Die Mechanik des Zytoskeletts

Maren Funk & Shoh Asano

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Gliederung

Einleitung

Struktureller Aufbau

Elastizität des Zytoskeletts

Motilität (Zellbewegung)

Mechanosensing

Anwendung: Tumordiagnostik

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Einleitung

Was ist das Zytoskelett?

Protein-Netzwerk im Zellplasma

Keine statische Struktur

Zweck:

- Transporte innerhalb der Zelle

- Bewegung der Zelle

- Stabilität der Zelle

- Signalübertragung zwischen Zellen

- Wichtig bei Zellteilung

Beinhaltet drei Komponenten/Proteine:

- Mikrotubuli (im Bild grün)

- Aktin-Filamente (im Bild rot)

- Intermediär-Filamente

In allen eukaryotischen Zellen vorhanden; Kann in prokaryotischen vorkommen

Floureszenzmikroskopie eines Zytoskelettes einer Drüsenzelle

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Aufbau des Zytoskelettes

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Proteinnetzwerk der Zelle schematisch dargestellt

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Aktin-Filamente

Mit Myosin dekorierte Aktin Filamente: Die Asymmetrie der Helizes geben uns die Information, wo welche Enden liegen (Pfeil zeigt in „pointed end“ = Minus Ende)

Aktin Filament-Netzwerk

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Aktin-Filamente

Hauptprotein: Aktin; zwei aus Aktinmonomeren polymerisierte Ketten bilden ein Aktin-Filament (d~7nm)

Die Zelle wird unterhalb der Plasmamembran mit Aktin-Filamenten vernetzt

Auch hier polare Enden mit schnell wachsenden Plus-Ende bzw. langsam wachsenden Minus-Ende

Aktin-Filamente sind rund 30 mal länger als MT

Funktion:

- Stabilität durch das Vernetzen mit Verbindungsproteinen

- Stofftransport (kurzstreckig) von Vesikeln

- Fixierung von Transmembranproteinen (Kanäle, Rezeptoren, etc)

- Zellmotilität durch gezielte Polymerisierung sowie Myosin-Aktin WW (Muskelfaser)

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Intermediär-Filamente

Intermediär-Filament-Netzwerk Intermediär-F. (blau eingefärbt) wechselwirken mit Mikrotubuli (rot) durch u.a. Plektin Proteinen (grün)

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Intermediär-Filamente

Durchmesser: 8-12nm, somit zwischen MT und Aktin-Fil., Aufgebaut aus vers. Faserproteinen

Aufbau:

- Zwei Monomere verknüpfen sich parallel zu einem Dimer

- Zwei Dimere verknüpfen antiparallel zu einem Tetramer

- Mehrere Tetramere verbinden sich parallel zu einer Protofibrille, diese können Bündel bilden (Tonofilamente)

Durchspannt die komplette Zelle

Funktion:

- Auch hier Stabilität der Zelle

- Fixierung der Zellorganellen

- Anders als bei MT und AF nicht beteiligt an Zellmotilität

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Mikrotubuli

Mikrotubuli Netzwerk

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Mikrotubuli

Röhrenförmige Proteine bestehend aus Alpha- und Beta- Tubulindimere (in Helizes polymerisiert)

Durchmesser: 15-25 nm

Besitzen zwei „unterschiedliche“ Enden (polar):

- Am Plus (alpha) Ende findet die Polymerisation schneller statt (im Ggs. Zum Minus (beta) Ende)

- Transport (von Vesikeln, Mitochondrien, etc.) findet gerichtet statt (Motorprotein-abhängig)

- Bilden sich an dem MTOC und kann dort auch abgelöst werden

Funktion:

- Stabilität der Zelle

- Stofftransport (Trennung der Chromosomen bei Zellteilung)

Bildung der MT

Materialtransport an einem MT

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Gliederung

Einleitung

Struktureller Aufbau

Elastizität des Zytoskeletts

Motilität (Zellbewegung)

Mechanosensing

Anwendung: Tumordiagnostik

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Rheologie des Zytoskelettes

Experimentelle Beobachtungen bei der Viskositätsmessung von F-Aktin

TEM-Bild von Aktinnetzwerk

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Rheologie des Zytoskelettes

Mechanische Eigenschaften beschrieben durch Drücke und daraus entstehenden Spannungen

Viskoelastisches Modul als Materialeigenschaft

Messmethoden:

- Ein oszillierendes Magnetfeld wird angelegt; Aus der Verschiebung magnetischer Partikel im System lässt sich eine frequenzabhängige Suszeptibilität schließen.

