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Tom Goldammer, Marieke Verleih,

Alexander Rebl, Ronald Brunner

und Kooperationspartner

DEUTSCHER FISCHEREITAG

Lübeck, 28.-30.August 2018

Die Regenbogenforelle – Regionale Zucht und genetische Vielfalt versus Importfisch

2

Inhalt

• Regenbogenforellenproduktion - Standorte

• Zuchtlinien BORN und IMPORT

• Genombasierte Messmethoden

• Molekulargenetische Faktoren der Anpassung

• Produktionsleistungen im Vergleich

• Zusammenfassung und Fazit

• Gedanken und Ausblicke

3

• Wie wollen wir Fische produzieren?

• Welches Maß an Umweltbelastung halten wir für vertretbar?

• Ist es legitim, vermeintliche oder tatsächliche Probleme der

Aquakultur in ferne Länder zu exportieren?

Fachforum Aquakultur der DAFA (2014)

Kiel voli vi ninfabriki?

Nachhaltigkeit der Regenbogenforellenproduktion

4

Unklar:

• Wie viele Betriebe nutzen eigene Laicherstämme?

• Wie viele Betriebe importieren sterile Augenpunkteier?

• Ist die Erbrütung und Aufzucht von Importfischen ökologisch?

• Welche genetischen Ressourcen besitzt Deutschland?

Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss)

• Produktionsbetriebe: 1045

• davon 29 ökologisch bewirtschaftet

• Erzeugte Menge: ca. 6800 t im Jahr 2017 ≙ 35 %

• 208 Betriebe > 5 t mit insgesamt 6150 t Produktion (90 %)

• z.B. B-W: 31 Betriebe > 5 t mit insgesamt 1800 t (96 %) – im Mittel ca. 60 t

MV5

73t

SH5

?t

Sl1?t

RP25

340t

B 571

1640t

BW84

1867t

Bb10

187t

H42

348t

Th43

476t

S50

152t

SA11

324tNRW112888t

NS86

423t

Deutschland Regenbogenforellenproduktion 2017

Destatis 2018 – Erzeugung in Aquakulturbetrieben - FS3 R4.6 – 2017

Betriebe und Produktionsleistung

5

fischzucht-stoerk.de/forellenzucht

Regionale Produktion von Regenbogenforellen

„Außerdem sind wir einer der führenden Anbieter für Forelleneier in Deutschland.“

• 76 Betriebe mit Brut- und Aufzuchtanlagen – (unverbindlich) Laich, ca. 11 Mio Eier

• Wieviel davon von eigenen regionalen Laicherstämmen?

• Verkauf von fertilen Regenbogenforelleneiern?

• Regionale genetische Ressourcen vorhanden – Wie viele?

• Züchterische Anpassung an regionale Umwelten seit X? Generationen

• Basis für familiengestützte Selektion von Forellen grundsätzlich vorhanden

Ein positives Beispiel:

6

Importfisch konfrontiert mit unbekannten regionalen Stressoren:• differente Habitate, • Wasserqualitäten, • Pathogene, Keime, Gifte, • Futtermittel, Handling etc.

www.troutlodge.com

Globaler Export/Import von Regenbogenforellen

• 500.000.000 Eier pro Jahr• Rein weiblich XX steril oder• triploid 3x=90 Chromosomen• nur wenige Genpools• Export in ca. 70 Länder

World’s leading producer of eyed trout eggs

7

Geschlossene Kreislaufanlagen recirculating aquaculture system, RAS

Durchflussanlagenraceways/flow-through systems

Netzgehege- oder Käfiganlagen cage or net pen culture

Teichwirtschaftpond culture

fjordkrone.de/de/haltungsformen-aquakultur/

Fotos privat oder freie Quellen

Verschiedene Haltungsumwelten für eine Fischart

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Zucht in neuem Lebensraum - Ostsee-Ästuare, BrackwasserMin. 0°C - Monatsdurchschnitt 3-24°C - Max. 28°C

