Arch. exper. Path. u. Pharmakol., Bd. 209, S. 375--388 (1950).

Aus dem Tuberkuloseforschungsinstitut Borstel (Holstein) und der I I . Medizinisehen Abteilung des AUg. Krankenhauses St. Georg in Hamburg.

Die antibiotisehe Wirkung yon Eseherichia coli auf Mycobacterium tuberculosis.

V I I I . Mi t te i lung .

Studien zur Chemotherapie der Tubcrkulose%

Von

GERTRUD ME1SSNER und ERICH HESSE.

(Eingegangen am 23. September 194~.)

Bei der U n t e r s u c h u n g zahl re icher B a k t e r i e n und Pilzarter~ a u f ihre b a k t e r i o s t a t i s c h e n F i ih igke i t en gegeni iber Tuberke lbaz i l l en mi t der K a p i l l a r m e t h o d e yon WRmHT fanden HESSE und MEISSNER im J a h r e 1932 den vorL H~ssE sp~ter , im J a h r e 1947, besch r i ebenea Coli- a n t a g o n i s m u s gegen KocHsche Bazi l len. HESSE 1 wies in seinen VerSffeIl t- l i chungen au f die besondere B e d e u t u a g dieses Befundes hin, welche da r in bes teh t , d a b normale Darmbakterien arLtagonistische E igenseha f t en gegen Tube rke lbaz i l l en besi tzen. D a m i t wird die F r a g e der a l lgemeinen und spez i f i s ch -an t i t ube rku lSsen I n f e k t i o n s a b w e h r von e iner neuen Sei te aufgerol l t , und es b i e t e t sieh n u m n e h r die MSgl iehkei t , m i t kSrpere igenen Abwehr s to f f en die Tuberku lose zu beki~mpfen.

Ahnl i che B e o b a c h t u n g e n wie die yon HEssE und MEISSNER wurden im J a h r e 1936 yon PERETZ, NEWLER und KAR~NOW 2, im J a h r e 1939 voil SAR~OWEC a und im J a h r e 1948 yon PoP u n d CO~RADI 4 m i t K u l t u r f i l t r a t e n yon Col ibaz i l len erhoben. SAR~OVIEC prf i f te in der T i e f enku l t u r naeh K~RC~INER neben ande ren Bak te r i en - auch Coli- k u l t u r f i l t r a t e u n d fand, dal~ sie be i e inem 1~ t iber u n d u n t e r 7,0, n i ch t dagegerL bei p~ 7,0 w i rksam waren. E r v e r m u t e t e , dug es sich h ie rbe i urn F e r m e n t w i r k u i t g e n hande le , und h~ t seine B e o b a c h t u n g e n u ich t we i t e r verfolgt . P o t u n d CO~RA~)I wogen don Tuberke lbaz i l l en - rasen vo~x S c h w i m m k u l t u r e n au f S a u t o n naeh Zusa tz yon Col iku l tu r - filtrate~x u n d er~tsprechender Bebr f i tung bei 37% Sie far, den eine op t inmle W a c h s t u m s h e m m u n g der Tube rke lbaz i l l en bei Zusa tz yon 1% F i l t r a t .

* MElSSNER, G., u. E. HESSE: Arch. exper. Path. (D.) VII. Mitt. 201, 99 (1943).

HESSE: Ther. Umsch. 1947, H. 10. - - Gi. ital. tuberc. 1, 237 (1947). - - Med. Klin. 1947, 7. - - ~ 1)~aE~z, N ~ w ~ a u. K A ~ o w : Zhur microbiol, epi- demiol, immunol. 17, 78 (1936). -- 3 S ~ o v i ~ c : Zbl. Bacter. usw. I Orig. 142~ 231 (1939). - - a PoP ~x. CONR~m: Sitzg ~rzteverein Braunschweig. J anuar 1948.

376 GERTRUD MEISSNER u n d ]~RICH ]-~ESSE :

Wir geben naehs t ehend eine Zusammenfassuug unserer bisherigen Ergebnisse . )/[it verschiedenen Methoden wurden die bakter ios ta t i schen

und bak te r i z iden F~higke i ten yon lebenden Escher ieh ia eoli und ihren

Kul tu r f l f i s s igke i t en geprtift .

I. Versuche mit lebenden Escherichia coli.Stgmmen.

a) Bakteriostasis. Die ers ten Versuche wurden nfit der Kapi l l a r -

me thode yon W~IGHT 1 durchgef i ihr t .

Methodik. 50mm a frisch entnommenes Meerschweinchenblut wird mit 5 mm 3 Tuberkelbazillenaufschwemmung und 5 rain a der zu priifenden Bakterienkultur gemischt und in 3 Kapillaren atffgezogen. Die an den Enden zugeschmolzenen Kapillaren werden 14 Tage bei 370 bebrfitet. Dann werden die Blutf~den in eine 1/2--1%ige Saponinl6stmg ausgeblasen. Das Saponin 15s~ den Blutfarbstoff heraus. Soweit sich an den Blutfadenenden H~matin gebildet hat, wird es mit einigen Tropfen 10%iger KOH entfernt. SchlieBlich zieht man die Faden auf Objekttr~ger auf, trocknet und fitrbt sie nach ZIEHL-NEELSEN.

Die Tuberkelbazillen wachsen an den Fadenenden zu mehr oder weniger grogen, dichtstehenden Kolonien aus, welche mit schwacher VergrSBerung - - 40fach - - gut zu sehen sind. Wir bezeichnen mit + + zahlreiche groBe Kolonien (VergrSBerung 40faeh), + eben sichtbare Kolonien (Vergr6Berung 40fach), (+) Kolonien yon 10--20 Bazillen (nur mit 01immersion erkennbar), Z keine Kolonien, nur einzeln liegende Bazillen, gelegentlich zu mehreren liegend, ent- spreehend der Einsaatkontrolle.

Auch die Escherichia coli wachsen an den Fadenenden entweder diffus oder zu mehr oder weniger groBen lockeren Kolonien aus. Stets aber reicht das Wachstum der Taberkelbazillen etwas welter in den Faden hinein als das der Escherichia eoli.