Diese wird dann umgerechnet in das lokale Ve.Modul.

- Gleiches Prinzip: oszillatorische Spannungen und die entstehenden Drücke messen

- Durch das Spektrum der thermischen Bewegung (wird näher beleuchtet)

Viskoelastisches Modul beschrieben durch komplexe Zahl G*(ω), wobei gilt:

- G*(ω)= G‘+ i G‘‘ mit G‘ als „storage“ (Elastizitäts-) und G‘‘ als „loss“ (Verlust-) Modul

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Schwierigkeiten einer einheitlichen Elastizitätstheorie

Drei verschiedene Aktin-Filament Strukturen und ihre Struktur

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Theoretische Modelle der Polymerphysik

Gummiband-Theorie nicht mehr anwendbar

Benötigen Modelle für semiflexible Polymere (Filamente)

Auftretende Schwierigkeiten:

- anisotropes Ansprechverhalten auf angewandte Drücke

- Wege der Kraftübertragung:

Viskose Kupplung zwischen Filamenten und Lösung

Räumliche Wechselwirkungen zwischen Filamenten (z.B. Kollisionen)

Modell anhand eines Einzelfilamentes, da WW zwischen Filamenten vernachlässigbar ist

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Schlauchmodell

Jedes Polymer ist von vielen anderen umgeben, somit Einschränkung der Bewegungsfreiheit

Ebenfalls Einschränkungen der Wellenbewegung von größeren Längenskalen

Theoretisch/Experimentell wurde ein Modell erschaffen, in der Kontur und Dicke des Schlauches durch Krümmungsenergie (eine gerader, dünner Schlauch) und Entropie (dicker, kurviger Schlauch) bestimmt wird

Charakterische Größe Le, unter der man den Schlauch als gerade ansehen kann

Nachteil: keine Behandlung von Crosslink Netzwerk möglich

d ist der SchlauchdurchmesserLe die Verfilzungslängeξ die Maschengröße

5

75

1

0 cTlkFG pB

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Messmethode: „Two-Point Microrheology“ (2000)

Zweck: Bestimmung des komplexen Schermoduls G*(ω)

(Fluoreszierende) Tracer Partikel (~1 µm) werden in das Medium eingeführt

Mit Videomikroskopie/Interferometrie wird die Brownsche Bewegung aufgenommen

Bei ve. Stoffen diffundiert der Tracer nicht heraus, weiterhin hängt die Bewegung von der Elastizität ab

Vorteile:

- man braucht nur sehr kleine Testvolumina

- Inhomogenitäten sind erkennbar

- Unabhängig von Tracer Größe und Form

- Günstiger als ein mechanisches Rheometer

Diffusion von Partikeln in Wasser

Brownsche Bewegung bei Wasser (links) und DNA (rechts)

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Die Physik hinter der Messung

Energiebilanz eines Tracerpartikels:

- Thermodynamik: pro Freiheitsgrad ½ kB T an thermischer Energie

- “Elastische” Energie (vgl. Federenergie): K <x²>

Somit gilt (bei langen dt): ½ kB T = K <x²> dt

- “Federkonstante” K nährungsweise proportional zum Schermodul

Messung/Berechnung von <x²> erweist sich als schwierig, da zwischen dt und <x²> meist kein linearer Zusammenhang besteht

“Two-Point”: Man misst die Korrelationen zwischen zwei Partikelbewegungen und erkennt:

- ~ 1/x, wobei x: Abstand der zwei Partikel

- ~ zum Schermodul des Materials

Messung der brownsche, als auch korrelierte Bewegung, wobei erstere bei der Mittelbildung wegfällt

Der Abfall beträgt stets ~ 1/x, somit kann man auf Inhomogenitäten schließen

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Schematisches Diagramm

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Elastizität des Cytoskeletts

