This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

2 6 4 F.-CH. CZYGAN UND W. EICHENBERGER

Die Fettsäuren der Sekundär-Carotinoid-Ester von Ankistrodesmus braunii (Naegeli) Collins (Chlorophyta, Chlorococcales)

Fatty Acids of Esters of Secondary Carotenoids from Ankistrodesmus braunii

(Naegeli) Collins (Chlorophyta, Chlorococcales)

FRANZ -CHRISTIAN C Z Y G A N

Institut für Pharmakognosie der Botanischen Anstalten der Universität Würzburg

W A L D E M A R EICHENBERGER

Institut für Organische Chemie der Universität Bern

(Z. Naturforsch. 26 b, 264—267 [1971] ; eingegangen am 10. November 1970)

Three fractions of carotenoid esters (I, II, and III) were isolated from nitrogen-deficient cells of the green alga Ankistrodesmus braunii. I and II are composed of diesters of astaxanthin with C16-, Ci8(2 = )-, and Ci8(3 = )-acids in different combinations. Ill consists of monoesters of 3-oxi-3',4,4'-trioxo-/?-arotene with Ci8(2 = )-» and Ci8(3 = )-acids. The pattern of fatty acids of the total lipids is quite different from that of the ester fractions I, II, and III (see table 1). Therefore it has been concluded from this selective esterification that specific enzymatic reactions occur even in old nitrogen-deficient algae.

Bei Stickstoffmangel synthetisieren viele Grün-algen neben Fetten1 Oxo-Derivate des /^-Carotins, sogenannte Sekundär-Carotinoide * (SC) 2 . Ein Teil dieser Polyene enthält zusätzlich Hydroxyl-Gruppen, die verestert sind. Die Säurekomponenten der Ester sind bisher nur bei Sphaeroplea3 und bei Proto-siphon 4 auf Grund chromatographischer Vergleiche mit bekannten Estern der Blütenblätter von Adonis annua5 bestimmt worden. Gaschromatographische Analysen der isolierten Fettsäuren fehlen. Ankistro-desmus braunii ist eine der Algen, deren SC-Bildung besonders eingehend untersucht worden i s t 2 ' 6 - 8 . An SC enthält diese Algenart neben wenig Cantha-xanthin besonders Astaxanthinester. Die Säureanteile dieser Ester werden in der vorliegenden Arbeit ana-lysiert. Außerdem interessieren uns in diesem Zu-sammenhang zwei weitere Fragen: Einmal soll unter-sucht werden, ob Unterschiede in der Fettsäuren-Zusammensetzung der Ester und der der Gesamt-lipide, die bis 6 5 % der Trockenmasse der N-Mangel-

Sonderdruckanforderungen an Doz. Dr . F . - C . CZYGAN, Botan. Anstalten d. Univ. Würzburg, Institut für Pharma-kognosie, D-8700 Wurzburg, Mittlerer Dallenbergweg 64.

* Abkürzung: SC: Sekundär-Carotinoide. 1 H. v. WITSCH, in: W. RUHLAND (Herausg.), Handb. Pflan-

zenphysiol. Vol. 7, 50. Springer-Verlag, Berlin-Göttingen-H e i d e l b e r g 1 9 5 7 . M . STEINER, i n : W . RUHLAND (Her-ausg.) , Handb. Pflanzenphysiol. Vol. 7, 209. Springer-Ver-lag, Berlin-Göttingen-Heidelberg 1957.

2 F.-C. CZYGAN, Arch. Mikrobiol. 61, 81 [1968]. 3 H. KLEINIG, Z. Naturforsch. 22 b, 977 [1967].

algen ausmachen können, bestehen. Zum anderen wollen wir das Problem einer Lösung näher bringen, ob unter N-Mangelbedingungen, also in einer Ent-wicklungsphase, bei der das Wachstum bereits einge-stellt ist, noch gezielte Reaktionen, in unserem Fall spezifische Veresterungen ablaufen können.

