Der biologische Abbau von Universität Stuttgart 2 … · 2013-08-20 · Primer sind somit zur...
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Einsatz von MEK 700 im Technikumsbiofilter: Das in Bild 3 gezeigte Sägezahnmuster wird von der zur Substratzugabe benutzten Gaswaschflasche erzeugt, da die zugegebene Menge an 2-Butanon vom Füllstand in der Flasche abhängig ist. Beim Nachfüllen der Flasche zeichnet das FID keine oder eine verminderte Konzentration an 2-Butanon im Zulauf des Biofilters auf. Wird der Wirkungsgrad (Bild 4) berechnet, äußert sich dieses Verhalten als plötzlichen Einbruch (Bild 4). Bild 3: Aufgezeichnete Meßwerte des FID Die Messwerte des FID (Bild 3) zeigen, dass das 2-Butanon fast vollständig im Biofilter entfernt wurde. Daraus ergibt sich ein Wirkungsgrad von nahezu 100% über die gesamte Betriebsdauer des Biofilters (Bild 4). Bild 4: Verauf des Wirkungsgrades während des Betriebs. Der Wirkungsgrad wurde aus den in Bild 3 gemessenen Wertenberechnet, die Einbrüche sind durch wartungsbedingte Unterbrechungen entstanden. Der Abbauweg von 2-Butanon: Der Abbauweg von 2-Butanon konnte an Transposonmutanten von MEK 700 untersucht werden. Auf Metabolitbildung wurde die Mutante P26R18 sowie die Mutanten MEK 5 (BVMO) und MEK 6 (HAT) vom Institut für Industrielle Genetik (IIG) untersucht. Zum Nachweis wurden die Mutanten in einem mit 2-Butanon (3 mmol/L) und Glucose (10 mmol/L) enthaltenden Kulturmedium angezogen. Alle im Medium gebildeten Metabolite wurden mit Gerstel Twister® sorbiert und mit GC/MS analysiert (Abteilung Technische Analytik der Luft). Das Spektrum ist in Bild 1 dargestellt: Bild 1: Spektrum der von Mutante MEK 6 erzeugten Metabolite. Rot eingezeichnet die Integrationsgrenze zwischen 2-Butanon und Ethylacetat. Retentionszeiten und enthaltene Komponenten siehe Tabelle 1. Nachgewiesen werden konnten 2-Butanon bei MEK 5 (BVMO) und MEK 6 (HAT), Ethylacetat bei MEK 6 (HAT) und Butanol bei MEK 5 (BVMO) und P26R18. Aus diesen Ergebnissen konnte der folgende Abbauweg (Bild 2) postuliert werden. Tabelle 1: Ergebnisse der Twister® Untersuchung von MEK 6 (HAT) Bei Toluol und Undecen handelt es sich um Substanzen, die aus dem Septum des Schüttelkolbendeckels stammen. Der biologische Abbau von 2-Butanon in der biologischen Abluftreinigung Dipl.-Ing. Martin Kieninger, Dipl.-Ing. Niko Strunk, Prof. Dr. K.-H. Engesser Ansatz MEK 6 (HAT) Substrat 2-Butanon Konzentration 3 mmol/L Retentionszeit (min) Area (%) Identifikation Qualität der Identifizierung 2,91 5,28 Butanon 86 3,09 12,12 Ethylacetat 52 6,95 34,09 Toluol 91 23,48 13,12 1-Undecen 95 Wirkungsgrad des Reaktors 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 Zeit in Tagen (%) FID Ergebnisse Butanon Reaktor 0 50 100 150 200 250 300 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 Tage Corg [mg/m3] Martin FID vor Filter [mg Corg / m3] Martin FID nach Filter [mg Corg / m3] 2-Butanon ist ein gut wasserlösliches Lösemittel, das in großen Mengen hergestellt und hauptsächlich als Lösungsvermittler in Lacken oder ähnlichen Produkten mit hohem Feststoffanteil eingesetzt wird. Bei der Verarbeitung 2-Butanonhaltiger Produkte entstehen große Mengen an Abluft, die mit Hilfe von biologischen Verfahren schnell und kostengünstig gereinigt werden können. Aufgabenstellung Ziel dieser Arbeit war es den Abbau von 2-Butanon an dem Stamm Pseudomonas veronii MEK 700 zu zeigen und die Möglichkeit des Einsatzes von MEK 700 in einem industriell genutzten Biofilter zu demonstrieren. Darüber hinaus sollte durch Anreicherung aus Umweltkompartimenten ein Eindruck von der Verbreitung des Abbaus von 2-Butanon gewonnen werden. Universität Stuttgart Institut für Siedlungswasserbau, Wassergüte- und Abfallwirtschaft Abteilung ALR Bandtäle 2 70569 Stuttgart PCR zur Identifikation von MEK 700: Die Primer MarEst1 (5’-GATCTCGAGCTCGCGAA-3’) und MarEst2 (5’-GCTGACCCATCCCCAA-3’) sollten zur Identifizierung des Stammes MEK 700 verwendet werden, um nach längerer Lagerung in der Stammsammlung der Abteilung ALR die Identität seine zu beweisen. Im Gel (Bild 5, links) waren statt des erwarteten Amplifikats mehrere Amplifikate (Bild 5, links A) zu sehen. Die Primer sind somit zur Identifikation von MEK 700 nicht geeignet. Die von Herrn Dr. Altenbuchner (IIG Universität Stuttgart) zur Verfügung gestellten Primer S4033 und S4034 wurden erfolgreich zur Identifikation von MEK 700 eingesetzt. Die Primer sind so designed, dass sie innerhalb der zu untersuchenden Esterasesequenz liegen. Das Gel (Bild 5, rechts A) zeigt ein Amplifikat, das die Identität von MEK 700 beweist. O O O OH O OH Homoacetyl- transferase (HAT) O 2 H 2 O H 2 O H O Acetat Ethanol Acetaldehyd Butanon Essigsäureethylester Alkoholdehydrogenase Aldehydehydrogenase Hauptabbauweg Nebenreaktionen bei inaktivierter Butanon- Monooxygenase OH 2-Butanol Annahme: Defekte Baeyer-Villiger- Monooxygenase oder Alkoholdehydrogenase rot: Erkannter Metabolit Bayer-Villiger- Monooxygenase (BVMO) Einschleusung und Metabolisierung im Tricarbonsäurezyklus X XH 2 H 2 O XH 2 XH 2 X OH OH OH H O OH OH O OH O Einschleusung und Metabolisierung im Tricarbonsäurezyklus 2,4 Butandiol 3-Hydroxy- Butanal 3-Hydroxy- Butyrat Acetat O OH O Acetoacetat Bild 5: PCR mit den Primern MarEst 1 und MarEst 2 (links) sowie eine PCR mit den Primern S4033 und S4034 (rechts) M Marker M Marker A Ansatz mit beiden Primern A Ansatz mit beiden Primern K1 Kontrolle 1 mit Primer MarEst 1 K1 Kontrolle 1 mit Primer S4033 K2 Kontrolle 2 mit Primer MarEst 2 K2 Kontrolle 1 mit Primer S4034 Bild 2: Abbauweg von 2-Butanon zu Acetat und Acetaldehyd. Links der gefundene Metabolit 2-Butanol. In grün dargestellt, der theoretische Abbauweg von 2-Butanon über 2-Butanol. Rechts der postulierte Abbauweg von 2-Butanon über Ethylacetat.
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Einsatz von MEK 700 im Technikumsbiofilter:
Das in Bild 3 gezeigte Sägezahnmuster wird von der zur Substratzugabe benutzten Gaswaschflasche erzeugt, da die zugegebene Menge an 2-Butanon vom Füllstand in der Flasche abhängig ist. Beim Nachfüllen der Flasche zeichnet das FID keine oder eine verminderte Konzentration an 2-Butanon im Zulauf des Biofilters auf. Wird der Wirkungsgrad (Bild 4) berechnet, äußert sich dieses Verhalten als plötzlichen Einbruch (Bild 4).
Bild 3: Aufgezeichnete Meßwerte des FID
Die Messwerte des FID (Bild 3) zeigen, dass das 2-Butanon fast vollständig im Biofilter entfernt wurde. Daraus ergibt sich ein Wirkungsgrad von nahezu 100% über die gesamte Betriebsdauer des Biofilters (Bild 4).
Bild 4: Verauf des Wirkungsgrades während des Betriebs.Der Wirkungsgrad wurde aus den in Bild 3 gemessenen Wertenberechnet, die Einbrüche sind durch wartungsbedingteUnterbrechungen entstanden.
Der Abbauweg von 2-Butanon:
Der Abbauweg von 2-Butanon konnte an Transposonmutanten von MEK 700 untersucht werden. Auf Metabolitbildung wurde die Mutante P26R18 sowie die Mutanten MEK 5 (BVMO) und MEK 6 (HAT) vom Institut für Industrielle Genetik (IIG) untersucht.Zum Nachweis wurden die Mutanten in einem mit 2-Butanon (3 mmol/L) und Glucose (10 mmol/L) enthaltenden Kulturmedium angezogen.Alle im Medium gebildeten Metabolite wurden mit Gerstel Twister® sorbiert und mit GC/MS analysiert (Abteilung Technische Analytik der Luft). Das Spektrum ist in Bild 1 dargestellt:
Bild 1: Spektrum der von Mutante MEK 6 erzeugten Metabolite.Rot eingezeichnet die Integrationsgrenze zwischen 2-Butanonund Ethylacetat. Retentionszeiten und enthaltene Komponenten siehe Tabelle 1.
Nachgewiesen werden konnten 2-Butanon bei MEK 5 (BVMO) und MEK 6 (HAT), Ethylacetat bei MEK 6 (HAT) und Butanol bei MEK 5 (BVMO) und P26R18.Aus diesen Ergebnissen konnte der folgende Abbauweg (Bild 2) postuliert werden.
