,4 4,20 mult. Hle5-NH 3 1,31 dubl. 2-NH 7,88 dubl. Hle5 1 2 55,5 4,30 mult. Gln6-NH 3 76,0 3,47 mult. 4 5 6 5-OH 5,10 dubl. Hle3-OH 2-NH 7,70 dubl. Ala4-2, Gln6-2 Gln6 1 2 49,0 4,61 doppeltes dubl. Hle5-NH 3 4 5 2-NH 7,77 dubl. NH2 7,24 / 6,88 dubl. Hle5-2 MeIle7 1 2 59,6 4,73 dubl. Has8-NH 3 4 5 6 N-CH3 2,96 sing. Has8 1 2 55,5 4,61 dubl. Thr9-NH 3 70,4 4,34 mult. 4 2-NH 7,70 dubl. MeIle7-2 NH2 7,30 3-OH 5,82 dubl. Thr9 1 2 55,8 4,47 mult. 3 66,2 3,90 mult. 4 1,04 dubl.

Ergebnisse 71

2-NH 7,32 dubl. Has8-2 3-OH 4,98 mult. Pro10 1 2 59,5 4,34 mult. 3 4 5 47,0 3,67 / 3,65 dubl. Leu11 1 2 51,0 4,34 mult. Thr12-NH 3 4 5 6 2-NH 7,87 mult. Thr12 1 2 57,8 4,11 mult. Aoc1-NH 3 66,2 3,98 mult. Aoc1-NH 4 0,99 2-NH 7,80 dubl. Leu11-2 3-OH 4,82 dubl. Aoc1-NH Korrelationen innerhalb des Spinsystems einer Aminosäure werden nicht aufgeführt.

3.1.7. Struktur von Scytocyclamid C Erste Untersuchungen zu Scytocyclamid C ergaben große Ähnlichkeit zu Scytocyclamid B.

Dies galt für das Verhalten während der chromatographischen Aufreinigung. Beispielsweise

eluierten Scytocyclamid B und C bei ähnlichen Retentionszeiten (26 min / 28 min). Die UV-

Spektren waren identisch (ohne Abb.).

3.1.7.1. Infrarotspektroskopie Die Infrarotspektroskopie-Aufnahmen wurden unter den bereits beschriebenen Bedingungen

durchgeführt. Wie aus dem Spektrum ersichtlich ergaben sich zu Scytocyclamid B keine

nennenswerten Unterschiede, weshalb auf eine Zuordnung der Wellenzahlen an dieser Stelle

verzichtet wird.

Abb.28: Infrarotspektrum von Scytocyclamid C

Scytocyclamid C

65011501650215026503150365075

85

95

3284,962962,29

1641,86

1520,70

1450,72

1201,501137,36

838,23800,45

721,08

cm-1

% T

rans

mis

sion

Ergebnisse 72

3.1.7.2. Massenspektrometrie Scytocyclamid C verursachte in der MALDI-TOF-Analyse drei prominente Signale im

positive ion mode. Dies entsprach bei m/z 1.351,74 [M+H], der base peak bei 1.373,73

[M+Na] und bei 1.389,72 [M+K]. Somit unterschied sich die Masse von Scytocyclamid C zu

Scytocyclamid B um 16 Dalton. Dieser Massenunterschied ließ eine Strukturmodifikation mit

einer um ein Sauerstoffatom verminderter Struktur vermuten. Anhand der post source decay

(PSD)-Spektren wurde nach dieser Modifikation gesucht. In den PSD-Spektren konnte kein

neues Immoniumion zugeordnet werden, welches einen Rückschluss auf die modifizierte

Aminosäure gegeben hätte. Mit diesem Hinweis und vermuteter Strukturanalogie zu dem

bekannten Laxaphycin D wurde versucht die Fragmente zuzuordnen. Es wurden zahlreiche

Analogien zu Laxaphycin D, respektive Scytocyclamid B gefunden. Die Struktur konnte

jedoch nur mit Hilfe der NMR-Analysen geklärt werden (siehe unten). Beispielsweise

konnten in der Massenspektrometrie Leucine nicht von Isoleucinen unterschieden werden.

Ebenso wenig war Hydroxyprolin von Leucin oder Isoleucin zu unterscheiden, so dass eine

eindeutige Strukturaufklärung nur über NMR-Analysen gemacht werden konnte. Bei den

Fragmenten mit hoher Massenzahl war zudem die Zuordnung schwierig, da die

Fragmentspektren gemittelte Massen aus mehreren Messungen repräsentieren und

Unterschiede von einer Masse nicht immer zweifelsfrei zugeordnet werden konnte. Bei der

NMR-Analyse war zu klären, ob es sich um Hydroxyasparagin oder Hydroxyasparaginsäure,

bzw. ob es sich um Glutamin oder Glutaminsäure handelt. Nachdem die Strukturmodifikation

per NMR-Analytik identifiziert wurde, konnten die in Tabelle 23 angegebenen Fragmente

zugeordnet werden. Durch Überlappung der verschieden Abschnitte konnte die Sequenz

bestimmt und bestätigt werden (siehe hierzu Abb. 29). Die fehlende Hydroxylierung wurde

anhand der Fragmente eindeutig am Leucin5 lokalisiert.

Tabelle 23: PSD-Fragmente von Scytocyclamid C Sequenz Ion m/z Aoc Val Hle Ala Leu Gln NM-Ile Has Thr Pro Leu Thr M+H 1351 Aoc Val Hle Ala Leu NM-Ile Has Thr Pro Leu Thr M+H 1224 Aoc Val Hle Ala Leu Gln Pro Leu Thr M+H 993 Aoc Val Hle Ala Leu Pro Leu Thr M+H 866 Aoc Val Hle Ala Pro Leu Thr M+H 752 Aoc Val Hle Pro Leu Thr M+H 682 Aoc Val Pro Leu Thr M+H 552 Aoc Pro Leu Thr M+H 453 Pro Leu Thr M+H 312 Pro Leu M+H 211 Thr Pro Leu M+H 312 Has Thr Pro Leu M+H 442 NM-Ile Has Thr Pro Leu M+H 569

Ergebnisse 73

NM-Ile Has Thr Pro M+H 456 NM-Ile Has Thr M+H 359 Gln NM-Ile M+H 256 Leu Gln NM-Ile M+H 369 Ala Leu Gln NM-Ile M+H 440 Hle Ala Leu Gln NM-Ile M+H 569 Hle Ala Leu Gln M+H 442 Hle Ala Leu Gln NM-Ile Has Thr M+H 800 Aoc Val Hle Ala Leu Gln NM-Ile Has Thr M+H 1040 Aoc Val Hle Ala Leu Gln NM-Ile Thr M+H 910 Aoc Val Hle Ala Leu Gln Thr M+H 783 Aoc Val Hle Ala Leu Gln M+H 682 Aoc Val Thr M+H 342 Aoc Thr M+H 243 NM-Ile Immoniumion 100 Leu Immoniumion 86 Leu Immoniumion 86 Thr Immoniumion 74 Thr Immoniumion 74 Val Immoniumion 72 Pro Immoniumion 70 Ala Immoniumion 44 3.1.7.3. NMR-Analytik zu Scytocyclamid C Das 1H-NMR-Spektrum zeigte die vermutete Analogie zu Scytocyclamid B (Abb. 29). Die

Zuordnung der chemischen Verschiebungen zu bestimmten Strukturelementen erfolgte nach

Auswertung der Korrelationsmessungen (TOCSY-, ROESY-, COSY-, HSQC-Messungen).

Die genauen Zuordnungen, sowie die Unterschiede zu Scytocyclamid B sind Tabelle 24 zu

entnehmen. Ebenso wie Scytocyclamid B lag Scytocyclamid C als Konformerengemisch vor,

so dass nicht alle Signale eindeutig zugeordnet werden konnten. Das Vorhandensein von

Hydroxyasparaginsäure und Glutaminsäure konnte durch Zuordnung von Signalen „freier“

Amidprotonen ausgeschlossen werden. Leucine, Isoleucine oder deren Analoga und

Hydroxyprolin konnten anhand ihrer typischen Spinmuster unterschieden, bzw.

ausgeschlossen werden.

Abb. 28: NMR-Spektrum Scytocyclamid C

8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0Chemical Shif t (ppm)

0.99

(12-

Thr4

)1.

05(9

-Thr

4)

1.25

(4-A

la3)

2.31

(1-O

ct3)

2.42

(1-O

ct3)

2.94

(7-M

e-Ile

1)

3.50

(3-H

le3)

3.67

(10-

Pro5

)3.

93(9

-Thr

3)3.

98(1

2-Th

r3)

4.02

(2-V

al2)

4.09

(1-O

ct2)

4.11

(12-

Thr2

)4.

17(5

-Leu

2)4.

18(4

-Ala

2)4.

32(1

1-Le

u2)

4.34

(3-H

le2)

4.35

(8-H

as3,

10-P

4.48

(9-T

hr2)

4.59

(6-G

ln2)

4.63

(8-H

as2)

4.70

(7-M

e-Ile

2)

6.82

(6-G

ln6)

7.25

(6-G

ln6)

7.33

(8-H

as5)

7.35

(9-T

hr1)

7.60

(8-H

as1)

7.65

(1-O

ct1)

7.72

(12-

Thr1

)7.

81(5

-Leu

1)7.

84(4

-Ala

1)7.

91(6

-Gln

1)7.

94(1

1-Le

u1)

8.02

(3-H

le1)

8.21

(2-V

al1)

Ergebnisse 74

Tabelle 24: NMR-Spektroskopie und Teilstrukturen von Scytocyclamid C Aminosäure Position δ 13C


Aoc1 1 2 41,0 2,42 / 2,31 2x mult. 3 46,6 4,09 mult. 4 5 6 7 8 3-NH 7,65 dubl. Thr12-3, Thr12-2, Thr12-5 Val2 1 2 59,8 4,02 mult. Hle3-NH 3 4 5 2-NH 8,21 dubl. HLe3 1 2 56,0 4,34 mult. 3 77,0 3,50 dubl. 4 5 6 2-NH 8,02 dubl. Val2-2 3-OH Leu5-NH Ala4 1 2 49,5 4,18 mult. Leu5-NH 3 18,5 1,25 dubl. 2-NH 7,84 dubl. Leu5 1 2 52,0 4,17 mult. Gln6-NH 3 4 5 6 2-NH 7,81 dubl. Ala4-2, Gln6-2 Gln6 1 2 49,0 4,59 doppeltes dubl. Leu5-NH 3 4 5 2-NH 7,91 dubl. Leu5-2 NH2 7,25 / 6,82 dubl. MeIle7 1 2 60,5 4,70 dubl. Has8-NH 3 4 5 6 N-CH3 2,94 sing. Has8 1 2 56,0 4,63 dubl. Thr9-NH 3 4,35 mult. Thr9-NH 4 2-NH 7,33 mult. MeIle7-2 NH2 7,30 3-OH Thr9 1 2 56,5 4,48 mult. 3 67,0 3,93 mult. 4 19,5 1,05 dubl. 2-NH 7,35 mult.. Has8-2, Has8-3

Ergebnisse 75

3-OH Pro10 1 2 4,35 mult. 3 4 5 48,0 3,67 mult.. Leu11 1 2 52,0 4,32 dubl. Thr12-NH 3 4 5 6 2-NH 7,94 dubl. Thr12 1 2 58,5 4,11 mult. Aoc1-NH 3 67,0 4,01 mult. Aoc1-NH 4 20,2 0,99 dubl. 2-NH 7,72 dubl. Leu11-2 3-OH Aoc1-NH Korrelationen innerhalb des Spinsystems einer Aminosäure werden nicht aufgeführt.