Elastizität ist grundlegend abhängig von der

Struktur im Zytoskelett:

„Grundgerüst“: Messung des Schermoduls anhand der Messung in einer Aktin-Lösung

Verfeinerung des Experimentes mithilfe von Crosslinkern eines Types

→ Trotz der Verfeinerung ist man derzeit immernoch nicht in der Lage, ein gültiges Modell für das Protein Netzwerk aufzustellen

→ Bei starken Vereinfachungen (Crosslinker haften fest und fallen nicht ab), lassen sich Modelle (z.B. Gummi-Elastizität) darauf anwenden

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Elastizität des Zytoskeletts

Motilität (Zellbewegung)

Mechanosensing

Anwendung: Tumordiagnostik

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Wofür Zellbewegung / Zellmigration

+ Reparation von Gewebe (z.B. Nervenregeneration)

- chronische Entzündungen

- Tumor und Metastasenbildung

Evt. Gewebe züchten

Evt. Zelltransplantationen

+ Immunantwort

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Zellmotilität (Zellbeweglichkeit)

große Unterschiede in der Elastizität in der Zelle

Zellmotilität funktioniert unabhängig vom Zellkern und den meisten Zellorganellen

Komplexes Zusammenspiel vieler Bestandteile

Lokale Aktivierung verschiedener Crosslinker ermöglicht eine dynamische Erzeugung lokalisierter Meso-Strukturen

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Vorgang der Zellmigration

Externes chemotactisches Signal

Signal wird ins Zellinnere geleitet

Lokale Aktivierung von Crosslinkern

Und polymerisation von Aktin (thermisch getrieben)

Fortsatzbildung

Ausbildung eines Bogens

Anheften an das Substrat (spezielle Komplexe sammeln sich an)

Der Zellkörper wird durch Actomyosin-Filamente nach vorne gezogen

Der letzte „Fuß“ wird losgelassen und nach vorne gezogen

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Richtungsfindung

Der Fortsatz selber ist hart

Die Vorschubkräfte sind aber klein

Ab 300 Pa Widerstand zieht sich der Fortsatz ein Stück zurück und ändert dann zufällig seine Wachstumsrichtung

Durch Druck auf die Zellmembran werden Ca2+ Kanäle geöffnet.

Ca2+ aktiviert Gelsolin, das die Depolimerisation von Aktin bewirkt

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Struktureller Aufbau

Elastizität des Zytoskeletts

Motilität (Zellbewegung)

Mechanosensing

Anwendung: Tumordiagnostik

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Mechanosensing

Eine Antwort auf mechanische Reize erfordert generell drei (nicht notwendigerweise verschiedene) Komponenten:

- Eine Komponente, die direkt durch Krafteinwirkung verändert wird (Sensor)

- Eine Komponente, die die Information zum Erfolgsorgan bringt

- Ein Erfolgsorgan

Das Zytoskelett kann Aufgaben in allen drei Komponenten übernehmen.

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Zytoskelett als Teil eines mechanischen Sensors

An gedehntes und nicht gedehntes Zytoskelett können unterschiedliche Proteine binden (Erfolgsorgan)

Druck auf die Zelle kann sich auf die Transkription von Zytoskelett-proteinen auswirken.

Das Zytoskelett ist dafür geeignet, Kraft in weit entfernte Regionen der Zelle weiter zu geben. Z.B. entstehen chemische Stoffe an anderen Stellen als die Kraft ausgeübt wird.

Transmembranproteine enthüllen bei Krafteinwirkung Schlüsselstellen, an die Zytoskelett-Linker anbinden können. Diese Konformationsänderung und eine höhere Konzentration von den Komplexen für die Adhäsion helfen Zelle größere Kräfte auszuüben. Z.B. bei steifem Untergrund

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Prüfen des Zelluntergrunds

Viele Zellen wachsen nur auf einem Untergrund gut, der die gleiche Steifigkeit hat, wie sie selbst.

Z.B. zeigt Zellwachstum auf weichem Agar-Gel Krebszellen an.

Zellen überprüfen ihre Umgebung, indem sie daran ziehen (Kontraktion durch Myosin) und auf gute Adhäsion (Anhaften an den Untergrund).