Material und Methoden

Als Ausgangsmaterial dienten N-Mangelkulturen von Ankistrodesmus braunii (Naegeli) Collins Stamm 202-7c der Göttinger Pringsheim-Algensammlung 9. Die Algen wurden nach 1. c . 1 0 in mit 41 N-Mangelnähr-lösung ( 8 -10~ 4 M KN0 3 ) gefüllten 6-Liter-Rundkolben kultiviert. Nach 4 — 6 Wochen ernteten wir die orange-roten Zellen. Die Ausbeute betrug 0,5 — 0,8 mg Trocken-masse je ml Nährlösung. Die Trockenmasse enthielt ca. 5 5 - 6 5 % Lipide und ca. 0 , 1 5 - 0 , 2 1 % SC. Die Gesamt-lipide wurden nach 1. c .1 1 und die Pigmente nach 1. c. 2

extrahiert. Die Auftrennung der Farbstoffe erfolgte säulenchromatographisch 12. Uns interessierten in die-sem Zusammenhang nur die drei Hauptfraktionen (I, II

4 H . KLEINIG U. F . - C . CZYGAN, Z . Naturforsch. 2 4 b , 9 2 7 [1969].

5 K . EGGER U. H . KLEINIG, Phytochem. 6 , 4 3 7 [ 1 9 6 7 ] ; K . EGGER, Phytochem. 4, 609 [1965].

6 G. DERSCH, Flora [Jena] 149 ,566 [I960]. 7 F.-C. CZYGAN, Arch. Mikrobiol. 62, 209 [1968]. 8 F . MAYER U. F . - C . CZYGAN, Planta 8 6 , 1 7 5 [ 1 9 6 9 ] . 9 W. KOCH, Arch. Mikrobiol. 47, 402 [1964].

1 0 E . KESSLER U. F . - C . CZYGAN, Arch. M i k r o b i o l . 7 0 , 2 1 1 [1970].

11 H. MILNER, J. biol. Chemistry 176, 813 [1948]. 12 F..C. CZYGAN, Flora [Jena] Abt. A 159, 339 [1968].

FETTSÄUREN DER SEKUNDÄR-CAROTINOID-ESTER 2 6 5

und III), die SC-Ester enthielten. Daneben ließen sich gelegentlich noch weitere Astaxanthinester in Spuren nachweisen (z. B. bei einem Rf-Wert von ca. 0,3 in Abb. 1). I, II und II wurden im einzelnen durch folgende dünnschichtchromatographischen Systeme cha-rakterisiert (vgl. 1. c. 4 und die Abbn. 1 — 3) . 1. Adsorp-tionschromatographie an Kieselgel G mit Benzin (Sdp. 1 0 0 - 1 4 0 °C) + Isopropanol + Chloroform (90 + 10 + 70 Vol.-Tle.). 2. Verteilungschromatographie an Zellulose (mit 10% Paraffin in Petroläther imprägniert) mit Aceton + Methanol + Wasser (30 + 10 + 3 Vol.-Tle.). Gelegentlich wurde zur besseren Trennung mit dem gleichen Lauf mittel zweimal entwickelt. 3. Verteilungs-chromatographie an Zellulose (mit 10% Olivenöl in Pe-troläther imprägniert) mit Methanol + Aceton + Was-ser ( 3 0 + 1 0 + 2 Vol.-Tle.).

Zur Gewinnung und Reinigung der Fettsäuren wur-den spektralphotometrisch bestimmte2 Mengen der Astaxanthinester-Fraktionen bzw. die Gesamtlipide mit methanolischer KOH (Endkonzentration: 5%) 2 bis 4 Stdn. unter N2 im Dunkeln verseift. Die Fettsäuren trennten wir vom Unverseifbaren und von den Pigmen-ten nach 1. c.1 3 .