Aus den so gewonnen Daten ergibt sich folgende Struktur für Scytocyclamid C:

Abb. 29: Struktur von Scytocyclamid C

3.2. Biologische Aktivität

3.2.1. Enzyminhibitions-Assays Für einige Peptide aus dem Sekundärstoffwechselprodukte von Cyanobakterien ist potente

spezifische Hemmung proteolytischer Enzyme bekannt. Um das Wirkungsspektrum der aus

Scytonema hofmanni PCC 7110 isolierten Peptide auf Proteasen zu dokumentieren, wurde die

Hemmung der einzelnen isolierten Peptide auf verschiedene Serinproteasen (Trypsin,

N

O

NHOH O

NH NH

O

O

NH

OH

O NH

O

NH

NH ONH2

O

O

N

O

NH

OO

NH

OH

O

NH2

OH

O

NH

Aoc1Val2

Hle3

Ala4

Gln6

N-Me-Ile7

Has8

Thr9

Pro10

Leu11

Thr12

Leu5

Ergebnisse 76

Chymotrypsin, Thrombin, Plasmin und Elastase) und auf die Cysteinprotease Papain

untersucht. Um das Spektrum an getesteten Enzymen zu erweitern, wurde zudem eine

mögliche Hemmung der Metalloproteasen Carboxypeptidase A, Thermolysin und der Leucin-

Aminopeptidase überprüft. Des Weiteren wurde auf Hemmung der Glutathion-S-Transferase

und der Proteinphosphatase 1A getestet.

Die isolierten Peptide wurden in 50 % (v/v) wässrigem Methanol gelöst (1µg/ml) und

zunächst in der 1:100 Verdünnung eingesetzt. Als Testsubstrate wurden kommerzielle p-

Nitroanilin-markierte Peptide eingesetzt, und es wurde die Freisetzung von p-Nitroanilin und

die damit verbundene Absorptionsänderung bei 405 nm verfolgt.

Cyanopeptolin 1067A hemmte Trypsin mit einem IC50-Wert von 0,064µg/ml (ca. 60 nmol).

Für Plasmin wurde ein IC50-Wert von 1,03 µg/ml (ca. 0,97 µmol) bestimmt. Bei den anderen

getesteten Enzymen wurde keine nennenswerte Hemmung durch Cyanopeptolin 1067A

festgestellt.

Abb. 30: Enzyminhibitionsassays von Cyanopeptolin 1067A mit Trypsin bzw. Plasmin. Die Bestimmung der IC50-Werte erfolgt bei halbmaximaler Wirkung, welche aus den Positivkontrollen bestimmt wurden. Wellenlänge: 405 nm Cyanopeptolin 946A hatte eine den zuvor bestimmten Scyptolinen (Matern et al., 2001),

vergleichbare Hemmwirkung (IC50 0,45 µg/ml, ca. 0,48 µmol). Zum Vergleich wurden auch

die IC50-Werte von Scyptolin A und B bestimmt (Scyptolin A und B: IC50 0,15 µg/ml, bzw

0,16 µg/ml entsprechend ca. 0,14 µmol). Bei den übrigen Enzymen wurde keine Hemmung

festgestellt.

Cyanopeptolin 1067A: Trypsin

0.0000.0250.0500.0750.1000.1250.1500.1750.2000.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

Konzentration [µg/ml]

OD

405

nm

Cyanopeptolin 1067A: Plasmin

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.00.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

Konzentration [µg/ml]

OD

405

nm

Ergebnisse 77

Abb. 31: Wirkung von Cyanopeptolin 946A auf Elastase (OD-Änderung bei 405 nm). Die halbmaximale Enzyminhibition wurde anhand der Positivkontrolle bestimmt. Für Proteinphosphatase 1A, Glutathion-S-Transferase, Leucin-Aminopeptidase, Thermolysin

und Carboxypeptidase A wurde bei keinem der in dieser Arbeit untersuchten Peptide

Hemmwirkung beobachtet. Auch mit Cyanopeptolin 1060A wurde in keinem Testsystem eine

Hemmung der Enzymaktivität festgestellt.

3.2.2. Antimikrobielle Untersuchungen Für einige Sekundärstoffwechselprodukte aus Cyanobakterien ist antimikrobielle Aktivität

nachgewiesen worden, unter anderem für verschiedene Cyanopeptoline sowie die den

Scytocyclamiden strukturell verwandten Laxaphycine, Lobocyclamide und Hormothamnine.

In Mikrodilutionsassays wurde daher die Wirkung der isolierten Peptide auf folgende

Mikroorganismen getestet: Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC

25922), Bacillus subtilis (ATCC 6633), Streptococcus pyogenes Gr. A E 12449/98,

Enterococcus faecium 41769 van sensibel, Acinetobacter baumannii (ATCC 19606 T),

Corynebacterium pseudodiphtericum RV2 / 92, sowie Candida albicans (ATCC 90028). Die

visuelle Auswertung der Versuchsansätze ergab für keines der getesteten Peptide bei einer

maximalen Konzentration von 64 µg/ml einen signifikanten Effekt.

3.2.3. Toxizitätsversuche mit Kleinkrebsen Toxizitätstestungen auf Primärkonsumenten von Cyanobakterien können einen ersten

Einblick in die ökologische Funktion der untersuchten Peptide geben. Scyptolin A und B

sowie Hofmannolin und die Scytocyclamide A und B wurden daher auf ihre toxischen

Eigenschaften auf Thamnocephalus platyurus überprüft. Ergänzend wurden Scytocyclamide

A und B auf ihre Wirkung auf Daphnia magna getestet. In keinem Fall wurde eine

Cyanopeptolin 946A: Elastase

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.70.06

0.07

0.08

0.09

0.10

0.11

0.12

Konzentration [µg/ml]O

D 4

05nm

Ergebnisse 78

Beeinflussung der Vitalität der Daphnien erhalten. Auch Scyptolin A und B hatten keinen

Effekt auf die Crustaceen. Im 24 h Toxizitätsassay auf Thamnocephalus platyurus erwiesen

sich die Scytocyclamide jedoch bereits nach zwei Stunden als letal (LD50 ca. 18 µmol für

Scytocyclamid A und 3,7 µmol für Scytocyclamid B; Abb. 32). Bei der Auszählung der toten

Crustaceen fielen morphologische Veränderungen auf, welche sich durch austretenden

Körperinhalt äußerten (Abb. 33).

Abb. 32: Bestimmung der Letalität von Scytocyclamid A (Doppelansatz) und B für Thamnocephalus platyurus. Abb. 33: Thamnocephalus platyurus (A): Morphologische Veränderungen nach Zugabe von 20 µM Scytocyclamid A nach 60 min (B): Pfeil zeigt austretenden Körperinhalt an

3.2.4. Zelltoxizitäts-Assays Bei Überprüfung von Bioaktivität wird oft auch auf zytotoxische Eigenschaften getestet. Die

von Matern et al. (2001 und 2003) charakterisierten Cyanopeptoline A und B, Hofmannolin

sowie Scytocyclamid A und B wurden an verschiedenen eukaryotischen Zelllinien auf

zellschädigende Eigenschaften untersucht:

0.0625 0.125 0.25 0.5 1 2 4 8 16 32 64 1280

102030405060708090

100110

Scytocyclamid B [µM]

Leta

lität

[%]

0.01 0.1 1 10 100 10000

102030405060708090

100110

Scytocyclamid A [µM]

Leta

lität

[%]

A B

Ergebnisse 79

CaCo 2 adhärente epitheliale Zellen aus humanen colorectalem Adenokarzinom HeLa humane Epithelzellen eines Zervixkarzinoms Swiss 3T3 adhärente Zellen aus embryonalen Mäusefibroblasten Ebl embryonale Rinderlungenzellen Rbl basophile Rattenleukämiezellen LoVo Zellen aus humanen colorectalem Adenokarzinom 293 adhärente Fibroblasten aus humaner embryonaler Niere

Die Auswertung erfolgte visuell nach 30 min bzw. 2 h (anfangs nach 24 h) Inkubation mit

dem Lichtmikroskop. Auf eine Begutachtung nach 24 h wurde verzichtet, da alle zu

beobachtenden Veränderungen direkt nach Applikation der Peptide zu sehen waren. Die

Cyanopeptoline hatten keinen Einfluss auf die Viabilität der Zellen. Dagegen hatten

Scytocyclamide starke zellschädigende Eigenschaften: Bei visueller Beobachtung unter dem

Mikroskop ließen sich die Bildung von Vesikeln („blebbing“) und Veränderungen an der

Zellstruktur verfolgen. Zellschädigung wurde bis zu einer Konzentration von 10 µg/ml

beobachtet. In den 1:10 Verdünnungen waren keine eindeutigen Veränderungen zu erkennen.

Abb. 34: Hela-Zellen im Phasenkontrastmikroskop (Phase 2). Die Aufnahmen erfolgten direkt nach Applikation (10 µg/ml) der jeweiligen Scytocyclamide A, B und C (entsprechend dem Buchstabenkürzel) sowie Zusatz von 10 µl einer 0,5 %igen (v/v) Trypanblau-Lösung. Kontrolle: Ansatz mit 1 % (v/v) DMS.

Kontrolle A

B C

Ergebnisse 80

Bei den mit Trypanblau gefärbten Zellen wurde eine erhöhte Granularität beobachtet. In

Abb. 35 sieht man die durch die Scytocyclamide verursachten morphologischen

Veränderungen: Ausstülpungen der Zellmembran (siehe Pfeile) sowie Veränderungen in der

Zellstruktur.

Abb. 35: Swiss 3T3-Zellen im Phasenkontrastmikroskop (Phase 2). Die Aufnahmen erfolgten direkt nach Peptid-Applikation (10 µg/ml). Kontrolle: Ansatz mit 1 % (v/v) DMSO. Buchstabenkürzel stehen für das jeweilige Scytocyclamid. Pfeile: zeigen „blebbing“ an.

3.2.5. Porenbildende Aktivität Die durchgeführten Versuche mit Scytocyclamiden an künstlichen Lipidmembranen

bestehend aus Diphytanoyl-Phosphatidylcholin und n-Dekan brachten keine Hinweise auf die

Bildung von Poren. Es wurden nur geringe Leitfähigkeitsänderungen beobachtet. Bei

Cholesterol-haltigen Membranen bewirkten die Scytocyclamide höhere

Leitfähigkeitsänderungen (persönliche Mitteilung R. Benz).

A

Kontrolle

B

D

A

C

Ergebnisse 81

3.2.6. Membranschädigung Zur Prüfung einer möglichen Membranschädigung durch Scytocyclamid A und B wurde der

Efflux von radioaktivem Rubidium (86Rb+) aus HT-29-Zellen mit einem Scintillationszähler

gemessen. Zur Kontrolle wurde DMSO in gleicher Konzentration mitgeführt. Die

Auswertung belegt Membranschädigung durch die eingesetzten Peptide ohne dass die

Wirkung durch DMSO erklärt werden könnte. Beide getesteten Scytocyclamide induzieren 86Rb+-Efflux. In der höchsten Konzentration des jeweiligen Peptids ergibt sich ein 5-fach

höherer 86Rb+-Efflux. Die Konzentrationsabhängigkeit kann der Grafik in Abb. 36

entnommen werden.

Abb. 36: Scytocyclamid A (1222) und B (1366) auf HT-29-Zellen (je 1,76 µl Peptidstammlösung (10µg/µl) Kontrollen: Medium, Medium + 1,76 µl DMSO

3.2.7. Hämolysetest Eine weitere Möglichkeit den Einfluss der Peptide (Scytocyclamid A und B, gesättigte

Lösung in Ethanol) auf Membranen zu testen war die mikroskopische Beobachtung einer

möglichen Hämolyse. Die hierzu untersuchten Schaf-Erythrozyten wurden durch die

Peptidlösung, bzw. die Kontrolle mit Ethanol nicht beeinträchtigt: Die Auswertung der

Blutagarplatte ergab nach 24 h keine Hämolyseaktivität. Nach 48 h wurde eine Entfärbung

geringen Umfangs jeweils an den Auftragsstellen beobachtet.

