Das Cytoskelett eukaryotischer Zellen (ein dynamisches ... · 3 Aktin-Filamente stabilisieren und...
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Das Cytoskelett eukaryotischer Zellen(ein dynamisches, filamentöses Netzwerk)
Vorlesung 2015
Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.
Netzwerk aus
fibrösen
Elementen(hier: nach Extraktion einer Karotten-Zelle in
Anwesenheit von Detergenz)
Struktur und Funktion von Cytoskelett-Komponenten
Mikrotubuli Mikrofilamente Intermediärfilamente
bei Tieren ! eventuell auch bei Pflanzen !
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Monomer: Protein mit endständigen globulären Bereichen und einem mittleren helikalen Bereich (ca. 300 Aminosäuren).
• Parallele Anordnung der Monomere im Dimer
• Antiparallele Anordnung zweier Dimere zum Tetramer
Intermediär-
filamente bilden
Netze aus!
Beispiel: Lamine
(nukleäre Lamina)
10-40 Kandidaten (in Arabidopsis!)
Intermediär-
filamente
Vorlesung 2016
Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.
Monomer
Dimer
Tetramer
Protofilament
Filament
Polarität!
Mitose
Nukleoplasma
Cytoplasma
EM-Aufnahme des Nukleus einer Tabak-Zelle mit Kernporen (Gefrierbruch-Technik).
Intermediärfilamente
Beispiel: Lamin-Netzwerk (und nukleäre Lamina)
From: Heese-Peck & Raikhel (1998). The nuclear pore complex. Plant Mol Biol. 38:145-162. Review.
Kernporen-Komplex
Netzwerk
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Aktin-Filamentestabilisieren und verändern die Zellform
geben Struktur (zusammen mit Microtubuli), steuern Bewegungen, vermitteln bei Zellteilung
Vorlesung 2016
Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.
„Plus“-Ende
„Minus“-Ende
„Plus“-
Ende
„Minus“-
Ende
G-Aktin
(offen)
F-Aktin
(geschlossen)
F-Aktin-
Filament
Vorlesung 2016
Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.
Mikrotubuli-
Struktur
Tubulin-Untereinheit
Dimere: α- und β-Tubuline bilden Heterodimere mit polarer Ausrichtung (haben dadurch plus und minus-Enden)
Vermitteln Zelluläre Bewegungen von Geißeln, Cilien und Organellen (via Motor-Proteine)
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• Cytoskelett-Elemente sind dynamisch(zeigen gleichzeitig Bildung und Zerfall)
• ihre Polymerisation/Depolymerisation wird durch Bindung und Hydrolyse von Nukleotiden vermittelt (ATP bei Aktin, GTP bei Mikrotubuli)
• Cytoskelett-Elemente wachsen polar (nur an einem Ende)
„Wachstumskurve“ eines
Cytoskelett-Elements
Dynamische Stabilität
Vorlesung 2016
Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.
Beispiele für „treadmilling“ (auf der Stelle treten - dynamische Stabilität)
Aktin-Filament
Mikrotubuli
Vorlesung 2016
Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.
WachsenGTP-gebundene Tubuliun-Dimere
SchrumpfenGDP-gebundene Tubuliun-Dimere
„Plus“-
Ende
„Minus“-
Ende
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Visualisierung des Cytoskeletts
Vorlesung 2016
Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.
HEUTE: stabile oder transiente Expression von Fusionsproteinen (GFP- oder RFP-Derivate)
Markierung mit fluoreszierenden Substanzen, die an polymerisiertes Aktin, Tubulin (oder deren freie Komponenten), bzw. assoziierte Proteine binden (wie MAPs = Microtubuli-Associated Proteins).
2. Direkt
Einbau markierter Komponenten
1. Indirekt
Mikro-Injektion markierter Komponenten
YFP-MAP4
Julia Frank, 2005
Micro-
tubuli
Transiente Expression in Tabak-Protoplasten (24 h)
chlorophyll merge Bright field merge
Protoplasten = Pflanzenzellen ohne Polarität (anders als im Gewebe)
MAP, Microtubule-
associated protein
YFP-mTalin
Actin
chlorophyll merge Bright field merge
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Die Orientierung der Mikrotubuli legt die Zellorientierung, Wandtextur und Dehnungsrichtung von wachsenden Pflanzenzellen fest.
Mikrotubuli und Wandtextur
Vorlesung 2016
Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.
Zur Erinnerung!
MOR1 (für Microtubule ORganization)
gehört zu einer evolutionär alten Gruppe von Microtubuli-assoziierten Proteinen (MAPs)
mor1-Mutanten zeigen kaum Zellstreckung!