Die Fettsäuren wurden in trockenem Diäthyläther mit Diazomethan verestert und die Methylester auf Dünnschichtplatten (Kieselgel G, Petroläther-Diäthyl-äther 100 + 5 Vol.-Tle.) vorgereinigt. Anschließend ana-lysierten wir die Ester auf einem PYE-Argon-Chro-matographen auf Kolonnen von 5% Polyäthylenglycol-adipat auf Chromosorb W (Länge 125 cm; Durchmes-ser 4 mm) bei 170 °C und einem Säulenvordruck von 0,3 atm (Argon). Die einzelnen Komponenten ließen sich auf Grund der Retentionszeiten durch Vergleich mit entsprechenden Standard-Gemischen identifizieren. Außerdem wurden die Proben bei Raumtemperatur hydriert und auf die Anteile der einzelnen Homologen untersucht. Die quantitativen Bestimmungen erfolgten durch Triangulation der Flächen unter Berücksichtigung individueller Korrekturfaktoren.

Ergebnisse

1. Fraktion I enthielt Astaxanthin (8 ,2 mg; Mol.-Gew. 597) und Fettsäuren (als Methylester 7,2 mg; Mol.-Gew. ca. 280) im molaren Verhältnis von 1 : 1 ,88. Dies deutete auf Diester hin. Die Fettsäu-ren bestanden auf Grund gaschromatographischer Daten (Tab. 1) zu ca. zwei Dritteln aus Palmitin-säure und zu ca. einem Drittel aus zwei- und drei-fach ungesättigten C18-Säuren, die mit größter Wahr-scheinlichkeit mit Linol- bzw. Linolensäure identisch waren. Fraktion I verhielt sich im System 1 (Abb. 1) einheitlich wie authentisches Astaxanthindipalmitat (Synthese nach 1. c . 1 4 ) . Im System 2 (Abb. 2) tra-

1 3 H . W A G N E R U. P . POHL, B i o c h e m . Z . 3 4 1 , 4 7 6 [ 1 9 6 5 ] .

Fett-säure

Zahl der Doppel-

bindungen

I I I I I I Gesamt-lipide

9 1,4 0,6 1,8 0,0

Cl6 0 1

62,0 0,0

33,7 0,0

1,8 0,0

25,4 3,1

? 2,0 0,0 1,3 1,7 Cl8 ?}

2 3

1,0 22,5 11,2

1,8

50,7 13,0

1,9

55,7 37,5

Spur 39,6 16.3 10.4

? 0,0 0,0 0,0 3,7 C19 bis 0,0 0,0 0,0 0,0 C 2 4

Tab. 1. Fettsäurenzusammensetzung der Sekundär-Caro-tinoid-Ester und der Gesamtlipide von N-Mangelzellen der Grünalge Ankistrodesmus braunii. Angaben in Gewichts-% der Gesamtfettsäuren; die Werte stellen Mittelwerte aus je drei C h r o m a t o g r a m m e n dar. I — I I I : F r a k t i o n e n I — I I I (vgl . den

Text).

1.0-

Rf

0.5

0

Abb. 1. Dünnschichtchromatographische Auftrennung von Carotinoidestern nach System 1 (Adsorptionschromatogra-phie). V : Vergleichssubstanzen Canthaxanthin (Canth.) und Echinenon (Ech.) ; A.br.: veresterte Sekundär-Carotinoide von Ankistrodesmus braunii nach säulenchromatographischer Ab-trennung von den Gesamtpigmenten; I und II: Astaxanthin-diester-Fraktionen I und II (vgl. den Text), häufig in System 1 nicht genau voneinander trennbar; III: Monoester-Fraktion III (vgl. den Text) des 3-Oxi-3'.4.4'-trioxo-/?-carotins; Astax.:

authentisches Astaxanthindipalmitat.

ten dagegen neben einem Hauptfleck, der den Rf-Wert von Astaxanthindipalmitat (30 — CH2-Einhei-ten) besaß, zwei Nebenkomponenten auf. Nach ihrer Lage im Ghromatogramm mußten sie 32 bzw. 34 C,H-Einheiten aufweisen. Für diese Bestandteile von Fraktion I kamen folgende Fettsäurekombinationen

1 4 R . K U H N U. N . A . SÖRENSEN, Ber . dtsch. chem. Ges . 7 1 , 1888 [1938].

