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Die prognostische Bedeutung von Makrophagen des M1 und M2

Phänotyps sowie von zytotoxischen und regulatorischen T-

Lymphozyten bei strahlentherapeutisch behandelten Patienten

mit einem Adenokarzinom des Pankreas

Aus der Strahlenklinik

der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Direktor: Prof. Dr. R. Fietkau

Der Medizinischen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

zur

Erlangung des Doktorgrades Dr. med.

vorgelegt von

Hanno Zoske

aus

Salzgitter

2

Als Dissertation genehmigt von der

Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Dr. h.c. J. Schüttler

Gutachter: PD. Dr. L. Distel

Gutachter: Prof. Dr. R. Fietkau

Tag der mündlichen Prüfung: 26. Juli 2016

4

Für meine Eltern

2. Zusammenfassung ..................................................................................................... 3

2.1. Hintergründe und Ziele ..................................................................................... 3

2.2. Methoden ............................................................................................................ 3

2.3. Ergebnisse und Beobachtung ............................................................................ 4

2.4. Schlussfolgerung ................................................................................................. 5

3. Abstract ...................................................................................................................... 6

4. Einleitung ....................................................................................................................... 7

4.1. Pankreaskarzinom ............................................................................................. 7

4.1.1. Epidemiologie ............................................................................................... 7

4.1.2. Ätiologie ....................................................................................................... 8

4.1.3. Klassifikation ................................................................................................ 8

4.1.4. Klinik .......................................................................................................... 10

4.1.5. Diagnostik ................................................................................................... 11

4.1.6. Therapie und Prognose ............................................................................... 13

4.1.7. Die Rolle der Strahlentherapie beim Pankreaskarzinom ................................ 14

4.2. Immunsystem .................................................................................................... 15

4.2.1. Aufbau des Immunsystems ......................................................................... 15

4.2.2. Tumor - assoziierte - Makrophagen (TAM) ............................................... 16

4.2.3. Tumor - infiltrierende - Lymphozyten (TIL) .............................................. 17

5. Methoden .................................................................................................................. 18

5.1. Kollektiv ............................................................................................................ 18

5.2. Herstellung der Tissue - Microarrays (TMA) ............................................... 19

5.3. Immunhistologische Färbung .......................................................................... 20

5.3.1. E-Cadherin ..................................................................................................... 20

5.3.2. CD68 und CD163 ........................................................................................... 21

5.3.3. FoxP3 und CD8 .............................................................................................. 22

5.4. Auswertung ....................................................................................................... 23

5.5. Statistik .............................................................................................................. 24

6. Ergebnisse ................................................................................................................ 24

6.1. Zellverteilung und Anzahl .................................................................................. 25

6.1.1. CD68 .............................................................................................................. 25

6.1.2. CD163 ............................................................................................................ 26

6.1.3. FoxP3 ............................................................................................................. 27

6.1.4. CD8 ................................................................................................................ 28

2

6.2. Die Zellverteilung und Anzahl als prognostischer Faktor ............................... 29

6.2.1. CD68+ Zelldichte im Verhältnis zum rezidivfreien Überleben ...................... 29

6.2.2 Dichte der CD68+ Zellen im Verhältnis zum metastasenfreien Überleben ..... 30

6.2.3. Dichte der CD68+ Zellen im Verhältnis zum progressionsfreien Überleben . 31

6.2.4. Dichte der CD68+ Zellen im Verhältnis zum Gesamtüberleben .................... 32

6.2.5. Dichte der CD163+ Zellen im Verhältnis zum frühzeitigen Tumortod .......... 34

6.2.6. Dichte der CD163+ Zellen im Verhältnis zum Gesamtüberleben .................. 36

6.2.7. Dichte der FoxP3+ Zellen im Verhältnis zum metastasenfreien Überleben ... 38

6.2.8. Dichte der FoxP3+ Zellen im Verhältnis zum progressionsfreien Überleben 39

6.2.9. Dichte der FoxP3+ Zellen im Verhältnis zum vorzeitigen Tumortod............. 40

6.2.10. Dichte von FoxP3+ Zellen im Verhältnis zum Gesamtüberleben ................ 42

6.2.11. Dichte der CD8+ Zellen im Verhältnis zum metastasenfreien Überleben .... 44

6.2.12. Dichte der CD8+ Zellen im Verhältnis zum progressionsfreien Überleben . 46

6.2.13. Dichte der CD8+ Zellen im Verhältnis zum vorzeitigen Tumortod ............. 48

6.2.14. Dichte der CD8+ Zellen im Verhältnis zum Gesamtüberleben .................... 51

6.2.15. Der prognostische Wert von Kombinationen verschiedener Zelltypen aus

verschiedenen Gewebslokalisationen ....................................................................... 55

6.3. Das Tumorstadium als prognostischer Faktor ................................................. 59

6.4. Therapieform und Prognose ............................................................................... 62

7. Diskussion ................................................................................................................. 64

7.1. TAMs als prognostischer Faktor ........................................................................ 64

7.1.1. CD68+ Zellen als prognostischer Faktor ........................................................ 64

7.1.2. CD163+ Zellen als prognostischer Faktor ...................................................... 66

7.2. TIL als prognostischer Faktor ............................................................................ 67

7.2.1. FoxP3+

Zellen als prognostischer Faktor ........................................................ 67

7.2.2. CD8+

Zellen als prognostischer Faktor ........................................................... 69

7.3. Immunmodulatorischer Therapieansatz ........................................................... 71

7.4. Die Therapieentscheidung anhand der Klassifikation ..................................... 73

7.5. Die Implementierung immunologischer Faktoren ins TNM - System ............ 74

8. Literaturverzeichnis ................................................................................................ 76

9. Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................... 85

10. Danksagung ............................................................................................................. 86

11. Lebenslauf ................................................................................................................ 87

3

2.1. Hintergründe und Ziele

Die Therapie des Pankreaskarzinoms ist eine große Herausforderung. Trotz der

Fortschritte in der Tumortherapie ist die Prognose für Patienten mit Pankreaskarzinom

nach wie vor schlecht. Die derzeit einzige Option auf eine Heilung stellt die operative

Entfernung des Tumors dar, welche oft nur noch schwer zu erreichen ist, da der

Bauchspeicheldrüsenkrebs aufgrund fehlender Frühsymptome in der Regel erst spät

diagnostiziert wird.

Die Dichten der vorhandenen Tumor - assoziierten - Makrophagen (TAM) und der

Tumor - infiltrierenden - Lymphozyten (TIL) im Tumorgewebe oder in dem den Tumor

umgebenen Stroma wurden bereits von verschiedenen Autoren bei unterschiedlichen

Malignomen als prognostische Faktoren beschrieben. In dieser Arbeit soll der

prognostische Wert von TILs und TAMs hinsichtlich des Adenokarzinoms des Pankreas

untersucht werden. Bei den oft schwierigen Entscheidungen zwischen den vorhandenen

Behandlungsoptionen wäre eine Ergänzung der aktuell verwendeten TNM-Klassifikation

und der darauf basierenden Stadieneinteilung nach UICC (Union internationale contre le

cancer) wünschenswert, um für den Patienten das optimale Therapiekonzept besser

finden zu können. Auch um zwischen einzelnen Optionen zukünftiger Therapiestrategien

wie dem immunmodulatorischen Ansatz abwägen zu können, könnte eine Klassifikation

des individuellen inflammatorischen Milieus des Karzinoms sinnvoll sein. Die

Implementierung von immunologischen Faktoren in das etablierte TNM-System bedarf

jedoch sicherlich noch viel weiterer Forschung.

2.2. Methoden

In dieser Arbeit wurden Gewebeproben von 63 Patienten mit einem Adenokarzinom des

Pankreas untersucht, die im Zeitraum von 1996 bis 2012 an der Strahlenklinik der

Universitätsklinik Erlangen-Nürnberg behandelt wurden.

Neben Gewebe des Primärtumors konnte bei 28 Patienten zusätzlich Gewebe der

Invasionsfront des Primärtumors und bei 32 Patienten Pankreasnormalgewebe gewonnen

werden. Von diesen 123 Gewebeproben wurden Tissue-Microarrays (TMA) angefertigt.

Ein Schnitt wurde einfach immunhistologisch mit Antikörpern gegen Cadherin-E gefärbt,

bei zwei Schnitten erfolgte eine immunhistologische Doppelfärbung, es entstanden

2. Zusammenfassung

4

insgesamt 369 unterschiedliche Stanzzylinder von Gewebeproben. Mit Antikörpern

gegen CD68 (Cluster of differentiation) wurden proinflammatorische und mit

Antikörpern gegen CD163 antiinflammatorische Makrophagen identifiziert. Zur

Identifizierung von regulatorischen T-Lymphozyten (Treg) dienten Antikörpern gegen

das Forkhead Box Protein P3 (FoxP3). Antikörper gegen CD8 wurden zur Identifizierung

von zytotoxischen Lymphozyten verwendet.

Nach der Digitalisierung der TMA-Schnitte erfolgte die Auswertung mit Hilfe des

Bildanalyseprogramms Biomas (PD Dr. Distel, Strahlenklinik Erlangen, Deutschland). Es

wurde bei allen drei Gewebslokalisationen zwischen stromalem und intraepithelialem

Gewebe differenziert und die jeweilige Zellzahl pro Quadratmillimeter ermittelt. Jedes

Merkmal wurde bezüglich seiner Zellzahl am Median getrennt und in zwei Gruppen

unterteilt. Für beide Gruppen wurden die Kaplan-Meier-Kurven berechnet, der

Unterschied zwischen beiden Überlebenskurven wurde mit Hilfe des Log-Rank Testes

auf seine Signifikanz untersucht. Die Berechnung der Kaplan-Meier-Kurve und des

Signifikanzniveaus mittels Log-Rank-Tests erfolgte mit der Statistik- und

Analysesoftware SSPS (IBM Deutschland GmbH, Nürnberg, Deutschland).

2.3. Ergebnisse und Beobachtung

Die Auswertung der durchschnittlichen Zellzahl zeigt stromal eine ähnliche Verteilung

der CD68+, der CD163

+, der FoxP3

+ und der CD8

+ Zellen. Es liegen von den vier

Zelltypen jeweils am meisten Zellen im stromalen Bereich um den Tumor und tendenziell

am wenigsten Zellen stromal um das normale Pankreasdrüsengewebe. Das Muster der

intraepithelialen Zellverteilung ist inhomogener als die stromale. Während sie sich für die

CD163+ Zellen in allen drei Lokalisationen ähnelt, sind von den FoxP3

+ Zellen im

zentralen Tumor und in seiner Invasionsfront tendenziell gleich viele Zellen vorhanden

und im Normalgewebe weniger. Die Verteilung der CD68+ Zellen, von denen im

zentralen Tumor am meisten und im Normalgewebe am wenigsten Zellen sind, und der

CD8+

Zellen, bei denen das Vorkommen umgekehrt aufgeteilt ist, verhält sich genau

gegensinnig.

Ein signifikanter prognostischer Wert kann für die Anzahl der verschiedenen Zelltypen

im Bezug auf klinische Faktoren gezeigt werden. Eine Zellzahl von

proinflammatorischen Makrophagen im intraepithelialen Bereich des zentralen Tumors,

die oberhalb des Medians liegt, beeinflusst das progressionsfreie Überleben positiv. Beim

Gesamtüberleben zeigt die Untersuchung des prognostischen Wertes von Zellzahlen

einzelner Gewebslokalisationen nur Tendenzen. Jedoch zeigt die Gruppe, deren Zellzahl

5

sowohl im stromalen als auch im intraepithelialen Bereich des Normalgewebes unterhalb

des Medians liegt, gegenüber den restlichen Patienten einen signifikanten Vorteil im

Gesamtüberleben. Bei den antiinflammatorischen Makrophagen wirkt sich eine oberhalb

des Medians liegende Zellzahl im stromalen Gewebe der Invasionsfront positiv auf das

Gesamtüberleben aus. Eine Zellzahl im stromalen Gewebe des Pankreasnormalgewebes,

die unterhalb des Medians liegt, wirkt sich positiv auf den frühzeitigen Tumortod aus. Bei

den Treg ist eine oberhalb des Medians liegende Zellzahl im intraepithelialen Bereich der

Invasionsfront im Bezug auf den frühzeitigen Tumortod vorteilhaft. Hohe Treg -

Zellzahlen wirken sich tendenziell positiv auf verschiedene klinische Parameter aus. Bei

den zytotoxischen T-Lymphozyten kann die Beobachtung gemacht werden, dass sich

intraepitheliale Zellzahlen oberhalb des Medians durchweg als positives prognostisches

Kriterium zeigen. Das progressionsfreie und metastasenfreie Überleben wird bei

entsprechenden Zellzahlen im stromalen wie intraepithelialen Bereich des zentralen

Tumors positiv beeinflusst. Im Bezug auf den frühzeitigen Tumortod und das

Gesamtüberleben können bei der Betrachtung der Zellzahl in den einzelnen

Lokalisationen nur Tendenzen festgestellt werden. Erst die Kombination der Zellzahl im

intraepithelialen Bereich des zentralen Tumors und seiner Invasionsfront erbringt

signifikante Ergebnisse bei den beiden klinischen Parametern. Eine in beiden

Lokalisationen gleichzeitig oberhalb des Medians liegende Zellzahl beeinflusst sie

positiv, während eine in beiden Lokalisationen gleichzeitig unterhalb des Medians

liegende Zellzahl sich negativ auf die Parameter auswirkt. Auch die Kombination aus

Verteilung verschiedener Zelltypen kann eine signifikante prognostische Aussagekraft

haben.

2.4. Schlussfolgerung

Die Dichten der hier untersuchten Subgruppen von TIL (CD8+ zytotoxischen T-

Lymphozyten und FoxP3+ regulatorischen T-Lymphozyten) und TAM (CD68

+

proinflammatorische und CD163+ antiinflammatorischen Makrophagen) sind beim

Pankreaskarzinom von prognostischer Signifikanz. Während bei den TIL durchweg hohe

Dichten positiven Einfluss auf die Prognose haben, haben bei den TAM hohe Dichten im

tumerösen und niedrige Dichten im Normalgewebe einen positiven Einfluss. Die

prognostische Aussagekraft des individuellen inflammatorischen Tumormilieus kann

weiter erhöht werden, wenn das Auftreten verschiedener Zelltypen in verschiedenen

Gewebslokalisationen kombiniert wird. Eine Implementierung von immunologischen

Faktoren ins TNM-System könnte in Zukunft sinnvoll sein. Bis dahin sollte die Wirkung

6

und das Zusammenspiel der einzelnen Zellgruppen in inflammatorischen Tumormilieu

besser erforscht werden.

Pancreatic ductal adenocarcinoma is characterized by late detection and poor prognosis.

With some other types of cancer for example colorectal cancer the microenviroment of

inflammation is proven to influence the development and progression of the disease.

This survey analyses the influence of tumor-associated macrophages (TAM) and tumor-

infiltrating lymphcyts (TIL) on the prognosis of pancreatic ductal adenocarcinoma. The

prognostic significance of the density of two subtypes of both immunologic cell types is

evalueted. We differentiated between proinflammatory (M1) and antiinflammatory (M2)

macrophages as well as regulatory (Treg) and cytotoxic (CTL) T-Cells.

