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BioProzessingDays 2017. 20.02.17 - 22.02.17

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1 Einleitung

Neben standardisierten Bioreaktoren und Anlagenkonzepten werden zukünftig in der

modernen Bioprozesstechnik vermehrt Systeme entwickelt, die den besonderen

Eigenschaften und Anforderungen neuer Biokatalysatoren Rechnung tragen.

Dabei wird die Leistungsfähigkeit traditioneller Konzepte durch neue Methoden der

Mess- und Regeltechnik beträchtlich verbessert. Die Entwicklung von nichtinvasiven

Systemen zum online-Monitoring biotechnischer Prozesse und ein besseres

Verständnis von Transportprozessen in kleinen Maßstäben ermöglicht es bereits

jetzt, „vollwertige“ Experimente mit Zellen im Mikromaßstab durchzuführen. Auf allen

Ebenen – sei es auf molekularer Ebene oder bei der Regelung ganzer

Produktionsprozesse – ist darüber hinaus die modellhafte Beschreibung der

beobachteten Phänomene durch Modellbildung und Simulation von entscheidender

Bedeutung.

In diesem Zusammenhang sollen relevante Akteure aus dem Bereich der

Bioprozesstechnik zusammengeführt werden und eine Plattform für neue Impulse

und Ansätze bieten. Die Veranstaltung greift die wichtigsten Herausforderungen auf

und spannt eine Diskussionslinie entlang der Wertschöpfungskette vom smarten

Sensor bis zur Prozessintelligenz. In den Workshops sollen neue Entwicklungen

vorgestellt und mit modernster Messtechnik aus dem Bereich der

Prozessoptimierung praxisnah demonstriert werden.

Dr. Holger Müller Prof. Dr.-Ing. Frank Eiden

BlueSens gas sensor GmbH Westfälische Hochschule

AG BioProzessTechnik


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Inhalt

1 EINLEITUNG ........................................................................................................ 1

2 AGENDA .............................................................................................................. 3

3 WORKSHOPS ...................................................................................................... 4

4. TEILNEHMER ....................................................................................................... 7

5. REFERENTEN UND VORTRAGSABSTRACTS ................................................ 12

6. POSTER UND ABSTRACTS .............................................................................. 20

7. UNTERNEHMENSPROFILE "ELEVATOR PITCH" ........................................... 55

8. RAUMPLAN / WEGESKIZZE ............................................................................. 58

9. SPONSOREN ..................................................................................................... 60

10. ARBEITSGRUPPE BIOPROZESSTECHNIK ..................................................... 63

BioProzessingDays 2017 20.02.17 - 22.02.17

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2 Agenda

BioProzessingDays 2017 20.02.17 - 22.02.17

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3 Workshops

Workshop 1:

Thema Analyse von Bioprozessdaten - Berechnungen, Visualisierungen, Daten Kondensierung und Multivariate Auswertung

Unternehmen Exputec GmbH

Workshop 2:

Thema "Kleine Kniffe, grosse Wirkung - so kann ein Bioprozess optimiert werden - Online Messung von Zelldichte und beste Kalibrationspraxis von pH / DO - deshalb gelingt es.“

Unternehmen Hamilton Messtechnik GmbH

Workshop 3:

Thema Alles richtig gemacht! Tipps zur professionellen Analyse geschüttelter Bioprozesse.

Unternehmen PreSens Precision Sensing GmbH / Kuhner AG

Ziel dieses Workshops ist es, den Einsatz moderner Online-Messtechnik sowie den Einfluss wichtiger Versuchsparamater auf geschüttelte Bioreaktoren in praktischer Herangehensweise zu erfahren.

Raum 101

Raum 102

Raum 103

Raum 103


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Workshop 4:

Thema Optimierung und Regelung eines Fermentationsprozesses mittels Glucose- und Abgasmessung

Unternehmen TRACE Analytics GmbH / BlueSens gas sensor GmbH

Ziel ist es, die Vorteile von online-Messungen und Regelungen von Glukose und Laktat in einer Kultivierung von mikrobiellen und tierischen Zellen kennen zu lernen. In diesem Workshop erläutern wir den Nutzen der Glukose und der Abgasanalyse gekoppelt mit den in BlueVis 4.0 integrierten Softsensoren.

Workshop 5:

Thema Benefits of a Modern Single Use Process Development System – ambr250m

Unternehmen Sartorius Stedim Biotech GmbH

Workshop 6:

Thema Automated cultivation on a microbioreactor

Unternehmen m2p-labs GmbH / ProcessShield

Raum 104

Raum 104

Raum 105

Raum 106

Raum 106


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Workshop 7:

Thema Bioprocess Monitoring in Shake Flask Cultures

Unternehmen Infors AG / Aquila Biolabs GmbH

Workshop 8:

Thema Clone-screening under fully controlled conditions in a micro-scale bioreactor.

Unternehmen Infors AG / Aquila Biolabs GmbH

Raum 107

Raum 107

Raum 108


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4. Teilnehmer

Teilnehmer-Anzahl

Titel Nachname Vorname Institution

1 Anagreh Khaled Westfälische Hochschule

2 Anic Iva Biochemical Engineering at TU Dortmund University

3 Ascheberg Angela Westfälische Hochschule

4 Aupert Florian Institut für Technische Chemie, Universität Hannover

5 Dr. Ballerstedt Hendrik RWTH-Aachen / iAMB

6 Prof. Dr. Barbe Stephan TH Koeln - Fakultät Angewandte Naturwissenschaften

7 Dr. Baumfalk Reinhard Sartorius Lab Instruments GmbH & Co. KG

8 Bayer Jens aquila biolabs GmbH

9 Prof. Dr. Becker Thomas TU München

10 Beckers Bernd Forschungszentrum Jülich GmbH IBG-1

11 Belitsky Alice Westfälische Hochschule

12 Dr. Bergmaier Dirk Chr Hansen GmbH

13 Beutler Falco PreSens GmbH

14 Dr. Binder Stephan SenseUp GmbH

15 Bittner David Westfälische Hochschule

16 Dr.-Ing. Blaesen Markus Leiber GmbH

17 Prof. Dr.-Ing.

Blank Lars RWTH Aachen University

18 Dipl.-Ing. Blesken Christian Carl

RWTH Aachen

19 Blum Sebastian m2p-labs Microbioreactors

20 Böhm Christian BIOCOM AG

21 Bohn Jonas Westfälische Wilhelms Universität Münster (WWU)

22 Branding Lisa Westfälische Hochschule

23 Brunek Phillip Westfälische Hochschule

24 Buchen Daniel Westfälische Hochschule

25 Buchholz Tatjana PlasmidFactory GmbH & Co. KG

26 Buevink Marc Biostream Int

27 Burmeister Alina HAW Hamburg

28 Bykow Elisabeth Westfälische Hochschule

29 Carsten Sandra Pfeifer & Langen GmbH & Co. KG

30 Claaßen Wolfgang Universität Hohenheim /Institut für Lebensmittelwissenschaft und Biotechnologie

31 David Lampe Bibitec Gesellschaft für Prozessentwicklung mbH

32 Denkelmann Christine BlueSens gas sensor GmbH


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33 Deutsch Sebastian BlueSens gas sensor GmbH

34 Dietzmann Silke CellGenix GmbH

35 Donath Volker Hamilton Bonaduz AG

36 Dipl.-Ing Dounia Sandra Versuchs- und Lehranstalt für Brauerei in Berlin (VLB) e.V.

37 Drescher-Hartung

Silvia Ostfalia HaW

38 Dreßen Alana Sales & Customer Service

39 Dybowski Sarah Westfälische Hochschule

40 Ebeling Jessica Westfälische Hochschule

41 Eickelmann Chantal Westfälische Hochschule

42 Prof. Dr.-Ing.

Eiden Frank westfälische Hochschule

43 Eigenbrodt Jennifer Evonik Creavis GmbH

44 Endres Stephan m2p-labs Microbioreactors

45 Engel Nadine Sartorius Stedim Biotech GmbH

46 Engemann Moritz Evonik Industries

47 Erhard Kristina Roche Diagnostics GmbH, Penzberg

48 Ettelt Volker Westfälische Hochschule

49 Dr. Feigel Burkhard Infors GmbH

50 Filgertshofer Alois Roche Diagnostics GmbH

51 Frank Marlene Hamilton Bonaduz AG

52 Fruth Enrico Westfälische Hochschule

53 Gassenhuber René Wacker Chemie AG, Consortium für elektrochemische Industrie

54 Dipl.-Ing. Gleich Torsten Sanofi-Aventis Deutschland GmbH

55 Gluma Dennis Westfälische Hochschule

56 Gora Christopher Westfälische Hochschule

57 Dr. Grammann Kathrin Westfälische Hochschule

58 Grasshoff Martin westfälische Hochschule

59 Guilmaille Olivier Roche Diagnostics GmbH

60 Günther Christopher Eppendorf Polymere GmbH

61 Haindl Simon Subitec GmbH / Bioprozesstechnik

62 Halbfeld Christoph RWTH Aachen - iAMB

63 Halka Lisa Technische Universität Dortmund

64 Halloin Caroline Medizinische Hochschule Hannover, LEBAO

65 Halmschlag Birthe RWTH Aachen - iAMB

66 Dr. Hartlep Michael Trace Analytics GmbH

67 Hartmann Ines Eppendorf AG

68 Häusler Lars Westfälische Hochschule

69 Heich H.-J. Westfälische Hochschule

70 Helisch Harald Institut für Raumfahrtsysteme, Universität Stuttgart


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71 Hemmerich Johannes Forschungszentrum Jülich, Institute of Bio- and Geosciences

72 Hentschel Jacqueline Westfälische Hochschule

73 Dr. Herwig Christoph TU Wien

74 Dr. Hintermayer Sarah Evonik Technology & Infrastructure GmbH

75 Hoffarth Marc Hochschule Ostwestfalen-Lippe

76 Dr.-Ing Holtmann Dirk DECHEMA-Forschungsinstitut, Industrial Biotechnology

77 Prof. Dr. Huber Robert Hochschule München

78 ja Nicole Westfälische Hochschule

79 Dr. rer. nat.

Janzen Nils Biopharmaceuticals Process Science Austria Fermentation, Boehringer Ingelheim RCV GmbH & Co KG

80 Dr. John Gernot Thomas

PreSens GmbH

81 Dr. Julsing Mattijs Technische Universität Dortmund

82 Kary Stefan Westfälische Hochschule

83 Keil Marie-Therese

Westfälische Hochschule

84 Keil Timm RWTH Aachen

85 Keppler Jochen Institut für Raumfahrtsysteme, Universität Stuttgart

86 Dr. Kleebank Sebastian DASGIP GmbH

87 Kleineberg Wiebke Lonza AG

88 Kloß Timo Westfälische Hochschule

89 Koepff Joachim Forschungszentrum Jülich GmbH

90 Dr. Krauth Stefanie WILEY-VCH Verlag

91 Kress Anna m2p-labs Microbioreactors

92 Kühn Jörg BlueSens gas sensor GmbH

93 Kuhnnke Neele Westfälische Hochschule

94 Dr. Künnecke Wolfgang Trace Analytics GmbH

95 Lakowitz Hanna-Christin

Evonik Creavis GmbH

96 Lamottke Elisa Westfälische Hochschule

97 Lattermann Clemens Kuhner Shaker GmbH

98 Lenz Martin Sanofi-Aventis Deutschland GmbH

99 Dr. Leuchtle Bernd Institut für Angewandte Mikrobiologie, RWTH Aachen

100 Li Yingjia Institut für Bioprozess- und Analysenmesstechnik e.V.

101 Lisicar Josipa TH Koeln - Fakultät Angewandte Naturwissenschaften

102 Lucht Simon Westfälische Hochschule/ Universität Hohenheim

103 Dr. Luetz Stephan TU Dortmund

104 Mahr Stefan I&L Biosystems GmbH


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105 Malchow Stefanie Versuchs- und Lehranstalt für Brauerei Berlin e.V.