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

Kontro

lle

DMSO-Kon

trolle

1222

1,76

µl

1222

1:10

1222

1:10

0

1366

1,76

µl

1366

1:10

1366

1:10

0

Ergebnisse 82

3.2.8. Apoptose-Assays Bei den in dieser Arbeit durchgeführten Versuchen zur Apoptose wurde Scytocyclamid A an

embryonalen Mäusefibroblasten-Zellen (MEF-SV40) getestet. Im Phasenkontrastmikroskop

ließ sich die Bildung von Vesikeln (blebbing) beobachten, was ein erster Hinweis auf

apoptotische Vorgänge sein könnte. Blebbing ist ein charakteristisches Kennzeichen für

apoptotische Prozesse. Alle Versuche wurden durch Durchflusszytometrie analysiert. Bei

dieser Methode werden Zellen einzeln angesaugt und durch einen Laserstrahl geschossen.

Während der Detektion können gleichzeitig verschiedene Parameter überprüft werden:

Vorwärts- und Seitwärtsstreulicht, sowie die verschiedenen Fluoreszenzqualitäten. Auf Kanal

1 wurde Vorwärtsstreulicht, auf Kanal 2 Seitwärtsstreulicht gelegt. Diese beiden

Grundparameter ermöglichten eine Vorauswahl an lebenden, nicht geschädigten Zellen, da

sich im Untergang befindliche Zellen üblicherweise einen hohen Gehalt an Granula im

Vergleich zur ansonsten homogenen Zellpopulation aufweisen. Der höhere Gehalt an Granula

bewirkt eine geringere Durchlässigkeit für Lichtquanten und die Zellen zeigen praktisch keine

Seitwärtslichtstreuung. Durch Setzen eines Tores („Gates“) wurden die Zellen ausgewählt,

deren Eigenschaften in Bezug auf diese Parameter nicht lebendige Zellen ausschließt. Der

erste Datenplot jeder Versuchsreihe zeigt die Ausgangssituation der betreffenden

Zellpopulation ohne Fluoreszenzmarkierungen (Abb. 37). Beim direkten Vergleich der beiden

Ausgangspopulationen ergab sich eine sichtbare Veränderung der „Zellwolke“ nach Zugabe

von Scytocyclamid A. Dies machte sich in einer Intensitätsabnahme der

Vorwärtslichtstreuung bemerkbar, wohingegen eine Zunahme der Lichtstreuung im

Seitwärtsscatter beobachtet wurde.

Ein sehr früh nachzuweisendes Apoptose-Merkmal ist der Verlust der asymmetrischen

Verteilung von Phosphatidylserin in der Plasmamembran der Zelle. Annexin V ist ein

Phospholipid-bindendes Protein, das in Anwesenheit von Calcium große Affinität zu dem

Phospholipid Phosphatidylserin besitzt. Dieses Phospholipid transloziert in einem frühen

Stadium der Apoptose von der Innen- zur Außenseite der Zellmembran (Vermes, 2000). FITC

markiertes Annexin V bindet Ca2+-abhängig Phosphatidylserin und diese Bindung kann durch

FACS-Analyse quantifiziert werden. Dabei werden die Zellen mit Propidiumiodid (PI)

gegengefärbt. In Kombination mit Propidiumiodid, einem fluoreszierenden Lebendfarbstoff,

der DNA solcher Zellen färbt, die die Membranintegrität verloren haben, kann man lebende

(AV-/PI-), früh apoptotische (AV+/PI-) und spät apoptotische / tote Zellen (AV+/PI+)

voneinander unterscheiden. Im Versuchsansatz befindet sich bei den Kontrollzellen

Phospharidylserin fast ausschließlich in der dem Cytoplasma zugewandten

Ergebnisse 83

Phospholipiddoppelschicht. Beim Vergleich der Kontrollzellpopulation und den mit

Scytocyclamid A behandelten Zellen (2x 105 Zellen, 10 µM, 5-6 h Inkubation) im Annexin V-

Versuchsansatz wurde eine zusätzliche „Zellwolke“ beobachtet, welche durch

Propidiumiodid-positive/Annexin V positive Zellen verursacht wurde. Hier lagen

spätapoptotische oder nekrotische Zellen vor. Die Zunahme im rechten unteren Quadranten

war auf Zellen im frühen apoptotischen Stadium zurückzuführen, welche Propidiumiodid

negativ (= vital) sind.

Bei induzierter Apoptose kann als mögliches weiteres Charakteristikum eine Reduktion des

Mitochondrien Membranpotentials beobachtet werden. Mitochondrien mit normalen

Membranpotential lagern bedingt durch die Ladungsdifferenz verstärkt den Farbstoff 3,3´-

Dihexyloxacarbocyanin-Iodid (DiOC6(3) in ihrer Membran ein. Sind die Mitochondrien einer

Zelle depolarisiert, so bleibt die Akkumulation des Fluoreszenzfarbstoffes DiOC6(3) in den

Mitochondrien aus. Die dann gemessene Fluoreszenz ist deutlich niedriger als bei Zellen mit

nicht depolarisierten Zellen. Die Fluoreszenz sowohl der Vergleichspopulation als auch der

mit Scytocyclamid A behandelten Zellen wiesen unveränderte Fluoreszenz auf. Eine mögliche

Apoptoseinduktion verläuft ohne Verlust des Mitochondrien Membranpotentials

Ein weiterer Mechanismus über den zytotoxische Substanzen Apoptose induzieren können,

verläuft über die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). Dies wurde mit 2-

Hydroethidin, einem typischen Marker für die Generierung von ROS untersucht. Durch

reaktive Sauerstoffspezies gebildetes Ethidium interkaliert in die zelluläre DNA und zeigt

Fluoreszenz. Diese Auswirkung lässt sich im linken oberen Quadranten des DiOC6(3) / 2-HE

Versuches verfolgen (Abb. 37) Die Fluoreszenzmarkierung führte zu keiner Fluoreszenz bei

den Kontrollzellen, während die mit Scytocyclamid A behandelte Fraktion eine deutliche

Fluoreszenzzunahme in Form einer zusätzlichen „Zellwolke“ im linken oberen Quadranten

zeigte, was auf die Aktivität reaktiver Sauerstoffspezies zurückzuführen war (Abb. 37).

Ergebnisse 84

Abb. 37: FACS-Messungen. Die erste Versuchsreihe zeigt Veränderung in der unbehandelten Zellpopulation unter den erforderlichen Behandlungsschritten. Reihe 2 zeigt die Auswirkungen durch Inkubation mit Scytocyclamid A (10 µM). Inkubation jeweils: 5-6 h.

3.2.9. Immunhistochemische Untersuchungen Bei diesen Versuchen wurden fluoreszenzmarkierte Antikörper (Le Dizet et al., 1991)

spezifisch an Antikörper für α-Tubulin und F-Actin gebunden. Mittels

Immunfluoreszenzmikroskopie können so spezifisch die verschiedenen Filamente des

Zytoskeletts der verwendeten HeLa-Zellen dargestellt werden. Die hierzu verwendete

Methode ist die Konfokale Laser Scanning Mikroskopie bei der bei der 50 konfokale

Aufnahmen („shots“) gemacht wurden, welche anschließend vertikal projiziert wurden. Zur

Kontrolle wurde Scyptolin A unter gleichen Bedingungen mitgeführt (ohne Abb.). Für

Scyptolin A wurde keine Veränderung in Vergleich zu unbehandelten Zellen beobachtet. Das

α-Tubulin der mit Scytocyclamid B behandelten Zellen ließ sich durch die

fluoreszenzmarkierten Antikörper nicht mehr darstellen (Abb. 38: Bezeichnung „5“ für

Scytocyclamid B). Die Färbung des F-Actin weist keine deutlichen Veränderungen auf. Diese

Aufnahmen belegen eine Aktivität von Scytocyclamid B auf das Zytoskelett über eine

Zerstörung bzw. Depolymerisation des α-Tubulins. In der 3. Reihe (C) lässt sich eine in der

Zellteilung befindliche Zelle sehen, bei welcher die Mitosespindel noch zu sehen ist.

SSC

SSC

FSC

FSC Annexin V-FITC

Annexin V-FITC

PIPI

DiOC6(3)

DiOC6(3)

2-H

E2-

HE

1 11

12

4

2

31 4

418

306

Ergebnisse 85

Abb. 38: Immunfluoreszenzmikroskopie: HeLa-Zellen; Färbung von α-Tubulin und F-actin „5“: Scytocyclamid B (10µg / 750 µl)

A

B

C

Diskussion 86

4. Diskussion Die vorgelegte Arbeit sollte zur Kenntnis von Cyanobakterien als Quelle unbekannter

Sekundärstoffwechselprodukte mit biologischer Aktivität beitragen. Untersucht wurden

Peptidmetabolite aus axenisch kultivierten Scytonema hofmanni PCC 7110 Zellen. Die heute

verfügbaren und in der Arbeit angewendeten chemischen Methoden haben die

Strukturaufklärung von Molekülen selbst in Mikrogramm-Mengen erlaubt. Dadurch war es

möglich, auch zuvor unbekannte Peptide, die teils in nur niedriger zellulärer Konzentration

vorlagen und von Matern (2002) noch nicht identifiziert wurden, aufzuklären. Diese

einleitenden Worte sind hier vorangestellt, da die zelluläre Konzentration der im Folgenden

beschriebenen Peptide 0,04 % bezogen auf das Trockengewicht nicht überstieg. Die

Besprechung der Isolierung der großenteils neu detektierten und identifizierten

Cyanopeptoline und der Scytocyclamide erfolgt im nächsten Abschnitt gemeinsam, die

Strukturaufklärung nach Substanzklassen getrennt.

4.1. Isolierung und Strukturaufklärung Ein im Arbeitskreis etabliertes Reinigungsprotokoll zu Peptiden aus Scytonema hofmanni

(Matern et al., 2001) sieht die Herstellung eines Rohextraktes aus lyophilisierten Zellen mit

70 % (v/v) Methanol vor. Da jedoch die Extraktionsmethode jeweils für die zu isolierenden

Peptide individuell anzupassen war, wurden die verschiedenen Verfahrensschritte überprüft.

Vorversuche dienten dazu die optimale Methanolkonzentration für die Extraktion zu

ermitteln. Die Methanolkonzentration konnte von 70 % auf 50 % (v/v) ohne merkbaren

Verlust an dem jeweiligen Peptid reduziert werden. Andere Extraktionsmittel wie 5 % (v/v)

wässrige Essigsäure oder Acetonitril brachten keine Vorteile. Nach Herstellung des

Rohextraktes aus lyophylisiertem Zellmaterial sieht das Reinigungsprotokoll ein

Größenausschlussverfahren über Gelpermeationschromatographie an Sephadex® LH 20 vor.

Zur Peptidisolierung (Abb. 2) wurde jedoch immer der gesamte Durchbruch verwendet, so

dass unter den gewählten Bedingungen die Funktion des Größenausschluss nicht

gewährleistet war. LH-20-Material ist über C3-Gruppen modifiziert. Über diese

Strukturmodifikation könnte eine Trennung über schwach lipophile Stoffeigenschaften

vorgenommen werden. Die LH-20-Eluate zeigten nach HPLC-Analyse weder Peptide in den

Chromatogrammen noch ergaben sich Hinweise auf verbesserte Stofftrennung des LH-20-

Durchbruchs im Vergleich zum methanolischen Rohextrakt. Wie aus dem in dieser Arbeit

Diskussion 87

verwendeten Reinigungsprotokoll zu entnehmen ist, wurde daher auf diesen Verfahrensschritt

verzichtet. Der nächste Reinigungsschritt sieht eine Bindung der im Rohextrakt befindlichen

Peptide an eine Festphase vor. Über amphiphile Wechselwirkungen werden die Peptide

vollständig an Chromabond® C18-Material gebunden, so dass der Durchbruch keine Peptide

im Chromatogramm zeigt. Auf weitere Verfahrensschritte der

Ionenaustauschchromatographie (Matern et al., 2001 und 2003) wurde daher ebenfalls

verzichtet, da sie die Ausbeute an neu zu isolierenden Peptide nicht erhöhten. Bei den

Versuchen hierzu wurde unter anderem festgestellt, dass die Bindung der Peptide an die

Festphasenmaterialien nicht ausschließlich auf ionische Wechselwirkungen zurückzuführen

ist, sondern lipophile Stoffeigenschaften einschließt. Zur Kontrolle der Anwendung der

Ionenaustauschchromatographie wäre eine zusätzliche Elution mit Methanol nach erfolgter

Elution mit dem salzhaltigen Elutionsmittel sinnvoll.