From: Whittington et al. (2001) MOR1 is essential for organizing
cortical microtubules in plants. Nature 411: 610-613.
nur isotropes
Zellwachstum
Thermo-sensitiver
Phänotyp
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anti-Tubulin Immunfluoreszenz (nach 2 h bei 29°C)
Wildtyp mor1-1
mor1-Mutanten zeigen fragmentierte Mikrotubuli (Temperatur-abhängiger, konditionaler Phänotyp)
Nachweis: Fluorochrom-markierte Sekundär-
Antikörper nach Bindung an α-Tubulin Primär-Antikörper
MT
verkürzt
Signal
The microfibril length-regulation
hypothesis
Structural properties of cellulose microfibrils in
wild-type and microtubule-disrupted cells before
and during cell expansion (Wasteneys, 2004)
a, In wild-type, cortical microtubules are arranged parallel to each other at the cell periphery close to the PM. Cellulose microfibrils are produced by cellulose synthase complexes at the PM in a highly ordered arrangement parallel to cortical microtubules. Those microfibrils are long and strong enough to resist turgor pressure. Disrupted microtubules in the mor1
mutant (grown at 29°C). Although cortical microtubules are disorganized, cellulose synthase complexes continue to produce cellulose microfibrils parallel to one another. Structural anomalies result in relatively short microfibrils.
b, In wildtype, cellulose microfibrils are composed of long β1,4-linked glucan chains. Long microfibrils require a high
degree of cellulose polymerization and crystallization, and/or
a relatively long life span of cellulose synthase complexes. These long microfibrils move apart while remaining parallel to each other during expansion and cells undergo anisotropic growth. In case of microtubule-disrupted cells, cellulose microfibrils might be short due to: (1) reduced cellulose crystallinity, (2) a low degree of cellulose polymerization or (3) short life span of cellulose synthase complexes. Microfibrils produced in the absence of well-organized cortical microtubules may not have enough mechanical strength to resist turgor pressure during the expansion, leading to fragmentation of microfibrils. During expansion, short microfibrils move apart from each other both in the direction of their orientation as well in the normal longitudinal direction, causing cells to lose growth anisotropy.
From:
Wasteneys & Fujita (2006). Establishing and maintaining axial growth: wall mechanical properties and the cytoskeleton. J. Plant Res. 119: 5-10.
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Fig. 8. Lechner et al. (2012) J Cell Sci 125: 4812-4821
Putative microtubule-binding domain and interaction with microtubules. (A) The N-terminal sequence of MOR1 was aligned with three other representatives of the subgroup with five TOG domains of the XMAP215
family using ClustalW2. MOR1 has an additional insert of five amino acids containing a putative microtubule-binding motif ‘KLLK’ (red box). (B) (B) The model shows the interaction of the first two TOG domains (blue) with a protofilament (grey). The putative microtubule-binding
domain is shown in red. The N-terminal tag (purple) inhibits binding to the protofilament, whereas the wild-type construct has moderate affinity. The mor1-1 point mutation (red X) increases the affinity for microtubules. (C) The binding affinity of the TOG12 constructs has different effects on microtubule dynamics in vitro. At the microtubule plus-end, constructs with an N-terminal tag have no effect. The wild-type construct can promote microtubule growth and diffuse along the microtubule lattice. Constructs with the mor1-1 point mutation bind too strongly to microtubules and therefore do not diffuse along the microtubule lattice. TOG12mor1-1 is unstable when not bound to microtubules (faint version) but when strongly bound to microtubules it inhibits shrinkage.
Die N-terminale TOG-Domäne von MOR1 moduliert die Affinität für Microtubuli-Polymere
less dynamic = more staticless dynamic = more staticmasked
Organell-Verankerung (allgemein)
Vorlesung 2016
Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.
Migration
Cytoskelett-Faser
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Motor-Proteine:
vermitteln bei zellulären Bewegungen, bei Organellwanderung und Vesikel-Transport am Cytoskelett
Cytokinese (Zellbewegung)
Vorlesung 2016
Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.
„Motor-Proteine“ sind Cytoskelett-assoziierte, mechano-
chemische Enzyme, die chemische Energie (ATP, GTP) in
mechanische Arbeit konvertieren können.
Motor-Protein Superfamilien:
• Dynein & Kinesin
• Akto-Myosin
Cytokinese (Zellbewegung)
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• Kinesin ist ein „Plus“-Ende-Motor• Dynein ist ein „Minus“-Ende-Motor
Dynein und Kinesin bewegen sich an Mikrotubuli fort
Vorlesung 2016
Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.
kontrolliert in Pflanzen die Zellform und vermittelt beim Vesikel-Transport
Akto-Myosin II
(ähnelt dem Muskelsystem)
Myosin-Köpfe bewegen sich (angetrieben durch ATP-Spaltung) an Aktin-Filamenten entlang
Das Akto-Myosin-System
Vorlesung 2016
Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.