106 Mochoff Xenia Westfälische Hochschule

107 Morschett Holger Forschungszentrum Jülich, Institute of Bio- and Geosciences

108 Dr.-Ing. Mross Stefan Fraunhofer-Institut für Mikroelektronische Schaltungen und Systeme IMS

109 Dr. Müller Holger BlueSens gas sensor GmbH

110 Nacke Thomas Institut für Bioprozess- und Analysenmesstechnik e.V.

111 Naue Inga Eppendorf Polymere GmbH

112 Netzer Julius aquila biolabs GmbH

113 Prof. Dr. Neubauer Peter TU Berlin

114 Nieswandt Janosch Westfälische Hochschule

115 Olfers Till m2p-labs Microbioreactors

116 Orthwein Tim Westfälische Hochschule

117 Pißarreck Mona Westfälische Hochschule

118 Pollich Ludwig Westfälische Hochschule

119 Pooth Viola Forschungszentrum Jülich, Institute of Bio- and Geosciences

120 Riel Maike Westfälische Hochschule

121 Roick Thomas Jäckering Mühlen- u. Nährmittelwerke GmbH

122 Dr. Rosenthal Kathrin Technische Universität Dortmund

123 Rudat Annika Forschungszentrum Jülich

124 Sagmeister Patrick Exputec GmbH

125 Santos Fernandes

Carolina I&L Biosystems GmbH

126 Scherz Pascal Subitec GmbH / Bioprozesstechnik

127 Dipl.-Ing. Schiffler Jens DASGIP GmbH

128 Prof. Dr. Schlüter Michael Westfälische Hochschule

129 Dr. Schmale Udo BlueSens gas sensor GmbH

130 Dr. Schmeer Marco PLasmidFactory GmbH & Co. KG

131 Schmitz Lisa Marie Technische Universität Dortmund

132 Prof. Dr. Schörken Ulrich TH Köln - Campus Leverkusen

133 Schröder Anna Daiichi-Sankyo Europe GmbH

134 Dr. Schwarz Christian NUMAFERM

135 Schwarz Jenny Technische Universität Dortmund

136 Dr. Shankar Rem PLasmidFactory GmbH & Co. KG

137 Dr. Solle Dörte Leibniz Universität Hannover, Institut für Technische Chemie

138 Spindler Daniel EWN

139 Staps Kathy Evonik Nutrition & Care GmbH

140 Staworzynska Malgorzata Nordmark Arzneimittel GmbH & Co KG

141 Steinberger Nadine Roche Diagnostics GmbH


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142 Steinke Nadine Evonik Creavis GmbH

143 Steinwandter Valentin Exputec GmbH

144 Dr Stock Janpeter Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf/ Numaferm

145 Stötefalke Julia Evonik Nutrition & Care GmbH

146 Sturm Jonathan Westfälische Hochschule

147 Sven Wegerhoff Technische Universität Dortmund

148 Dr. Telaar Maurice Infors GmbH

149 Teuber Ines Ostfalia Hochschule f.a.W.

150 Thon Patrick Westfälische Hochschule

151 Dr. Tindal Stuart Sartorius Stedim Biotech GmbH

152 Dr Uhde Andreas Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf/ Numaferm

153 Uhrig Thomas TU Kaiserslautern Fachgebiet Ressourceneffiziente Abwasserbehandlung

154 Dr van Summeren-Wesenhagen

Philana Forschungszentrum Jülich GmbH

155 Vierhaus Ina Evonik Creavis GmbH

156 Vogt Dominik Westfälische Hochschule

157 Dr. Volmer Jan Technische Universität Dortmund

158 Wagner Marcus Nordmark Arzneimittel GmbH & Co KG

159 Weber Florian PLasmidFactory GmbH & Co. KG

160 Wegener Patrick Richter-Helm BioLogics GmbH&Co.KG

161 Prof. Wiedemann Philipp Hochschule Mannheim

162 Wiltfang Matthias BlueSens gas sensor GmbH

163 Wohlgemuth Dennis Westfälische Hochschule

164 Wolf Nathalie Westfälische Hochschule

165 Yau-Rose Sinyee Tap Biosystems (part of Sartorius Stedim Biotech GmbH)

166 Zerhusen Christian TH Köln - Campus Leverkusen

167 Zöllkau Markus Wacker Biotech GmbH


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5. Referenten und Vortragsabstracts

Prof. Dr.-Ing. Lars M. Blank

RWTH Aachen University Chair of Applied Microbiology Biology Department Worringerweg 1 52074 Aachen

Mail: [email protected] Phone: +49 (0)241/80-26600 Fax: +49 (0)241/80-22180

Prof. Dr. rer. nat. Stephan Luetz

TU Dortmund Bioprozesstechnik Fakultät Bio– und Chemieingenieurwesen Emil-Figge-Strasse 66 44227 Dortmund

Mail: [email protected] T: 0231 755 - 4764

Prof. Dipl.-Ing. Dr.techn. Christoph Herwig

TU Wien Inst. f. Verfahrenstechnik, Umwelttechnik und Techn. Biowissenschaften

Gumpendorfer Str. 1a 1060 Wien

Mail: [email protected] T: +43 (1) 58801 - 166 400 F: +43 (1) 58801 - 166 980

mailto:[email protected]


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Prof. Dr. Peter Neubauer

TU Berlin Bioverfahrenstechnik Institut für Biotechnologie

Ackerstrasse 76/ Entrance A / ACK 24 D-13355 Berlin

Mail: [email protected] T: 030 314 72269 F: 030 314 27577

Prof. Dr.-Ing. habil. Thomas Becker

TU München Lehrstuhl für Brau- und Getränketechnologie

Weihenstephaner Steig 20 D-85354 Freising-Weihenstephan

Mail: [email protected] T: 08161 - 71-3261 F: 08161 - 71-3883

Dr. Reinhard Baumfalk

Sartorius Lab Instruments GmbH & Co. KG Vice President R&D Instrumentation & Control

Otto-Brenner-Strasse 20 37075 Göttingen

Mail: [email protected] T: 0551 308 3984


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Metabolic networks in action or what we can learn

using advanced analytics for quantitative physiology

Lars M. Blank

iAMB - Institute of Applied Microbiology, ABBt – Aachen Biology and Biotechnology,

RWTH Aachen University, Aachen, Germany

The transition of a crude oil to a renewable resource based chemical industry

requires new catalysts that can utilize these new carbon and energy sources. Nature

is using in many aspects microbes to close element cycles such as nitrogen and

importantly carbon. To be useful in industry, these microbes require optimization of

the wished for catalytic activity. An ever increasing arsenal of genetic tools is

available that allows single nucleotide exchanges and whole genome (re)editing.

While the genetic tools are available, the required changes are often not obvious or

in other words the challenges in rational strain engineering are many, as the

genotype – phenotype relationship is rarely well described. Here, I argue that the

recent and ongoing improvements in quantitative analytics bring us closer to the

envisaged rational strain engineering. The examples from our lab are concerned with

results from yeast cultivations, in which we use quantitative physiology to improve our

knowledge about the biochemical network that we want to manipulate. The

knowledge gained is the basis for (rational) strain engineering efforts.


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Abbildung 1: Potential der Biokatalyse illustriert an einer Genom-Analyse von E.coli

Biokatalytische Prozesse zur Herstellung von Wert- und Wirkstoffen

Stephan Lütz

Lehrstuhl für Bioprozesstechnik, Fakultät für Bio- und Chemieingenieurwesen, TU Dortmund, Dortmund, Deutschland

Enzyme und Mikroorganismen können die Umsetzung nicht-natürlicher Substrate oft mit bemerkenswerter Selektivität durchführen. Außerdem können durch biokatalytische Schritte Synthesen vereinfacht und die Stufenanzahl verringert werden. Daher hat die Biokatalyse Ihren Platz sowohl im Labor als auch im industriellen Maßstab eingenommen. [1] Im Vortrag werden neuere Beispiele für biokatalytische Prozesse zur Herstellung von chiralen Bausteinen sowie der Modifikation von pharmazeutisch aktiven Verbindungen vorgestellt. Hierbei werden insbesondere Beispiele von Redox-Reaktionen (Enzymklasse 1, Abbildung 2) diskutiert. [2]

Speziell bei der Herstellung von Wirkstoff-Metaboliten im präparativen Maßstab bietet der Einsatz von Oxidoreduktasen Vorteile gegenüber chemischen Methoden der C-H-Aktivierung, da die biologisch relevanten Verbindungen häufiger aus Biotransformationen isoliert werden können. [3] Schließlich können auch Naturstoffe - pharmakologisch aktive Sekundärmetabolite – aufgrund der hohen Selektivität der biologischen Katalysatoren ohne Einführung von Schutzgruppen weiter modifiziert werden. An diesen drei Beispielen (chirale Bausteine, Metabolite, Naturstoff-Derivatisierung) wird illustriert wie moderne Bioprozesse vom Genom über das Maßschneidern der Katalysatoren zum isolierten Produkt führen können.

[1] H.-P. Meyer, E. Eichhorn, S. Hanlon, S. Lütz, M. Schürmann, R. Wohlgemuth, R.

Coppolecchia, Catalysis Science & Technology, 2013, 3, 29-40. [2] I. M. Keseler et al., Nucleic acids research 2011, 39, D583-590. [3] J. Genovino, S. Lütz, D. Sames, B. Touré, Journal of the American Chemical Society,

2013, 135 (33), 12346-12352

297

430

349

145

83

79

4497 genes

1383 enzymes2

bond formation under energy consumptionC-O, C-N, C-S, C-X, DNA Ligases

isomerization and racemization

bond formation and cleavage

bond cleavage under H2O consumption

Reduction and Oxidation

transfer of functional groups :-CH3, -NH2, -CHO, sugars


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Skalierbare und schnelle Prozessentwicklung – Ein integrierter methodischer Ansatz

Christoph Herwig 1,2

1Research Division Biochemical Engineering, Institute of Chemical and Biochemical Engineering, TU WIEN, Vienna, Austria

2Christian Doppler Laboratory for Mechanistic and Physiological Methods for Improved Bioprocesses, Vienna, Austria

Eine erfolgreiche Bioprozessentwicklung muss einen hochproduktiven, skalierbaren und robusten Prozess liefern, und dies in einer kurzen Zeit. Um diese Ziele sicherzustellen, ist es wichtig eine methodische Strategie parat zu haben, welche folgende Fragen beantworten kann:

1) Welche Messungen machen Sinn, Wie oft muss ich Probe nehmen? 2) Wie erkenne ich Fehler in meinen Messungen 3) Wie komme ich automatisch zu Kenngrössen, die unabhängig sind von den

Initialbedingungen und Maßstab? 4) Gibt es effizientere Experimentalmethoden als Design of Experiments? 5) Wie erkenne ich Wirkungszusammenhänge und formuliere diese so, dass ich

sie technologisch Nutzen kann? 6) Wie stelle ich diese Modelle in Echtzeit für eine robuste Prozesskontrolle zur

Verfügung?

Der Beitrag zeigt ein anhand eines Methoden-Zyklus wie obige Fragen, für Mikroben wie auch für Säugetierzellen, systematisch und durch Software unterstützt beantwortet werden können.


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Innovative Konzepte aus dem Bereich der Bioprozessentwicklung

Becker, T. TU München; Lehrstuhl für Brau- und Getränketechnologie; Freising-Weihenstephan

Die Biotechnologie gilt als eine der Schlüsseltechnologien für die Zukunft des Produktionsstandortes Deutschland. Durch das Aufkommen neuer Fertigungsphilosophien wie der PAT-Initiative der FDA ergibt sich speziell im Life Science-Bereich eine Neuausrichtung bei der Entwicklung und Kontrolle von biotechnologischen Prozessen. Hierbei wird in erster Linie eine Validierung und Freigabe von Produkten oder Prozessabschnitten in Echtzeit angestrebt. Um das hierfür notwendige Prozesswissen zu generieren, wird eine Online-fähige Prozessüberwachung vorausgesetzt. In dieser Hinsicht präsentieren sich akustische und optische Messverfahren in Verbindung mit modernen Methoden der statistisch basierten Datenauswertung als ideal, um die gewonnenen Prozessinformationen für eine anschließende Prozesssteuerung nutzbar zu machen. Insbesondere hat sich der Einsatz von Ultraschalltechniken in verschiedenen Bereichen der Prozessüberwachung in den letzten Jahren deutlich erhöht. Im Vergleich zu anderen vorhandenen Techniken bietet Ultraschall eine schnelle, nicht destruktive und nicht invasive Messtechnik, die den Vorteil hat, für opake Medien geeignet zu sein. Daher ermöglichen Anwendungen von Ultraschallmesstechniken die Analyse und Überwachung von Produkteigenschaften bereits während der Herstellung, wodurch eine Optimierung der Produktion erleichtert wird.

Der Beitrag zeigt die Umsetzung einer PAT-basierten Prozess- und Qualitäts-überwachung anhand ausgewählter Anwendungen im Life Science Bereich. Diesbezüglich wird beispielsweise auf die Entwicklung und Umsetzung von ultraschallbasierten Überwachungstechniken zur Bestimmung der physikochemischen Eigenschaften von getreidebasierten Lebensmitteln eingegangen. Darüber hinaus werden innovative Methoden zur multivariaten Datenauswertung und deren Einbindung in ein PAT-basiertes Framework zur Prozesskontrolle vorgestellt.


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Bioprocess design by combining in-silico cell models with robot based automated parameter identification in parallel experiments

Peter Neubauer, M. Nicolas Cruz-Bournazou

Fachgebiet Bioverfahrenstechnik, TU Berlin, Berlin, Germany www.bioprocess.tu-berlin.de [email protected]

Although mechanistic models have been widely applied for a better understanding of metabolic networks, they are rarely used for process development. This is mainly due to the fact that a comprehensive model with a large number of parameters and differential equations which describes the physiological situation of a cell very well, is often difficult to apply and even not robust enough to allow all parameters to be identified.

However, if such mechanistic models could be used, process development and operation to our opinion could greatly benefit to propose a process and to evaluate the robustness and operation space. A key in the use of such models is to decrease the efforts needed to identify the parameters for a specific process or strain, which includes model reduction approaches, to make the parameters identifiable, and the methodology of how to identify the parameters for the specific system. Here we describe an approach of how parallel experimentation and model-based approaches can be combined in an automated way to identify model parameters within a single experiment and thus provide a basis for computation-based process development. In combination with on-line and at.-line analytical tools moving horizon approaches with a steady change of the experimental conditions can be applied to gain the maximum information from an experiment. In first applications such approaches were very useful to identify model parameters within a single multibioreactor experiment in a fully automated system.

1. Cruz Bournazou et al. 2016. Online Optimal Experimental Re-Design in Robotic Parallel

Fed-Batch Cultivation Facilities for Validation of Macro-Kinetic Growth Models at the Example of E. coli. Biotechnol Bioengin. DOI: 10.1002/bit.26192.

2. Nickel et al. 2016. Online bioprocess data generation, analysis and optimization for parallel fed-batch fermentations at mL scale. Engin Life Sci. DOI: 10.1002/elsc.201600035

http://www.bioprocess.tu-berlin.de/



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New strategies for bioprocess control: An academia -industry cooperation to develop a science

based approach

Dr. Reinhard Baumfalk

Sartorius Lab Instruments GmbH & Co. KG Göttingen

A close partnership between academia and industry is cooperating within the research network “Strategische Allianz: Wissensbasierte Prozessintelligenz”, granted by the BMBF. To allow an intense interaction a novel approach was chosen, where all partners contribute to central and shared process prototypes. The results achieved so far and an outlook into the coming period will be given in this presentation.


