Aus der Klinik für Chirurgie mit Poliklinik

der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Direktor: Prof. Dr. med. Dr. h.c. W. Hohenberger

Die Evaluation von Humanem Guanylat-Bindungsprotein-1 als Marker

im Blutserum für Entzündung und Sepsis

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung der Doktorwürde

der Medizinischen Fakultät

der

Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

vorgelegt von

Julia Annette Tonak

aus Erlangen

Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. J. Schüttler

Referent: Prof. Dr. med. Dr. h.c. W. Hohenberger

Korreferent: Prof. Dr. rer. nat. Dr. rer. biol. hum. M. Stürzl

Tag der mündlichen Prüfung: 20.07.2011

Inhaltsverzeichnis

1 ZUSAMMENFASSUNG ................................................................ 1

2 EINLEITUNG ................................................................................ 3

2.1. Begriffserklärung Entzündung, Sepsis und Sepsis-assoziierte

Erkrankungen ................................................................................ 3

2.2. Epidemiologie der Entzündung und Sepsis ................................... 6

2.3. Pathophysiologie der Entzündung und Sepsis .............................. 7

2.4. Prognostische Scores zur Schweregradeinschätzung und

Verlaufskontrolle einer Entzündung und Sepsis .......................... 11

2.5. Behandlung der Entzündung und Sepsis .................................... 12

2.6. Diagnosestellung und Entzündungs- und Sepsismarker ............. 14

2.6.1. Diagnosestellung und generelle Entzündungs- und

Sepsismarker .............................................................................. 14

2.6.1.1. Leukozyten .................................................................................. 14

2.6.1.2. C-reaktives Protein (CRP) ........................................................... 15

2.6.1.3. Procalcitonin (PCT) ..................................................................... 15

2.6.1.4. Interleukin-6 ................................................................................ 16

2.6.1.5. Der Stellenwert der Entzündungs- und Sepsismarker ................. 17

2.6.2. Humanes Guanylat-Bindungsprotein-1 (hGBP-1) ....................... 18

2.6.2.1. Grundlegende Mechanismen bei Entzündung ............................ 18

2.6.2.2. Molekulare Kennzeichen und Eigenschaften der

hGBP-Familie .............................................................................. 19

2.6.2.3. Funktion von hGBP-1 .................................................................. 20

2.6.2.4. Nachweisbarkeit von hGBP-1 ..................................................... 22

2.6.2.5. Überlegungen zu diagnostischen und therapeutischen

Möglichkeiten von hGBP-1 .......................................................... 23

2.7. Zielsetzung .................................................................................. 25

3 MATERIAL UND METHODEN .................................................... 26

3.1. Das Studienkollektiv .................................................................... 26

3.1.1. Das Patientenkollektiv ................................................................. 26

3.1.2. Der Studienarm: Sepsis-Patienten .............................................. 28

3.1.3. Der Studienarm: Nicht-Sepsis-Patienten ..................................... 30

3.1.4. Die Studienuntergruppe: Patienten mit Entzündung ................... 33

3.2. Die Methode zur IL-6- und hGBP-1-Messung:

Der Sandwich-ELISA .................................................................. 34

3.2.1. Das allgemeine Prinzip des Sandwich-ELISA ............................. 34

3.2.2. Die hGBP-1-Messung mittels Sandwich-ELISA .......................... 35

3.2.3. Die IL-6-Messung mittels Sandwich-ELISA ................................. 38

3.2.4. Die Kalkulation der ELISA-Ergebnisse ........................................ 39

3.3. Die statistische Auswertung ........................................................ 44

4 ERGEBNISSE ............................................................................. 47

4.1. Die Korrelation von CRP, Leukozyten, PCT und IL-6................ 479

4.1.1. Die Korrelation von CRP und Leukozyten ................................... 49

4.1.2. Die Korrelation von PCT mit anderen Entzündungsmarkern ....... 51

4.1.3. Die Korrelation von IL-6 mit anderen Entzündungsmarkern ........ 51

4.2. Die statistische Auswertung von hGBP-1 .................................... 56

4.2.1. Das Patientenkollektiv ................................................................. 56

4.2.2. Der Studienarm: Sepsis-Patienten .............................................. 57

4.2.3. Der Studienarm: Nicht-Sepsis-Patienten ..................................... 59

4.2.4. Die Patientengruppe mit Entzündung.......................................... 60

4.3. Zusammenfassung der Ergebnisse............................................. 64

5 DISKUSSION .............................................................................. 65

6 LITERATURVERZEICHNIS ........................................................ 76

7 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ................................................... 94

8 ANHANG ..................................................................................... 97

9 DANKSAGUNG........................................................................... 99

10 LEBENSLAUF ......................... Fehler! Textmarke nicht definiert.

1

1 ZUSAMMENFASSUNG

Einleitung: Die frühzeitige Erkennung einer Entzündung und beginnenden

Sepsis bei Patienten ist immens wichtig. Trotz etablierter

Entzündungsmarker im Blut, wie z.B. die Leukozytenzahl und CRP, ist die

Suche nach einem sichereren und spezifischeren Marker immer noch aktuell.

Endothelzellen spielen eine entscheidende Rolle bei entzündlichen

Prozessen. Untersuchungen haben gezeigt, dass durch inflammatorische

Zytokine aktivierte Endothelzellen insbesondere „Humanes Guanylat-

Bindungsprotein-1“ (hGBP-1) exprimieren. Die Untersuchung von hGBP-1

als potentieller Sepsis- bzw. Entzündungsmarker liegt somit nahe.

Material und Methode: Es wurden Blutserumproben von Patienten der

Chirurgischen Universitätsklinik Erlangen-Nürnberg abgenommen und auf

die Expression von hGBP-1 hin untersucht. Die Blutabnahmen wurden bei

unterschiedlichen Entzündungszuständen durchgeführt und die Güte von

hGBP-1 als Sepsis- bzw. Entzündungsmarker geprüft. Des Weiteren wurde

hGBP-1 mit den Entzündungsmarkern Leukozyten, CRP, IL-6 und

Procalcitonin im Serum verglichen.

Ergebnisse: Der Nachweis von hGBP-1 im Blutserum ist möglich. Die

Sensitivität von hGBP-1 als Entzündungsmarker liegt bei 7,5%, die Spezifität

bei 95,8%. HGBP-1 als Sepsismarker hat eine Sensitivität von 66,7% und

eine Spezifität von 97,3%. Im Exakten Fisher-Test wird hier ein signifikanter

Zusammenhang bestätigt. HGBP-1 korreliert im Gesamt-Patientenkollektiv,

bei septischen Patienten und in der Untergruppe der Patienten mit

Entzündung signifikant mit der Leukozytenzahl.

Diskussion: Durch die starke Korrelation mit der Leukozytenzahl als

etablierter Entzündungsmarker wird bestätigt, dass hGBP-1 eine Entzündung

anzeigt. Ein signifikanter Zusammenhang zur Sepsis ist belegt. Eine weitere

Studie kann Aufschluss über die diagnostische Aussagekraft anhand der

prädiktiven Werte von hGBP-1 geben. Zudem sind Blutprodukte in

unterschiedlichen Medien unterschiedlich empfindlich nachweisbar. So ist

eine Analyse von hGBP-1 in einem anderen Medium, wie z.B. Blutplasma,

oder eine Verbesserung des Detektionssystems anzuraten.

2

EXECUTIVE SUMMARY

Background: Early detection of inflammation or beginning sepsis in patients

plays an important role. Although there are some established markers, that

indicate inflammation early, like white blood cells and CRP, the search for a

more reliable and more specific marker is still relevant. Endothelial cells play

an important role in inflammations. Analyses showed, that endothelial cells,

which are activated by inflammatory cytokines, express particularly “human

guanylate binding protein-1”. Here was investigated hGBP-1 as a potential

marker of sepsis respectively of inflammation.

Material and methods: Blood serums of patients of the Department of

Surgery at the University hospital of Erlangen-Nürnberg were taken to

explore the expression of hGBP-1. The collection of blood samples was

accomplished in different states of inflammation. Thus the quality of hGBP-1

as marker of sepsis respectively of inflammation was tested. Furthermore

hGBP-1 was compared to inflammation markers like white blood cells, CRP,

IL-6 and Procalcitonin in blood serum.

Results: Analysis shows, that hGBP-1 in serum is detectable. With a

sensitivity of 7.5% and a specificity of 95.8% hGBP-1 serves as inflammation

marker. The sensitivity for hGBP-1 as sepsis marker is 66.7% and the

specificity is 97.3%. The fisher-yates exact test verifies a significant

coherence. A correlation between hGBP-1 and white blood cell count is

found in total patient population, in septic patient group and in patient group

of inflammation.

Conclusions: Because of the strong correlation between hGBP-1 and white

blood cell count approves as established inflammation marker, hGBP-1 is

certified to identify an inflammation. A significant coherence between hGBP-1

and septicaemia is confirmed. Another clinical trial would allow a better

understanding of diagnostic value by means of predictive values of hGBP-1.

Beyond that, blood products are detectable in different mediums and different

ways. Therefore an exploration of hGBP-1 in another medium, such as

bloodplasma, or by an advanced detection system is recommended.

3

2 EINLEITUNG

2.1. Begriffserklärung Entzündung, Sepsis und Sepsis-assoziierte

Erkrankungen

„Notae vero inflammationis sunt quattuor:

rubor et tumor cum calore et dolore.” [015]

So beschrieb A. C. CELSUS im 1. Jahrhundert n. Chr. die Zeichen der

Entzündung, die noch heute als die vier Kardinalsymptome einer lokalen

Entzündung gelten. Zu Rötung, Schwellung, Überwärmung und Schmerz

fügte C. GALEN im 3. Jahrhundert n. Chr. noch functio laesa (lat.

„eingeschränkte Funktion“) als fünfte Säule der lokalen Entzündung hinzu.

[073]

Im Vergleich zur Entzündung ist die Sepsis (griech. σηπω „Fäulnis“) ein

Krankheitszustand, der schon wesentlich früher beschrieben wurde.

HIPPOKRATES erklärte bereits 400 v. Chr. einen septischen Zustand als ein

durch faulende Materie verursachtes Fieber. [042]

In der Vergangenheit wurde die Beschreibung und Definition einer Sepsis oft

verändert und abgewandelt. Ursache dafür war die große Variabilität in

Ausmaß, Auslöser und Krankheitsbild einer Sepsis. Erst 1914 erklärte H.

SCHOTTMÜLLER, Ordinarius für Innere Medizin in Hamburg:

„Eine Sepsis liegt dann vor, wenn sich innerhalb des Körpers ein Herd

gebildet hat, von dem konstant oder periodisch pathogene Bakterien in den

Blutkreislauf gelangen, und zwar derart, dass durch diese Invasion subjektive

und objektive Krankheitserscheinungen ausgelöst werden.“ [076]

Diese Erläuterung ist nun Vorbild für viele weitere Definitionen einer Sepsis

und wird bis heute in ihrem Kern nicht verändert. 2005 definierten H. P.

SCHUSTER und U. MÜLLER-WERDAN die Sepsis als „die Gesamtheit der

lebensbedrohlichen klinischen Krankheitserscheinungen und

pathophysiologischen Veränderungen als Reaktion auf die Aktion pathogener

Keime und ihrer Produkte, die aus einem Infektionsherd in den Blutstrom

eindringen, die großen biologischen Kaskadensysteme und spezielle

4

Zellsysteme aktivieren und die Bildung und Freisetzung humoraler und

zellulärer Mediatoren auslösen.“ [077]

Vieles in der Pathophysiologie einer Sepsis ist auch in der heutigen Zeit noch

nicht vollständig geklärt und erschwert die Diagnose.

Diese Arbeit befasst sich mit der Suche nach einem neuen möglichen

Entzündungs- und Sepsismarker, der eine Entzündung und Sepsis früher

erkennen, diagnostizieren und damit auch besser behandeln lässt.

Unter den Begriffen „Entzündung, Sepsis und Sepsis-assoziierte

Erkrankungen“ versteht man eine Reihe von verschiedenen

Allgemeinreaktionen des Körpers, deren Unterschiede nun im Folgenden

zusammengefasst werden.

Entzündung

Die fünf Kardinalzeichen einer Entzündung, Rubor, Calor, Tumor, Dolor und

Functio laesa, die die lokalen Zeichen einer Entzündung beschreiben,

werden hervorgerufen durch Abwehrmechanismen des Gefäß- und

Bindegewebes. Sie werden unter anderem verursacht durch Vasodilatation,

erhöhte Gefäßpermeabilität, physikalische und chemische Stimulation der

Nozizeptoren und dem Schmerz selbst. [079] Neben diesen lokalen Zeichen

kann eine Entzündung auch systemische Symptome hervorrufen. Diese

werden dann als Zustand Systemic Inflammatory Response Syndrome

bezeichnet.

Systemic Inflammatory Response Syndrome (SIRS)

1992 wurde in einer Konferenz des American College of Chest Physicians

(ACCP) und der Society of Critical Care Medicine (SCCM) nicht nur der

Begriff des SIRS, in Abgrenzung zur Sepsis, geprägt, sondern auch der

Zustand eines SIRS bzw. Sepsis definiert. [053]

Ein SIRS liegt dann vor, wenn der Patient mindestens zwei der folgenden

Kriterien erfüllt: Körpertemperatur >38°C oder <36°C, Herzfrequenz >90/min,

Atemfrequenz >20/min oder PaCO2 <32mmHg oder die Notwendigkeit einer

maschinellen Beatmung, Leukozyten >12.000/µl oder <4.000/µl oder >10%

5

unreife Formen. Die Ursache für ein SIRS kann unterschiedlich sein, geht

aber ohne Infektion einher. [025]

Sepsis

Eine Sepsis hingegen ist gekennzeichnet durch eine systemische

Entzündungsreaktion, also ein SIRS, und zusätzlich einer Infektion. Der

Nachweis einer Infektion, und damit die Invasion von Mikroorganismen in

den Körper, kann hierbei optimalerweiser mikrobiologisch belegt oder ohne

mikrobiellen Nachweis als stark verdächtig akzeptiert werden. [046]

Schwere Sepsis

Ein Patient leidet definitionsgemäß unter einer schweren Sepsis, wenn zu

der Sepsis noch eine Organdysfunktion hinzukommt. Dabei kann jedes

Organ betroffen sein und sich unterschiedlich äußern. Beispiele hierfür sind

Depressionen, Hypotonie, Tachykardie, Anstieg der Leberenzyme, Oligurie,

Kreatininanstieg, Thrombozytopenie, Koagulationsstörung, Minderperfusion.

[025]

Septischer Schock

Als septischen Schock bezeichnet man einen Zustand der Sepsis, bei dem

der Patient trotz ausreichender Volumensubstitution unter einem Schock,

Organdysfunktion und einer Hypotonie leidet. Die Hypotonie ist hier definiert

als systolischer Blutdruck <90mmHg, MAP (Mean Arterial Pressure)

<60mmHg oder als Abfall des systolischen Blutdrucks um >40mmHg; dabei

darf keine andere Ursache für die Hypotonie vorliegen. [046]

Multiple Organ Dysfunction Syndrome (MODS)

Gefürchtete Komplikation einer Sepsis ist, wenn ein Patient an einem MODS

erkrankt. Als MODS gilt die Funktionsstörung mindestens zweier Organe

beim akut kranken Patienten, so dass dessen Homöostase nicht ohne

Intervention stabilisiert werden kann. [007]

6

Abb. 1: Grafik zu Entzündung, Sepsis und Sepsis-assoziierten Erkrankungen

MODS

Septischer Schock

Schwere Sepsis

Sepsis

SIRSInfektion

2.2. Epidemiologie der Entzündung und Sepsis

Sepsis ist eine der häufigsten Todesursachen bei kritisch kranken Patienten

in den USA. Jährlich erkranken 750.000 Amerikaner an einer Sepsis und

mehr als 210.000 davon sterben. [036] G. S. MARTIN et al. veröffentlichten

2003 eine Studie, die zeigte, dass auch die Häufigkeit einer schweren Sepsis

über die Jahre zunimmt. 1979 waren es noch 83 Fälle/100.000 Einwohner,

2000 zählten G. S. MARTIN et al. schon 240 Fälle/100.000 Einwohner. [051]

Auch in Europa zählt die Sepsis zu einer sehr häufigen Komplikation. Eine

Studie der Sepsis Occurrence in Acutely Ill Patients (SOAP) aus dem Jahr

2006 berichtete, dass mehr als ein Drittel (35%) der Patienten auf einer

Intensivstation in Europa eine Sepsis entwickeln. Die Mortalität lag hierbei

bei 27%. [096]

Während die Mortalität einer schweren Sepsis ebenfalls zwischen 25% und

30% lag, stieg die Mortalität bei einem septischen Schock auf 40% bis 70%.

[075]

7

G. FRIEDMAN et al. erklärten 1998 in ihrer Veröffentlichung, dass trotz

Zunahme des Auftretens eines septischen Schocks die prozentuale

Sterblichkeit aber zurückgeht. [024]

Aktuelle Studien zeigen, dass die Pneumonie mit 40% die häufigste Ursache

einer Sepsis darstellt. Daneben lösen intraabdominale Infektionen (20%),

katheterbedingte oder primäre Bakteriämien (15%) und Infektionen des

Harntrakt (10%) ebenfalls häufig eine Sepsis aus. Während früher vor allem

gram-negative Erreger für eine Sepsis verantwortlich waren, sind heute

gram-positive und gram-negative Erreger gleichermaßen verursachend.

Wesentlich seltener sind Infektionen durch Pilze oder Parasiten. Bei einem

Drittel der Patienten ist jedoch kein Erreger nachweisbar. Mögliche Gründe

dafür sind eine bereits greifende antimikrobielle Therapie (z.B. in Form von

Antibiotika-Gabe) oder Probleme bei der Probenentnahme (z.B. durch

fehlende Sputumproduktion). [096]

2.3. Pathophysiologie der Entzündung und Sepsis

Pathophysiologisch ist eine Entzündung, insbesondere eine Sepsis, ein

Zusammenspiel aus proinflammatorischen, antiinflammatorischen,

prokoagulativen und antikoagulativen Interaktionen, um den Körper von den

eingedrungenen und in der Blutbahn verbreiteten Erregern zu befreien.

Dabei spielen das angeborene und das erworbene Immunsystem eine

zentrale Rolle.

Das angeborene Immunsystem reagiert zuerst auf eine Infektion. Aktiviert

werden die Zellen des angeborenen Immunsystems (Makrophagen,

Monozyten, Granulozyten) durch Bindung der eingedrungenen

Mikroorganismen an Toll-like Rezeptoren (TLR) auf der Oberfläche der

Immunzellen. Hierbei binden z.B. TLR-2 die Peptidoglykane von gram-

positiven Bakterien und TLR-4 die Lipopolysaccharide von gram-negativen

Bakterien. Die Bindung des Pathogens induziert die Dimerisierung der TLR,

wodurch eine intrazelluläre Signalkaskade aktiviert wird, die dann zu einer

Sezernierung von proinflammatorischen Zytokinen, wie TNF-α und IL-1β u.a.,

und antiinflammatorischen Zytokinen wie IL-10 u.a. führt. [075]

8

Makrophagen und Monozyten gehören aber auch zu den Antigen-

präsentierenden Zellen, wodurch hier eine Verknüpfung mit dem erworbenen

Immunsystem entsteht.

Die erworbene Immunabwehr wird vermittelt durch aktivierte B- und T-Zellen.

Die adaptive Immunantwort unterliegt dem Prinzip der klonalen Selektion.

Dabei löst ein Antigen durch Bindung eine klonale Expansion spezifischer B-

Zellen aus. Ausdifferenzierte B-Zellen, sogenannte Plasmazellen,

produzieren spezifische Antikörper verschiedener Ig-Klassen, die durch

unterschiedliche konstante Teile, bezeichnet als FC-Anteile, gekennzeichnet

sind. Unter anderem können diese Antikörper die für die Immunabwehr

wichtige Komplementkaskade aktivieren. So kommt es z.B., eingeleitet durch

ein einziges IgM-Molekül, zur Lyse der befallenen Zelle.

T-Zellen sind in der Lage intrazelluläre Erreger zu bekämpfen. Mit speziellen

Rezeptoren erkennen sie die körperfremden Antigene, die mittels MHC-

Komplexen auf befallenen Zellen präsentiert werden. CD-8 tragende „Killer-

T-Zellen“ werden dabei durch präsentierte MHC-Klasse-I-Proteine aktiviert

und leiten damit die Apoptose der befallenen Zelle ein. Die CD-4 tragende

„Helfer-T-Zelle“ (TH-Zelle) wird stattdessen von MHC-Klasse-II-Proteinen

aktiviert. MHC-II befindet sich auf Makrophagen, B-Zellen und dendritischen

Zellen. [035] TH1-Zellen und TH2-Zellen produzieren entgegenwirkende

Zytokine. So sezerniert die TH1-Zelle proinflammatorische Mediatoren, wie

z.B. TNF-α, Interferon-γ und IL-2, und die TH2-Zelle antiinflammatorische

Mediatoren, wie z.B. IL-4 und IL-10. Die entscheidenden Faktoren, ob nun

TH1- oder TH2-Zellen aktiviert werden, sind bisher nicht vollständig bekannt.