Zur Beurteilung eines Ansatzes stehen 6 Fadenenden zur Verfiigung. Das jeweils st~rkste Wachstum wird als Ergebnis gewertet. Die Sicherheit der Methode h~ngt ab:

1. Von dem verwendeten Meerschweinchenblut; um die sehr selten auftre- tenden nattirlichen Hemmungen auszuschalten, wird jeder Versuchsansatz mit Blur yon zwei versehiedenen Meerschweinchen durchgefiihrt;

2. yon der I{aftung der Fadenenden an der Kapillarwand; ziehen sich die Fadenenden bei der Gerinnung zu weir in die Serumsgule zuriick, so waehsen die Tuberkelbazillen nicht zu Kolonien aus;

3. yon einer sachgem~Ben Behandlmlg der Fadenenden beim Herausblasen, damit die Enden nicht abreiBen und eventuell verlorengehen; durch sorgf~ltige Technik vermeidbar.

Die Zuver l~ss igkei t der Methode, die wir seinerzei t in vie len tau-

senden Ans~tzer~ fes ts te l len konnten , geht aus folgenden neu gewonnenen Zahlen hervor . Von 190 Kontrol lansi~tzen - - Blur + Tuberke lbaz i l len

+ 0,9 %ige NaC1-L6sung - - ze igten 181 (95 %) gutes W a c h s t u m , w~h- rend nur 9 (5%) mehr oder weniger s tarke W a c h s t u m s h e m m u n g auf- wiesen. I n 307 Ans~tzen mi t l ebendea Escher ich ia coli dagegen wurde

254mal (83%) die E a t w i c k l u n g der Tuberke lbaz i l l ea g e h e m m t ; 51real

1 WRtO~T: ~Veitere Einzelheiten s. MEISSNER: Zbl. Baeter. usw. I Orig. 106, 210 (1928).

Wirkung yon Escherichia coli auf Mycobacterium tuberculosis. VIII. 377

(17%) wuchserL die KocHschen Bazillen t rotz vorhandener Colikeime zu Kolonien aus (Tabelle 1).

Der vorwiegend ffir die Versuche benutzte Tuberkelbazillus war ein seinerzeit aus Sputum frisch herausgeziichteter S tamm v o m Typ. humanus , den wir auf Petragnani-l~/ihrboden iiberimpften. Auch andere St~mme vom Typ. humanus , bovinus uad Tabelle 1. WRiaHTsche Versuchsanordnung.

gallinaceus wurden durch Wachstura Zahl dor Coli im Wachstum ge- der Zah l der Anst~tze m i t

T u b e r k e l - Kontrol lanst~tze l e b e n d e n hemmt. Alle boten im Blur- baz i l len E s c h e r i c h i a coli

faden (abgesehen yon einer fast regelm~Big auftreten- ~ 6 (3%) 96 (31%) den Granulabildung sowohl (÷) 3 (2%) 160 (52%) ÷ 27 (14%) 40 (13%) in den Kontrollen als in + ÷ 154 (81%) ] 11 (4%) den Versuchsf~den) keine ~nderungen der Form und F~rbbarkeit . ~ b e r die Brauchbarkei t der Colini~hrbSden gibt Tabelle 2 AufschluB.

Danach scheint Aszitesbouillon zur Erhal tung der Aktivi t~t be- sonders geeignet zu seir~. Die Schwierigkeiten aber einer Beschaffung grSBerer Aszitesmengen veranlaBte uns, als l~/ihrboden die Trauben- zuckerbouillon mit Hott inger-Grundlage zu nehmen. Werden d i e

Tabelle 2. Wn~OgTsche Versuchsanordnu~g.

~ V a c b s t u m de r T u b e r k o l b a z i l l e n i m B l u t f a d e n be i D a u e r k o n t a k t E s c h e r i c h i a m i t l e b e n d e n E s c h e r i c h i a coli, welche gez f i ch te t w a r e n a u f

coli S t a m m - N r . T r a u b e n z u c k e r - T r a u b e n z u c k e r b o u i l l o n

boui l lon -k 5 % M e n s c k e n b l u t Asz i t e sbou i l lon

1000 116 458 454 483

++ ÷ ÷

÷ ÷ ÷

(+) (+) (÷) (÷)

(+) (+) (+) ÷ (+) (+)

antagonistisch wirksamen Colist~mme auf diese I~/ihrlSsung alle 2 Tage fiberimpft, so behal ten sie, wie die Erfahrungen im Laufe yon 3 Jahren gezeigt haben, ihre Aktivit~t . Andere N~hrbSden wie Endo-Agar, 1Y[ercksche Traubenzuckerbouil lon Standard I und I I sind weniger ge- eignet. Sie fiihren im Laufe der Zeit entweder zum Verlust oder zur Abschw~chung der Aktivit~t .

Die Escherichia coli-St~mme sind in ihrem antituberkulSsen Wert unterschiedlich. Zu ihrer Differenzierung wurde anfangs die Typen- einteilung yon NISSL]~ herangezogen. Unter den sog. Normalcoli (Typ I nach I~ISSLE) finder man etwa 20% ar~tibiotisch wirksame St~mme, w~hrend unter der~ anderen Gruppen, soferrL unsere kleinen Zahlen

378 GERTRUD MEISSNER u n d ERICH HESSE:

Tabelle 3. WRI~HTsche Versuchsanordnung.

~ V a c h s t u m ] Z a h l de r gep r t i f t en E s c h e r i c h i a coli yo re N~SSLE-Typ de r I T u b e r k e l b a z i l l e n I I I I I I IV P a r a c o l i

I

(+) ~- bis -?

2 5 - - -

64 - 1 23 I 2

4 2

7 3

ein Ur te i l e r l auben , zwar wi rksame Ver t r e t e r vo rhanden s ind (Tabelle 3) ; abe r deren Aktivi t /~t scheint n ich t so groB zu sein wie die yon Normal - eoli. Die zur Charak te r i s i e rung der Colist/~mme herangezogenen I m v i c - R e a k t i o n e n zeigten keinen Z u s a m m e n h a n g mi t der A k t i v i t g t der Ke ime .