Wasserqualität: Trüb, hohe Keimbelastung

Selektion auf lokales Überleben

Zucht im natürlichen Lebensraum – Gebirgsflüsse/-seenMin. 5°C - Monatsdurchschnitt 8-22°C - Max. 25°C

Wasserqualität: Klar, keimarm

Selektion auf WachstumModerat

8°C - 15°C - 23°C

Kälteschock5°C - 0°C

Sommerhitze20°C - 27°C

Infektion/Stimul.A. salmonicida

Kein Stress

BrackwasserSeewasser

FlusswasserGrundwasser

Stamm IMPORT

Lokaler Stamm BORN

Temperatur

Besatzdichte

Pathogene

Haltungs-umwelt

adaptiert

nicht adaptiert

Vergleich differenter Zuchtlinien in regionaler Aquakultur

BORN-Forelle

IMPORT-Forelle

HochModeratGering

9

Fingerlinge im Anzuchtbecken

Optimale HaltungsbedingungenKriterien:Trinkwasser, Temperatur 12-18°C

Zucht/SelektionKriterien:

• Brackwasser, eutroph, hohe Keimbelastung • stärker schwankende Temperaturen 0-28°C

Fingerlinge in Rinnen der Kaltwasseranlage Born

evolviertes Adaptationspotential

Regionale Zuchtlinie BORN wurde züchterisch/genetisch angepasst.

Evolviertes Adaptationspotential / Genomausstattung

10Darstellungen modifiziert nach E. Anders (1983) Diss. 160pp)

Üb

erle

ben

de

Fore

llen

[n] 81,3

24,5

0

20

40

60

80

100

F1-BORN unselektierteKontrolle

Parallele Haltung von Forellen in Brackwasser für 180 Tage

Üb

erle

ben

srat

e[%

]

15000

2096

702 311

0

3000

6000

9000

12000

15000

1975 1976 1977 1978

Brackwasseraufzucht von Jungfischen < 1g

Genetische Ursachen unbekannt!

Züchterische Anpassung durch klassische Selektion auf Überleben unter regionalen Umweltbedingungen

Regionale Etablierung des Zuchtstamms BORN

P0-Generation

11

Molekulargenetische Faktoren erfolgreicher regionaler Anpassung

DNA, cDNA

• Gensequenzierung,

• Transkriptomsequenzierung

• Genomsequenzierung

Genexpression

• Transkriptomsequenzierung (RNA-Seq),

• cDNA- bzw. Oliogo-Mikroarray-Hybridisierung

• quantitative Real-Time PCR (qPCR)

• quantitative Biochips-qPCR

In vitro Zellsysteme

• Einzelmolekülaktivität in der Zelle

• Lokalisation von Molekülen

• Fischzellwachstum, -proliferation

Wesentliche Technologien & Methoden

Biomark HD Fluidigm; Roche Lightcycler96HiSeq Illumina, cDNA Mikroarrays Agilent Live Cell Mikroskopie Zeiss Observer

Strukturanalysen Funktionsanalysen

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Genaktivität stressreaktiver früher Schutzgene “First Barrier”-Gene

Rebl et al. (2012) Vet Immunol Immunopathol 145

• Erhöhte Grundexpression von Schutzgenen in der Leber gesunder regionaler Forellen

• Verbesserte Sperre gegen das Eindringen von Pathogenen

• Adaptation an die lokalen Wasserparameter (Keimspektrum, Eutrophie, Temperaturamplitude)

• Abreguliertes angeborenes Immunsystem

Kein Stress

Mikroarray-Transkriptomstudie


13


Genaktivität des stressreaktiven angeborenen Immunsystems

Beispiel: Vergleich der Expression von Komplementgenen

• Abreguliertes, weniger aktives angeborenes Immunsystem in der Milz gesunder regionaler Forellen