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6. Poster und Abstracts

NR: AUTHOR ABSTRACT TITLE

1 Hernández Rodríguez, T.

Influence of parameter accuracies in cell culture seed train simulations

2 Lisicar, J. Yeast Fermentation Technology: Process Optimization and Modelling

3 Nacke, T. Entwicklung und Anwendung einer elektronischen Zunge zum Nachweis organischer Säuren

4 Nacke, T. Online monitoring of fermentation processes via contactless microwave sensors

5 Nacke, T. Clamp-On-Mikrowellen-Schlauchsensoren zur berührungslosen Flüssigkeitscharakterisierung

6 Nacke, T. Impedanzspektroskopische Methoden für die Online-Messung der Biomasse in Hairy Root Kulturen

7 Hartlep, M. Online-Controlling of Glucose in Cultivations and Fermentations – demonstrated in Acetone Production with a recombinant E.coli

8 Hartlep, M. Online-Measurement of Glucose and Lactate in up to four fermentation processes in parallel

9 Blesken, C. Production and downstream processing of fatty acid derivatives for biofuel synthesis

10 Halmschlag, B. How fast can a Bacillus subtilis grow? Strain engineering for enhanced Poly-γ-glutamic acid production

11 Halbfeld, C. Discovering dynamics of volatile metabolites in yeast fermentations using SESI Orbitrap MS

12 Leuchtle, B. Method development for investigation of microbial fuel contamination

13 Keil, T. Characterization of an innovative fed-batch microplate feeding system

14 Sturm, J.

Modular “Soft-sensor” based platform using process intelligence for robust online fermentation control

15 Kloß, T. Feedback controlled process regulation (FCPR) and stoichiometric approximations of flux ratios based on a modular soft-sensor platform

16 Scherz, P. Industrielle Kultivierung von Mikroalgen in FPA Photobioreaktoren

17 Dounia, S. Prozesskontrolle mittels elektooptischer Messung von Bacillus-Kulturen im Bioreaktor


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18 Wegerhoff, S. Modelling the Crabtree Effect in Saccharomyces cerevisiae by Dynamic Flux Balance Modeling with a reduced stoichiometric Model

19 Rosenthal, K. Single-cell physiological analysis

20 Schwarz, J. Einfluss von Prozessbedingungen auf die Sekundärmetabolit-Produktion-P. fallax HKI727 als Beispiel für die Aktivierung stiller Gen-Cluster

21 Schmitz, L.M. Identifying potential novel biocatalysts for hydroxylation processes by genome mining

22 Volmer, J. Impact of solvent tolerance and carbon source availability on styrene epoxidation with Pseudomonas taiwanensis VLB120

23 Lucht, S. Optimizing the Heterologous Expression of Long-chain Rhamnolipid Congeners in Pseudomonas putida KT2440

24 Aupert, F. Wissensbasierte Prozessintelligenz Neue Wege zu stabilen Bioprozessen

25 Pooth, V. E.coli under dynamic oxygen supply: scale-down bioreactor vs. single STR with oscillation profile

26 Hemmerich, J. Mini Pilot Plant methods for quantitative phenotyping of recombinant protein secretion with Corynebacterium glutamicum

27 Koepff, J. Speeding up bioprocess-development for filamentous organisms

28 Rudat, A. Microfluidic cultivation chamber for the investigation of synthetic microbial co-cultures on single-cell level: From the development to first application

29 Morschett, H. Integrated Framework for the Accelerated Development of Phototrophic Bioprocesses

30 Burmeister, A. Microfluidic heterogeneity analysis of fluorescence-based gene expression of industrially relevant production strains on single-cell level

31 Sensor-, Mess-& Regeltechnik: „One Dimension“

līfHack-BioCompetition

32 Industrielle Biotechnologie: „Fermsoft“


33 Industrielle Biotechnologie: „lifHacker“



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Influence of parameter accuracies in cell culture seed train simulations

Tanja Hernández Rodríguez1, Kirsten S. Koopmann1, Ralf Pörtner 2, Björn Frahm1

1 Ostwestfalen-Lippe University of Applied Sciences, Biotechnology & Bioprocess Engineering, Lemgo, Germany

2 Hamburg University of Technology, Bioprocess- and Biosystems Engineering, Hamburg, Germany

The production of biopharmaceuticals in suspension cell culture bioreactors from a few hundred liters up to 20 m3 is state of the art. However, the generation of an adequate number of cells for the inoculation of a production bioreactor is time- and cost-intensive. The cell number needs to be increased by multiple passaging steps from volumes used for cell thawing up to larger cultivation systems.

Appropriate design of seed trains is more and more acknowledged as important since cultivation conditions during the seed train have a significant impact on the cell performance in production scale. Suboptimal cultivation conditions, even if they occur only for a short period of time, can lead to changes in cell metabolism such as reduced cell growth and product formation persisting into production scale.

There are various options for the optimization of existing seed trains in biotechnological plants or for the design of new seed trains. Furthermore, clones are evaluated during clone selection also concerning their suitability for existing seed train schemes.

A software tool has been developed which enables seed train analysis, layout and optimization, based on information on the cell line, medium and the seed train vessels. A key element is the applied cell culture model and its model parameters. The tool currently contains four model variations so that different cell lines can be simulated. Adaptions to the actual cell behavior of the cell line or to changes in cell behavior during the seed train are possible using the implemented model parameter identification. Using experimental data the model parameters are adjusted.

Such seed train simulations are influenced by the accuracy of the data which is entered into the software tool. Results for a CHO cell line regarding the robustness of the simulations in response to inaccuracies will be presented.


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Yeast Fermentation Technology: Process Optimization and Modelling

J. Lisicar, C. Zerhusen, U. Schörken und S. Barbe

TH Köln, Campus Leverkusen, Faculty of Applied Natural Sciences, Biotechnology Group

The production of bioethanol, biosurfactants and other chemical intermediates as well as Baker’s Yeast are well known examples for the major role played by yeast fermentation in industrial biotechnology. Our group develops and optimizes processes related to the cultivation of Saccharomyces cerevisiae and the production of biosurfactants with Starmerella bombicola and related strains

In this regard, results and concepts for the optimization of the fed-batch fermentation of S. cerevisiae by means of monitoring of fermentative capacity and the use of membrane Technology for higher yields will be presented. The development of synthetic doughs for the investigation of functional aspects such as sensitivity to osmotic stress and “maltose lag” will be discussed.

The production of sophorolipid derivatives by variation of strain and lipid substrate including the scale-up to a 30L-pilot fermenter, which enables kg-sample production for application testing, was achieved. As a means for overall process cost optimization the recycling of S. bombicola biomass is shown and finally, a numerical approach for the modeling of the biosynthesis of sophorolipids will be presented.


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Entwicklung und Anwendung einer elektronischen Zunge zum

Nachweis organischer Säuren

Thomas Nacke1, Andreas Barthel1, Robert Kühler1, Daniel Martin1, Sandra Engelhardt2, Martin Engelmann2, Xenia Nakos1, Olaf Schröder2, Yahor Zaikou1

1 iba e.V. Rosenhof, 37308 Heilbad Heiligenstadt, Germany 2 Pattern Exper, Bitterfelder Str. 14, 04129 Leipzig, Germany

Einleitung:

Seit Beginn der 90er Jahre wird versucht, die beeindruckenden Geschmacks-empfindlichkeiten der tierischen und menschlichen Zunge und Nase mit elektronischen Sensoren nachzubilden. Dabei kommen bisher die verschiedensten elektro-chemischen Messmethoden, wie Voltametrie, Amperometrie und Impedanzspektroskopie als Messmethode für elekronische Zungen (engl. Electronic Tongue – ET) zur Anwendung. Hauptanwendungsgebiete sind Untersuchungen zur Herkunft, zu Inhaltsstoffen, Verunreinigungen und der Qualität in der Lebensmittel-technik, in der Wasser- und Abwasseranalyse und in der Medizintechnik, z.B. zur Detektion von Krankheitserregern. Um Prozessstörungen z.B. bei Fermentations-verläufen von Biogasanalage (BGA) schneller zu erkennen, werden feldtaugliche Online-Analysenmethoden benötigt. Durch die Anwendung einer elektronischen Zunge können z.B. online die Anteile flüchtiger organischer Säuren (FOS) mittels impedanz-spektroskopischer Messmethoden in Biogasgüllen online erfasst werden. Diese elektrochemische Messmethode basiert auf einem Multielektrodenarray mit unterschiedlichen Elektrodenmaterialien, einem impedanzspektroskopischen Messsystem und der Anwendung von multivariaten statistischen Datenauswertungen (MSD) zur Kalibration und quantitativen Ausgabe der Messergebnisse.

Lösungsansatz:

Trotz des erhöhten technischen Aufwandes findet die elektrische Impedanzspektroskopie (EIS) für Anwendungen der ET verstärktes Interesse. Die Vorteile bestehen in der Anwendung kleinerer Anregungsspannungen, mit weniger Einfluss auf die Elektrodeneigenschaften und längeren Standzeiten. Weiterhin auch in der Erfassung der frequenzabhängigen komplexen konduktiven und dielektrischen Eigenschaften in Abhängigkeit von der Wechselwirkung zwischen den Elektroden und den zu untersuchenden Elektrolyten.

Durch die komplexe stoffliche Zusammensetzung von realen Biogasgüllen werden bezüglich der Reproduzierbarkeit der Messungen erhöhte Anforderungen an Probenahme, Referenzmedien sowie an die Kalibration und Datenberechnung auf Basis eines multivariaten Regressionsmodells, gestellt. Die Ansteuerung des gesamten Messplatzes erfolgt auf Grundlage eines am iba in C++ entwickelten Programms. Für die Datenauswertung mit MSR und Ergebnisdarstellung wurde die Software MATLAB von der MathWorks, Inc. verwendet.


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Online monitoring of fermentation processes

via contactless microwave sensors

Thomas Nacke1, Brian P Cahill1, Robert Kühler1, Ralf Klukas2, Daniel Martin1, Yahor Zaikou1

1 iba e.V. Rosenhof, 37308 Heilbad Heiligenstadt, Germany 2 IRK Dresden, 01723 Mohorn, Nossener Str. 30, Germany

Introduction: Contamination-free process measurement is essential for efficient monitoring of fermenters especially for single use bioreactors (SUB). This contribution introduces the use of high-frequency sensors for the contactless measurement of the permittivity and conductivity of fermentation media. The sensor can be installed directly to the outer surface of the fermenter or can be clamped onto tubing.

Objectives: Until now various ex-situ contactless process-monitoring technologies exist that are not yet commercially available for SUB, for instance, optical infrared sensors, ultrasound and High-Frequency (HF) or rather Microwave (MW) Sensors. These ex-situ sensors must be connected to the SUB by means of a special port and associated cabling. MW-Sensors can measure through optically opaque materials und are particularly suited to contactless measurement of conductivity, concentration of solid matter or water content.

Methods Microwave sensors measure the interaction of matter with high frequency electromagnetic electric fields. This technology is particularly well suited for sensor application in non-destructive testing because microwaves can penetrate deep into the material without any direct contact and can even be transmitted through the material. In an experiment as the central sensor element is a multilayer ceramic chip antenna for the frequency range 400 MHz~500 MHz. Four measurement chambers were built, which were connected to a network analyzer by means of a multiplexer and 50 Ohm coaxial cable. When microorganisms grow in liquid culture media, dead cells are broken down into small uncharged macromolecules. As part of this metabolism, ions are released that lead to a measurable change in the capacitance and electrical conductivity of the medium.The growth of E. coli microorganisms in culture medium was performed as a batch measurement by means of microwave sensors und conductivity measurement technology.

Conclusion: This presentation describes high frequency sensors for the contactless monitoring of liquids in cell culture reactors und dosing systems. The contactless nature of these sensors enables the cost-effective production of microwave sensors that can avoid sample contamination. This technique in combination with reasonably-priced high-frequency electronic circuits opens up the possibility of simplifying automation and miniaturizing routine application for a wide variety of single-use and microfluidic applications. The development of inexpensive electronic process instrumentation for broader application has already begun.


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Clamp-On-Mikrowellen-Schlauchsensoren zur berührungslosen Flüssigkeitscharakterisierung

Thomas Nacke1, Brian P Cahill1, Caspar Demuth3, Mike Eggli2, Robert Kühler1, Ralf Klukas2 Daniel Martin1, Iris Poggendorf3, Yahor Zaikou1

1 iba e.V. Rosenhof, 37308 Heilbad Heiligenstadt, Germany 2 IRK Dresden, 01723 Mohorn, Nossener Str. 30, Germany

3 Zurich University of Applied Sciences, CH-8820 Wädenswil, Grüentalstrasse 14, Swizerland

Einleitung: Für ein effizientes Monitoring von Fermentoren ist die kontaminations-freie messtechnische Erfassung des Prozessgeschehens unerlässlich. In diesem Beitrag wird eine Mikrowellensensorik zur kontaktlosen Bestimmung der Permittivität und Leitfähigkeit von Fermentationsmedien vorgestellt. Da Mikrowellen (MW) ohne größere Dämpfung Kunststoffe durchdringen, lassen sich Messanordnungen realisieren, die ohne direkten Kontakt mit den zu untersuchenden Medien funktionsfähig und langzeitstabil anwendbar sind. MW-Sensoren können z.B. direkt an der Außenhülle eines Fermenters angebracht werden oder als “Clamp-On“-Sensor an Schläuchen installiert werden.

Messtechnik: Wie bereits aus der optischen Messtechnik bekannt, erfolgt beim Auftreffen einer elektromagnetischen Welle auf eine Grenzschicht eines Materials eine Reflexion und beim Durchdringen eine Absorption durch das wässrige Material sowie Streuungen an Materialteilchen. Als Messverfahren kommen sowohl Transmissions-, Reflexions- und Resonanzverfahren zum Einsatz.

Der Aufbau von MW-Sensoren als Resonatormesszellen mit auswechselbaren Schläuchen ermöglicht eine sehr empfindliche messtechnische Bestimmung der Permittivität (z.B. B. Konzentration von Proteinen in Puffer) oder der elektrischen Leitfähigkeit von Flüssigkeiten.