Auch im Lochtest (Diffusionsplat te) l i e s sich die bak te r io s t a t i s che W i r k u n g lebender Escher ich ia coli au f Tuberke lbaz i l l en verseh iedener T y p e n zur Dars t e l lung br ingen. W i t ve rwende ten P e t r a g n a n i - N g h r - bodenp l a t t en , welehe mi t e iner rein ver r iebenen Tuberke lbaz i l l en- au f schwenmmng (20 rag/era 3 0,9 %ige NaC1-LSsung) beschick t wurde~l ; Bebr i i tung in feuehten K a m m e r n bei 37 o C. I n das im Z e n t r u m der P l a t t e ausges tanz te Loch - - Durehmesser - - 1 cm - - waren 0,1 cm 3 yon mehreren Verdfinnunge~l e iner 16 S tun de n a l ten Traubenzucke r - bou i l l onku l tu r von Escher ieh ia eoli e ingebrach t (Verd i immngen in 0 ,9%iger NaCI-LSsung au f 1 : 1 0 0 0 0 , 1 : 100000 und 1 :1000000) . In der hSchs ten Verdf innung be t rug in 0,1 cm 3 die Zah l der Ke ime e twa 40- -80 . Man erhi~lt naeh 2wSehigem A ufe n tha l t der P l a t t e im B r u t s e h r a n k eine um (las Loch gelegene dunkelgrf in gef~trbte, waehs- tumsfre ie Zone, die yon e inem d ich ten Rasen yon Tuberke lbaz i l l en au f gelbgrf inem N~hrbode~t umgeben ist , w~ihrend die K o n t r o l l p l a t t e n t o t a l bewaehsen silld. Unte r sch iede in der Gr6Be der wachs tumsf re ien H5fe k o n n t e n bei den versch iedenen E insaa t en fes tges te l l t werden. W~.hlt man hShere Co l ikonzen t r a t i onen , so wird die ganze P l a t t e dunkelgr f in verf i i rb t , und das W a e h s t u m der Tuberke lbaz i l l en au f der ganzen P l a t t e gehemmt . Die Wasse rs to f f ionenkonzen t ra t io r t des N~hr- bodens be t rug im wachs tumsfre ien :Bezirk e twas fiber 6,0 (PH)" Die H e m m m l g k a n n also n ieh t der ak tue l l en l~eakt ion des NKhrbodens zur L a s t gelegt werden, sondern m u g au f der Dif fus ion eines yon den Col ibazi l len gebi lde ten , an t ib io t i sch wi rksamen Stoffes beruhen.

b) Bakterizidie. Auger den besehr iebenen bak te r io s t a t i s ehen Eigen- sehaf ten bes i tzen ak t ive , lebende Escher ieh ia coli die F~h igke i t , Tube rke lbaz i l l en in v i t ro abzu tS ten .

Methodik. 4 cm 3 Traubenzuckerboaillon werden mit 1 cm a einer 24 Stunden alten Coli-Traubenzuckerbouillonkultur bzw. einer entsprechenden Verdiinnung derselben (mit Traubenzuckerbouillon) verse$zt. In diese LSs,mg tropft man 2 mg in 0,2 cm 3 0,9%iger NaC1-L6sung aufgeschwemmte Tuberkelbazillen. :Die

Wirkung yon Escherichia coli auf Mycobacterium tuberculosis. VI I I . 379

Tabelle 4. Schddigung der Tuberkelbazillen durch lanydauernden Kontakt bei Plt 4,8. Je 5 cm a Traubenzuckerbouil lon (ohne Goli) werden mi t 0,2 mg Tuberkel-

bazillen vom Typ. humanus , aufgeschwemmt in 0,9 %iger NaC1-LSsung, verse tz t und naeh der entsprechenden Kontak tze i t d i rekt ~ ohne Schwefels~ure --- auf- gearbeitet . Beur te ihmg des Wachs tums der Tuberkelbazillen s. Tabelle 5.

Einsaat yon Tuberkelbazillen PH

in mg

0,2 4,8 0,2 6,0

~Vachstum der Tuberkelbazillen nach Kontakt mit Traubenzuckerbonillon yon PH 4,8 und 6,0

!~ontaktdauer in Tagen

1 2 4 7

÷ ÷ ÷ +

÷ ÷ ÷ ÷ ÷ ÷ ÷ ÷

Mischung bleibt einen oder mehrere Tage lang im Bru tschrank . D a n n werden 4 cm a v o n der gu t umgeschfi t te l ten Mischung nach I-IoHN mi t 10%iger Schwefel- s~ure aufgearbei te t und das gesamte Sediment nach 2maligem Wasehen mit te ls Kapillare au f ein Pc t ragnani -RShrehen fibertragen. Die RShrchen werden 1 Tag lang schr~g gelegt, leicht paraf f in ier t und in den Bru t sch rank gebraeht . Ablesung des Versuchs- ergebnisses naeh 6 Woe]sen. Eine weitere Beobach tung ist n icht erforderlich, da ein Nachwachsen naeh 6 Wo- chen n ieht e int r i t t . Wohl aber k o m m t es reeht h£u- fig in dem Zei t raum der 3 . - -6 . Bebri i tungswoche zu einem Auswachsen yon an- f~nglich in der Entwiek- lung gehemmten Tuberkel- bazillen.

])a infolge der Zucker- vergi~rung durch die Coli- bazil len die Wasserstoff- ionenkonzentra t ion der

Tra abenzuekerboui l lon nach der sauren Seite ver- schoben wird - - nach 12- stfindigcm Wachs tum ist et- wa p~ 4,8 erreicht , miissen

Tabelle 5. Wachstum yon TuberkelbaziUen nach einem 1--4tdgigen Kontakt mit lebendem Escherichia

coli Nr. 1000. Au/arbeitu~ 9 nacJ~ HOHN.

~Vachstum der Tuberkelbazillen, Eseherichia coli Kontaktdauer mit Bact. coli

Nr. 1000 in Tagen

1 2 4

+ +

Keimaufsehwemmungen. Myeobakter ium tu- berculosis Typ. humanus 23~0 Millionen/cm 3, Escheriehia eoli 4200 Millionen/em a.