Vermutet wird ein Zusammenhang mit der Art des Pathogens und der

Infektion. [036] Proinflammatorische Zytokine führen neben einer Aktivierung

von Endothelzellen, welche daraufhin Stickoxide (NO), einen starken

Vasodilatator, bilden, auch zu einer Hochregulation von Adhäsionsmolekülen

(Selektine, Integrine, ICAM-1 und VCAM-1 [035]) in Endothelzellen und

neutrophilen Granulozyten. Neutrophile Granulozyten bekämpfen nicht nur

körperfremde Mikroorganismen, sondern führen am Endothel auch zur

Gewebsschädigung. Dabei erhöhen die ausgeschütteten Mediatoren die

Gefäßpermeabilität, was zu Ödemen in den Organen führt. [075] Am

9

Endothel führen die proinflammatorischen Zytokine zur Leukozytenadhäsion

und damit zur Leukozyten-Extravasation ins entzündete Gewebe. [047]

Neben der pro- und antiinflammatorischen Immunantwort reagiert der Körper

auch mit einer koagulativen Wirkung auf die systemische Infektion.

Lipopolysaccharide stimulieren Endothelzellen zur vermehrten Ausschüttung

von Thromboplastin. Dies führt im Zuge der damit aktivierten

Gerinnungskaskade zu einer katalysierten Umwandlung von Fibrinogen zu

Fibrin, was eine verstärkte Gerinnung zur Folge hat.

Physiologischerweise werden auch Faktoren zur Hemmung und damit zur

Modulation der Gerinnung aktiviert. Neben Protein S, Antithrombin III und

TFPI (Tissue Factor Pathway Inhibitor) wird auch Protein C aktiviert. Dabei

katalysiert die Bindung von Thrombin an Thrombomodulin wiederum die

Bindung von Protein C an einen endothelialen Protein C Rezeptor. Das so

aktivierte Protein C inaktiviert nun Faktor Va und VIIIa der

Gerinnungskaskade und hemmt die Synthese eines Plasminogenaktivator-

Inhibitors 1. Aktiviertes Protein C senkt darüber hinaus die

Leukozytenadhäsion, Apoptose und Zytokinproduktion.

Während einer Sepsis sinkt der Spiegel an Protein C, Protein S, Antithrombin

III und TFPI-1. Lipopolysaccharide und TNF-α reduzieren die Synthese von

Thrombomodulin und dem endothelialen Protein C Rezeptor, was letztlich zu

einer Störung der Fibrinolyse führt und somit Mikrothromben und

Mikrozirkulationsstörungen verursachen kann. [075]

Diese Verbindung zwischen Entzündung und Mikrothromben führt zu der in

der Sepsis auftretenden Zellhypoxie, zum anaeroben Metabolismus und

letztlich zum Zelltod. [025]

Neben der hoch inflammatorischen Phase ist die Sepsis auch durch eine

auftretende immunsuppressive Phase gekennzeichnet.

Die Theorie einer kompensatorischen antiinflammatorischen Antwort stellten

R. C. BONE et al. im Jahre 1997 auf. Sie nannten diesen Zustand

Compensatory Anti-inflammatory Response Syndrome (CARS) und

definierten ihn als verminderte Expression (<30%) von HLA-DR (Human

Leukocyte Antigene) auf Monozyten und reduzierte Fähigkeit der Monozyten

inflammatorische Zytokine, wie TNF-α oder IL-6, zu bilden. [008]

10

Die Vorstellung einer immunsuppressiven Phase erklärt das bis dahin nicht

erklärbare aber häufige Auftreten sekundärer Infektionen während einer

SIRS oder Sepsis. Solche Sekundärinfektionen können mit verursachend für

die gefürchtete Spätletalität sein. Dabei ist dieses Phänomen eines CARS

aber nicht als globales Defizit, sondern als Anpassung des Immunsystems,

eine überschießende inflammatorische Reaktion des Körpers abzudämpfen,

zu verstehen. [001]

Mögliche Mechanismen der Immunsuppression werden im Folgenden

vorgestellt. Studien zeigten, dass bei Patienten nach Unfällen oder

Verbrennungen erniedrigte TH1-Zytokinspiegel im Blut nachweisbar sind,

während die antiinflammatorischen TH2-Zytokine erhöht sind. Andere Studien

bewiesen, dass das antiinflammatorische IL-10 bei Sepsispatienten nicht nur

erhöht ist, sondern auch als Prognosefaktor für die Mortalität herangezogen

werden kann. Demnach geht man bei einer Sepsis von einer Verschiebung

von der inflammatorischen TH1- zur antiinflammatorischen TH2-Antwort aus.

Ein weiterer Mechanismus der Immunsuppression wird unter dem Begriff der

Anergie zusammengefasst. Anergie bezeichnet dabei den Zustand der T-

Zelle, die nicht funktionstüchtig ist. [036] J. D. PELLEGRINI et al.

beschrieben in ihrer Veröffentlichung aus dem Jahr 2000, dass Patienten, die

ein Trauma oder Verbrennungen erlitten haben, verminderte Spiegel

zirkulierender T-Zellen aufwiesen und die überlebenden T-Zellen anergetisch

waren. [063]

Die Sepsis-induzierte Apoptose von CD4-T-Zellen, B-Zellen und

dendritischen Zellen führt zu einem weiteren immunsuppressiven Effekt. Bei

mehr als 75% der Sepsispatienten liegt der Lymphozytenspiegel unter dem

der Norm eines gesunden Patienten. Ursache dafür mag ein

stressinduzierter endogener Anstieg von Glucocorticoiden sein. Diese

Apoptose führt wiederum zu Anergie und zur Ausschüttung von

antiinflammatorischen Zytokinen.

Die Immunsuppression kann aber auch durch einen Mangel an MHC-Klasse-

II-Komplexen auf Makrophagen auftreten und damit zu einem Mangel an

proinflammatorischer Mediatorbildung führen. [036]

R. C. BONE beschrieb neben der Phase des CARS auch die Möglichkeit

eines Mixed Antagonistic Response Syndrome (MARS). Dabei kommt es

11

abwechselnd zu Schüben eines SIRS und eines CARS. Es kann somit als

unbalancierte Ausschüttung pro- und antiinflammatorischer Mediatoren

betrachtet werden. Ohne eine Antwort in seiner Veröffentlichung aus dem

Jahr 1996 zu geben, warf R. C. BONE damit die Frage auf, welche

Auswirkungen die immunsuppressive Phase wiederum auf die

proinflammatorische Kaskade hat. [006]

2.4. Prognostische Scores zur Schweregradeinschätzung und

Verlaufskontrolle einer Entzündung und Sepsis

Um eine Krankheit und insbesondere die Schwere einer Krankheit

quantifizieren zu können, behilft sich die Medizin mit sogenannten Scoring-

Systemen. Mithilfe dieser Scoring-Systeme läßt sich aber nicht nur die

Schwere und damit verbunden die Prognose eines Patienten objektivieren,

sondern sie unterstützen den behandelnden Arzt auch in seiner

Behandlungsentscheidung. Behandlungsergebnisse können anhand solcher

Scores objektiviert werden und helfen damit bei der Verbesserung der

Therapie. Durch die Möglichkeit der früheren Identifikation schwerkranker

Patienten und Behandlungsentscheidungen wird die klinische Relevanz

solcher Scoring-Systeme weiter ansteigen. [005]

Die richtige Wahl eines Scoring-Systems richtet sich nach dem

Verwendungszweck, Erhebungsaufwand und den entstehenden Kosten.

Modelle zur Erfassung der Morbidität, Mortalität und des therapeutischen

Aufwandes stehen zur Verfügung. Zu den bekanntesten Scores der

Intensivmedizin gehören TISS (Therapeutic Intervention Scoring System),

APACHE (Acute Physiology and Chronic Health Evaluation), SAPS

(Simplified Acute Physiology Score), MPM (Mortality Predicting Model) und

SOFA (Sequential Organ Failure Assessment). [039]

Diese Scoring-Systeme werden überarbeitet, verbessert und

weiterentwickelt. Aus diesem Grund gibt es einige Modelle bereits in der

zweiten und dritten Generation. S. LEMESHOW und J. R. LE GALL

beschrieben 1994 in ihrer Veröffentlichung, dass die Modelle der dritten

Generation ihren jeweiligen Vorgängerversionen überlegen sind. [044]

12

Die Möglichkeiten solcher Scoring-Systeme sind aber auch begrenzt. Sie

werden nie mit absoluter Sicherheit die Überlebenswahrscheinlichkeit oder

die Irreversibilität einer Krankheit wiedergeben können. [092]

2.5. Behandlung der Entzündung und Sepsis

Über die optimale Behandlung einer Sepsis sind sich führende Gremien nicht

einig. Die Variabilität und vor allem die Komplexität einer Sepsis machen

eine richtige Therapie sehr schwierig. Von entscheidender Bedeutung ist

eine frühe Diagnosestellung. Gerade hier zeigt sich die Schwierigkeit, denn

eine Sepsis zu erkennen, ist oft die größte Herausforderung. Darauf wird im

nächsten Kapitel näher eingegangen.

2008 veröffentlichte die Surviving Sepsis Campaign (SSC) eine überarbeitete

Fassung der International Guidelines For Management Of Severe Sepsis

And Septic Shock aus dem Jahr 2004. Trotz unterschiedlicher Ansichten

erarbeiteten internationale Experten gemeinsame Leitlinien für die

Behandlung einer Sepsis. Um den verschiedenen Meinungen gerecht zu

werden, wurde in den Richtlinien das GRADE (Grades of Recommendation,

Assessment, Development and Evaluation)-System verwendet. Dabei wurde

zwischen starker und schwacher Empfehlung und zudem nach abgestuften

Evidenzgraden unterschieden. [020]

Auf eine ausführliche Erläuterung der Therapie wird an dieser Stelle

verzichtet und lediglich ein Abriss der Behandlung einer Sepsis

wiedergegeben.

Das Management einer Sepsis umfasst zunächst eine initiale Stabilisierung

und Infektionskontrolle. Darin beinhaltet ist die anfängliche Stabilisierung

(innerhalb der ersten sechs Stunden), die Diagnosestellung, eine Antibiotika-

Therapie, die Identifizierung des Infektionsherdes und dessen Sanierung. Als

hämodynamische Unterstützung und adjuvante Therapie empfiehlt sich eine

Flüssigkeitszufuhr, die Gabe von Vasopressoren, eine inotrope Therapie,

Steroidgabe und rekombinantes humanes aktiviertes Protein C (rhAPC). Als

weitere supportive Therapie stehen eine Reihe von Möglichkeiten zur

Verfügung: Blutprodukte, mechanische Beatmung bei sepsis-induziertem ALI

(Acute Lung Injury) / ARDS (Acute Respiratory Distress Syndrome),

13

Sedierung, Analgesie und neuromuskuläre Blockade, Blutzuckerkontrolle,

Nierenersatztherapie, Bikarbonat-Therapie, Stressulkusprophylaxe,

Erwägung einer Therapielimitierung. [020]

Aber der wohl wichtigste Faktor in der Behandlung einer Sepsis ist die Zeit.

A. KUMAR et al. beschrieben 2006, dass bei einem septischen Schock eine

effektive antimikrobielle Therapie innerhalb der ersten Stunde mit einem

ansteigenden Überleben von 79,9% assoziiert ist. Dennoch werden nur 50%

der septischen Patienten mit dokumentierter Hypotonie innerhalb der ersten

sechs Stunden therapiert, die anderen 50% erst nach sechs Stunden. Jede

Stunde der Verzögerung einer antibiotischen Therapie senkt die

Überlebensrate um 7,6%. [043]

Noch deutlicher zeigten E. RIVERS et al. 2001 in ihrer Studie, wie wichtig der

Zeitfaktor in der Behandlung eines septischen Patienten ist. Sie verglichen

hierbei Patienten, die bei der Einlieferung in eine Notaufnahme unter einer

schweren Sepsis oder einem septischen Schock litten und unterschiedliche

Behandlungen erhielten, bevor sie auf eine Intensivstation verlegt wurden.

Patienten, die eine sogenannte „early goal-directed therapy“ innerhalb der

ersten sechs Stunden erhielten, unterlagen einer Mortalität von 30,5%,

während Patienten, die eine Standardtherapie erhielten, eine Mortalität von

46,5% aufwiesen. Die „early goal-directed therapy“ beinhaltete neben der

Standardtherapie, d.h. einer physiologischen Einstellung des CVP (Central

Venous Pressure), Urinausscheidung, MAP und ScvO2 (Central Venous

Oxygen Saturation), auch rasche Flüssigkeitsinfusionen, vasoaktive

Medikamente und Bluttransfusionen innerhalb der ersten sechs Stunden.

[074]

14

2.6. Diagnosestellung und Entzündungs- und Sepsismarker

Das Erkennen eines septischen Zustandes ist nicht einfach. Trotz fester

Kriterien, die eine Entzündung, SIRS und Sepsis beschreiben, sind die

Übergänge fließend. Ein diagnostischer Marker zeigt spezifisch an, ob eine

Erkrankung vorliegt und schließt sie aus, wenn sie nicht vorliegt. Diese

Spezifität liegt vor, wenn der Marker einen einzelnen speziellen biologischen

Aspekt eines gesuchten komplexen Prozesses aufzeigt. Ein Sepsismarker

soll also einen speziellen Schritt, der spezifisch für eine Sepsis ist, anzeigen

und nicht auf die Gesamtheit eines pathologischen Vorgangs reagieren.

2.6.1. Diagnosestellung und generelle Entzündungs- und

Sepsismarker

Derzeitige mutmaßliche Sepsismarker sind eher als prognostische Marker

anzusehen, die das steigende Risiko der Mortalität wiederspiegeln. Beispiele

hierfür sind IL-1 (Interleukin-1), IL-6, IL-8, IL-10, Tumor-Nekrose-Faktor-α

(TNF-α), C-reaktives Protein (CRP), High-Mobility-Group 1 (HMG-1), Laktat,

Nitric oxide, Elastase und viele weitere. [050]

Im Folgenden werden die wichtigsten Mediatoren kurz vorgestellt.

2.6.1.1. Leukozyten

Die Leukozytenzahl im Blut ist, wie bereits der Definition eines SIRS zu

entnehmen ist, ein allgemeiner Entzündungsmarker.

Aktuelle Daten von A. PFÄFFLIN aus dem Jahr 2009 bestätigten, dass die

Leukozytenzahl und besser noch die Neutrophilenzahl die schnelle Diagnose

einer Entzündung und Infektion unterstützen. [066] Neben einer Entzündung

kann ein Anstieg der Leukozytenzahl auch mit einem akuten Myokardinfarkt

einhergehen. Des Weiteren ist die totale Leukozytenzahl auch mit der

Schwere eines akuten Ereignisses assoziiert. [094]

15

2.6.1.2. C-reaktives Protein (CRP)

CRP, ein Akute-Phase-Protein, gilt ebenfalls als allgemeiner

Entzündungsmarker. Während TNF als Inhibitor der CRP-Expression in der

Leber gilt, induzieren IL-1 und IL-6 die Bildung von CRP in Hepatozyten.

[103] 2006 beschrieben D. G. HAIDER et al., dass CRP auch in peripheren

Monozyten gebildet wird. Durch Lipopolysaccharide (LPS), IL-1, IL-6 und

TNF-α wird hier die Expression von CRP induziert, während IL-10 diese

reduziert. [030] 2005 untersuchten P. PÓVOA et al. kritisch kranke Patienten

auf ihren CRP-Wert und fanden heraus, dass CRP ein besserer Marker für

eine Infektion ist als die Körpertemperatur [069] und ein sensiblerer Marker

für eine Sepsis als Körpertemperatur und Leukozyten. [068] Im Jahr zuvor

veröffentlichten R. SIERRA et al. eine Studie, in der sie CRP als frühen

Indikator einer Infektion bei SIRS-Patienten vorstellten. [083] J. SILVESTRE

et al. erklärten 2009, dass CRP als prognostischer Marker einer Sepsis nicht

geeignet ist, da sie in ihrer Studie keine Korrelation zwischen der CRP-

Konzentration und der Schwere der Sepsis nachweisen konnten. [084]

2.6.1.3. Procalcitonin (PCT)

Empfindlicher scheint Procalcitonin (PCT) auf eine Sepsis anzusprechen. Bei

einem Vergleich 2003 berichteten A. LUZZANI et al., dass PCT eine höhere

Korrelation mit dem Grad der Infektion hat und damit ein besserer Marker für

eine Sepsis ist als CRP. [049] Auch eine Veröffentlichung 2004 von Y. L.

CHAN et al. bestätigte, dass PCT mit der Schwere einer Infektion korreliert.

[016] Ebenfalls 2004 veröffentlichten G. P. CASTELLI et al. ihre Ergebnisse,

in denen sie belegten, dass sowohl CRP als auch PCT empfindlich mit dem

SOFA-Score korrelieren. Aber während CRP bereits bei niedrigen SOFA-

Score-Werten ein Maximum erreichte, lag das Maximum von PCT wesentlich

höher und war somit empfindlicher. [012] Zudem fand man heraus, dass PCT

im septischen Schock früher reagiert als CRP. [018] Aus einer Studie im Jahr

2000 von O. SELBERG et al. ging hervor, dass man anhand von PCT eher

zwischen einer Sepsis und einer SIRS unterscheiden kann, als durch CRP.

[080] Auch eine Meta-Analyse 2006 zeigte, dass PCT dem CRP überlegen

16

war und empfahl diesen Marker zur Aufnahme in die Leitlinien der Sepsis-

Diagnostik. [093]

Dagegen zeigte eine Meta-Analyse im Jahr 2007 aus 18 Studien, dass PCT

mit einer Sensitivität und Spezifität von je 71% und einer gemeinsamen Area

under the Curve (AUC) von 0,78 zwischen einer Sepsis und anderen nicht-

infektiösen SIRS nicht sicher unterscheiden kann. Somit wurde die häufige

Verwendung von PCT-Tests auf Intensivstationen infrage gestellt. [088]

Weitere Mediatoren und Zytokine, die im Plasma septischer Patienten

nachweisbar sind, wurden in der Vergangenheit untersucht. So korrelierten,

neben vielen anderen, TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8 mit einer Entzündung und

Sepsis.

2.6.1.4. Interleukin-6

Bereits 1987 beschrieben A. WAAGE et al., dass eine hohe Konzentration an

TNF-α mit einer erhöhten Sterblichkeit assoziiert ist. So starben bei der

damaligen Studie, in der das Serum von Meningokokken-Meningitis- und

Sepsis-kranken Patienten untersucht wurde, alle Patienten, bei denen eine

TNF-α-Konzentration über 440 U/ml gemessen wurde. [100] In einer

weiteren Studie 1989 bewiesen A. WAAGE et al., dass neben TNF-α auch

IL-1 und IL-6 in der initialen Phase einer lokalen Meningokokken-induzierten

Entzündungsreaktion produziert werden. [101] In einem Meningokokken-

induzierten septischen Schock zeigten IL-1 und IL-6 als prognostische

Marker eine hohe Sterblichkeit an. [099]

IL-6 ist ein wichtiger Mediator in der Entzündungsreaktion. Das bewiesen

bereits C. E. HACK et al. in ihrer Studie aus dem Jahr 1989, in der sie eine

Korrelation zwischen IL-6 und den Laktat-Werten, Herzfrequenz und

umgekehrt mit MAP und der Thrombozytenzahl nachwiesen. IL-6 war

signifikant erhöht bei Patienten mit einer Sepsis oder septischem Schock.

[029] Im Jahr 2002 verglichen T. HRYNIEWIECKI et al. den Verlauf von IL-6

und CRP bei Patienten mit infektiöser Endokarditis. Dabei stellten sie fest,

dass IL-6 unter antimikrobieller Therapie schneller abfällt als CRP und somit

zum Monitoring besser geeignet ist als CRP. [037] M. E. CECCON et al.

17

untersuchten im Jahr 2006 IL-6 und CRP bei Neugeborenen mit einer late-

onset Sepsis. Eine kombinierte Betrachtung von beiden Markern erfüllte hier

die genaueste Aussagekraft. Dabei ist zu erwähnen, dass IL-6 aber bereits

24 Stunden vor CRP auf eine late-onset Sepsis hinwies. [014] Daraus kann

man schließen, dass IL-6 sowohl früher im Blut nachweisbar, als auch bei

klinischer Besserung des Patienten schneller wieder abfällt und damit als

früherer und zeitnäherer Marker einer Entzündung dem CRP überlegen ist.