Zusammenfassung: Die berührungslose Arbeitsweise von kostengünstig herzustellenden MW-Sensoren vermeidet jegliche Kontamination der zu untersuchenden Proben durch das Messsystem. Somit sind für das Monitoring von Flüssigkeiten an Einweg-Bioreaktoren kontaktlose, kontinuierliche MW-Messverfahren zur Bestimmung der Permittivität und der Leitfähigkeit mit angepassten Sensorkonfigurationen im Frequenzbereich ab 300 MHz bis 10 GHz realisierbar.


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Impedanzspektroskopische Methoden für die Online-Messung der Biomasse in Hairy Root Kulturen

Thomas Nacke1, Caspar Demuth2, Mike Eggli2, Robert Kühler1, Iris Poggendorf2 Joel Varonier2

1 iba e.V. Rosenhof, 37308 Heilbad Heiligenstadt, Germany 2 Zurich University of Applied Sciences, CH-8820 Wädenswil, Grüentalstrasse 14,

Swizerland

Hairy Roots sind pflanzliche Organkulturen, die oft für die Produktion von Sekundärmetaboliten eingesetzt werden, welche als Pharmazeutika, Lebensmittelzusatzstoffe oder in Kosmetika Verwendung finden. Um das Wachstum dieser Kulturen zu überwachen, müssen die Biomasse und Viabilität der Zellverbände bestimmt werden können. Bis heute sind jedoch kaum Verfahren bekannt, die in pflanzlichen Zellverbänden eine Online-Überwachung dieser Parameter erlauben.

Die Impedanzspektroskopie hat sich mittlerweile als Standardmethode zur Online-Messung der Lebendzellzahl in Suspensionskulturen etabliert. In der vorliegenden Arbeit wurden Kultivierungsgefässe mit integrierten Elektroden so adaptiert, dass sie sich für die impedanzspektroskopische Online-Messung von Wurzelkulturen eignen. Dazu wurde ein selbstgebautes Impedanzmessgerät im Frequenzbereich zwischen 1 kHz und 10 MHz eingesetzt.

Abb. 1: Messaufbau Abb. 2: Messkammer mit 4-Elektroden Front-End

In Wachstumsversuchen wurden Hairy Root Kulturen in Einweg-Kunststoffgefässen mit stiftförmigen oder planaren Elektroden über mehrere Wochen kultiviert. Die Messungen zeigten, dass die berechneten normierten Kapazitäten gut mit den offline bestimmten Werten der Zellmasse korrelierten.


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Online-Controlling of Glucose in Cultivations and Fermentations – demonstrated in Acetone Production with a recombinant E.coli

Hartlep, M.1, Riel,M.2, Bittner,D.2, Eiden,F.2, Künnecke, W.1

1TRACE Analytics GmbH, Braunschweig, Germany;

2Westfälische Hochschule, Recklinghausen, Germany

Glucose is used as substrate for bacteria, yeast, fungi, and animal cell lines. In cell cultivations and microbial fermentations the glucose concentration has to be monitored. Furthermore it is beneficial to control the glucose concentration on a certain level to reduce the formation of by-products. In most of the processes low glucose concentrations in the medium will be preferred (substrate limitation).

TRACE C2 Control is an online analyzer for controlling the glucose concentration. The integrated PID controller is able to keep the glucose concentration on a low and constant level in cell cultivations and microbial fermentations. The installed feeding pump is suitable for bioreactors with a working volume up to 5 L. Feeding in large bioreactors is also possible by direct connection of an external pump (e.g. Watson-Marlow 505DU) via the serial port of the instrument. Glucose can be controlled in a range between 0.1 g/L and 40 g/L. The parameter lactate can be additionally measured in a range between 0.05 g/L and 10 g/L.

The optimal adjustment of the Glucose level controller is shown in an acetone production process with a recombinant E.coli strain. An unregulated feeding strategy is compared to a feed on demand regulation. By products like acetate can be reduced considerably with the feed on demand. This strategy was realized with the online controller TRACE C2 Control.


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Online-Measurement of Glucose and Lactate in up to four fermentation processes in parallel

Hartlep M., Künnecke W.

TRACE Analytics GmbH, Braunschweig / Germany

Cultivations of microorganisms and cell lines as well as screenings for active pharmaceutical ingredients and media optimization will be done often in parallel batches. Very often multi-fermenter-systems will be used (e.g. Biostat® Qplus from Sartorius, DASbox® from DASGIP, Sixfors® from Infors, etc.). Glucose is used as substrate for a lot of microorganisms and cell lines. In those fermentations and cell cultivations the Glucose concentration has to be monitored permanently. Lactate appears very often as an unwanted by-product. High concentrations of Lactate have to be avoided and a regular measurement of the actual concentration is advantageously.

MultiTRACE is a new online analyzer for controlling Glucose and Lactate concentrations in four cultivations in parallel. The range for Glucose is between 0.1 g/L and 40 g/L and for Lactate between 0.05 g/L and 10 g/L. As a sampling system, a filtration and a dialysis probe is available. The sequence of the bioreactors and the number of measurements per reactor can be selected with a scheduler. The appropriate probe will be selected automatically. Measurements are possible every minute (filtration mode) or every two minutes (dialysis mode). For each reactor a changing time period of 5 minutes is necessary. This analyzer will recommended for especially for cell cultures, where the change of substrate and product is not too fast. In microbial fermentations the variation of Glucose and Lactate concentrations is much higher. For those applications another faster MultiTRACE was developed. With this new device it is possible to measure without the changing time period.

The use and the advantages of the MultiTRACE will be shown in different fermentation processes.


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Production and downstream processing of fatty acid derivatives for biofuel synthesis

Christian C. Blesken1, Till Tiso1, Lars M. Blank1

1) Institut für Angewandte Mikrobiologie (iAMB), RWTH Aachen, Aachen

Microbial production of fatty acid derived intermediates for biofuel synthesis is still hampered. Fatty acid producing yeasts and algae synthesize intracellular lipid bodies. Product recovery requires cell breakage, a cost-intensive step. Especially for fuels, extra costs have to be avoided. The here presented production of the fatty acid derived hydroxyalkanoyloxy-alkanoic acids (HAAs) circumvents this obstacle, as the production host secretes the product of choice into the medium. HAAs are synthesized as intermediates in the biosynthesis pathway of glycolipids and are mainly produced by bacteria from the genus Pseudomonas. They are dimers of hydroxy fatty acids and feature chain lengths of 8 to 12 carbon atoms. Chains of these dimensions are ideal precursors for kerosene production. The establishment of correspondent catalytic reactions for kerosene synthesis from HAAs is ongoing.

Although HAAs are secreted into the media, the downstreaming process evokes multiple challenges. The concentration of HAAs can decrease over the course of the cultivation. Therefore, continuous product recovery needs to be established. With hydrophobic hydrocarbon chains and hydrophilic parts as alcohol and carboxyl groups, HAAs tend to accumulate in foam. That is why foam fractionation is the preferred technique to remove the HAAs from the bioreactor for further purification. First established purification steps will be described within this work.


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How fast can a Bacillus subtilis grow? Strain engineering for enhanced Poly-γ-glutamic acid production

Birthe HALMSCHLAG, Lars M. BLANK

Institute of Applied Microbiology - iAMB, Aachen Biology and Biotechnology – ABBt, RWTH Aachen University, Worringer Weg 1, 52074 Aachen, Germany

E-mail: [email protected]

For bioprocesses based on whole-cell catalysts such as the production of Poly-γ-glutamic acid (PGA) with Bacillus subtilis, the productivity of the process can be enhanced by increasing the growth rate for specific culture conditions by laboratory evolution.1 The laboratory evolution can be carried out either by serial dilutions or by continuous fermentations.2 Here, a continuous fermentation based on the online measurement of biomass concentration is used to evolve a B. subtilis strain for the application as whole-cell catalyst in PGA production resulting in clones with three fold higher growth rates compared to the starting strain. Aiming at a Bacillus strain producing PGA with a high yield, the strain was further genetically modified.

By combining a high growth rate corresponding to a high productivity and gene deletions resulting in higher yields for products derived from the central carbon metabolism, a promising B. subtilis strain applicable for several bioprocesses, e.g. Poly-γ-glutamic acid production, is constructed.

References: (1) LaCroix, R. A. et al. Appl Environ Microbiol 2015, 81, 17-30. (2) Dragosits, M.; Mattanovich, D. Microb Cell Fact 2013, 12, 64-81.


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Discovering dynamics of volatile metabolites in yeast fermentations using SESI-Orbitrap-MS

Christoph Halbfeld1, Birgitta E. Ebert1, Pablo Martinez-Lozano Sinues2, Lars M. Blank1

[email protected]

1iAMB - Institute of Applied Microbiology, RWTH Aachen University, Aachen, Germany 2Deaprtment of Chemistry and Applied Biosciences, ETH Zurich, Switzerland

Keywords: Secondary electrospray ionization, SESI, Orbitrap, fermentation, continuous cultivation, online measurements, Yeast, Saccharomyces cerevisiae

The volatile nature and low concentrations of microbial volatile organic compounds (VOCs) has made their measurement extremely challenging in the past and prohibited thorough investigations of the volatilome, i.e., the sum of all VOCs produced by a microorganism. The baker’s yeast Saccharomyces cerevisiae is no exception to that rule. Apart from the well-known volatiles ethanol and acetaldehyde, the volatile space has only sparsely been explored and investigated rather qualitatively than quantitatively.

So far, the broad characterization of VOC kinetics has been rather impossible with available analytical techniques as the time scales of methods requiring chromatographic pre-separation, e.g. low resolution gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), are magnitudes higher than metabolic changes (15-90 minutes vs. few seconds) preventing online measurements while offline techniques suffer from analyte loss during sampling and fast online sensors are available only for few metabolites. However, advances in modern day analytics are changing the conditions drastically. Secondary electrospray ionization (SESI) is one new development that allows efficient ionization of gases and when coupled to mass spectrometers with high-resolution accurate-mass performance such as Orbitraps enables online analyses of complex, gaseous mixtures and analyte identification by mass and chemical formula, derived from isotope distribution analysis.

Here, we applied SESI-Orbitrap-MS to monitor the response of VOC formation to rapid changes of the metabolism of S. cerevisiae induced by a glucose pulse injected into a continuously growing culture. The direct and fast measurements of the fermentation off-gas resulted in comprehensive sets of highly time- and mass-resolved data allowing unprecedented inside into the yeast’s volatilome.

The potential of SESI-Orbitrap-MS for in-depth analysis of microbial volatilomes but also for noninvasive real-time monitoring of bioprocesses is discussed.



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Method development for investigation of microbial fuel contamination

Bernd. Leuchtle1, Simon. Eiden2, Wei. Xie1, Winfried. Koch2, David. Diarra2, Martin. Zimmermann1, Lars. M. Blank1

1 Institute of Applied Microbiology - iAMB, ABBt - Aachen Biology and Biotechnology, RWTH Aachen University, 52074 Aachen, Germany

2 Oel-Waerme-Institut - OWI - Affiliated institute RWTH Aachen, 52134 Herzogenrath, Germany

Microbial contamination of fuels is a challenge for producer and consumer. Microorganisms can enter fuel storage tanks in different ways, and, if external circumstances are good enough, grow in the fuels. Growth leads to the formation of biofilms and the production of metabolites, such as surfactants and acids. These surfactants further enhance growth and lead to loss of fuel quality. The main problem arising from such contamination is the potential destruction of the storage tank or other fuel bearing parts due to microbial induced corrosion, caused by secreted metabolites or biofilms, blocking filters and pipes. Hence, research in the field of fuel contamination is important, but also challenging.

Fuel research must deal with a two-phase-system, in which organisms grow in a water phase but require water immiscible fuel as energy source. Hence, determination of growth is challenging as standard methods for both, sampling, and examination, are not applicable.

We tested, developed, and evaluated different methods for determination of microbial growth under storage conditions, that allows to mimic storage tank contamination in laboratory scale. They included classical ones such as measuring optical density of pure cultures in a rich medium, determination of cell dry weight from a mixed population, determination of total DNA using complete cell disruption or less invasive staining methods. Microbial influence on fuel bearing parts and materials was investigated by placing materials in direct contact to the fuels or, later, by building and improving a fuel test rig, which again mimics real conditions.

The improvements made led to a better understanding of the microorganisms involved in contamination, factors required for their growth, the influence of their growth on fuel bearing parts and the production of metabolites.

With this knowledge, researchers can create realistic experiments with fewer errors and without the need to use large sampling sizes or high amounts of fuels. This will lead to faster results, improved storage safety, while being more environmental friendly as less fuel is used and discarded.


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Characterization of an innovative fed-batch microplate feeding system

Timm Keil1, Barbara Dittrich2, Sebastian Selzer3, Jochen Büchs1

1) Aachener Verfahrenstechnik – Biochemical Engineering, RWTH Aachen University

2) DWI – Leibniz Institut for Interactive Materials, RWTH Aachen University 3) PS Biotech – Herzogenrath, Germany

Most industrial bioprocesses nowadays apply fed-batch operation mode to improve space-time yield and to provide an optimal production environment for microorganisms. To identify potential production strains, small-scale high-throughput screenings experiments are conducted, preferably in microplates.

Up to now, these screening procedures are mostly conducted in batch operation mode, which is in contrast to the above mentioned commonly applied industrial conditions. Screening in batch operation mode results in a selection of suboptimal strains for fed-batch bioprocesses due to phenomena like overflow-metabolism, substrate inhibition and/or catabolite repression of product formation [1]. For a selection of optimal strains in small-scale screening systems it is crucial to apply conditions similar to production already during these early steps of process development.

This study introduces an innovative and easy to use fed-batch microplate system. Glucose is released as soon as the cultivation media gets in contact with a matrix at the bottom of each well. With these microplates it is highly uncomplicated to conduct experiments with continuous feeding of nutrients. The plates are produced by pouring a homogeneous mixture of siloxane matrix and glucose into each well of a microplate and a subsequent cross-linking step. This study investigates the glucose release of different siloxane matrix recipes and how varying cultivation conditions influence the release of glucose.