Aktin-
Verankerung an
der PM
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Chloroplasten-Bewegungen werden durch das Akto-Myosin-System vermittelt
Schwachlicht Starklicht
Vorlesung 2016
Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.
Zeigen Chloroplasten auch im Laserlicht des confokalen Mikroskops!
Im Schwachlichtrichten sich die Chloroplasten der fädigen Grünalge Mougeotia
horizontal zum Licht aus, bei Starklicht
dagegen vertikal.
Optimierung der Lichtausbeute, Vermeidung von Lichtschäden
(� Photosynthese).
Beispiel: Chloroplasten-Bewegungen einer Grünalge
Aktin-Filamente
Vorlesung 2016
Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.
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Einseitiges Wachstum als Resultat von gerichtetem Vesikel-Transport
Polarer Transport
Vorlesung 2016
Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.
Polarität
YouTube video:
„fantastic vesicle traffic“
http://www.youtube.com/watch?v=7sRZy9PgPvg&index=6&list=PL8C12803AFDAC2272
GFP-illuminated directional vesicle transport supporting polar root hair growth
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Beim polaren Wachstum von Pollenschläuchen bewegen sich Vesikel an Aktin-Filamenten (Transportbahnen) entlang zum wachsenden Pol.
Ähnliches geschieht beim polaren Wachstum von Wurzelhaaren.
� einseitige Sekretion von Zellwandmaterial an der Spitze
In Pflanzen: nur bei Pollenschläuchen und Wurzelhaaren!
Vorlesung 2016
Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.
„Pol“
weichhart
Vorgänge während des polaren Spitzenwachstums
Figure 1. Images of Living Lily Pollen Tubes Showing Different Structures or Activities.
From: Hepler et al. (2013) Control of cell wall extensibility during pollen tube growth. Mol Plant 6: 998-1017.
10 μm
DIC: Nomarski differential interference contrast
PI: propidium iodide, stains the cell wall
Life-act: GFP-based stain of F-actin
FM4-64: lipid dye (sterols), stains the PM and vesicles
(inverted cone)
Fura-2 dextran, stains free Ca2+
(steep, tip-focused gradient)
BCECF: labelled dextran, pH-reporterpH 6.8
pH 7.5
Mito-FM: Mitotracker, stains respiring mitochondria
NAD(P)H fluorescence can be imaged directly (strongest signal in the region of mitochondria)
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Periphere (cortikale) Mikrotubuli bestimmen:
• Wandtextur (Dehnungsrichtung), Zellstreckung
• Orientierung von Zellteilungen
Periphere Mikrotubuli
Mikrotubuli und Zellteilung
Tierische Zelle Pflanzenzelle
Ein
kontraktiler
Ring aus
Aktin-
Filamenten
schnürt die
Zelle in der
Mitte ein
Mikrotubuli
bilden den
Phragmoplasten
(organisieren die
neue Zellplatte)
Vorlesung 2016
Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.
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Mikrotubuli geben die Lage der neuen Zellwand vor
Vorlesung 2016
Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.
MT hinter-
lassen eine
unsichtbare
Markierung
Definierte
Zellteilungs-
ebene
Fluoreszenz-Aufnahmen der Zellteilung (fixierte Wurzelzellen). Entwicklung der mitotischen Spindel aus kortikalen Mikrotubuli in gelb bzw. grün (DNA in blau). (A-D) Ausbildung des Prä-Prophase-Bandes; (E-H) die Prophase-Spindel bildet sich beidseitig des (sich auflösenden) Nukleus aus; (G,H) das Prä-Prophase-Band verschwindet (Pfeile); (I-K) vollständige Ausbildung der Spindel nach Auflösen der Kernhülle und Anordnung der kondensierten Chromosomen in der Äquatorialebene (roter Pfeil).
Vorlesung 2016
Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.
Mikrotubuli – Stadien der Zellteilung in Pflanzen
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Mikrotubuli (MT) & Zellteilung (schematisch)
Vorlesung 2016
Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.
Re-
Arrangement
kortikale MT
Der Golgi-Apparat
liefert das Material für
die neue Zellwand
Vorlesung 2016
Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.