Die in der Arbeit charakterisierten Cyanopeptoline und Scytocyclamide wurden direkt aus den

C18-Eluaten per RP-HPLC-Auftrennungen isoliert. Da sich teilweise die Retentionszeiten der

Cyanopeptoline von den Scytocyclamiden während der HPLC-Auftrennung deutlich

unterschieden, wurde eine Vortrennung während der Festphasenchromatopgraphie

vorgenommen. Über die Elution mit steigender Methanolkonzentration wurden Fraktionen

mit unterschiedlichem Peptidmuster erzeugt. Die isokratische Fließmittelzusammensetzung

wurde für optimale Trennergebnisse im präparativen Maßstab jeweils angepasst. Gering

wechselnde Peptidzusammensetzungen der einzelnen Fraktionen von Extraktion zu

Extraktion ließen den Schluss zu, dass neben der gesteigerten Elutionskraft durch den

erhöhten Anteil an organischem Lösungsmittel auch die Menge an Elutionsmittel Einfluss auf

die Peptidzusammensetzung der Eluate hat. Dies konnte jedoch problemlos über die

Programmierung der Fließmittelzusammensetzung während der präparativen Aufbereitung

ausgeglichen werden.

Die Struktur der isolierten Peptide wurden schließlich durch Methoden der UV-/IR-

Spektroskopie, MALDI-TOF-/FTICR-Massenspektrometrie sowie zweidimensionale 1H und 13C-NMR-Messungen einschließlich Korrelationsmessungen aufgeklärt.

Scytocyclamide: Hinweise auf die Sequenzbausteine der isolierten Scytocyclamide (Abb. 24,

27 und 29) wurden über die Fragmentmassen der Immoniumionen aus den PSD-Spektren der

MALDI-TOF-Analysen oder aus charakteristischen Spinsystemen in 2D-NMR-

Korrelationsmessungen bekommen (beispielhaft gezeigt in Abb. 20 und 21). Teilweise wurde

Diskussion 88

aus den NMR-Daten direkt die Konfiguration einzelner Bausteine abgeleitet, so im Fall der E-

Konfiguration des Dehydrobutyrylrestes in Scytocyclamid A. Auch wurde die trans-

Konfiguration des 4-Hydroxyprolins anhand der NOE-Korrelationen bestimmt. Zur weiteren

Konfigurationsbestimmung wurde Scytocyclamid A einer Hydrolyse unterworfen, um die

entstehenden Produkte nach Derivatisierung an chiralen Phasen per Gaschromatographie zu

identifizieren. Hierzu wurden käufliche Aminosäuren als Referenzsubstanzen verwendet.

Aminooctansäure konnte mangels Referenz nicht näher bestimmt werden. Als problematisch

erwies sich, dass manche Aminosäuren enantiomer (Leucin), bzw. als Diastereomere

(Isoleucin) vorkamen. Die Struktur von Scytocyclamid A beinhaltet 2 Leucine, wie auch 2

Isoleucine. Die gaschromatographischen Untersuchungen belegten das Vorhandensein von je

einem L- und D-Leucin sowie von L-Isoleucin und einem D-Isoleucin, bzw. einem D-allo-

Isoleucin. Anhand der Retentionszeiten konnten D-Isoleucin und D-allo-Isoleucin nicht

unterschieden werden. Weiterhin war es unmöglich die genaue Lokalisierung der betreffenden

Aminosäuren vorzunehmen. Hierzu hätte man Partialhydrolysen durchführen können, mit

Bestimmung und Aufreinigung der Bruchstücke. Bedingt durch den geringen Gehalt an

Scytocyclamiden (ca. 0,04 % der Zelltrockenmasse) wurde hierauf verzichtet.

Anfang der 90iger Jahre war Laxaphycin A, eine Substanz mit großer Strukturähnlichkeit

beschrieben worden (Frankmölle, et al., 1992). Scytocyclamid A unterscheidet sich

Laxaphycin A (Kap. 1.7.2.1.) durch den Produzenten sowie in der Aminosäuresequenz, bei

der Glutamin anstatt Homoserin an Position2 eingebaut ist. Ein zu Laxaphycin

strukturähnliches Peptid, Hormothamnin, wird von einem weiteren Cyanobakterium

(Hormothamnium enteromorphoides) produziert. Der Unterschied zu Laxaphycin A besteht in

der Z-Konfiguration des Dehydrobutyrins (Gerwick et al., 1989). Ein weiteres

strukturverwandtes Peptid ist Lobocyclamid aus Lyngbya converfoides (MacMillan et al.,

2002). Lobocyclamide besitzen an Position2 ein Serin, an Position6 Tyrosin anstatt

Phenylalanin. Wenn man die Konfiguration der Strukturverwandten Laxaphycin A,

Hormothamnin A und Lobocyclamid A vergleicht, scheinen die zuordnungsrelevanten

Aminosäuren eine konservierte Konfiguration aufzuweisen. Deshalb lässt sich die folgende

Struktur Scytocyclamid A postulieren:

Diskussion 89

Abb. 39: Struktur von Scytocyclamid A (postulierte Stereochemie an der Stereozentren der Aminosäuren in Position1,7,8,9,10) Konfigurationsanalysen zu Scytocyclamid B und C konnten nicht durchgeführt werden, da

ihre Strukturen erst kürzlich gelöst wurden. Mit den Scytocyclamiden A bis C konnten für

Scytonema hofmanni PCC 7110 bis dato unbekannte Peptide charakterisiert werden. Die

Namensgebung der zuvor genannten und zu den Scytocyclamiden strukturverwandten Peptide

orientierte sich jeweils am produzierenden Organismus. Die Bezeichnungen Scytophycin

(Patterson et al., 1994) und Scytonemin (Helms et al., 1988) waren bereits für andere

cyanobakterielle Inhaltsstoffe vergeben, weshalb hier Scytocyclamid gewählt wurde.

Scytocyclamid B besitzt eine identische Aminosäuresequenz zu Laxaphycin D (Frankmölle,

et al., 1992). Die Stereochemie von Scytocyclamid B wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht

bestimmt. Jedoch lässt sich durch die von Scytocyclamid A zu Laxaphycin A bestehende

Strukturverwandschaft auch bei Scytocyclamid B eine zu Laxaphycin D identische

Stereochemie erwarten.

Bei den Scytocyclamiden sind untypische Aminosäuren, wie β-Aminooctansäure, Homoserin

sowie D-Aminosäuren am Aufbau beteiligt. Dies ist als Hinweis auf nichtribosomale

Biosynthese zu sehen. Neben den genannten untypischen Aminosäuren besitzt Scytocyclamid

A Dehydrobutyrin als Baustein. Dehydrobutyrin wurde auch bei den zuvor genannten

strukturverwandten Peptiden sowie in Microcystinen gefunden (Beattie et al., 1998). Des

Weiteren kennt man Dehydro-Aminosäuren von Lantibiotika. Lantibiotika wurden nach der

untypischen Aminosäure Lanthionin benannt. Diese Aminosäure treten in der Natur

normalerweise nicht auf (Sahl et al., 1995). Die chemische Reaktion, welche für die

NH

ONH

NH

NH

O

OO

O

NOH

O

O

NH2

NH

ONH

ONH

ONH O

NHNH

O

OH

Aoc1

Gln2

Dhb3

Hyp4

Hse5Phe6

Leu7

allo-Ile8

Ile9

Leu10 Gly11

Diskussion 90

chemische Synthese dieser Aminosäuren gebraucht wird wurde erstmals durch Ingram (1970)

postuliert. Dehydratisierung von Threonin führt zu Dehydrobutyrin. Es wäre denkbar, dass in

Scytocyclamid A Dehydrobutyrin ebenfalls aus Threonin gebildet wird. Anhand der

Massendaten, welche direkt aus dem Rohextrakt generiert wurden ergibt sich kein Hinweis

auf Threonin in der Aminosäuresequenz.

Cyanopeptoline: Das Molekulargewicht der Cyanopeptoline wurde über MALDI-TOF-MS

bzw. durch ein Verfahren mit gepulster Laserionisierung bestimmt, welches eigens für die

Detektion cyanobakterieller Peptide entwickelt worden war (Erhard et al., 1998). Im letzteren

Verfahren werden Mutterionen im Flug weiter fragmentiert, und man erhält post source decay

(PSD)-Spektren aus wenigen, teilweise überlappenden Fragmentionen. Ein Vergleich der

Fragmentionen der neu isolierten Peptide mit Fragmentmassen aus einer Fragmentdatenbank,

welche Angaben zu Molekulargewichten und charakteristischen PSD-Fragmenten für mehr

als 2.000 cyanobakterielle Peptide enthält brachte keine Strukturhinweise für die neu zu

charakterisierenden Peptide (Erhard, 1999). Strukturhinweise auf die neu identifizierten

Cyanopeptoline wurden hauptsächlich über Vergleiche ihrer PSD-Spektren mit denen von

Matern et al. (2002) bereits charakterisierter Cyanopeptoline gewonnen. So konnten damals

anhand der Massenunterschiede verschiedene Modifikationen vorgeschlagen werden, welche

über umfangreiche NMR-Analysen bestätigt bzw. gelöst wurden. Da in der jetzt vorgelegten

Arbeit die Ausbeute an den einzelnen Peptid bezogen auf das Trockengewicht der Zellen mit

max. 0,04 % sehr gering war, musste auf eine Konfigurationsanalyse verzichtet werden.

Bisher wurden für die Aminosäuren der Cyanopeptoline jedoch nur L-Konfigurationen

bestimmt, so dass für die neu charakterisierten Cyanopeptoline diese Konfiguration ebenfalls

postuliert wird. Diese Annahme wird durch eine von Matern et al. (2003) durchgeführte

Konfigurationsanalyse gestützt, bei welcher für Scyptolin A und B ausschließlich L-

konfigurierte Aminosäuren gefunden wurden. Die isolierten Cyanopeptoline weisen die

Charakteristika auf, welche sie in die Klasse der Cyanopeptoline subsumiert (Jakobi et al.,

1995): es sind zyklische Depsipeptide, bei denen der Ringschluß über eine Esterbindung zum

Lacton erfolgt. Die Ahp-Gruppe ist jeweils vorhanden.

Die in der Massenspektrometrie auftretenden Signale, welche [M-H2O+H]+ zugeordnet

wurden, gehen vermutlich auf Dehydratisierung unter Ausbildung einer Doppelbindung

zurück (Forchert, 1999). Dieser Effekt trat bei ESI-MS noch stärker in Erscheinung, so dass

hier von einer Fragmentierung in der Ionenquelle auszugehen ist. Ein Nachweis der

Diskussion 91

Wasserabspaltung konnte durch NMR-Analytik nicht gezeigt werden, so dass von einer

Quellenfragmentierung auszugehen ist.

Cyanopeptolin 946A wurde durch Einbau von nicht-chloriertem Tyrosin im Vergleich zu

Scyptolin A modifiziert. Veränderungen der Bioaktivität gegenüber den Scyptolinen wurden

nicht gefunden. Daher stellt sich die Frage, weshalb diese Strukturmodifikation gebildet wird.