A total of 63 patients has been examined for the survey. They had all been treated for

pancreatic ductal adenocarcinoma ranging from Stage I to IV in `Strahlenklinik Erlangen`

between 1996 an 2012. We performed a immunohistological staining of tissue from the

primary tumor site, invasive margin and normal tissue (if available) with antibodies to

FoxP3 (Treg), CD8 (cytoxic T-Cells), CD68 (antiinflammatory macrophages) and CD163

(proinflammatory macrophages). The stained cells were counted by the semi-automatic

programme `Biomas Count´ (PD Dr. Distel, Erlangen). In each region we differencitiated

between the intraepithelial and stromal cell density. For each localisation we divided

patients in two groups: one with a higher, the other with a lower cell density than the

median.

The stromal density of immunological cells around the tumor side is higher than in the

normal pancreatic tissue. A high density of proinflammatory macrophages in the central

tumor seems to be associated with a better progression-free survival rate. The group of

patients with a low density of proinflammatory macrophages in the intraepithelial as well

as stromal area of the normal pancreatic tissue has a better overall survival rate.

Antiinflammatory macrophages have a positive influence on overall survival, if their

density is in the stromal areas of the invasion margin is high. A high density of Treg in

the intraepithelial area of the invasion margin has a positive influence on the remaining

time until cancer death. The group of patients with a high level of cytotoxic T-Cells in the

3. Abstract

7

different intraepitelial and stromal localisations has a consistently better outcome in the

evaluated clinical parameters.

In conclusion the density of proinflammatory (M1) and antiinflammatory (M2)

macrophages as well as regulatory T-Cells (Treg) and cytotoxic T-Cells (CTL) is of

prognostic significance for pancreatic ductal adenocarcinoma. Particulary the density of

CTL seems to be a good indicator for a patient´s prognoses. In future local immune

response could be a new component in the classification of cancer.

4.1. Pankreaskarzinom

4.1.1. Epidemiologie

In Deutschland sind im Jahr 2010 ca. 16000 Menschen an einem Pankreaskarzinom

erkrankt. Männer und Frauen sind etwa gleichhäufig betroffen, die Inzidenz liegt im Jahr

2010 bei 20 Erkrankungen je 100000 Personen. Bei dem prozentualen Anteil von

Krebsneuerkrankungen in Deutschland im Jahr 2010 nimmt das Pankreaskarzinom bei

Männern den zehnten Rang mit einem Anteil von 3,2% ein, bei Frauen den sechsten Rang

mit einem Anteil von 3,6%. Das Lebenszeitrisiko an Bauchspeicheldrüsenkrebs zu

erkranken, berechnet anhand der Daten aus dem Jahr 2010, beträgt 1,6% für beide

Geschlechter. Das durchschnittliche Erkrankungsalter betrug 2010 in Deutschland für

Männer 71 Jahre und für Frauen 75 Jahre.

Die relative Fünfjahres-Überlebensrate von 2009 bis 2010 ermittelt betrug lediglich 8%

für beide Geschlechter, was besonders im Hinblick auf die Fünfjahres-Überlebensrate

anderer Tumorlokalisationen sehr schlecht erscheint. Dies erklärt auch den höheren

prozentualen Anteil des Pankreaskarzinoms an den Krebssterbefällen im Vergleich zu

dem prozentualen Anteil an den Krebsneuerkrankungen in Deutschland im Jahr 2010,

denn der Bauchspeicheldrüsenkrebs nimmt bei den Krebssterbefällen bei beiden

Geschlechtern den vierten Rang ein und verursacht bei den Männern 6,4% und bei den

Frauen 7,9% der Krebssterbefälle. Im Zusammenhang hiermit steht, dass das

Pankreaskarzinom oft erst in fortgeschrittenen Stadien erstdiagnostiziert wird (Robert-

Koch-Institut et al. 2013).

4. Einleitung

8

4.1.2. Ätiologie

Die Ätiologie des Pankreaskarzinoms ist nicht abschließend geklärt und Gegenstand

aktueller Forschung. Es kommen verschiedene Risikofaktoren in Betracht, die zur

Entstehung eines Pankreaskarzinoms führen, wie überhöhter Alkoholkonsum (Talamini

et al. 2010) sowie Tabakkonsum (Nilsen et al. 2000). Bei Patienten mit chronischer

Pankreatitis, die nicht selten alkoholbedingt ist, ist die Erkrankungswahrscheinlichkeit

gegenüber der Normalbevölkerung genauso erhöht (Malka et al. 2002). Personen, die an

Übergewicht oder Diabetes leiden, haben ebenfalls ein erhöhtes Risiko an

Bauchspeichelkrebs zu erkranken (Larsson et al. 2005). Bezüglich der Ernährung wird

gegrilltes Fleisch (Anderson et al. 2002) bei übermäßigem Konsum als Risikofaktor

gesehen.

Neben diesen im Wesentlichen durch den Lebensstil zu beeinflussenden Faktoren scheint

beim Pankreaskarzinom auch eine genetische Komponente zu bestehen. So haben

Verwandte ersten Grades eines Pankreaskarzinomerkrankten das doppelte Risiko selber

zu erkranken. Wenn der Pankreaskarzinomerkrankte unter sechzig Jahre alt ist, besteht

bei den Verwandten ersten Grades ein sogar annähernd dreifach erhöhtes Risiko selbst zu

erkranken (McWilliams et al. 2005). Genetisch bedingte Syndrome wie das Peutz-

Jeghers-Syndrom (Giardiello et al. 2000), die Familiäre-Adenomatöse-Polyposis

(Giardiello et al. 1993) oder die hereditäre Pankreatitis (Lowenfels et al. 1997) erhöhen

ebenso das Risiko an einem Pankreaskarzinom zu erkranken. Scheinbar hat auch das

ABO-Blutgruppensystem Einfluss auf die Wahrscheinlichkeit an einem

Pankreaskarzinom zu erkranken. So haben Träger der Blutgruppe 0 ein niedrigeres Risiko

an Bauchspeicheldrüsenkrebs zu erkranken als die Träger der restlichen Blutgruppen,

wobei dieser Mechanismus noch nicht abschließend geklärt ist (Pelzer et al. 2013).

4.1.3. Klassifikation

Das Pankreaskarzinom gliedert sich entsprechend des in der Bauchspeicheldrüse

vorhandenen Gewebes in Malignome der endokrinen und der exokrinen Anteile. Die

folgenden Ausführungen beschränken sich auf die Klassifikation der Pankreastumore, die

ihren Ursprung in den Zellen des exokrinen (epithelialen) Gewebes der

Bauchspeicheldrüse haben.

Maligne Tumore der exokrinen Pankreasanteile werden anhand histologischer Kriterien

in das duktale Adenokarzinom (75-90%), das adenosquamöse Karzinom (4%), das

9

intraduktale papillär muzinöse Karzinom (3%), das muzinöse Zystadenokarzinom (1%),

das Adenokarzinom der azinären Zellen (1%), das seröse Zystadenokarzinom (<1%) und

das Pankreatikoblastom (<1%) unterteilt. Benigne Tumore des exokrinen Pankreas sind

das seröse Zystadenom, das muzinöse Zystadenom, das intraduktale papillär-muzinöse

Adenom und das reife Teratom (Grenacher et al. 2009).

Die Ausbreitung von Tumorerkrankungen wird anhand der TNM-Klassifikation

eingeteilt. Das TNM-System beruht auf drei verschiedenen Eigenschaften, wobei sich T

auf die Tumorgröße, N auf den Befall von Lymphknoten und M auf den Nachweis von

Metastasen bezieht. Diese Klassifikation wurde maßgeblich von dem Franzosen Pierre

Denoix in den 40er Jahren des 20. Jahrhunderts entwickelt (Brierley et al. 2006). Die

Ideen von Denoix wurden von der UICC aufgegriffen, wodurch 1968 eine erste Ausgabe

eines zusammenfassenden Werkes zur Tumorklassifikation herausgegeben wurde (Sobin

2003). Seitdem wurde das Klassifikationssystem konstant weiter entwickelt bis zur

aktuellen 7. Auflage, wobei bezüglich des Pankreaskarzinoms im Vergleich zur 6.

Auflage keine Änderungen stattgefunden haben (Wittekind 2010).

Im Folgenden werden in Tabelle 1 und 2 die aktuelle TNM-Klassifikation und

Stadieneinteilung für das Pankreaskarzinom dargestellt.

10

Tabelle 1: 6. Auflage des TNM Systems für das Pankreaskarzinom des American

Joint Committee on Cancer (AJCC) (Bilimoria et al. 2007)

TNM - Nomenklatur für das Pankreaskarzinom

TX Primärtumor kann nicht beurteilt werden

T0 Kein Primärtumor nachweisbar

Tis Karzinoma in situ

T1 Tumor auf Pankreas begrenzt; Größter Durchmesser des Primärtumors ≤ 2 cm

T2 Tumor auf Pankreas begrenzt; Größter Durchmesser >2cm T3 Der Tumor hat die Organgrenze überschritten, aber der Truncus coeliacus

oder die Arteria mesenterica superior sind nicht infiltriert

T4 Tumor infiltriert den Truncus coeliacus oder die Arteria mesenterica superior

NX Die regionären Lymphknoten können nicht beurteilt werden

N0 Keine regionären Lymphknotenmetastasen

N1 Regionäre Lymphknotenmetastasen vorhanden

MX Fernmetastasen können nicht beurteilt werden

M0 Keine Fernmetastasen

M1 Fernmetastasen

Tabelle 2: 6. Auflage der Stadieneinteilung des Pankreaskarzinoms basierend auf

der TNM Klassifikation des AJCC (Bilimoria 2007)

Stadieneinteilung

Stadium 0 Tis N0 M0 Tumor innerhalb des Pankreas

Stadium IA T1 N0 M0 Tumor innerhalb des Pankreas

Stadium IB T2 N0 M0 Tumor innerhalb des Pankreas

Stadium IIA T3 N0 M0 Lokal invasiv, resektabel

Stadium IIB T1,2 oder 3 N1 M0 Lokal invasiv, resektabel

Stadium III T4 jedes N M0 lokal fortgeschritten, nicht resektabel

Stadium IV jedes T jedes N M1 Fernmetastasen

4.1.4. Klinik

Die Symptome des Pankreaskarzinoms treten meist erst in fortgeschrittenen Stadien auf.

So ist zu erklären, dass die meisten Patienten zum Diagnosezeitpunkt bereits an einer

fortgeschrittenen Tumorerkrankung leiden (Bilimoria 2007).

Die Symptome des Pankreaskarzinoms, die auch im Frühstadium auftreten, erscheinen

eher unspezifisch. Am häufigsten treten im Frühstadium der Erkrankung Schwäche,

11

Appetitlosigkeit und Gewichtsverlust auf. Symptome wie ein Ikterus oder

Oberbauchschmerzen treten meist erst danach auf. Das Auftreten eines Ikterus hängt

allerdings von der Lage des Karzinoms ab. Er tritt bei Pankreaskopfkarzinomen häufiger

auf (Porta et al. 2005). Ein nicht unerheblicher Anteil älterer Patienten mit einem neu

aufgetretenen Ikterus ist an einem Pankreas- oder Gallengangskarzinom erkrankt

(Reisman et al. 1996). Als weiteres, häufiger auftretendes Symptom ist Rückenschmerz

zu nennen, der ein fortgeschrittenes Tumorleiden anzeigen kann (Ridder et al. 1995).

4.1.5. Diagnostik

Da das Pankreaskarzinom wenig spezifische Symptome hat, ist eine Aussage zu einem

diagnostischen Algorithmus zum Ausschluss eines Pankreastumors schwierig.

Die aktuelle S3 - Leitlinie „Exokrines Pankreaskarzinom“ schlägt bei dem relativ

unspezifischen Symptom des nicht durch Veränderungen des Bewegungsapparates

erklärbaren alleinigen Rückenschmerz ein nach Alter und Verdachtslevel aufgeteiltes

Vorgehen vor. Bei einem niedrigen Verdachtslevel und einem Alter unter 50 Jahren sollte

bei alleinigem Rückenschmerz eine Sonographie des Pankreas durchgeführt werden,

wenn eine Symptompersistenz besteht. Eine sonographische Untersuchung sowie

gegebenenfalls eine Computertomographie der Bauchspeicheldrüse sollten bei Patienten

mittleren Verdachtslevels unter 50 Jahren stattfinden, wenn neben den Rückenschmerzen

auch Symptome wie Inappetenz, Gewichtsverlust oder Schwäche bestehen. Das gleiche

Vorgehen wird für Patienten empfohlen, die sich ebenfalls im mittleren Verdachtslevel

befinden und älter als 50 Jahre sind sowie Rückenschmerzen alleine oder mit den oben

genannten Symptomen zusammen haben. Bei einem hohen Verdachtslevel, einem Alter

über 50 Jahren sowie Schmerzen mit anderen Symptomen kann neben der Sonographie

und der Computertomographie auch eine Endosonographie als diagnostische Möglichkeit

angeboten werden. Es wird jedoch betont, dass individuell je nach

Rückenschmerzcharakter auch schon früher eine Computertomographie oder

Endosonographie vorgenommen werden können. Der diagnostische Algorithmus sollte

also mit einer Oberbauchsonographie beginnen. Bei konkretem Tumorverdacht sollte

neben der perkutanen Sonographie auch eine Endosonographie, eine

Computertomographie (CT), eine Magnetresonanztomographie (MRT) mit

Magnetresonanz-Cholangiopankreatikographie (MRCP) oder Endoskopische

Cholangiopankreatikographie (ERCP) erfolgen. Die sensitivsten Verfahren, um ein

Pankreaskarzinom zu diagnostizieren, sind die CT und die MRT in Kombination mit der

12

MRCP sowie die Endosonographie. Im Rahmen des Tumorstagings sollte mindestens

eine Sonographie des Abdomens, eine Röntgenaufnahme des Thorax sowie eine CT des

Abdomens stattfinden (Seufferlein et al. 2013). Die MRT spielt hier eine untergeordnete

Rolle. Sie kann eingesetzt werden, um fragliche kleine hepatische Raumforderungen oder

zystische Läsionen des Pankreas komplementär zur CT abzuklären (Kinney 2010).

Vor einer Operation ist die CT unverzichtbar, um einzuschätzen, ob der Tumor resektabel

ist (Bipat et al. 2005). Eine zytologische oder histologische Diagnosesicherung ist

präoperativ nicht notwendig, da potentiell resektable Raumforderungen der

Bauchspeicheldrüse mit unklarer Dignität operativ entfernt werden sollten (Seufferlein

2013).

Bevor ein Pankreaskarzinom anderweitig therapiert wird, ist eine bioptische

Diagnosesicherung aufgrund der vielen möglichen Differentialdiagnosen einer

Raumforderung des Pankreas unabdingbar, um Fehlbehandlungen zu vermeiden (David

et al. 1998). In dieser Situation bietet die endosonographisch gestützte Feinnadelbiopsie

eine sichere und genaue Möglichkeit zur Sicherung der Diagnose (Varadarajulu et al.

2005).

Die Rolle verschiedener Biomarker wie CA19-9, Cancer-Antigen 125 (CA125) und

Carcinoembryonales Antigen (CEA) in der Diagnostik des duktalen Adenokarzinoms des

Pankreas ist Gegenstand der aktuellen Forschung und wird kontrovers diskutiert. In der

heutigen klinischen Routine wird die Bestimmung der Serumkonzentration des CA19-9

angewandt. CA19-9 ist ein Antigen, das von Zellen exokriner Epithelien produziert und

normalerweise auf der Oberfläche von Erythrozyten absorbiert wird. Die Zellen des

Bauchspeicheldrüsenkrebses sezernieren eben dieses Oliogosaccharid (Winter et al.