Beurtei lung des Waehstums" ~ = kein Waehs- t u m ; ± = 1--20 einzeln liegende Kolonien; ( + ) -- fiber 20 einzeln liegende Kolonien; + = d ieht s tehende, zum Toil konfluierende Kolonien; - t -+ = d iehter Rasen.

unverdi innt 1:10 l : 100 1 : 1 0 0 0 1 : 10000

Kontrolle pn 6,0

die Kontrol len in einer gleich sauren Traubenzuckerboui l lon angelegt werden, bzw. dar f die Versuchsdauer nicht fiber den Ze i t raum yon 4 Tagen ausgedehnt werden. Tabelle 4 zeigt, dab nach e inem 7tagigen K o n t a k t mi t unbeimpf te r Traubenzuckerboui]lon yon pa 4,8 die Keimsch~digung recht weit gediehen ist. Es wachsen dann keine Tuberkelbazil len mehr au f dem Pe t ragnan i -N~hrboden aus. Arbei te t m an den Ansatz nach H o ~ s auf, t r i t t die bazil lensch~digende Einwirkung der Schwefels~urebehandlung hinzu.

A l s B e i s p i e l f i i r d i e b a k t e r i z i d e W i r k s a m k e i t e i n e s C o l i s t a m m e s

sei a u f T a b e l l e 5 v e r w i e s e n . E s k o m m t be i d i e s e r V e r s u c h s a n o r d a u n g

380 G E R T R U D M E I S S N E R u n d E R I C H H E S S E :

natiirlich zur Vermehrung der Colibakterien im N~hrboden, aber t rotzdem ist die Beziehung des Wirkeffektes zur Eirtsaatgr613e un- verkennbar. Je gr613er die Coli-Eir~saat, um so friiher tri t t die Ab- t6tung der Tuberkelbazillen ein. Als kiirzest wirksame Koataktdauer ergab sich eine Zeit yon etwa 12--14 Stundcn (Tabelle 6).

Tabelle 6. Wachstum von Tuberkelbazillen Typ . humanus nach Kontat't mit lebenden Escherichia coll in Stunden. Aufarbeitung nach HoI4N.

S b u n d e n

1 3 6 13 24

Coli Nr. 1000 . . . . . ~ (?) (~_) ;~ Kontrollen PH 4,8 . . . . ÷ +

25cm a Traubenzuckerbouillon mit 5cm a Colikultur und 750 Millionen Tuberkelbazillen Typ. humanus (suspendiert in 1 cm a 0,9%iger I~aC1-LSsuug).

Ffir unsere Ansicht, dai~ Colibazillen bei ihrem Wachstum anti- biotische Stoffe produzieren, spricht auch das Ergebnis einer Versuchs- reihe, in welcher wir in 0,9%iger NaC1-LSsung suspendierte Colikeime auf Tuberkelbazillen einwirken lie~en (Tabelle 7). l~ur in ganz groBen Dosen, bei denen in 0,9 %iger NaC1-LSsung mSglicherweise eia geringes Wachstum bzw. eine Wirkstoffabgabe stattfindet, kommt es nach langer Einwirkungszeit zur AbtStung der Tuberkelb~zillen.

TabeUe 7.

M i t 0,9 % i g e r N a C 1 - L 6 s u n g a u f 25 c m 3 a u f g e f i i l l t e s G e m i s c h y o n g l e i c h f a l l s i n 0,9 % l g e r N a C 1 - L 6 s u n g a u f g e s c h w e m m t e n

E s c h e r i c h i a col i S t a m m N r . 1000

t i n a

h u m a n e n T u b e r k e l b a z i l l e n

clr[ a

* W a c L s t u m y o n T u b e r k e l b a z i l l e n n a c h I ~ o n t a k t m i t l e b e n d e n ] ~ s c h e r i c h i a col i ,

A u f e n t h a l t i n T a g e n be i 37 °. A u f a r b e i t u n g y o n 4 c m a d e s G e m i s c h e s n a c h H O H N

2 T a g e 4 T a g e

5 1 + 3 1 + ± 2 ] (+) + + 1 1 + + + +

- 1 + + +

Escherichia eoli-Aufschwemmung in 0,9%iger NaC1-L5sung von Endoplatten- kulturen = 20000 Mil]ionen Keime je Kubikzentimeter.

Tuberkelbazillenaufschwemmung in 0,9%iger NaC1-L6sung (Typ. humanus Gr.) ~ 6600 Millionen Keime je Kubikzentimeter

Ebenso wie bei der Priifung der bakteriostatischen Wirkung er- gaben sich bei der Untersuchung der bakteriziden F~higkeiten voa lebenden Escherichia coli Aktivit~tsunterschiede (Tabelle 8). ,,Normal- coli" von Menschen, welche eine typhSse bzw. paratyphSse Er-

W i r k u n g yon Esche r i cb i a coli a u f M y c o b a c t e r i u m tuberculos is . V I I I . 881

Tabe l l e 8. Wachstum yon Tuberkelbazillen nach 24sti$ndigem Kontakt mit lebenden Escherichia coli. A u f a r b e i t u n g n a c h HOH~. Al le K o n t r o l l e n -- o h n e Z u s a t z yon

C o l i b a z i l l e n - - be i p~ 4,8 z e i g t e n d ie W a c h s t u m s i n t e n s i t i ~ t ~ -i-.

Zahl der St~mme yon Escherichia coli "Wachstum

der Tuberkel- yon yon Menschen, welehe bazillen yon gesunden tuberkulSsen Typhus, Pa ra typhus B

bzw. Ghrtnerinfektion Mensehen Menschen i ibers tanden ba t t en

0 19 7 5 ~: 23 32 0

( + ) 9 24 6 A- 4 8 3

+ + 0 6 0

G e s a m t z a h l 55 77 i 14

krankung iiberstanden hatten, ebenso Colist~mme yon TuberkulSsen scheinen weniger akt iv zu sein als die yon Gesunden. Wi~hrend Coli- st~mme yon Gesunden zu etwa 75 % gute bis ausreichende tuberkulocide Wirkung aufweisen, zeigten nur die Hiilfte der Colist~mme yon Tuber- kulSsen ausreichende Wirksamkeit und diejenigen yon Rekonvaleszenten nach Darminfektionen sogar in einem noch geringeren Prozentsatz.