• Genetisch determinierte Adaptation an die lokale Umwelt - Brackwasser

Köbis et al. (2013) Mol Biol Rep 40 Köbis et al. (2014) Fish & Shellfish Imm 42


Kein Stress

14


Effekte veränderter Genetik auf Überleben nachi.p.-Infektion mit A. salmonicida [104cfu]

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3 4 5 6 7 8 10 12 24

kum

ula

tive

Mo

rtal

ität

[%]

Tage nach Infektionsbeginn (dpi)

Überleben

BORN Import

∆ 50%

72h

n=30 Fische pro Stamm

Korytář et al. (2013) Fish Shellfish Immunol 35 Rebl et al. (2014) Mar Biotechnol 16


Regionale Zuchtlinie BORN:

• Anpassung des Immunsystems an Lebensraum Brackwasser

• Effizientere angeborene Immunantwort

• Höhere Überlebensrate

• Schnellere adaptive Immunantwort in der regionalen Zuchtlinie

21d

0

20

40

60

80

100

0 7 21

CD

4-A

ktiv

ität

MH

C II

[%

]

Tage nach Infektionsbeginn

Aktivität erworbenes Immunsystem

BORNImport

7d21d

InfektionA. salmonicida

15


Korytář et al. (2013) Fish Shellfish Imm 35 Korytář et al. (2013) Diss FLI

BORN vs. Import

Effekte veränderter Genetik auf Leukozytenzellkinetik nach Stimulation

StimulationA. salmonicida

FACS-Zellsortierung

• Lymphozyten dominieren im nicht infizierten Fisch

• Myeloidzellen kontrollieren die Auflösung der beginnenden Entzündung

• Stimulation induziert dramatische Wechsel in der Zellkomposition des Peritoneums

• ca. 24h schnellerer Zelltransfer bei der regionalen Zuchtlinie BORN

16


Korytář et al. (2013) Fish Shellfish Imm 35 Korytář et al. (2013) Diss FLI

Effekte veränderter Genetik auf Leukozytenzellkinetik nach Stimulation

StimulationA. salmonicida

FACS-Zellsortierung

• Stimulation induziert dramatische Wechsel in der Zellkomposition• Nur moderater Anstieg der Leukozytenanzahl in regionaler Zuchtlinie

Qualität der Abwehr ist wichtiger als erhöhte Quantität an Abwehrzellen!

LymphozytenMyeolidzellen

0hpi 24hpi 72hpi 0hpi 24hpi 72hpi

i.P

.-Ze

llko

mp

osi

tio

n

BORN vs. Import

BORN Import BORN Import

17


Mikroarray-TranskriptomstudieRebl et al. (2013) Marine Biotechnol 15 Verleih et al. (2015) Marine Biotechnol 17

Identifizierung früher Stressindikatoren für Temperaturstress

Genexpression KiemeBORN/IMPORT

Umfassende globaleTranskriptomanalysen

Heat map

Kiemen

Niere

Leber

Gehirn

Heat map Top 20 Gene

Moderat8°C - 15°C - 23°C

Temperatur = abiotischer ökologischer Masterfaktor in der Aquakultur (Brett JR,1971)

• Nachweis linienspezifischer Strategien für die Stress-antwort auf moderaten Temperaturstress

• Angeborenes Immun-system wird auch bei Temperaturstress aktiviert

• Temperaturanstieg induziert Akute-Phase-Gene nur in der regionalen Zuchtlinie BORN

8°C 23°C

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• Genotypisierung identifiziert ca. 150 Gene mit zu 100% zuchtlinienspezifischen SNPs

• u.a. First Barrier Gene und angeborenes Immunsystem• Frühe Stressindikatoren mit „Zuchtpotential“ – DNA-Sequenzvariation

n=8/Zuchtlinie6 Gewebe

HauptkomponentenanalyseDifferente Geneexpression

Gen-/DNA-Fragmentassemblierung

Transkriptomsequenzierung zur Identifizierung genetischer Zuchtlinienunterschiede