The glucose amount released in each well is determined in different synthetic and complex media and varying environmental conditions. Cultivations were conducted with E.coli BL21 DE3 as a model organism. The oxygen transfer rate was monitored online in each well [2], which gives the opportunity to investigate a variety of different cultivation conditions and their specific impact on growth and metabolic activity. Additionally, samples were taken from selected cultures and analyzed for glucose, acetate, ammonia, pH and cell dry weight. It was shown that there was a significant difference between different siloxane recipes regarding both the total amount of glucose released and dependence of releasing rate on pH and osmolality. For cultivations in defined synthetic media a high well-to-well reproducibility was found. Oxygen transfer rates up to 30 mmol/L/h could be achieved during the fed-batch phase of the cultivations. With varying culture volumes in each well, different glucose release rates could be adjusted, which leads to a corresponding respiration activity.

In conclusion, the newly developed microplate feeding system (Feed Plate®) is an ideal tool for mimicking industrial conditions in small-scale high-throughput screening procedures. Applying this technology in future screening experiments will result in the selection of the best production strains already in early stages of process development.

Literatur 1 Scheidle M, Jeude M, Dittrich B et al. (2010) High-throughput screening of Hansenula

polymorpha clones in the batch compared with the controlled-release fed-batch mode on a small scale. FEMS Yeast Research; 10 (1): 83–92

2 Flitsch D, Krabbe S, Ladner T et al. (2016) Respiration activity monitoring system for any individual well of a 48-well microtiter plate. J Biol Eng; 10 (1): 21


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Modular “Soft-sensor” based platform using process intelligence for robust online fermentation control

Jonathan Sturm1, Phillip Brunek1, David Bittner1, Holger Müller2, Frank Eiden1

1AG Bioprozesstechnik Westfälische Hochschule, Recklinghausen, Germany; 2BlueSens gas sensor GmbH, Herten, Germany

Measuring and monitoring various process parameters like off-gas, product yields, cell growth, culture vitality, metabolic activities and carbon distributions is crucial for analysing microbial fermentations. While some of these parameters can be displayed in primary data, others need to be calculated or estimated to generate secondary data. Software based mathematic algorithms, so called “soft-sensors” can be used to provide this information in real-time, which is important to gain knowledge of your process. Here, we introduce the advanced process intelligence system “ProcessShield”, which is a soft-sensor-based monitoring platform for observing, stabilizing and optimizing fermentation processes. It is purposed to collect primary process data and calculate secondary data, for instance the respiratory quotient, biomass and yield coefficients of the process online. The modular structure of this tool makes it easier to adapt and enhance its performance to solve different scientific challenges in the context of microbial processes. The application “Biomass Observer” calculates the amount of vital biomass and various process rates with data provided by online CO2, O2 and glucose measurement, as well as providing the obtained information in a strictly specified manner. The modular design eases the development of tailor-made extensions to “ProcessShield”. For example, the "Process-Protector"-Add-on combines additional primary data, such as pH or pO2 with secondary data provided by the “Biomass-Observer” to quickly detect possible limitation effects of the fermentation in real-time. Furthermore, it has a semantic interface which displays different alerts for variances of adjusted process parameters and possible counteractive measures for the user. While most of the mentioned features are used to simplify the monitoring of important process data, the “ProcessShield”-platform gives new possibilities in fermentation control.


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Feedback controlled process regulation (FCPR) and stoichiometric approximations of flux ratios based on a

modular soft-sensor platform

Timo Kloß1, Dominik Vogt1, David Bittner1, Holger Müller2, Frank Eiden1

1AG Bioprozesstechnik Westfälische Hochschule, Recklinghausen, Germany; 2BlueSens gas sensor GmbH, Herten, Germany

Simplification, monitoring and utilization of various process parameters within a microbial fermentation, is crucial for controlling biotechnical processes. The measuring and control tool “ProcessShield” monitors primary process parameters like off-gas, substrate concentration, dissolved oxygen and pH-values. Secondary parameters, such as the physiological cell status, metabolic activities and carbon distributions can be calculated and estimated in real time using primary parameters and software based mathematic algorithms, so called “soft-sensors”. This tool has a modular design, making it easier to create and advance its performance to solve specific challenges in the context of microbial processes. The “Feeding-Distributor”-module allows reactions towards the cultures vitality in fed-batch fermentations. Estimations of the carbon distributions in continuous fermentations can be performed with a “Flux-Calculator”-module. Usually information about microbial metabolic fluxes is collected by cultivating the microorganisms with 13C marked glucose.

The “Flux-Calculator”-module estimates and displays carbon flux distributions of the microbial process with a short time offset. It uses a stoichiometric calculation, which depicts certain reactions of the microbes in a mathematic matrices-model. Data can be collected by experimental chemostat-fermentations, to precise the flux model and to improve the prediction of efficient carbon distributions. Therefore, it leads to a better understanding of the metabolic activities during a microbial fermentation and helps in the detection of metabolic bottlenecks, leading to approaches for specific metabolic or process engineering. By the use of this module an in silico flux analysis is created, which could be an additional alternative and a cheap first approach, compared to 13C glucose fermentations. While the “Flux-Calculator” simplifies and gains important process data, the “Feeding-Distributor”-tool is not restricted to creating output data. This module actively returns input data to the controlling interface, utilizes a “Feedback-Controlled-Process-Regulation” (FCPR) and realizes a “feed-on-demand” strategy for fed-batch fermentations. In this context, the process is optimized by special feeding-profiles, which depend on the current nutrient claim of the cell. The varying feeding intervals lead to an extended production phase. Taking the actual needs of the microbial culture into consideration opens new possibilities in online process control.


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Industrielle Kultivierung von Mikroalgen in FPA Photobioreaktoren

P. Scherz2, S. Haindl2, Prof. Dr. W. Trösch1, Dr. P. Ripplinger2

1 Universität Hohenheim, Institut für Lebensmittelwissenschaft und Biotechnologie, Garbenstraße 28, 70599 Stuttgart

2 Subitec GmbH, Julius-Hölder-Straße 36, 70597 Stuttgart

[email protected]

Schlüsselwörter:

Flat-Panel Airlift, Kultivierung, Mikroalgen, Nachhaltigkeit, Photobioreaktor

Neue Wege in der Bioökonomie: Mikroalgen bergen ein bislang nur in Ansätzen ausgeschöpftes, enormes ökologisches und wirtschaftliches Potential. Mit dem patentierten Flat-Panel Airlift (FPA)-Photobioreaktor der Subitec GmbH gelingt die kostengünstige, industrielle Kultivierung von Mikroalgen in einem geschlossenen System. Unter Nutzung von industriellen CO2-Quellen sowie natürlichem Sonnenlicht oder künstlichen Lichtquellen werden wertvolle Inhaltsstoffe für die Kosmetik-, Pharma-, Futter- und Nahrungsmittelindustrie gewonnen. Zudem ermöglichen integrierte Kreislaufprozesse auch die energetische Nutzung der Biomasse, z.B. in Form von Biokraftstoff. Im heutigen wirtschaftlichen Fokus stehen verstärkt hochpreisige Extrakte, wie antioxidative Farbstoffe (Astaxanthin) oder hochwertige ω-3 Fettsäuren, die beispielsweise in der Aquakultur eingesetzt werden.

Die Firma Subitec GmbH wurde im Jahr 2000 als Spin-off des Fraunhofer-Instituts für Grenzflächen- und Bioverfahrenstechnik (IGB) gegründet und bietet ein einzigartiges, patentiertes Photobioreaktorsystem. Dieses basiert auf der FPA-Technologie, welche sowohl im Labormaßstab als auch zur industriellen Kultivierung von Mikroalgen bereits bei zahlreichen Pilot- und Produktionsanlagen für namenhafte Kunden im Einsatz ist. Die FPA-Photobioreaktoren sind in drei verschiedenen Kultivierungsvolumina verfügbar, wobei die 6 Liter und 28 Liter Reaktoren für Prozessentwicklung und -optimierung im Labor- und Pilotmaßstab vorgesehen sind, während die 180 Liter Reaktoren für die industrielle Kultivierung verwendet werden. Alle Reaktoren sind charakterisiert durch die herstellungsseitige Einarbeitung von statischen Mischern und Downcomer-Kompartimenten, welche zu einer idealen horizontalen bzw. vertikalen Durchmischung führen und somit die spezifische Lichtausbeute im Vergleich zu anderen Systemen (z.B. Blasensäulen) wesentlich verbessern und Produktivität und Ausbeuten signifikant maximieren. Für die Kultivierung wird ein Gemisch aus technischem CO2 und Luft in die Zellsuspension injiziert. Angetrieben durch die Auftriebskraft ermöglichen CO2-angereicherte Luftblasen eine homogene Verteilung von Nährstoffen und Mikroalgenzellen sowie eine konstante Allokation der Zellen zwischen der beleuchteten Reaktoroberfläche und dem dunklen Innenraum der Reaktoren.



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Prozesskontrolle mittels elektooptischer Messung von Bacillus-Kulturen im Bioreaktor

Sandra Dounia1, Alexander Angersbach2, Martin Senz1

1Versuchs- und Lehranstalt für Brauerei in Berlin, Forschungsinstitut für Biotechnologie und Wasser,

Fachgebiet Bioprozesstechnik und Angewandte Mikrobiologie, Berlin, Deutschland 2EloSystems GbR, Berlin, Deutschland

Angesichts der steigenden Anforderungen an standardisierte, reproduzierbare Bioprozesse nimmt die Prozessanalysetechnologie (PAT) einen hohen Stellenwert in deren Entwicklung und Optimierung ein. Konventionelle Messmethoden (T-, pO2-, pH-Sonden etc.) dienen als Grundlage zur Überwachung und Analyse solcher Prozesse, erfassen jedoch komplexe biochemische Vorgänge während der Kultivierung nicht ausreichend. Eine vielversprechende Analysetechnologie zur in vivo Charakterisierung von Bakterienkulturen ist die elektrooptische Analyse, bei der die Polarisierbarkeit von Zellen bedingt durch den Gehalt intrazellulärer und membrangebundener Ladungsträger als charakteristisches Merkmal des zellulären Zustandes genutzt wird.

Das für die Prozessentwicklung von Bacillus-Fermentationen verwendete Messmodul EloTrace® gewährleistet eine vollautomatische Probenahme und -vorbereitung sowie die kontinuierliche, nicht-invasive Messung und Datenaufzeichnung von optischer Dichte, Zellgröße und Polarisierbarkeit (AP-Level) als Parameter des physiologischen Zustandes der Zellen. Prozessbegleitend wurde das Gerät für die Echtzeitmessung und Charakterisierung physiologischer und morphologischer Veränderungen des vegetativen Wachstums und der Sporulation von industrierelevanten Bacillus - Stämmen eingesetzt. Die zeitlichen Verläufe der Polarisierbarkeitslevel reflektieren Veränderungen der intrazellulären Matrix ebenso wie Modifikationen der Zellmembranen während der Kultivierung. So konnten Polarisierungsprofile mit dem Einsetzen der Sporulation korreliert werden, welche auf der Umstrukturierung der Zelle basiert.

Die Nutzung des elektrooptischen Messmoduls als Überwachungstool erweitert die Möglichkeiten der Prozesskontrolle und ermöglicht es, den wachsenden Ansprüchen an Reproduzierbarkeit, Qualitätskontrolle und -sicherung biotechnologischer Prozesse zu entsprechen.


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Modelling the Crabtree Effect in Saccharomyces cerevisiae by Dynamic Flux Balance

Modeling with a reduced stoichiometric Model

Sven Wegerhoff* and Sebastian Engell*

* TU-Dortmund, Emil-Figge-Str. 70, 44227 Dortmund

Saccharomyces cerevisiae is a species of yeast, which are eukaryotic microorganisms that belong to the fungus kingdom. S. cerevisiae is usually known as Baker's yeast or Brewer's yeast according to its traditional application for baking, winemaking and brewing. Other applications of S. cerevisiae are the production of recombinant proteins or the production of bioethanol and it is an important model organism in biological research. This high variety of application ranges leads to an increasing demand of yeast cells with an annual production of 900,000 tons in Europe of which 600,000 are consumed in the European Union (www.lesaffre.com). The yeast cells are produced in a series of fed batch reactors which are fed with oxygen and molasses that contain glucose as the main carbon source. One problem during the cultivation process is that the cell culture can switch to the undesired production of ethanol, and when the ethanol concentration is at the end of the process greater than a tolerable range then the batch cannot be sold. For increasing the yield while avoiding the switch to ethanol production by the cells, a suitable dynamic model that bases on a dynamic modeling of the fluxes is proposed that can be used for example to control the process within a model predictive control. The model must be able to predict the switch to ethanol production and to describe the growth of the cell culture so that the operating policies can be optimized. This work presents a novel approach that uses a reduced dynamic metabolic model which is derived from biochemical stoichiometric network where the transition to ethanol production is realized by taking ATP as a key regulator. The dynamic model derived was fitted to different experimental data and has shown in each case a good fit. It is shown that this method is very flexible and can be used to extend also further metabolites to the model or it can be transferred to other microorganisms.