II . V~rsuche mit Escherichia coli-Kultur/liissigkeiten.

a) BaIderiostasis. Der Nachweis des Wirkstoffes yon Colikultur- fliissigkeiten mit der WRIGrlTschen 1Vfethode gelingt Iticht einwand- frei, offenbar deswegen, weil die im Blutfaden notwendigerweise ein- t re tende Verdtinnung des Wirkstoffes yon 1:12 zu hoch ist. Dies gilt sowohl fiir Kulturflfissigkeitsfil trate dutch Berkefel4- und Membranfi l ter wie ffir die nach Absterben der Kul turen (in Trauben- zuckerbouillon etwa nach 5- -6 Tagen) gewonnenen sterilen Zentrifugate. Bei der Verwendung yon auf dem Wasserbade eingeengten Kultur- flfissigkeiten wirkte die erhShte Salzkonzentration stSrend und ver- schleierte vielfach die Ergebnisse. Es daf t auch die MSglichkeit einer partiellen Inakt iv ierung des Wirkstoffes nicht aui3er acht gelassen werden (Auftreten antagonistisch wirkender Faktoren, chemisehe Umwandlung). Immerhin ergaben 18--23 Tage alte Kulturfli issigkeiten

Tabe i l e 9. WI~xOH'rsche Versuchsanordnung.

Grad des Wachstums der Tuberkelbazil len

(s. Tabelle 1)

(+) +

÷ +

Traubenzucker- bouillon-

kontrol len

18--23 Tage alte, abges torbene

Coli-Traubenzucker - bouillonlrulturen

(Zentrifugat)

12 (is%) 13 (20%) 23 (35%) 18 (27%)

382 GERTEUD MEISSNER u n d ERICH HESSE:

Tabelle 1 ).

W a c h s t m n der Tuberke lbaz i l l en nack K o n t a k t m i t

K o n t a k t - Bodensa tz daue r Kul tur f l i i s s igke i t Kul tur f l i i s s igkc i t

in einschliefilick ohne der a b g e s t o r b e n e n T rauben - Bak te r i en le ibe r : gucker- S tunden der a b g e s t o r b e n e

a b g e s t o r b e n e n Bak te r i en le ibe r in T raubenzucke r - bouil lon- Bak te r i en le ibe r (Zent r i fuga t ) bouillon kon~rolle

a u f g e n o m m e n [

12 24

12 Ta

(+) ÷ ÷ Z

!

e a lte, sterile Ooli-Traubenzuckerbouillonkultur. PH in allen An- sStzen 4,8. Tuberkelbazillen Typ. humanus Gr. = 1900 Millionen Keime je Kubikzentimeter.

aus Traubenzuckerbou i l lon in 38% der gepri if ten Colisti~mme eine absolute oder part iel le H e m m u n g des Wachs tums der Tuberkelbazi l len (Tabelle 9).

I m Lochte~'t erh/~lt m a n nur mi t 1:20 eingeeilgten Kul turf l i i ss ig- kei ten vereinzel t ia geringem Umfange eine Hemmung . I m Bereich

Tabelle 11. Wachstum vo~ Tuberkelbazillen nach Kontakl bei 370 mit 10 Tage alten Kultur/liissig.

keiten yon ve','schiedenem PH.

K o n t a k t : K o n t a k t : ptt 1 T a g 2 Tagc

Escherichia coli 4,8 ;~ Stamm Nr. 1000 7,0 - - + - - +

1o,o + (+)

Traubenzucker- 4,8 + + (+) bouillonkontrolle 7,0 + + + --

lo,o + +

Tuberkelbazillen Typ. hmnanus Gr. -- 7800 Millionen Keime in 0,9%iger ~aC1-LSsung. Auf- arbeitung naeh H o ~ .

der Hemmmlgszone ist (tie En twick lung der Tuberkelbazi] len hie- mats vollst/~ndig unter - dri ickt (vgl. Lochtest- versuche mi t l ebenden Escherichia coli).

b) B o k t e r i z i d i e .

Bringt ma n dagegen die unve rd i innte K u l t u r - fliissigkeit yon Trauben- zuckerboui l lonkul turen , in denen die Colikeime abges torben sind, mi t Tuberke lbaz i l len in

K o n t a k t , so k a n n die ab tStende F~thigkeit des Coliwirkstoffes von ak t iven Escherichia coli zur Dars te l lung gebracht werden.

Methodik. 4 cm a klare, tiberstehende Kulturfltissigkeit aus Traubenzucker- bouillonkulturen, deren Sterilitgt tiberprtift ist, werden mit Sodal6stmg auf das gewtinsehte Pv. - - meist 6,0 - - gebracht, im Reagensglas mit 0,2 mg Tuberkel- bazillen (yon Petragnani-N/~brboden in 0,2cm a 0,9%iger NaCl-L6sung sus- pendiert) versetzt and bei 370 in Kontakt gehalten. Danach werden 3,5 cm a in ein steriles ZentrifugenrShrehen tibertragen, 15 rain lang bei 2500 Touren zentrifugiert und das ganze Sediment auf ein Petragnani-gShrehen tibertragen. Keine SchwefeMiurebehandlung.

Mit dieser Methode wurden die Eigenschaften des Coliwirkstoffes in Kul tur f l i i ss igkei ten s tudier t . Es ergaben sich folgende Befunde:

Wirkung yon Eseherichia coil auf Myeobucterium tuberculosis. VIII. 383

Tabelle 12. Wachstum von Tuber]celbaziUen nach 48sti~ndigem Kontakt bei 37 ° mit Kultur/li~ssigkeiten, welche au] verschiedene Temperaturen 1/2 Stunde lang

erhitzt waren.