2013). Zur Früherkennung von Bauchspeicheldrüsenkrebs ist die Bestimmung des

Serumspiegels von CA19-9 als Screening - Untersuchung in der asymptomatischen

Bevölkerung nach einer japanischen Studie nicht sinnvoll (Homma et al. 1991). Auch in

einer koreanischen Studie an über 70.000 asymptomatischen Personen konnte festgestellt

werden, dass aufgrund des sehr niedrigen positiven prädiktiven Wertes der

Serumspiegelbestimmung von CA19-9 bezüglich des Pankreaskarzinoms eine Screening

- Untersuchung nicht effizient ist (Kim et al. 2004). Eine andere Studie kommt zu dem

Ergebnis, dass CA19-9 bereits erhöht ist, bevor sich erste Symptome zeigen, und schlägt

eine Screeninguntersuchung für Risikopersonen vor. Es ist jedoch anzumerken, dass es

sich bei den untersuchten Personen nur um postmenopausale Frauen gehandelt hat und

die Fallzahl mit 154 Personen eher gering ist. Hervorzuheben ist jedoch, dass eine CA19-

13

9 Serumspiegelbestimmung keine diagnostische Sicherheit bietet und eher als ergänzende

Maßnahme zu den bereits erläuterten Möglichkeiten anzusehen ist (Baghbanian et al.

2013).

4.1.6. Therapie und Prognose

Das Pankreaskarzinom wird meistens erst in fortgeschrittenen Stadien diagnostiziert, was

bei 80 – 85% der Patienten eine chirurgische Resektion unmöglich macht. Aktuell ist aber

eben diese chirurgische Resektion der einzige kurative Heilungsansatz. Erschwerend

kommt noch hinzu, dass der Bauchspeicheldrüsenkrebs auf viele Chemotherapeutika nur

schlecht anspricht (Vincent et al. 2011).

Bei Patienten mit resktablen Pankreaskarzinom sollte, wenn möglich, eine Resektion

durchgeführt werden, da eine alleinige Chemotherapie, Radiotherapie oder

Radiochemotherapie schlechtere Überlebensraten erzielt (Doi et al. 2008). Bezüglich der

Resektabilität werden in der Literatur unterschiedliche Angaben gemacht. Das National

Comprehensive Cancer Network (NCCN) definiert lokalisierte und resektable

Pankreastumoren anhand dreier Kriterien. Es sollten keine Fernmetastasen bestehen und

es sollte keine Infiltration, Distorsion oder Umhüllung sowie kein Tumorthrombus der

Vena mesenterica superior oder der Pfortader radiologisch nachweisbar sein. Auch

sollten deutliche Fettflächen um den Truncus coeliacus, die Arteria hepatica sowie die

Arteria mesenterica superior bestehen (Callery et al. 2009). Die aktuelle S3-Leitlinie zum

exokrinen Pankreaskarzinom verweist bezüglich der Kriterien von grenzwertig

resektablen Tumoren ebenfalls auf die NCCN Guidelines (Seufferlein 2013). Die

Standardoperation beim Pankreaskopfkarzinom ist die partielle Doudenopankreatektomie

(klassische Operation nach Whipple) oder die Pylorus erhaltende

Duodenopankreatektomie. Beide Operationen sind gleichwertige Alternativen (Diener et

al. 2014). Bei Karzinomen des linksseitigen Pankreas ist die Pankreaslinksresektion mit

einer Splenektomie die Therapie der Wahl (Gebhardt et al. 2000). Bei allen Resektionen

sollte ein Sicherheitsabstand zum gesunden Gewebe von mindestens einem Millimeter

eingehalten werden. Patienten, bei denen der Sicherheitsabstand unterschritten wurde,

haben die gleiche Prognose wie Patienten ohne vorhandenen Sicherheitsabstand

(Campbell et al. 2009).

Wenn es möglich ist, sollte nach einer kurativen Resektion eine adiuvante Chemotherapie

durchgeführt werden. Es wurde gezeigt, dass eine adiuvante Chemotherapie mit

Gemcitabin (Ueno et al. 2009) oder Floururacil in Kombination mit Folinsäure

(Neoptolemos et al. 2010) der alleinigen Operation überlegen ist. Auch Patienten mit

14

inkompletter Resektion profitieren von einer postoperativen Chemotherapie mit

Gemcitabin (Oettle et al. 2007).

Aufgrund der fehlenden Frühsymptome und der damit einhergehenden späten Diagnose

präsentiert sich das Tumorleiden häufig in einem schon fortgeschrittenen Stadium, das

einen palliativen Therapieansatz erfordert. In dieser Situation sollte, soweit möglich, eine

die Symptomlast der Patienten reduzierende, palliative Chemotherapie durchgeführt

werden. Patienten mit metastasiertem Bachspeicheldrüsenkrebs in gutem

Allgemeinzustand können von einer Kombinationschemotherapie aus 5-Floururacil,

Folinsäure, Irinotecan und Oxaliplatin profitieren (Conroy et al. 2011). Wenn dieses

Therapieregime nicht möglich sein sollte, stellt die Kombination von nab-Paclitaxel mit

Gemcitabine eine Alternative dar. Die Kombination beider Wirkstoffe ist der alleinigen

Therapie mit Gemcitabin überlegen (Von Hoff et al. 2013)

Insgesamt ist die Prognose des Pankreaskarzinoms schlecht. Die Fünfjahres-

Überlebensrate beträgt durchschnittlich für alle Patienten im Stadium IA 13,6%, IB

11,7%, IIA 6,5%, IIB 5,1%, III 2,7% und im Stadium IV nur 0,7%. Wenn eine Resektion

des Tumors durchgeführt wurde, ist die Prognose besser als bei nicht resezierten

Tumoren. Bei pankreatektomierten Patienten im Stadium IA beträgt die Fünfjahres-

Überlebensrate 33,4%, wohingegen sie bei Patienten im gleichen Stadium, deren Tumor

nicht reseziert werden konnte, nur bei 3,8% liegt (Bilimoria 2007).

4.1.7. Die Rolle der Strahlentherapie beim Pankreaskarzinom

Die Rolle der Strahlentherapie beim Pankreaskarzinom ist nicht abschließend geklärt und

Gegenstand von aktuellen Studien. Eine adiuvante Radio-Chemo-Therapie (RCT) nach

einer vollständigen Resektion mit ausreichendem Sicherheitssaum um den Tumor oder

eine postoperative RCT nach einer unvollständigen Resektion oder ungenügendem

Sicherheitssaum um den Tumor sollte nur im Rahmen von Studien stattfinden, da die

bisherige Studienlage kontrovers ist. Die adiuvante RCT nach einer kompletten Resektion

oder die postoperative RCT nach inkompletter Resektion scheint der alleinigen

Chemotherapie nicht überlegen (Stocken et al. 2005), wobei die in der Metaanalyse

eingeschlossenen Studien von älterem Datum sind und nicht den aktuellen

technologischen Stand der Radioonkologie repräsentieren. Diese unklare Situation ist

jedoch Gegenstand aktueller Studien.

Die neoadiuvante RCT sollte bei resektabelen Adenokarzinomen des Pankreas ebenfalls

nicht außerhalb von Studien durchgeführt werden, da, obwohl die lokale Kontrolle

verbessert wird, kein Überlebensvorteil gegenüber der sofortigen Operation

15

nachgewiesen werden konnte (Barbier et al. 2011). Bei dem lokal fortgeschrittenen

inoperablen Pankreaskarzinom kann durch eine neoadiuvant intendierte RCT in einigen

Fällen eine Resektabilität erreicht werden, wodurch die betroffenen Patienten eine

bessere Prognose haben als solche Patienten, bei denen keine Resektion durchgeführt

werden kann (Seufferlein 2013). Aktuelle Studien versuchen auch hier die Rolle der

Strahlentherapie in der neoadiuvanten Therapie des Pankreaskarzinoms zu klären.

In der palliativen Situation erzeugt die RCT gegenüber der alleinigen Chemotherapie

einen signifikanten Überlebensvorteil beim lokal fortgeschrittenen inoperablen

Pankreaskarzinom (Huguet et al. 2007; Loehrer et al. 2011). Es wird ein sequenzielles

Vorgehen empfohlen, bei dem vor der RCT eine Induktionschemotherapie durchgeführt

wird. Diejenigen Patienten, deren Tumorleiden während der Induktionschemotherapie

nicht progredient ist, können am ehesten von der folgenden RCT profitieren (Krishnan et

al. 2007). Dieses Therapiekonzept wird im Rahmen der CONKO-007 Studie aktuell auch

auf seinen Stellenwert in der neoadiuvanten Therapie des Bauchspeicheldrüsenkrebses

untersucht.

4.2. Immunsystem

4.2.1. Aufbau des Immunsystems

Das Immunsystem kann in das spezifische und unspezifische System unterteilt werden,

die zusammen arbeiten. Die unspezifische oder angeborene Immunität reagiert

unmittelbar auf Pathogene und besteht aus humoralen und zellulären Bestandteilen. Die

spezifische oder erworbene Immunität ist in jedem Individuum einzigartig und wird erst

durch Kontakt mit einem Antigen aktiviert. Sie besitzt die Fähigkeit extrem langlebige

Zellen zu produzieren, die das immunologische Gedächtnis des Organismus bilden.

Im unspezifische System gehören die neutrophilen und eosinophilen Granulozyten, das

Monozyten-Makrophagen-System, dendritische Zellen und die natürliche Killerzellen zu

den zellulären Bestandteilen. Humorale Bestandteile sind Zytokine, Akute-Phase-

Proteine, Defensine und das Komplentsystem. Diese Bestandteile hängen eng zusammen.

Das spezifische System besteht im Wesentlichen aus antigenspezifisch arbeitenden T-

und B-Lymphozyten sowie den von ihnen produzierten Immunglobulinen und Zytokinen.

Um einen T-Lymphozyten zu aktivieren, muss diesem das passende und aufgearbeitete

Antigen auf einem humanen-Leukozyten-Antigen (HLA) präsentiert werden. Alle

kernhaltigen Zellen exprimieren auf ihrer Oberfläche Klasse-I-HLA-Moleküle, die CD8+

16

zytotoxische T -Zellen aktivieren können. Zytotoxische T-Zellen können die gebundenen

Zellen töten. Antigen präsentierenden Zellen wie B-Lymphozyten, Monozyten,

Makrophagen oder dendritische Zellen präsentieren Antigene auf Klasse-II-HLA-

Molekülen, die ausschließlich von CD4+

T-Helferzellen erkannt werden. CD4+

T-Zellen

können die Immunantwort entweder verstärken (TH1- /TH2-Zellen) oder dämpfen (Treg).

Die B-Lymphozyten werden durch CD4+ T-Zellen über ihre MHC-Moleküle oder durch

Zytokine aktiviert, wenn sie das passende Antigen auf ihrem B-Zell-Rezeptor gebunden

haben. Daraufhin vermehrt sich die aktivierte B-Zelle und differenziert sich zur

antikörperproduzierenden Plasmazelle und zur B-Gedächtniszelle, die das

immunologische Gedächtnis des Organismus darstellt. Wenn die gebildeten Antikörper

das passende Antigen binden, so inaktivieren sie diese und erleichtern deren Phagozytose.

Zudem aktivieren sie das Komplementsystem (Angstwurm et al. 2012).

4.2.2. Tumor - assoziierte - Makrophagen (TAM)

Monozyten entstammen der myeloischen Zellreihe und differenzieren sich zu

Makrophagen, wenn sie in das periphere Gewebe übertreten. Dort übernehmen sie

Aufgaben wie die Phagozytose oder die Antigenpräsentation (Chaplin 2010).

Makrophagen können sich in verschiedene Subgruppen differenzieren. Über Interferon-γ

(IFN-γ) werden sie von TH1-Zellen angeregt, sich zu einem proinflammatorischen

Makrophagen zu differenzieren. TH2-Zellen können über die Zytokine Interleukin 4,

Interleukin 5 und Interleukin 13 eine Differenzierung zu einem antiinflammatorischen

Makrophagen auslösen (Gordon 2003). Entsprechend ihrer Aktivierung durch TH1-Zellen

wird diese Makrophagenantwort als M1-Antwort bezeichnet, wohingegen die durch TH2-

Zellen ausgelöste Makrophagenantwort als M2-Antwort bezeichnet wird (Mills et al.

2000).

Aktivierte Makrophagen des M1-Phänotyps sind in der Lage, Mikroorganismen und

Tumorzellen zu töten sowie proinflammatorische Zytokine auszuschütten. Die

Makrophagen des M2-Phänotyps hingegen beeinflussen die Entzündungsreaktion,

entfernen Detritus, fördern die Angiogenese sowie die Gewebeheilung. Die Monozyten

werden durch verschiedene Zytokine wie den Colony-Stimulating-Factor-1 (CSF-1), den

Vascular-Endothelial-Growth-Factor (VEGF) oder Chemokine zur Migration in das

Tumorgebiet und zur Differenzierung angeregt. Teilweise werden ebendiese Botenstoffe

vom Tumor selbst produziert (Murdoch et al. 2004). Es wird angenommen, dass durch

die vom Tumor selbst oder die von den T-Zellen ausgeschütteten Zytokine die meisten

TAM den M2-Phänotyp annehmen (Mantovani et al. 2002). Schon frühe, nicht invasive

17

Tumore scheinen Makrophagen und andere inflammatorische Zellen in das sie

umgebende Stroma zu locken. Dort fördern sie die Tumorinvasion, indem sie mit ihren

verschiedenen Proteasen die Basalmembran schädigen und den Tumorzellen das

Wachstum in das umgebende Stroma erleichtern. Auch fördern sie durch die Abgabe

verschiedener Stoffe gerade in den hypoxischen Bereichen um den Tumor die

Angiogenese. In den hypoxischen Arealen unterdrücken sie außerdem die antitumeröse

Wirkung der anderen Zellen des Immunsystems. Die Metastasierung fördern sie zudem

dadurch, dass sie die Mobilität der Tumorzellen erhöhen und sie in Richtung der

Blutgefäße anziehen (Lewis et al. 2006).

4.2.3. Tumor - infiltrierende - Lymphozyten (TIL)

In Studien wurde bereits ein Zusammenhang zwischen TIL und der Prognose von

Malignomerkrankungen gefunden. Zytotoxische CD8+

TIL sind dabei mit einem besseren

Überleben assoziiert, während sich die Situation bei den regulatorischen FoxP3+-Zellen

schwieriger darstellt. Man geht davon aus, dass sie die Funktion des Immunsystems

unterdrücken und damit vorteilhaft für den Tumorprogress sein würden. Aktuell

verbreitet sich jedoch auch die Meinung, dass FoxP3+-Zellen mit einer besseren Prognose

verbunden sein können (deLeeuw et al. 2012).

CD8+ T-Zellen können die von Tumorzellen auf MHC-I Molekülen präsentierten

tumorspezifischen Antigene erkennen. Von den tumorspezifischen Antigenen aktiviert

können CD8+-Zellen die als körperfremd erkannte Zelle entweder zytolytisch oder durch

die Sekretion von Zytokinen wie TNF (Tumor-Nekrose-Faktor) oder IFN-γ zerstören

(Savage et al. 2014). Die Annahme, dass zytotoxische T - Zellen Tumorzellen angreifen

und zerstören können, ist dadurch bestätigt worden, dass eine hohe Dichte von CD8+ bei

vielen Tumorentitäten ein unabhängiger und positiver prognostischer Faktor ist (Kim et

al. 2007).

Treg spielen eine wichtige Rolle in der Selbsttoleranz sowie in der Regulation von

Immunreaktionen und das FoxP3 ist ein Treg spezifischer Transkriptionsfaktor

(Sakaguchi et al. 2008). Das seltene IPEX-Syndrom (Immune dysregulation,

polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked) ist durch eine angeborene Mutation in eben

diesem FoxP3-Gen verursacht und durch Autoimmunprozesse in mehreren Organen

charakterisiert (Barzaghi et al. 2012), was die wichtige Rolle dieses Transkriptionsfaktors

verdeutlicht.