Illumina HiSeq – RNA-Seq

Kein Stress

Brunner & Verleih (2014-17) Labordaten

Gen-/DNA-Sequenzvariation

Doktorandin Lydia de los Rios Pérez (2018)

Linienspezifische SNPs

GATK - Genome Analysis Toolkit

30-fold coverage/strain

GIMAP7

Borchel (2015) Diss. 28-diss2015-0192-2


Reads Pre-ProcessingVariantensuche

Variantenanalyse SNP’s / Indels

Callset RefinementGenotypen

19

IMPORT (selektiert auf Wachstum)BORN (selektiert auf Überleben)

RinnenanlageBrackwasser

Netzkäfiganlage See

TeichanlageGrundwasser

Fotos: Ralf Bochert

RinnenanlageFluss

Goldammer et al. (2016) Fischerei & Fischmarkt 3www.aquakultur-mv.de – Abschlussbericht EFF-BORN-Forelle (2015)

BrackwasserSeewasser

FlusswasserGrundwasser

Regional + Import -65% männliche Tiere

BORN vs. IMPORT – Produktionsleistung in regionalen UmweltenMittlere Produktionsleistungen von 4 Testbetrieben

http://www.aquakultur-mv.de/

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Zusammenfassung & Fazit - Regionale versus Importzuchtlinie

Regionale Zucht führt zu signifikanten Unterschieden:- Gen-, Genomsequenzvariation, Genotyp - Gen-, Genomfunktion- Stressbewältigungsstrategien

• First Barrier-Gene• angeborene & erworbene Immunabwehr• Leukozytenaktivität• spezifisch regulierte Stressgene und Signalkaskaden

- Mortalitätsrate unter Stresseinwirkung- Produktionsleistungen, Phänotyp

Fazit: Regionale Zucht ist nachhaltig, ökologisch und produktiv.

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Gedanken und Ausblicke

Deutschland fördert die Verbesserung von: Fischfutter, Aquakultursystemen, Filtersystemen, Fütterungssystemen,Erbrütungstechnologien, die Nachnutztung von Abprodukten (Aquaponik).Fischhaltung erfolgt sogar im Ökolandbau….

Fischzucht in Deutschland erfolgt zumeist überphänotypgestützte Massenselektion- Wir müssen das ändern!- Wann “verbessert” Deutschland die Fische?

Foto: Ronald Brunner

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Gedanken und Ausblicke – Genomanteil am Zuchterfolg

http://aquagen.no/en/2013/06/12/selective-breeding-progress/

Deutschland braucht die familiengestützte Selektion von Regenbogenforellen

Selektion auf Milchmenge, 9200l – mittlere Heritabilität h2=0,25

5000

6000

7000

8000

9000

Milchleistung [kg] bei natürlichem Fettgehalt

HB-Kühe RZMV 1994-2009

Zuchtreport_Milch-09 (2009) LALLF

RindRegenbogenforelle

Selektion auf Merkmal Körpergewicht ausgenommen am praktikabelsten mittlere Heritabilität [h²] = 0.29

Kause et al. (2007) J.Anim.Sci. 85

Zuchtprogramm FinnlandVerbesserung Filetqualität

[email protected] (1996)20 bis 40%

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+

Zuchtwertberechnung über Phänotypen von:- Individuum- Elterntiere- Voll- und Halbgeschwister- NachkommenSchätzung der Genetik (Genotyp) mit geeignetem Test: BLUP-Test

Dam

Sire 1 Sire 2 Sire 3

Gedanken und Ausblicke - Genomanteil am Zuchterfolg

Grundvoraussetzung: Familienstrukturen und Zuchtwertschätzung

Offspring

Erfassung von Leistungsdaten und deren Abweichung vom Populationsmittelwert ergibt den Zuchtwert für jedes Tier.