Eine einfache Erklärung wäre, dass bei der Biosynthese im Multienzymkomplex der

Unterschied zwischen chlorierter und nicht-chlorierter Aminosäure nicht erkannt wird und der

geringe Gehalt an dieser Strukturmodifikation durch die „Fehlerrate“ zu erklären ist. Denkbar

wäre, dass die Halogenase, welche für die Chlorierung zuständig ist, ein gewisses

Fehlerpotential aufweist. Molekulargenetische Untersuchungen könnten hier Aufschluss

geben.

In der Arbeit von Matern et al. (2002) wird Scyptolin A als mögliches Artefakt von Scyptolin

B diskutiert. Würde Scyptolin A aus Scyptolin B durch Esterhydrolyse während der

Aufreinigung entstehen, so müsste eine Strukturvariation von Scyptolin B entstehen, welche

am Tyrosin nicht chloriert ist. Dieses Artefakt konnte mit LC-MS-Analysen, sowie durch

MALDI-TOF-Analysen nicht nachgewiesen werden. Auch die über C18-Festphasen

konzentrierten Eluate zeigen diese Masse nicht, so dass man zu dem Schluss kommen kann,

dass Scyptolin A nicht aus Scyptolin B entstanden ist. Jedoch wird durch diese Feststellung

eine Fehlsteuerung während der Biosynthese, welche die Produktion von Cyanopeptolin 946A

erklärt, unwahrscheinlich, da Scyptolin B in größerer Menge als Scyptolin A synthetisiert

wird. Somit müsste auch ein Artefakt mit der Masse von 1.070 Da zu finden sein, welches

Scyptolin B ohne Chlorierung entspricht. Insofern bleibt die Bedeutung der Synthese von

Strukturvarianten weiterhin spekulativ. Die Untersuchung der Biosynthese sollte in

absehbarer Zeit die Antwort geben, da molekulargenetische Untersuchungen zur Biosynthese

nichtribosomal gebildeter Sekundärstoffwechselprodukte im Fokus vieler Arbeitsgruppen

liegen (Chang et al., 2002, Hofmann et al., 2003, Grünewald et al., 2005). Neuere genetische

Studien bestätigen, dass Depsipeptide in Cyanobakterien über nichtribosomale Peptid-

Synthetasen gebildet werden. Peptid-Synthetasen wurden für Anabaenopeptilide (Rouhiainen

et al., 2000), Nostocyclopeptide (Becker et al., 2004) sowie Nostopeptolid A (Hofmann et al.,

2003) charakterisiert. Die modulare Struktur der Peptid-Synthetasen erleichtert den Austausch

von Aminosäurebausteinen innerhalb der Peptide und die Bildung einer großen Zahl an

Strukturvarianten mit unterschiedlichen Zielspezifitäten und Wirkungen (Mootz et al., 2000).

Cyanopeptolin 1060A hat bis auf eine Methylengruppe in der Seitenkette eine zu

Hofmannolin (Matern et al., 2001) identische Struktur. Eine Konfigurationsanalyse wurde

Diskussion 92

nicht durchgeführt, jedoch wird durch die Strukturanalogie von einer identischen

Konfiguration ausgegangen. Strukturmodifikationen in der Seitenkette sind typische

Erscheinungen bei Cyanopeptolinen. Besonders häufig ist der N-Terminus durch eine Säure

acyliert. So ist beispielsweise der N-Terminus von Cyanopeptolin 954 ist durch Essigsäure

acyliert (von Elert et al., 2005). Bei Tasipeptinen findet man Butyrylreste am N-Terminus

(Williams et al., 2003).

Cyanopeptolin 1067A besitzt strukturelle Ähnlichkeit zu Hofmannolin (Matern et al., 2001).

In Position4 findet sich jedoch bei Cyanopeptolin 1066 mit Arginin eine basische Aminosäure.

Cyanopeptoline mit Arginin zwischen der Ahp-Gruppe und Threonin sind häufig beobachtete

Strukturvarinaten: Cyanopeptolin A (Martin et al., 1993), Cyanopeptolin S und SS (Jakobi et

al., 1995 und 1996), Micropeptin 90 (Ishida et al., 1995), Micropeptin EI992 (Ploutno et al.,

2002), Oscillapeptin J (Blom et al., 2003) seien beispielhaft angeführt. Mit der Bestätigung

der Struktur von Cyanopeptolin 1067A durch NMR-Analysen konnte ein von Matern et al.

(2002) nur anhand der MS-Daten und Datenbankvergleich getroffener Strukturvorschlag: 3-

(4-Hydroxyphenyl)-lactyl-Glu-(Thr-Arg-Ahp-Leu/Ile-NMTyr-Leu/Ile-O-) widerlegt werden.

Für die Seitenkette wurde Glutaminsäure und als N-Acylrest para-Hydroxyphenylmilchsäure

mit dem Hinweis auf notwendige Überprüfung postuliert. Da die Struktur von Hofmannolin

bekannt war, konnte die Zuordnung der Fragmentmassen durch Vergleich mit den beiden

Spektren erfolgen. Viele der von Matern et al. zugeordneten Fragmentmassen wiesen

Übereinstimmung mit den gemessenen Massenzahlen auf, trotzdem waren der Acylrest der

Seitenkette sowie die Leucine, bzw. Isoleucine nicht in der Sequenz von Cyanopeptolin

1067A enthalten. Bei den Fragmentzuordnungen fehlte unter anderem das für den Ring ohne

Seitenkette charakteristische Fragment, welches normalerweise in den Fragmentspektren von

Cyanopeptolinen deutlich zu erkennen ist (siehe PSD-Fragmentzuordnungen Tabelle 10, 13

und 15)

4.2. Biologische Aktivität

4.2.1. Enzymhemmwirkung

Von den in dieser Arbeit charakterisierten Peptiden haben die Scytocyclamide A bis C keine

Enzymhemmung in den gewählten Aktivitätstests. Bei den Cyanopeptolinen ergeben sich

vergleichbare Aktivitäten zu den von Matern et al. (2001 und 2003) untersuchten Scyptolinen

A und B sowie Hofmannolin. So hemmt Cyanopeptolin 946A Elastase spezifisch und potent

Diskussion 93

(IC50 0,48 µM). Die Werte für die Scyptoline A und B liegen vergleichbar bei 0,14 µM

(Matern et al., 2001), was sich schon durch die strukturelle Ähnlichkeit vermuten ließ.

Anhand der von Matern et al. (2003) publizierten kristallographischen Daten lässt sich kein

Hinweis auf eine Beteiligung der Chloridfunktion an der Bindung an die Inhibitor-

Bindungsstellen im aktiven Zentrum des Enzyms feststellen. Mit den Erfahrungen aus der

Gesamtheit der für diese Arbeit durchgeführten Enzymhemmtests kann man die relativ

geringen Unterschiede (ca. dreifach) im Wirkungsgrad auf die unterschiedlichen

Enzymchargen und damit verbundenen Aktivitätsunterschiede zurückführen. Außerdem sind

Enzymhemmtests relativ empfindlich für Störungen.

Für Cyanopeptolin 1060A konnte trotz des erweiterten Spektrums an getesteten Enzymen

keine Enzymhemmwirkung nachgewiesen werden. Cyanopeptolin 1060A unterscheidet sich

von Hofmannolin nur durch eine um eine Methylengruppe verkürzte Seitenkette. Diese dürfte

auf eine mögliche Enzymhemmung keinen Einfluss haben. Hofmannolin ist mit Scyptolin B

das mengenmäßig am stärksten exprimierte Peptid in Scytonema hofmanni PCC 7110.

Postuliert man wie von Elert et al. (2005), dass das primäre Ziel der von Cyanobakterien

produzierten Proteasehemmstoffe die Verdauungsenzyme der Primärkonsumenten ist, dann

stellt sich die Frage, ob nicht alle Strukturverwandten der Cyanopeptoline Enzymhemmstoffe

sein müssten.

Für Cyanoeptolin 1067A konnte indes eine potente Hemmung von Trypsin (IC50 60 nM)

nachgewiesen werden. Plasmin wurde ebenfalls gehemmt (IC50-Wert von 0,97 µM). Da sich

die Strukturen von Cyanopeptolin 1067A und Hofmannolin nur durch den Austausch der

Aminosäure an Position4 unterscheiden, kann die unterschiedliche Wirkung auf die basische

Aminosäure zurückgeführt werden. Dieses Ergebnis steht in Einklang mit den bisher

publizierten Daten zu Cyanopeptolinen, welche ebenfalls an Position4 eine der basischen

Aminosäuren Arginin oder Lysin aufweisen (z. B. von Elert et al., 2005, Czarnecki et al.,

2005) und Hemmstoffe von Trypsin sind.

4.2.2. Testung auf antimikrobielle Aktivität

Von einigen Inhaltsstoffen aus Cyanobakterien ist auch antimikrobielle Aktivität bekannt

(Ostenvik et al., 1998). Inhaltsstoffe aus Scytonema sp. TISTR 8208 wurden als stark

wirksame antimikrobielle Substanzen mit Wirkung auf gram-positive wie gram-negative

Bakterien und pathogene Hefen beschrieben (Chetsumon et al., 1993). Zugehörige Strukturen

wurden jedoch nicht veröffentlicht. Auch wurden Laxaphycine mit antifungaler Wirkung

Diskussion 94

beschrieben, wobei Laxaphycin A nur in Kombination mit Laxaphycin B eine Wirkung

zugeschrieben werden konnte (Frankmölle et al., 1992). Dies waren Anhaltspunkte auch bei

den neu charakterisierten Scytocyclamiden eine Aktivität erwarten zu lassen. Jedoch wurde

hier bis zu einer maximalen Konzentration von 64 µg/ml keine Wirkung beobachtet.

4.2.3. Toxizitäts-Assays 4.2.3.1. Toxizitätstest mit Primärkonsumenten

Um eine mögliche ökologische Funktion der untersuchten Peptide zu überprüfen, wurden die

isolierten Peptide in ihrer toxischen Wirkung auf Primärkonsumenten getestet. In der Literatur

finden sich Hinweise, dass Cyanopeptoline toxische Wirkungen bei Primärkonsumenten

verursachen, so beispielsweise durch Oscillapeptin J, einem Cyanopeptolin, welches Arginin

als Aminosäurebaustein am N-Terminus der Ahp-Gruppe besitzt (Blom et al., 2003). Die hier

ebenfalls getesteten Scyptoline A und B sowie Hofmannolin hatten jedoch keine toxischen

Effekte bei Thamnocephalus platyurus. Da Cyanopeptolin 1067A zum Untersuchungszeit-

punkt noch nicht identifiziert war, blieb eine Antwort hier offen.

Die Scytocyclamide A und B, erwiesen sich gegenüber Thamnocephalus platyurus als hoch

toxisch, so wurde bereits nach 2 h im 24 h Toxizitätstest die letale Wirkung durch diese

Peptide beobachtet. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit dem beschriebenen Fraßschutz bei

Laxaphycinen. Hormothamnion enteromorphoides scheint nicht als Nahrungsquelle für

Herbivore zu dienen, weshalb Fraßschutz verleihende Inhaltsstoffe vermutet wurden

(Pennings et al., 1997). In der untersuchten Spezies wurde Laxaphycin A als

Hauptkomponente bestimmt, jedoch kein Hormothamnin A. Für Laxaphycin A und auch für

eine Mischung der isolierten Peptide wurde Fraßschutz nachgewiesen. Bei dem hier

durchgeführtem Toxizitätstest wird der isolierte Wirkstoff zum Medium gegeben, so dass die

Crustaceen zwangsweise in Kontakt mit dem Wirkstoff kommen, während sie in der Natur

den Verzehr der cyanobakteriellen Zellen vermeiden können. Eine Wirkung der

Scytocyclamide A und B auf Daphnia magna wurde in dieser Arbeit zwar in Vorversuchen

beobachtet, die jedoch der Reproduzierung bedürfen.