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Single-cell physiological analysis

Katrin Rosenthal1, Christian Dusny

2, Andreas Schmid

2

1TU Dortmund University, D-44227 Dortmund, Germany

2Centre for Environmental Research UFZ, D-04318 Leipzig, Germany

Microfluidic lab-on-a-chip (LOC) devices open up new possibilities in biological research by

enabling single cell cultivations and analyses under controlled environmental conditions.1

Single cell analysis is currently an important research topic in industrial biotechnology for studying physiological functions and mechanisms without relying on average values of a population. A new microfluidic LOC device was developed and used for studying the physiology of the industrially relevant microorganism Corynebacterium glutamicum at a

single cell level. The new Envirostat (Envirostat = environment, constant2) is versatile, chemically inert and can be used for contactless single cell cultivation under constant

environmental conditions.3 Manufacturing via direct fusion bonding with high temperature provides LOC devices with an exceptional operational stability and defined surface chemistry. The microelectrodes in the microchannels enable selective and gentle cell manipulation and trapping via negative

dielectrophoresis (nDEP). The preservation of functionality and selectivity of the electrodes after thermal bonding is proven, as well as a high efficiency of the cell trapping process. Cellular parameters were quantified during single cell cultivation addressing the substrate uptake rate and production rates of amino acids. Analytical technologies typically used at a population level were insufficiently sensitive for single cell metabolite analyses. Therefore methodologies based on optical fluorescence readouts were applied. Glucose uptake by single C. glutamicum cells was investigated using a fluorescent glucose analog. Interestingly, the glucose analog was taken up by some other transport systems next to the PTS. Furthermore, the uptake of the analog was dependent on the available glucose concentration. Little is known about the influence of glucose on other transport systems than the PTS in C. glutamicum. Our results thus form a basis for further studies of regulatory mechanisms controlling the metabolism of C. glutamicum. The influences of medium components on L-lysine production and secretion by C. glutamicum cells were also investigated. It turned out that individual medium components, which are typically used in microbial L-lysine production processes, either hamper or support L-lysine production. Secretion rates were doubled for cells cultivated with extremely low extracellular L-lysine concentrations in the cultivation medium. Increased chemical concentration gradients, as a result of low extracellular L-lysine concentrations, were identified as factors limiting L-lysine secretion rates. This shows the high potential for process optimization to increase production yields. Furthermore, single C. glutamicum cells were cultivated under phosphate limitation during L-lysine production. The absence of extracellular phosphate induced the formation of subpopulations. Cells were either growing and producing or not growing and not producing. The formation of subpopulations might reflect the different metabolic prerequisites of individual cells, but this remains to be elucidated. Such inhomogeneities can have severe consequences on biotechnological process performance and hence constitute a central development focus for optimization.

1 Dusny C, Schmid A (2015) Microfluidic single-cell analysis links boundary environments and individual microbial phenotypes. Environ Microbiol 17 (6):1839-1856

2 Kortmann H, Chasanis P, Blank LM, Franzke J, Kenig E, Schmid A (2009) The Envirostat - A new bioreactor concept. Lab Chip 9:576-585

3 Rosenthal K, Falke F, Frick O, Dusny C, Schmid A (2015) An inert continuous microreactor for the isolation and analysis of a single microbial cell. Micromachines 6 (12):1836-1855


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Zeit [Minuten]

Abbildung 2: A- Strukturformel von Penicillin; B- Ausschnitt des Referenzsekundärmetabolitprofils von Pyxidicoccus fallax HKI727

Einfluss von Prozessbedingungen auf die Sekundärmetabolit-Produktion- P. fallax HKI727 als Beispiel

für die Aktivierung stiller Gen-Cluster

Jenny Schwarz und Stephan Lütz

Lehrstuhl für Bioprozesstechnik, Fakultät für Bio- und Chemieingenieurwesen, TU Dortmund, Dortmund, Deutschland

[email protected]

Sekundärmetabolite werden von vielen Pflanzen und Mikroorganismen produziert und sind interessant, weil sie pharmazeutisch aktiv sein und einen Nutzen für den Menschen haben können. [1] Beispiele für pharmazeutisch aktive Sekundärmetabolite sind das Antibiotikum Penicillin (Abbildung 2-A) und Zytostatika wie Bleomycin. Die Untersuchung des biosynthetischen Potentials von Mikroorganismen ist wichtig, da die Behandlungsmöglichkeiten einiger bakterieller Infektionen durch die Entwicklung von Resistenzen gegen vorhandene Antibiotika sehr eingeschränkt sind und dementsprechend neue Wirkstoffe benötigt werden. [2] Auf dem Genom sind Sekundärmetabolite vor allem durch Gen-Cluster kodiert, die nur unter bestimmten Umgebungsbedingungen exprimiert werden. Da diese Bedingungen in der Regel im Labor nicht gegeben sind und viele Sekundärmetabolite dort nur in sehr geringen Mengen oder gar nicht synthetisiert werden, wird oft von stillen Gen-Clustern gesprochen. Mit bioinformatischen Methoden wie dem Online-Tool antiSMASH [3] kann das biosynthetische Potential von Mikroorganismen analysiert werden und es können Vorhersagen über mögliche Produkte getroffen werden. [4] Solche Genomanalysen sind sinnvoll um geeignete Produzenten für Sekundärmetabolite zu identifizieren und wurden für 32 ausgewählte Mikroorganismen durchgeführt.

Im Gegensatz zu molekularbiologischen Methoden beinhaltet der bioverfahrens-technische Ansatz zur Aktivierung stiller Gen-Cluster die Änderung physikalischer und chemischer Parameter der Kultivierungsbedingungen, um die Produktion mehrerer und zudem neuer Verbindungen von einem Mikroorganismus anzuregen. [5] Am Beispiel von Pyxidicoccus fallax HKI727 wird dieser Ansatz zur Aktivierung stiller Sekundärmetabolit-Gen-Cluster

[1] W.-D. Deckwer, W. Ackermann, Römpp-Lexikon Biotechnologie und Gentechnik: Eintrag Sekundärmetabolite, Thieme 1999. [2] A. L. Demain, Applied microbiology and biotechnology 1999, 52 (4), 455. [3] T. Weber et al., Nucleic acids research 2015, 43 (W1), W237-W243. [4] H. B. Bode, B. Bethe, R. Höfs, A. Zeeck, ChemBioChem 2002, 3 (7), 619. [5] J. S. Zarins-Tutt et al., Natural product reports 2016, 33 (1), 54.

I [10 6 mAU]

B A


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Identifying potential novel biocatalysts for hydroxylation processes by genome mining

Lisa Marie Schmitz and Stephan Lütz

Chair for Bioprocess Engineering, Department of Bio- and Chemical Engineering, TU Dortmund University

While P450 monooxygenases are found in nearly all kingdoms of life their number within organisms differs greatly. They are versatile biocatalysts as they can incorporate oxygen into activated and non-activated C-H bonds for a broad variety of substrates. The catalyzed reactions comprise among others hydroxylations, epoxidations, dealkylations and deaminations, while P450 monooxygenases often act in a regio- and stereoselective manner 1. Due to their high catalytic potential they can modify already existing chemical compounds leading to diversification of substances and thus new drug candidates or metabolites. Therefore, they are considered outstanding biocatalysts for organic chemistry and pharmacological drug development 2, 3. In order to take advantage of their full catalytic potential, it is essential to identify new microbial P450 monooxygenases from bacteria and fungi and investigate their potential to hydroxylate different substrates. To overcome issues regarding the need for redox partner systems, the use of microorganisms as whole cell biocatalysts is an option. Despite their highly divers sequences all P450 monooxygenases have a conserved region containing a heme iron-center which is bound to the protein via a cysteine 4. Consequently, a bioinformatics approach screening for conserved regions, can be used to identify novel microbial P450 monooxygenases. The high number of genome sequencing projects drastically increased the number of annotated P450 monooxygenases within the last decades. The results were summarized in different databases, such as CYPED 5. Based on this database and genome mining, promising microorganisms with a high number of P450 monooxygenases preferably from divers families or superfamilies can be found. Identified bacteria mainly belong to the gram-positives, including Streptomycetaceae, Mycobacteriaceae, Pseudonocardiaceae and Nocardiaceae with a maximum of 80 P450 and 20 to 30 superfamilies per genome. For fungi, interesting organisms mainly derive from the Ascomycetes including Glomerellaceae, Nectriaceae and Pleosporaceae with up to 200 P450 and 40 to 50 superfamilies.

1. Sono, M., Roach, M. P., Coulter, E. D. & Dawson, J. H. Heme-Containing Oxygenases. Chem Rev 96, 2841–2888 (1996). 2. Schroer, K., Kittelmann, M. & Lütz, S. Recombinant human cytochrome P450 monooxygenases for drug metabolite synthesis. Biotechnol. Bioeng. 106, 699–706 (2010). 3. Girvan, H. M. & Munro, A. W. Applications of microbial cytochrome P450 enzymes in biotechnology and synthetic biology. Curr. Opin. Chem. Biol. 31, 136–145 (2016). 4. Poulos, T. L. & Johnson, E. F. Structures of cytochrome P450 enzymes. In: Ortiz de Montellano (ed) Cytochrome P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry, third edition. (Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, 2005). 5. Gricman, Ł., Vogel, C. & Pleiss, J. Identification of universal selectivity-determining positions in cytochrome P450 monooxygenases by systematic sequence-based literature mining. Proteins Struct. Funct. Bioinforma. 83, 1593–1603 (2015).1.


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Impact of solvent tolerance and carbon source availability on styrene epoxidation with Pseudomonas taiwanensis VLB120

Jan Volmer1, Martin Lindmeyer1, Julia Bielecki1, Andreas Schmid2, Bruno Bühler2

1TU Dortmund, Lehrstuhl für Biotechnologie, Emil-Figge-Straße 66, 44227 Dortmund, 2Helmholtz Zentrum für Umweltforschung UFZ, Department Solare Materialien,

Permoserstraße 15, 04318 Leipzig

The toxicity of many substrates and products often hampers biotechnological processes for chemical synthesis. The application of solvent tolerant bacteria is frequently highlighted as elegant solution to overcome toxicity issues. Recently, P. taiwanensis VLB120∆C∆ttgV was constructed aiming at constitutive solvent tolerance without the need for tedious adaptation processes[1]. Nitrogen-limited resting cells of this strain showed very high styrene epoxidation activities up to 67 U gCDW

-1 making it a promising alternative to established solvent sensitive biocatalysts for the production of (S)-styrene oxide. In this study, the styrene epoxidation performance of P. taiwanensis VLB120∆C∆ttgV was investigated in batch and fed-batch cultivation setups. It could be shown that under glucose excess conditions, the strain increased glucose uptake probably to cover the high energy demands for solvent tolerance mechanisms. In comparison to resting cells, styrene monooxygenase expression levels as well as the specific styrene epoxidation rates were increased. However, the subjection to substrate inhibition required a setup enabling controlled substrate addition. By applying a two-liquid phase setup with Bis(2-ethylhexyl)phthalate (BEHP) serving as substrate reservoir and product sink and by providing glucose excess conditions to allow high glucose uptake rates, the highest reported styrene epoxidation activities (180 U gCDW

-1) as well as improved yields on glucose and biomass were obtained.

In conclusion, the application of P. taiwanensis VLB120∆C∆ttgV in high cell density setups will outcompete existing bioprocesses for the production of (S)-styrene. Furthermore, the solvent tolerance of P. taiwanensis VLB120∆C∆ttgV might also be exploited to reduce the volumetric amount of environmentally critical BEHP as extractive phase.

References

[1] Volmer et al., 2014, Appl. Environ. Microbiol. 80(20): 6539-6548


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Optimizing the Heterologous Expression of Long-chain Rhamnolipid Congeners in Pseudomonas putida KT2440

Simon Luchta, Fabiola Weggenmanna, Andreas Wittgensb, Frank Rosenaub, Marius Henkela and Rudolf Hausmanna

aInstitute of Food Science and Biotechnology, Department of Bioprocess Engineering, University of Hohenheim, Stuttgart, Germany

bUlm Center for Peptide Pharmaceuticals (U-PEP), Ulm University, Ulm, Germany

Several microorganisms are known to produce a wide variety of surface-active substances, which are referred to as biosurfactants. An interesting example for biosurfactants are rhamnolipids, glycolipids mainly known from Pseudomonas aeruginosa produced during cultivation on different renewable substrates such as vegetable oils or sugars. Rhamnolipids display very promising physico-chemical properties, and may therefore be used as alternatives to widely-used synthetic surfactants. To circumvent pathogenicity of P. aeruginosa, a recombinant approach with the bacterium Pseudomonas putida KT2440, which naturally produces the precursors required for the biosynthesis of rhamnolipids, was chosen.

Besides rhamnolipids naturally occurring in cultures of P. aeruginosa, different Burkholderia sp. such as Burkholderia glumae are known to produce longer-chain rhamnolipids. With differing physico-chemical properties, these long-chain rhamnolipids may be interesting products for supplementation of surfactant formulations to adjust overall surfactant properties. For this purpose, the central genes involved in rhamnolipid biosynthesis rhlAB from B. glumae were recombinantly expressed in P. putida KT2440.

The main drawback however is the comparably low titer obtained during bioreactor cultivation, which do not yet allow for an economic production in large industrial scale. In this study, different cultivation conditions, medium and feed compositions with the aim of increasing heterologous long-chain rhamnolipid production are investigated.


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Wissensbasierte Prozessintelligenz Neue Wege zu stabilen Bioprozessen

Aupert, Florian, Solle Dörte, Scheper Thomas Institut für Technische Chemie, Universität Hannover

Um biotechnologische Produktionsprozesse zuverlässig und sicher steuern zu können, bedarf es einer schnellen und sicheren Methode der Prozesskontrolle. Stand heute ist, dass die meisten Prozessgrößen offline durch Laboranalytik bestimmt werden. Oft reicht dieses Vorgehen jedoch nicht aus, um eine schnelle Reaktion auf Prozessveränderungen zu gewährleisten. Für eine höhere Prozesseffizienz bedarf es einer zunehmenden Automatisierung auch zur Absicherung des Produktionsprozesses.

Vor diesem Hintergrund haben sich unter der Leitung der Sartorius AG verschiedene Firmen aus dem Bereich der Biotechnologie, der Sensortechnik und der Datenverarbeitung mit verschiedenen Universitätspartnern zusammengeschlossen und die strategische Allianz „Wissensbasierte Prozessintelligenz“ ins Leben gerufen (Förderkennzeichen 031A616). Das Volumen der in den ersten drei Jahren geförderten Projekte umfasst zehn Millionen Euro.