Wenn man das Myosin blockiert, erkennen die Zellen harten Untergrund nicht mehr.

Sie passen sich in gewissem Maß an den Untergrund an.

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Prüfen des Zelluntergrunds

Zellen auf weichem Untergrund müssen weniger Kraft zum Zusammenziehen und lassen sich deshalb leichter wieder ablösen.

Auch die Adhäsion ist bei weichem Grund dynamischer.

Zellen zeigen auf hartem Grund mehr, zu großen Streben organisiertes, F-aktin.

Sehr bewegliche Zellen, wie die Fresszellen im Blut haben keinen bevorzugten Untergrund. Sie wachsen in Flüssigkeiten genau so gut wie in Glasschalen.

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Gliederung

Einleitung

Struktureller Aufbau

Elastizität des Zytoskeletts

Motilität (Zellbewegung)

Mechanosensing

Anwendung: Tumordiagnostik

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Eigenschaften von Tumorzellen

Tumorzellen sind dedifferenziert (stammzellenähnlich) und viel weicher als ausdifferenzierte Zellen.

Je weicher sie sind, desto eher können sie wandern und Metastasen bilden.

Die Elastizität ist ein Merkmal, das mit am stärksten zwischen Tumor- und normalen Zellen variiert.

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Prinzip des Testgeräts

Somit nimmt der Lichtimpuls in der Zelle zu und auf Grund der Impulserhaltung erhält die erste Oberfläche der Zelle einen Impuls/Kraft nach hinten (=außen), die zweite nach vorne (=außen). Es sollte natürlich weniger reflektiert und absorbiert werden als hindurch geht.

c

hfp

Mit optischen Fallen kann man durch den Strahlungsdruck des Lichtes Partikel fangen und Kräfte im pN Bereich auf sie ausüben.

Zwei entgegengerichtete NICHT fokussierte Laserstrahlen

Angenommen: Brechungsindex der Zelle nz> nu Umgebung

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Prinzip des Testgeräts

Damit keine Gesamtkraft auf die Zelle wirkt haben wir zwei entgegengerichtete gleiche Laser

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Möglichkeiten dieses Tests

Diagnose und Einstufung des Tumors anhand von nur 50 Zellen möglich

Vorhersage möglich, ob der Tumor Metastasen bildet / gebildet hat

Z.B. präventive Brustentfernungen vermeidbar

3600 Zellen / min

Auch als Vorsorgeuntersuchung routinemäßig z.B. beim Zahnarzt gegen Mundkrebs einsetzbar

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Quellen

Alberts et al. Molecular Biology of the Cell 4th ed.

Prof. Rief, Vorlesungsskript: „Einführung in die Biophysik 2“

Lodish, Molecular Cell Biology 5th ed.

Prof. Bausch, „A Bottom-up approach to cell mechanics“, Nature Vol. 2/06

J. Crocker, „Two-Point Microrheology of Inhomogenous Soft Materials“, Physical Review Letters Vol. 85/00

Paul A. Janmey, David A. Weitz, „Dealing with mechanics: mechanisms af force transduction in cells“ Review TRENDS in Biochemical Sciences Vol. 29 No.7 July 2004

http://www.uni-leipzig.de/%7Epwm/kas/cytoskeleton/Cytoskeleton.html

http://academic.brooklyn.cuny.edu/biology/bio4fv/page/cytoskeleton.html

http://kumarlab.berkeley.edu/biophysics.html

http://www.biochemweb.org/cytoskeleton.shtml

http://www.zum.de/Faecher/Materialien/hupfeld/Cytologie/cysk-fkt/cysk01.html

http://www.people.fas.harvard.edu/~jiayuliu/actinlength/actinlength.htm

http://www.deas.harvard.edu/projects/weitzlab/papers/PRL01250.pdf

http://www.uni-leipzig.de/~pwm/kas/motility/migration.html

http://www.uni-leipzig.de/~pwm/kas/mechsensing.html

http://www.innovations-report.com/html...ts/physics_astronomy/report-42905.html

http://biophysj.org/cgi/full/81/2/767

http://biop.dk/Research/Tweezers.htm