18

5.1. Kollektiv

Diese Arbeit basiert auf einem Kollektiv von 63 Patienten mit einem Adenokarzinom des

Pankreas, die im Zeitraum von 1996 bis 2012 an der Strahlenklinik der Universitätsklinik

Erlangen-Nürnberg behandelt wurden. Patienten mit Tumoren anderer histologischer

Subgruppen wurden ausgeschlossen. Von diesen 63 Patienten sind 31 weiblichen und 32

männlichen Geschlechts. Das Durchschnittsalter bei der Diagnosestellung beträgt 63,6

Jahre, wobei der jüngste Patient 44,7 Jahre alt ist und der älteste 78,6 Jahre.

Der Tumor der Mehrzahl der 63 Patienten wurde nach den Kriterien der UICC genauer

klassifiziert. Nach der zum jeweiligen Diagnosezeitpunkt gültigen UICC Klassifikation

befanden sich 8 Patienten im Stadium I, 32 Patienten im Stadium II, 12 Patienten im

Stadium III und 8 Patienten im Stadium IV (Abbildung 1). Der Primärtumor war bei 6

Patienten im T1 Stadium, bei 7 Patienten im T2 Stadium, bei 36 Patienten im T3 Stadium

sowie bei 11 Patienten im T4 Stadium. 31 Patienten wiesen zum Diagnosezeitpunkt

bereits Lymphknotenmetastasen (N1) auf, bei 10 Patienten waren Fernmetastasen (M2)

nachweisbar (Tabelle 3).

Abbildung 1: Aufteilung der Kollektivs nach UICC Klassifikation

Tabelle 3: Aufteilung des Kollektivs nach TNM - Klassifikation

0

5

10

15

20

25

30

35

I II III IV

UICC Stadien

Anzahl

5. Methoden

19

TNM - Klassifikation Anzahl Patienten

T1 6

T2 7

T3 36

T4 10

N0 27

N1 31

M0 53

M1 10

33 Patienten wurden neoadiuvant einer kombinierten Radio-Chemotherapie unterzogen. 4

von diesen Patienten konnten nicht operiert werden, während bei 9 Patienten eine

Pankreaslinksresektion und bei 20 Patienten eine Doudenopankreatektomie nach Whipple

durchgeführt werden konnte. 7 Patienten wurden adiuvant und weitere 18 Patienten im

palliativen Sinne bestrahlt.

Die Daten wurden beim Erlanger Tumorzentrum abgefragt und mithilfe des Archives des

Pathologischen Institutes der Universitätsklinik so weit wie möglich vervollständigt. Die

fehlenden Daten waren nicht zu ermitteln.

5.2. Herstellung der Tissue - Microarrays (TMA)

Insgesamt wurde von 63 Patienten Gewebe des Primärtumors gewonnen. Von diesen

konnte bei 28 Patienten zusätzlich Gewebe der Invasionsfront des Primärtumors und bei

32 Patienten Gewebe vom Normalgewebe des Pankreas gewonnen werden. Von diesen

123 Gewebeproben wurden TMAs angefertigt.

Um diese TMAs anzufertigen wurden die entsprechenden, in Paraffinblöcken

eingebetteten Gewebeproben und die dazugehörigen feingeweblichen Schnitte aus dem

Archiv des Pathologischen Institutes der Universitätsklinik Erlangen entnommen. Die mit

Hämatoxylin-Eosin (HE) gefärbten Schnitte dienten als Schablone für ihre dazugehörigen

Paraffinblöcke, auf den Schnitten wurden die jeweiligen Gebiete mithilfe eines

Lichtmikroskops eingezeichnet. Mit Hilfe dieser Schablone wurden die markierten Areale

20

durch eine Hohlnadel aus dem Paraffinblock entnommen. Bis zu 60 entnommene

Stanzzylinder wurden in einem TMA Block zusammen neu eingebettet.

5.3. Immunhistologische Färbung

Von den TMA - Paraffinblöcken wurden drei feingewebliche Schnitte angefertigt. Ein

Schnitt wurde einfach immunhistologisch gefärbt, bei den zwei anderen Schnitten

erfolgte eine immunhistologische Doppelfärbung. Es entstanden also 369

unterschiedliche Gewebeproben.

5.3.1. E-Cadherin

Um zwischen Tumorgewebe und stromalen Gewebe differenzieren zu können, wurde

eine immunhistologische Färbung mit einem Antikörper gegen E-Cadherin vorgenommen

(Abbildung 2). Das Molekül E-Cadherin dient der Zell - Zell - Adhäsion und kommt in

menschlichen Epithelien vor (Geiger et al. 1992).

Die immunhistologische Färbung mit dem Antikörper gegen E-Cadherin (BD,

Heidelberg, Germany) wurde mit dem vollautomatischen Ventana BenchMark Ultra

Färbesystem (Roche, Grenzach-Wyhlen, Germany) durchgeführt. Zur Antigenerkennung

wurde ein CCL Puffer (Benchmark ULTRACC1, Roche, Germany) verwendet und die

Zellkerne wurden mit Hämatoyxlin angefärbt.

Abbildung 2: Tumorgewebe (bräunlich) umgeben von stromalem Gewebe

(Vergrößerung 20:1)

21

5.3.2. CD68 und CD163

Um zwischen Makrophagen des M-1 und des M-2 Phänotyps differenzieren zu können

wurde eine immunhistologische Doppelfärbung mit Antikörpern gegen CD68 und CD163

Moleküle vorgenommen (Abbildung 3). CD68 ist ein Pan-Makrophagen Marker,

wohingegen CD163 ein spezifischer Marker für Makrophagen vom M-2 Phänotyp ist

(Brown et al. 2009).

Für die Färbung wurde zunächst ein Feingewebsschnitt von dem TMA Paraffinblock

angefertigt. Der Schnitt wurde mittels Xylol und Ethanollösung entparaffiniert. Der im

TRIS-Puffer gelagerte Schnitt wurde nun im Dampftopf zur Antigendemaskierung

gekocht. Nach der Antigendemaskierung fand eine Spülung mit TRIS-Puffer statt. Im

Folgenden wurde der Schnitt für eine Nacht in einer Lösung mit dem Primärantikörper

gegen CD163 (Novocastra, NCL - CD 163) und Humanalbumin im Verhältnis 1:500

gelagert. Anschließend wurde der Schnitt mit einem AP-Polymer-Kit (Zytomed, Berlin,

Germany) und Fast Red angefärbt. Nachdem der Schnitt erneut mit TRIS-Puffer gespült

wurde, musste er für eine Stunde zusammen mit einer Lösung aus dem

Sekundärantikörper gegen CD68 (Dako, Code M 0876) und Humanalbumin im

Verhältnis 1:200 gelagert werden. Die Färbung wurde mittels eines AP-Polymer-Kits

(Zytomed, Berlin, Germany) und Fast Blue durchgeführt. Nach einer Spülung mit TRIS-

Puffer erfolgte die Eindeckelung mit einem wässrigen Eindeckmedium.

Abbildung 3: Immunhistologische Färbung mit Antikörpern gegen CD163 (rot) und

CD68 (blau) (Vergrößerung 20:1)

22

5.3.3. FoxP3 und CD8

Die immunhistologische Doppelfärbung mit Antikörpern gegen das FoxP3 und das CD8

Molekül dient der Identifikation von Treg und zytotoxischen CD8+ T - Zellen (Abbildung

4). Das FoxP3 ist ein für Treg spezifischer Transkriptionsfaktor (Sakaguchi 2008). Adulte

Lymphozyten exprimieren entweder das CD4 oder das CD8 Molekül, wobei das CD8

Molekül die Identifikation von zytotoxischen T - Zellen erlaubt (Andersen et al. 2006).

Für die Färbung wurde zunächst ein Feingewebsschnitt von dem TMA Paraffinblock

angefertigt. Für die FoxP3 - Färbung wurde die Biotin - Streptavidin - Komplex-Methode

mit einer Verstärkung durch Tyramin angewandt. Die gleiche Methode ohne Verstärkung

wurde für die CD8 - Färbung verwendet. Um den Schnitt zu entparaffinieren, musste er in

Xylol- und Ethanol - Lösungen in verschiedenen Konzentrationen gebadet werden. Im

nächsten Schritt wurde der Schnitt in einer Zitronensäurepufferlösung bestehend aus 2,1

Gramm Zitronensäure auf 1 Liter Aqua mit einem pH-Wert von 6 gelagert. Zur

Antigendemaskierung wurde das Gefäß mit dem Schnitt für fünf Minuten in einem

Wasserbad im Dampftopf bei 120° Celsius gekocht. Anschließend wurde der

Objektträger mit dem Schnitt auf der Unterseite auf eine Cuverplatte gelegt, auf die

vorher 1 L TRIS - Puffer zusammen mit 1ml TWEEN gegeben wurden. Die dann in einen

Ständerkasten gestellte Cuverplatte wurde mit TRIS/TWEEN - Puffer aufgefüllt. Der

TRIS/TWEEN - Puffer wurde abgelassen und fünf Tropfen Blocking Sol. 1 wurde in die

Kammer gegeben. Nach fünf Minuten fand eine erneute Spülung mit TRISS/TWEEN -

Pufferlösung statt. Anschließend wurde die Lösung bestehend aus dem FoxP3 Antikörper

(abcam, Code 20034) und Humanalbumin im Verhältnis 1:100 über Nacht zu dem

Objektträger gegeben. Nach der Einwirkzeit wurde die Kammer erneut mit

TRISS/TWEEN - Lösung gespült und nach seinem Ablaufen fünf Tropfen Post Block

Reagent 2 in die Kammern geträufelt. Die Kammer wurde nach 20 Minuten wiederum

mit TRISS/TWEEN Lösung gespült und dann mit fünf Tropfen AP-Polymer-Kit

(Zytomed, Berlin, Germany) beträufelt, der eine halbe Stunde einwirken musste. Nach

erneuter Spülung mit TRISS/TWEEN Lösung wurden drei Tropfen Fast Red Lösung auf

den Objektträger geträufelt, der für 20 Minuten bei Raumtemperatur zugedeckt

verbleiben musste. Danach wurde der Objektträger unter fließendem Wasser abgespült

und in einem Gefäß wieder mit destilliertem Wasser aufgefüllt. Für die zweite Färbung

muss der Schnitt für eine Minute im Zitronensäurepuffer (pH=6) in einer Mikrowelle

zum kochen gebracht werden. Daraufhin musste er für eine Stunde in einer Lösung

einwirken, in der sich CD8-Antikörper (Dako, Code M7103) und Humanalbumin im

Verhältnis 1:50 befanden, worauf eine Spülung mit TRISS/TWEEN Lösung folgte.

23

Nachdem ein Tropfen Brij (Polyalkylenglycolether) aufgebracht wurde, wirkte der

Antikörper in Lösung von 1:50 erneut eine halbe Stunde ein. Nach wiederholtem Spülen

mit TRISS/TWEEN Lösung wurde der Objektträger für 30 min in einem Strept -AB -

Komplex (Dako, Code K 391) eingelegt. Die Färbung durch eine Fast-Blue-Farbreaktion

erfolgte nach erneutem Spülen mit TRISS/TWEEN Lösung. Bevor die Gegenfärbung

mittels Hämalaun erfolgen konnte, musste der Objektträger unter fließendem Wasser

abgespült werden und in destilliertem Wasser eingelegt werden. Im letzten Schritt

erfolgte die Eindeckelung mit einem wässrigen Eindeckmedium.

Abbildung 4: Immunhistologische Färbung mit Antikörpern gegen FoxP3 (rot) und

CD8 (blau) (Vergrößerung 20:1)

5.4. Auswertung

Für die Auswertung wurden die TMAs im ersten Schritt digitalisiert. Dies erfolgte mittels

eines hochauflösenden Scanners (MIRAX-Scanner, Zeiss, Oberkochen, Deutschland).

Die nun digitalisierten TMAs wurden mittels des Programms Pannoramic Viewer (3D

Histech, Budapest, Ungarn) in kleinere Untereinheiten zugeschnitten. Die

zugeschnittenen Bildteile wurden mit dem Programm Irfan View (Irfan Skiljan, Wien,

Österreich) überspeichert, damit sie im nächsten Schritt weiter bearbeitet werden

konnten. Mit Hilfe des Bildanalyseprogramms Biomas (PD Dr. Distel, Strahlenklinik

Erlangen, Deutschland) wurden die Untereinheiten der TMAs in die einzelnen runden

Gewebsstanzen zugeschnitten.

Es lagen nun von jedem ausgestanzten Gewebszylinder drei übereinanderliegende

unterschiedlich gefärbte Schnitte vor. Damit eine präzise Auswertung möglich war,

mussten die drei übereinanderliegenden Schnitte nun genau aufeinander ausgerichtet

24

werden. Als Grundlage dazu dienten die Cadherin-E-Färbung bzw. die FoxP3/CD8 -

Färbung, auf die die anderen Schnitte mithilfe des Programms Biomas ausgerichtet

wurden. Ebenfalls mithilfe des Biomas-Programms wurden nun in allen Gewebszylindern

in der Cadherin-E-Färbung die intraepithelialen Gebiete und das sie umgebene stromale

Gebiet definiert. Die in der Cadherin-E-Färbung definierten Gebiete konnten vom

Biomas - Programm auf Grund der bereits erfolgten Ausrichtung der anderen Schnitte auf

eben diese übertragen werden. Nachdem die intraepithelialen und stromalen Gebiete

definiert waren, zählte das Biomas-Programm halbautomatisch in Einzelschritten die

vorhandenen Zellen. Nach dem automatischen Zählen und Markieren eines Merkmals

konnten noch manuell Änderungen vorgenommen werden. Die jeweilige Häufigkeit der

Merkmale in einer Stanzzylinderserie schrieb das Biomas-Programm in eine Exel-Tabelle

(Microsoft Office, Microsoft, USA).

5.5. Statistik

Das Biomas - Programm errechnete aus der absoluten Zellzahl und der betrachteten

Fläche die relative Zelldichte pro mm2. Die relative Zelldichte pro mm

2 wurde für alle

Färbungen der Stanzzylinder für das stromale und intraepitheliale Gebiet errechnet. Es

lagen nun für jedes Merkmal in dem zentralen Tumorgewebe, der Invasionsfront des

Tumors und dem Pankreasnormalgewebe jeweils im intraepithelialen und stromalen

Gebiet die Zellzahlen pro mm2 vor. Alle diese Gruppen wurden an ihrem Median in

kleiner als der Median „0“ und größer als der Median „1“ aufgeteilt.

Beim Erlanger Tumorzentrum wurden bezüglich der 63 Patienten des Kollektivs die

Daten zum rezidivfreien Überleben, metastasenfreien Überleben, Gesamtüberleben sowie

zur Komplettremission und dem tumorbedingten Tod abgefragt. Anhand dieser Daten

wurden für die beiden am Median getrennten Gruppen die Kaplan-Meier-Kurven

berechnet. Mithilfe des Log-Rank Testes wurden die Überlebenszeiten der beiden

Gruppen untersucht und festgestellt, ob sie signifikant verschieden sind. Die Berechnung

der Kaplan-Meier-Kurve und des Signifikanzniveaus mittels Log-Rank-Tests erfolgte mit

der Statistik- und Analysesoftware SSPS (IBM Deutschland GmbH, Nürnberg,

Deutschland).