Tabelle 1: Ergebnisse der Twister® Untersuchung von MEK 6 (HAT)
Bei Toluol und Undecen handelt es sich um Substanzen, die ausdem Septum des Schüttelkolbendeckels stammen.
Der biologische Abbau von 2-Butanon in der biologischen AbluftreinigungDipl.-Ing. Martin Kieninger, Dipl.-Ing. Niko Strunk, Prof. Dr. K.-H. Engesser
Ansatz MEK 6 (HAT) Substrat 2-Butanon Konzentration 3 mmol/L
Retentionszeit (min) Area (%) Identifikation Qualität der Identifizierung
2,91 5,28 Butanon 86
3,09 12,12 Ethylacetat 52
6,95 34,09 Toluol 91
23,48 13,12 1-Undecen 95
Wirkungsgrad des Reaktors
0
10
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0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72Zeit in Tagen
(%)
FID Ergebnisse Butanon Reaktor
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0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72Tage
Cor
g [m
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Martin FIDvor Filter[mg Corg / m3]Martin FIDnach Filter[mg Corg / m3]
2-Butanon ist ein gut wasserlösliches Lösemittel, das in großen Mengen hergestellt und hauptsächlich als Lösungsvermittler in Lacken oder ähnlichen Produkten mit hohem Feststoffanteil eingesetzt wird. Bei der Verarbeitung 2-Butanonhaltiger Produkte entstehen große Mengen an Abluft, die mit Hilfe von biologischen Verfahren schnell und kostengünstig gereinigt werden können.
AufgabenstellungZiel dieser Arbeit war es den Abbau von 2-Butanon an dem Stamm Pseudomonas veronii MEK 700 zu zeigen und die Möglichkeit des Einsatzes von MEK 700 in einem industriell genutzten Biofilter zu demonstrieren. Darüber hinaus sollte durch Anreicherung aus Umweltkompartimenten ein Eindruck von der Verbreitung des Abbaus von 2-Butanon gewonnen werden.
Universität StuttgartInstitut für Siedlungswasserbau, Wassergüte- und AbfallwirtschaftAbteilung ALRBandtäle 270569 Stuttgart
PCR zur Identifikation von MEK 700:
Die Primer MarEst1 (5’-GATCTCGAGCTCGCGAA-3’) und MarEst2 (5’-GCTGACCCATCCCCAA-3’) sollten zur Identifizierung des Stammes MEK 700 verwendet werden, um nach längerer Lagerung in der Stammsammlung der Abteilung ALR die Identität seine zu beweisen. Im Gel (Bild 5, links) waren statt des erwarteten Amplifikats mehrere Amplifikate (Bild 5, links A) zu sehen. Die Primer sind somit zur Identifikation von MEK 700 nicht geeignet.Die von Herrn Dr. Altenbuchner (IIG Universität Stuttgart) zur Verfügung gestellten Primer S4033 und S4034 wurden erfolgreich zur Identifikation von MEK 700 eingesetzt. Die Primer sind so designed, dass sie innerhalb der zu untersuchenden Esterasesequenz liegen. Das Gel (Bild 5, rechts A) zeigt ein Amplifikat, das die Identität von MEK 700 beweist.
O
O
O
OH
O
OH
Homoacetyl-transferase (HAT)
O2
H2O
H2O
H
O
Acetat
Ethanol
Acetaldehyd
Butanon
Essigsäureethylester
Alkoholdehydrogenase
Aldehydehydrogenase
HauptabbauwegNebenreaktionenbei inaktivierterButanon-Monooxygenase
OH
2-Butanol
Annahme:Defekte Baeyer-Villiger-Monooxygenase oderAlkoholdehydrogenase
rot: Erkannter Metabolit
Bayer-Villiger-Monooxygenase (BVMO)
Einschleusung und Metabolisierung im Tricarbonsäurezyklus
X
XH2
H2O
XH2
XH2
X
OH
OH
OH
H
O
OH
OH
O
OH
O
Einschleusung und Metabolisierung im Tricarbonsäurezyklus
2,4 Butandiol
3-Hydroxy-Butanal
3-Hydroxy-Butyrat
Acetat
O
OH
O
Acetoacetat
Bild 5: PCR mit den Primern MarEst 1 und MarEst 2 (links) sowie eine PCR mit den Primern S4033 und S4034 (rechts) M Marker M Marker A Ansatz mit beiden Primern A Ansatz mit beiden Primern K1 Kontrolle 1 mit Primer MarEst 1 K1 Kontrolle 1 mit Primer S4033 K2 Kontrolle 2 mit Primer MarEst 2 K2 Kontrolle 1 mit Primer S4034
Bild 2: Abbauweg von 2-Butanon zu Acetat und Acetaldehyd. Links der gefundene Metabolit 2-Butanol. In grün dargestellt, der theoretische Abbauweg von 2-Butanon über 2-Butanol. Rechts der postulierte Abbauweg von 2-Butanon über Ethylacetat.