Eseherichia coli S~amm M 25/1 24 Tage alte

Traubenzucker- bouillonkul~ur

%

Unerkif.zt 900 100 o II0 o 1200

75 ~ ~ ~ ~ Z 50 -4- ~ :E ;~ ;~ 25 (+) & + ~: ±

Traubenzuekelbouillonkontrolle t -~-÷, Traubenzuekelbouillonkontrolle 2 ÷ . Die Colikulturflfissigkeiten wurden mit Traubenzuekerbouillon zu den an-

gegebenen Prozents~tzen verdfinnt. S~mtliche LSsungen pn 6,0. Verarbeitung ohne Schwefels~Lre.

Tuberkelbazillen TUp. humanus Gr. ~ 0,2 mg auf 4 cm 3 Kulturfltissigkeit bzw. entspreehende Verdiinnung.

1. E x t r a k t e yon Colibakterien en tha l ten tuberkulos ta t i schen Wirk- s toff (nach eigenen Isol ierungsversuchen) .

2. Lebende Colibakterien geben Wirks to f f an die Kulturf l f iss igkei t

ab ; abgestorbene Colibakterien geben keinen Wirks to f f ab (der Kon- t a k t mi t ihnen bleibt auf Tuberkelbazi l len ohne Einfluft) (Tabelle 10).

3. Die Wirksamke i t des bakter ios ta t i sch-bakter iz iden Prinzipes im

N~hrbSden ist an eine saure Reak t ion gebunden, neutra le und alka- ]isehe Ni~hrlSsung ist unwirksam (Tabelle 11).

4. Der bakter ios ta t i sch-bakter iz ide Coliwirkstoff aus Ni~hrlSsungen ist hi tzebest~ndig, er ver t r~gt T e m p e r a t u r e n bis zu 120 ° C fiir die Dauer 1/2 S tunde (Tabelle 12).

5. Der Wirkstoff , der yon den Bazi l len an die N~hrlSsung abge- geben wird, ist gelegentl ich in 4 Tage a l ten K u l t u r e n nachweisbar,

er ist fiber 23 Tage lang ha l tba r und zeigt erst am 63. Tage seines

Tabelle 13.

Alter der Traubenzucker- bouillonkultur

in Tagen

4 8

10 20 63

~vVachs~um yon Tuberkelbazillen naeh 1--2t~gigem Kontakt mit

Kulturflfissigkeiten - - Coli Nr. 1000 - - verschiedenen

Alters

±

Traubenzucker- bouillon-

kontrollen

÷ + +

÷ ÷ + + + +

Tuberkelbazillen Typ. humanus ~ etwa 3000 Millionen Keime je Kubik- zentimeter Kulturflfissigkeit und Kontrollen Pa 4,8.

384 GERTRUD MEISSNER u n d ERICH HESSE:

Tabelle 14. Waehstum von TuberkelbaziUen nach 48sti~ndigem Kontakt bci 370 mit Kultur]li~ssigkeiten, die verschiedene Filter passiert hatten.

E s e h e r i c h i a coli S t a m m 1000,

3 ~ r o c h e n a l to T r a u b e n - z u c k e r b o u i l l o n k u l t u r

100 Kontrolle

Berke fe ld - f i l t e r

++ +-7

M e m b r a n - U n f i l t r i e r t f i l t e r

0 ++ +-7

Aufen tha l t es im Bru t sch rank einen geringen Verlust seiner Ak t iv i t i i t

(Tabelle 13). 6. Der Coliwirkstoff is t durch Membranf i l t e r f i l t r ie rbar , er ver l ier t

~ber seine A k t i v i t ~ t nach Pass ieren yon Berkefe ldf i l te rn (Tabelle 14). 7. Die Menge des geb i lde ten Wirks to f fes is t yon der Zusammen-

se tzung des Nghrbodens abhgng ig ; geringe A u s b e u t e n ergeben Prob- az idpas t e (F i rmu Maggie) und S t a n d a r d - I I - B o u i l l o n von Merck, bessere S t a n d a r d - I - B o u i l l o n von Merck ; a m bes ten bewi~hrt sich nach unserer

Tabelb 15. Wachstum von Tuberkelbazillen nach Kontakt mit Kultur/li~ssigkeiten (20 Tage alt, unverdi~nnt) aus versehiedenen Bouillongrundlagen, au/ welche die

Colist~imme aus Probazidbouillon i~berimp]t waren.

E s c h e r i e h i a eoli Bou i l lonpu lve r B o u i l l o n p u l v e r P r o b a c i d p a s t e S ta tu re Nr . S t a n d a r d I y o n S t a n d a r d I I y o n y o n der F i r m a

M e r c k Merck M a g g i e

02 ~ (+) (+) 100o ~ ~ ±

M 25/1 ;~ ~ (@) Wachstum der Kontrolle 1 und 2: + J - , + -7 Kulturfliissigkeiten und Traubenzuckerbouillon zur Verdtinnung pn6,0.

Tuberkelbazillen vom Typ humanus Gr. = 0,2rag in 0,9%iger NaC1-Li~sung. Verarbeitung ohne Schwefelsgure.

Tabelle 16.

S t a m m E s c h e r i c h i a coli

lO00 27/2

95/91a 2g/13~

Traubenzucker- bouillonkontrollen

p~ = 6,0

%Vachstum yon T u b e r k e l b a z i l l e n n a c h 4 8 s t i i n d i g e m I~on- t a k t m i t C o l i - K u l t u r f l i i s s i g k e i t e n (38 T a g e a l t ) , PH =6 ,0 ,

h e r g e s t e l l t aus

t t o t t i n g e r - T r a u b e n z u c k e r - i H o t t i n g e r - T r a u b e n z u c k e r - boui l lon m i t P e p t o n i boui l lon ohne P e p t o n

100% 75% 50% 25% 100% 75% 50% 25%

± = + ÷ + + + + + 4 o ± -- (+) + + ++ ++ < (+) (~) (+) + + + + + +

o (+) (+) + + + !-. + +

÷ + ÷ ÷

Wirkung yon Escherichia coli auf Mycobactcrium tuberculosis. VIII. 385

langji~hrigen Erfahrung Traubenzuckerbouil lon auf t to t t inger-Grund- [age mit Peptonzusatz (Tabelle 15 und 16), wobei auf eine saehgem~Be Sterilisierung der Traubenzuekerbouillon besonders zu achten ist.