1 C Z ZD J TT

I—I CD Ech. Ech.

i—I C=3 Canth. Canth.

C >jzr

/ A.br. Astax. V

266 F.-CH. CZYGAN UND W. EICHENBERGER

V (1) (2) (3) (4) (5) V

Abb. 2. Dünnschichtchromatographische Auftrennung von Carotinoidestern nach System 2 (Verteilungschromatogra-phie) . V : Vergleichssubstanzen Canthaxanthin (Canth.) und Echinenon (Ech.) ; (1) : Ester aus Blütenblättern von Adonis annua (vgl. 1. c. 5) ; a: Monoester des 3-Oxi-3'.4.4'-trioxo-/?-carotins; b —k: Diester des 3.3'-Dioxi-4.4'-dioxo-/?-carotins (Astaxanthin), Säurekomponenten ( = Zahl der — CH2 —) ; b: 16-CH2— ; c: 1 8 - C H , - ; d: 2 0 - C H 2 - ; e: 22 -CH 2 - ; f : 2 4 - C H , - ; g: 2 6 - C H , - ; h: 2 8 - C H 2 - ; i: 3 0 - C H 2 - ; k: 32-CH,—; (2) : authentisches Astaxanthindipalmitat (30-CH2 —) ; (3) : Athaxanthindiester aus N-Mangelzellen von Ankistrodesmus braunii (Franktion I) ; (4) : Astaxanthin-diester aus N-Mangelzellen von Ankistrodesmus braunii (Fraktion II) ; (5) : Monoester des 3-Oxi-3'.4.4'-trioxo-/?-caro-tins aus N-Mangelzellen von Ankistrodesmus braunii (Frak-

tion III).

in Frage:

Cl6 + Ci8(2 = ) , Cie + Ci8(3 =) , Ci8(2 =) + Ci8f2 =) , Cl8(3 = ) + Ci8(3 = ) und Ci8(2 = ) + Ci8(3 = ) •

2. Fraktion II verhielt sich im System 1 (Abb. 1) einheitlich, wurde jedoch hier und an der Säule et-was stärker adsorbiert als Fraktion I. Das molare Verhältnis von Astaxanthin (3 ,5 mg) und Fettsäu-ren (als Methylester 3 ,0 mg) betrug 1 : 1,83 und sprach ebenfalls für Diester. Die Auftrennung im System 2 (Abb. 2) ergab dieselben Komponenten, die sei tl in Fraktion I gefunden wurden, mit dem Unterschied, daß nur wenig Astaxanthindipalmitat auftrat. Dafür waren die Flecken, die Diestern mit insgesamt 32 bzw. 3 4 C,H-Einheiten zugeschrieben werden mußten, sehr intensiv. Die Tatsache, daß die Fettsäuren zu zwei Dritteln aus Ci8(2 = )- und Cis(3 = )-Säuren bestanden (Tab. 1 ) , stimmte damit überein. Die Fraktion enthielt somit zur Hauptsache Asta-xanthindiester mit den für Fraktion I angegebenen Fettsäurekombinationen.