6. Ergebnisse

25

6.1. Zellverteilung und Anzahl

6.1.1. CD68

Abbildung 5: Durchschnittliche Anzahl CD68+ Zellen in den verschiedenen

Geweben

Die Anzahl der CD68+ Zellen ist intraepithelial durchweg höher als stromal.

Durchschnittlich finden sich pro mm2 intraepithelial im zentralen Tumor 20,6 Zellen, in

seiner Invasionsfront 18,3 und im normalen Pankreasgewebe 12,2 Zellen. Die

durchschnittliche Anzahl der stromal gelegenen CD68+ Zellen ist geringer und weist die

gleiche Tendenz auf. Im zentralen Tumor befinden sich stromal mehr Zellen (9,0 pro

mm2) als in der Invasionsfront (7,0 pro mm

2) und im Pankreasnormalgewebe (5,2 pro

mm2) (Abbildung 5).

0

5

10

15

20

25

Central Invasionsfront Normalgewebe

Zel

lzah

l / m

m2

CD68 intraepithelial

CD68 stromal

26

6.1.2. CD163

Abbildung 6: Durchschnittliche Anzahl CD163+ Zellen in den verschiedenen

Geweben

Stromal sind durchweg mehr CD163+ Zellen gelegen als intraepithelial. Am meisten

Zellen sind stromal beim zentralen Tumor gelegen (304,6 pro mm2), während an der

Invasionsfront (271,8 pro mm2) und im Normalgewebe (263,8 pro mm

2) weniger Zellen

vorhanden sind. Intraepithelial sind die CD163+ Zellen zwischen den verschiedenen

Gewebslokalisationen recht homogen verteilt (Tumor zentral: 220 pro mm2,

Invasionsfront: 240 pro mm2, Normalgewebe: 215,5 pro mm

2) (Abbildung 6).

0

50

100

150

200

250

300

350


Zel

lzah

l / m

m2

CD163 Intraepithelial

CD163 stromal

27

6.1.3. FoxP3

Abbildung 7: Durchschnittliche Anzahl FoxP3+ Zellen in den verschiedenen

Geweben

Stromal sind erneut durchweg mehr FoxP3+ Zellen vorhanden als intraepithelial. Im

Stroma des zentralen Tumors sind die meisten FoxP3+ Zellen lokalisiert (50,6 pro mm

2).

Im Stroma der Invasionsfront sind durchschnittlich 41,0 Zellen pro mm2 vorhanden,

während sich im Normalgewebe nur 21,5 Zellen pro mm2 befinden. Intraepithelial liegen

im zentralen Tumor (25,88 pro mm2) und in der Invasionsfront (27,5 pro mm

2) etwa

gleich viele Zellen, wohingegen im Normalgewebe weniger vorhanden sind (9,3 pro

mm2) (Abbildung 7).

0

10

20

30

40

50

60


Zel

lzah

l / m

m2

FoxP3 Intraepithelial

FoxP3 stromal

28

6.1.4. CD8

Abbildung 8: Durchschnittliche Anzahl CD8+ Zellen in den verschiedenen Geweben

Die durchschnittliche Verteilung der CD8+ Zellen ist sehr unterschiedlich. Die meisten

Zellen liegen stromal im zentralen Tumor (161,2 pro mm2), während sich in der

Invasionsfront (143,3 pro mm2) und im Normalgewebe (139,8 pro mm

2) weniger Zellen

befinden. Intraepithelial liegen im normalen Pankreasgewebe die größte Anzahl CD8+

Zellen (119,8 pro mm2), wohingegen sich im zentralen Tumor (83,1 pro mm

2) und in der

Invasionsfront (108,6 pro mm2) weniger Zellen befinden (Abbildung 8).

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180


Zel

lzah

l / m

m2

CD8 Intraepithelial

CD8 stromal

29

6.2. Die Zellverteilung und Anzahl als prognostischer Faktor

6.2.1. CD68+ Zelldichte im Verhältnis zum rezidivfreien Überleben

Abbildung 9: Dichte der stromalen CD68+ Zellen pro mm

2 des

Pankreasnormalgewebes im Verhältnis zum rezidivfreien Überleben in Monaten

(p=0,181)

Es besteht die Tendenz, dass diejenigen Patienten, deren stromale CD68+ Zellzahl im

Pankreasnormalgewebe kleiner als der Median ist, länger rezidivfrei überleben als

Patienten, deren Zellzahl größer als der Median ist (Abbildung 9). Die gleiche Tendenz

besteht bei der intraepithelialen Zellzahl.

30

6.2.2 Dichte der CD68+ Zellen im Verhältnis zum metastasenfreien Überleben

Abbildung 10: Dichte der intraepithelialen CD68+ Zellen pro mm

2 des zentralen

Tumors im Verhältnis zum metastasenfreien Überleben in Monaten (p=0,085)

Bei Patienten, deren intraepitheliale CD68+ Zellzahl im zentralen Tumor größer als der

Median ist, besteht eine Tendenz zu einem längeren metastasenfreien Überleben als bei

Patienten, deren Zellzahl geringer als der Median ist (Abbildung 10). Die gleiche

Tendenz ließ sich für die intraepitheliale und stromale CD68+ Zellzahl in der

Invasionsfront des Tumors beobachten.

31

6.2.3. Dichte der CD68+ Zellen im Verhältnis zum progressionsfreien Überleben


2 des

zentralen Tumors im Verhältnis zum progressionsfreien Überleben in Monaten

(p=0,049)

Es besteht ein Unterschied bezüglich des progressionsfreien Überlebens bei der

intraepithelialen Zellzahl im zentralen Tumor. Patienten, deren CD68+ Zellzahl größer als

der Median ist, haben ein längeres progressionsfreies Überleben als Patienten, deren

Zellzahl kleiner ist (Abbildung 11). Eine Tendenz in die gleiche Richtung besteht bei der

stromale Zellzahl der Invasionsfront.

32

6.2.4. Dichte der CD68+ Zellen im Verhältnis zum Gesamtüberleben


2 des

Pankreasnormalgewebes im Verhältnis zum Gesamtüberleben in Monaten (p=0,082)

Bei dem Gesamtüberleben besteht die Tendenz, dass Patienten mit einer CD68+ Zellzahl,

die kleiner als der Median ist, länger überleben als Patienten, deren Zellzahl größer als

der Median ist (Abbildung 12). Diese Beobachtung wurde bei dem Stroma des zentralen

Tumors und des Pankreasnormalgewebes sowie bei dem intraepithelialen Bereich der

Invasionsfront und des Pankreasnormalgewebes gemacht.

33

Abbildung 13: Einfluss von CD68

+ Zellen auf das Gesamtüberleben, wenn sowohl

ihre intraepitheliale als auch ihre stromale Zellzahl bei einem Patienten im

Normalgewebe des Pankreas unterhalb des Medians liegt (p=0,026)

Aus der Abbildung 13 geht hervor, dass die Patienten, deren intraepitheliale sowie

stromale CD68+ Zellzahl innerhalb des Pankreas Normalgewebes unterhalb des Medians

liegt, ein längeres Gesamtüberleben vorweisen als die restlichen Patienten. Patienten mit

niedrigen CD68+ Zellzahlen sind gegenüber denen im Vorteil, deren Zellzahl in beiden

Gewebslokalisationen oberhalb des Medians liegt (Abbildung 13).

34

6.2.5. Dichte der CD163+ Zellen im Verhältnis zum frühzeitigen Tumortod


2 der Invasionsfront des

Tumors im Verhältnis zum frühzeitigen Tumortod in Monaten (p=0,075)

Bei der Invasionsfront des Tumors zeigt sich intraepithelial wie stromal die Tendenz,

dass Patienten mit CD163+

Zellzahlen, die kleiner als der Median sind, eher einen

frühzeitigen Tumortod erleiden als Patienten, deren Zellzahl größer als der Median ist

(Abbildung 14).

35


2 des

Pankreasnormalgewebes im Verhältnis zum frühzeitigen Tumortod in Monaten

(p=0,026)

Im stromalen Pankreasnormalgewebe zeigt sich ein gegensätzlicher Unterschied im

Vergleich zu der Invasionsfront. Hier erleiden Patienten mit einer CD163+ Zellzahl, die

größer als der Median ist, eher einen frühzeitigen Tumortod als Patienten mit einer

Zellzahl, die kleiner als der Median ist (Abbildung 15). Im intraepithelialen

Pankreasgewebe zeigt sich nicht der gleiche Unterschied, jedoch besteht eine Tendenz in

die gleiche Richtung.

36



2 der Invasionsfront des

Tumors im Verhältnis zum Gesamtüberleben in Monaten (p=0,018)

Es zeigt sich im Gesamtüberleben ein Unterschied bezüglich der stromalen CD163+

Zellzahl der Invasionsfront. Patienten mit einer Zellzahl, die größer als der Median ist,

überleben länger als Patienten, deren Zellzahl kleiner als der Median ist (Abbildung 16).

Eine Tendenz in die gleiche Richtung zeigt sich intraepithelial im zentralen Tumor.

37


2 des

Pankreasnormalgewebes im Verhältnis zum Gesamtüberleben in Monaten

(p=0,099)

Beim stromalen und intraepithelialen Pankreasnormalgewebe zeigt sich wiederum eine

gegensätzliche Tendenz zu der Invasionsfront. Patienten mit einer kleineren CD163+

Zellzahl als der Median überleben länger als die mit einer höheren Zellzahl (Abbildung

17). Die gleiche Tendenz zeigt sich für die intraepithelialen Gebiete des Normalgewebes.

38

6.2.7. Dichte der FoxP3+ Zellen im Verhältnis zum metastasenfreien Überleben

Abbildung 18: Dichte der intraepithelialen FoxP3+ Zellen pro mm

2 des zentralen

Tumors im Verhältnis zum metastasenfreien Überleben in Monaten (p=0,111)

Patienten, deren FoxP3+ Zellzahl pro mm

2 im zentralen Tumor intraepithelial größer als

der Median ist, überleben tendenziell länger metastasenfrei als Patienten, die dort eine

geringere FoxP3+ Zelldichte als der Median haben (Abbildung 18).

39

6.2.8. Dichte der FoxP3+ Zellen im Verhältnis zum progressionsfreien Überleben


2 der

Invasionsfront des Tumors im Verhältnis zum progressionsfreien Überleben

(p=0,113)

Sowohl im zentralen Tumor als auch in seiner Invasionsfront zeigt sich intraepithelial die

gleiche Tendenz. Patienten mit einer FoxP3+ Zellzahl oberhalb des Medians haben ein

längeres progressionsfreies Überleben, als Patienten, deren Zellzahl darunter liegt

(Abbildung 19). Für das intraepithelial gelegene Gewebe des zentralen Tumors zeigt sich

die gleiche Tendenz.

40

6.2.9. Dichte der FoxP3+ Zellen im Verhältnis zum vorzeitigen Tumortod


2 der

Invasionsfront des Tumors im Verhältnis zum vorzeitigen Tumortod (p=0,05)

41


2 des

Pankreasnormalgewebes im Verhältnis zum vorzeitigen Tumortod (p=0,065)

Patienten mit einer größeren oder kleineren FoxP3+ Zellzahl als der Median im

intraepithelialen Gewebe der Invasionsfront erleiden unterschiedlich schnell den

vorzeitigen Tumortod, wobei diejenigen mit größeren Zellzahl als der Median im Vorteil

sind (Abbildung 20). Kein Unterschied, jedoch dieselbe Tendenz besteht bei der

intraepithelialen FoxP3+ Zellzahl des Pankreasnormalgewebes (Abbildung 21).

42

6.2.10. Dichte von FoxP3+ Zellen im Verhältnis zum Gesamtüberleben


2 der

Invasionsfront des Tumors im Verhältnis zum Gesamtüberleben (p=0,101)

Es zeigt sich die Tendenz, dass Patienten mit einer höheren FoxP3+ Zellzahl als der

Median im intraepithelialen Gewebe der Invasionsfront und des Pankreasnormalgewebes

länger überleben als diejenigen, deren Zellzahl unterhalb des Medians liegt (Abbildung

22, Abbildung 23).

43


2 des

Pankreasnormalgewebes im Verhältnis zum Gesamtüberleben (p=0,135)

44

6.2.11. Dichte der CD8+ Zellen im Verhältnis zum metastasenfreien Überleben


2 des zentralen

Tumors im Verhältnis zum metastasenfreien Überleben (p=0,016)

45


2 des zentralen Tumors im

Verhältnis zum metastasenfreien Überleben (p=0,024)

Das metastasenfreie Überleben für das am Median getrennte Kollektiv weist sowohl

bezüglich der intraepithelialen als auch der stromalen Zellzahl beim zentralen

Tumorgewebe Unterschiede auf. Für beide Gewebslokalisationen gilt, dass eine CD8+

Zellzahl, die größer als der Median ist, mit einem längeren metastasenfreien Überleben

einhergeht als eine kleinere Zellzahl (Abbildung 24, Abbildung 25).

46

6.2.12. Dichte der CD8+ Zellen im Verhältnis zum progressionsfreien Überleben


2 des zentralen

Tumors im Verhältnis zum progressionsfreien Überleben (p=0,026)

47


2 des zentralen Tumors im

Verhältnis zum progressionsfreien Überleben (p=0,038)

Bezüglich des progressionsfreien Überlebens gilt der Unterschied, dass diejenigen

Patienten ein längeres progressionsfreies Überleben haben, deren CD8+

Zellzahl oberhalb

des Medians liegt. Dies gilt für die stromale (Abbildung 27) als auch intraepitheliale

(Abbildung 26) Zellzahl des zentralen Tumors.

48

6.2.13. Dichte der CD8+ Zellen im Verhältnis zum vorzeitigen Tumortod


2 der Invasionsfront

des Tumors im Verhältnis zum vorzeitigen Tumortod (p=0,206)

Es besteht die Tendenz, dass Patienten mit einer CD8+ Zellzahl, die größer als der

Median des Kollektivs ist, im Verhältnis zu denen, die eine geringere Zellzahl aufweisen,

später einen tumorbedingten Tod sterben (Abbildung 28). Diese Tendenz besteht

ebenfalls bei der intraepithelialen Zellzahl des zentralen Tumors.

49

Abbildung 29: Einfluss von CD8+ Zellen auf den frühzeitigen Tumortod, wenn ihre

intraepitheliale Zellzahl bei einem Patienten sowohl im zentralen Tumor als auch in

seiner Invasionsfront oberhalb des Medians liegt (p=0,008)

Aus der Abbildung 29 ist zu erkennen, dass die Patienten, deren intraepitheliale CD8+

Zellzahl sowohl im zentralen Tumor als auch in seiner Invasionsfront oberhalb des

Medians liegt, später einen frühzeitigen tumorbedingten Tod erleiden, als die restlichen

Patienten. Deutlich im Vorteil sind diejenigen, deren Zellzahl in beiden

Gewebslokalisationen oberhalb des Medians liegt.

50


+ Zellen auf den frühzeitigen Tumortod, wenn ihre


seiner Invasionsfront unterhalb des Medians liegt (p=0,004)

In der Abbildung 30 wird das umgekehrte Auftreten der bereits in Abbildung 29

beschrieben Faktoren untersucht. Aus der Abbildung 30 ist zu erkennen, dass zwischen

den Patienten, deren intraepitheliale CD8+ Zellzahl sowohl im zentralen Tumor als auch

in seiner Invasionsfront unterhalb des Medians liegt, und den restlichen Patienten ein

Unterschied bezüglich des tumorbedingten Todes besteht. Die Patienten, deren Zellzahl

in beiden Gewebslokalisationen unterhalb des Medians liegt, sterben eher einen

frühzeitigen Tumortod als Patienten mit einer Zellzahl oberhalb des Medians.