Mit der strategischen Allianz “Wissensbasierte Prozessintelligenz” wird ein Beitrag für die Automatisierung und Optimierung von biotechnologischen Produktionsprozessen geleistet. Für die Anwenderbetriebe ergeben sich durch die Nutzung intelligenter Sensornetzwerke wesentliche Vorteile. So werden biotechnologische Prozesse sicherer und besser kontrollierbar. Über die vorgestellten Ansätze können kostenintensive fehlerhafte Produktionschargen frühzeitig erkannt und vermieden werden. Damit leistet die Allianz einen Beitrag für eine sichere, energieeffiziente Fertigung und zu einem erhöhten Verbraucherschutz.

Die gewonnenen Erkenntnisse können in vielen Bereichen der biotechnologischen Herstellung von Nahrungs- und Genussmitteln sowie pharmazeutischen Produkten zum Einsatz kommen. Neue Prozesse und Produkte können mit geringerem Risiko realisiert werden


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Mini Pilot Plant methods for quantitative phenotyping of recombinant protein secretion with Corynebacterium glutamicum

J. Hemmerich1,2, C. Steffens1, L. Freier1, P. Rohe1, B. Kleine1, S. Jurischka1,2, R. Freudl1,2, W. Wiechert1,2, E. von Lieres1, M. Oldiges1,2

1: Institute of Bio- and Geosciences, IBG-1: Biotechnology, Forschungszentrum Jülich, Jülich/DE

2: Bioeconomy Science Center (BioSC)

Modern molecular biology allows to engineer microbial production organisms on the genetic level, leading to great progress in molecular understanding of microbial cells. Due to the complexity of such microbial cell factories, complete in-silico construction and behavior simulation of designer bugs is still not possible. Hence, the detailed characterization of newly constructed production strains needs to rely on screening campaigns, which are increasingly conducted in microbioreactor (MBR) systems. Advanced methods from a Mini Pilot Plant (MPP) toolbox are presented, highlighting the need to maximize experimental output from MBRs used for quantitative phenotyping.

First, online monitoring of culture growth allows for precise sampling at the end of the exponential growth, leading to reduced statistical error in product quantification compared to sampling after undetermined stationary phase from simple overnight cultivations [1]. As application example, screening of a Sec signal library for optimizing cutinase secretion is shown[2].

Second, an improved method for repeated low-volume sampling of individual cultivations to derive regression-based specific yields and rates is presented. The method is applied to screen several genome-reduced C. glutamicum strains[3] for improved cutinase secretion efficiency.

Third, a Kriging-based iterative optimization framework is shown exemplarily for medium optimization with C. glutamicum secreting GFP as model protein[4]. As result, GFP titer could be doubled, and further data highlights the need for strain-specific medium optimization.

In conclusion, the presented methods can be hyphenated in a flexible manner with respect to objectives from both basic and applied research. Future research in industrial biotechnology will focus on automated data processing, integration of mathematical modelling of systems behavior, and transferability of MBR screening results into pilot- and production scale. The vision is that the combination of in-silico design, microscale experimentation and automated data processing and interpretation will be an enabling framework for accelerated industrial bioproduction development.

References

[1] Rohe et al. Microb. Cell Fact. 2012 11:144 [2] Hemmerich et al. Microb. Cell Fact. 2016 15:208 [3] Unthan et al. Biotech. J. 10(2): 290:301 [4] Freier et al. Eng. Life Sci. 2016 16(6): 538:549


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Speeding up bioprocess-development for filamentous organisms

Joachim Koepff1, Melanie Klauer1, Mohamed Labib1, Tobias Busche2, Jörn Kalinowski2,

Wolfgang Wiechert1, Marco Oldiges1

1IBG-1: Biotechnologie, Forschungszentrum Jülich GmbH, Jülich, Germany 2 Bielefeld University, Center for Biotechnology (CeBiTec), Microbial Genomics and

Biotechnology, Bielefeld, Germany

Bacteria of the genus Streptomyces are promising candidates for heterologous protein expression and production of pharmacological active compounds. Having fast genetic engineering tools available, large strain libraries can be built up in very short time. Screening these libraries and performing subsequent bioprocess development studies demand to test a high number of different conditions, which inevitably leads to a very high number of individual biological experiments. This effort is even intensified, as the complex filamentous growth behavior of Streptomyces sp. result in larger variability between independent biological experiments, compared to bisecting bacteria. Therefore, a larger number of parallel cultivations are needed to verify phenotypic differences with sufficient statistical confidence. Surprisingly, so far only very few approaches focused on sophisticated growth and production characterization methods for this important class of producer organisms.

By applying techniques from automated and parallelized µL-scale cultivation while paying attention to the special needs of filamentous organisms, we try to accelerate the strain characterization process also for this industrial relevant class of organisms. An automated microtiter-plate based cultivation system is applied to gain a comprehensive set of biological information throughout the bacterial growth process: Beside the non-invasive measured on-line parameters (pH, dissolved oxygen, fluorescence and backscatter), we additionally gain further signals, by realizing robot-assisted sampling techniques and subsequent cell separation by filtration. This allows both, gaining reliable bio-dry-mass information, as well as cell free supernatant sample for further analysis, from one single milliliter-scale cultivation cavity. Moreover, morphology, as one of the key parameters for filamentous organisms, is accessed by at-line light microscopy.

To prove the usability of this novel workflow we conducted comprehensive comparison to our established 1 L lab-scale cultivation system. The results revealed no significant differences with respect to growth rate, substrate uptake and morphology. This striking discovery is not obvious, especially due to the different energy input, i.e., shaking at small scale vs. stirring at lab-scale. To further examine this observed comparability, transcriptomics via next generation sequencing analysis were applied at both scales.

The novel cultivation workflow provides very efficient screening of Streptomyces strain libraries enabling acceleration of strain phenotyping and bioprocess development with filamentous organisms. We applied our workflow to screen a set of 58 genome-reduced S.lividans strains, where only a small number of strains showed significant growth deficiencies or morphological effects and could be selected for more detailed analysis. With the large set of parameters available from the microtiter-plate based cultivation, in future, many questions may be addressed in small scale directly.


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Microfluidic cultivation chamber for the investigation of synthetic microbial co-cultures on single-cell level:

From the development to first application

Annika Rudat, Wolfgang Wiechert, Dietrich Kohlheyer and Alexander Grünberger

Institute of Bio- and Geosciences, IBG-1: Biotechnology, Forschungszentrum Jülich GmbH (Jülich Research Center), Germany

Microbial communities are fascinating and complex systems involving an extensive diversity of biological reactions. Knowledge and understanding of these processes is of high relevance for current and future processes in biotechnology, since microbial communities already play central but often poorly understood roles, for example, in wastewater treatment, biogas production, and bioremediation [1, 2]. Deeper insight into the interaction between multiple strains and species is mandatory to understand natural as well as synthetic communities. Therefore, novel analytical methods need to be developed facilitating the analysis of microbial interactions and their underlying processes at the single-cell level.

In this contribution, we demonstrate the development and application of a microfluidic cultivation device involving two interacting strains. Similar to previously developed systems for the investigation of isogenic colonies only [3,4], the device incorporates several hundred parallel chambers of picoliter volume with a continuous medium infusion. The present configuration additionally contains integrated sieve structures with a sub-micrometer pore size facilitating diffusion based interaction, cellular communication, cross-feeding, etc. of two opposing colonies. The chamber height of approximately 1 µm restricts bacterial growth to a cell monolayer, which is ideally suited for image based time-lapse microscopy with full spatiotemporal resolution.

The system can be used to determine growth rates, interactions and cell-to-cell heterogeneity of two interacting microbial strains. As a proof of principle the behavior of C. glutamicum Δ LysA, a lysine auxotroph strain, and its interaction with different Corynebacterium glutamicum lysine production strains was investigated.

Our results show that the single-cell analysis concept for co-cultivations has the potential to investigate bacterial interactions of multiple strains and species in more detail. This lays the foundation for an improved understanding of natural and synthetic co-cultures and could lead to novel strategies of designing and establishing novel microbial bioprocesses.

[1] Jagmann, N., et al., (2014). Journal of Biotechnology, 184:209-218. [2] Peng, X., et al., (2016). Current Opinion in Biotechnology, 14:103-109. [3] Grünberger, A., et al., (2012). Lab on a Chip, 12(11): 2060-2068. [4] Grünberger, A., et al., (2015). Cytometry


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Integrated Framework for the Accelerated Development of Phototrophic Bioprocesses

Holger Morschett1, Wolfgang Wiechert1, Marco Oldiges1

1 Institute of Bio- and Geosciences, IBG-1: Biotechnology, Forschungszentrum Jülich GmbH,

Jülich, Germany

The design of industrial scale microagal processes requires conducting numerous experiments regarding strain screening and process parameter optimization. These early stage, but essential tasks, are restricted by the comparably slow growth of algae and the high number of potentially interacting input variables. Thus, an urgent need of tools for phototrophic cultivation at elevated throughput has been identified and some prototypes have been described in literature. However, there is no micro-photobioreactor system available that provides sufficiently defined cultivation conditions at a sufficient degree of parallelization.

In this study, we take advantage of a special BioLector® (m2p-labs) prototype enabling 48-fold parallelized phototrophic cultivation in microtiter plates. The setup was realized by the integration of a newly designed modular LED-based illumination unit. Besides providing well-defined process conditions, the system enables non-invasive biomass monitoring via scattered light measurement [1].

Focusing lipid production with Chlorella vulgaris as a model process, a blueprint concept for the accelerated development of phototrophic bioprocesses was developed and the scalability of the system compared to established laboratory-scale setups was validated [2]. In this context, the aforementioned microbioreactor system is assisted by tailored workflows for time and material efficient strain maintenance [3] as well as for automated product analytics [4]. Meanwhile an interface to automated media preparation and sophisticated experimental design enables additional potential in process development by further minimization of hands-on-times and focusing on experimental conditions providing maximal information content [5].

[1] Morschett et al. (2017). DOI: 1/bit.26051 [2] Morschett et al. (2017). DOI: 10.1007/s00449-016-1731-5 [3] Morschett et al. (2016). DOI: 10.1002/elsc.201500056 [4] Morschett et al. (2016). DOI: 10.1186/s12934-016-0433-7 [5] Morschett et al. (2017). DOI: 10.1186/s13068-017-0711-6

http://dx.doi.org/10.1016/j.rser.2014.04.007


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Microfluidic heterogeneity analysis of fluorescence-based gene

expression of industrially relevant production strains on single-cell level

Alina Burmeister1, Nora Lisa Bitzenhofer2, Alexander Grünberger1, Dennis Binder2, Thomas

Drepper2, Wolfgang Wiechert1 and Dietrich Kohlheyer1

1Institute of Bio- and Geosciences, IBG-1: Biotechnology, Systems Biotechnology,

Forschungszentrum Jülich GmbH (Juelich Research Center), Germany 2Institute of Molecular Enzyme Technology, Heinrich-Heine-University Düsseldorf,

Forschungszentrum Jülich GmbH (Juelich Research Center), Germany

The industrial application of Bacillus as production host for heterologous proteins has gained great interest because of its beneficial growth and production properties [1]. Unfortunately phenotypic heterogeneity in microbial populations may negatively affect the product yield in bioprocesses. In order to understand population heterogeneity, analytical tools with single-cell resolution are necessary. To this end, microfluidic devices can be used as cultivation devices to analyze heterogeneity of production strains [2, 3]. In this work, picoliter bioreactor cultivation systems were developed to observe growth and gene expression of Bacilli on a single-cell level. Especially the morphology of Bacillus megaterium constitutes a major challenge for microfluidic applications and for the first time this species was successfully cultivated in picoliter bioreactors in perfusion and micro-batch mode. As proof of principle, we cultivated different Bacillus megaterium and Bacillus subtilis strains on single-cell level. Focus was laid on plasmid- and genome-based PxylA-controlled GFP expression that was monitored for both strains upon Xylose induction [4]. These model systems were systematically investigated regarding their heterogeneity/homogeneity in growth and gene expression. In addition, environmental conditions such as inducer concentration and medium components were varied. The results revealed significant differences within gene expression of cells, depending on chosen model systems as well as cultivation conditions and modes. Our latest results show that GFP expression heterogeneity distinctly varied for the analyzed strains, yet particularly depended on the localization of the PxylA promoter. The quantitative real-time monitoring of cell cultivation via automated time-lapse microscopy in combination with microfluidic devices facilitates insights into population heterogeneity of different bacterial strains. In-depth knowledge on PxylA-based cell-to-cell variations will inevitably be a key aspect in optimizing vital Bacillus production processes in the future. [1] Vary, P. S. et al., 2007, Applied Microbiology and Biotechnology, 76:957-967. [2] Grünberger, A., et al., 2014, Current Opinion in Biotechnology, 29:15-23. [3] Grünberger, A., et al., 2012, Lab on a Chip, 12(11): 2060-2068. [4] Rygus, T. and Hillen, W., 1991, Applied Microbiology Biotechnology, 35:594-599.


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Produktorientierte Substratmengenberechnung bei der Fermentation von Hefe

N.Krüssel, N. Wolf, M. Pißarreck, E. Bykow, M.-T.Keil, J. Ebeling

Sensor-, Mess-& Regeltechnik (SMR) - Gruppe 3: „One Dimension“

Im Rahmen der lifHack-BioCompetition wird eine maximal zweistündige Fermentation mit Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisae) gefahren. Ziel ist es, eine vorgegebne CO2-Konzentration nach einer bestimmten Zeit, durch die Variation an Substrat- und Hefekonzentration, zu erreichen. Zur Berechnung der Anfangskonzentrationen an Substrat und Inokulum wurde ein Softwaretool entwickelt.