3. Fraktion III wurde im System 1 noch stärker adsorbiert als die Fraktionen I und II und der authentische Astaxanthindiester (Abb. 1 ) . Das mo-

lare Verhältnis von Alkoholkomponente (5,5 mg) und Fettsäuren (als Methylester 3,7 mg) betrug 1 : 1,43 und war für einen Diester zu niedrig. Für einen Astaxanthinmonoester (mit einer freien OH-Gruppe) wiederum war der Rf-Wert zu hoch (Abb. 1 ) . Ferner gelang es nicht, durch weitere Ver-esterung von Fraktion III einen entsprechenden Di-ester zu gewinnen. Die Fraktion verhielt sich in Übereinstimmung mit den Angaben von EGGER und KLEINIG 5 und KLEINIG und CZYGAN 4 im Chromato-gramm viel eher wie verestertes 3-Hydroxy-3 ' .4 .4-trioxo-^-carotin (Abb. 2 ) . Auf Grund der Angaben in Tab. 1 lag dieses Carotinoid als Ester der Ci8(2=)- u n ( l d e r Cis(3 = )-Säure vor. Daß bei der Ver-seifung von Fraktion III der Carotinoidalkohol quantitativ in Astacin (Tetraoxo-Verbindung) über-geführt wurde (Abb. 3 ) , stellte keinen Widerspruch

<—1 a

CZD b

O c

ß ß ß 0

c=> crr> c=> c=> d C=> c C=3 b

a

v i u m v i n m System 1 System 3

Abb. 3. Dünnschichtchromatographische Auftrennung (nach den Systemen 1 und 3) der verseiften Sekundär-Carotinoid-Ester aus N-Mangelzellen von Ankistrodesmus braunii. V : Vergleichssubstanzen a: 4-Oxo-/?-carotin (Echinenon) ; b: 4.4'-Dioxo-/?-carotin (Canthaxanthin); c: 3.4.4'-Trixoxo-/?-carotin; d: 3.3'.4.4'-Tetraoxo-/?-carotin (Astacin); I —III: verseifte Esterfraktionen I —III (vgl. den Text) = Astacin.

dar, da die gleiche Umwandlung, die an Astaxan-thin (Dioxi-dioxo-Verbindung) und dessen Estern beobachtet wurde 15, auch für 3-Hydroxy-3'.4.4'-tri-oxo-/?-carotin und seine Ester erwartet werden mußte.

4. Die Zusammensetzung der Fettsäuren in den Gesamtlipiden von etwa 6 Wochen alten orangeroten N-Mangelalgen zeigt Tab. 1. Diese Fettsäuren stimm-ten qualitativ gut mit denen normaler grüner, nicht unter N-Mangel kultivierter Zellen von Ankistrodes-mus braunii überein16. Auffallend war auch hier,

15 R. KUHN u. N. A. SÖRENSEN, Ber. dtsch. chem. Ges. 71, 1879 [1938].

18 V. R. WILLIAMS and R. MCMILLAN, Science [Washington] 133, 459 [1961].

FETTSÄUREN DER SEKUNDÄR-CAROTINOID-ESTER 267

wie schon andere Autoren nachwiesen (Zusammen-fassung bei 1. c . 1 7 ) , das Fehlen von C19-, C2 0- und C22-Fettsäuren, charakteristischen Komponenten der Fettsäuregarnituren verschiedener Salzwasseralgen. Andererseits unterschieden sich die Fettsäuren der Gesamtlipide der Mangelzellen qualitativ und vor allem quantitativ stark von den entsprechenden Be-standteilen der SC-Ester.

Diskussion

Unsere Untersuchungen machen deutlich, daß von den in der Zelle vorhandenen Fettsäuren zur Ver-esterung der SC nur bestimmte Komponenten be-nutzt werden. Besonders das Fehlen von Garotinoid-estern der C18-Monoensäure, die sowohl in grünen, als auch in N-Mangelzellen eine der Hauptfettsäuren ist ( I . e . 1 6 ; Tab. 1 ; zur Zusammensetzung der Fett-säuregarnituren in Algen vgl. I . e . 1 7 ) , hebt diese Spezifität in der Auswahl der Säuren hervor.