O. SELBERG et al. beschrieben im Jahr 2000, dass man sowohl anhand von

PCT, als auch von IL-6 und Protein Komplement 3a eher eine Sepsis von

einem SIRS abgrenzen kann, als durch CRP und die Leukozyten-Elastase.

[080]

2.6.1.5. Der Stellenwert der Entzündungs- und Sepsismarker

Zusammenfassend ist festzuhalten, dass bereits viele Entzündungs-,

Prognose- und Sepsismarker beschrieben sind. Dennoch ist bisher kein

zuverlässiger Sepsismarker verfügbar. In Bezug auf die Zuverlässigkeit

scheint z.B. die bereits erwähnte immunsuppressive Phase einer

Entzündung und Sepsis zu Problemen zu führen. Der dabei beschriebene

Abfall von inflammatorischen Markern und Mediatoren, wie z.B. IL-6 und

Leukozyten, könnte als mutmaßliche Besserung fehlgedeutet werden und

somit Fehlerquelle in der Interpretation bekannter Entzündungs- und

Sepsismarker sein.

Aus diesen Gründen wird weiterhin versucht, einen geeigneten und

zuverlässigen Sepsismarker zu finden, der eine frühe und sichere Diagnose

bestätigt und damit eine rechtzeitige und richtige Therapie einleitet.

18

2.6.2. Humanes Guanylat-Bindungsprotein-1 (hGBP-1)

Diese Studie evaluiert einen möglicherweise zukünftigen Entzündungs- und

Sepsismarker und untersucht seine Genauigkeit, eine Entzündung und

Sepsis anzuzeigen und ggf. eine Unterscheidung zu ermöglichen. Die

Hoffnung ist, dass Humanes Guanylat-Bindungsprotein-1 (hGBP-1)

spezifisch während einer Entzündung und Sepsis im Blut ansteigt und die

schwer abzugrenzende und vor allem rechtzeitige Diagnose einer Sepsis

stellt.

2.6.2.1. Grundlegende Mechanismen bei Entzündung

Um die Funktion von hGBP-1 erklären können, werden zunächst die

grundlegenden Mechanismen der Endothelzelle während der Entzündung

erläutert.

Die Endothelzelle hat eine wichtige Überwachungsfunktion in vielen

physiologischen und pathophysiologischen Prozessen. So übernimmt sie

eine zentrale Rolle bei der Regulation der Koagulation, des vasomotorischen

Tonus, des Gefäßmuskelwachstums, der Ischämie und Reperfusion bei

Verletzungen, der Arterioskleroseentstehung und der

Leukozytenextravasation. [082]

Endothelzellen bilden eine Grenzfläche zwischen der Blutbahn und dem

interstitiellen Gewebe. Während einer Entzündung müssen die Leukozyten

aus dem Blut diese endotheliale Barriere überwinden, um ins Gewebe und

damit zum Ort der Entzündung zu gelangen. Die Leukozyten-Extravasation

verläuft in mehreren Schritten. Phase 1 ist das Rolling, Phase 2 die Adhäsion

und Phase 3 die transendotheliale Migration. [072] Um diesen Mechanismus

zu induzieren, muss eine Kaskade von Mediatoren freigesetzt werden. Am

Anfang dieser Kaskade steht die Ausschüttung von Entzündungsmediatoren,

wie IL-1, Lipopolysaccharide und TNF-α. TNF-α induziert daraufhin

Selektine, die ihrerseits die Leukozyten-Transmigration in ihren Schritten

einleiten. [086]

Entzündungsmediatoren regulieren aber nicht nur die Leukozyten-Adhäsion

am Endothel, sondern führen auch zur Angiogenese. Nach Aktivierung der

19

Signalkaskade führt die Ausschüttung von Wachstumsfaktoren, wie z.B.

Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), zur Aktivierung der

Endothelzelle und damit zur Gefäßneubildung. [041] Dies unterstützt die

vermehrte Auswanderung von Leukozyten in das entzündete Gewebe.

Das bedeutet, dass eine Entzündung zur Angiogenese, d.h. zur

Endothelproliferation, und zur Leukozyten-Extravasation führt. Diese beiden

Aktivierungs-Phänotypen einer Endothelzelle werden durch unterschiedliche

Mediatoren zeit- und ortsabhängig koordiniert. [056]

Die potentesten Aktivatoren der Endothelzelle stellen die sogenannten

inflammatorischen Zytokine (IZ) und die angiogenen Wachstumsfaktoren

(AWF) dar. Zu den IZ zählen IL-1β, TNF-α und Interferon-γ (IFN-γ). Zu AWF

zählen VEGF und basic Fibroblast Growth Factor (bFGF). [067]

IZ aktivieren die Endothelzelle zur Leukozyten-Adhäsion [013] und hemmen

deren Proliferation. [023] Im Unterschied dazu aktivieren AWF die

Proliferation [022] und Invasionsfähigkeit von Endothelzellen [021] und

können die Leukozyten-Adhäsion hemmen. [091]

Im Zuge der molekularen Charakterisierung dieses Mechanismus entdeckte

man ein durch IZ induziertes Protein in Endothelzellen, das die

antiangiogenetische Wirkung von IZ vermittelt: hGBP-1.

2.6.2.2. Molekulare Kennzeichen und Eigenschaften der

hGBP-Familie

1979 veröffentlichten S. L. GUPTA et al. die Ergebnisse ihrer Studie über die

Induktion verschiedener Proteine durch Interferone. Dort berichteten sie von

einem interferoninduzierten Protein, dessen Masse 67 kDa beträgt und

beschrieben dabei erstmals das später benannte hGBP-1. [028]

Sowohl α-, β- als auch γ-Interferone induzieren die Bildung von hGBP-1 im

Fibroblasten. Dabei wirkt IFN-γ am stärksten. Darüber hinaus hat hGBP-1 die

Möglichkeit Guanosin-Triphosphat (GTP)-Agarose, Guanosin-Diphosphat

(GDP)-Agarose und Guanosin-Monophosphat (GMP)-Agarose zu binden.

[017] Dieser ungewöhnlichen Eigenschaft verdankt das Protein auch seinen

Namen. Man vermutet, dass die Art und Weise der Bindung einzigartig für

GBP ist. [095]

20

Mittlerweile sind sieben verschiedene humane GBPs mit einem

Molekulargewicht von 67-73 kDa identifiziert (hGBP-1 bis hGBP-7) und elf

GBPs in der Maus, auf die hier nicht weiter eingegangen wird.

Charakterisierend für diese Genfamilien ist die Induktion der Expression

durch verschiedene Interferone. Während in Endothelzellen hGBP-1, hGBP-

2 und hGBP-3 sowohl durch IFN-γ, TNF-α und IL-1β induziert werden, wird

die Expression von hGBP-4 und hGBP-5 lediglich durch IFN-γ aktiviert. [090]

Die Expression von hGBP-6 und hGBP-7 wurde bisher nicht detailliert

untersucht. HGPB-1, hGBP-3 und hGBP-5 werden ausschließlich im

Zytoplasma nachgewiesen.

HGBP-1 ist das am besten untersuchte Protein dieser Familie und

Gegenstand dieser Studie; deshalb wird im Folgenden lediglich hGBP-1

näher erläutert.

2.6.2.3. Funktion von hGBP-1

Aufgrund der Kristallstruktur und biochemischer Experimente ist hGBP-1 der

Gruppe der großen GTP-bindenden Proteine zuzuordnen, so wie auch die

antiviral wirksamen Proteine Mx und Dynamin. Die gemeinsame Eigenschaft

ist die nukleotidabhängige Oligomerisierung und eine

konzentrationsabhängige GTPase-Aktivität. [070] HGBP-1 weist zwei

Domänen auf: Eine langgestreckte C-terminale Domäne, die aus α-Helices

aufgebaut ist, und eine N-terminale globuläre (G-) Domäne, die die GTPase-

Aktivität beinhaltet. [071] M. SCHWEMMLE und P. STAEHELI beschrieben

1994, dass hGBP-1 GTP eher zu GMP als zu GDP hydrolysiert. Diese

Reaktion erfolgt nicht durch die Abspaltung eines Pyro-Phosphat-Moleküls,

sondern durch zwei konsekutive Spaltungen von einzelnen Phosphat-

Molekülen. [078] Die längliche C-terminale Domäne des Proteins besitzt das

CaaX-Motiv, das die posttranslationale Isoprenylation von hGBP-1

ermöglicht. Dabei wird eine C15-Farnesylgruppe oder eine C20-Geranyl-

Geranylgruppe durch eine Thioether-Bindung an das Cystein des CaaX-

Motivs gebunden. [055]

21

Während hGBP-1 in vivo hauptsächlich in vaskulären Endothelzellen gebildet

wird, wird hGBP-1 in vitro in nahezu allen Zellen einschließlich

Endothelzellen, Fibroblasten, Keratinozyten, B-Zellen, T-Zellen und

Monozyten durch IFN-γ induziert. [026]

C. LUBESEDER-MARTELLATO et al. konnten 2002 nachweisen, dass die

Bildung von hGBP-1 in vivo durch IFN-γ, IL-1α, IL-1β und TNF-α induziert

wird. [048]

Bisher ist kein spezifischer Marker verfügbar, der zwischen dem IZ- und

AWF-aktivierten Phänotyp der Endothelzelle unterscheiden kann. 2005

berichteten E. NASCHBERGER et al., dass hGBP-1 selektiv in IZ-aktivierten

Endothelzellen exprimiert wird, so dass möglicherweise die Expression von

hGBP-1 IZ-aktivierte Endothelzellen charakterisieren könnte. [056] Diese

Mechanismen der Expression von hGBP-1 durch IZ konnte 2004 ebenfalls

geklärt werden. Dabei wurde aufgezeigt, dass durch Zusammenwirken eines

Nuclear Factor кB (NF-кB)- binding Motifs und eines IFN-α-Stimulated

Response Elements (ISRE) die Induktion von hGBP-1 durch IL-1β und TNF-

α gesteuert wird. [059]

In zellbiologischen Untersuchungen zur hGBP-1-Wirkung konnte gezeigt

werden, dass hGBP-1 die Proliferation, Invasion und Migration von

Endothelzellen hemmt und somit die antiangiogenetische Wirkung von IZ in

Endothelzellen vermittelt.

M. HAMMON et al. beschrieben 2010, dass hGBP-1 neben der Endothelzelle

auch von Endothelialen Vorläuferzellen (EPC) sezerniert wird. EPC sind

Progenitorzellen von Endothelzellen, die z.B. durch VEGF aus dem

Knochenmark mobilisiert werden und ebenfalls in die Gefäßbildung involviert

sind. HGBP-1 induziert die vorzeitige Differenzierung von unreifen EPC, was

M. HAMMON et al. durch den Nachweis der Hochregulation von fetal liver

kinase 1 (Flk-1), ein Rezeptor von VEGF, und von-Willebrand-Faktor (vWF)

als Marker für die EPC-Ausreifung in hGBP-1-exprimierenden EPC, in ihrer

Studie aufzeigten. Des Weiteren konnte nachgewiesen werden, dass hGBP-

1 die vaskulogenetische Aktivität von EPC durch Hemmung ihrer Proliferation

und Migration in vitro beeinträchtigt. Anhand eines arteriovenösen-

Gefäßschleifen-Modells an Ratten erhärtete sich ebenfalls der Verdacht,

dass hGBP-1 die Migration von EPC auch in vivo hemmt. [031]

22

Somit kann festgestellt werden, dass die antiangiogenetische Wirkung von

hGBP-1 während einer Entzündung sowohl durch direkte IZ-induzierte

antiangiogenetische Wirkung auf die Endothelzelle und darüber hinaus durch

die Hemmung der VEGF-induzierten vaskulogenetischen Aktivität der EPC

vermittelt wird.

Des Weiteren scheint hGBP-1 auch antiapoptotische Effekte von IFN-α in

Endothelzellen zu regulieren. J. PAMMER et al. untersuchten 2006 die

Unterschiede zwischen einer kurzfristigen und einer kontinuierlichen

Exposition von INF-α auf die Endothelzelle. Dabei beschrieben sie, dass die

kurzfristige Exposition von IFN-α einen antiapoptotischen Effekt hat. Der

begleitenden Induktion von hGBP-1 schrieben sie dabei eine wichtige

Funktion zu. [062]

2.6.2.4. Nachweisbarkeit von hGBP-1

Im Hinblick auf die tumorbedingte Angiogenese und Neovaskularisation

wurde die angiostatische Wirkung von hGBP-1 auch bei Tumorpatienten

untersucht. Bei 32% der kolorektalen Karzinome wurde hGBP-1

nachgewiesen. E. NASCHBERGER et al. publizierten 2008 eine hoch

signifikant höhere 5-Jahres-Überlebensrate von 92,2% bei Patienten mit

hGBP-1-positiven Tumoren. [057]

Des Weiteren wird hGBP-1 eine antivirale Wirkung zugeschrieben. Bereits

1999 veröffentlichten S. L. ANDERSON et al. einen Artikel, in dem

nachgewiesen wurde, dass hGBP-1 einen antiviralen Effekt gegen das

Vesiculare Stomatitis Virus (VSV) und das Enzephalomyokarditis Virus

(EMCV) besitzt. [003]

E. NASCHBERGER et al. wiesen 2006 hGBP-1 in signifikant erhöhten

Konzentrationen im Liquor von Patienten, die an einer bakteriellen Meningitis

litten, nach. Bei 71,9% der erkrankten Patienten war hGBP-1 im Liquor

erhöht und stellte sich als möglicher diagnostischer Marker der bakteriellen

Meningitis dar. [058]

2010 gelang M. HAMMON et al. der Nachweis von hGBP-1 im Blutserum.

Hierbei wurden signifikant erhöhte Konzentrationen von hGBP-1 bei

Patienten mit Autoimmunerkrankungen des rheumatischen Formenkreises,

23

wie rheumatoider Arthritis, systemischer Lupus erythematodes und

systemischer Sklerose, beschrieben. [031]

2.6.2.5. Überlegungen zu diagnostischen und therapeutischen

Möglichkeiten von hGBP-1

Neben der Nachweisbarkeit von hGBP-1 und dem damit verbundenen

besseren Verständnis für physiologische und pathophysiologische Vorgänge

der Adhäsions- und angiogenetischen Fähigkeit der Endothelzelle bietet

hGBP-1 auch Hoffnung zu diagnostischen und therapeutischen

Möglichkeiten.

M. STÜRZL et al. beschrieben 2005 zwei Möglichkeiten des therapeutischen

Einsatzes von hGBP-1. Zum einen ist die therapeutische Antagonisierung

von hGBP-1 zur Verbesserung der Kapillarbildung bei z.B. ischämischen

Zuständen vorstellbar, zum anderen könnte hGBP-1 in der Onkologie zur

Hemmung der Tumorangiogenese einsetzbar sein. [087]

2009 veröffentlichten dazu L. PERSANO et al. ihre Ergebnisse bezüglich der

Wirkung von IFN-α auf die Entwicklung von Prostatakrebs. Im Tiermodel

fanden sie heraus, dass die IFN-α-regulierten Gene hGBP-1, IFI204 und

CXCL10-11 dem ‚angiogenic switch‘ entgegenwirken und die

Tumorzellproliferation beeinträchtigen. Dem Tumorgeschehen wird auf diese

Weise entgegengesteuert. Da bei 40% der humanen Prostatatumore die IFN-

α-induzierten Proteine hGBP-1 und Myxovirus Resistance A nachgewiesen

wurden, gaben L. PERSANO et al. somit Anstoß zu Überlegungen in Hinsicht

auf die Chemoprävention von Prostatakrebs. [065]

Aufgrund verschiedener Hinweise besteht auch die Möglichkeit, dass hGBP-

1 als Entzündungs- und Sepsismarker geeignet sein kann.

Ein dafür wichtiges Kriterium ist die hGBP-1-Nachweisbarkeit im Blut. Dies

scheint durch die Tatsache, dass hGBP-1 von der Endothelzelle

ausgeschüttet wird, gegeben. Wie bereits erwähnt, konnten M. HAMMON et

al. 2010 hGBP-1 bereits in Serum nachweisen und beschreiben nach

genauer Untersuchung den zugrundeliegenden Mechanismus, der zu

signifikant erhöhten Konzentrationen dieses Proteins bei

Autoimmunerkrankungen führt. Des Weiteren erklärt diese Veröffentlichung

24

die Beobachtung der bekannten eingeschränkten Funktion von EPC bei

chronisch entzündlichen Autoimmunerkrankungen wie rheumatoider Arthritis,

systemischer Lupus erythematodes und systemischer Sklerose. AWF, wie

z.B. VEGF und IZ sind bei Autoimmunerkrankungen erhöht im Blut

nachweisbar. VEGF führt über Freisetzung von EPC aus dem Knochenmark

zur entzündungsbedingten Vaskulogenese und EPC sezerniert vermehrt

hGBP-1. IZ aktiviert, wie oben bereits beschrieben, die Endothelzelle, Die

Endothelzelle induziert und sezerniert ebenfalls hGBP-1. Durch die hGBP-1-

spezifische Hemmung der EPC-Migration und Proliferation, Invasion und

Migration der Endothelzelle wird die antiangiogenetische Wirkung bedingt. In

diesem Zusammenhang könnte dieser Mechanismus auch an bekannten

kardiovaskulären Dispositionen bei Patienten mit autoimmunentzündlichen

Erkrankungen beteiligt sein. [031]

Der offensichtlichste Grund dafür, dass hGBP-1 als Entzündungs- und

Sepsismarker denkbar ist, liegt somit in der starken Ausschüttung von IZ im

septischen Zustand. Diese erhöhten Konzentrationen an

Entzündungsmediatoren führen entsprechend zu einer vermehrten Bildung

von hGBP-1.

Neben IZ und AWF wird während einer Sepsis auch vermehrt Thrombin

gebildet. Thrombin führt unter anderem zur verstärkten Leukozytenadhäsion.

Diese wird durch die IZ-aktivierte Endothelzelle reguliert. So kommt es durch

die IZ-spezifisch aktivierte Endothelzelle zur verstärkten hGBP-1-Expression.

Ein weiterer Grund dafür, dass hGBP-1 eine Sepsis anzeigen kann, liegt in

der endothelialen Dysfunktion während einer Sepsis. G. C. BECK et al.

beschrieben 2007, dass es aufgrund von Schwellung, Deformierung und

Apoptose der Endothelzelle zur teilweisen Ablösung von der Basalmembran

und damit zur Zirkulation der Endothelzelle im Blut kommt. Diese Schädigung

führt zur Freisetzung endothelialer Abbauprodukte,

Mikrozirkulationsstörungen und Reparaturprozessen. Dazu gehört die

vermehrte Freisetzung von EPC und Endothelzellen aus dem Knochenmark.

[004]

Diese starke Präsenz endothelialer Abbauprodukte, EPC und Endothelzellen

bei Sepsis, wie durch G. C. BECK et al. beschrieben, lässt, basierend auf der

oben bereits aufgeführten Veröffentlichung von M. HAMMON et al., aufgrund

25

des vermehrten Vorhandenseins an hGBP-1-exprimierenden Zellen auch

eine gesteigerte Freisetzung von hGBP-1 vermuten. [004] [031]

2.7. Zielsetzung

Während hGBP-1 nun in Endothelzellen verschiedenster Gewebe, in

Tumoren, in EPC, in erkrankter Haut, im Liquor und im Serum nachgewiesen

wurde, stellte sich die Frage, ob hGBP-1 auch in dieser Studie im Blut

nachweisbar ist. Aufgrund der vorangegangenen Veröffentlichungen

zellbiologischer Untersuchungen sollte eine Messbarkeit von hGBP-1 im

Serum von Patienten mit Entzündungszeichen möglich sein.

Durch die bereits oben aufgeführten Argumente schien auch eine

Nachweisbarkeit von hGBP-1 insbesondere während einer Sepsis denkbar.

In dieser Studie wurden die hGBP-1-Konzentrationen im Serum von 37

Patienten mit Sepsis bestimmt. Dabei wurde untersucht, ob die

Serumkonzentrationen von hGBP-1 mit dem Entzündungsgrad korrelieren.

Diese Studie befasste sich mit der möglichen Nachweisbarkeit von hGBP-1

im Serum und dessen mögliche Schwankungen bei unterschiedlichen

immunologischen Reaktionszuständen des Körpers.

Dabei wurde hGBP-1 als Sepsis- bzw. Entzündungsmarker anhand

diagnostischer Tests und Ermittlung deren Güte evaluiert.

Darüber hinaus wurden die hGBP-1-Werte mit anderen Entzündungsmarkern

bei gleichem Blutentnahmezeitpunkt verglichen. Dazu wurden Leukozyten,

CRP, Procalcitonin und IL-6 herangezogen und mit hGBP-1 in eine mögliche

Korrelation gesetzt.

