Zielsetzung:Novasoy ist eine auf Soja basierende Nahrungsergänzungsmittel-Zutat, die reich an zwei wichtigen Isoflavonen Daidzein und Genistein ist. Isoflavone von Novasoy werden ausschließlich aus Soja extrahiert und zwar auf schonendste Weise, um das natürliche Profil und das Verhältnis der Isoflavone und

der anderen natürlichen Komponenten so zu erhalten, wie es in Sojabohnen vorhanden ist. Ziel dieser Arbeit ist es eine HPLC-Methode zur Isolierung, Trennung und Quantifizierung der Soja-Isoflavone Daidzein und Genistein im Novasoy-Extrakt- und Hydrolysat zu entwickeln. Mit der entwickelten

Methode werden die Kapseln (auf Basis von Novasoy 600) untersucht, die vom Lehrstuhl für Pharmazeutische Technik und Biopharmazie, Universität Würzburg für den Lehrstuhl für Lebensmittelchemie zum Zweck einer Interventionsstudie hergestellt wurden.

Entwicklung einer HPLC-Methode zur Isolierung, Trennung und Quantifizierung der Isoflavone Daidzein und Genistein im Novasoy-

Extrakt- und HydrolysatWissenschaftliche Abschlussarbeit von Olga Engel Betreuer: Dr. Harald Esch

Universität Würzburg, Institut für Pharmazie und Lebensmittelchemie , Lehrstuhl für Lebensmittelchemie, Am Hubland, 97074 Würzburg, Deutschland

Kalibriergerade von GEN bzw. von DAI mit IS (100 ng Apigenin). Links:

Kalibriergerade für GEN; gemessene GEN-Menge 5 – 15 ng,

Geradengleichung y = 0,11817x – 0,11163, R² = 0,999. Rechts:

Kalibriergerade für DAI; gemessene DAI-Menge 10-30 ng, Geradengleichung

y = 0,05062x – 0,04935, R² =0,998.

3. Kalibrierung mit internem Standard

1.Optimierung der Probenaufbereitung

4. Quantifizierung von Novasoy 600 sowie der Kapseln auf Basis von

Novasoy 600

Abb. 6

Übersicht der ermittelten DAI- und GEN-Gehalte von Novasoy 600 sowie der für die

Interventionsstudie hergestellten Kapseln auf Basis von Novasoy 600 nach der

Ultraschallextraktion mit Acetonitril/Wasser-Mischung (1:1) und saurer Hydrolyse mit konz.

Salzsäure.

Tab. 1

2. Optimierte Gradientenmethode

0 10 20 30 40 50 60

-1

0

1

2

3

4

5

Ab

so

rptio

n 2

60

nm

(m

AU

)

Zeit (min)

DAIGEN

IS

Hydrolyse, 1M HCl

0

10

20

30

40

50

0

10

20

30

40

50

DAIGEN

IS

Aceto

nitrila

nte

il (%)

Hydrolyse, konz. HCl

0 10 20 30 40 50 60

-1

0

1

2

3

4

5

Zeit (min)

HPLC-DAD Chromatogrammen von jeweils 130 ng Novasoy 400-Hydrolysat mit 100 ng

Apigenin als IS nach der Extraktion mit Acetonitril 50% (v/v) und anschließender

Hydrolyse mit 1M HCL (links) bzw. konz. HCl (rechts). HPLC: Agilent 1100, Säule:

Eurospher-100, RP-18, 250×4 mm i. D., 5 µm; Säulentemperatur: RT; Fließmittel: (A)

Wasser mit 0,1% (v/v) Ameisensäure, (B) Acetonitril mit 0,1% (v/v) Ameisensäure;

Gradient: 5 min 15% B, 36 min 29% B, 44 min 35% B, 60 min 15% B; Fluss: 1 ml/min;

Injektionsvolumen: 5 µl; Detektion: 260 nm.

Abb. 3

Vergleich der HydrolysenVergleich der Extraktionen

HPLC-DAD Chromatogrammen von jeweils 4,3 µg Novasoy 400-Extrakt mit 100 ng IS;

rechts: Extraktion mit Acetonitril 50% (v/v); links: Extraktion mit Methanol 80% (v/v). HPLC:

Agilent 1100, Säule: Eurospher-100, RP-18, 250×4 mm i. D., 5 µm; Säulentemperatur: RT;

Fließmittel: (A) Wasser mit 0,1% (v/v) Ameisensäure, (B) Acetonitril mit 0,1% (v/v)

Ameisensäure; Gradient: 5 min 15% B, 36 min 29% B, 44 min 35% B, 60 min 15% B; Fluss:

1 ml/min; Injektionsvolumen: 5 µl; Detektion: 260 nm.