Pflanzenzelle
Phragmoplast
Zellplatte
Neue Zellwand
durchbrochene
Zellplatte
tubuläres Netz-
werk (TN)
Golgi-Vesikel
unsichtbare
Markierung
Verbindung
mit
bestehender
Wand
Vesikelfusion
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Die Orientierung der peripheren Mikrotubuli kann durch äußere Signale, die in zellulären Signalkaskaden münden (Ca2+-Verschiebungen, Protein-Kinase-Kaskaden) moduliert werden.
Die Orientierung der Mikrotubuli wird reguliert
Vorlesung 2016
Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.
C = Chloroplast
N = Nukleus
V = Vakuole
In Wurzelzellen sind die MT transversal
(quer zur Dehnungs-richtung) orientiert.
Protein-Kinasen gehemmt (mit Stauroporin)
⇒ „Streutextur“ der MT
Hemmung von Protein-Kinasen stört die MT-Orientierung
(Resultat: isotropes Wachstum)
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Beispiel:
In wachsenden Arabidopsis-Keimlingen strecken sich die Zellen in Richtung der Längsachse - festgelegt durch die transversale Orientierung der Mikrotubuli(und Cellulose-Stränge).
Das Phytohormon Ethylen verursacht eine 90o-Drehung der Mikrotubuli (aus der Quer- in die Längsrichtung).
Dadurch können sich die Zellen nur noch lateral zur Sprossachse dehnen – und die Keimlinge werden dick und kurz (bilden Hypocotyl-Haken).
Eine Ethylen-insensitive Mutante wächst dagegen normal!
Beispiel für ein Mutanten-Screening
Vorlesung 2016 Abb. 22.7 aus Taiz/Zeiger „Physiologie der Pflanzen“ Spektrum Verlag.
Phytohormon-Regulation der Mikrotubuli-Orientierung
Ethylen-Rezeptor-Kinase ETR1
Mikrotubuli-Rearrangement
H2C=CH2
Vorlesung 2016
Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.
Ethylen
C2H4 ist ein
hydrophobes Gas
und kann
Membranen leicht
passieren!
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Rezeptor-Dimerisierung über Disulfidbrücken
(zwischen zwei Cys-Resten, C) im ER-Lumen wird durch oxidierende Bedingungen begünstigt.
From: Ma et al. (2006) Subcellular localization and
membrane topology of the melon
ethylene receptor CmERS1.
Plant Physiol. 141: 587-597.
Ethylen-Rezepor (Topologie)
C-terminale Effektor-
Domänen
(für CTR1-Bindung)
N-terminale Cysteine(D & E, saure, K & R basische As)
⇒ negative inside rule
Beispiel: ERS (ETR und EIN mit ähnlicher Struktur)
Hypothetisches Modell der EIN2-Wirkung im Ethylen-Signalweg
Ji & Guo (2013) From Endoplasmic Reticulum (ER) to Nucleus: EIN2 bridges the gap in ethylene signaling.
Mol. Plant 6: 11-14 (RESEARCH HIGHLIGHT).
Welcher Zusammenhang besteht zwischen Ethylen und MT-Umlagerung ?!
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Mechano-Perzeption an der Zellwand (Modell)
Cellulose-Mikrofibrillen stehen in Kontakt mit transmembranen Proteinen, die auf der Innenseite mit peripheren Mikrotubuli verbunden sind (z.B. Cellulose-Synthase-Komplexe via CSI1 u.a.)
⇒ mechanische Zellwand-Verformung löst eine Cytoskelett-vermittelte Reaktion aus (z.B. bei Wind, Berührung, etc.)
Vorlesung 2016
Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.
Figure 2. Working model for
microtubular function in the
decoding of stress signatures.
Microtubules with elevated
stability can act as (mechano-)
susceptors, and microtubules
with elevated dynamics can
directly perceive mechanical
stress. Osmotic stress, touch or
wounding stress and cold stress
are predicted to interact
differently with the susceptor
and perceptor populations of
microtubules, leading to different
temporal read-outs specific for
the respective quality of input.
From: Peter Nick (2013), The
Plant Journal (special issue).
Microtubules,
stress signaling
& responses
ROS (reactive
oxygen species)
Legend: CMF, cellulose microfibrils; TMP, transmembrane protein; MSC, mechano-sensitive (Ca2+) channel; PA, phosphatidic acid (from phosphatidylcholine by) PLD, phospholipase D; NADPox, NADPH oxidase; O2.
-, superoxide; H2O2, hydrogen peroxide.
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Zusammenfassung:
Kontrolle von:
• Zellform
• Zellbewegung
• Zellorientierung
Verankerung und Bewegung von Organellen
Vermittlung von gerichtetem Vesikel-Transport
Vermittlung bei Mechano-Perzeption (Außenreize)
Funktionen des Cytoskeletts