26

3 MATERIAL UND METHODEN

3.1. Das Studienkollektiv

Es wurde ein Studienkollektiv von 37 Patienten untersucht, darunter 20

Männer und 17 Frauen. Zum Zeitpunkt der Untersuchung waren die

Patienten 18 bis 79 Jahre alt. Das mediane Lebensalter des Kollektivs betrug

63 Jahre und das mittlere Lebensalter 61 Jahre.

3.1.1. Das Patientenkollektiv

Bei jedem Studienteilnehmer wurden Blutabnahmen zu unterschiedlichen

Zeitpunkten durchgeführt und die Konzentration von hGBP-1 gemessen,

sowie mit den bereits etablierten Entzündungsmarkern Leukozyten, CRP und

IL-6 verglichen und korreliert. Bei septischen Patienten wurde zusätzlich

noch Procalcitonin im Serum mitbestimmt.

Alle Parameter wurden jeweils zum gleichen Zeitpunkt gemessen. Im

gesamten Studienkollektiv konnten insgesamt 90 Blutentnahmen gewonnen

werden.

Der Ablauf der Probenentnahme erfolgte im Zeitraum vom 31.01.2007 bis

30.06.2008. Die Blutentnahme umfasste bei jedem Patienten drei

Blutentnahmeröhrchen. Jeweils ein Röhrchen für das Blutbild und ein

Röhrchen für Blutserum wurden zur Auswertung ins Routinelabor der

Chirurgischen Universitätsklinik Erlangen gebracht. Das dort gemessene

CRP, die Zahl der Leukozyten und ggf. Procalcitonin (bei septischen

Patienten) galten zusammen mit IL-6 als Vergleichswerte zu hGBP-1. Das

dritte Serumröhrchen, das dem Patienten abgenommen wurde, diente zur IL-

6- und hGBP-1-Messung. Während Leukozyten, CRP und Procalcitonin vom

Routinelabor gemessen wurden, wurden die Werte für hGBP-1 und IL-6

eigens für diese Studie mittels Sandwich-Enzyme-linked Immunosorbent

Assay (Sandwich-ELISA) in der Abteilung für Molekulare und Experimentelle

Chirurgie ermittelt. Dieses zusätzliche Serumröhrchen wurde zeitnah bei

1800 rpm zentrifugiert und der Überstand bis zur Messung von IL-6 und

27

hGBP-1 bei minus 80 °C eingefroren. Zu den einzelnen Messungen wurde

dieses Serumröhrchen ein- bis maximal zweimal aufgetaut.

Zur Evaluation von hGBP-1 wurde versucht, zu möglichst vielen Zeitpunkten

in unterschiedlichen Entzündungszuständen Entzündungsparameter zu

messen. Aus diesem Grund wurde das Patientenkollektiv in zwei

Studienarme gegliedert.

Der eine Studienarm umfasste elf Patienten. Sie unterlagen zum Zeitpunkt

der Blutentnahme einem septischen Zustand und galten in dieser Studie als

Patientengruppe mit den höchsten Entzündungswerten.

26 Patienten wurden während ihres stationären Aufenthalts im Krankenhaus

zu Studienzwecken begleitet und bildeten den zweiten Studienarm. Als

Patienten einer Allgemein-Chirurgischen Station wurde ihnen vor und an

unterschiedlichen Tagen nach ihrer jeweiligen Operation Blut entnommen

und ausgewertet. Dies ermöglichte einen direkten Vergleich zwischen

Werten eines Patienten vor der Operation ohne Entzündungszustand mit

Werten desselben Patienten nach einer Operation im entzündeten Zustand.

Keiner dieser Patienten litt während des Beobachtungszeitraums und der

Blutentnahmen unter einer Sepsis. So ließen sich diese Werte einer

Entzündung auch mit den Werten septischer Patienten des anderen

Studienarms vergleichen.

Als weitere Studienuntergruppe wurden die Patienten mit Entzündung

zusammengefasst. Dabei wurden alle Blutseren eingeschlossen, die

entweder post operationem oder septisch waren. Das bedeutet, es wurde

hier nicht unterschieden, wie stark die Entzündung war. Es wurden lediglich

die Seren ausgeschlossen, die prae operationem waren und keine erhöhten

Entzündungswerte aufwiesen.

Im Weiteren werden die Studienarme näher beschrieben.

28

3.1.2. Der Studienarm: Sepsis-Patienten

Abb. 2: Der Studienarm: Sepsis-Patienten (grün markiert)

In den Studienarm der septischen Patienten waren elf Patienten

eingeschlossen (Abb. 2). Bei acht Patienten wurde eine einmalige

Blutentnahme für die Studie entnommen, bei einem Sepsis-Patienten wurde

an zwei Tagen Blut entnommen und bei zwei Patienten konnten drei

Blutentnahmen an drei aufeinander folgenden Tagen gewonnen werden.

Somit ergaben sich insgesamt 16 verwertbare Blutwerte im Studienarm der

Sepsis-Patienten (Abb. 3).

29

Abb. 3: Überblick über die Blutentnahmen der Sepsis-Patienten

Die Ursachen und Verläufe der septischen Zustände der einzelnen Patienten

werden im Folgenden kurz zusammengefasst:

Neun Patienten litten unter einer Sepsis aufgrund einer Peritonitis bei einer

Hohlorganperforation. Einer dieser Patienten entwickelte dabei eine

Pneumonie mit respiratorischer Insuffizienz.

Ein Patient war an einer Staphylokokkensepsis erkrankt. Ursächlich dafür

war eine akute Ischämie des rechten Beines mit Nekrose bei einer

peripheren arteriellen Verschlusskrankheit (pAVK IV).

In die Studie mit aufgenommen wurde auch ein Patient, der aufgrund einer

Polytraumatisierung nach Verkehrsunfall ein septisches Multiorganversagen

ausgebildet hat.

30

3.1.3. Der Studienarm: Nicht-Sepsis-Patienten

Abb. 4: Der Studienarm: Nicht-Sepsis-Patienten (rot markiert)

Der Studienarm der Nicht-Sepsis Patienten umfasste 26 Patienten (Abb. 4).

Zu Studienzwecken konnten bei vier Patienten jeweils vier Blutentnahmen

entnommen werden. Bei 14 Patienten wurden drei Blutentnahmen und bei

acht Patienten zwei Blutentnahmen im Beobachtungszeitraum durchgeführt

(Abb. 5).

Abb. 5: Überblick über die Blutentnahmen der Nicht-Sepsis-Patienten

31

Somit wurden insgesamt 74 Blutentnahmen von diesem Patientenarm in die

Studie eingeschlossen. 24 Blutentnahmen wurden vor der Operation

abgenommen, 50 Blutentnahmen nach der Operation. Darunter fanden 23

Entnahmen am ersten Tag nach der Operation statt, eine am zweiten Tag

post operationem, 14 Entnahmen erfolgten am dritten Tag, eine am vierten

Tag, am Tag 5 waren es neun Blutentnahmen und am postoperativen Tag 6

und 7 war es jeweils eine Blutentnahme (Abb. 6).

Abb. 6: Überblick über die Blutentnahmezeitpunkte der Nicht-Sepsis-Patienten

Der Grund für den stationären Aufenthalt der 26 Patienten dieses

Studienarms auf einer Allgemein-Chirurgischen Station und damit auch

Anlass für ihre jeweilige Operation war bei sechs Patienten eine benigne

Erkrankung und bei 20 Patienten ein Malignom. Keiner der Patienten litt an

Autoimmun- oder anderen chronisch-entzündlichen Erkrankungen.

Divertikulitis, Pankreatitis, peptische Ösophagusstenose, benigner

Magenwandtumor, parastomale Hernie und Hämorrhoiden waren die

benignen Erkrankungen der sechs Patienten.

Von den 20 Patienten, die von malignen Krankheiten betroffen waren, litten

fünf an einem Rektumkarzinom, ein Patient hiervon wurde zur

Unterlappenresektion bei Lungenmetastasen eines bereits voroperierten und

primär hepatisch metastasierten Rektumkarzinoms aufgenommen.

32

Weitere fünf Patienten wiesen ein Kolonkarzinom auf, davon war ein Patient

von einem Siegelringzellkarzinom des Zökums betroffen. Vier Patienten

waren an einem Sigma-Adenokarzinom erkrankt, davon ein Patient mit

einem Sigma-Frühkarzinom. Bei drei Patienten wurde ein Adenokarzinom

des Magens diagnostiziert, darunter ein Patient mit fortgeschrittenem, wenig

differenzierten und hepatisch sowie peritoneal metastasierenden

Magenkorpuskarzinom, einer mit einem Antrumkarzinom (T2,N0,M0) und ein

Patient mit einem Magenfrühkarzinom. Je ein Patient litt unter einem

Pankreas-Adenokarzinom, einem verhornten Ösophagus-

Plattenepithelkarzinom und einem Ovarial-Adenokarzinom.

Des Weiteren wiesen sechs der Tumorpatienten Lymphknotenmetastasen

auf, ein Patient eine solitäre Lebermetastase und vier Patienten befanden

sich im fortgeschrittenen Zustand einer Tumorerkrankung mit Lymphknoten-

und Fernmetastasen.

Zu erwähnen ist, dass vier Patienten vor ihrer Operation eine neoadjuvante

Radiochemotherapie erhielten. Darunter war ein Patient, der wegen einer

Lungenmetastase in Behandlung war, zur Behandlung des primären Tumors

aber ebenfalls eine Radiochemotherapie erhielt. Ein Patient unterzog sich

einer neoadjuvanten Chemotherapie und ein Patient erhielt in seiner

Vergangenheit schon eine Radiotherapie.

Eine Chemobehandlung kann im Blutbild zu falsch-niedrigen

Leukozytenzahlen führen und somit die Ergebnisse dieser Studie

möglicherweise beeinträchtigen. Um eine derartige Verfälschung des

Blutbildes der Studienteilnehmer sicher auszuschließen, wurden keine

Patienten in die Studie eingeschlossen, deren Chemotherapie weniger als

sechs Wochen zurücklag.

33

3.1.4. Die Studienuntergruppe: Patienten mit Entzündung

Abb. 7: Die Studienuntergruppe: Patienten mit Entzündung (blau markiert)

Eine Untergruppe der Studienarme stellten die Patienten mit Entzündung dar

(Abb. 7). In dieser Gruppe wurden alle Blutseren der Patienten

eingeschlossen, die sich zum Zeitpunkt der Blutentnahme in einem

entzündeten Zustand befanden. Dabei wurde nicht unterschieden, wie stark

die Entzündung war und beinhaltete somit alle post operationem-Seren und

auch die septischen Blutseren. Die Seren von prae operationem wurden

ausgeschlossen.

So umfasste diese Untergruppe 66 Blutentnahmen.

34

3.2. Die Methode zur IL-6- und hGBP-1-Messung:

Der Sandwich-ELISA

Um die Serumproben der Studienpatienten auf ihren IL-6- und hGBP-1-

Gehalt zu messen, wurde der Sandwich-ELISA verwendet.

3.2.1. Das allgemeine Prinzip des Sandwich-ELISA

Ein ELISA ermöglicht den Nachweis verschiedenster Antikörper und

Antigene. 1971 veröffentlichten E. ENGVALL und P. PERLMANN erstmals

einen Artikel zur quantitativen Messung von IgG in Hasenserum mittels

ELISA. Im selben Jahr publizierten B. VAN WEEMEN und A. SCHUURS ihre

Arbeiten am Enzyme Immunoassay (EIA). Während beim damals bereits

bekannten Radioimmunoassay (RIA) Antigene radioaktiv markiert werden

mussten, kann die zu suchende Substanz beim ELISA mittels einer nicht-

radioaktiven Enzymreaktion sichtbar gemacht werden. [045]

Verschiedene Varianten der ELISA-Methode ermöglichen einen quantitativen

Nachweis spezifischer Antikörper und Antigene. Im Folgenden wird lediglich

auf den Sandwich-ELISA näher eingegangen. Der Sandwich-ELISA ist auch

die Methode der IL-6- und hGBP-1-Messung dieser Studie.

Die Idee eines ELISAs besteht darin, eine

gesuchte Substanz durch eine messbare

Farbreaktion zu quantifizieren. Beim Sandwich-

ELISA wird die zu suchende Substanz

(Antigen) an zwei Antikörper gebunden, welche

unterschiedliche Epitope des Antigens binden.

Der eine Antikörper ist an einer soliden

Unterfläche fixiert (1) und dient dazu, das

Antigen zu fixieren und vom Serum zu trennen

(2).

Ein zweiter Antikörper, der an ein Enzym

gekoppelt ist, bindet an ein weiteres Epitop des

bereits fixierten Antigens. Dabei ist es möglich

noch einen weiteren Antikörper zwischen den

Abb. 8: Das Prinzip des

Sandwich-ELISA

(2)

(1)

35

am Antigen fixierten und dem am Enzym

gekoppelten Antikörper zu schalten (3). Dies

erhöht die Spezifität, ist aber für einen

Sandwich-ELISA nicht unbedingt notwendig.

Nachdem man den Ansatz gereinigt hat und

nur noch die fixierte antikörperbeladene

Substanz zurückbleibt, wird nun das passende

Substrat zum gebundenen Enzym gegeben

und so eine Reaktion eingeleitet (4). Diese

Reaktion bedingt einen Farbumschlag, der

proportional zur gebundenen Antikörpermenge

und damit proportional zur gesuchten

Substanzmenge ist. [098]

Durch das Mitführen eines Standards, dessen

Konzentration bekannt ist, gibt der messbare

Farbumschlag eine quantitative Möglichkeit

an, die Menge der gesuchten Substanz

berechnen zu können.

Da für diese Studie sowohl die hGBP-1- als auch die IL-6-Messung nach

dem Prinzip des Sandwich-ELISA durchgeführt wurde, wird im Folgenden auf

die genaue Beschreibung der hGBP-1- und IL-6-Messung der Studie

eingegangen.

3.2.2. Die hGBP-1-Messung mittels Sandwich-ELISA

E. NASCHBERGER et al. wiesen hGBP-1 2006 mittels eines eigens dafür

entwickelten ELISA‘s im Liquor nach [058]. Damit wurde eine Methode

gefunden, hGBP-1 möglicherweise auch im Serum nachzuweisen.

Die bei der Testung verwendete Platte der Firma Nunc hat 96 Vertiefungen

(Wells) für die einzelnen Serumproben und den mitzuführenden Standard.

Zunächst muss die Platte beschichtet werden. Das bedeutet, dass am Boden

jeder Vertiefung in der Platte Antikörper fixiert werden, die später das zu

suchende hGBP-1 im Serum der Patienten binden. Zum Beschichten erstellt

man eine Lösung des Antikörpers 1B1 [gereinigter Ratten anti-GBP-1

(3)

(4)

36

monoklonaler Antikörper (mAB) [058] ] in einer Konzentration von 1 µg/ml in

1 x PBS (Phosphat Buffered Saline) und befüllt die Reaktionsschalen mit je

100 µl. Die Platte wird dann über Nacht bei Raumtemperatur stehen

gelassen.

Anschließend wird der Standard hergestellt. Dazu wird gereinigtes

rekombinantes His-getaggtes GBP-1 in PBS-1% Skim Milk (Fa. Neuform) mit

Normalserum (Fa. Sigma) in folgenden Konzentrationen hergestellt: 100

ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml, 12,5 ng/ml, 6,25 ng/ml, 3,125 ng/ml, 1,5625 ng/ml,

0 ng/ml. Je 100 µl der Lösungen werden in die Reaktionsschalen gegeben

und bis zum Beginn der Messung auf Eis aufbewahrt.

Bevor die bei -80°C tiefgefrorenen Patientenproben getestet werden, müssen

auch diese aufbereitet werden. Nach dem Auftauen wird jede Serumprobe im

Verhältnis 1:8 mit PBS-1% Skim Milk (Fa. Neuform) verdünnt und auf Eis bis

zur Testung aufbewahrt.

Die beschichtete Platte wird einmal mit 1 x PBS-0.1% Tween (Fa. Sigma)

gewaschen und anschließend wird die Waschlösung ausgeklopft.

Vor der Testung wird die Platte nun noch blockiert. Dazu wird eine

Blockierungslösung aus 1% Skim Milk (Fa. Neuform) und 1 x PBS hergestellt

und jeweils 100 µl davon in die Plattenvertiefungen pipettiert.

Nach einer 30-minütigen Inkubationszeit bei Raumtemperatur wird die

Blockierungslösung entfernt.

Nun kann das Patientenserum in die Reaktionsschalen geben werden.

Jeweils 100 µl der Proben- und Standardlösungen werden in Triplikaten in

die Reaktionsschalen pipettiert und für 2 Stunden bei Raumtemperatur

inkubiert. Dabei kann hGBP-1 des Serums an die Antikörper, die zu Beginn

am Boden beschichtet wurden, binden.

Nach der Inkubationszeit wird die Platte viermal mit 1 x PBS-0.1% Tween

(Fa. Sigma) gewaschen. Nun werden die Detektions-Antikörper in die Lösung

gegeben. Dazu verwendet man polyklonale anti-GBP-Antikörper #1 und #3,

die jeweils im Verhältnis 1:2500 mit 1% Skim Milk (Fa. Neuform) und 1 x

PBS-0.1% Tween (Fa. Sigma) vermischt werden. Aus diesem Ansatz gibt

man je 100 µl in die einzelnen Wells der Platte.

Nach einer zweistündigen Inkubationszeit und den darauf folgenden vier

Waschvorgängen mit 1 x PBS-0.1% Tween (Fa. Sigma) wird dem

37

Probenmaterial das Detektionsenzym, eine alkalische Phosphatase (AP),

zugefügt. Die Bindung an den Detektions-Antikörper erfolgt mittels eines am

Enzym fixierten Antikörpers IgG. Das AP-Ziege anti-Kaninchen Conjugate

(Fa. Zymed) vermischt man im Verhältnis 1:2000 mit 1% Skim Milk (Fa.

Neuform) und 1 x PBS-0.1% Tween (Fa. Sigma) und gibt je 100 µl in die

Wells. Während einer Inkubationszeit von einer Stunde bei Raumtemperatur

bindet das Detektionsenzym nun an die polyklonalen anti-GBP-Antikörper #1

und #3.

Nach der Inkubationszeit wird die Platte viermal mit 1 x PBS-0.1% Tween

(Fa. Sigma) gewaschen.

Das zum Enzym passende Substrat wird als -20°C tiefgefrorene Tablette (20

mg) in 20 ml Substratpuffer (1M Diethanolamine und 0.5 mM MgCl2) (Fa.

Sigma) gelöst. Als Substrat dient 4-Nitrophenylphosphate-disodium-salt-

hexahydrate und fungiert als Indikator, der, nachdem er mit dem Enzym

reagiert, später gemessen werden kann. Jeweils 100 µl werden in die

Ansätze gegeben.

Die Platte wird nun für eine Stunde lichtgeschützt bei Raumtemperatur

inkubiert. In dieser Zeit bindet das Substrat an das Enzym und wird

verstoffwechselt. Da es als Indikator dient, kann die optische Dichte der

einzelnen Ansätze nun bei 405 nm im ELISA-Reader gemessen werden.

Da der ELISA-Reader die Lichtdurchlässigkeit misst, nicht aber die

Konzentration von hGBP-1 im Serum, müssen die einzelnen

Probenkonzentrationen mittels eines Abgleiches mit der Standardkurve

errechnet werden. Die Standardkurve ergibt sich aus den mitgeführten

Standardproben und steigt bei Auftrag von kaltem Substrat generell nach

einer Stunde von einer optischen Dichte405nm~0.3 (Hintergrund) bis zu einer

optischen Dichte405nm~1.2 für 100 ng/ml hGBP-1.

Anhand dieser Standardkurve können die hGBP-1-Konzentrationen der

einzelnen Patientenseren errechnet und für statistische Auswertungen

weiterverwendet werden. [058]

38

3.2.3. Die IL-6-Messung mittels Sandwich-ELISA

Zur quantitativen Messung von IL-6 wurde der Quantikine® Human IL-6

Immunoassay der Firma R&D Systems verwendet.

Während bei der hGBP-1-Messung die 96 Wells einer Platte noch eigens

gecoatet werden mussten, kann bei der IL-6-Messung auf eine bereits

gecoatete Platte der Firma R&D Systems zurückgegriffen werden.

Bevor die eigentliche Messung beginnt, müssen auch hier einige

Vorbereitungen getroffen werden. So werden die bei -80°C tiefgefrorenen

Patientenseren aufgetaut und die Standardlösungen ähnlich wie bei der

hGBP-1-Messung in unterschiedlichen Konzentrationen hergestellt. Die IL-6-

Standardlösung mit einer Konzentration von 300 pg/ml wird verdünnt und so

entstehen für die IL-6-Messung folgende Standardkonzentrationen: 300

pg/ml, 100 pg/ml, 50 pg/ml, 25 pg/ml, 12,5 pg/ml, 6,25 pg/ml, 3,12 pg/ml und

0 pg/ml.