51



2 des zentralen

Tumors im Verhältnis zum Gesamtüberleben (p=0,185)

52


2 der Invasionsfront

des Tumors im Verhältnis zum Gesamtüberleben (p=0,088)

Es besteht bei der intraepithelialen CD8+ Zellzahl sowohl beim zentralen Tumor

(Abbildung 31) als auch bei seiner Invasionsfront (Abbildung 32) die Tendenz, dass

diejenigen Patienten mit einer Zellzahl, die größer als der Median ist, länger überleben als

diejenigen mit einer geringeren Zellzahl.

53


+ Zellen auf das Gesamtüberleben, wenn ihre


seiner Invasionsfront oberhalb des Medians liegt (p=0,021)

Aus der Abbildung 33 ist ersichtlich, dass zwischen den Patienten, deren intraepitheliale

CD8+ Zellzahl sowohl im zentralen Tumor als auch in seiner Invasionsfront oberhalb des

Medians liegt und den restlichen Patienten ein Unterschied im Gesamtüberleben besteht.

Eindeutig im Vorteil sind diejenigen mit einer Zellzahl, die in beiden

Gewebslokalisationen oberhalb des Medians liegt.

54


+ Zellen auf das Gesamtüberleben, wenn ihre


seiner Invasionsfront unterhalb des Medians liegt (p=0,008)


beschrieben Faktoren untersucht. Aus der Abbildung 34 ist ersichtlich, dass zwischen den

Patienten, deren intraepitheliale CD8+ Zellzahl sowohl im zentralen Tumor als auch in

seiner Invasionsfront unterhalb des Medians liegt, und den restlichen Patienten ein

Unterschied im Gesamtüberleben besteht. Die Patienten, deren Zellzahl in beiden

Gewebslokalisationen unterhalb des Medians liegt, haben ein eindeutig geringeres

Gesamtüberleben als Patienten mit einer Zellzahl oberhalb des Medians.

55

6.2.15. Der prognostische Wert von Kombinationen verschiedener Zelltypen aus

verschiedenen Gewebslokalisationen

Abbildung 35: Der Einfluss einer unterhalb des Medians liegenden CD163

+ Zellzahl

im stromalen Normalgewebe und einer oberhalb des Medians liegenden FoxP3+

Zellzahl im intraepithelialen Gebiet der Invasionsfront bei gemeinsamen Auftreten

auf den frühzeitigen tumorbedingten Tod (p=0,075)

Aus der Abbildung 35 ist zu erkennen, dass zwischen den Patienten, deren stromale

CD163+ Zellzahl im Normalgewebe unterhalb des Medians liegt und deren

intraepitheliale FoxP3+ Zellzahl der Invasionsfront oberhalb des Medians liegt, und den

restlichen Patienten eine unterschiedliche Tendenz bezüglich des Auftretens eines

tumorbedingten Todes besteht. Die Patienten mit dem beschriebenen

Zellverteilungsmuster sterben später als die restlichen Patienten einen frühzeitigen

Tumortod.

56

Abbildung 36: Der Einfluss einer oberhalb des Medians liegenden CD163

+ Zellzahl

im stromalen Normalgewebe und einer unterhalb des Medians liegenden FoxP3+

Zellzahl im intraepithelialen Gebiet der Invasionsfront bei gemeinsamen Auftreten

auf den frühzeitigen tumorbedingten Tod. (p=0,023)


beschrieben Faktoren untersucht. Aus der Abbildung 36 ist zu erkennen, dass zwischen

den Patienten, deren stromale CD163+ Zellzahl im Normalgewebe oberhalb des Medians

liegt und deren intraepitheliale FoxP3+ Zellzahl der Invasionsfront unterhalb des Medians

liegt, und den restlichen Patienten ein Unterschied bezüglich des Auftretens eines

tumorbedingten Todes besteht. Die Patienten mit dem beschriebenen

Zellverteilungsmuster sterben früher als die restlichen Patienten einen frühzeitigen

Tumortod.

57

Abbildung 37: Der Einfluss einer unterhalb des Medians liegenden CD68+ Zellzahl

im stromalen Normalgewebe und einer oberhalb des Medians liegenden CD163+

Zellzahl im stromalen Gebiet der Invasionsfront bei gemeinsamen Auftreten auf das

Gesamtüberleben. (p=0,047)

Aus der Abbildung 37 ist zu erkennen, dass zwischen den Patienten, deren stromale

CD68+ Zellzahl im Normalgewebe unterhalb des Medians liegt und deren CD163

+

Zellzahl im stromalen Gebiet der Invasionsfront oberhalb des Medians liegt, und den

restlichen Patienten ein unterschiedlich langes Gesamtüberleben besteht. Die Patienten

mit dem beschriebenen Zellverteilungsmuster leben länger als die restlichen Patienten.

58

Abbildung 38: Der Einfluss von unterhalb des Medians liegenden CD68+ und CD8

+

Zellzahlen im stromalen Gebiet der Invasionsfront des Tumors auf das

Gesamtüberleben in Monaten (p=0,027)

Aus der Abbildung 38 ist zu erkennen, dass im Gesamtüberleben zwischen den Patienten,

deren CD68+ und CD8

+ Zellzahlen im stromalen Gebiet der Invasionsfront des Tumors

unterhalb des Medians liegen, und den restlichen Patienten ein Unterschied besteht. Die

Patienten mit dem beschriebenen Zellverteilungsmuster leben kürzer als die restlichen

Patienten.

59

6.3. Das Tumorstadium als prognostischer Faktor

Abbildung 39: Der Einfluss des Tumorstadiums nach UICC auf das

progressionsfreie Überleben von Pankreaskarzinom Patienten in Monaten p=0,088

Es zeigt sich eine starke Tendenz, dass eine höhere Klassifikation des Tumors einen

negativen Einfluss auf das progressionsfreie Überleben hat (Abbildung 39). Außerdem ist

festzustellen, dass von den verschiedenen Parametern der UICC Klassifikation der

Lymphknotenstatus den stärksten Einfluss auf die Prognose des Patienten hat. Besonders

starken negativen Einfluss hat ein positiver Lymphknotenstatus auf das progressionsfreie

Überleben (Abbildung 40) und auf das metastasenfreie Überleben (Abbildung 41). Die

gleiche Tendenz zeigt sich bei dem Gesamtüberleben (Abbildung 42).

60

Abbildung 40: Der Einfluss des Lymphknotenstatus auf das progressionsfreie

Überleben in Monaten p=0,007

Abbildung 41: Der Einfluss des Lymphknotenstatus auf die metastasenfreie

Überleben in Monaten p=0,014

61

Abbildung 42: Der Einfluss des Lymphknotenstatus auf das Gesamtüberleben in

Monaten p=0,062

62

6.4. Therapieform und Prognose

Abbildung 43: Die neoadiuvante Strahlentherapie sowie andere Therapieformen im

Zusammenhang mit dem Gesamtüberleben (p=0,05)

In allen drei Kaplan - Meier - Kurven ist zu sehen, dass diejenigen Patienten, die eine

neoadiuvante RCT erhielten, gegenüber den Patienten im Vorteil sind, die sich einer

anderen strahlentherapeutischen Behandlungsform unterzogen. Es bestehen Unterschiede

bei dem Gesamtüberleben (Abbildung 43), dem metastasenfreien Überleben (Abbildung

44) und dem progressionsfreien Überleben (Abbildung 45).

63

Abbildung 44: Die neoadiuvante Strahlentherapie sowie andere Therapieformen im

Zusammenhang mit dem metastasenfreien Überleben (p=0,007)

Abbildung 45: Die neoadiuvante Strahlentherapie sowie andere Therapieformen im Zusammenhang mit dem progressionsfreien Überleben (p=0,003)

64

7.1. TAMs als prognostischer Faktor

Der Einfluss von TAM auf verschiedene Entitäten von Malignomen ist sehr

unterschiedlich. Beim Prostatakarzinom konnte gezeigt werden, dass TAMs mit

Lympknotenmetastasen assoziiert sind (Lissbrant et al. 2000). Eine erhöhte

Tumorangiogenese konnte beim Brustkrebs (Tsutsui et al. 2005) und beim

Plattenepithelkarzinom des Oesophagus (Koide et al. 2004) mit einer verstärkten TAM-

Infiltration in Verbindung gebracht werden. Beim Magenkarzinom wurde auf der einen

Seite gezeigt, dass eine hohe Infiltrationsdichte von TAMs mit einer schlechteren

Prognose einhergeht (Ishigami et al. 2003). Auf der anderen Seite wurde gezeigt, dass

eine hohe Anzahl von TAMs das Überleben positiv beeinflusst (Ohno et al. 2003). Beim

Kolorektalkarzinom wurde eine hohe peritumorale Makrophagendichte als prognostisch

günstig angesehen (Funada et al. 2003). Keine Korrelation zwischen Makropagendichte

und Überleben konnte beim Astrozytom (Rossi et al. 1989) festgestellt werden. Es wurde

jedoch bei diesen Studien anscheinend nicht zwischen Makrophagen des M1 und M2

Phänotyps differenziert.

7.1.1. CD68+ Zellen als prognostischer Faktor

In allen drei untersuchten Gewebsformen traten mehr M2 polarisierte als M1 polarisierte

Makrophagen auf. Damit stimmen die Ergebnisse mit denen anderer Autoren überein

(Mantovani et al. 2010). Die Anzahl von M1 polarisierten Makrophagen pro mm2 ist

intraepithelial in den drei verschiedenen Lokalisationen stets höher als stromal. Die

höchste Anzahl CD68+-Zellen ist intraepithelial im zentralen Tumor zu finden, was dafür

spricht, dass das Pankreaskarzinom zu einer Anreicherung dieser Zellen führt (Abbildung

5). Auch in einer anderen Arbeit konnte gezeigt werden, dass im Bereich des Tumors eine

höhere Zahl von CD68+-Zellen

vorhanden ist als im gesunden Gewebe. Ihre höchste

Anzahl wurde jedoch im Stroma der Invasionsfront nachgewiesen (Kurahara et al. 2011).

Die untersuchten Patienten wurden nicht strahlentherapeutisch behandelt, was einen

direkten Vergleich erschwert.

Bei der Betrachtung des prognostischen Wertes von CD68+ Zellen ist zwischen dem

gesunden Pankreasnormalgewebe und dem Tumorgewebe zu unterscheiden. Im

Pankreasnormalgewebe wirkt sich eine Dichte von CD68+-Zellen, die größer ist als der

7. Diskussion

65

Median, nachteilhaft auf das rezidivfreie und das Gesamtüberleben aus. Dies gilt in

beiden Fällen sowohl für das intraepitheliale normale Pankreasdrüsengewebe als auch für

das es umgebende Stroma (Abbildungen 9 und 12). Die beobachteten Unterschiede

wiesen jedoch keine Signifikanz auf. Da bezüglich des Gesamtüberlebens eine Tendenz

in die gleiche Richtung für das stromale wie das intraepitheliale Gebiet des

Normalgewebes besteht, wurden die beiden Faktoren im folgenden Schritt

zusammengeführt. Das Gesamtüberleben der Patienten, die sowohl im intraepithelialen

als auch im stromalen Gebiet des Normalgewebes eine M1 Makrophagendichte unterhalb

des Medians haben, ist signifikant besser (Abbildung 13). Makrophagen des M1

Phänotyps entfalten ihre zytotoxische Wirkung unter anderem durch reaktive

Sauerstoffradikale (ROI) und reaktive Stickstoffintermediate (RNI) (Mantovani et al.

2005). Diese bei chronischen Entzündungen auftretenden Verbindungen bewirken

Schädigungen in der Desoxyribonukleotidsäure (DNS) und sind damit potenziell

mutagen. Die dadurch hervorgerufenen Mutationen fördern die Ent- und

Weiterentwicklung von Neoplasien (Farrow et al. 2002), was die negative Auswirkung

von hohen Makrophagendichten des M1 Phänotyps im Normalgewebe erklären könnte.

Bei an Colitis ulcerosa erkrankten Patienten konnte gezeigt werden, dass das

Tumorsuppressorgen p53 schon in Kolonnormalgewebe signifikant öfter mutiert ist als in

Kolonnormalgewebe von nicht erkrankten Personen. Es konnte ein Zusammenhang zu

dem oxidativen Stress hergestellt werden, dem die Zellen bei chronischen Entzündungen

durch die dabei entstehenden reaktiven Radikalen ausgesetzt sind (Hussain et al. 2000).

Eben diese Mutation im Tumorsuppressorgen p53 zählt zu den beim Pankreaskarzinom

am häufigsten vorkommenden Mutationen. In 75% - 90% der Fälle ist sie nachweisbar

(Chiorean et al. 2015).

Im intraepithelialen Bereich des zentralen Tumors (Abbildung 10) und im

intraepithelialen Bereich sowie im stromalen Bereich der Invasionsfront haben CD68+-

Zellen einen positiven Einfluss auf das metastasenfreie Überleben, wenn die Häufigkeit

ihres Auftretens oberhalb des Medians liegt. Für das progressionsfreie Überleben kann

dieselbe Beobachtung des positiven Einflusses einer hohen Zellzahl für den

intraepithelialen (Abbildung 11) wie für den stromalen Bereich des zentralen Tumors

gemacht werden. Ähnliche Beobachtungen konnten schon in vorangegangenen Arbeiten

bezüglich des Gesamtüberlebens und des progressionsfreien Überleben beim

Pankreaskarzinom gemacht werden (Ino et al. 2013). Der positive Effekt von M1

Makrophagen lässt sich durch ihre proinflammatorische und zytotoxische Wirkung

66

erklären, die es ihnen ermöglicht den Körper gegen Pathogene und Tumorzellen zu

verteidigen (Allavena et al. 2008)

7.1.2. CD163+ Zellen als prognostischer Faktor

Die Anzahl von CD163+-Zellen ist in allen Gewebslokalisationen durchweg höher als die

der CD68+-Zellen, was sich mit den von Ino et al. gemachten Beobachtungen deckt (Ino

2013). Stromal sind durchweg mehr CD163+-Zellen vorhanden als intraepithelial.

Während intraepithelial in den drei Gebieten jeweils eine ähnliche Zellzahl vorliegt,

liegen im stromalen Bereich des zentralen Tumors mehr CD163+-Zellen als in seiner

Invasionsfront und im Normalgewebe des Pankreas (Abbildung 6). Die Beobachtung,

dass im stromalen Gewebe mehr M2 polarisierte Makrophagen liegen als im

intraepithelialen Gebiet, konnte schon von anderen Autoren gezeigt werden (Yoshikawa

et al. 2012).