Abb. 1

4 6 8 10 12 14 16

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0

10 15 20 25 30 35

Flä

ch

en

ve

rhä

ltn

is G

EN

/ I

S

GEN-Menge (ng)

GEN

Flä

ch

en

ve

rhä

ltn

is D

AI

/ IS

DAI-Menge (ng)

DAI

0,0

0,5

1,0

1,5

Pe

akflä

ch

en

ve

rhä

ltn

is D

AI

bzw

. G

EN

/ I

S

MeOH 50% ACN 80%

HPLC-DAD Chromatogramme von 1,5 µg Novasoy 600-Acetonitril-Extrakt (links) und 63 ng

Novasoy 600-Hydrolysat (rechts) mit jeweils 100 ng Apigenin als IS. HPLC: Agilent 1100,

Säule: Eurospher-100, RP-18, 250×4 mm i. D., 5 µm; Säulentemperatur: RT; Fließmittel: (A)

Wasser mit 0,1% (v/v) Ameisensäure, (B) Acetonitril mit 0,1% (v/v) Ameisensäure; Gradient: 0

min 23% B, 30 min 35% B, 35 min 23% B, 40 min 100% B, 45 min 100% B, 50 min 23% B, 60

min 23% B; Fluss: 1 ml/min; Injektionsvolumen: 5 µl; Detektion: 260 nm.

Abb. 5

Peakflächenverhältnis DAI-bzw.

GEN / IS in Acetonitril-und

Methanol-Mischungen

Abb. 2

Ergebnis:

Die Extraktion der Soja-Isoflavone

mit Acetonitril/Wasser-Mischung

(1:1) wird bevorzugt

Ergebnis:

Die konzentrierte Salzsäure hat

im Vergleich zu 1M Salzsäure

eine stärkere Hydrolysekraft.

Peakflächenverhältnis DAI-bzw. GEN /

IS, erhalten nach der Hydrolyse mit

1M HCl bzw. konz. HCL

Abb. 4

0

10

20

30

40

50

ISGENDAI

MeOH-Extrakt

Zeit (min)

0

10

20

30

40

50

DAI GENIS

Aceto

nitrila

nte

il (%)

ACN-Extrakt

0 10 20 30 40 50 60

0

3

6

60

90

120

Zeit (min)

Absorp

tion 2

60 n

m (

mA

U)

0 10 20 30 40 50 60

0

3

6

60

90

120

0,0

0,6

1,2

1,8

Pe

akf

läch

en

verh

ältn

is D

AI b

zw.

GE

N /

IS

1M HCL konz. HCl

Extraktion

Methanol/Wasser (8:2) Acetonitril/Wasser (1:1)

Novasoy

Ultraschallbad (55°C, 2h)

Filtration (0,45 µm PVDF)

HPLC-DAD-Analyse

HydrolyseNovasoy-Extrakt

1M Salzsäure konz. Salzsäure

Wasserbad (85°C, 2h)

Neutralisation (mit 25% (v/v) Ammoniak)

Filtration (0,45 µm PVDF)

HPLC-DAD-Analyse

0 10 20 30 40

0

2

4

6

8

0 5 10 15 20 25 30 35

0

3

60

90

120

Zeit (min)

Ab

so

rptio

n 2

60

nm

(m

AU

)

ACN-Extrakt

10

20

30

40

50

DAIGEN

IS

Ace

ton

itrilan

teil (%

)

Zeit (min)

DAIGEN

IS

konz. HCl-Hydrolysat

10

20

30

40

50

Gruppe Extrakt Hyrolysat Extrakt Hydrolysat

DAI-Gehalt

(mg/Kapsel)

GEN-Gehalt

(mg/Kapsel)

1 1,67 ± 0,08 (4,7%) 36,08 ± 2,96 (8,2%) 0,79 ± 0,04 (5,1%) 30,83 ± 3,75

(12,2%)

2 0,80 ± 0,09 (11,3%) 16,23 ± 1,59 (8,9%) 0,39 ± 0,04 (10,3%) 13,17 ± 0,90 (6,8%)

3 kein IF kein IF kein IF kein IF

4 0,99 ± 0,06 (6,0%) 23,82 ± 3,43 (14,4%) 0,47 ± 0,03 (6,4%) 18,92 ± 0,90 (4,7%)

DAI -Gehalt

(mg/g)

GEN-Gehalt

(mg/g)

Novasoy 600 12,84 ± 0,32

(2,5%)

292,02 ± 16,23

(5,6%)

6,12 ± 0,10

(1,6%)

217, 71 ± 19,01

(8,7%)