Die 96 Wells werden nun mit je 100 µl Assay Diluent RD1W, einer

Verdünnungslösung der Firma R&D Systems, befüllt. Diese Lösung enthält

Proteine, die die Platte und damit den ELISA aktivieren. Zusätzlich werden

jeweils 100 µl der Patientenproben und der Standardlösungen in die Wells

pipettiert und zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Während dieser

Inkubationszeit kann das IL-6 der einzelnen Proben an die Antikörper, die am

Boden der gecoateten Wells fixiert sind, binden. Danach werden die

ungebundenen Interleukine durch vier Wasch- und Absaugvorgänge mit

jeweils 400 µl Diluted Wash Buffer (Fa. R&D Systems) und anschließendem

Ausklopfen aus den Wells entfernt.

Nun werden 200 µl IL-6 Conjugate (Fa. R&D Systems) in jeden Ansatz

zugegeben. Dieses IL-6 Conjugate enthält polyklonale IL-6-Antikörper, an

denen ein Enzym gekoppelt ist. Als Enzym diente hier eine Horseradish

Peroxidase (Fa. R&D Systems). Zwei Stunden Inkubationszeit bei

Raumtemperatur ermöglicht der Konjugatlösung an das bereits fixierte IL-6 in

den Wells zu binden. Danach wird das überschüssige Antikörper-Enzym-

Gemisch wie im Schritt zuvor durch ebenfalls vier Wasch- und

Absaugvorgänge mit jeweils 400 µl Diluted Wash Buffer (Fa. R&D Systems)

und anschließendem Ausklopfen aus den Wells entfernt.

39

Als Substrat des Enzyms wird Substrate Solution (Fa. R&D Systems)

verwendet; darin enthalten sind stabiles Wasserstoffperoxid und Chromogen

(Tetramethylbenzidine). Nachdem 200 µl Substrate Solution in jedes Well

pipettiert werden, wird die Platte bei Raumtemperatur und lichtgeschützt für

20 Minuten inkubiert.

Die dabei enzymatische Umsetzung von Wasserstoffperoxid und Chromogen

wird durch den Zusatz von 50 µl Schwefelsäure-enthaltenden Stop Solution

(Fa. R&D Systems) gestoppt.

Mittels photometrischer Bestimmung der Farbintensität bei 450 nm

Wellenlänge kann die Konzentration von IL-6, die sich proportional zur

Farbintensität verhält, ermittelt werden. Da optische Fehler der Platte die

Ergebnisse fälschlicherweise erhöhen, wird die optische Dichte bei 450 nm

durch eine Wellenlängenkorrektur nachbearbeitet. Die Wellenlängenkorrektur

umfasst die Subtraktion der optischen Dichte von 570 nm Wellenlänge vom

Ergebnis der optischen Dichte bei 450 nm Wellenlänge.

Wie bereits bei der hGBP-1-Messung werden die exakten IL-6-

Konzentrationen anhand eines Abgleiches der Extinktion mit der

Standardkurve ermittelt. Die genaue Berechnung der Konzentrationen wird

im Folgenden dargestellt.

3.2.4. Die Kalkulation der ELISA-Ergebnisse

Zur Kalkulation der ELISA-Ergebnisse wurde die Computersoftware Microsoft

Office Excel von Microsoft Corporation verwendet.

Als Ergebnis der ELISA-Messung erhielt man zunächst die optische Dichte

der einzelnen Proben, die mittels ELISA-Reader erfasst wurden. Wurden die

Patientenseren in Triplikaten pipettiert, wie es bei der hGBP-1-Messung der

Fall war, so musste zunächst der Mittelwert errechnet werden. Die Messung

in Triplikaten und der daraus resultierenden Mittelwerte erhöhte die

Genauigkeit der Testung, da dadurch eventuelle Messungenauigkeiten

ausgeglichen oder gravierende Messfehler entdeckt wurden. Neben dem

Mittelwert wurde auch die Standardabweichung berechnet, die eine Aussage

über die Normalverteilung der Werte trifft.

40

Durch Mitführen des Standards bei der Messung konnte anhand der

bekannten Konzentrationen des Standards und den resultierenden optischen

Dichten eine messspezifische Standardkurve erstellt werden. Bei der hGBP-

1-Messung wurden folgende Standardkonzentrationen verwendet: 100 ng/ml,

50 ng/ml, 25 ng/ml, 12,5 ng/ml, 6,25 ng/ml, 3,125 ng/ml, 1,5625 ng/ml, 0

ng/ml. Bei der IL-6-Messung: 300 pg/ml, 100 pg/ml, 50 pg/ml, 25 pg/ml, 12,5

pg/ml, 6,25 pg/ml, 3,12 pg/ml und 0 pg/ml. Zusammen mit der jeweiligen

optischen Dichte erhielt man so messspezifische Wertepaare (X, Y).

Anhand dieser Wertepaare (X, Y) und ihrer grafischen Darstellung konnte ein

lineares Modell vermutet werden. Die allgemeine Formel der gesuchten

Regressionsfunktion lautet:

Formel 1: Regressionsfunktion

Regressionsfunktionen sind Geraden und sollen die Daten bestmöglichst

repräsentieren. X ist das unabhängige Merkmal und wurde in dieser Studie

definiert entweder als hGBP-1- oder IL-6-Wert. Y stellt das abhängige

Merkmal, hier die optische Dichte, dar. Die entsprechenden Parameter α und

β wurden von der Software nach der Methode der kleinsten Quadrate

bestimmt. α beschreibt die Regressionskonstante und β gibt als

Regressionskoeffizient die Steigung der Regressionsgeraden an.

Zur Prüfung der Güte der Regressionsgeraden wurde das Bestimmtheitsmaß

r² herangezogen. Dieses sagt aus, welcher Anteil der Varianz s des

abhängigen Merkmals (Y) durch das lineare Modell erklärt wird:

Formel 2: Bestimmtheitsmaß

41

r² nimmt Werte zwischen 0 und 1 an. Während ein Wert von r² = 0 als

statistische Unabhängigkeit und damit als Unkorreliertheit gilt, stellt r² = 1

eine vollständige lineare Abhängigkeit dar. Das bedeutet, dass r² die Stärke

der linearen Beziehung misst und möglichst nahe 1 liegen soll. [097]

Nachdem nun die spezifische Regressionsfunktion ermittelt wurde, konnten

die optischen Dichten der Patientenseren in die Funktion eingesetzt und die

genaue Konzentration von hGBP-1 oder IL-6 der einzelnen Seren berechnet

werden.

Im Folgenden wird die Auswertung eines hGBP-1-ELISAs exemplarisch

dargestellt.

Zunächst wurden die optischen Dichten des ELISA-Readers in eine Excel-

Tabelle übernommen. Der Übersichtlichkeit halber wurde die Anordnung

entsprechend der Reihenfolge auf der Messplatte gewählt. Da die hGBP-1-

Messung in Triplikaten gemessen wurde, entsprechen drei

nebeneinanderliegende Kästchen dem Triplikat einer Probe. Die ersten drei

Spalten entsprechen den Standardproben.

Tabelle 1: Optische Dichte der Triplikate

Optische Dichte der Triplikate 0,958 0,926 0,942 0,077 0,395 0,408 0,404 0,387 0,38 0,049 0,053 0,0520,681 0,698 0,666 0,076 0,369 0,38 0,394 0,391 0,38 0,047 0,045 0,0470,573 0,574 0,519 0,075 0,395 0,391 0,392 0,395 0,386 0,045 0,05 0,050,544 0,51 0,492 0,098 0,34 0,353 0,406 0,393 0,416 0,048 0,049 0,050,551 0,493 0,462 0,102 0,386 0,398 0,498 0,46 0,528 0,045 0,049 0,0480,531 0,467 0,462 0,078 0,404 0,416 0,415 0,405 0,393 0,05 0,051 0,0480,511 0,467 0,468 0,079 0,416 0,433 0,41 0,389 0,376 0,04 0,042 0,0450,511 0,449 0,489 0,081 0,44 0,434 0,474 0,445 0,455 0,046 0,056 0,046

Aus den optischen Dichten des Standards wurden die Mittelwerte und deren

Standardabweichungen berechnet. Da die Konzentrationen dieser Proben

bekannt waren, wurden sie den entsprechenden optischen Dichten

zugeordnet.

42

Tabelle 2: Optische Dichte der Standardproben

Standard100 0,942 0,016

50 0,681666667 0,01601041325 0,555333333 0,031469562

12,5 0,515333333 0,026407076,25 0,502 0,045177428

3,125 0,486666667 0,03847511,5625 0,482 0,025119713

0 0,483 0,031432467Konzentration (ng/ml)

Mittelwert Standard-abweichung

Als nächstes erstellte das Softwareprogramm aus den Ergebnissen der

Standardproben die Regressionsgerade und berechnete deren Funktion.

Dabei ist X definiert als hGBP-1-Wert und Y als optische Dichte. Die

Regressionskonstante α und der Regressionskoeffizient β wurden von der

Software anhand der Methode der kleinsten Quadrate berechnet.

Das Bestimmtheitsmaß r² lag hier mit einem Wert von 0,9909 sehr nahe 1

und beweist damit eine starke lineare Abhängigkeit der beiden Parameter

hGBP-1 und optische Dichte.

Des Weiteren waren auch die Standardabweichungen in die Darstellung der

Regressionsgeraden eingetragen. So ermöglichte das Diagramm einen

schnellen Überblick über die wesentlichen Variablen dieser Messreihe.

Abb. 9: Regressionsgerade der Standardproben

43

Durch Einsetzen der optischen Dichten der einzelnen Patientenseren in die

ermittelte spezifische Regressionsfunktion

Formel 3: Studienspezifische Regressionsfunktion

konnten die genauen Konzentrationen von hGBP-1 der einzelnen Seren

berechnet werden. Die Endkonzentrationen wurden noch mit acht

multipliziert, da die Proben zuvor im Verhältnis 1:8 verdünnt worden waren

(siehe Kapitel 3.2.2.). Ergebnisse mit negativem Vorzeichen bedeuten, dass

kein Nachweis von hGBP-1 möglich war. In dieser Messung war demnach

hGBP-1 lediglich in einem Patientenserum positiv.

Tabelle 3: Optische Dichte und Ergebnisse der Messreihe 1 vom 23.12.2008

Proben0,4015 0,009192388 -14,19565217 -0,325011071 -113,5652174 -2,6000885660,3745 0,007778175 -20,06521739 -0,416744363 -160,5217391 -3,3339549080,393 0,002828427 -16,04347826 -0,115465163 -128,3478261 -0,923721305

0,3465 0,009192388 -26,15217391 -0,693797789 -209,2173913 -5,5503823080,392 0,008485281 -16,26086957 -0,351984831 -130,0869565 -2,815878646

0,41 0,008485281 -12,34782609 -0,255548241 -98,7826087 -2,0443859260,4245 0,012020815 -9,195652174 -0,260398672 -73,56521739 -2,0831893740,437 0,004242641 -6,47826087 -0,062894584 -51,82608696 -0,503156671

0,390333333 0,012342339 -16,62318841 -0,525625177 -132,9855072 -4,2050014170,388333333 0,007371115 -17,05797101 -0,323784367 -136,4637681 -2,590274936

0,391 0,004582576 -16,47826087 -0,193127565 -131,826087 -1,5450205170,405 0,011532563 -13,43478261 -0,382561658 -107,4782609 -3,060493262

0,495333333 0,034078341 6,202898551 0,426752004 49,62318841 3,4140160330,404333333 0,011015141 -13,57971014 -0,369948285 -108,6376812 -2,9595862810,391666667 0,017156146 -16,33333333 -0,715447776 -130,6666667 -5,723582206

Mittelwert Standard-abweichung

Konzentration (ng/ml)

Standard-abweichung Konzentration (ng/ml)

Konzentration x 8 (ng/ml)

Standard-abweichung x 8 (ng/ml)

44

3.3. Die statistische Auswertung

Um einen Zusammenhang zwischen positiven hGBP-1-Messergebnissen in

den einzelnen Seren und dem Sepsis- bzw. Entzündungszustand zu

untersuchen, wurde ein statistischer Test angewendet. Dazu diente der

Exakte Fisher-Test, ein Chi-Quadrat-Test, für dichotome Variablen. Dieser

Test ermöglicht es, Beziehungen auch bei kleiner Fallzahl, wie in dieser

Studie, zuverlässig auf Signifikanz zu testen. [033] Das Signifikanzniveau

wurde bei α = 0,05 festgesetzt.

Zur Testung der Güte von hGBP-1 als Sepsis- oder Entzündungsmarker

wurden die Güteparameter Sensitivität und Spezifität herangezogen. Die

Sensitivität beschreibt dabei die Wahrscheinlichkeit, dass das Testergebnis

den tatsächlichen Zustand richtig positiv anzeigt. Im Gegenzug gibt die

Spezifität die Wahrscheinlichkeit an, dass das Testergebnis den

tatsächlichen Zustand richtig negativ aufdeckt. Am Beispiel verdeutlicht, ist

die Sensitivität also der Anteil der positiven Befunde bei kranken Patienten

und die Spezifität der Anteil der negativen Befunde bei gesunden Patienten.

[027]

Zur Ermittlung der Sensitivität und Spezifität wird eine Kreuztabelle

angefertigt, und anhand dieser können die Parameter berechnet werden.

Tabelle 4: Kreuztabelle

Kreuztabelle

tatsächlicher Zustand

Gesamt ja nein

Testergebnis ja richtig positiv falsch positiv positiv

nein falsch negativ richtig negativ negativ

Gesamt krank gesund Gesamt

Formel 4: Sensitivität

45

Formel 5: Spezifität

Neben der Bestimmung des diagnostischen Tests und dessen

Güteparametern, wurde in dieser Arbeit auch besonders mit den genauen

Messwerten der Entzündungsmarker gearbeitet. Mit den Ergebnissen der

ELISA-Messung erhielt man die genauen Konzentrationen der zu

untersuchenden Substanzen hGBP-1 und IL-6 im Serum der Patienten.

Durch die unterschiedlichen Entzündungszustände, in denen sich die

Patienten zum Zeitpunkt der Blutentnahme befanden, konnten Vergleiche

ermöglicht und Korrelationen mit anderen bereits etablierten

Entzündungsmarkern erstellt werden. Dazu wurde der Korrelationskoeffizient

nach Pearson r verwendet.

Der Korrelationskoeffizient ist ein Indikator für die Stärke und Richtung

linearer Beziehungen und berechnet sich aus der Kovarianz s(XY) und den

Varianzen s von X und Y bzw. aus dem Bestimmtheitsmaß r2:

Formel 6: Korrelationskoeffizient

Zur Berechnung ist ein linearer Zusammenhang zwischen zwei metrischen

Merkmalen X und Y vorausgesetzt. Der Korrelationskoeffizient liegt im

Wertebereich zwischen - 1 und + 1 und beschreibt dabei die Steigung. Ein

positiver Korrelationskoeffizient liegt bei einer ansteigenden Steigung vor,

d.h. wenn hohe Werte des einen Merkmals mit hohen Werten des anderen

Merkmals einhergehen. Ein negativer Korrelationskoeffizient ergibt sich im

umgekehrten Fall, bei dem hohe Werte des einen, niedrige Werte des

anderen Merkmals bedingen und damit eine fallende Steigung ergeben. Des

Weiteren bedeuten Werte nahe - 1 oder + 1 einen hohen, und Werte, die

gegen 0 gehen, einen geringen Zusammenhang. Ein Korrelationskoeffizient

von 0 besagt eine Unkorreliertheit. [097]

46

F. BROSIUS gab dazu Richtlinien in der folgenden Tabelle zur Interpretation

des Korrelationskoeffizienten an.

Tabelle 5: Interpretation des Korrelationskoeffizienten nach F. BROSIUS [009]

Betrag des Korrelationskoeffizienten Mögliche Interpretation0,0 Keine Korrelationüber 0,0 bis 0,2 Sehr schwache Korrelationüber 0,2 bis 0,4 Schwache Korrelationüber 0,4 bis 0,6 Mittlere Korrelationüber 0,6 bis 0,8 Starke Korrelationüber 0,8 bis unter 1,0 Sehr starke Korrelation1,0 Perfekte Korrelation

Die statistische Auswertung dieser Arbeit wurde mithilfe des statistischen

Softwareprogramms PASW Statistics 18 (Predictive Analytics Software) von

SPSS Inc., eine IBM Company, erarbeitet.

47

4 ERGEBNISSE

Die einzelnen Messergebnisse dieser Studie sind in Tabelle 24 (Überblick

der Messergebnisse des Gesamt-Patientenkollektivs) im Anhang aufgelistet.

Darin enthalten sind alle Messresultate von Leukozyten, CRP, PCT, IL-6 und

hGBP-1.

In dieser Auflistung, wie auch in folgenden Tabellen ist die Leukozytenzahl in

103/µl angegeben, die Konzentration von CRP in mg/l, PCT in ng/ml, IL-6 in

pg/ml und hGBP-1 in ng/ml.

Neben den einzeln untersuchten Messkonzentrationen führt Tabelle 24

(Überblick der Messergebnisse des Gesamt-Patientenkollektivs) auch die

Patientennummer (PatNr) und laufende Nummer (LfdNr) zur genauen

Identifikation der Studienseren auf.

Die Ergebnisse dieser Studie umfassten insbesondere die Berechnung von

Korrelationen nach Pearson. Eine zusammenfassende Tabelle über die

Korrelationsergebnisse, in der alle Blutseren eingeschlossen sind, soll einen

ersten Überblick über die Resultate dieser Studie bieten.

Tabelle 6 (Überblick der Korrelationen des Gesamt-Patientenkollektiv) zeigt

dabei hoch signifikante (α = 0,01) Korrelationen. So korrelieren CRP und die

Leukozytenzahl mit einem Koeffizienten von 0,313 miteinander, IL-6 und die

Leukozytenzahl mit 0,399 und IL-6 und CRP mit 0,440. Desweiteren zeigt

hGBP-1 und die Leukozytenzahl einen signifikanten (α = 0,01)

Zusammenhang von 0,650.

48

Tabelle 6: Überblick der Korrelationen des Gesamt-Patientenkollektivs

Korrelationen des Gesamt-Patientenkollektivs

Leukozyten-

zahl CRP PCT IL-6 hGBP-1

Leukozytenzahl Korrelation nach

Pearson

1 ,313** ,033 ,399** ,650**

Signifikanz (2-seitig) ,003 ,904 ,000 ,000

N 90 90 16 90 90

CRP Korrelation nach

Pearson

,313** 1 ,356 ,440** ,170

Signifikanz (2-seitig) ,003 ,176 ,000 ,110

N 90 90 16 90 90

PCT Korrelation nach

Pearson

,033 ,356 1 ,341 -,109

Signifikanz (2-seitig) ,904 ,176 ,196 ,687

N 16 16 16 16 16

IL-6 Korrelation nach

Pearson

,399** ,440** ,341 1 ,119

Signifikanz (2-seitig) ,000 ,000 ,196 ,266

N 90 90 16 90 90

hGBP-1 Korrelation nach

Pearson

,650** ,170 -,109 ,119 1

Signifikanz (2-seitig) ,000 ,110 ,687 ,266

N 90 90 16 90 90

**. Die Korrelation ist auf dem Niveau von 0,01 (2-seitig) signifikant.

49

4.1. Die Korrelation von CRP, Leukozyten, PCT und IL-6

Im Folgenden werden die einzelnen Korrelationsergebnisse von CRP, der

Leukozytenzahl und IL-6 dieser Studie vorgestellt. Die einzelnen

dazugehörigen Messwerte sind der Tabelle 24 (Überblick der

Messergebnisse des Gesamt-Patientenkollektivs) zu entnehmen.

4.1.1. Die Korrelation von CRP und Leukozyten

Bei der oben aufgeführten Tabelle 6 (Überblick der Korrelationen des

Gesamt-Patientenkollektivs), die eine zusammenfassende

Korrelationstabelle aller Blutentnahmen dieser Studie darstellt, fällt auf, dass

die bereits etablierten Entzündungsmarker CRP und Leukozyten signifikant

miteinander korrelieren. Diese signifikante Korrelation ist im Folgendem

nochmal explizit dargestellt (Tabelle 7).

Tabelle 7: Korrelationen des Gesamt-Patientenkollektivs (1)

Korrelationen des Gesamt-Patientenkollektivs

Leukozytenzahl CRP

Leukozytenzahl Korrelation nach Pearson 1 ,313**

Signifikanz (2-seitig) ,003

N 90 90

CRP Korrelation nach Pearson ,313** 1

Signifikanz (2-seitig) ,003

N 90 90

**. Die Korrelation ist auf dem Niveau von 0,01 (2-seitig) signifikant.

Das Signifikanzniveau liegt hier bei α = 0,01. Grafisch stellt sich diese

Korrelation von 0,313 wie folgt dar (Abb. 10).