Bei der Betrachtung des prognostischen Wertes von Makrophagen des M2 Phänotyps ist

wie schon bei dem M1 Phänotyp zwischen gesundem und erkranktem Gewebe zu

unterscheiden. Im Stroma des gesunden Pankreasgewebes wirkt sich eine Zellzahl, die

kleiner als der Median ist, signifikant positiv auf den tumorbedingten Tod aus (Abbildung

15). Das Gesamtüberleben wird in gleicher Weise beeinflusst, wenn die Zellzahl im

stromalen oder intraepithelialen Gebiet des Normalgewebes unterhalb des Medians liegt

(Abbildung 17). Der für den frühzeitigen Tumortod und das Gesamtüberleben

beschriebene Zusammenhang im Pankreasnormalgewebe gilt für das stromale wie

intraepitheliale Gewebe der Invasionsfront des Tumors in umgekehrter Richtung. Hier

wird der frühzeitige Tumortod (Abbildung 14) und das Gesamtüberleben (Abbildung 16)

von einer CD163+-Zellzahl positiv beeinflusst, die größer als der Median ist. Die

Wirkung auf das Gesamtüberleben ist dabei signifikant. Die hier gewonnenen Ergebnisse

widersprechen demnach denen einiger anderer Autoren. In diesen Studien zum

Pankreaskarzinom konnte gezeigt werden, dass eine hohe Zahl von Makrophagen des M2

Phänotyps die Tumorprogression, die Lymphangiogenese und lymphogene

Metastasierung fördern (Kurahara 2011) und das krankheitsfreie Überleben sowie das

Gesamtüberleben negativ beeinflussen (Yoshikawa 2012). Im Hinblick auf diese

Ergebnisse ist jedoch zu beachten, dass weder die von Kurahara et al. noch die von

Yoshikawa et al. untersuchten Patienten eine neoadiuvante Therapie erhielten, sondern

primär einer Resektion unterzogen wurden.

67

Beim Kolorektalkarzinom kam Edin et al. zu ähnlichen Ergebnissen wie in dieser Arbeit.

Auch hier waren M1 polarisierte Makrophagen mit einer verbesserten Prognose

verbunden. Bemerkenswert ist, dass hohe Infiltrationsdichten von M1 polarisierten

Makrophagen mit ebenfalls erhöhten Infiltrationsdichten von M2 polarisierten

Makrophagen assoziiert waren. Das Verhältnis zwischen M1 und M2 Makrophagen hatte

jedoch keinen Einfluss auf die Prognose der Patienten. Edin et al. gehen deshalb davon

aus, dass zumindestens beim Kolorektalkarzinom die M1 Makrophagen die M2

Makrophagen funktionell dominieren (Edin et al. 2013). Über die Gründe für den

positiven Einfluss der M2 polarisierten Makrophagen beim Pankreaskarzinom lässt sich

nur spekulieren. Als wahrscheinlich gilt jedoch, dass sich die verschiedenen Karzinome

in ihrem inflammatorischen Milieu unterscheiden und allgemeingültige Aussagen

hinsichtlich M2 polarisierten Makrophagen im Bezug auf ihre Rolle bei Karzinomen

vorsichtiger gemacht werden sollten. Im Bezug auf das M1/M2-Makrophagenkonzept

scheint eine stärkere Differenzierung zwischen den einzelnen Karzinomentitäten sinnvoll

zu sein.

Abschließend ist anzumerken, dass sich die M1 und M2 Phänotypen der Makrophagen in

weitere Subgruppen aufgliedern, deren Funktion nicht endgültig geklärt ist. Durch die

Verwendung einzelner immunhistologischer Marker lassen sich diese Untergruppen nur

unzureichend differenzieren, auch wenn sich das reine M1/M2-Konzept bei

verschiedenen Karzinomen als plausibel erwiesen hat (Niedobitek et al. 2015).

7.2. TIL als prognostischer Faktor

7.2.1. FoxP3+

Zellen als prognostischer Faktor

Die Bedeutung von Treg bei Malignomerkrankungen ist nicht genau geklärt, da sich die

Ergebnisse verschiedener Arbeiten stark unterscheiden. Beim Brustkrebs wird berichtet,

dass eine hohe Treg-Dichte die Prognose verschlechtern (Yan et al. 2011), nicht

beeinflussen (Mahmoud et al. 2011) oder verbessern (Ladoire et al. 2011) kann. Auch

beim Magenkarzinom zeigen Ergebnisse, dass eine hohe intratumorale Treg-Dichte die

Prognose ungünstig beeinflusst (Shen et al. 2010), wohingegen eine hohe stromale Treg-

Dichte die Prognose günstig beeinflusst (Haas et al. 2009). Beim analen

Plattenepithelkarzinom wurde beobachtet, dass Tregs keinen Einfluss auf die Prognose

haben (Grabenbauer et al. 2006).

68

Die Zellverteilung der Tregs beim Pankreaskarzinom zwischen dem intraepithelialen und

stromalen Gebiet weist bei allen drei Lokalisationen einen klaren Unterschied zugunsten

des stromalen Gebietes auf, denn stromal sind die Zellzahlen durchweg höher. Die

höchste stromale Dichte von FoxP3+-Zellen liegt im zentralen Tumor vor, während im

Normalgewebe am wenigsten Zellen vorhanden sind. Im intraepithelialen Bereich sind

die Zelldichten vom zentralen Tumor und der Invasionsfront etwa gleich hoch, im

Normalgewebe sind deutlich weniger Tregs vorhanden (Abbildung 7). Die Zellverteilung

lässt den Rückschluss zu, dass das Tumorgeschehen zu einer erhöhten Dichte von

FoxP3+-Tregs führt. Die Ergebnisse dieser Arbeit bezüglich des prognostischen Wertes

von Tregs haben gezeigt, dass eine Dichte von FoxP3+-Zellen, die größer als der Median

ist, durchweg einen positiven Einfluss auf die verschiedenen klinischen Faktoren hat. Die

Rolle der stromal gelegenen Treg scheint dabei von untergeordneter Bedeutung zu sein,

da sich alle Ergebnisse nur bei den intraepithelialen Gebieten zeigen. Eine Zellzahl im

zentralen Tumor, die größer als der Median ist, hat positiven Einfluss auf das

metastasenfreie (Abbildung 18) und das progressionsfreie Überleben. Wenn die

Zelldichte im Gebiet der Invasionsfront oberhalb des Medians liegt, beeinflusst sie das

progressionsfreie Überleben (Abbildung 19), den frühzeitigen Tumortod signifikant

(Abbildung 20) und das Gesamtüberleben positiv (Abbildung 22). Der frühzeitige

Tumortod (Abbildung 21) und das Gesamtüberleben (Abbildung 23) werden von der

gleichen Zellverteilung im Normalgewebe positiv beeinflusst.

In andern Studien zum Pankreaskarzinom wurde der entgegengesetzte Effekt gezeigt,

hohe Treg-Dichten waren mit einem vermindertem Überleben, mehr

Lymphknotenmetastasen und einem hohem Entdifferenzierungsgrad des Tumors

verbunden (Hiraoka et al. 2006). Auch Zhang et al. konnten zeigen, dass hohe FoxP3+-

Zelldichten mit einer schlechten Differenzierung des Tumors und einem vermindertem

Überleben der Patienten assoziiert waren (Zhang et al. 2015). Eine Erklärung für diesen

negativen Einfluss der Treg auf die Prognose von Tumoren ist ihre das Immunsystem

supprimierende Wirkung. Sie unterdrücken die Antwort der Effektorzellen auf die von

den Tumorzellen präsentierten tumorspezifischen Antigenen und helfen dem Tumor so

vom Immunsystem unerkannt zu bleiben (Oleinika et al. 2013).

Wie schon bei den CD163+-Makrophagen gibt es auch beim kolorektalen Karzinom

bezüglich der Treg Ergebnisse, die sich mit denen dieser Arbeit decken. Hohe Dichten

von FoxP3+-Zellen waren ebenfalls mit einer besseren Prognose verbunden (Hanke et al.

2015; Salama et al. 2009). Ein möglicher Erklärungsansatz von Correale et al. ist, dass

eine erhöhte Treg Infiltration ein indirekter Indikator für eine starke lokale Immunantwort

69

auf den Tumor sein könnte (Correale et al. 2010). Die antitumorös wirksamen

Bestandteile des Immunsystems würden somit durch ihre erhöhte Aktivität, die die

bessere Prognose der Patienten bedingt, gleichzeitig zu einer höheren Treg Dichte führen.

Bei den in dieser Arbeit betrachteten Patienten hatten 65% eine gleichsinnige Dichte von

Treg - und zytotoxischen T-Zellen, das heißt beide Zellreihen waren entweder größer

oder kleiner als der Median. Bei 35% der Patienten traten beide Zelltypen nicht

gleichsinnig häufig auf. Ein anderer möglicher Erklärungsansatz für diese Beobachtungen

ist die antiinflammatorische Wirkung von Tregs. Ein exzessiver Entzündungsprozess ist

potenziell karzinogen und die normale physiologische Kontrollfunktion der Treg kann

unter diesen Umständen ihren positiven Einfluss erklären. Zu beachten ist jedoch, dass

dieses Erklärungsmodell eher auf die frühen Stadien der Karzinogenese anzuwenden ist

(Whiteside 2012). Eventuell erklärt dieses Modell den positiven Einfluss der Treg beim

Pankreaskarzinom, scheint doch die Inflammation in Form der chronischen Pankreatitis

keine unerhebliche Rolle in der Pathogenese dieses Karzinoms zu spielen (Pinho et al.

2014). Es ist also anzunehmen, dass die chronische Entzündung ein Faktor ist, der zu

Mutationen führt, welche letztendlich eine gesunde Zelle in eine maligne Gründungszelle

des Karzinoms transformieren. Danach setzt sich die genetische Evolution der malignen

Zellen jedoch fort, weitere Progressormutationen befähigen die betreffende Zelle

beispielsweise zur Metastasierung oder Immunsuppression (Yachida et al. 2013).

Vielleicht reduzieren die Treg den inflammatorischen Prozess auch im späterem Stadium

des Tumors und damit ebenso die potenziell mutagenen Wirkung der chronischen

Entzündung, was das Auftreten von Progressormutationen verzögern könnte.

Bei der Interpretation der Ergebnisse ist zu berücksichtigen, dass der Transkriptionsfaktor

FoxP3 zwar spezifisch für Treg ist, aber nicht der Komplexität der vielen verschiedenen

Subphänotypen der FoxP3+ Zellen gerecht wird, die unterschiedliche Funktionen haben

können (Feuerer et al. 2009). Deleeuw et al. schlägt deshalb vor, dass zur besseren

Identifizierung der verschiedenen funktionalen Subgruppen der Treg und deren

prognostischer Relevanz mehrere immunhistologische Marker eingesetzt werden sollten

(deLeeuw 2012).

7.2.2. CD8+

Zellen als prognostischer Faktor

In zahlreichen Studien konnte der positive Einfluss von zytotoxischen CD8+ Zellen auf

die Prognose von Karzinomerkrankungen gezeigt werden, wie bei Nichtkleinzelligem-

Lungenkrebs (Zhuang et al. 2010), Ovarialkarzinom (Sato et al. 2005),

70

Oesophagealkarzinom (Schumacher et al. 2001), Plattenepithelkarzinom des Analkanals

(Grabenbauer 2006) oder Magenkrebs (Lee et al. 2008).

Die Zellverteilung der CD8+ Zellen beim Pankreaskarzinom weist klare Tendenzen auf.

In dem stromalen Bereich der Invasionsfront, dem des Pankreasnormalgewebes und dem

des zentralen Tumors sind mehr Zellen als intraepithelial gelegen. Während um den

zentralen Tumor stromal die insgesamt höchste Anzahl von Zellen vorhanden ist, liegen

intraepithelial im zentralen Tumor am wenigsten Zellen von allen untersuchten

Gewebslokalitäten (Abbildung 9). Diese Beobachtungen stützen die Hypothese von

Bernstorff et al., dass sich der Tumor der Immunüberwachung durch die CD8+ Zellen zu

entziehen scheint. Von Bernstorrf et al. beschreiben, dass sich TIL weniger in dem

Tumorgewebe selbst als in dem ihn umgebenden Gewebe befanden. Als Gründe für diese

Beobachtung wurde die Sekretion von immunsuppressiven Zytokinen wie Interleukin-10

und transforming-groth-factor beta 1/2 sowie der Verlust der CD3-ζ - Kette der T-

Lymphozyten genannt. Dies verhindert den Kontakt zwischen der zytotoxischer T- Zelle

und der Tumorzelle und unterbindet die zytotoxische Funktion der T-Lymphozyten (von

Bernstorff et al. 2001). Ademmer et al. haben ebenfalls die Verteilung von T-

Lymphozyten zwischen den verschiedenen Gewebslokalisationen untersucht und kamen

ebenso zu dem Ergebnis, dass sich die meisten T-Zellen in dem den Tumor umgebenden

Gewebe befinden und wenige im intraepithelialen Bereich (Ademmer et al. 1998)

Der Einfluss von CD8+Lymphozyten auf die verschiedenen klinischen Parameter ist

durchweg positiv, wenn ihre Anzahl in den entsprechenden Gewebslokalisationen

oberhalb des Medians liegt. Eine hohe intraepitheliale (Abbildungen 24; 26) als auch

stromale (Abbildungen 25; 27) Zellzahl im zentralen Tumor beeinflusst das

progressionsfreie und metastasenfreie Überleben signifikant positiv. Eine Tendenz in die

gleiche Richtung lässt sich für den intraepithelialen Bereich des zentralen Tumors und

seiner Invasionsfront im Bezug auf den frühzeitigen Tumortod (Abbildung 28) und das

Gesamtüberleben (Abbildungen 31; 32) beobachten. Um die prognostische Aussagekraft

für den frühzeitigen Tumortod und das Gesamtüberleben zu verbessern, wurden nun

Gruppen von Patienten gebildet, die im intraepithelialen Bereich sowohl im zentralen

Tumor als auch in seiner Invasionsfront die gleiche Zellverteilung vorweisen. Dadurch

konnte ein signifikanter Vorteil gegenüber den restlichen Patienten beim frühzeitigen

Tumortod (Abbildung 29) und dem Gesamtüberleben (Abbildung 30) für diejenigen

Patienten gezeigt werden, deren intraepitheliale Zellzahl sowohl im zentralen Tumor als

auch in seiner Invasionsfront oberhalb des Medians liegt. Von noch stärkerem

prognostischen Wert ist das umgekehrte Auftreten dieser beiden Merkmale. Patienten, die

71

intraepithelial sowohl im zentralen Tumor (Abbildung 30) als auch in seiner

Invasionsfront (Abbildung 34) eine unterhalb des Medians liegende Zellzahl von

zytotoxischen Lymphozyten vorweisen, sind im besonderem Maße im Nachteil. Sie

erleiden signifikant früher einen tumorbedingten Tod und haben ein signifikant kürzeres

Gesamtüberleben. Zwischen der CD8+ zytotoxischen T-Zellzahl im Normalgewebe und

einem der klinischen Parameter ist kein Zusammenhang nachweisbar.

Eine Erklärung für den offensichtlich positiven Einfluss der zytotoxischen T-Zellen ist

deren Fähigkeit Tumorzellen zu töten. Antigen-präsentierende-Zellen präsentieren den T-

Zellen tumorspezifische Antigene. Die entsprechenden CD8+ T-Zellen differenzieren zu

zytotoxischen T-Zellen, die die Tumorzellen angreifen können (Smyth et al. 2001). Die

Beobachtung, dass CD8+-Zellen einen positiven Einfluss auf die Prognose vom

Pankreaskarzinom haben, wurde von verschieden Autoren nachgewiesen. Kim et al.

sowie Fukunaga et al. konnten einen positiven Zusammenhang zwischen CD8+-Zellen

und dem Gesamtüberleben feststellen (Fukunaga et al. 2004; Kim 2007).

7.3. Immunmodulatorischer Therapieansatz

Die Wirkung der verschiedenen Subgruppen von TIL und TAM auf das

Pankreaskarzinom haben zu vielen Hypothesen und Untersuchungen zu

immunmodulatorischen Therapieansätzen geführt.