4.2.3.2. Testung auf Zytotoxizität

Bereits Ende der 80iger, Anfang der 90iger Jahre wurden cyanobakterielle Inhaltsstoffe als

potentielle zytotoxische Substanzen beschrieben. Carmeli et al. (1990) beschreibt Tolytoxine

und Scytophycine mit zytotoxischen Eigenschaften. Diese Substanzen wurden aus 3

Diskussion 95

verschiedenen Scytonema-Spezies isoliert. Zur gleichen Zeit wurde ein breit angelegtes

Screening-Programm initiiert, welches Laborstämme von Cyanobakterien als Quelle neuer

antineoplastischer Substanzen als Untersuchungsgegenstand hatte (Patterson et al., 1991). Im

Verlauf dieser Untersuchungen wurden die Familien der Scytonemataceae und

Stigonemataceae als überaus produktive Erzeuger neuer zytotoxischer Substanzen

identifiziert. Die Testung der Cyanopeptoline (Scyptoline A und B sowie Hofmannolin) ergab

keine zytotoxische Wirkung gegenüber den getesteten Zelllinien. Meist wurde Zytotoxizität

nur als Routinetest durchgeführt, so dass in vielen Veröffentlichungen keine Hinweise auf

einen möglichen Wirkungsmechanismus gegeben werden. Untersuchungen zur Zytotoxizität

der Laxaphycine A und B ohne nähere Hinweise auf den Wirkungsmechanismus wurden

kürzlich durch Gbankoto et al. (2005) beschrieben.

Die in der vorgelegten Arbeit isolierten Scytocyclamide A bis C erwiesen sich in einer

Konzentration von ca. 10 µM als toxisch, wobei die Wirkung direkt nach Applikation

beobachtet wurde. Die visuelle Auswertung deutete auch auf morphologische Veränderungen

hin, bei denen blebbing beobachtet wurde (Abb. 35). Blebbing tritt bei apoptotischen

Vorgängen auf, weshalb unter anderem auch auf Apoptose getestet wurde. Die zelltoxische

Wirkung wurde an mehreren Zelllinien (Kap. 3.2.4.) belegt. Die Wirkung der Scytocyclamide

A bis C weist insofern keine Spezifität innerhalb der eingesetzten Zelllinien auf. Der erste

Eindruck ließ Zelllyse und eventuell eine Zerstörung der Zellmembran vermuten. Da die

Peptide in DMSO als Lösungsmittel gelöst waren (1µg/µl), wurde jeweils eine DMSO

Kontrolle mitgeführt (die Verdünnung des eingangs unverdünnten DMSO erfolgte durch die

Zugabe in die Kavität der Ansätze). Weitere Faktoren wie Einflüsse des Fließmittels aus den

HPLC-Läufen wurden ausgeschlossen: zum einen unterscheiden sich die Peptide in den

Retentionszeiten um bis zu 5 min, so dass Wechselwirkungen zwischen den Peptiden

ausgeschlossen werden konnten, zum anderen haben alle 3 Scytocyclamide zytotoxische

Wirkung. Cyanopeptoline, welche aus der gleichen Extraktion unter gleichen HPLC-

Bedingungen isoliert wurden, waren unwirksam. Zusätzlich wurden 2 Fließmittelfraktionen

mit unterschiedlichen Retentionszeiten zu den Scytocyclamiden gesammelt und unter

identischen Bedingungen aufbereitet und auf Wirkung getestet. Alle Kontrollen belegen, dass

die Scytocyclamide für die zytotoxische Wirkung verantwortlich sind. Da die Scytocyclamide

relativ hydrophob sind (sie eluieren erst bei hohem Anteil organischen Lösungsmittel von der

Säule), aber auch funktionelle Gruppen mit hydrophilem Charakter besitzen, wurde überlegt

inwieweit eine Detergenswirkung Ursache für die Zellschädigung sein kann. Um sich einen

Eindruck einer Detergenswirkung auf die getesteten Zellen zu machen, wurden Lösungen

Diskussion 96

verschiedener Detergentien (Tween 1 % und 0,02 %, Triton X 1 % und 0,04 %, Thesit 1 %

und 0,02 %, SDS 1 % und 0,4 %, Zwittergent 1 % und 0,2 %, Chaps 1 % und 0,5 % jeweils

Volumenprozent in H2O) auf ihre Wirkung auf HeLa-Zellen getestet. Die von den

Detergentien bewirkten Veränderungen der Zellmorphologie ließen im Vergleich mit der

Wirkung der Scytocyclamide A bis C keinen Rückschluss auf einen Zelltod durch

Detergenswirkung durch die Scytocyclamide zu. Eine weitere Überlegung war, ob eventuell

Porenbildung für die Wirkung in Frage kommt. Die Literatur beschreibt Membrankanäle

bildende Peptide mit Molekulargewichten zwischen 1.000 und 1.500 Da. Beispiele hierfür

sind das zyklische Gramicidin S (Gause et al., 1944 und Kiricsi et al., 2002) sowie

Valinomycin (z. B. Dolowy, 2001). In einem Vorversuch wurde deshalb mit Valinomycin (10

µM) ein Ionophor als Vergleichssubstanz bei den Zytotoxizitätsassays mitgeführt. Nach

Applikation des Valinomycins konnte keine direkte morphologische Veränderung an den

Zellen beobachtet werden, so dass auch hier keine zu den Scytocyclamiden A bis C

vergleichbare Wirkung vermutet wurde. Um einer möglichen Porenbildung als Mechanismus

für den durch Scytocyclamide A bis C ausgelösten Zelltod nachzugehen, wurden „lipid-

bilayer“ Ansätze durchgeführt. Eine geringfügig erhöhte Membranleitfähigkeit lieferte keinen

Hinweis auf Porenbildung bei Verwendung von Diphytanoyl-Phosphatidylcholin als

Membrankomponente.

Die strukturverwandten Laxaphycine besitzen neben der Zytotoxizität auf KB-Zellen

(Hautkrebs) und LoVo-Zellen (colorektales Adenokarzinom) (Frankmölle et al., 1992)

antifungale Wirkung u.a. gegen Aspergillus oryzae, Candida albicans, wobei Laxaphycin A

nur in Kombination mit Laxaphycin B wirkt (Bonnard et al., 1997). Die Scytocyclamide A

bis C haben dagegen keine antibakterielle und auch keine antifungale Wirkung (Kap. 3.2.2.).

Da Laxaphycin A als Reinsubstanz unwirksam gegen Pilzpathogene ist und nur in

Kombination mit Laxaphycin B wirkt, könnte das in Einklang mit den Ergebnissen zu

Scytocyclamiden stehen, welche als Reinsubstanzen und im Gemisch unwirksam sind und

bisher kein Synergiepartner gefunden wurde.

Die Scytocyclamide A bis C besitzen keine Wirkung gegenüber den getesteten

Mikroorganismen. Es wäre jedoch möglich, dass sie einen spezifischen Partner in der

Membran brauchen, um ihre Wirkung zu entfalten. Die antifungale Wirkung der Laxaphycine

könnte sich durch Ergosterol in der Zellmembran erklären lassen, Bakterien fehlt jedoch

Cholesterol in der Membran. Daher wurden ergänzend Versuche an „lipid bilayern“ mit

cholesterolhaltigen künstlichen Membranen durchgeführt (Kap. 3.2.5.), wobei für die

Scytocyclamide A bis C erhöhte Membranleitfähigkeit festgestellt wurde (persönliche

Diskussion 97

Mitteilung R. Benz, Universität Würzburg). Ob dies als Hinweis auf den

Wirkungsmechanismus zu werten ist, muss dennoch vorerst offen bleiben. Hierzu müssten

weitere valide Untersuchungen durchgeführt werden. Dies war im Rahmen dieser Arbeit nicht

mehr möglich. Um die vermutete Membranschädigung zu überprüfen, wurden Versuche zum 86Rb+-Efflux aus HT-29-Tumorzellen durchgeführt. Das Ergebnis belegte eindeutig erhöhte

Effluxraten, welche auf die Peptidwirkung zurückzuführen waren und Membranschädigung

belegen. Eine mitgeführte DMSO-Kontrolle schließt eine Beteiligung des Lösungsvermittlers

an der Membranschädigung aus.

Weiterführende Versuche wurden mit Scytocyclamid B unternommen, um die

morphologischen Veränderungen zu erklären. Mit Fluoreszenzfärbung wurde α-Tubulin und

F-actin spezifisch angefärbt (Abb. 38). Durch Phalloidin-fluoreszenzmarkierte Antikörper

(Alexa Fluor® 594 phalloidin+anti-Ratte oder anti-Maus IgG) wurde F-Aktin gefärbt. Es

ließen sich keine Veränderungen durch Scytocyclamid B am F-Aktin Zytoskelett beobachten.

Scytocyclamid B behandelte Zellen lassen keine α-Tubulinfärbung (Alexa Fluor® 488

F(ab')2+anti-α-tubulin III Antikörper) mehr erkennen. Dies legt den Schluss nahe, dass der

Wirkungsmechanismus der Zellschädigung zusätzlich über Tubulinabbau erfolgen könnte. In

der Literatur sind wenige cyanobakterielle Sekundärmetabolite beschrieben, welche auf

Tubulin wirken. So wurde von Patterson et al. (1993) das aus Scytonema sp. isolierte

Tolytoxin mit zytostatischer und antifungaler Wirkung beschrieben (siehe auch Kap. 1.7.2.4.):

Tolytoxin gehört zur Klasse der Makrolide. Die zytostatische Wirkung beruht auf der

Zerstörung der Mikrofilamente, während kein Effekt auf Mikrotubuli oder die

Intermediärfilamente beschrieben wurde. Aus Nostoc sp. wurde Cryptophycin isoliert (Kap.

1.7.2.4.). Cryptophycin wirkt als Inhibitor der Mitose und die Zellteilung wird unterbrochen.

Des Weiteren wird der Abbau von Mikrotubuli beschrieben (Chen et al., 1998). Dieses

Phänomen würde den hier beobachteten Effekten entsprechen, jedoch lassen die strukturellen

Unterschiede von Scytocyclamiden und Cryptophycinen keine Verallgemeinerung im Sinne

eines vergleichbaren Mechanismus zu. Das aus Lyngbya majuscula isolierte Curacin A besitzt

ebenfalls toxische Wirkungen auf Krebszellen, indem es in die Mitose eingreift. Curacin A

bindet dabei an die Colchicin-Bindungsstelle der Mikrotubuli (Verdier-Pinard et al., 1998)

Für Microcystine wird eine Zerstörung der Intermediärfilamente im Zusammenhang mit der

hepatotoxischen Wirkung gesehen (Ding et al., 2001). Bei der genannten Untersuchung

wurde ebenfalls die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies durch die Gabe von Microcystin LR

beobachtet, gefolgt von der Alterung der Zytoskelettstrukturen. Chen et al. (1998) vermutet,

dass reaktive Sauerstoffspezies eine elementare Rolle in der durch Microcystin LR

Diskussion 98

induzierten Zerstörung des Zytoskeletts spielen. Versuche zur Apoptose (Kap. 3.2.8.) belegten

auch für Scytocyclamide die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies. Eine direkte Verbindung

kann jedoch auch hier nicht hergestellt werden, da Microcystine weitere Effekte verursachen,

wie z. B. Hyperphosphorelierung nach Hemmung der Proteinphosphatase 1A.

Scytocyclamide hatten keine Hemmwirkung auf die Phosphatase (Kap. 3.2.1.). Weitere auf

den Wirkungsmechanismus zielende Versuche waren die Untersuchung apoptotischer

Charakteristika. Die beobachteten durch „blebbing“ verursachten „apoptotic bodies“ (Abb.