50

Abb. 10: Streudiagramm der Leukozytenzahl und CRP im Patientenkollektiv

Auch in anderen Untergruppen ist eine signifikante Korrelation zwischen der

Leukozytenzahl und CRP nachweisbar. So besteht im Studienarm der Nicht-

Sepsis-Patienten eine Korrelation von 0,232 bei einem Signifikanzniveau von

α = 0,05 (Tabelle 8).

Tabelle 8: Korrelationen der Nicht-Sepsis-Patienten (1)

Korrelationen der Nicht-Sepsis-Patienten

Leukozytenzahl CRP

Leukozytenzahl Korrelation nach Pearson 1 ,232*

Signifikanz (2-seitig) ,047

N 74 74

CRP Korrelation nach Pearson ,232* 1

Signifikanz (2-seitig) ,047

N 74 74

*. Die Korrelation ist auf dem Niveau von 0,05 (2-seitig) signifikant.

51

Des Weiteren ergeben auch die Blutseren der Patienten mit Entzündung eine

signifikante Korrelation von 0,245 (α = 0,05) zwischen der Leukozytenzahl

und CRP (Tabelle 9).

Tabelle 9: Korrelationen der Blutseren der Patienten mit Entzündung (1)

Korrelationen der Blutseren der Patienten mit Entzündung

Leukozytenzahl CRP

Leukozytenzahl Korrelation nach Pearson 1 ,245*

Signifikanz (2-seitig) ,047

N 66 66

*. Die Korrelation ist auf dem Niveau von 0,05 (2-seitig) signifikant.

In den Arm „Patienten mit Entzündung“ sind alle Blutseren eingeschlossen,

die entweder post operationem oder septisch sind. Es wurden lediglich die

Seren ausgeschlossen, die prae operationem sind und keine erhöhten

Entzündungswerte aufweisen.

4.1.2. Die Korrelation von PCT mit anderen Entzündungsmarkern

Bei der Untersuchung der PCT-Werte auf Korrelationen mit anderen

Entzündungsmarkern konnten keine signifikanten Ergebnisse erzielt werden.

4.1.3. Die Korrelation von IL-6 mit anderen Entzündungsmarkern

In der Korrelationsberechnung ergeben sich zwei signifikante Ergebnisse.

Tabelle 10: Korrelationen des Gesamt-Patientenkollektivs (2)

Korrelationen des Gesamt-Patientenkollektivs

Leukozytenzahl CRP PCT hGBP-1

IL-6 Korrelation nach Pearson ,399** ,440** ,341 ,119

Signifikanz (2-seitig) ,000 ,000 ,196 ,266

N 90 90 16 90

**. Die Korrelation ist auf dem Niveau von 0,01 (2-seitig) signifikant.

52

Zum einen zeigt IL-6 mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,399, der auf

einem Niveau von α = 0,01 signifikant ist, einen Zusammenhang mit der

Leukozytenzahl (Tabelle 10).

Des Weiteren besteht eine signifikante (α = 0,01) Korrelation zwischen IL-6

und CRP von 0,440 (Tabelle 10).

Im Studienarm der Nicht-Sepsis-Patienten wurden ebenfalls zwei signifikante

Korrelationen mit IL-6 erzielt. Zwischen IL-6 und CRP besteht hier im

Studienarm der Nicht-Sepsis-Patienten eine signifikante Korrelation von

0,493 auf dem Niveau von α = 0,01 (Tabelle 11).

Neben CRP besteht ebenfalls eine signifikante Korrelation (α = 0,01) von

0,382 zwischen IL-6 und der Leukozytenzahl (Tabelle 11).

Anschließend ist die statistische Auswertung aufgeführt. Da nur bei den

septischen Patienten auf Intensivstation Procalcitonin im Routinelabor der

Chirurgischen Universitätsklinik Erlangen bestimmt wurde, sind für die

statistische Auswertung der Nicht-Sepsis-Patienten keine Procalcitoninwerte

mit berücksichtigt worden.

Tabelle 11: Korrelationen der Nicht-Sepsis-Patienten (2)

Korrelationen der Nicht-Sepsis-Patienten

Leukozytenzahl CRP hGBP-1

IL-6 Korrelation nach Pearson ,382** ,493** ,022

Signifikanz (2-seitig) ,001 ,000 ,851

N 74 74 74

**. Die Korrelation ist auf dem Niveau von 0,01 (2-seitig) signifikant.

Das Streudiagramm der Korrelation zwischen IL-6 und der Leukozytenzahl

im Studienarm der Nicht-Sepsis-Patienten kann das Ergebnis noch

veranschaulichen (Abb. 11).

53

Abb. 11: Streudiagramm der Leukozytenzahl und IL-6 bei Nicht-Sepsis-Patienten

Bei der alleinigen Betrachtung aller Blutseren post operationem ergab die

statistische Auswertung weitere signifikante Korrelationen. Dabei sind alle

Blutseren Tag 1-7 post operationem eingeschlossen, hingegen

ausgeschlossen sind die präoperativ abgenommenen Blutproben.

Mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,358 korreliert IL-6 signifikant (α =

0,05) mit der Leukozytenzahl. Auch zwischen IL-6 und CRP lässt sich hier

eine signifikante Korrelation von 0,333 (α = 0,05) nachweisen (Tabelle 12).

Tabelle 12: Korrelationen der Blutseren post operationem 1-7

Korrelationen der Blutseren post operationem 1-7

Leukozytenzahl CRP hGBP-1

IL-6 Korrelation nach Pearson ,358* ,333* ,028

Signifikanz (2-seitig) ,011 ,018 ,846

N 50 50 50

*. Die Korrelation ist auf dem Niveau von 0,05 (2-seitig) signifikant.

54

Die Korrelationsberechnungen der Untergruppen, die sich auf die einzelnen

Tage post operationem beziehen, werden nun im Folgenden erläutert.

Bei der Korrelationstestung am Tag 1 post operationem zeigt sich ein

Zusammenhang von 0,538 zwischen IL-6 und CRP. Das Signifikanzniveau

liegt hier bei α = 0,01 (Tabelle 13).

Tabelle 13: Korrelationen der Blutseren am Tag 1 post operationem

Korrelationen der Blutseren am Tag 1 post operationem

Leukozytenzahl CRP

IL-6 Korrelation nach Pearson ,123 ,538**

Signifikanz (2-seitig) ,577 ,008

N 23 23

**. Die Korrelation ist auf dem Niveau von 0,01 (2-seitig) signifikant.

Da hGBP-1 in den Blutseren dieser Untergruppe des 1. Tages post

operationem nicht nachweisbar war, kann hier keine statistische Beurteilung

mit den anderen Entzündungsmarkern stattfinden.

Der Pearson‘sche Korrelationskoeffizient von 0,661 bei einer Signifikanz von

α = 0,05 zeigt am Tag 3 post operationem einen starken Zusammenhang

zwischen IL-6 und CRP (Tabelle 14).

Tabelle 14: Korrelationen der Blutseren am Tag 3 post operationem

Korrelationen der Blutseren am Tag 3 post operationem

Leukozytenzahl CRP hGBP-1

IL-6 Korrelation nach Pearson ,146 ,661* ,277

Signifikanz (2-seitig) ,617 ,010 ,337

N 14 14 14

*. Die Korrelation ist auf dem Niveau von 0,05 (2-seitig) signifikant.

55

Die statistische Beurteilung der Blutseren des 5. Tages post operationem

ergibt einen Korrelationskoeffizienten von 0,851 zwischen IL-6 und der

Leukozytenzahl. Das Signifikanzniveau liegt bei α = 0,01 (Tabelle 15).

Tabelle 15: Korrelationen der Blutseren am Tag 5 post operationem

Korrelationen der Blutseren am Tag 5 post operationem

Leukozytenzahl CRP

IL-6 Korrelation nach Pearson ,851** ,645

Signifikanz (2-seitig) ,004 ,061

N 9 9

**. Die Korrelation ist auf dem Niveau von 0,01 (2-seitig) signifikant.

HGBP-1 war am Tag 5 post operationem nicht nachweisbar und somit

konnte keine statistische Auswertung zwischen IL-6 und hGBP-1 erfolgen.

Wie auch bei vielen anderen Untergruppen korreliert IL-6 auch in der

Patientengruppe mit Entzündung signifikant mit der Leukozytenzahl und

CRP. In dieser Untergruppe sind alle Patientenseren beinhaltet, die sich zum

Abnahmezeitpunkt in einem entzündeten Zustand befanden. Dazu gehören

sowohl alle Blutseren post operationem, wie auch die Seren der Sepsis-

Patienten.

Bei einem Signifikanzniveau von α = 0,01 steht IL-6 mit einem

Korrelationskoeffizienten von 0,379 mit der Leukozytenzahl in Beziehung.

Des Weiteren korreliert IL-6 mit einem signifikanten (α = 0,01) Ergebnis von

0,412 in dieser Untergruppe der Patienten mit Entzündung ebenfalls mit CRP

(Tabelle 16).

Tabelle 16: Korrelationen der Blutseren der Patienten mit Entzündung (2)

Korrelationen der Blutseren der Patienten mit Entzündung

Leukozytenzahl CRP PCT hGBP-1

IL-6 Korrelation nach Pearson ,379** ,412** ,341 ,100

Signifikanz (2-seitig) ,002 ,001 ,196 ,426

N 66 66 16 66

**. Die Korrelation ist auf dem Niveau von 0,01 (2-seitig) signifikant.

56

4.2. Die statistische Auswertung von hGBP-1

Zum Überblick des gesamten Patientenkollektivs in Hinblick auf die einzelnen

Blutwerte, wird auf Tabelle 24 (Überblick der Messergebnisse des Gesamt-

Patientenkollektivs) im Anhang verwiesen.

4.2.1. Das Patientenkollektiv

Zunächst zeigt sich, dass hGBP-1 im Serum nachweisbar ist. Bis auf eine

Ausnahme ist hGBP-1 nur im entzündeten oder septischen Bereich messbar

gewesen.

HGBP-1 war in sechs Fällen von insgesamt 90 Blutentnahmen positiv.

Darunter sind vier Patientenproben, die sich zum Zeitpunkt der Blutentnahme

im septischen Zustand befanden, eine Serumprobe im entzündeten

postoperativen und eine Blutprobe im nicht entzündeten präoperativen

Bereich. Das bedeutet, dass hGBP-1 eine sehr geringe Sensitivität für einen

entzündeten oder septischen Zustand hat, die Spezifität im Gegenzug aber

sehr hoch einzuschätzen ist. Dieses Ergebnis wird in Kapitel 4.2.2. und

Kapitel 4.2.4. noch näher erläutert.

Des Weiteren zeigt sich in der statistischen Auswertung eine signifikante

Korrelation zwischen hGBP-1 und der Leukozytenzahl. Der

Korrelationskoeffizient von 0,650, der auf einem Niveau von α = 0,01

signifikant ist, gibt laut F. BROSIUS (siehe Kapitel 3.3.) eine starke

Korrelation an (Tabelle 17).

Tabelle 17: Korrelationen des Gesamt-Patientenkollektivs (3)

Korrelationen des Gesamt-Patientenkollektivs

Leukozytenzahl CRP PCT IL-6

hGBP-1 Korrelation nach Pearson ,650** ,170 -,109 ,119

Signifikanz (2-seitig) ,000 ,110 ,687 ,266

N 90 90 16 90

**. Die Korrelation ist auf dem Niveau von 0,01 (2-seitig) signifikant.

57

4.2.2. Der Studienarm: Sepsis-Patienten

Wie bereits erwähnt, waren vier der sechs positiven hGBP-1-Werte im

septischen Bereich. Das bedeutet, dass im Vergleich zu den 90

Blutentnahmen des Gesamtkollektivs nur sehr wenige Blutentnahmen positiv

für hGBP-1 waren. Von diesen sechs positiven hGBP-1-Blutseren lagen aber

66,7% im septischen Bereich. Das folgende Balkendiagramm soll dies

verdeutlichen (Abb.12).

Abb. 12: hGBP-1 * Sepsis Balkendiagramm

58

Tabellarisch lässt sich diese Konstellation in einer Kreuztabelle formulieren.

Dabei wird ebenfalls verdeutlicht, dass vier von sechs positiven hGBP-1-

Ergebnissen im septischen Zustand waren und im Vergleich lediglich bei

zwei von 74 nicht-septischen Patienten hGBP-1 im Blutserum nachgewiesen

wurde (Tabelle 18).

Tabelle 18: hGBP-1 * Sepsis Kreuztabelle

hGBP-1 * Sepsis Kreuztabelle

Sepsis

Gesamt ja nein

hGBP-1 pos 4 2 6

neg 12 72 84

Gesamt 16 74 90

Zur Analyse des Zusammenhangs zwischen positiven hGBP-1-Werten und

einem septischen Zustand wurde der Exakte Fisher-Test, ein Chi-Quadrat-

Test, verwendet. Dabei ergibt sich ein statistisch signifikanter

Zusammenhang (p = 0,008) (Tabelle 19).

Tabelle 19: Chi-Quadrat-Test bezüglich hGBP-1 * Sepsis

Chi-Quadrat-Test

Wert df

Asymptotische

Signifikanz (2-

seitig)

Exakte

Signifikanz (2-

seitig)

Exakte

Signifikanz (1-

seitig)

Chi-Quadrat nach

Pearson

10,512a 1 ,001

Kontinuitätskorrekturb 7,234 1 ,007

Likelihood-Quotient 7,704 1 ,006

Exakter Test nach Fisher ,008 ,008

Zusammenhang linear-

mit-linear

10,395 1 ,001

Anzahl der gültigen Fälle 90

a. 2 Zellen (50,0%) haben eine erwartete Häufigkeit kleiner 5. Die minimale erwartete Häufigkeit ist

1,07.

b. Wird nur für eine 2x2-Tabelle berechnet

59

Die Berechnungen von Sensitivität und Spezifität von hGBP-1 als

Sepsismarker werden im Folgenden dargestellt.

Zur Beurteilung der Güte von hGBP-1 eine Sepsis anzuzeigen, ergibt sich

somit eine Sensitivität von 66,7% und eine Spezifität von 97,3%.

In Hinsicht auf die Korrelationskoeffizienten zwischen hGBP-1 und anderen

Entzündungsmarkern ergeben sich weitere Ergebnisse. Der Studienarm der

septischen Patienten zeigt einen signifikant starken Zusammenhang von

0,670 bei α = 0,01 zwischen hGBP-1 und der Leukozytenzahl (Tabelle 20).

Tabelle 20: Korrelationen der Sepsis-Patienten

Korrelationen der Sepsis-Patienten

Leukozytenzahl CRP PCT IL-6

hGBP-1 Korrelation nach Pearson ,670** -,242 -,109 -,193

Signifikanz (2-seitig) ,004 ,366 ,687 ,474

N 16 16 16 16

**. Die Korrelation ist auf dem Niveau von 0,01 (2-seitig) signifikant.

4.2.3. Der Studienarm: Nicht-Sepsis-Patienten

Der Studienarm der Nicht-Sepsis-Patienten umfasste die Blutseren prae

operationem und alle Blutproben post operationem. Wie bereits erwähnt,

wurde bei den nicht-septischen Patienten kein Procalcitonin bestimmt.

Die statistische Auswertung der Nicht-Sepsis-Patienten zeigt keine

signifikanten Korrelationen.

60

Die Studiengruppe der Nicht-Sepsis-Patienten kann noch weiter unterteilt

werden.

Werden nur die Blutproben prae operationem betrachtet, ergeben sich

ebenfalls keine signifikanten Resultate. Zu erwähnen ist, dass, wie der im

Anhang aufgeführten Tabelle 24 (Überblick der Messergebnisse des

Gesamt-Patientenkollektivs) zu entnehmen ist, ein positiver hGBP-1-Wert

unter den nicht entzündlichen präoperativen Seren ermittelt wurde.

Eine Untergruppe, die ebenfalls auf Korrelationen untersucht wurde, stellt

eine Zusammenstellung aller Patientenseren, die post operationem

abgenommen worden sind, dar. Dazu gehören alle Blutwerte Tag 1-7 post

operationem, in denen also alle Blutproben enthalten sind, die weder prae

operationem noch im septischen Zustand abgenommen wurden. Diese

Zusammenstellung zeigt in der statistischen Auswertung keine signifikanten

Korrelationen.

Des Weiteren wurden einzelne Tage post operationem auf Korrelationen mit

hGBP-1 untersucht.

Bei der alleinigen Betrachtung von jeweils Tag 1, 2, 4, 5, 6 und Tag 7 post

operationem resultieren keine Korrelationen, weil hGBP-1 in diesen Fällen im

Serum nicht nachweisbar war.

Am Tag 3 post operationem wurde ein Patientenserum positiv für hGBP-1

getestet. Die statistische Untersuchung auf Korrelationen ergibt hier keine

signifikanten Ergebnisse.

4.2.4. Die Patientengruppe mit Entzündung

Die Patientengruppe mit Entzündung setzt sich aus allen Patientenseren

zusammen, deren Zustand im entzündeten Bereich lag, unabhängig davon,

wie stark die Entzündung war. Somit gehören alle postoperativen und alle

septischen Blutseren dazu, präoperativ abgenommene Patientenseren sind

dagegen ausgeschlossen.

61

Hier zeigt sich, dass fünf Blutproben positiv auf hGBP-1 waren. Im Hinblick

auf das Gesamt-Patientenkollektiv, bei dem insgesamt sechs positive hGBP-

1-Werte gemessen wurden, zeigt sich somit eine interessante Verteilung der

positiven hGBP-1-Blutseren. 83,3% aller positiven hGBP-1-Werte in

Blutproben lagen im entzündeten Bereich.

Das Balkendiagramm soll dies veranschaulichen (Abb. 13).

Abb. 13: hGBP-1 * Entzündung Balkendiagramm

Die dazugehörige Kreuztabelle ist im Folgenden dargestellt. Dabei wird

verdeutlicht, dass fünf von sechs positiven hGBP-1-Messergebnissen im

entzündeten Zustand nachweisbar waren und im Gegensatz dazu lediglich

eine von 24 Blutproben hGBP-1-postiv im nicht-entzündeten Zustand

getestet wurden (Tabelle 21).

62

Tabelle 21: hGBP-1 * Entzündung Kreuztabelle

hGBP-1 * Entzündung Kreuztabelle

Entzündung

Gesamt ja nein

hGBP-1 pos 5 1 6

neg 61 23 84

Gesamt 66 24 90

Der Exakte Fisher-Test, ein Chi-Quadrat-Test zur Testung des

Zusammenhangs zwischen hGBP-1 und einer Entzündung, ergab keine

signifikanten Resultate (Tabelle 22).

Tabelle 22: Chi-Quadrat-Test bezüglich hGBP-1 * Entzündung

Chi-Quadrat-Test

Wert df

Asymptotische

Signifikanz (2-

seitig)

Exakte

Signifikanz (2-

seitig)

Exakte

Signifikanz (1-

seitig)

Chi-Quadrat nach

Pearson

,329a 1 ,566

Kontinuitätskorrekturb ,009 1 ,924

Likelihood-Quotient ,360 1 ,548

Exakter Test nach Fisher 1,000 ,490

Zusammenhang linear-

mit-linear

,325 1 ,569

Anzahl der gültigen Fälle 90

a. 2 Zellen (50,0%) haben eine erwartete Häufigkeit kleiner 5. Die minimale erwartete Häufigkeit ist

1,60.

b. Wird nur für eine 2x2-Tabelle berechnet

Um die Güte von hGBP-1 als Entzündungsmarker festzustellen, wurden die

Sensitivität und Spezifität wie folgt berechnet.

63

Die Sensitivität von hGBP-1 eine Entzündung anzuzeigen beträgt 7,5%. Die

Spezifität liegt im Vergleich bei 95,8%.

In der statistischen Korrelationsanalyse mit anderen Entzündungsmarkern

zeigt die Patientengruppe mit Entzündung signifikante Ergebnisse. Wie

bereits erwähnt, sind darin die Blutseren Tag 1-7 post operationem und die

septischen Blutproben eingeschlossen, Blutseren prae operationem sind

hingegen ausgeschlossen.

HGBP-1 ist hier mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,660 mit der

Leukozytenzahl stark korreliert. Das Signifikanzniveau liegt bei α = 0,01

(Tabelle 23).

Tabelle 23: Korrelationen der Blutseren der Patienten mit Entzündung (3)

Korrelationen der Blutseren der Patienten mit Entzündung

Leukozytenzahl CRP PCT IL-6

hGBP-1 Korrelation nach Pearson ,660** ,129 -,109 ,100

Signifikanz (2-seitig) ,000 ,303 ,687 ,426

N 66 66 16 66

**. Die Korrelation ist auf dem Niveau von 0,01 (2-seitig) signifikant.

64

4.3. Zusammenfassung der Ergebnisse

Anhand der oben aufgeführten Ergebnisse lassen sich einige Schlüsse über

die untersuchten Entzündungsmarker dieser Studie ziehen.