Die mögliche Rolle von TAM als Ziel einer immunmodulatorischen Therapie ist aktuell

weitestgehend unklar. Vonderheide et al. konnten in einem Mausmodell zeigen, dass die

Aktivierung von TAM des Pankreaskarzinoms mit einem agonistisch wirkenden

Antikörper gegen CD40 eine Tumorregression förderte. Er begründet diese Beobachtung

damit, der agonistische CD40 Antikörper eine Umwandlung von tumorfördernden

Makrophagen zu M1 Makrophagen gefördert haben könnte (Vonderheide et al. 2013).

Beatty et al. konnten zeigen, dass CD40 aktivierte Makrophagen das Pankreaskarzinom

schnell infiltrieren und in der Maus wie im Menschen antitumorös wirkten (Beatty et al.

2011). Die hier gemachten Ergebnisse stützen einerseits die Theorie, dass sich eine

erhöhte Dichte von proinflammatorischen M1 Makrophagen im Tumorgewebe positiv

auswirken könnte, andererseits haben hier die antiinflammatorischen Makrophagen des

M2-Phänotyps auch einen positiven Einfluss auf die Prognose. Ein Wechsel des

Phänotyps könnte also nicht nur positive Folgen haben. Bei den systemisch wirkenden

Antikörpern ist außerdem zu beachten, dass hohe Dichten von M1 Makrophagen nach

72

den Ergebnissen dieser Arbeit im Normalgewebe des Pankreas ein negativer

prognostischer Faktor für das Gesamtüberleben sind. Somit könnte eine starke

Aktivierung der proinflammatorischen Makrophagen auch nachteilhafte Auswirkungen

haben.

Die immunsupprimierende Wirkung von Treg begründet die Überlegung, dass sie eine

den Tumorprogress fördernde Wirkung hätten. Diese Hypothese wird auch von den

bisherigen Ergebnissen zu der Rolle von Treg beim Pankreaskarzinom unterstützt

(Hiraoka 2006; Zhang 2015). Im Mausmodell konnte nachgewiesen werden, dass eine

Depletion von CD4+CD25

+-Treg die tumorspezifische Immunantwort verstärkt hat und

damit ein therapeutischer Ansatz sein könnte (Viehl et al. 2006). Im Hinblick auf die hier

gewonnen Ergebnisse wirft dieser Ansatz jedoch Fragen auf. Ghansah et al. haben die

Depletion von Treg ebenfalls im Mausmodell untersucht. Sie konnten keinen

signifikanten Effekt auf das Tumorwachstum oder das Überleben nachweisen (Ghansah

et al. 2013). Die genaue Wechselwirkung von Treg, den anderen TIL und TAM und dem

Karzinom muss noch weiter erforscht werden, um hier sichere Aussagen treffen zu

können.

Der mehrfach bewiesene positive Einfluss von CD8+ zytotoxischen Zellen hat auch diese

in den Fokus neuer immunmodulatorischer Therapien gerückt. Ein möglicher Ansatz zur

Verstärkung der Wirkung der zytotoxischen T-Lymphozyten ist die Impfung mit

Pankreaskarzinom-spezifischen Antigenen. Als diese Antigene können Peptide oder

deren Fragmente, DNS und RNS (Ribonukleotidsäure) fungieren (Sideras et al. 2014).

Eine Impfung bei resezierten Pankreaskarzinompatienten gegen das mutierte K-ras

Protein hat zu einer Verbesserung des Langzeit-Überlebens geführt und könnte in

Zukunft eine Rolle als adiuvante Therapie spielen (Weden et al. 2011). Ein anderer

Ansatz ist die adoptive Immuntherapie. Kawaoka et al. haben dabei an

Bauchspeicheldrüsenkrebs erkrankten Patienten mononukleäre Zellen des peripheren

Blutes entnommen und diese zu zytotoxischen T-Lymphozyten kultiviert, die spezifisch

gegen ein vom Karzinom exprimiertes Antigen gerichtet waren. Diese autologen

zytotoxischen T-Lymphozyten wurden nach der Resektion des Pankreaskarzinoms in den

Kreislauf des jeweiligen Patienten zurückgegeben. Die Häufigkeit des Auftretens von

hepatischen Metastasen konnte so signifikant verringert werden (Kawaoka et al. 2008).

73

7.4. Die Therapieentscheidung anhand der Klassifikation

Ein wichtiger Faktor um das richtige Therapieregime für jeden einzelnen Patienten finden

zu können ist die Einstufung seiner Krankheit in das TNM- und das UICC-System. Das

TNM- und das UICC-System bieten die Möglichkeit die Ausdehnung des

Pankreaskarzinoms in vergleichbare Gruppen einzuteilen und sind somit wichtige

prognostische Faktoren für viele verschiedene klinische Parameter (Bilimoria 2007; Buc

et al. 2014; Katz et al. 2008a). Auch die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen den hohen

prognostischen Wert der beiden aufeinander basierenden Klassifikationen. Für das

Tumorstadium nach UICC kann in dieser Arbeit gezeigt werden, dass ein höheres

Stadium mit einem verringerten progressionsfreien Überleben verbunden ist (Abbildung

39). Als stärkster prognostischer Faktor in der TNM-Klassifikation hat sich der

Lymphknotenstatus erwiesen. Lympfknotenmetastasen wirken sich tendenziell negativ

auf das Gesamtüberleben aus (Abbildung 42) und haben einen signifikant negativen

Einfluss auf das progressionsfreie (Abbildung 40) und das metastasenfreie Überleben

(Abbildung 41). Der positive prognostische Wert einer niedrigen Einstufung der

Krankheit in der TNM Klassifikation wird durch die sich dadurch ergebenen

Therapieoptionen noch verstärkt. So haben die Patienten, die einer neoadiuvanten RCT

und einer erfolgreichen Resektion des Tumors unterzogen wurden, ein signifikant

besseres Gesamtüberleben (Abbildung 43), metastasenfreies (Abbildung 44) und

progressionsfreies Überleben (Abbildung 45) gegenüber den restlichen

strahlentherapeutisch behandelten Patienten.

Die TNM-Klassifikation bildet also die Prognose wie auch die Ausdehnung des

Pankreaskarzinoms des Patienten optimal ab und ermöglicht es, dem Patienten das für ihn

beste Therapieregime anbieten zu können. Es gibt jedoch auch Situationen, in denen das

TNM - System wie bei borderline-resektablen Pankreaskarzinomen an seine Grenzen

stößt. Für diese Patientengruppe existiert noch kein festgelegtes Therapieschema (Katz et

al. 2008b). Hier wäre es im klinischen Alltag wünschenswert, weitere prognostische

Faktoren in die Überlegung bezüglich der optimalen individuellen Therapie mit

einbeziehen zu können.

74

7.5. Die Implementierung immunologischer Faktoren ins TNM - System

Der hohe prognostische Wert von immunologischen Faktoren hat beim

Kolorektalkarzinom bereits zu der Überlegung geführt, das TNM-System um einen so

genannten „Immonoscore“ zu erweitern. Es wird vorgeschlagen, dass zwei lymphozytäre

Zelltypen jeweils im zentralen Tumor und in der Invasionsfront in einer vierstufigen

Skala aufgeteilt werden sollten. Ein „Immunoscore 0“ würde bedeuten, dass in beiden

Gewebslokalisationen beide Zelltypen in niedrigen Dichten vorliegen würden, bei einem

„Immunoscore 4“ würden von beiden Zelltypen eine hohe Dichten vorliegen (Galon et al.

2014). Ein ähnliches Modell wäre auch für das Pankreaskarzinom denkbar, weil auch hier

die Kombination von verschiedenen Immunzelltypen oder Gewebslokalisationen den

höchsten prognostischen Wert hat. Bei der isolierten Betrachtung des prognostischen

Wertes der CD8+ zytotoxischen Lymphozytenzahl im intraepithelialen Bereich des

zentralen Tumors und seiner Invasionsfront bezüglich des frühzeitigen Tumortodes

(Abbildung 28) und des Gesamtüberlebens (Abbildungen 31; 32) können nur Tendenzen

festgestellt werden. Die kombinierte Betrachtung dieses Zelltyps in den gleichen

Gewebslokalisationen hingegen zeigt eine Signifikanz des „Immunosore 0“ (Abbildungen

30; 34), bei dem die Zellzahl in beiden Gewebslokalisationen unterhalb des Medians

liegt, und dem „Immunoscore 4“, bei dem die Zellzahl in beiden Lokalisationen oberhalb

des Medians liegt (Abbildungen 29; 30).

Das „Immunoscore“ Modell von Galon et al. verwendet zwei unterschiedliche Typen von

Lymphozyten, in dem vorangegangenen Beispiel wird jedoch nur ein Zelltyp

berücksichtigt. Die Berücksichtigung eines zweiten lymphozytären Zelltyps im Rahmen

des Modells könnte die prognostische Aussagekraft auch beim Pankreaskarzinom weiter

verbessern. Die Möglichkeit dies zu untersuchen wird jedoch durch die geringe Größe

des hier untersuchten Kollektivs limitiert. Die Kombination der Häufigkeit zweier

verschiedener Zelltypen zur Erhöhung ihres prognostischen Wertes scheint jedoch auch

beim Pankreaskarzinom sinnvoll. Hinsichtlich des frühzeitigen Tumortodes erweist sich

die Kombination aus der Zellzahl von M1 Makrophagen im stromalen Normalgewebe

und von Tregs im intraepithelialen Bereich der Invasionsfront als sinnvoll. Wenn sich die

Anzahl der M1 Makrophagen unterhalb des Medians befindet und die Treg Zahl oberhalb

des Medians, so wirkt sich dies tendenziell positiv auf den frühzeitigen Tumortod aus

(Abbildung 35). Ist das Verhältnis umgekehrt, erleiden die entsprechenden Patienten

signifikant später einen frühzeitigen Tumortod (Abbildung 36). Auch im Hinblick auf das

Gesamtüberleben sind Kombinationen verschiedener Zelltypen und Gewebe-

lokalisationen sinnvoll. Eine hohe Zellzahl von M1 Makrophagen in der Invasionsfront

75

und eine niedrige von M2 Makrophagen im Normalgewebe im jeweiligen stromalen

Bereich haben einen signifikant positiven Einfluss (Abbildung 37). Einen signifikant

negativen Einfluss hat eine hohe M1 Makrophagendichte im stromalen Normalgewebe in

Kombination mit einer niedrigen Dichte von zytotoxischen T-Lymphozyten

intraepithelialen Bereich der Invasionsfront (Abbildung 38).

Das „Immunoscore“ Modell wird ebenfalls der wachsenden Bedeutung der

immunmodulatorischen Karzinomtherapie gerecht. Das komplexe System der TIL und

TAM bietet viele unterschiedliche Möglichkeiten zum Eingreifen. Es wird sich in

Zukunft die Frage stellen, von welchem der immunmodulatorischen Therapieansätzen der

einzelne Patient am meisten profitiert, weil sich die Infiltrationsmuster von TIL und TAM

individuell stark unterschieden können. So könnte der „Immunoscore“ gegebenenfalls die

Wirksamkeit von verschiedenen immunmodulatorischen Therapien vorhersagen (Angell

et al. 2013).

Unter Berücksichtigung der in dieser Arbeit gewonnen Ergebnisse und dem aktuellen

wissenschaftlichen Kenntnisstand scheint es prinzipiell sinnvoll, das etablierte TNM-

System um immunologische Faktoren zu erweitern. In Zukunft könnte diesen Faktoren

eine wachsende Bedeutung zu Teil werden, da sie, ähnlich wie es heute mit dem TNM-

System praktiziert wird, als prognostische Faktoren und Therapieentscheidungshilfen

fungieren könnten. Gleichzeitig demonstrieren die oft widersprüchlichen Ergebnisse zum

prognostischen Wert der verschiedenen immunologischen Faktoren, dass bis zur

klinischen Anwendung noch viel Forschung zu betreiben ist. Die beste zukünftige Lösung

könnte die Kombination des TNM - Systems mit immunologischen Faktoren sein.

76

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85

TIL - Tumor - infiltrierenden - Lymphozyten

TAM - Tumor - assoziierten - Makrophagen

FoxP3 - Forkhead Box Protein P3

UICC - Union internationale contre le cancer

TMA - Tissue-Microarrays

CD - Cluster of differentiation

Treg - Regulatorische T-Lymphozyten

CT - Computertomographie

MRT - Magnetresonanztomographie

MRCP - Magnetresonanz – Cholangiopankreatikographie

ERCP - Endoskopische Cholangiopankreatikographie

CA19-9 - Carboanhydrat 19-9

CA125 - Cancer-Antigen 125

CEA - Carcinoembryonales Antigen

NCCN - National Comprehensive Cancer Network

EGFR - epidermal groth factor receptor

RCT - Radio-Chemo-Therapie

HLA - humanen Leukozyten Antigen

IFN-γ - Interferon-γ

CSF-1 - Colony - Stimulating - Factor - 1

VEGF - Vascular - Endothelial - Groth - Factor

TNF - Tumornekrosefaktor

HE - Hämatoxylin-Eosin

ROI - Reaktive Sauerstoffradikale

RNI - Reaktive Stickstoffradikale

DNS - Desoxyribonukleotidsäure

RNS - Ribonukleotidsäure

9. Abkürzungsverzeichnis

86

Ich möchte an dieser Stelle allen meinen Dank aussprechen, die durch ihre Hilfe zur

Fertigstellung dieser Arbeit beigetragen haben.

Herrn Prof. Dr. med. Rainer Fietkau danke ich, da er mir ermöglichte, an seiner Klinik

meine Dissertation zu schreiben.

Meinen beiden persönlichen Betreuern Herrn PD Dr. Luitpold Distel sowie Herrn Dr.

Markus Hecht möchte ich ebenso meinen Dank aussprechen, da sie bei allen meinen

Fragen stets ausgesprochen hilfsbereit und geduldig waren.

Frau Dr. Katharina Erlenbach-Wünsch (Pathologisches Institut der Universität Erlangen-

Nürnberg) hat mir bei Fragen bezüglich der Pathologie geholfen, weswegen ich mich

auch bei ihr bedanken möchte.

Außerdem möchte ich mich bei meiner Freundin Nadine für ihre Geduld und Hilfe

bedanken, genauso wie bei meiner Schwester Anna, die die formale Korrektur meiner

Arbeit vorgenommen hat.

Im besonderen Maße möchte ich meinen Eltern meinen Dank aussprechen, da Sie mich

während der Höhen und Tiefen meins Studiums in jeder Form begleitet und unterstützt

haben und mich damit erst in die Situation gebracht haben diese Arbeit zu schreiben und

erfolgreich abschließen zu können. Ihnen ist diese Arbeit gewidmet.

10. Danksagung

87

Persönliche Daten

Name: Hanno Zoske

Geburtsdatum/ –ort: 08.06.1988, Salzgitter

Familienstand: ledig

Staatsangehörigkeit: deutsch

Schulische Ausbildung

1995 – 1999 Adolf Reichwein Grundschule Göttingen

1999 – 1998 Bertolt - Brecht Orientierungsschule Göttingen

1997 – 2007 Hainberggymnasium Göttingen

Abschluss: Allgemeine Hochschulreife

Akademische Ausbildung

04/2008 – 05/2015 Studium der Humanmedizin an der

Friedrich Alexander Universität (FAU) Erlangen-Nürnberg

29.05.2015 Approbation als Arzt

Praktische Erfahrungen

2007 – 2008 Zivildienst an der Universitätsmedizin Göttingen

11/2011 – 12/2013 Studentische Hilfskraft an der Strahlenklinik Erlangen

12/2014 – 04/2015 Strahlenklinik, FAU Erlangen-Nürnberg

seit 11/2015 Assistenzarzt in der Strahlenklinik des Universitätsklinikums

Erlangen-Nürnberg

11. Lebenslauf

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