Best Linear Unbiased Prediction

Vorteile:- Garantierter schneller Zuchtfortschritt- Zuchtfortschritt auch bei niedriger Vererbbarkeit

Familie 1 Familie 2 Familie 3

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Familiengestützte Selektion – verschiedene Zuchtziele

Grundvoraussetzung: Familienstrukturen

1 3

Zucht neuer Familien durch KreuzungKombination gewünschter Merkmale

Erhaltung und Verbesserung einer Familie

+

Gedanken und Ausblicke - Genomanteil am Zuchterfolg

Neue Elterntiere mit besten individuellen und Familienmittelwerten im Vergleich zur Gesamtpopulation

Familie mitbestem

Wachstum

Familie mitniedrigsterMortalität

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Gedanken und Ausblicke – Pioniere von Zuchtprogrammen

Vergleich von 15 Zuchtbetrieben eigene Zuchtstämme mit eigener Laichproduktion in Europa – davon:Familiengestützte Selektion: 9Phänotypbasierte Massenselektion: 6

1992 2015

*troutlodge.com*seafoodsourc.com

*aquagen.no

*vbcn.se

*troutex.dk

*hofer-forellen.de*uni-goettingen.de

Boosting European aquaculture by advancing selective breeding to the next levels

2018

?Europa gesamt in 2011: 1,55 Mrd Eier(Dänemark 320 Mio, Frankreich 400 Mio)

*assumed breeders

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Gedanken und Ausblicke - Zuchtprogramme

• Zuchtprogramme (national/ regional)

• Zuchtzentren: Betriebe/ Bundesländer mit eigenen Zuchtstämmen

• Aufbau echter Familienstrukturen – Monitoring –Stammbucherstellung (Herdbuch) – Digitalisierung

• Genetische Vielfalt regionaler Zuchtstämme erfassen

Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss)

• 208 Betriebe > 5 t / 6151 t Produktion (90 %)

• z.B. B-W: 31 Betriebe > 5 t / 1786 t (96 %)

• 76 Betriebe mit Laichproduktion, ca. 11 Mio Eier

MVSH

Sl

RP

B38

6,65 Mio EierBW12

2,45 Mio Eier

Bb

H Th

S

SA

NRW8

0,70 Mio Eier

NS5

0,56 Mio Eier

Rest:13 0,65 Mio Eier

Betriebe mit Laichproduktion

Notwendige Schritte zur kompetitiven Erhöhung der Eigenproduktion:

Destatis 2018 – Erzeugung in Aquakulturbetrieben - FS3 R4.6 – 2017

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Gedanken und Ausblicke - Anpassungszeitraum

Fraser et al. (2011) Heredity 106Primmer (2011) Heredity 106

Populationsgenetische Metaanalyse zur Erschließungneuer Verbreitungsareale durch Salmoniden in Flußgebieten:

Zeitspanne für Anpassung an neuen Lebensraumund Manifestierung als neue Population:

6-30 Generationen (>15 - 100 Jahre)

Oncorhynchus spec.-Populationen

+ lokale Population

± neue Population (lokale Adaptation erschwert)

±+

+

±

+

Pazifik450 mi700 km

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Gedanken und Ausblick – Genetische Vielfalt erfassen

Fluidigm Integrated Fluidic Circuit (IFC) Arrays

Duplex-PCR-Typisierung zur Geschlechtsbestimmung in der

Regenbogenforelle

Werkzeuge für markergestützte Selektion von Forellen sind vorhanden

Molekulare Werkzeuge zur Stressmessung: Biochip mit

Indikatorgenen

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Finanzielle Unterstützung u.a. durch den Europäischen Fischereifond (EFF) und das Ministerium für Landwirtschaft, Umwelt und Verbraucherschutz des Landes M-V (2012-2016).

Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!

Danke an die beteiligten Fischereibetriebe in M-V für ihre Kooperation.

Danke an die LFA-MV mit E. Anders, Carsten Kühn, Ralf Bochert u.a. sowie das FLI mit Bernd Köllner und Tomas Korytar u.a. für die aktive Kooperation, Mitarbeit und Unterstützung der Projekte zur BORN-Forelle (2009-2016).

Abteilung Fischgenetik (2018)

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