Eine gleiche bakterizide Wirkung tier Colikulturflfissigkeiten fanden wir bei weiteren Tuberkelbazillensti~mmen vom Typ. humanus, w/ihrend bovine und Geflfigeltuberkelbazillen weniger oder gar nicht beeinfluBt wurden. Ebenso sind frisch herausgezfiehtete Tuberkelbazillenst/~mme vom Typ. humanus etwas schwerer abzutSten als Eltere Laborator iums- st~mme.

I I I . Aus tes tung von Escherichict col i -Stdmmen.

Zur Auswertung yon Colist/~mmen auf ihre Akti~it~t erscheint uns der Bakterizidietest mit Kulturflfissigkeiten als eine geeignete Routinemethode. Mit diesem Verfahren wurden zun~chst 110 Coli- st/imme yon Gesunden und 39 St~mme yon TuberkulSsen geprfift. Als Beispiel ist das Ergebnis yon 9 St~mmen in Tabelle 17 wieder- gegeben.

Tabelle 17. Wachstum von Tuberkelbazillen nach 48stiindigem Kontakt bei 370 mlt Traubenzuckerbouillonkulturfliissigkeiten (22 Tage alt)

verschiedener Escherichia colt.

Lfd. Escherichia coli, S?~amm :Nr. , Verdiinnung der Kulturfliissigkeiten Nr. Typisiemmg nach NXSSL~: 100 % 75 % 5 0 % 25 %

! 1 Spr. 29/1 Typ II ~ ~- q-q- q- Jr 2 Spr. 29/2 Paracoli (~-) ( ~- ) 7 - -k q- 3 Lo. 31/1 TypI (~) ~ +r+ -k-k 4 Lo. 31/2 Typ I I I q--k 5 Die. 32/1 TypI ~_~_ +_~ +~- + + 6 Die. 32/2 Typ I I I + + + + 7 A1. 33/1 TypI + + q-+ 8 M. 25/2a TypI ~ (+) + + 9 M. 25/2b TypI ~ i (-F) -F-k Wachstum der Kontrolle 1 und 2: ÷-L, ÷__.

Tuberkelbazillenstamm Typ. humanus Gr. (20 Tage alt). Verarbeitung ohne Sehwefels/~ure. Verdiinnungsfliissigkeit = Traubenzuckerboufllon pa 6,0.

Von den untersuchten St~mmen sind 4 unwirksam, 3 schwach wirksam und 2 weisen eine gute Wirksamkei t auf. Es gibt aber auch, aUerdings recht selten, hoehaktive Escheriehia coli-St/~mme, deren Kulturflfissigkeiten in einer Verdfinnung yon 3 : 4 und 1 : 2 die Waehs- tumsfi~higkeit der Tuberkelbazillen vol lkommen unterdrficken. Ta- belle 18 enth/flt die ~bers ieht fiber die 110 Colisti~mme yon Gesunden.

Die Tabelle zeigt, dab yon 110 Colikulturfliissigkeiten nur 15 in unverdfinnter Form die Waehstumsf/~higkeit tier Tuberkelbazillen vol lkommen aufheben, yon diesen 10 in 75%iger und 3 in 50%iger

386 GERTRUD MEISSNER und ERICR HESSE :

Verdiinnung. Die letzteren 3 Escherichia coli sind als besonders akt ive St~mme zu bewerten. 36 St~mme waren schwach wirksam, 59 S t~mmen fehlte jeder Effekt . I rgendwelche Zusammenh~nge der an t i tube rku lSsen Wirksamkei t mi t der Typene in te i lung nach N~SSLE l ie$en sich n ich t erkennen. Tabelle 19 gibt die Aufschliisselung unserer

un te r such ten Colist~mme Tabelle 18. Zahl der Escherichia coli-StSmme, nach den NISSLE-Typen deren Kultur/li~ssigkeiten nach 48st~ndigem Kon- wieder. Auch die Imvic- takt mit Tuberkelbazillen bei 37 o in /allenden Reak t ionen zeigten keine Verdi~nnungen angesetzt wurden und die Wachs- tums/iihigkeit yon Tuberkelbazillenin entsprechen- gesetzm/~Bigen Beziehun-

der Weise beein/luflten, gen zur bakter iz iden Wit-

G r a d des V e r d i i n n u n g tier K u l t u r f l f i s s i g k e i t e n kung. I n Tabelle 20 sind Wachs . . . . . . . . . . . . . . von 15 akt iven Colisti~m- tunas 100 % 75 % 50 % 25 %

men die Imvic - Formel 15 l0 3 ;~ und der Bakter iz idie tes t

~k 18 14 13 8 der entsprechenden Kul- (+) 18 20 15 16 turfliissigkeitel~ wiederge- ÷ 30 23 30 ] 8

÷ ÷ 29 43 49 65 geben.

Nicht alle Stamme yon Escherichia coli 39Colis t~mmeaus Stiih- wurden in den oben genannten Verdiinnungen len yon Tuberkul6sen hat- geprfift, nur der Ansatz mit 100% ist mit s/~mt- ten, soweit die kleinen lichen Colist~mmen durehgef/ihrt worden. Coli-Traubenzuckerbouillonkulturen etwa drei Zahlen i iberhaupt ein Ur- Wochen alt. Tuberkelbazillenstamm Typ. hu- teil zulassen, eine etwas manus Gr. Aufarbeitung ohne Schwefels/~ure. geringere tuberkulozide Ak-

tivit/~t, derart , dab unge- f/~hr a/4 unwirksam waren im Gegensatz zu den Colist/~mmen aus Stiih- len yon Nicht tuberkul6sen mit nur etwas mehr als der H/~lfte voll- kommen unwirksamer St/~mme (Tabelle 21). Die statistische Aus- wer tung der Ergebnisse lehrb, dab die gefundenen Differenzen grSB~r sind als der dreifach mit t lere Fehler.

Eine weitere, spi~ter angelegte Versuchsreihe mit im ganzen 42 St/~m- men von Gesunden und Tuberkul6sen ha t te ein /~hnliches Ergebnis (Tabelle 22).