35) sind typisch für Apoptose. In der Literatur der letzten Jahre finden sich vermehrt

Untersuchungen apoptotischer Vorgänge, welche durch cyanobakterielle Inhaltsstoffe

induziert werden (Herfindal et al., 2005; Ding et al., 2003; Botha et al., 2004). Die hierzu in

der vorgelegten Arbeit durchgeführten Versuche (Kap. 3.2.8.) belegen, dass Scytocyclamid A

keine Caspase-Aktivität und kein Verlust des Mitochondrienmembranpotentials induziert.

Somit können diese Signaltransduktionswege zur Apoptoseeinleitung ausgeschlossen werden

(Kap. 3.2.8.). Die Daten aus den Versuchen zu reaktiven Sauerstoffspezies (Abb. 37) belegen,

dass reaktive Sauerstoffspezies in einen Apoptoseprozess involviert sein können.

Weiterführende Versuche sollten zur Bestätigung durchgeführt werden. So sollte die Bildung

reaktiver Sauerstofferstoffspezies durch die Zugabe von Antioxidantien wie N-Acetylcystein

zu unterbinden sein (Gottlieb et al., 2000). Membranschädigung und Apoptose schließen sich

nicht gegenseitig aus. Es wäre auch denkbar, dass mehrere Prozesse unabhängig voneinander

verlaufen. Apoptose wurde nach 5-6 h Inkubation gemessen, während die morphologischen

Veränderungen direkt nach Applikation beobachtet wurden. Dies würde für unabhängige

Prozesse sprechen. Bei den Filmaufnahmen zur Wirkung der Scytocyclamide A und B auf

HeLa und Ebl-Zellen mit einem Differential-Phasenkontrast-Mikroskop, bzw. mit einem

Phasenkontrastmikroskop konnte eine zellschädigende Wirkung in Bruchteilen von Sekunden,

bzw. in wenigen Sekunden verfolgt werden (siehe DVD im Anhang). Diese Beobachtungen

stehen wiederum in Einklang mit den Ergebnissen von der Fluoreszenzfärbung.

Weiterführende Versuche zur Klärung des Wirkungsmechanismus (ß-Tubulinfärbung, weitere

Immunohistochemische-Untersuchungen, Dosis-Wirkungsstudien, Involvierung von Ca2+-

Kanälen) könnten die bereits durchgeführten und diskutierten Experimente ergänzen.

4.3. Ökologie cyanobakterieller Sekundärstoffwechselprodukte Wie anfangs erwähnt, besiedeln Cyanobakterien viele verschiedene, teilweise extreme

Lebensräume. Die große Vielfalt an den von ihnen bewohnten ökologischen Nischen ist ein

Diskussion 99

möglicher Hinweis auf einen hohen Grad biologischer Adaptation, welcher es den

Cyanobakterien ermöglicht sich erfolgreich in der Natur zu behaupten. Mit ein Grund dafür

könnte ihre Fähigkeit sein, ein breites Spektrum an defensiven Metaboliten zu produzieren.

Diese Sekundärstoffwechselprodukte zeigen ein breites Spektrum biologischer Aktivitäten,

vor allem wachstumshemmende oder entwicklungshemmende Eigenschaften (Burja et al.,

2002). Unter den Sekundärstoffwechselprodukten aus Cyanobakterien finden sich z. B.

verschiedene Toxine (s. Kap. 1.7.1.). Sie gehören zu den meist untersuchten Stoffen, da von

ihnen potentielle gesundheitliche Gefahr ausgeht. Über die Funktion cyanobakterieller Toxine

gibt es, wie auch bei vielen anderen bioaktiven Sekundärmetaboliten von Bakterien, Algen

oder Pilzen, eher Spekulationen als gesicherte Erkenntnisse. Unter anderem wurde über die

Funktion von Peptiden als Speicherstoffe spekuliert, was jedoch vermutlich ausgeschlossen

werden kann, da auch unter Mangelbedingungen kein nennenswerter Abbau der Peptide

innerhalb der Zelle beobachtet wird (Chorus et al., 1999). Daneben wurde

Lichtschutzfunktion diskutiert, jedoch ist dies auch eher unwahrscheinlich, da es ebenso

Spezies gibt, welche keine Toxinbildung haben. In den meisten Fällen ist nicht einmal

bekannt, wie die Biosynthese bzw. die Akkumulation der Verbindungen reguliert wird, oder

ob es induzierende Faktoren gibt, welche dazu führen, dass manche Spezies toxinbildend ist,

während verwandte Spezies dieses Merkmal nicht aufweisen. Eine nahe liegende Bedeutung

für die Bildung von Toxinen könnte in der Abwehr von Feinden liegen (Vining, 1990). Dieser

Kontext könnte erklären, dass „schutzlose“ marine Invertebraten, welche sich kaum gegen

Feinde wehren oder vor ihnen fliehen können bioaktive Substanzen bilden, während das für

bewegliche oder gepanzerte Meeresbewohner nicht gilt (Pawlik, 1993). Die Abwehr von

Fraßfeinden kann sich in Form einer „chemischen Abwehr“ äußern. Die direkte Bekämpfung

von Nahrungskonkurrenten wäre über die Absonderung von Toxinen möglich, doch trotz

intensiver Forschung gibt es bisher keinen Beleg, dass die Toxine aus der Zelle exportiert

werden. Bisher gelten cyanobakterielle Toxine als Endotoxine (Watanabe et al., 1996).

Jüngste Daten von Sequenzanalysen des Gens mcyH lassen einen ABC-Transporter für dieses

Protein vermuten, welcher Verwandschaft zu Proteinen aufweist, die bei anderen Bakterien

für den Export von Peptiden zuständig sind (Boerner, 2001). Der Export konnte jedoch noch

nicht nachgewiesen werden. Das im Medium nachweisbare Toxin könnte ebenso durch

Zelllyse freigesetzt worden sein. Schwieriger als bei den toxischen Sekundärmetaboliten fällt

es eine Funktion für die nicht-toxischen Peptide zu postulieren. Viele der nicht-toxischen

Peptide sind Hemmstoffe von Proteasen (Fastner et al., 2001). Protease-Inhibition kann

weitreichende Folgen für den Fraßfeind haben. Bei Insekten konnte beispielsweise ein

Diskussion 100

Aminosäuredefizit nach Aufnahme eines Proteasehemmstoffes beobachtet werden (Jongsma

und Bolter, 1997). Cyanopeptolin SS wirkt auf Primärkonsumenten von Cyanobakterien, wie

Daphnien toxisch (Jakobi et al., 1996). Die in dieser Arbeit getesteten Cyanopeptoline aus

Scytonema hofmanni PCC 7110 hatten keinen Effekt auf Daphnien. Jedoch verursachen die

isolierten Peptide ausgeprägte Hemmung von Serin-Proteasen. Dies könnte durchaus auch

Effekte bei den Primärkonsumenten verursachen wie sie von Agrawal et al. (2005)

beschrieben wurden: Ein Zellextrakt von Microcystis sp. PCC 7806 verursachte Hemmung

der Verdauungsenzyme aus dem Darm von Daphnien. Ein Beitrag zu einer möglichen

ökologischen Funktion der Peptide aus Scytonema hofmanni PCC 7110 wurde in dieser Arbeit

durch die Toxizitätstests von Cyanopeptolinen und Scytocyclamiden geleistet. So wurde eine

toxische Wirkung der Scytocyclamide auf Thamnocephalus platyurus, einem Fraßfeind in

Süßwasser, festgestellt. Daphnien wurden durch die isolierten Scytocyclamide A bzw. B nicht

geschädigt. Für Oscillapeptin J wurde ebenfalls eine toxische Wirkung auf Thamnocephalus

beschrieben (Blom et al., 2003). Oscillapeptin J besitzt die Charakteristika eines

Cyanopeptolins, und in der Aminosäuresequenz ist Arginin mit dem N-Terminus der Ahp-

Gruppe verknüpft, ein Strukturmerkmal was auch in dem neu charakterisierten Cyanopeptolin

1067A zu finden ist. Eine Hemmung ganz anderer Art wurde kürzlich von Becher et al.

(2005) beschrieben: das einen Biofilm bildende Cyanobakterium Fischerella sp. (ATCC

43239) produziert Sekundärstoffwechselprodukte, welche insektizid auf benthnische Insekten

Larven wirkt.

Die besprochene strukturelle Vielfalt der Metabolite aus Cyanobakterien, sowie ihre

verschiedenen Lebensräume bieten somit viel Platz für weitere Spekulationen über die

Funktion dieser Stoffwechselprodukte. Die gefundenen Bioaktivitäten sind aber auch immer

vom benutzten Aktivitätstest abhängig, so dass die eigentliche Funktion nicht unbedingt mit

den beschriebenen Bioaktivitäten übereinstimmen muss. Die in dieser Arbeit angewandten

Aktivitätstests geben einen kleinen Eindruck möglicher Bioaktivität wider. Bei den

beschriebenen Bioaktivitäten muss beachtet werden, dass die in vitro Versuche nur geringe

Rückschlüsse auf die Funktion oder Wirkung unter natürlichen Bedingungen zu lassen.

4.4. Therapeutische Relevanz peptidischer Sekundärmetabolite Wie in der Einleitung angedeutet haben besonders Peptide und Polyketide aus Bakterien und

Pilzen ein breites Wirkungsspektrum, das von antibiotischen über zytostatische bis zu

immunsuppressiven Eigenschaften reicht. Charakteristisch sind zyklische Strukturen, der

Diskussion 101

Einbau nicht-proteinogener Aminosäuren und Fettsäuren sowie postsynthetische

Modifikationen (Sieber und Marahiel, 2003). Die in der vorgelegten Arbeit isolierten

Scytocyclamide aus Scytonema hofmanni PCC 7110 besitzen Ähnlichkeit zu Laxaphycinen

aus Anabaena laxa (Frankmölle et al., 1992), jedoch wurden im Gegensatz zu diesen weder

bei den Scytocyclamiden noch beim Peptidgemisch der 3 Scytocyclamide antibiotische

Wirkung festgestellt. Aus Scytonema sp. TISTR 8208 wurde von einer ca. 1.400 Da großen

Verbindung berichtet, welche antibiotische Wirksamkeit vergleichbar mit Tetracyclin gegen

gram-positive Bakterien, pathogene Hefen und filamentöse Pilze besitzt (Chetsumon et al.,

1998). Es gibt weitere cyanobakterielle Peptide, welche eine „multidrug resistance-reversing

activity“ besitzen. Beispiele hierfür sind die Cryptophycine aus Nostoc Arten oder das

zyklische Hexapeptid Dendroamid A aus Stigonema dendroideum (Smith und Zhang, 1996;

Ogino et al., 1996).

Neben antibiotischer Wirksamkeit wird vermehrt nach zytostatischen Eigenschaften gesucht.