Das Softwaretool wurde mit C# entwickelt und beruht auf der Monod-Kinetik und arbeitet nach folgendem Prinzip:

Nach Eingabe der CO₂-Konzentration in Vol.% erfolgt eine Umrechnung in g/L Abfrage der Zeit - Eingabe in Stunden Durchlaufen mehrerer Prozesssimulationen mit verschiedenen Startbedingungen,

kombiniert aus Biomasse und Substratkonzentration, bis entsprechende Zeit und

CO₂- Konzentration übereinstimmen Zunächst wird die Substratkonzentration erhöht, kann kein passender Wert

ermittelt werden, wird die Konzentration der Biomasse angepasst Nach erfolgreicher Ermittlung der Startwerte wird abschließend das Wachstum

der Biomasse bestimmt

Aus Gründen der Vereinfachung wurden Aspekte wie die Diffusionskostante der Membran und die Umstellung von S. cerevisae auf die neue Umgebung nicht beachtet. Daher sind Abweichungen zwischen Theorie und Praxis zu erwarten, jedoch lag unser Ziel darin diese so klein wie möglich zu halten.

Literatur:

Prof. Eiden, Vorlesung „Sensor-, Mess- und Regeltechnik WS 2016-17“ Recklinghausen, 2017


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Patrick Thon, Sarah Dybowski, Carolin Schaumburg, Christopher Gora, Janosch Nieswandt und Tim Orthwein

Industrielle Biotechnologie (IBT) – Gruppe: „Fermsoft“

„iFerm by Fermsoft“

Die Aufgabe bestand darin, ein Softwaretool zur Berechnung von Fermentationsprozessen zu entwickeln. Diese soll mit Hilfe der Vorgabe der Kohlenstoffdioxid-Gasvolumenmenge und der Fermentationszeit die Glukose-Konzentration und das entsprechendem Inoculum (Biomasse an Saccharomyces cerevisiae) ermitteln. Unser Softwaretool „iFerm“ wurde mit der Programmiersprache „Python“ erstellt und setzt sich aus drei Modulen zusammen.

1) „The Numerical Solver“ ist ein numerischer Löser, welcher einem algebraischen, partiellen Differentialgleichungssystem folgt. Dabei wurden Anfangswerte und kinetische Parameter des Produktionsstammes aus der Literatur (siehe unten) entnommen.

2) „The Fitting Modul“ gleicht die im Labor beobachteten Ergebnisse der durchgeführten Fermentationen als Maßstab an die Differentialgleichungen an.

3) „The Loop Modul“ ist ein Problemstellungslöser und ermittelt mit Hilfe von while-Schleifen die Glukose-Konzentration bis zum vorgegeben Kohlenstoffdioxid-Partialdruck und der Zeit.

Das Programm ermöglicht eine relativ gute Approximation der experimentell-ermittelten Werte und ist für eine dynamische Anpassung geschaffen. Wir erhoffen uns mit diesem Tool eine Vorhersage von Fermentationsprozessen und somit die Erleichterung unmittelbar in den Prozess eingreifen zu können und ihn nach unseren Vorstellungen zu optimieren.

Literatur:

Praxis der Bioprozesstechnik mit virtuellem Praktikum -Hass & Pörtner, 2. Auflage, 2011, Springer-Spektrum Verlag, 978-3827428288


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Neele Kuhnke, Daniel Buchen, Enrico Fruth, Lars Häusler, Jacqueline Hentschel, Stefan Karg

Industrielle Biotechnologie (IBT) – Gruppe: „lifHacker“

Im Rahmen der lifHack-BioCompetition wird eine Fermentation mit Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe) durchgeführt. Die Aufgabe bestand darin, die Anfangskonzentrationen des Mediums und Inokulums so zu bestimmen, dass nach Ablauf einer bestimmten Zeit eine gewünschte CO2-Gasvolumenmenge im Fermenter vorliegt.

Hierfür wurde in Gruppenarbeit ein Softwaretool entwickelt, welches auf der Grundlage von kinetischen Parametern arbeitet und mittels realen Versuchswerten optimiert wurde. Das Programm wurde erst in Excel erstellt und anschließend in Python übertragen. Einige für den Versuch relevante Größen können durch den Nutzer manuell eingestellt werden. Dazu zählen die Reaktorgröße, das Mediumvolumen, die Temperatur und natürlich die Versuchslaufzeit, sowie die gewünschte CO2-Gasvolumenmenge. Auch die Inokulumkonzentration kann prinzipiell durch den Nutzer manuell angepasst werden. Davon wird jedoch abgeraten, da das Programm für eine Hefe-Anfangskonzentration von 35 g/l optimiert wurde.

Das Programm arbeitet auf der grundlegenden Annahme, dass die CO2-Produktion umgekehrt proportional zur Substratabnahme verläuft. Solange die Hefe Substrat verarbeitet, entsteht in Abhängigkeit von der Biomasse-Konzentration und dem verfügbaren Substrat CO2, welches in die Gasphase des Fermenters freigesetzt wird. Das Biomasse-Wachstum wiederum ist ebenfalls umgekehrt proportional zum Substratverbrauch – solange Kohlenhydrate vorhanden sind, findet Zellwachstum statt. Für das Zellwachstum gibt es kinetische Formeln und Konstanten. Dank der aufgeführten Beziehungen zwischen Zellwachstum, Substratverbrauch und CO2-Produktion können Rückschlüsse auf die gesuchte Substrat-Anfangskonzentration gezogen werden.

Jedoch handelt es sich bei dieser Berechnung um rein theoretische Überlegungen. Abweichungen zur Realität sind daher nicht auszuschließen. Auch besteht eine große Schwierigkeit in der Komplexität und Anzahl an relevanten Wirkungsfaktoren, welche einen Einfluss auf die CO2-Produktion und das Biomassewachstum haben. Dies zeigt sich auch bei der Durchführung der Fermentation im Labor – kein Versuch lässt sich zu 100 % reproduzieren. Mit dem Softwaretool können jedoch zumindest gute Näherungswerte erzielt werden.

Literatur:

Prof. Dr. Eiden, Vorlesung „Industrielle BioTechnologie WS 2016-17“ Recklinghausen, 2017


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7. Unternehmensprofile "Elevator Pitch"

Das Fraunhofer IMS beschäftigt sich mit der Entwicklung von mikroelektronischen

Schaltungen, elektronischen Systemen, Mikrosystemen und Sensoren. Aufgrund

seines umfangreichen Know-hows, dem Zugang zur Technologie und den

hochwertigen Entwicklungsleistungen ist das Institut weltweit ein anerkannter Partner

für die Industrie. In acht Geschäftsfeldern widmet sich das Fraunhofer IMS der

angewandten Forschung, der Vorentwicklung für Produkte und deren Anwendungen.

Stabile, effiziente und vermarktbare Technologien und Verfahren, die in vielen

Branchen zum Einsatz kommen, stehen dabei im Mittelpunkt der Auftragsarbeiten.

Im Bereich der Biotechnologie entwickelt das Fraunhofer IMS Sensorsysteme zur

Überwachung von Parametern wie Glukose, Laktat, Zelldichte und pH in

Bioreaktoren. Die Systeme sind für die Integration in den Bioprozess vorgesehen,

sodass eine kontinuierliche Messung der Parameter ohne Probennahme möglich ist.

Fraunhofer-Institut für Mikroelektronische Schaltungen und Systeme IMS Gruppe Biohybride Systeme Mikro- und Nanosysteme Finkenstraße 61 47057 Duisburg

Dr.-Ing. Herr Stefan Mross Tel.: 0203 3783 254 [email protected]


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Underwater adhesives, harmless pesticides or antibiotics that are effective against multi-resistant microbes – it all sounds utopian, but could already have been a reality for a long time! Because peptides, "small proteins" of up to 100 amino acids, allow these and numerous other innovations . And, although already well-researched in laboratories, a launch of "super glue", "Smart Protect" or "Antibiotic 2.0" has not been previously possible. The leading reason is the cost of the "miracle” raw materials. The dominant method, chemical synthesis, is extremely costly. The preparation of a milligram of peptide costs an average of 80 € (or about a million in production scale). At the same time, chemical syntheses are not highly scalable and peptides in large quantities ( > kg ) are inaccessible. For these reasons, peptides currently have a very limited role except in pharmaceutical applications.

NUMAFERM has succeeded in taking a quantum leap into the production of peptides. Based on the research of Dr. Christian Schwarz (Heinrich-Heine University in Duesseldorf), a patented process was developed successfully making peptide production up to 1,000 times more cost-effective. With us, the fascinating raw material peptide is cheaper for pharmaceutics, for the first time, affordable for non-pharmaceutical applications. Our team of 6 well-educated and experienced scientists will use and offer the technology for the production of peptides on a mass scale and support our customers with our know-how in the development of marketable peptide-based products. Through the development and distribution of our own peptides with new functions, we can reach customers who previously had no knowledge of peptides.

The broad applicability of peptides enables the development of various markets. We already carry out concrete projects in the pharmaceutical, cosmetics, adhesives, pesticides and aquaculture industry. Our target customers are companies from these sectors and commissioned manufacturers that use our technology for third parties. We have not seen competitive rival technologies for the production of peptides.

NUMAFERM GmbH

Merowingerplatz 1

40225 Düsseldorf


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Evolution of microbial production strains for the bioeconomy

Availability of suitable microbial strains for a bio-based production of essential nutrients, novel bioactive substances and new biologically synthesized molecules in pharmaceuticals is limited and techniques for microbial strain development are laborious, time-consuming and inefficient.

The limiting, recurrent challenge in each strain development process is to identify the most productive cells of a strain under millions of others and to isolate them. SenseUp developed a disruptive technology to accelerate this step by magnitudes, enabling isolation of most productive cells out of millions in minutes, instead of thousands of cells in years with conventional techniques. Furthermore, the SenseUp technology enables screening out of real fermentations ensuring the isolation of cells performing optimal under process conditions, instead of shaking flasks.

The SenseUp-Technology makes productivity visible on single-cell level and uses flow cytometry (FACS) for analysis of up to 50.000 cells per second and direct isolation of those, emitting strongest fluorescence (most productive ones).

Figure 1: Microscopic picture of microbial cells with different production performance for the amino acid L-Lysine. Cells on the left side are not equipped with our metabolite sensor – all of them look the same, even if their productivity is different. Cells on the right side carry our Lysine-specific metabolite-sensor and emit graded fluorescence, which correlates with Lysine-accumulation.

Based on this patented technology, SenseUp develops customized microbial production strains and licenses them to producing companies. Our customers benefit from short development times, upscale-compatibility of constructed strains, comprehensive IP generation and compatibility to non-GM applications.

SenseUP GmbH Karl-Heinz-Beckurts-Straße 13 52428 Jülich

Dr. Stephan Binder (Co-Founder) [email protected]


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8. Raumplan / Wegeskizze

Tagungsräume: Hörsaal A (Gebäude B)

Workshopräume:

B.2.101 – Exputec GmbH

B.2.102 – Hamilton GmbH

B.2.103 – PreSens Precision Sensing GmbH / Kuhner AG

B.2.104 – TRACE Analytics GmbH / BlueSens gas sensor GmbH

B.2.105 – Sartorius Stedim Biotech GmbH

B.2.106 – m2p-labs GmbH / Processshield AG BPT

B.2.107 – Aquila Biolabs GmbH / Infors AG

B.2.108 – I&L Biosystems GmBH


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Abendveranstaltung am 21.02.17 - 19:00

Ratskeller Recklinghausen Rathausplatz 3 45657 Recklinghausen

WHS Recklinghausen (August-Schmidt-Ring 10)


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9. Sponsoren

BlueSens gas sensor GmbH Snirgelskamp 25 45699 Herten T: 02366 / 499 55 00 F: 02366 / 499 55 99 W: http://www.bluesens.de/

Hamilton Messtechnik GmbH Forsteler Str. 13 64739 Höchst T: 06163 910 495 F: 06163 910 458 W: http://www.hamilton-messtechnik.de/

I &L Biosystems GmbH Königswinterer Str. 409a 53639 Königswinter T: 02223-9192-0 F: 02223-9192-48 W: http://www.il-biosystems.de/

TRACE Analytics GmbH Richard-Wagner-Straße 1 38106 Braunschweig T: 0531/209008-0 F: 0531/209008-39 W: http://www.trace.de/

Biostream International BV

P.O Box 669 7000 AR Doetinchem T: +31 (0) 314 200041 W: http://www.biostream-international.com/

http://www.bluesens.de/

http://www.hamilton-messtechnik.de/

http://www.il-biosystems.de/

http://www.trace.de/


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aquila biolabs GmbH

Arnold-Sommerfeld-Ring 2 52499 Baesweiler T: 0163 / 2922615 W: http://aquila-biolabs.de/

Infors GmbH

Dachauer Str. 6 85254 Einsbach T: 081 / 35 83 33 F: 081 / 35 83 20 W: http://www.infors-ht.de/

Kuhner Shaker GmbH Technologiepark Herzogenrath Kaiserstraße 100 52134 Herzogenrath T: 02407 / 5548822 F: 02407 / 5548824 W: http://www.kuhner.com/about.html

PreSens - Precision Sensing GmbH Am BioPark 11 93053 Regensburg T: 0941 / 942 72 100 F: 0941 / 942 72 111 W: https://www.presens.de/

Sartorius Stedim Biotech GmbH August-Spindler-Straße 11 37079 Göttingen T: 0551 / 3080 W: https://www.sartorius.de/sartoriusDE/de/


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PlasmidFactory GmbH & Co. KG Meisenstr. 96 D-33 607 Bielefeld T: 0521 / 299 735-0 F: 0521 / 299 735-5 W: http://cms.plasmidfactory.com/en/

m2p-labs GmbH Arnold-Sommerfeld-Ring 2 52499 Baesweiler T: 02401 / 805330 F: 02401 / 805333 W: http://www.m2p-labs.com/

EXPUTEC GmbH Pfeilgasse 32/20 A-1080 Wien T: +43-(0)1-997 28 49 W: http://exputec.com/


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10. Arbeitsgruppe BioProzessTechnik

Prof. Dr.-Ing. Frank Eiden Westfälische Hochschule Standort Recklinghausen FB Molekulare Biologie August-Schmidt-Ring 10 45665 Recklinghausen

T: +49 2361 – 915585 F: +49 2361 – 915484

M: [email protected] http://www.apz-rl.de/BioProzessTechnik


http://www.apz-rl.de/BioProzessTechnik

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