488ti~nd~ Zahl der Escherichia coli-St~imme, deren Kultur]l~tssigkeiten in

T y P e n e i n t e i l u n g nactt NISSL-~ G r a d des W a c h s t u m s der

T u b e r k e l b a z i l l e n

,em Kontakt mit Tuberkelbazillen belassen wurden.

T y p I V T y p I T y p I I T y p ][II

l l . . . . . 13 2 - -

12 1 3 23 3 2 20 ] 2

1

2

4

Paracoli

± (+) +

÷ ÷

Tabelle 19.

W i r k u n g yon Esche r i ch i a coli a u f M y c o b a c t e r i u m tuberculos is . V I I I . 3 8 7

Tabel le 20.

Escheriehia coll Stature Nr.

]Bo. Kol . l~oe. Sw. l~e. :Bo. Z. M. M. Z. Kr . Bo. T. S. Kol.

23 3/2

27/2 O3 27/2 22 26/1 25 /2b 25/2a 26 /2a 19/2 10 13/1 15/1 ~/1

Wachs tum yon Tuberkel- bazi l len naeh Einwirkung yon

Kulturf l i iss igkei t in einer Verdi innung yon

1O0 % I 75 % t 50% I 25%

(+) (+) (+) (+)

E. coli ~ E s c h e r i c h i a coli ; i n t e rm . F. =

• _ (+ )

(+) (+) + + (+) + +

(+)_ (+) (+)

Imvic-Formel

I Me~hy1- Voges-

Pros- Indol rot kauer

2~ ~ -i- z

i n t e r m e d i a r e F o r m .

Z i t r a t

÷

(+)

(+) (+) (+)

(+)

Bezeichnung des

Stammes

E . c o l i E . coli

P a r a c o l i E . coli

i n t e r m . F. E. coli

i n t e r m . F. i n t e r m . F. i n t e r m . F.

E. coli i n t e r m . F.

E. coli E. coli

Pa raco l i E. col

Tabe l l e 21. Zahl der Escherichia col i -S tdmme, deren Kul tur / l i~ss igkei ten nach 48sti~ndigem K o n t a k t bei 370 - - PH -- 6,0 - - unverdi~nnt das Wachs tum

yon Tuberkelbazi l len entsprechend beein]luflten.

Grad des Wachs tums der Tuberkelbazi l len

Herkunf t der Colisg~mme yon

Nicht tuberkulSsen

15 ] = 51 w i rk sam 18 / u n d s chwach w i r k s a m 18

30 [ = 59 u n w i r k s a m 29 J

110

Tuberku16sen

O } = 10 w i r k s a m 7 u n d schwach w i r k s a m 12}

17 = 29 u n w i r k s a m

39

0 ±

(+) ÷

÷ ~ -

G e s a m t z a h l

Tabe l l e 22. Ant i tuberku l6se W i r k s a m k e i t yon 191 verschiedenen Coli-Kulturf l i~ssigkeiten.

Anti tuberkulSse Wi rksamke i t

1. Versuchsre ihe w i r k s a m u n d s chwach w i r k s a m u n w i r k s a m . . . . . . . .

2. Versuchsre ihe w i r k s a m u n d schwach w i r k s a m u n w i r k s a m . . . . . . . .

G e s a m t z a h l der u n t e r s u c h t e n S t~mme . . . . . . . . . . 126

Arch. exper. Path . u. Pharmakol . , Bd. 209.

Zahl der Colist~mme, deren Kulturf lf iss igkei ten nach 48sti indigem Kon tak t bei 370 __ pg = 6,0 - - das VVachstum yon Tuberkelbazi l len entsprechend

beeinflull ten

Herkunf t der St~imme yon

Nicht- tuberkulSsen

51 = 46% 59 = 54%

7 = 44% 9 = 56%

TnborkulSsen

10 = 26% 29 = 74%

6 = 23 % 20 = 77%

65

26

388 G. M~ISS~'R und E. HEssE: Eschcrichia coh auf Mycobacterium. VIII.

Bei der aul]erordentlichen Variabilit/~t der Colibakterien und ge- messen an der Zahl der t~glich im Darmk~nal des Menschen ent- stehenden Colibakterien (ca. 72 000 Milliarden Keime) ist die Zahl der untersuchten St/~mme nattirlich noch viel zu klein, um ein exaktes Urteil zu f/~llen. Die bis jetzt vorliegenden Ergebnisse sind nur als Hinweise zu werten, in welcher Richtung die Bedeutung der Darmflora bei der Tuberkulose liegen dfirfte.

Zusammen/assung. 1. Lebende Darmbakterien des Menschen - - Escherichia coli - -

besitzen antibiotisehe Wirkuagen auf Mycobacterium tuberculosis. Die bakteriostatischen F~higkeiten sind im WRmuTschea Ztichtuags- verfahren und im Lochtest, die bakteriziden Eigenschaften im direkten Kontakt mit Tuberkelbazillen erkeanbar. Die lebenden Colibakterien sind yon untersehiedlicher Aktivit~t. Hochwirksame St~mme sind selten. Ihre Aktivit~tserhaltung in vitro gelingt fiber mehrere Jahre bei zwciti~giger ~berimpfung auf Traubenzuckerbouillon mit Hottinger- Grundlage.

2. Aktive Escherichia coli produzieren bei ihrem Wachstum bakterizide Substanzen, welche in schwach saurem Milieu optimal wirken, hitzebest/~ndig und im Brutschrank mehrere Wochen lang haltbar sind. Ob ~och andere Substanzen gebildet werden, werden die I~olierungsarbeiten lehren.

3. Zur Auswertung von Escherichia coli-St/hnmen eignet s~ch der Bakterizidietest mit keimfreien Kulturflfissigkeiten. Die Aktivit/~t der Colikeime zeigt keine gesetzm~fligen Beziehungen zu ihrer Type~:- einteilung nach ~IS.'.LE bzw. zur Imvic-Formel.

4. Die Kulturflfissigkeiten von Colist/~mmen Tuberkul6ser weisen eine geringere antituberkul6se Wirksamkeit auf als diejenige yon ge- sunden Menschen.