Die Veresterung von Carotinoiden in N-Mangel-algen erinnert an die von EICHENBERGER und GROB 18 in Herbstblättern von Acer platanoides be-obachtete Veresterung von typischen Sommercaro-tinoiden. Dieser Vorgang, der in grünen Blättern nicht nachgewiesen werden konnte, wird daher von EICHENBERGER und GROB als Ausdruck des Erwer-bes neuer synthetischer Fähigkeiten gewertet. Dem-gegenüber zeigen EGGER und SCHWENKER 1 9 , daß die Hydroxy-Carotinoide des Herbstlaubes von Aesculus parviflora mit den vorhandenen Fettsäuren alle theoretisch möglichen Kombinationen eingehen. EGGER und SCHWENKER sprechen folgerichtig von einem „Verlust der Steuerungsmöglichkeiten des Stoffwechsels". Zu ähnlichen Ergebnissen kommen

17 P. POHL U. H. WAGNER, Phytochem. 7, 1565 [1968]. 18 W. EICHENBERGER U. E. C. GROB, Helv. chim. Acta 45,

1556 [1962] ; 46, 2411 [1963] ; 48, 1194 [1965]. 19 K. EGGER u. U. SCHWENKER, Z. Pflanzenphysiol. 54, 407

[1966]. 20 H. KLEINIG U. H. NITSCHE, Phytochem. 7, 1171 [1968]. 21 K. EGGER, Ber. dtsch. bot. Ges. 81, 153 [1968].

auch KLEINIG und NITSCHE 2 0 bei der Bearbeitung der Carotinoidmuster gelber Blütenblätter (vgl. auch 1. c. 5) und EGGER 21 bei der Untersuchung der Farbwachse von Capsicum (vgl. auch 1. c. 3 ' 4 ) .

Worauf bei der Veresterung der SC in Ankistro-desmus die Bevorzugung bestimmter Komponenten der Gesamtfettsäurengarnitur beruht, ist noch völlig unklar. An zwei prinzipielle Unterschiede zwischen den Farbstoffen der Blütenblätter, der Früchte und des Herbstlaubes und den SC der Mangelalgen ist zu denken. Erstens sind die SC der höheren Pflan-zen intraplastidär, die Oxopolyene von Ankistrodes-mus jedoch extraplastidär8. Zum anderen können auch mehr als 100 Tage unter N-Mangelbedingun-gen kultivierte Algen nach Zusatz von assimilierba-rem Stickstoff innerhalb weniger Tage ergrünen 6 ' 8 . Bei den Organen der höheren Pflanzen ist das nicht oder doch nur in Ausnahmefällen möglich (z. B. Um-wandlung von Chromo- in Chloroplasten in Oran-gen 2 2 ; Wiederergrünen vergilbter alternder Blätter und Sprosse 2 3 ' 2 4 ) .

Der Stoffwechsel der alten N-Mangeialgen muß also „intakter" als der alternder Organe höherer Pflanzen sein. Vielleicht ist dies eine Deutungsmög-lichkeit für die hier mitgeteilte Beobachtung, daß auch unter Voraussetzungen, bei denen der Stoff-wechsel auf ein Minimum herabgesetzt ist, spezifische Reaktionen katalysiert werden und nicht ungerichtet zwischen den einzelnen Zellbestandteilen ablaufen.

Der Deutschen Forschungsgemeinschaft und dem Schweizerischen Nationalfonds zur Förderung der wis-senschaftlichen Forschung danken wir für die Unter-stützung dieser Arbeit. Der Fa. Hoffmann-La Roche & Co. AG (Basel), besonders Herrn Dr. H. THOMMEN, sind wir für authentische Carotinoide zu Dank verpflich-tet.

22 W. W. THOMSON, L. N. LEWIS, and C. W. COGGINS, Cyto-logia32,117 [1967].

23 N. LJUBE§IC, Protoplasma 66, 369 [1968]. 24 E. C. GROB and J. RUFENER, in: H. METZNER (Herausg.),

Progress in Photosynthesis Research I, 55. Verlag C. Lich-tenstern, München 1969.