Einige der aus Cyanobakterien isolierten Substanzen oder Derivate haben Eingang in

klinische Prüfphasen erlangt. Darunter auch Dolastatin-10, welches sich in Phase II der

klinischen Prüfung befindet, ebenso die synthetischen Analoga Cemadotin und ILX-651,

(Haefner, 2003). Dolastatine wirken antimitotisch und greifen in die Tubulinpolymerisation

ein. Einen anderen bisher einzigartigen Wirkungsmechanismus hat Kahalalide F, ein

zyklisches Depsipeptid. Kahalalide F gehört zu einer Familie neuartiger

dehydroaminobuttersäure-haltiger Peptide und verändert die Funktion der lysosomalen

Zellmembran (Jimeno et al. 2004) und führt dadurch zum Zelltod. Im Gegensatz zu anderen

Zytostatika wird hier die Erbinformation der Tumorzellen oder deren Proteinsynthese nicht

beeinflusst. Das Peptid wurde aus der vor Hawaii lebenden Meeresschnecke Elysia rufescens

gewonnen, jedoch wird die Herkunft der Substanz einer Grünalge (Bryopsis sp.)

zugeschrieben (Hamann et al., 1993) Für viele aus marinen Invertebraten gewonnenen

Substanzen wird auch eine mikrobielle Herkunft vermutet, wie das auch für die Dolastatine

gilt (Haefner, 2003). Die zytotoxischen Laxaphycine und die in der vorliegenden Arbeit neu

charakterisierten Scytocyclamide weisen ebenfalls Dehydroaminobuttersäure als Baustein auf,

so dass diese Peptide Leitstrukturcharakter besitzen könnten. Ein aus Lyngbya majuscula

isoliertes zyklisches Depsipeptid Apratoxin A besitzt starke in vitro Zytotoxizität auf humane

Tumorzelllinien im Bereich von 0,36 bis 0,52 nM, dagegen nur geringe in vivo Aktivität

gegen Darmkrebs und Brustkrebs (Luesch et al., 2001). Tubulin ist ein Angriffspunkt für

Zytostatika. So werden Colchicin aus der Herbstzeitlosen (Colchicum autumnale) und

Paclitaxel aus Taxus brevifolia (bzw. partialsynthetisch aus Baccatin III aus Taxus baccata) in

Diskussion 102

der Pharmakotherapie eingesetzt. Neue Leitsubstanzen sind von großem Interesse, da die

bekannten antimicrotubulären Substanzen gute Substrate für Effluxpumpen sind, welche den

Wirkstoff wieder aus der Zelle transportieren und somit die Wirksamkeit verringern und zur

Resistenzentwicklung beitragen (Endicott et al., 1989). Für die ebenfalls in dieser Arbeit

beschriebenen Cyanopeptoline konnte keine zytotoxische Aktivität beschrieben werden. In

der Literatur gibt es jedoch Hinweise, dass Cyanopeptoline zytotoxisch sein können.

Beispielhaft seien die aus Symploca sp. isolierten Tasipeptine genannt, welche ihre Wirkung

bis zu einem IC50-Wert von 0,82 µM entfalten (Williams et al., 2003). Cyanopeptoline sind

häufig Inhibitoren von Proteasen. Die neu charakterisierte Strukturvariante in Cyanopeptolin

1067A besitzt mit einem IC50-Wert von 60 nM starke Hemmwirkung auf Trypsin. Des

Weiteren wurden durch die in Scytonema hofmanni PCC 7110 gefundenen Cyanopeptoline

1067A, bzw. 946A Plasmin und Elastase gehemmt (Abb. 30 und 31). Proteasen spielen eine

Schlüsselrolle bei pathologischen Prozessen. Fehlregulation von Proteasen spielt eine Rolle

bei z. B. rheumatoider Arthritis, kardiovaskulären Erkrankungen, bakteriellen oder viralen

Infektionen, Krebs oder der Alzheimer Krankheit. In allen Organen unseres Körpers besitzen

Proteasen essentielle Funktionen (Lendeckel und Hooper, 2004 und 2005). Die

kristallographischen Studien mit cyanobakteriellen Peptiden und ihren Zielenzymen können

dazu beitragen die Struktur-Wirkungsbeziehungen zu erkennen und ggf. Leitsubstanzen für

potentielle Pharmaka zu entwickeln oder zu modifizieren. Bei den Cyanopeptolinen wurde

Ko-Kristallisation von A90720A aus Microchaete lokatensis mit Trypsin und bei Scytonema

hofmanni von Scyptolin A mit Elastase erreicht (Lee et al.,1994; Matern et al., 2003), bei

Microcystinen LR mit der Proteinphosphatase 1 (Goldberg et al., 1995), bei Aeruginosin 98B

mit Trypsin (Sandler et al., 1998). Anhand der gewonnen Informationen versucht man

synthetische Inhibitoren der Proteasen zu entwickeln (Walker et al., 2001). Es bleibt

anzumerken, dass Peptid-Substrate als Arzneistoffe für die Hemmung von Proteasen nur

bedingt geeignet sind, da sie eine gute orale Bioverfügbarkeit ausschließen. Bei einer

parenteralen Applikationsform muss eine geeignete Formulierung gefunden werden, welche

ausreichende Bioverfügbarkeit gewährleistet. Eine mögliche Anwendung als Arzneistoff setzt

voraus, dass keine hämolytische Aktivität vom Wirkstoff ausgeht. Der in dieser Arbeit

durchgeführte Versuch zur Hämolyse (Kap. 3.2.7.) kann diese nicht gänzlich ausschließen;

Hämolyse hätte jedoch bei mikroskopischer Beobachtung anhand des Aufplatzens der

Erythrozyten und dem Austreten des Blutfarbstoffs beobachtet werden müssen.

Diskussion 103

4.5. Ausblick Die Ergebnisse der vorgelegten Arbeit lassen Spielraum für vielfältige Folgeuntersuchungen

und Ergänzungen. So war es im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr möglich weitere

Untersuchungen zur Konfigurationsbestimmung durchzuführen. Dabei wäre vor allem das

zuletzt aufgeklärte Scytocyclamide B von besonderem Interesse, da hier eine identische

Aminosäuresequenz zu Laxaphycin D gefunden wurde. Auch wären molekulargenetische

Untersuchungen von Interesse, welche eine mögliche Verwandschaft von Scytonema

hofmanni zu Anabaena laxa, welche die Laxaphycine bilden, belegen könnten. Dies gilt

insbesondere für die NRPS-Gene.

Für die Laxaphycine wurde eine antifungale Wirkung beschrieben (Frankmölle et al., 1992),

welche bei den hier untersuchten Scytocyclamiden nicht belegt werden konnte. Jedoch ist zu

bedenken, dass diese Wirkung nur in Form eines Synergie-Effektes zu Stande kam und

Laxaphycin A als Reinsubstanz nicht antifungal wirksam ist. Es stellt sich nun die Frage, ob

auch Scytonema Peptide produziert, die antifungale Wirkung induzieren können.

In Bezug auf einen möglichen Mechanismus zur Zytotoxizität wurden viele Ansatzpunkte

durch die in dieser Arbeit durchgeführten Versuche gefunden, welche weiterer

Untersuchungen bedürfen und ein breites Feld für Folgeversuche bieten: Es wurden

Fluoreszenzfärbungen mit α-Tubulin und F-actin durchgeführt, so dass ergänzend geprüft

werden müsste, ob ß-Tubulin ebenfalls abgebaut wird. Des Weiteren bietet sich hier die

Möglichkeit Dosis-Wirkungs-Beziehungen näher zu untersuchen. Fluoreszenzfärbungen den

Zellkern betreffend wurden ebenfalls nicht vorgenommen. In Zusammenhang mit der

Tubulindepolymerisation ist auch ein möglicher Zusammenhang mit der Membranschädigung

zu sehen, da hohe intrazelluläre Ca2+-Konzentrationen zu Tubulinabbau führen können

(O´Brien et al. 1997). Auch wäre eine Beteiligung von Ca2+-Kanälen denkbar, welche in

diesem Zusammenhang untersucht werden müssten. Ebenso müssten die zur Apoptose

durchgeführten Versuche ergänzt werden, um eine Zelltoxizität über einen

Apoptosemechanismus zu bestätigen oder zu widerlegen. So müsste man beispielsweise die

Wirkung reaktiver Sauerstoffspezies durch die Zugabe von Antioxidantien oder

Radikalfängern mildern können.

Die Hemmung von Trypsin mit Cyanopeptolin 1067A im nmol-Bereich würde eine

Untersuchung der Hemmwirkung auf molekularer Ebene ermöglichen, so dass hier

Kristallisationsversuche angestrebt werden könnten. Dies würde einen Vergleich zu der

Wirkung von Scyptolin A auf die Serin-Protease Elastase zulassen (Matern et al., 2003).

Diskussion 104

Eine Fortführung der Toxizitätsversuche auf Thamnocephalus platyurus mit Cyanopeptolin

1067A wäre ebenfalls interessant, da die aus Scytonema hofmanni isolierten Cyanopeptolin

(Scyptolin A und B sowie Hofmannolin) keine Wirkung zeigten (Kap. 3.2.3.), Cyanopeptolin

1067A jedoch strukturelle Ähnlichkeit zu dem wirksamen Oscillapeptin J besitzt (Blom et al.,

2003). Auch könnte eine ökologische Funktion der Peptide durch Versuche zur Entwicklung

von Fischen und Amphibien (Oberemm et al., 1999) untersucht werden.

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Danksagung 119

Danksagung Die vorliegende Arbeit entstand am Institut für Biologie II in der Abteilung für Mikrobiologie, der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. J. Weckesser. Herrn Prof. Dr. J. Weckesser danke ich für die Überlassung des überaus interessanten Themas, die wissenschaftliche Betreuung dieser Arbeit und seine Unterstützung. Allen früheren und jetzigen Mitarbeitern im Labor „Weckesser“ danke ich für die Hilfsbereitschaft, Diskussionsbereitschaft…: Ute, Ximena, Manuel, Andreas und Karin. Ein spezieller Dank geht an Frau Silvia Radziwill für ihre stetige Hilfsbereitschaft und Unterstützung. Herrn Prof. Dr. G. Fuchs danke ich für die Aufnahme in das Graduiertenkolleg „Biochemie der Enzyme“, sowie für finanzielle Unterstützung und seine stetige Hilfsbereitschaft. Großer Dank gilt sämtlichen Kooperationspartnern, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben: Lukas Oberer, Novartis Pharma AG, Basel: NMR-Analytik und Diksussionbereitschaft Dr. M. Erhard, AnagnosTec GmbH, Luckenwalde: MALDI-MS-Analysen Drs. G. Modjesch, F. Volk, P. Bissel, Pharmazeutisches Institut, Universität Freiburg: FT-IR-Messungen Prof. Dr. W. Haehnel, Dr. F. Drepper, Frau B. Knapp: Institut für Biologie II, Biochemie der Pflanzen, Universität Freiburg: MS-Workshop und LTQ-FTICR-MS-Messungen Prof. Jüttner, Frau Dr. J. Blom, Limnologische Station, Universität Zürich: LC-MS-, GC-MS-Messungen, Toxizitätsassays; Prof. Dr. M. Simon, Dr. J. Pardo, Max-Planck-Institut Freiburg: Apoptoseuntersuchungen Dr. Pelz, Frau A. Wittmer: Institut für medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Universität Freiburg: Antimikrobielle Untersuchungen, Hämolyse Prof. Dr. R. Benz, Frau E. Maier: Biozentrum, Universität Würzburg: Untersuchungen an künstlichen Membranen Prof. Dr. K. Aktories, Frau Dr. G. Schmidt, Dr. J. Leemhuis, Dr. T. Giesemann, Institut für Pharmakologie, Universität Freiburg: Zelltoxizität, 86Rb+-Efflux, Immunhistochemische Untersuchungen, Mikroskopische Aufnahmen Hochschuldidaktikzentrum der Universitäten des Landes Baden-Württemberg: Fortbildungen Graduiertenkolleg „Biochemie der Enzyme“: Stipendium, Reisemittel, Fortbildung Allen nicht namentlich genannten Personen, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben, danke ich für die entgegengebrachte Unterstützung (Werkstatt, Bibliothek, Labor „Fuchs“, Graduiertenkolleg,…)

Danksagung 120

Abschließend nochmals hervorheben und meinen besonderen Dank aussprechen möchte ich Prof. Dr. J. Weckesser und Prof. Dr. G. Fuchs, Lukas Oberer, Frau Dr. J. Blom, Frau Dr. G. Schmidt, Prof. Dr. M. Simon, Dr. J. Pardo, Dr. J. Leemhuis, Frau S. Radziwill und M. Kraft, die mich bestmöglichst unterstützt haben. Besonders danken möchte ich meinen Eltern, die mich immer unterstützt und meine Ausbildung gefördert haben sowie allen Freunden…und natürlich Tina für ihre Unterstützung.

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