So korrelierten die Leukozytenzahl und CRP sowohl im Bereich des Gesamt-

Patientenkollektivs, der Nicht-Sepsis-Patienten und der Patienten mit

Entzündung miteinander.

PCT zeigte weder im entzündlichen, noch im septischen, noch im

entzündungsfreien Zustand eine Korrelation zu anderen

Entzündungsmarkern.

IL-6 korrelierte im Gesamt-Patientenkollektiv, bei Nicht-Sepsis-Patienten und

in der Untergruppe Patienten mit Entzündung sehr gut mit der

Leukozytenzahl und CRP, jedoch nicht im entzündungsfreien Bereich.

In Bezug auf hGBP-1 ließen sich folgende Ergebnisse darstellen:

Der Nachweis von hGBP-1 im Blutserum ist möglich, allerdings bis auf eine

Ausnahme nur im entzündeten oder septischen Bereich.

Je höher der Entzündungszustand war, desto häufiger war hGBP-1

nachweisbar.

83,3% der positiven hGBP-1-Messergebnisse wurden bei Patienten mit

Entzündung gemessen. Bei 5/66 Patientenseren mit Entzündung konnte

hGBP-1 nachgewiesen werden. Die Sensitivität von hGBP-1 als

Entzündungsmarker liegt bei 7,5%, die Spezifität bei 95,8%.

66,7% der positiven hGBP-1-Ergebnisse wurden bei septischen

Patientenseren gemessen. In 4/16 der septischen Blutproben war die hGBP-

1-Testung positiv. HGBP-1 als Sepsismarker hat eine Sensitivität von 66,7%

und eine Spezifität von 97,3%. Im Exakten Fisher-Test wird ein signifikanter

Zusammenhang bestätigt.

Im Gegenzug war in 12/16 der Sepsisfälle kein hGBP-1 nachweisbar.

Man könnte postulieren, dass hGBP-1 in Sepsiszuständen nachweisbar ist,

allerdings sehr unzuverlässig, da bei 75% der Fälle dieser Patientengruppe

kein Nachweis erbracht werden konnte.

HGBP-1 korrelierte im Gesamt-Patientenkollektiv, bei septischen Patienten

und in der Untergruppe der Patienten mit Entzündung mit der

Leukozytenzahl.

65

5 DISKUSSION

A. PFÄFFLIN et al. prüften im Jahr 2009 aktuelle Entzündungsmarker auf

ihre Wertigkeit im Point-Of-Care-Testing (POCT). [066]

Das POCT ist eine patientennahe Sofortdiagnostik, die es ermöglicht,

Diagnosen rasch, zeitig und möglichst direkt am Geschehen zu stellen. Ziel

des POCT ist es, aus schnell gewonnenen Laborwerten direkte

therapeutische Konsequenzen ableiten zu können. Beispiele für POCT, die

bereits heute schon am Patientenbett durchgeführt werden, sind die

Blutglukosemessung und die Blutgasbestimmung. [040]

In der Veröffentlichung aus dem Jahr 2009 legten A. PFÄFFLIN et al. ihre

Ergebnisse bezüglich der Entzündungsmarker im POCT dar. Diese

bestätigten, dass die Leukozytenzahl, CRP und PCT gut geeignet sind, die

schnelle Diagnose einer Entzündung und Infektion bei Kindern und

Erwachsenen zu stellen. Darüber hinaus beschrieben die Autoren, dass im

Vergleich dazu IL-6 und IL-8 besser zur Detektion einer Sepsis bei

Neugeborenen geeignet sind. [066]

H. PELTOLA et al. untersuchten 1986 die diagnostische Bedeutung von CRP

und der Leukozytenzahl bei akuter Appendizitis. Bereits in 88% aller

Appendizitisfälle dieser Studie waren entweder die CRP-Werte oder die

Leukozytenzahl erhöht. Der positive Vorhersagewert für eine akute

Appendizitis bei einem zugleich erhöhten CRP- und Leukozytenwert ergab

sogar 93%. [064]

Auch S. M. SHAFI et al. veröffentlichten 2009 die Ergebnisse ihrer Studie

bezüglich der diagnostischen Hilfestellung von u.a. Leukozyten und CRP bei

akuter Appendizitis. Die Leukozytenzahl hatte hier eine Sensitivität von

97,82%, eine Spezifität von 55,55% und einen positiven Vorhersagewert von

91,8%. CRP schnitt nicht weniger schlecht ab mit einer Sensitivität von

95,6%, einer Spezifität von 77,77% und einem positiven Vorhersagewert von

95,6%. [081]

Solche Studienergebnisse zeigen, dass die Leukozytenzahl und CRP als

Entzündungsmarker häufig Hand-in-Hand gehen.

66

Auch die Korrelationsergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass diese beiden

Entzündungsmarker signifikant miteinander korrelieren. Wie den

Messergebnistabellen zu entnehmen ist, sind die Leukozytenzahlen und

CRP-Werte in Entzündungszuständen erhöht. Die signifikanten

Pearson‘schen Korrelationskoeffizienten von 0,313 (α = 0,01) im Gesamt-

Patientenkollektiv, 0,232 (α = 0,05) bei den Nicht-Sepsis-Patienten und 0,245

(α = 0,05) bei Patienten mit Entzündung deuten daraufhin, dass, wie

erwartet, die Leukozytenzahl und CRP bei unterschiedlichen Zuständen im

entzündeten Bereich in Beziehung zueinander stehen. Die positiven

Korrelationskoeffizienten zeigen, dass bei Zunahme des einen Parameters,

es auch zur Zunahme des anderen kommt. Mit dieser Aussage geht dieses

Studienergebnis konform mit vielen anderen Studien, beispielsweise wie die

oben erwähnten Veröffentlichungen von A. PFÄFFLIN et al. [066], H.

PELTOLA et al. [064] und S. M. SHAFI et al. [081].

Auch U. HELLGREN et al. schilderten bezüglich der Leukozytenzahl und

CRP bereits 1986 ähnliche Ergebnisse bei ihrer Untersuchung von 851

Patienten, die unter einer Sepsis oder einer Endokarditis litten. Die

Leukozytenzahl war in 60% der Fälle positiv (>9 x 109/l) und der CRP-Wert

sogar in 93% positiv (> 10 mg/l). [034]

In einer Meta-Analyse von L. SIMON et al. aus dem Jahr 2004 über 351

Studien wurden PCT und CRP als Marker einer bakteriellen Entzündung

gegenüber gestellt. Sie bekundeten PCT eine höhere Sensitivität von 88%

und eine höhere Spezifität von 81% in Bezug auf die Detektion einer

bakteriellen versus nicht-infektiösen Entzündung. Im Vergleich dazu lag CRP

bei einer Sensitivität von 75% und einer Spezifität von 67%. [085]

M. HATHERILL et al. verglichen 1999 PCT mit anderen

Entzündungsmarkern. Sie kamen ebenfalls zu dem Ergebnis, dass PCT ein

besserer Marker für Entzündung ist als CRP und die Leukozytenzahl. [032]

2004 analysierten G. P. CASTELLI et al. CRP- und PCT-Konzentrationen bei

Patienten mit unterschiedlichen Gesundheitszuständen. Zur Klassifizierung

der Erkrankungsschwere wurde bei jedem Patienten der jeweilige SOFA-

Score ermittelt. Dieser beschreibt objektiv die Organdysfunktion. Die

Resultate der Studie zeigten, dass CRP und PCT mit der Schwere der

Erkrankung ansteigen. Während die PCT-Konzentration bei SIRS über

67

Sepsis zu schwerer Sepsis und septischem Schock, und mit dem SOFA-

Score, anstieg, erschöpfte sich der CRP-Anstieg mit immer höherer

Erkrankungsschwere. Des Weiteren reagierte PCT rascher als CRP und

erlaubte die Diagnose einer Sepsis 24-48 Stunden früher als CRP. Demnach

ist PCT im Vergleich zu CRP der schnellere und sicherere Sepsismarker.

[012]

Zu einem ähnlichen Ergebnis kamen G. P. CASTELLI et al. auch im Jahr

2006, indem sie die Wertigkeit von PCT, CRP, Leukozyten und dem SOFA-

Score bezüglich der Einschätzung der Schwere der Erkrankung, Prognose

und Verlauf der Patienten auf Intensivstation ermittelten. So beschrieben sie,

dass PCT und der SOFA-Score mit der Erkrankungsschwere stärker

korrelierten als die anderen untersuchten Parameter. Und des Weiteren

erklärten sie, dass PCT ein besserer Parameter zur Diagnostik und zum

Monitoring der septischen und intensivpflichtigen Patienten sei als CRP,

Leukozyten und der SOFA-Score. [011]

Bei der Betrachtung der Ergebnisse von PCT in dieser Studie ergaben sich

keine signifikanten Korrelationen zu anderen Entzündungsmarkern. Das

kann verschiedene Ursachen haben.

Möglicherweise war die Fallzahl der PCT-Werte in dieser Studie zu gering.

Da PCT nur bei septischen Patienten auf Intensivstation routinemäßig

bestimmt wurde, ergaben sich lediglich 16 Blutentnahmen zur PCT-Messung.

Im Vergleich werteten L. SIMON et al. 2004 in der Meta-Analyse [085] 351

Studien, G. P. CASTELLI et al. ebenfalls aus dem Jahr 2004 [012] über 220

Patientendaten aus und im Jahr 2006 analysierten G. P. CASTELLI et al.

[011] 255 Beobachtungszeitpunkte.

Des Weiteren können auch die zeitlich unterschiedlichen An- und Abstiege

der anderen Entzündungsmarker Leukozyten, CRP und IL-6 ursächlich dafür

sein, dass PCT in dieser Studie nicht mit den anderen Entzündungsmarkern

korreliert. Wie bereits in Kapitel 2.6.1. erläutert, sind die einzelnen

Entzündungsmarker unterschiedlich schnell und stark in ihrem Anstieg und

ihrem folgenden Abfall bei Sepsis. Dies bestätigten auch D. MOKART et al.

2005, als sie erklärten, dass IL-6 und PCT bei postoperativ-septischen

Patienten ein früherer Marker ist als CRP [054], und R. CLAEYS et al. im

Jahr 2002, die u.a. ebenfalls veröffentlichten, dass PCT einen septischen

68

Schock früher anzeigt als CRP [018]. P. MARUNA et al. erläuterten 2000 in

Bezug auf die Regulation von PCT, dass PCT nach der Elevation von TNF

und IL-6, aber vor dem Anstieg von CRP, ansteigt. [052]

Auch die Leukozytenzahl unterliegt Schwankungen während einer Sepsis.

So berichteten 2008 auch N. S. WARD et al. von einer kompensatorischen

antiinflammatorischen Immunantwort (CARS) im Verlauf einer Sepsis, wie

auch in Kapitel 2.3. bereits beschrieben. Dieser Zustand CARS zeigte nach

N. S. WARD et al. klinisch neben Hypothermie, Anergie u.a. eine

Leukopenie. [102]

Auf diese Weise lässt sich möglicherweise die fehlende Korrelation von PCT

mit anderen Entzündungsmarkern in dieser Studie erklären.

IL-6 zeigt in dieser Studie sehr gute Korrelationen mit CRP und den

Leukozyten, insbesondere im entzündeten Zustand. Dieses Ergebnis lässt

sich durch viele andere Studien bekräftigen. So wiesen P. DAMAS et al.

1992 eine direkte, signifikante Korrelation zwischen IL-6 und der

Körpertemperatur und zwischen IL-6 und CRP (r = 0,66, p < 0,001) bei akut

kranken und entzündeten Patienten nach. Des Weiteren beschrieben sie

auch eine direkte Korrelation zwischen IL-6 und TNF-α während eines

septischen Schocks. IL-6 korrelierte außerdem mit dem APACHE II Score,

der das Sterberisiko intensivpflichtiger Patienten vorhersagt. Dabei stieg die

Mortalität bei IL-6-Werten über 1000 pg/ml signifikant an. Dementsprechend

folgerten P. DAMAS et al., dass IL-6 ein guter Marker für die Schwere einer

bakteriellen Entzündung ist. [019]

L. C. CASEY et al. veröffentlichten 1993 einen Artikel, in dem sie ebenfalls

beschrieben, dass IL-6 mit der Mortalität des septischen Syndroms korreliert.

[010]

Die signifikanten Korrelationen von IL-6 mit den bereits etablierten

Entzündungsmarkern Leukozyten und CRP in dieser Studie bestätigen die

Aussage, dass IL-6 eine Entzündung anzeigt. Und bei genauerer

Betrachtung der einzelnen Messwerte, die der Tabelle 24 (Überblick der

Messergebnisse des Gesamt-Patientenkollektivs) zu entnehmen sind, steigt

auch erwartungsgemäß in dieser Studie der IL-6-Wert mit dem

Entzündungszustand. Liegt der Mittelwert von IL-6 prae operationem noch

69

bei einer Konzentration von 6,53 pg/ml, steigt er post operationem auf

gemittelte 78,16 pg/ml an und erreicht bei den Sepsis-Patienten einen

Mittelwert von 2240,95 pg/ml. Da man davon ausgehen kann, dass die

Sterblichkeit bei septischen Patienten höher ist, als bei nicht septischen,

könnte man annehmen, dass IL-6 auch in dieser Studie mit der Mortalität,

wie bei L. C. CASEY et al. beschrieben [010], korreliert.

Im Gegensatz zu den Korrelationen im entzündeten und septischen Bereich,

konnten in der Patientengruppe prae operationem keine signifikanten

Korrelationen zwischen IL-6 mit den anderen Entzündungsmarkern

nachgewiesen werden.

Bei genauerer Betrachtung der statistischen Auswertung der Blutproben

präoperativ zeigt sich, dass zwischen keinem der gemessenen und

ausgewerteten Entzündungsmarker prae operationem Korrelationen

nachweisbar waren. Auch die bereits etablierten Marker Leukozyten und

CRP standen im entzündungsfreien Zustand nicht in signifikanter Beziehung

zueinander. Verschiedene Ursachen sind denkbar.

Ein möglicher Grund dieser allgemeinen fehlenden Korrelation bei

präoperativen Blutproben könnte ganz naheliegend die fehlende Entzündung

sein. Ein Marker kann einen Zustand nur anzeigen, wenn dieser Zustand

auch vorherrscht. Verschiedene Marker desselben Zustandes können nur

miteinander korrelieren, wenn der anzuzeigende Zustand auch gegeben ist.

In einer Publikation aus dem Jahr 2007 befassten J. E. AGUILAR-

NASCIMENTO et al. sich u.a. mit der Frage, ob unterschiedliche

präoperative IL-6-Werte spätere postoperative Infektionen prognostizieren

können. Dazu erklärten sie, dass die IL-6-Werte präoperativ nicht mit einer

postoperativen längeren Liegedauer im Krankenhaus korrelieren. Lediglich

am Tag 5 postoperativ konnte IL-6, anhand eines weiterhin hohen und nicht

abfallenden IL-6-Wertes, eine in etwa sechs Tage längere Krankenhaus-

Verweildauer prognostizieren. [002] Daraus könnte man schließen, dass IL-6

am Tag 5 post operationem deshalb ein vorhersagender Marker ist, weil IL-6

eine Entzündung anzeigte und sich mit einer postoperativen Infektion auch

die Liegedauer in der Regel verlängerte. Dementsprechend prognostizierte

IL-6 prae operationem unter Umständen keine längere Liegedauer, weil zu

70

diesem Zeitpunkt, wie auch in dieser Studie bei präoperativ abgenommenen

Blutproben, keine Entzündung vorherrschte.

Somit könnte man zu dem Schluss kommen, dass IL-6 auch in dieser Studie

als Entzündungsmarker gut einsetzbar ist, da er mit der Schwere der

Entzündung ansteigt und im entzündungsfreien Bereich keine Korrelationen

mit den bereits etablierten Entzündungsmarkern Leukozyten und CRP, wie

diese auch untereinander, bietet.

Hinsichtlich der Ergebnisse der hGBP-1-Untersuchung konnte zunächst

aufgezeigt werden, dass hGBP-1 im Serum nachweisbar ist.

Wie in Kapitel 2.6.2.4. bereits aufgeführt, wurde hGBP-1 schon in einigen

unterschiedlichen Medien nachgewiesen. 2006 wiesen E. NASCHBERGER

et al. anhand eines eigens dafür entwickelten ELISA‘s hGBP-1 im Liquor

nach [058], 2008 erforschten E. NASCHBERGER et al. hGBP-1 in

kolorektalen Karzinomen [057] und L. PERSANO et al. erbrachten 2009 den

Nachweis von hGBP-1 im Prostatakarzinom [065]. C. LUBESEDER-

MARTELLATO et al. konnten 2002 hGBP-1 in den Gefäßen

unterschiedlichster Gewebe, z B. Kolon, Herz, Milz, Gehirn,

immunhistochemisch nachweisen [048]. 2010 gelang M. HAMMON et al.

bereits der Nachweis des Proteins mittels ELISA im Serum. [031] Die

Vorstellung, dass der Nachweis von hGBP-1 dann auch in dieser Studie im

Serum möglich ist, ist demnach naheliegend.

Sechs von 90 Blutseren wurden in dieser Studie positiv auf hGBP-1 getestet.

Somit konnte die Nachweisbarkeit von hGBP-1 im Serum mittels Sandwich-

ELISA belegt werden.

Neben den verschiedensten Geweben, in denen hGBP-1 nachgewiesen

wurde, gelang es C. LUBESEDER-MARTELLATO et al. im Jahr 2002 hGBP-

1, neben den bereits oben Aufgeführten, auch in den Endothelzellen der

Hautgefäße nachzuweisen. Die Expression konnte in kleinen Gefäßen bei

Medikamenten-induzierter Hautreaktion, in mittelgroßen Gefäßen bei Kaposi-

Sarkom und bei Psoriasis-erkrankter Haut in den großen Gefäßen festgestellt

werden. Hingegen konnte hGBP-1 nicht in gesunder Haut nachgewiesen

werden. [048] Auch E. NASCHBERGER et al. wiesen 2006 hGBP-1 in einem

entzündeten Medium nach. Wie bereits oben beschrieben gelang ihnen der

71

Nachweis von hGBP-1 im Liquor. Der dazu untersuchte Liquor stammte von

Patienten mit bakterieller Meningitis. [058] Bei Patienten mit Erkrankungen

des rheumatischen Formenkreises, wie rheumatoider Arthritis, sytemischer

Lupus erythematodes und systemischer Sklerose, bestätigten M. HAMMON

et al. 2010 signifikant erhöhte hGBP-1-Werte im Blutserum. [031] Diese

Erkenntnisse, dass hGBP-1 besonders im entzündeten Zustand nachweisbar

ist, geht konform mit den Resultaten dieser Studie.

Bei der Betrachtung der statistischen Auswertung dieser Studie ergaben sich

interessante Korrelationen. So korrelierte hGBP-1 im Gesamt-

Patientenkollektiv, bei septischen Patienten und in der Untergruppe der

Patienten mit Entzündung, signifikant mit der Leukozytenzahl. Dabei lag der

Korrelationskoeffizient (α = 0,01) bei 0,650, 0,670 und 0,660. Das entspricht

nach F. BROSIUS [009] in allen drei Fällen einer starken Korrelation. Die

Leukozytenzahl ist ein etablierter Entzündungsmarker. Das bestätigt die

Aussage, dass hGBP-1 eine Entzündung anzeigt.

Gründe für die fehlenden Korrelationen im nicht entzündeten Zustand der

präoperativ abgenommenen Blutproben wurden bereits besprochen und

liegen möglicherweise an den generell mangelnden Korrelationen der

präoperativen Entzündungsmarker.

HGBP-1 konnte in sechs von 90 Blutproben entdeckt werden. Vier davon

waren im septischen Zustand, eine Serumprobe im entzündeten

postoperativen Zustand und lediglich eine Probe zum entzündungsfreien

präoperativen Zeitpunkt.

Somit kann die These aufgestellt werden, dass bei steigendem

Entzündungszustand des Patienten sich auch die Wahrscheinlichkeit der

Nachweisbarkeit von hGBP-1 erhöht.

Die hGBP-1-positive Serumprobe (12,73 ng/ml), die präoperativ

abgenommen wurde, zeigt in den Vergleichsblutwerten keine oder allenfalls

aufgrund des leicht erhöhten CRP-Wertes eine geringfügige Entzündung

(Leukozyten 6,13 x 10³/µl, CRP 5 mg/l, IL-6 0 pg/ml). Geht man davon aus,

dass es sich hier um einen statistischen Ausreißer handelt, dessen hGBP-1-

Wert falsch-positiv war, sind alle anderen positiven Ergebnisse im

entzündeten oder septischen Bereich. Das bedeutet, von 90 Blutproben

unterschiedlichster Entzündungs- und entzündungsfreier Zustände ist hGBP-

72

1 nur im entzündeten Zustand positiv. Damit scheint die Sensitivität von

hGBP-1 für eine Entzündung sehr gering zu sein, aber die Spezifität sehr

hoch.

War das Messergebnis der präoperativen Blutprobe richtig-positiv, muss ein

Teil der mutmaßlichen Spezifität von hGBP-1 als Entzündungsmarker

eingebüßt werden. Dennoch liegt die berechnete Spezifität für hGBP-1 als

Entzündungsmarker noch bei hohen 95,8%. Wie bereits vermutet, ist die

Sensitivität im Gegensatz dazu sehr gering. Lediglich bei 5/66 der

Patientenseren mit Entzündung konnte hGBP-1 nachgewiesen werden, das

entspricht einer Sensitivität von 7,5%. Dies ist bei der Betrachtung der

relativen Häufigkeit von hGBP-1 bezüglich des Entzündungszustandes der

Patienten zum Abnahmezeitpunkt auch zu erwarten, denn 83,3% der

positiven hGBP-1-Messergebnisse wurden bei Patienten mit Entzündung

gemessen.

Des Weiteren wird die Vermutung, dass hGBP-1 eine Entzündung anzeigt

und es sich bei der besagten positiven Blutprobe im präoperativen Zustand

um einen Ausreißer handelt, durch andere Erkenntnisse über hGBP-1

gestützt. Der Nachweis von hGBP-1 im Liquor bei Meningitis [058], der

alleinige Nachweis von hGBP-1 in Gefäßen erkrankter Haut [048], erhöhte

hGBP-1-Serumwerte bei rheumatischen Erkrankungen [031] und das

Wissen, dass hGBP-1 durch inflammatorische Zytokine induziert wird [026],

lässt vermuten, dass hGBP-1 während einer Entzündung eher nachweisbar

ist als im Blutserum im nicht entzündeten Zustand.

Die erheblich vermehrte Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen bei

Sepsis, die ihrerseits eine vermehrte Expression von hGBP-1 induzieren

[026], die mikrovaskuläre Schädigung bei Sepsis, die zu einer erhöhten Zahl

zirkulierender endothelialer Zellen mit relevanter Endothelzellschädigung

führt und damit die verstärkte Freisetzung endothelialer Abbauprodukte im

Blut bedingt [004] und die verstärkte AWF-induzierte Sekretion von ebenfalls

hGBP-1-exprimierenden EPC [031] lassen erhöhte hGBP-1-Werte bei Sepsis

vermuten.

Diese Studie kann dies bestätigen. 66,7% der positiven hGBP-1-Ergebnisse

wurden bei septischen Patientenseren gemessen. Demnach kann hGBP-1

eher als möglicher Sepsis- anstatt Entzündungsmarker gesehen werden.

73

Allerdings waren lediglich vier von 16 der septischen Blutproben in der

hGBP-1-Testung positiv. Dementsprechend war in 75% der Sepsisfälle

hGBP-1 negativ. Diesen Umstand spiegeln auch die Güteparameter von

hGBP-1 als Sepsismarker wieder. So liegt die Sensitivität bei 66,7% und die

Spezifität bei 97,3%. Auch im Exakten Fisher-Test wird ein signifikanter

Zusammenhang zwischen positivem hGBP-1-Wert und dem septischen

Zustand eines Patienten bestätigt.

Zusammenfassend zeigt hGBP-1 damit nur sehr unzuverlässig eine Sepsis

an, dies aber sehr spezifisch. Dies verdeutlicht ein Vergleich mit dem bereits

etablierten Entzündungsmarker CRP in der Studie von J. E. AGUILAR-

NASCIMENTO et al. aus dem Jahr 2007. Dort wurde der Vorhersagewert

einzelner Entzündungsmarker vor und nach einer Operation bezüglich des

postoperativen Infektionsrisikos untersucht. Unabhängig von den

Ergebnissen ihrer Studie, beschrieben sie einen signifikanten Anstieg aller

CRP-Werte nach der Operation. [002] Das bedeutet, der anerkannte

Entzündungsmarker CRP war bei allen Patienten nach einer Operation und

damit im entzündeten Zustand erhöht. Somit ist die Sensitivität von CRP,

eine Entzündung anzuzeigen, sehr hoch.

In dieser Studie war die Sensitivität von hGBP-1 eine Sepsis anzuzeigen

gering. Wird ein Sepsismarker gesucht, der eine Sepsis so sensitiv anzeigt,

wie CRP eine Entzündung, muss man anhand dieser Studie annehmen, dass

hGBP-1 als Sepsismarker nicht geeignet ist.

Als Ergebnis dieser Arbeit kann festgehalten werden, dass hGBP-1 im

Serum nachweisbar ist und mit dem Entzündungszustand ansteigt, jedoch

als sensitiver Entzündungs- oder Sepsismarker versagt.

Allerdings ist zu beachten, dass die Güteparameter des diagnostischen

Tests, wie die Sensitivität und Spezifität, die Wahrscheinlichkeit beschreiben,

einen positiven Befund bei einem kranken Patienten zu finden. Im klinischen

Alltag ist allerdings interessanter, wie wahrscheinlich die Krankheit bei einem

positivem Befund ist. Anhand der Kreuztabelle lassen sich die prädiktiven

Werte ableiten. Diese sind Maßzahlen der diagnostischen Aussagekraft. Im

Gegensatz zur Sensitivität und Spezifität sind sie von der Prävalenz der

Krankheit in der untersuchten Stichprobe abhängig. Um direkt

74

aussagekräftige positive und negative prädiktive Werte zu erhalten, muss die

zu untersuchende Stichprobe der reellen Prävalenz einer Krankheit

entsprechen. [027]

In dieser Arbeit wurden prävalenzunabhängig Blutseren der

unterschiedlichen Entzündungszustände abgenommen, um zunächst einmal

zu ermitteln, ob hGBP-1 überhaupt als Entzündungs- oder Sepsismarker

infrage kommt. Eine weitere Studie könnte zusätzlichen Aufschluss über die

diagnostische Aussagekraft anhand der prädiktiven Werte von hGBP-1

erreichen und damit anhand unverfälschter prädiktiver Werte eine

zuverlässige Aussage von hGBP-1 als Entzündungs- oder Sepsismarker im

klinischen Alltag ermöglichen.

Des Weiteren sind die Ergebnisse der Messung im Serum dieser Studie nicht

allumfassend für hGBP-1 zu sehen. Zur vollständigen Vorstellung bezüglich

des Nachweises und Verhaltens von hGBP-1 bezüglich unterschiedlicher

Entzündungszustände könnten ebenfalls weitere Untersuchungen Aufschluss

geben. So ist bekannt, dass Blutprodukte in unterschiedlichen Medien

unterschiedlich stark nachweisbar sind.

G. NORDIN et al. beschrieben 1996, dass CRP in niedrigen

Konzentrationsbereichen bis 20 mg/l in Blutserum geringere Werte anzeigt

als in EDTA-Plasma. Im Gegenzug dazu zeigt CRP im hohen

Konzentrationsbereich über 20 mg/l höhere Werte in Serum als in EDTA-

Plasma. [061] T. K. NILSSON et al. veröffentlichten im Jahr 2005 ihre

Ergebnisse hinsichtlich der unterschiedlichen CRP-Konzentrationen in

unterschiedlichen Medien nach acht bis elf eingefrorenen Jahren. Diese

Untersuchung ergab, dass der CRP-Wert im Serum höher ist als im Citrat-

Plasma, aber eine gute Übereinstimmung der CRP-Konzentration bezüglich

dem EDTA-Plasma- und Serum-CRP besteht. [060]

Diese Beispiele zeigen, wie empfindlich Blutprodukte auf die

Lagerungsdauer, Lagerungsart, aber vor allem auch auf das zu messende

Medium reagieren.

Demnach könnte eine Untersuchung von hGBP-1 in einem anderen Medium,

wie z.B. EDTA- oder Citrat-Plasma, neue Ergebnisse aufzeigen.

Auch könnte das in dieser Studie verwendete Detektionssystem von hGBP-1

im Blutserum zu ungenau gewesen sein. Der hier angewendete ELISA zum

75

Nachweis und zur Konzentrationsmessung des Proteins könnte Ursache für

die geringe Güte von hGBP-1 als Entzündungs- und Sepsismarker sein. So

erscheint ein Marker als ungeeignet, obwohl der Marker selbst vielleicht sehr

zuverlässig einen Zustand anzeigt, aber durch seine Detektion mangelhaft

ist. Durch eine mögliche Verbesserung der Empfindlichkeit des ELISAs

könnte die Detektionsrate von hGBP-1 im Serum erhöht werden. Diese

Erhöhung der Sensitivität des Detektionssystems könnte so auch zu einer

damit verbundenen Erhöhung der Sensitivität von hGBP-1 als Entzündungs-

und Sepsismarker führen. So ist es möglich, dass hGBP-1 trotz der

Ergebnisse dieser Studie ein exakter und zuverlässiger Entzündungs- und

Sepsismarker ist. Durch Verwendung eines verbesserten oder anderen

Detektionssystems könnte diese Möglichkeit anhand einer weiteren Studie

untersucht werden.

HGBP-1 zeigt auch in neuesten Studien viel Potential in der medizinischen

Forschung.

Neben der bereits angesprochenen denkbaren Möglichkeit bezüglich der

Chemoprävention von Prostatakrebs [065], untersuchten I. TIETZEL et al. im

Jahr 2009 die antimikrobiellen Effekte der GBP-Familie gegen Chlamydia

trachomatis. Dabei zeigten sie, dass hGBP-1 und hGBP-2 eine

wachstumshemmende Wirkung auf Chlamydia trachomatis haben. Wissend,

dass hGBP-1 und hGBP-2 durch IFN-γ induziert werden, zeigten hGBP-1

und hGBP-2 in Verbindung mit IFN-γ eine noch potentere Hemmung auf das

Chlamydienwachstum und verstärkten damit die IFN-γ-bedingte Bekämpfung

von Chlamydia trachomatis. [089] Auch Y. ITSUI et al. beschrieben 2009,

dass die Interferon-induzierte Expression von hGBP-1 einen antiviralen

Effekt auf die HCV-Replikation hat. Dabei bindet hGBP-1 das Hepatitis C –

NS5B Protein und hemmt die virale GTPase-Aktivität. [038]

HGBP-1 birgt somit noch viel Potential für klinische und experimentelle

Forschung.

Abschließend ist zu sagen, dass hGBP-1 ein vielversprechendes Protein zu

sein scheint, welches in vielen Bereichen wie Diagnostik, Therapie und

Prävention zu medizinischen Fortschritten führen kann.

76

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94

7 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

°C Grad Celsius

Abb. Abbildung

ACCP American College of Chest Physicians

ALI Acute Lung Injury

AP alkalische Phosphatase

ARDS Acute Respiratory Distress Syndrome

AUC Area Under The Curve

AWF Angiogene Wachstumsfaktoren

bFGF Basic Fibroblast Growth Factor

bzw. beziehungsweise

CARS Compensatory Anti-Inflammatory Response Syndrome

CRP C-reaktives Protein

CVP Central Venous Pressure

d.h. das heißt

EIA Enzyme Immunoassay

ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay

EMCV Enzephalomyokarditis Virus

EPC Endotheliale Vorläuferzellen

et al. et alii (Maskulinum), et aliae (Femininum) oder et alia

(Neutrum); lateinisch „und andere“

Fa. Firma

Flk-1 Fetal liver kinase 1

GDP Guanosin-Diphosphat

ggf. gegebenenfalls

GMP Guanosin-Monophosphat

GRADE Grades of Recommendation, Assessment, Development

griech. griechisch

GTP Guanosin-Triphosphat

hGBP-1 humanes Guanylat-Bindungsprotein-1

HLA Human Leukocyte Antigene

HMG-1 High-Mobility-Group 1

95

HUVEC Human Umbilical-Vein Endothelial Cells

ICAM-1 Intercellular Adhesion Molecules 1

IFN-γ Interferon-γ

Ig Immunglobulin

IL Interleukin

inf. infolge

ISRE IFN-Α-Stimulated Response Element

IZ Inflammatorische Zytokine

lat. lateinisch

Leukoz. Leukozyten

LfdNr Laufende Nummer

LPS Lipopolysaccharide

mAB monoklonaler Antikörper

MAP Mean Arterial Pressure

MARS Mixed Antagonistic Response Syndrome

MHC Haupthistokompatibilitätskomplex

MMP-1 Matrix Metalloproteinase-1

MODS Multiple Organ Dysfunction Syndrome

n. Chr. nach Christus

NF-кB Nuclear Factor кB

od. oder

PASW Predictive Analytics Software

PatNr Patienten Nummer

pAVK periphere Arterielle Verschlusskrankheit

PBS Phosphat Buffered Saline

PCT Procalcitonin

POCT Point-Of-Care-Testing

R² Bestimmtheitsmaß

rhAPC Rekombinantes humanes aktiviertes Protein C

RIA Radioimmunoassay

Rpm Revolutions per minute

SCCM Society of Critical Care Medicine

ScvO2 Central Venous Oxygen Saturation

SIRS Systemic Inflammatory Response Syndrome

96

SOAP Sepsis Occurrence in Acutely Ill Patients

SSC Surviving Sepsis Campain

TFPI Tissue Factor Pathway Inhibitor

TLR Toll-like Rezeptoren

TNF-α Tumor-Nekrose-Faktor-α

u.a. unter anderem / und andere

USA United States of America

v. Chr. vor Christus

VCAM-1 Vascular Cell Adhesion Molecule 1

VEGF Vascular Endothelium Growth Factor

VSV Vesicular Stomatitis Virus

vWF von-Willebrand-Faktor

z.B. zum Beispiel

Z.n. Zustand nach

97

8 ANHANG

Tabelle 24: Überblick der Messergebnisse des Gesamt-Patientenkollektivs

LfdNr PatNr Geschlecht Messzeitpunkt Leukozyten CRP PCT IL-6 hGBP-1

1 1 männlich Sepsiszeitpunkt 1 14,3 342 290,12 4962,07 0

2 2 männlich Sepsiszeitpunkt 1 19,8 106 3,67 9056,9 0

3 3 männlich Sepsiszeitpunkt 1 8,8 322 11,16 5022,41 0

4 4 weiblich Sepsiszeitpunkt 1 28,8 223 0,37 61,46 51,82

5 5 männlich Sepsiszeitpunkt 1 10,1 290 3,04 3703,45 0

32 32 weiblich Sepsiszeitpunkt 1 8,02 282 0,79 179,93 0

33 33 männlich Sepsiszeitpunkt 1 19,65 68 1,28 18,06 51,82

34 34 männlich Sepsiszeitpunkt 1 11,8 226 35,93 4289,66 0

35 35 männlich Sepsiszeitpunkt 1 79,71 314 46,48 4858,62 49,62

36 36 männlich Sepsiszeitpunkt 1 8,84 128 3,81 614,83 0

37 37 weiblich Sepsiszeitpunkt 1 17,81 216 1,06 70,07 0

69 32 weiblich Sepsiszeitpunkt 2 9,99 237 0,39 961,38 0

70 33 männlich Sepsiszeitpunkt 2 26,04 54 1,2 73,96 30,91

71 34 männlich Sepsiszeitpunkt 2 11,01 446 24,77 997,59 0

106 32 weiblich Sepsiszeitpunkt 3 13,06 275 0,88 344,14 0

107 33 männlich Sepsiszeitpunkt 3 24,29 47 1,36 640,69 0

6 6 männlich präop 11,32 1,9 0 0

7 7 weiblich präop 7,42 1,9 0 0

8 8 weiblich präop 9,15 59 18,96 0

9 9 weiblich präop 13,26 31 0,49 0

10 10 weiblich präop 7,97 1,9 0 0

11 11 männlich präop 11,8 57 3,26 0

12 12 männlich präop 10,25 1,9 89,93 0

13 13 weiblich präop 4,55 1,9 29,51 0

14 14 weiblich präop 7,05 11 6,46 0

15 15 männlich präop 6,82 8 1,6 0

16 16 männlich präop 8 5 1,04 0

17 17 weiblich präop 6,31 1,9 0 0

18 18 männlich präop 6,88 30 3,13 0

19 19 weiblich präop 8,58 1,9 1,18 0

20 20 weiblich präop 13,29 2 0 0

21 21 männlich präop 6,75 1,9 0 0

22 22 männlich präop 8,09 5 0 0

23 23 weiblich präop 8,1 3 0 0

24 24 weiblich präop 5,63 4 0 0

27 27 weiblich präop 5,36 1,9 0 0

28 28 männlich präop 5,59 1,9 0 0

29 29 weiblich präop 6,13 6 0 12,73

30 30 weiblich präop 6,49 1,9 0 0

31 31 männlich präop 7,99 1,9 1,15 0

26 26 männlich postop Zeitpunkt 1 9,12 80 254,48 0

43 6 männlich postop Zeitpunkt 1 19,61 141 34,65 0

44 7 weiblich postop Zeitpunkt 1 10,26 99 148,26 0

45 8 weiblich postop Zeitpunkt 1 13,88 133 292,71 0

46 9 weiblich postop Zeitpunkt 1 10,47 80 16,46 0

47 10 weiblich postop Zeitpunkt 1 19,24 22 36,46 0

48 11 männlich postop Zeitpunkt 1 11,03 113 118,82 0

49 12 männlich postop Zeitpunkt 1 10,81 75 96,7 0

50 13 weiblich postop Zeitpunkt 1 11 76 192,99 0

51 14 weiblich postop Zeitpunkt 1 13,01 90 75,9 0

52 15 männlich postop Zeitpunkt 1 12,2 141 323,45 0

53 16 männlich postop Zeitpunkt 1 6,72 74 85,07 0

54 17 weiblich postop Zeitpunkt 1 14,24 51 11,04 0

55 18 männlich postop Zeitpunkt 1 10,65 230 147,01 0

56 19 weiblich postop Zeitpunkt 1 5,26 50 32,85 0

57 20 weiblich postop Zeitpunkt 1 11,31 57 39,93 0

58 21 männlich postop Zeitpunkt 1 8,08 63 59,65 0

60 23 weiblich postop Zeitpunkt 1 13,95 135 413,1 0

98

LfdNr PatNr Geschlecht Messzeitpunkt Leukozyten CRP PCT IL-6 hGBP-1

62 25 männlich postop Zeitpunkt 1 8,41 61 24,51 0

64 27 weiblich postop Zeitpunkt 1 6,62 3 0 0

67 30 weiblich postop Zeitpunkt 1 7,89 39 69,51 0

68 31 männlich postop Zeitpunkt 1 8,72 152 149,51 0

96 22 männlich postop Zeitpunkt 1 16,36 111 105,76 0

65 28 männlich postop Zeitpunkt 2 10,68 250 59,38 0

63 26 männlich postop Zeitpunkt 3 7,88 120 115,35 0

80 6 männlich postop Zeitpunkt 3 11,21 79 4,24 0

82 8 weiblich postop Zeitpunkt 3 8,35 177 95,63 29,09

88 14 weiblich postop Zeitpunkt 3 9,68 81 24,51 0

89 15 männlich postop Zeitpunkt 3 6,11 240 27,15 0

91 17 weiblich postop Zeitpunkt 3 10,96 84 19,1 0

92 18 männlich postop Zeitpunkt 3 8,25 198 102,29 0

97 23 weiblich postop Zeitpunkt 3 9,41 212 111,46 0

98 24 weiblich postop Zeitpunkt 3 5,11 42 2,29 0

99 25 männlich postop Zeitpunkt 3 7,7 73 40,76 0

101 27 weiblich postop Zeitpunkt 3 4,17 2 0 0

103 29 weiblich postop Zeitpunkt 3 6,81 182 117,01 0

104 30 weiblich postop Zeitpunkt 3 6,29 60 8,96 0

133 22 männlich postop Zeitpunkt 3 9,08 192 41,74 0

119 8 weiblich postop Zeitpunkt 4 5,99 97 44,1 0

117 6 männlich postop Zeitpunkt 5 10,26 32 5,76 0

118 7 weiblich postop Zeitpunkt 5 11,97 117 88,13 0

121 10 weiblich postop Zeitpunkt 5 6,11 11 8,96 0

123 12 männlich postop Zeitpunkt 5 15,08 149 151,04 0

124 13 weiblich postop Zeitpunkt 5 3,91 48 4,65 0

126 15 männlich postop Zeitpunkt 5 6,69 80 23,96 0

127 16 männlich postop Zeitpunkt 5 8,11 41 3,96 0

129 18 männlich postop Zeitpunkt 5 8,82 163 53,26 0

130 19 weiblich postop Zeitpunkt 5 6,54 154 17,43 0

122 11 männlich postop Zeitpunkt 6 8,83 33 0,07 0

102 28 männlich postop Zeitpunkt 7 4,67 180 7,99 0